JP5472288B2 - タンパク質の電荷調節剤、及びタンパク質内包高分子ミセル複合体 - Google Patents
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Description
本発明は、タンパク質分子の電荷調節剤、及び、タンパク質を内包する高分子ミセル複合体に関し、詳しくは、当該調節剤により分子全体の電荷が調節されたタンパク質を内包する高分子ミセル複合体に関する。また本発明は、当該複合体を用いたタンパク質送達デバイス及びタンパク質送達用キット等に関する。
ポストゲノム時代において、タンパク質の機能の解明は生物学の分野において最も重要な領域であり、タンパク質を有効成分とする各種疾患の治療薬の開発は、医薬科学の分野において大きな潜在性及び可能性を有するものである。タンパク質の機能についての基礎研究においては、特定のタンパク質の発現を亢進させたり、タンパク質発現を抑制（ノックダウン）する等の様々な方法が用いられてきた。おそらく、最もシンプルで確実な方法は、細胞内にタンパク質を直接導入することである。そのような直接的な送達方法によると、タンパク質の機能は、転写−翻訳経路における影響等を何も受けることなく解析され得る。さらに、生体内への効果的なタンパク質送達は、例えば、ワクチン接種やタンパク質製剤等の治療用途において極めて重要なものである。タンパク質をベースとする様々な生物薬剤学的研究がなされてきたが、血清中でのタンパク質の不安定性、及び細胞質へのタンパク質送達デバイスの欠如は、将来の成功を大きく制限してきた（I. M. Tomlinson, Nature Biotech., 2004, vol. 22, p. 521-522）。そのため、多くの研究者等が、ヒドロゲル、リポソーム、ナノチューブ又は無機担体等を用いたタンパク質送達方法の開発に注力してきたが（K. Y. Lee et al., Prog. Polym. Sci., 2007, vol. 32, p. 669-697；N. W. S. Kam et al., Angew. Chem. Int. Ed.,2006, vol. 45, p. 577-581；I. I. Slowing et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, vol. 129, p. 8845-8849）、高効率であり且つ血清中での安定性に優れ、しかも汎用性の高いタンパク質送達方法は、未だ開発されていない。
このような状況下において、細胞質への効果的なタンパク質送達手段の開発が望まれていた。
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、タンパク質の電荷調節剤、タンパク質内包高分子ミセル複合体（ポリイオンコンプレックスミセル）、細胞内へのタンパク質送達デバイス、細胞内へのタンパク質送達用キット等を提供するものである。
（１）下記式（I）で示される化合物又はその誘導体を含むことを特徴とする、タンパク質の電荷調節剤。
〔式中、Ra及びRbは、それぞれ互いに独立して、水素原子、又は置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、複素環基、複素環アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基若しくはアリールオキシ基を表す。また、RaとRbとが結合し、それぞれが結合している炭素原子と共に芳香環又はシクロアルキル環を形成していてもよい。Ra及びRbがそれぞれ結合している炭素原子間の結合は、単結合であってもよいし二重結合であってもよい。〕
ここで、上記式（I）で示される化合物としては、例えば、下記式（Ia）〜（Ig）で示される化合物のうちの少なくとも１種であるものが挙げられる。
本発明の電荷調節剤は、例えば、塩基性又は中性タンパク質の全体としての電荷を酸性タンパク質の電荷に変換するものが挙げられ、具体的には、前記式（I）で示される化合物又はその誘導体が、タンパク質に含まれるアミノ基と結合するものが挙げられる。
（２）上記(1)に記載の電荷調節剤により全体としての電荷が変換されたタンパク質（電荷変換タンパク質）。
本発明の電荷変換タンパク質としては、例えば、下記式（I）で示される化合物又はその誘導体が、当該タンパク質に含まれるアミノ基と結合したものが挙げられる。
〔式中、Ra及びRbは、それぞれ互いに独立して、水素原子、又は置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、複素環基、複素環アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基若しくはアリールオキシ基を表す。また、RaとRbとが結合し、それぞれが結合している炭素原子と共に芳香環又はシクロアルキル環を形成していてもよい。Ra及びRbがそれぞれ結合している炭素原子間の結合は、単結合であってもよいし二重結合であってもよい。〕
ここで、上記式（I）で示される化合物としては、例えば、下記式（Ia）〜（Ig）で示される化合物のうちの少なくとも１種であるものが挙げられる。
（３）少なくとも一部にポリカチオン部分を有するカチオン性高分子と、上記(2)に記載のタンパク質とを含むことを特徴とする、ポリイオンコンプレックス。
本発明のポリイオンコンプレックスは、例えば、前記ポリカチオン部分が、側鎖にカチオン性基を有するポリペプチドであるものが挙げられ、具体的には、前記ブロックコポリマーが下記一般式(1)で示されるものが挙げられる。
〔式中、R1及びR2は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、
R3及びR4は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、
L1は、NH、CO、下記一般式(4)：
-(CH2)p1-NH- (4)
（式中、p1は1〜6の整数を表す。）
で示される基、又は下記一般式(5)：
-L2a-(CH2)q1-L3a- (5)
（式中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜6の整数を表す。）
で示される基を表し、
m1、m2及びm3は互いに独立して0〜500の整数を表し（但し、m1、m2及びm3の合計は10〜500の整数を表す。）、m4は1〜5の整数を表し、m5は1〜5の整数を表し、nは0〜500の整数を表す。
「/」の表記は、その左右に示された(m1+m2+m3)個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
ここで、上記一般式(1)のカチオン性高分子中、-R3基及び／又は-R4基としては、例えば、下記一般式(2)：
-NH-(CH2)r-X1 (2)
（式中、X1は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、rは0〜5の整数を表す。）
で示される基、又は下記一般式(3)：
-〔NH-(CH2)s〕t -X2 (3)
（式中、X2は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。s及びtは、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH2)s〕ユニット間で独立して、sは1〜5の整数を表し、tは2〜5の整数を表す。）
で示される基が挙げられ、具体的には、-NH-NH2 及び -NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2 が挙げられる。
本発明のポリイオンコンプレックスは、例えば、前記カチオン性高分子中のポリカチオン部分と前記タンパク質とが静電的相互作用により結合したものが挙げられる。具体的には、前記カチオン性高分子がさらにポリエチレングリコール部分を含む高分子であって、前記タンパク質と前記カチオン性高分子中のポリカチオン部分とがコア部分を形成し、前記カチオン性高分子中のポリエチレングリコール部分が前記コア部分の周囲にシェル部分を形成したものが挙げられる。
本発明のポリイオンコンプレックスとしては、例えば、細胞内に導入後のポリイオンコンプレックスより放出されたタンパク質から、前記式（I）で示される化合物又はその誘導体が脱離することにより、当該タンパク質の全体としての電荷が当該タンパク質の本来有する電荷に回復することを特徴とするものが挙げられる。
（４）上記(3)に記載のポリイオンコンプレックスを含むことを特徴とする、細胞内へのタンパク質送達デバイス。
（５）少なくとも一部にポリカチオン部分を有するカチオン性高分子と、上記(1)に記載の電荷調節剤とを含む、細胞内へのタンパク質送達用キット。
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、タンパク質の電荷調節剤、タンパク質内包高分子ミセル複合体（ポリイオンコンプレックスミセル）、細胞内へのタンパク質送達デバイス、細胞内へのタンパク質送達用キット等を提供するものである。
（１）下記式（I）で示される化合物又はその誘導体を含むことを特徴とする、タンパク質の電荷調節剤。
ここで、上記式（I）で示される化合物としては、例えば、下記式（Ia）〜（Ig）で示される化合物のうちの少なくとも１種であるものが挙げられる。
（２）上記(1)に記載の電荷調節剤により全体としての電荷が変換されたタンパク質（電荷変換タンパク質）。
本発明の電荷変換タンパク質としては、例えば、下記式（I）で示される化合物又はその誘導体が、当該タンパク質に含まれるアミノ基と結合したものが挙げられる。
ここで、上記式（I）で示される化合物としては、例えば、下記式（Ia）〜（Ig）で示される化合物のうちの少なくとも１種であるものが挙げられる。
（３）少なくとも一部にポリカチオン部分を有するカチオン性高分子と、上記(2)に記載のタンパク質とを含むことを特徴とする、ポリイオンコンプレックス。
本発明のポリイオンコンプレックスは、例えば、前記ポリカチオン部分が、側鎖にカチオン性基を有するポリペプチドであるものが挙げられ、具体的には、前記ブロックコポリマーが下記一般式(1)で示されるものが挙げられる。
R3及びR4は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、
L1は、NH、CO、下記一般式(4)：
-(CH2)p1-NH- (4)
（式中、p1は1〜6の整数を表す。）
で示される基、又は下記一般式(5)：
-L2a-(CH2)q1-L3a- (5)
（式中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜6の整数を表す。）
で示される基を表し、
m1、m2及びm3は互いに独立して0〜500の整数を表し（但し、m1、m2及びm3の合計は10〜500の整数を表す。）、m4は1〜5の整数を表し、m5は1〜5の整数を表し、nは0〜500の整数を表す。
「/」の表記は、その左右に示された(m1+m2+m3)個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
ここで、上記一般式(1)のカチオン性高分子中、-R3基及び／又は-R4基としては、例えば、下記一般式(2)：
-NH-(CH2)r-X1 (2)
（式中、X1は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、rは0〜5の整数を表す。）
で示される基、又は下記一般式(3)：
-〔NH-(CH2)s〕t -X2 (3)
（式中、X2は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。s及びtは、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH2)s〕ユニット間で独立して、sは1〜5の整数を表し、tは2〜5の整数を表す。）
で示される基が挙げられ、具体的には、-NH-NH2 及び -NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2 が挙げられる。
本発明のポリイオンコンプレックスは、例えば、前記カチオン性高分子中のポリカチオン部分と前記タンパク質とが静電的相互作用により結合したものが挙げられる。具体的には、前記カチオン性高分子がさらにポリエチレングリコール部分を含む高分子であって、前記タンパク質と前記カチオン性高分子中のポリカチオン部分とがコア部分を形成し、前記カチオン性高分子中のポリエチレングリコール部分が前記コア部分の周囲にシェル部分を形成したものが挙げられる。
本発明のポリイオンコンプレックスとしては、例えば、細胞内に導入後のポリイオンコンプレックスより放出されたタンパク質から、前記式（I）で示される化合物又はその誘導体が脱離することにより、当該タンパク質の全体としての電荷が当該タンパク質の本来有する電荷に回復することを特徴とするものが挙げられる。
（４）上記(3)に記載のポリイオンコンプレックスを含むことを特徴とする、細胞内へのタンパク質送達デバイス。
（５）少なくとも一部にポリカチオン部分を有するカチオン性高分子と、上記(1)に記載の電荷調節剤とを含む、細胞内へのタンパク質送達用キット。
図１は、電荷変換型ポリイオンコンプレックスミセルの調製方法を示す概略図である。具体的には、シトクロムcタンパク質のリジン残基のアミンに、電荷調節剤としての無水シトラコン酸や無水シス−アコニット酸を結合させることにより、総荷電がマイナス側に変換されたシトクロムc（以下、シトクロムc誘導体）を調製し、このシトクロムc誘導体と、カチオン性高分子としての所定のブロックコポリマー（PEG-pAsp(DET)）とを用いて、当該誘導体が内包された状態のポリイオンコンプレックス（PIC）ミセルを調製したことを示す。また、その後、PICミセルがpH5.5環境下におかれると、当該ミセルが崩壊すると共に、内包されていたシトクロムc誘導体から電荷調節剤として結合していた無水シトラコン酸や無水シス−アコニット酸が脱離し、当該誘導体がもとのシトクロムcに再生することを示す。
図２は、シトクロムc誘導体と、カチオン性高分子としての所定のブロックコポリマー（PEG-pAsp(DET)）とを用いたPICミセル（N/C比 = 2）の形成を示す図である。具体的には、A及びCは、原子間力顕微鏡（AMF）によるPICミセルの観察像を示し（図中の白色のスケールバーは200nmのスケールを表す。）、B及びDは、動的光散乱法（DLS）により測定したPICミセルの粒径分布を示す。A及びBのPICミセルは、電荷調節剤として無水シトラコン酸を用いた場合のものであり、C及びDのPICミセルは、電荷調節剤として無水シス−アコニット酸を用いた場合のものである。
図３は、シトクロムc誘導体の分解率を示す図である。具体的には、Aは電荷調節剤として無水シトラコン酸を用いた場合のシトクロムc誘導体（Cyt-Cit）であり、Bは電荷調節剤として無水シス−アコニット酸を用いた場合のシトクロムc誘導体（Cyt-Aco）である。図中、白抜きのプロット(○；open circle)はpH 7.4（生理条件）環境下における分解率を示し、黒塗りのプロット(●；closed circle)はpH 5.5環境下における分解率を示す。
図４は、PICミセルからのシトクロムc誘導体の放出（リリース）率を、蛍光発光測定により示した図である。具体的には、Aは電荷調節剤として無水シトラコン酸を用いた場合のPICミセルであり、Bは電荷調節剤として無水シス−アコニット酸を用いた場合のPICミセルである。図中、白抜きのプロット(○；open circle)はpH 7.4（生理条件）環境下における放出率を示し、黒塗りのプロット(●；closed circle)はpH 5.5環境下における放出率を示す。
図５は、シトクロムcによるABTS（2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)）の酸化活性の測定結果を示す図である。図中、白抜きのプロット(○；open circle)は、電荷調節剤として無水シトラコン酸を用いた場合のPICミセルから放出されたシトクロムcの活性を示し、黒塗りのプロット(●；closed circle)は、野生型のシトクロムcの活性を示す。
図６は、電荷変換型PICミセルによる細胞内へのタンパク質送達系の概略図である。
図７は、所定の物質を細胞内に送達したHuH-7細胞の、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）による観察像を示す図である（トランスフェクション後24時間）。具体的には、Aはフリーの野生型シトクロムcを、Bは電荷調節剤として無水コハク酸を用いた場合のPICミセル（Cyt-Suc PIC micelles）を、Cは電荷調節剤として無水シス−アコニット酸を用いた場合のPICミセル（Cyt-Aco PIC micelles）を、Dは電荷調節剤として無水シトラコン酸を用いた場合のPICミセル（Cyt-Cit PIC micelles）を、細胞内に送達した場合の結果を示す。いずれのシトクロムc誘導体もAlexa Fluor 488 (緑色)で標識されており、後期エンドソーム及びリソソームはLysoTracker Red (赤色)で染色した。図中の白色のスケールバーは50μmのスケールを表す。
図８は、Alexa Fluor 488で標識されたシトクロムc誘導体の蛍光（緑色）と、LysoTracker Redの蛍光（赤色）との共局在性（co-localization）の結果を示す図である。具体的には、Aはフリーの野生型シトクロムcの場合、Bは電荷調節剤として無水コハク酸を用いた場合のPICミセル（Cyt-Suc PIC micelles）の場合、Cは電荷調節剤として無水シス−アコニット酸を用いた場合のPICミセル（Cyt-Aco PIC micelles）の場合、Dは電荷調節剤として無水シトラコン酸を用いた場合のPICミセル（Cyt-Cit PIC micelles）の場合を示す。いずれのエラーバーも20個の細胞を測定した場合の標準偏差を意味する。
図９は、電荷変換IgGを用いた電荷変換型PICミセルの調製法を示す概略図である。
図１０は、電荷変換F(ab’)2を用いた電荷変換型PICミセルの調製法を示す概略図である。
図１１は、動的光散乱法（DLS）により測定したF(ab’)2内包PICミセルの粒径分布を示す図である。
図１２は、(A)は電荷変換型PICミセルによるF(ab’)2の細胞内送達を示す概略図である。(B)は、PICミセルにより細胞内送達がなされたHeLa細胞の共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）による観察像を示す図である。
図１３は、電荷変換型ポリイオンコンプレックスミセルの調製方法を示す概略図である。具体的には、IgG抗体タンパク質のリジン残基のアミンに、電荷調節剤としての無水シトラコン酸や無水シス−アコニット酸を結合させることにより、総荷電がマイナス側に変換されたIgG（以下、IgG誘導体）を調製し、このIgG誘導体と、カチオン性高分子としての所定のブロックコポリマー（PEG-C6-pAsp(DET)）とを用いて、当該誘導体が内包された状態のポリイオンコンプレックス（PIC）ミセルを調製したことを示す。また、その後、PICミセルがpH5.5環境下におかれると、当該ミセルが崩壊すると共に、内包されていたIgG誘導体から電荷調節剤として結合していた無水シトラコン酸や無水シス−アコニット酸が脱離し、当該誘導体がもとのIgGに再生する（すなわちIgG抗体としての機能を回復する）ことを示す。
図１４Ａは、抗核膜孔複合体（抗NPC）IgG誘導体による核膜孔複合体(NPC)の認識を示す図である。A) IgG-Aco（pH 7.4で4 hrインキュベート後）、B) IgG-Aco（pH 5.5で3 hrインキュベート後）、C) IgG-Suc（pH 7.4で4 hrインキュベート後）、D) IgG-Suc（pH 5.5で4 hrインキュベート後）で処理されたHuh-7細胞の、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）による観察像である。いずれのIgG誘導体も、膜透過化後のパラホルムアルデヒド固定細胞内に送達されている。細胞核はHoechst 33258（青色）で染色され、IgG誘導体は2次抗体であるAlexa Fluor 488標識化 抗マウス IgG (Fab’)2 フラグメント（緑色）により検出される。図中の白色のスケールバーは20 μmのスケールを表す。
図１４Ｂは、抗核膜孔複合体（抗NPC）IgG誘導体による核膜孔複合体(NPC)の認識を示す図である。a) native IgG（未変性IgG）、b) IgG-Cit、c) IgG-Cit（pH 7.4で4 hrインキュベート後）、d) IgG-Cit（pH 5.5で4 hrインキュベート後）で処理されたHuh-7細胞の、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）による観察像である。いずれのIgG誘導体も、膜透過化後のパラホルムアルデヒド固定細胞内に送達されている。細胞核はHoechst 33258（青色）で染色され、IgG誘導体は2次抗体であるAlexa Fluor 488標識化 抗マウス IgG (Fab’)2 フラグメント（緑色）により検出される。図中の白色のスケールバーは20 μmのスケールを表す。
図１５は、動的光散乱法（DLS）により測定した、(A) IgG-Cit, (B) IgG-Aco及び (C) IgG-Sucを内包する各PICミセルの粒径分布の結果を示す図である。カチオン性高分子としてPEG-C6-pAsp(DET)が使用されている。
図１６は、動的光散乱法（DLS）により測定した、(A) (Fab’)2-Cit, (B) (Fab’)2-Aco及び (C) (Fab’)2-Sucを内包する各PICミセルの粒径分布の結果を示す図である。カチオン性高分子としてPEG-C6-pAsp(DET)が使用されている。
図１７は、PICミセルからの(Fab’)2誘導体の放出（リリース）率を、蛍光発光測定により示した図である。具体的には、Aは電荷調節剤として無水シトラコン酸を用いた場合のPICミセルであり、Bは電荷調節剤として無水シス−アコニット酸を用いた場合のPICミセルであり、Cは無水コハク酸を用いた場合のPICミセルである。図中、白抜きのプロット(○；open circle)はpH 7.4（生理条件）環境下における放出率を示し、黒塗りのプロット(●；closed circle)はpH 5.5環境下における放出率を示す。
図１８は、Alexa Fluor 488で標識された 抗マウス IgG (Fab’)2 フラグメント誘導体（緑色）を内包するPICミセルが送達されたHuH-7細胞の、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）による観察像を示す図である。a）は (Fab’)2-Cit、b）は (Fab’)2-Aco、c）は (Fab’)2-Sucを、上記誘導体として使用した場合の図である。後期エンドソーム及びリソソームをLysoTracker Red（赤色）により染色した。図中の白色のスケールバーは20 μmのスケールを表す。d）は、(Fab’)2 誘導体の緑色蛍光とLysotracker Redの赤色蛍光との共局在性（co-localization）を示すグラフである（エラーバー: 標準偏差）。
図１９は、IgG誘導体を内包するPICミセルが送達されたHuH-7細胞の、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）による観察像を示す図である。a）は IgG-Cit、b）は IgG-Aco、c）は IgG-Sucを、上記誘導体として使用した場合の図である。細胞核は、Hoechst 33258（青色）により染色した。IgG誘導体は、2次抗体であるAlexa Fluor 488標識化 抗マウス IgG (Fab’)2 フラグメント（緑色）により検出した。図中の白色のスケールバーは20 μmのスケールを表す。d）は、各PICミセルにより処理された（各PICミセルが送達された）HuH-7細胞の細胞増殖性を示すグラフであり、白色及びグレーの棒グラフは、それぞれ、24 hrインキュベート後の細胞生存率 及び48 hrインキュベート後の細胞生存率を表す（エラーバー: 標準偏差）。
図２は、シトクロムc誘導体と、カチオン性高分子としての所定のブロックコポリマー（PEG-pAsp(DET)）とを用いたPICミセル（N/C比 = 2）の形成を示す図である。具体的には、A及びCは、原子間力顕微鏡（AMF）によるPICミセルの観察像を示し（図中の白色のスケールバーは200nmのスケールを表す。）、B及びDは、動的光散乱法（DLS）により測定したPICミセルの粒径分布を示す。A及びBのPICミセルは、電荷調節剤として無水シトラコン酸を用いた場合のものであり、C及びDのPICミセルは、電荷調節剤として無水シス−アコニット酸を用いた場合のものである。
図３は、シトクロムc誘導体の分解率を示す図である。具体的には、Aは電荷調節剤として無水シトラコン酸を用いた場合のシトクロムc誘導体（Cyt-Cit）であり、Bは電荷調節剤として無水シス−アコニット酸を用いた場合のシトクロムc誘導体（Cyt-Aco）である。図中、白抜きのプロット(○；open circle)はpH 7.4（生理条件）環境下における分解率を示し、黒塗りのプロット(●；closed circle)はpH 5.5環境下における分解率を示す。
図４は、PICミセルからのシトクロムc誘導体の放出（リリース）率を、蛍光発光測定により示した図である。具体的には、Aは電荷調節剤として無水シトラコン酸を用いた場合のPICミセルであり、Bは電荷調節剤として無水シス−アコニット酸を用いた場合のPICミセルである。図中、白抜きのプロット(○；open circle)はpH 7.4（生理条件）環境下における放出率を示し、黒塗りのプロット(●；closed circle)はpH 5.5環境下における放出率を示す。
図５は、シトクロムcによるABTS（2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)）の酸化活性の測定結果を示す図である。図中、白抜きのプロット(○；open circle)は、電荷調節剤として無水シトラコン酸を用いた場合のPICミセルから放出されたシトクロムcの活性を示し、黒塗りのプロット(●；closed circle)は、野生型のシトクロムcの活性を示す。
図６は、電荷変換型PICミセルによる細胞内へのタンパク質送達系の概略図である。
図７は、所定の物質を細胞内に送達したHuH-7細胞の、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）による観察像を示す図である（トランスフェクション後24時間）。具体的には、Aはフリーの野生型シトクロムcを、Bは電荷調節剤として無水コハク酸を用いた場合のPICミセル（Cyt-Suc PIC micelles）を、Cは電荷調節剤として無水シス−アコニット酸を用いた場合のPICミセル（Cyt-Aco PIC micelles）を、Dは電荷調節剤として無水シトラコン酸を用いた場合のPICミセル（Cyt-Cit PIC micelles）を、細胞内に送達した場合の結果を示す。いずれのシトクロムc誘導体もAlexa Fluor 488 (緑色)で標識されており、後期エンドソーム及びリソソームはLysoTracker Red (赤色)で染色した。図中の白色のスケールバーは50μmのスケールを表す。
図８は、Alexa Fluor 488で標識されたシトクロムc誘導体の蛍光（緑色）と、LysoTracker Redの蛍光（赤色）との共局在性（co-localization）の結果を示す図である。具体的には、Aはフリーの野生型シトクロムcの場合、Bは電荷調節剤として無水コハク酸を用いた場合のPICミセル（Cyt-Suc PIC micelles）の場合、Cは電荷調節剤として無水シス−アコニット酸を用いた場合のPICミセル（Cyt-Aco PIC micelles）の場合、Dは電荷調節剤として無水シトラコン酸を用いた場合のPICミセル（Cyt-Cit PIC micelles）の場合を示す。いずれのエラーバーも20個の細胞を測定した場合の標準偏差を意味する。
図９は、電荷変換IgGを用いた電荷変換型PICミセルの調製法を示す概略図である。
図１０は、電荷変換F(ab’)2を用いた電荷変換型PICミセルの調製法を示す概略図である。
図１１は、動的光散乱法（DLS）により測定したF(ab’)2内包PICミセルの粒径分布を示す図である。
図１２は、(A)は電荷変換型PICミセルによるF(ab’)2の細胞内送達を示す概略図である。(B)は、PICミセルにより細胞内送達がなされたHeLa細胞の共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）による観察像を示す図である。
図１３は、電荷変換型ポリイオンコンプレックスミセルの調製方法を示す概略図である。具体的には、IgG抗体タンパク質のリジン残基のアミンに、電荷調節剤としての無水シトラコン酸や無水シス−アコニット酸を結合させることにより、総荷電がマイナス側に変換されたIgG（以下、IgG誘導体）を調製し、このIgG誘導体と、カチオン性高分子としての所定のブロックコポリマー（PEG-C6-pAsp(DET)）とを用いて、当該誘導体が内包された状態のポリイオンコンプレックス（PIC）ミセルを調製したことを示す。また、その後、PICミセルがpH5.5環境下におかれると、当該ミセルが崩壊すると共に、内包されていたIgG誘導体から電荷調節剤として結合していた無水シトラコン酸や無水シス−アコニット酸が脱離し、当該誘導体がもとのIgGに再生する（すなわちIgG抗体としての機能を回復する）ことを示す。
図１４Ａは、抗核膜孔複合体（抗NPC）IgG誘導体による核膜孔複合体(NPC)の認識を示す図である。A) IgG-Aco（pH 7.4で4 hrインキュベート後）、B) IgG-Aco（pH 5.5で3 hrインキュベート後）、C) IgG-Suc（pH 7.4で4 hrインキュベート後）、D) IgG-Suc（pH 5.5で4 hrインキュベート後）で処理されたHuh-7細胞の、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）による観察像である。いずれのIgG誘導体も、膜透過化後のパラホルムアルデヒド固定細胞内に送達されている。細胞核はHoechst 33258（青色）で染色され、IgG誘導体は2次抗体であるAlexa Fluor 488標識化 抗マウス IgG (Fab’)2 フラグメント（緑色）により検出される。図中の白色のスケールバーは20 μmのスケールを表す。
図１４Ｂは、抗核膜孔複合体（抗NPC）IgG誘導体による核膜孔複合体(NPC)の認識を示す図である。a) native IgG（未変性IgG）、b) IgG-Cit、c) IgG-Cit（pH 7.4で4 hrインキュベート後）、d) IgG-Cit（pH 5.5で4 hrインキュベート後）で処理されたHuh-7細胞の、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）による観察像である。いずれのIgG誘導体も、膜透過化後のパラホルムアルデヒド固定細胞内に送達されている。細胞核はHoechst 33258（青色）で染色され、IgG誘導体は2次抗体であるAlexa Fluor 488標識化 抗マウス IgG (Fab’)2 フラグメント（緑色）により検出される。図中の白色のスケールバーは20 μmのスケールを表す。
図１５は、動的光散乱法（DLS）により測定した、(A) IgG-Cit, (B) IgG-Aco及び (C) IgG-Sucを内包する各PICミセルの粒径分布の結果を示す図である。カチオン性高分子としてPEG-C6-pAsp(DET)が使用されている。
図１６は、動的光散乱法（DLS）により測定した、(A) (Fab’)2-Cit, (B) (Fab’)2-Aco及び (C) (Fab’)2-Sucを内包する各PICミセルの粒径分布の結果を示す図である。カチオン性高分子としてPEG-C6-pAsp(DET)が使用されている。
図１７は、PICミセルからの(Fab’)2誘導体の放出（リリース）率を、蛍光発光測定により示した図である。具体的には、Aは電荷調節剤として無水シトラコン酸を用いた場合のPICミセルであり、Bは電荷調節剤として無水シス−アコニット酸を用いた場合のPICミセルであり、Cは無水コハク酸を用いた場合のPICミセルである。図中、白抜きのプロット(○；open circle)はpH 7.4（生理条件）環境下における放出率を示し、黒塗りのプロット(●；closed circle)はpH 5.5環境下における放出率を示す。
図１８は、Alexa Fluor 488で標識された 抗マウス IgG (Fab’)2 フラグメント誘導体（緑色）を内包するPICミセルが送達されたHuH-7細胞の、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）による観察像を示す図である。a）は (Fab’)2-Cit、b）は (Fab’)2-Aco、c）は (Fab’)2-Sucを、上記誘導体として使用した場合の図である。後期エンドソーム及びリソソームをLysoTracker Red（赤色）により染色した。図中の白色のスケールバーは20 μmのスケールを表す。d）は、(Fab’)2 誘導体の緑色蛍光とLysotracker Redの赤色蛍光との共局在性（co-localization）を示すグラフである（エラーバー: 標準偏差）。
図１９は、IgG誘導体を内包するPICミセルが送達されたHuH-7細胞の、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）による観察像を示す図である。a）は IgG-Cit、b）は IgG-Aco、c）は IgG-Sucを、上記誘導体として使用した場合の図である。細胞核は、Hoechst 33258（青色）により染色した。IgG誘導体は、2次抗体であるAlexa Fluor 488標識化 抗マウス IgG (Fab’)2 フラグメント（緑色）により検出した。図中の白色のスケールバーは20 μmのスケールを表す。d）は、各PICミセルにより処理された（各PICミセルが送達された）HuH-7細胞の細胞増殖性を示すグラフであり、白色及びグレーの棒グラフは、それぞれ、24 hrインキュベート後の細胞生存率 及び48 hrインキュベート後の細胞生存率を表す（エラーバー: 標準偏差）。
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００９−０６５２８７号明細書（２００９年３月１７日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．電荷調節剤
本発明の電荷調節剤は、前述の通り、下記式（I）で示される化合物又はその誘導体を含むことを特徴とするものである。
上記式（I）中、Ra及びRbは、それぞれ互いに独立して、水素原子、又は置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、複素環基、複素環アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基若しくはアリールオキシ基を表す。また、RaとRbとが結合し、それぞれが結合している炭素原子と共に芳香環又はシクロアルキル環を形成していてもよい。また、式（I）中、Ra及びRbがそれぞれ結合している炭素原子間の結合は、単結合であってもよいし二重結合であってもよく、限定はされない。式（I）においては、両結合様式を合わせて示すために、当該炭素原子間は一本の実線ともう一本の破線で表している。
上記式（I）の化合物は、具体的には、下記式（Ia）〜（Ig）で示される化合物が好ましく挙げられ、中でも、式（Ib）及び（Ic）で示される化合物がより好ましく、さらに好ましくは式（Ic）で示される化合物である。
本発明の電荷調節剤は、塩基性又は中性タンパク質の全体としての電荷を酸性タンパク質の電荷に変換するものである。換言すれば、本発明の電荷調節剤は、総荷電がプラス（＋）側又はニュートラルな状態にあるタンパク質を、総荷電がマイナス（−）側にあるタンパク質となるように、電荷量をコントロールして、総荷電の変換を行うものであると言える。上記総荷電の変換は、具体的には、前記式（I）で示される化合物又はその誘導体が、タンパク質に含まれるアミノ基（プラス荷電を有する基）と結合し、タンパク質全体をマイナス荷電にすることにより行われることが好ましい。
当該結合は、例えば、前記式（I）で示される化合物と、タンパク質中のアミノ基とが結合（共有結合）して、下記式（I’）に示されるような構造をとることでなされる。
当該結合に関しては、例えば、前記式（I）で示される化合物が前記式（Ib）及び（Ic）で示される化合物である場合、当該結合後の上記式（I’）に示される構造としては、以下の通りとなる。
本発明の電荷調節剤は、例えば、総荷電の変換の対象となるタンパク質と水溶液中で混合するのみで、上述した結合を形成させることができるが、結合反応の手法は特に限定はされない。
また、上記結合については、例えば、弱酸性のpH環境下（細胞のエンドソーム内等）において結合が切れるため、これにより、総荷電の変換の対象となったタンパク質は再度もとの総荷電に戻り、その構造及び活性等が再生することになる。
２．ポリイオンコンプレックス
本発明のポリイオンコンプレックス（PIC）は、特定のカチオン性高分子（ホモポリマー、ブロックコポリマー、グラフトコポリマー）と、前述した本発明の荷電調節剤により処理されたタンパク質（詳しくは後述する）とを含むことを特徴とする、ミセル状のタンパク質内包高分子ミセル複合体である。
(1) カチオン性高分子
本発明のPICの構成成分である特定のカチオン性高分子は、少なくとも一部にポリカチオン部分を有するカチオン性高分子である。当該カチオン性高分子は、ポリカチオン部分のみからなるポリマー（ホモポリマー）であってもよいし、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）部分及びポリカチオン部分を有するブロックコポリマー又はグラフトポリマーであってよく、限定はされず、本発明のPICの用途等によって適宜好ましい態様を選択することができる。
上記PEG及びポリカチオンとしては、その構造（例えば重合度等）は限定されず、任意の構造のものを選択できるが、なかでもポリカチオンとしては、カチオン性基を側鎖に有するポリペプチドであることが好ましい。なお、ここで言うカチオン性基とは、水素イオンが配位して既にカチオンとなっている基に限らず、水素イオンが配位すればカチオンとなる基も含む意味である。このようなカチオン性基としては、公知のものが全て含まれる。カチオン性基を側鎖に有するポリペプチドとは、塩基性側鎖を有する公知のアミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン等）がペプチド結合してなるもののほか、各種アミノ酸がペプチド結合し、その側鎖（例えばアスパラギン酸やグルタミン酸の側鎖）がカチオン性基を有するように置換されたものも含む。
上記特定のカチオン性高分子としては、具体的には、例えば、下記一般式(1)で示されるブロックコポリマーが好ましく挙げられる。
ここで、一般式(1)の構造式中、繰り返し単位数（重合度）がnのブロック部分がPEG部分であり、繰り返し単位数がm1の部分とm2の部分とm3の部分とを合わせたブロック部分（一般式(1)中、[ ] 内に示された部分）がポリカチオン部分である。また、ポリカチオン部分の構造中式中の「/」の表記は、その左右に示された各モノマー単位の配列順序が任意であることを意味する。例えば、Ａ及びＢというモノマー単位から構成されるブロック部分が、[-(Ａ)a-/-(Ｂ)b-/-(Ｃ)c-]と表記されている場合は、ａ個のＡとｂ個のＢとｃ個のＣとからなる合計(ａ+ｂ＋ｃ)個の各モノマー単位が、ランダムにどのような並び順で連結していてもよいことを意味する（但し、すべてのＡ、Ｂ及びＣは直鎖状に連結している。）。
一般式(1)中、R1及びR2は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表す。
上記炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基、デシル基及びウンデシル基等が挙げられる。
また上記アルキル基の置換基としては、例えば、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、炭素数２〜７のアシルアミド基、シロキシ基、シリルアミノ基、及びトリアルキルシロキシ基（各アルキルシロキシ基は、それぞれ独立に、炭素数１〜６である）等が挙げられる。
上記置換基がアセタール化ホルミル基である場合、酸性の温和な条件下で加水分解することにより、他の置換基であるホルミル基（アルデヒド基；-CHO）に転化することができる。また、上記置換基（特にR1における置換基）がホルミル基、又はカルボキシル基若しくはアミノ基の場合は、例えば、これらの基を介して、抗体若しくはその断片又はその他の機能性若しくは標的指向性を有するタンパク質等を結合させることができる。
一般式(1)中、カチオン性基を含む部分となるR3及びR4は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表す。-R3基及び-R4基としては、例えば、下記一般式(2)又は下記一般式(3)で示される基が挙げられ、中でも下記一般式(3)で示される基が好ましい。
-NH-(CH2)r-X1 (2)
〔式(2)中、X1は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、rは0〜5の整数を表す。〕
-〔NH-(CH2)s〕t -X2 (3)
〔式(3)中、X2は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。s及びtは、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH2)s〕ユニット間で独立して、sは1〜5（好ましくは2）の整数を表し、tは2〜5（好ましくは2）の整数を表す。〕
一般式(2)及び(3)中、末端の-X1基及び-X2基（アミン化合物残基）としては、例えば、-NH2、-NH-CH3、-N(CH3)2、及び下記式(i)〜(viii)に示される基等が好ましく挙げられ、中でも-NH2が特に好ましい。なお、下記式(vi)中、Yとしては、例えば、水素原子、アルキル基（炭素数１〜６）、及びアミノアルキル基（炭素数１〜６）等が挙げられる。
一般式(1)中、-R3基及び-R4基としては、具体的には「-NH-NH2 」又は「-NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2 」が特に好ましく、中でもエチレンジアンミンユニットを含む後者がより好ましい。なお、上記「-NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2 」は、pKaが6.0及び9.5という２段階を示し、コンプレックスを形成するpH 7.4では、gauche型のシングルプロトン化状態であるので（下記反応式１参照）、内包するタンパク質と静電的相互作用をすることができる。一方、エンドソーム内（pH 5.5）では、上記「-NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2 」は、さらにプロトン化され、anti型に変化するので（下記反応式１参照）、バッファー効果によるエンドソームエスケープを促進させる効果を有する。
一般式(1)中、リンカー部分となるL1は、NH、CO、下記一般式(4)：
-(CH2)p1-NH- (4)
〔式(4)中、p1は1〜6（好ましくは2〜3）の整数を表す。〕
で示される基、又は下記一般式(5)：
-L2a-(CH2)q1-L3a- (5)
〔式(5)中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜6（好ましくは2〜3）の整数を表す。〕
で示される基を表す。
一般式(1)中、nは、PEG部分の繰り返し単位の数（重合度）を表し、具体的には、0〜500（好ましくは100〜400、より好ましくは200〜300）の整数を表す。
また、ポリカチオン部分を構成する各モノマー単位の重合度であるm1、m2及びm3については、それぞれ互いに独立して、0〜500（好ましくは0〜100、より好ましくは10〜100、さらに好ましくは20〜100、さらにより好ましくは30〜100）の整数を表す（但し、m1、m2及びm3の合計（m1+m2+m3）は、10〜500（好ましくは10〜300、より好ましくは20〜200、さらに好ましくは30〜150、さらに好ましくは40〜120、さらにより好ましくは50〜100、特に好ましくは60〜70）である。）。
さらに、ポリカチオン部分の側鎖中のメチレン基(-CH2-)の繰り返し単位数については、m4は1〜10（好ましくは1〜5、より好ましくは3〜4、さらに好ましくは1〜2）の整数を表し、m5は1〜10（好ましくは1〜5、より好ましくは3〜4、さらに好ましくは1〜2）の整数を表す。
以上より、一般式(1)で示されるカチオン性高分子は、以下の２つのブロック部分から構成されるポリマーであると言える。
・内包するタンパク質と静電結合する側鎖を持つブロック部分（側鎖にカチオン性基を有する重合度「m1+m2+m3」のブロック部分：ポリカチオン部分）
・親水性であり生体適合性に優れたポリエチレングリコール(PEG)鎖からなるブロック部分（重合度nのブロック部分：PEG部分）
一般式(1)で示されるカチオン性高分子の分子量（Mw）は、限定はされないが、23,000〜45,000であることが好ましく、より好ましくは28,000〜34,000である。また、個々のブロック部分については、PEG部分の分子量（Mw）は、8,000〜15,000であることが好ましく、より好ましくは10,000〜12,000であり、ポリカチオン部分の分子量（Mw）は、全体で15,000〜30,000であることが好ましく、より好ましくは18,000〜22,000である。
一般式(1)で示されるカチオン性高分子の製造方法は、限定はされないが、例えば、R1とPEG鎖のブロック部分とを含むセグメント（PEGセグメント）を予め合成しておき、このPEGセグメントの片末端（R1と反対の末端）に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖をカチオン性基を含むように置換又は変換する方法、あるいは、上記PEGセグメントと、カチオン性基を含む側鎖を有するブロック部分とを予め合成しておき、これらを互いに連結する方法などが挙げられる。当該製法における各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し適宜選択又は設定することができる。
上記PEGセグメントは、例えば、WO 96/32434号公報、WO 96/33233号公報及びWO 97/06202号公報等に記載のブロックコポリマーのPEGセグメント部分の製法を用いて調製することができる。PEGセグメントのうち-R1基と反対側の末端は、一般式(1)において「-L1」となる部分であり、-NH2、-COOH、下記一般式(6)：
-(CH2)p2-NH2 (6)
〔式(6)中、p2は1〜5（好ましくは2〜3）の整数を表す。〕
で示される基、又は一般式(7)：
-L2b-(CH2)q2-L3b (7)
〔式(7)中、L2bは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3bは、NH2又はCOOHを表す。q2は1〜6（好ましくは2〜3）の整数を表す。〕
で示される基であることが好ましい。
一般式(1)で示されるカチオン性高分子の具体的な製造方法としては、例えば、末端にアミノ基を有するPEGセグメント誘導体を用いて、そのアミノ末端に、β-ベンジル-L-アスパルテート（BLA）及びNε-Z-L-リシン等の保護アミノ酸のN-カルボン酸無水物（NCA）を重合させてブロックコポリマーを合成し、その後、各ブロック部分の側鎖が前述したカチオン性基を有する側鎖となるように、ジエチレントリアミン（DET）等で置換又は変換する方法が挙げられる。
(2) 荷電変換タンパク質
本発明のPICにおいて、コア部分の構成成分となるタンパク質としては、前述した本発明の電荷調節剤により全体としての電荷が変換されたタンパク質（荷電変換タンパク質）であればよく、具体的には、総荷電が、塩基性又は中性タンパク質の総荷電（プラス側又はニュートラルな状態）から酸性タンパク質の総荷電と同様にマイナス側となるように変換されたタンパク質であればよい。総荷電がマイナス側となるように変換されたタンパク質は、タンパク質全体としてはアニオン性の物質（ポリアニオン）であると言える。従って、前記カチオン性高分子中のポリカチオン部分との静電的相互作用により、もともと塩基性又は中性タンパク質では困難であったミセル状複合体を容易に形成することができる。
本発明に用いるタンパク質の種類としては、もともと塩基性又は中性タンパク質に含まれるものであればよく、限定はされない。本発明に用いるタンパク質は、単純タンパク質以外にも、糖タンパク質及び脂質タンパク質等も包含する。また、本発明に用いるタンパク質は、全長アミノ酸配列からなるものに限らず、その部分断片及びペプチド等も包含し、さらには、二分子（二量体）以上からなるタンパク質や、その部分配列又は全長配列どうしの融合タンパク質も包含する。また、本発明に用いるタンパク質は、天然アミノ酸から構成されているものに限定はされず、少なくとも一部に非天然アミノ酸を構成成分として含む修飾タンパク質も包含する。さらに、本発明に用いるタンパク質は、必要に応じて、適宜、各種標識物質等を付加したものも包含する。
本発明に用いるタンパク質の具体例としては、例えば、各種酵素、又は抗体（例えば、核膜孔複合体に対する抗体等）若しくは抗体断片等が挙げられる。ここで、抗体断片としては、限定はされないが、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2（(Fab’)2と表記することもある）、Fv（variable fragment of antibody）、一本鎖抗体（H鎖、L鎖、H鎖V領域、及びL鎖V領域等）、scFv、diabody（scFv二量体）、dsFv（ジスルフィド安定化V領域）、並びに、相補性決定領域（complementarity determining region：CDR）を少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。以下、抗体断片の調製について概要を述べる。
Fabは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、H鎖のN末端側約半分とL鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、抗体のFabをコードするDNAを、原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Fabを製造することもできる。
F(ab')2は、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、後述するFabをチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させて、作製することもできる。
Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した、分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、抗体のFab'断片をコードするDNAを、原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Fab'を製造することもできる。
scFvは、１本のH鎖V領域（VH）と１本のL鎖V領域（VL）とを適当なペプチドリンカー（P）を用いて連結した、VH-P-VLないしはVL-P-VHポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。scFvは、抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築して、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
diabodyは、scFvが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。diabodyは、抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAをPのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築して、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
dsFvは、VHおよびVL中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は、Reiterらにより示された方法（Protein Engineering, vol. 7, p. 697-704, 1994）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。dsFvは、抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築して、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
CDRを含むペプチドは、VH又はVLのCDRの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のCDRを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。CDRを含むペプチドは、抗体のVHおよびVLのCDRをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入して、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）及びtBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
本発明に用いる荷電変換タンパク質は、前述した式（I）で示される化合物又はその誘導体が、当該タンパク質に含まれるアミノ基と結合したものである。当該結合に関しては、前記１.項における説明が同様に適用できる。
前述したように、荷電変換タンパク質分子はポリアニオンとなるため、カチオン性高分子のポリカチオン部分の側鎖と静電的相互作用により結合することができる。
なお本発明においては、必要に応じ、上記荷電変換タンパク質と共に、細胞内で機能発現する様々な物質をコア部分に含有させることもできる。例えば、高分子量又は低分子量の「アニオン性物質」を用いることができ、具体的には、ペプチドホルモン、タンパク質、酵素及び核酸（DNA、RNA又はPNA）等の高分子物質、あるいは分子内に荷電性官能基を有する低分子物質（水溶性化合物）等が挙げられる。なお、当該アニオン性物質としては、複数の異なる帯電状態の官能基（アニオン性基及びカチオン性基）を有する分子について、pHを変化させることにより分子全体としての帯電状態をアニオン性に変化させることができるものも含む。これらアニオン性物質は、１種のみ用いてもよいし２種以上を併用してもよく、限定はされない。
(3) ポリイオンコンプレックス（PIC）
本発明のPICは、荷電変換タンパク質と、上述したカチオン性高分子中の一部（ポリカチオン部分）とが静電的相互作用をしてコア部分を形成し、当該カチオン性高分子中の他の部分（PEG部分を含む部分）がコア部分の周囲にシェル部分を形成したような状態の、コア−シェル型のミセル状複合体ということができる。
本発明のPICは、例えば、荷電変換タンパク質とカチオン性高分子とを任意のバッファー（例えばTrisバッファー等）中で混合することにより容易に調製することができる。
カチオン性高分子と荷電変換タンパク質との混合比は、限定はされないが、本発明においては、例えば、ブロックコポリマー中のカチオン性基（例えばアミノ基）の総数（N）と、荷電変換タンパク質中のカルボキシル基の総数（C）との比（N/C比）を、0.1〜200とすることができ、また0.5〜100としてもよく、さらに1〜50としてもよい。N/C比が上記範囲のときは、遊離のカチオン性高分子を低減できる等の点で好ましい。なお、上記カチオン性基（N）は、ミセルに内包する荷電変換タンパク質中のカルボキシル基と、静電的に相互作用してイオン結合を形成することができる基を意味する。
本発明のPICの大きさは、限定はされないが、例えば、動的光散乱測定法（DLS）による粒径が5〜200 nmであることが好ましく、より好ましくは10〜100 nmである。
本発明のPICは、細胞内に導入された後、内包していた前記荷電変換タンパク質を放出するが、この際、細胞質内におけるpH環境の変化（弱酸性環境下（例えばpH 5.5程度）に変化）の影響により、前記式（I）で示される化合物又はその誘導体が当該タンパク質から解離する（結合が切れる）。これにより、当該タンパク質の全体としての電荷（総荷電）が、当該タンパク質がもともと有する固有の電荷（総荷電）に回復するため、導入した細胞内においては、当該タンパク質をその構造及び活性等が再生した状態で存在させることができる。
３．タンパク質送達デバイス
本発明においては、上述したポリイオンコンプレックス（PIC）を含むタンパク質送達デバイスが提供される。本発明のタンパク質送達デバイスは、細胞内外の酸化還元環境の変化を利用し、PICのコア部分に内包した所望のタンパク質（電荷変換タンパク質）を、標的細胞内に効率的に導入する手段として使用できる。
具体的には、所望のタンパク質を内包したPICを含む溶液を被験動物に投与して、体内の標的細胞に取り込ませる。その後、細胞内に取り込まれたPICがエンドソームに到達すると、電荷調節剤がタンパク質より脱離し、PIC内の電荷のバランスが変化することによってPICが崩壊する。PICが崩壊すると、PICからタンパク質がリリースされ、それと同時にPICから解離したポリマーがエンドソーム膜を傷害する。それによってエンドソームが破壊されるために、リリースしたタンパク質の細胞質内へのデリバリーが達成される（図６参照）。
本発明のタンパク質送達デバイスは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ及びネコ等の各種哺乳動物に適用することができ、限定はされない。被験動物への投与方法は、通常、点滴静注などの非経口用法が採用され、投与量、投与回数及び投与期間などの各条件は、被験動物の種類及び状態に合わせて適宜設定することができる。
本発明のタンパク質送達デバイスは、各種疾患の原因となる細胞に所望のタンパク質を導入する治療（例えば、酵素補充療法や、抗体を用いた免疫治療等）に用いることができる。よって本発明は、前述したPICを含む医薬組成物（例えば、酵素補充療法用や免疫治療用等の医薬組成物）、及び、前述したPICを用いる各種疾患の治療方法（例えば、酵素補充療法や、抗体を用いた免疫治療法等）を提供することもできる。なお、投与の方法及び条件は前記と同様である。
上記医薬組成物については、薬剤製造上一般に用いられる賦形材、充填材、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。また、医薬組成物の形態は、通常、静脈内注射剤（点滴を含む）が採用され、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態等で提供される。
４．タンパク質送達用キット
本発明のタンパク質送達用キットは、前記特定のカチオン性高分子、及び前述した本発明の電荷調節剤を含むことを特徴とするものである。当該キットは、例えば、酵素補充療法や抗体を用いた免疫治療方法等の所望のタンパク質を用いた各種治療方法などに好ましく用いることができる。
本発明のキットにおいて、カチオン性高分子の保存状態は、限定はされず、その安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して溶液状又は粉末状等の状態を選択できる。
本発明のキットは、前記特定のカチオン性高分子及び電荷調節剤以外に、他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては、例えば、各種バッファー、細胞内に導入する各種タンパク質（電荷変換タンパク質）、溶解用バッファー及び使用説明書（使用マニュアル）等を挙げることができる。
本発明のキットは、標的細胞内に導入する所望のタンパク質をコア部分としたポリイオンコンプレックス（PIC）を調製するために使用され、調製したPICは、標的細胞へのタンパク質送達デバイスとして有効に用いることができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００９−０６５２８７号明細書（２００９年３月１７日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．電荷調節剤
本発明の電荷調節剤は、前述の通り、下記式（I）で示される化合物又はその誘導体を含むことを特徴とするものである。
上記式（I）の化合物は、具体的には、下記式（Ia）〜（Ig）で示される化合物が好ましく挙げられ、中でも、式（Ib）及び（Ic）で示される化合物がより好ましく、さらに好ましくは式（Ic）で示される化合物である。
当該結合は、例えば、前記式（I）で示される化合物と、タンパク質中のアミノ基とが結合（共有結合）して、下記式（I’）に示されるような構造をとることでなされる。
また、上記結合については、例えば、弱酸性のpH環境下（細胞のエンドソーム内等）において結合が切れるため、これにより、総荷電の変換の対象となったタンパク質は再度もとの総荷電に戻り、その構造及び活性等が再生することになる。
２．ポリイオンコンプレックス
本発明のポリイオンコンプレックス（PIC）は、特定のカチオン性高分子（ホモポリマー、ブロックコポリマー、グラフトコポリマー）と、前述した本発明の荷電調節剤により処理されたタンパク質（詳しくは後述する）とを含むことを特徴とする、ミセル状のタンパク質内包高分子ミセル複合体である。
(1) カチオン性高分子
本発明のPICの構成成分である特定のカチオン性高分子は、少なくとも一部にポリカチオン部分を有するカチオン性高分子である。当該カチオン性高分子は、ポリカチオン部分のみからなるポリマー（ホモポリマー）であってもよいし、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）部分及びポリカチオン部分を有するブロックコポリマー又はグラフトポリマーであってよく、限定はされず、本発明のPICの用途等によって適宜好ましい態様を選択することができる。
上記PEG及びポリカチオンとしては、その構造（例えば重合度等）は限定されず、任意の構造のものを選択できるが、なかでもポリカチオンとしては、カチオン性基を側鎖に有するポリペプチドであることが好ましい。なお、ここで言うカチオン性基とは、水素イオンが配位して既にカチオンとなっている基に限らず、水素イオンが配位すればカチオンとなる基も含む意味である。このようなカチオン性基としては、公知のものが全て含まれる。カチオン性基を側鎖に有するポリペプチドとは、塩基性側鎖を有する公知のアミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン等）がペプチド結合してなるもののほか、各種アミノ酸がペプチド結合し、その側鎖（例えばアスパラギン酸やグルタミン酸の側鎖）がカチオン性基を有するように置換されたものも含む。
上記特定のカチオン性高分子としては、具体的には、例えば、下記一般式(1)で示されるブロックコポリマーが好ましく挙げられる。
一般式(1)中、R1及びR2は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表す。
上記炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基、デシル基及びウンデシル基等が挙げられる。
また上記アルキル基の置換基としては、例えば、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、炭素数２〜７のアシルアミド基、シロキシ基、シリルアミノ基、及びトリアルキルシロキシ基（各アルキルシロキシ基は、それぞれ独立に、炭素数１〜６である）等が挙げられる。
上記置換基がアセタール化ホルミル基である場合、酸性の温和な条件下で加水分解することにより、他の置換基であるホルミル基（アルデヒド基；-CHO）に転化することができる。また、上記置換基（特にR1における置換基）がホルミル基、又はカルボキシル基若しくはアミノ基の場合は、例えば、これらの基を介して、抗体若しくはその断片又はその他の機能性若しくは標的指向性を有するタンパク質等を結合させることができる。
一般式(1)中、カチオン性基を含む部分となるR3及びR4は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表す。-R3基及び-R4基としては、例えば、下記一般式(2)又は下記一般式(3)で示される基が挙げられ、中でも下記一般式(3)で示される基が好ましい。
-NH-(CH2)r-X1 (2)
〔式(2)中、X1は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、rは0〜5の整数を表す。〕
-〔NH-(CH2)s〕t -X2 (3)
〔式(3)中、X2は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。s及びtは、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH2)s〕ユニット間で独立して、sは1〜5（好ましくは2）の整数を表し、tは2〜5（好ましくは2）の整数を表す。〕
一般式(2)及び(3)中、末端の-X1基及び-X2基（アミン化合物残基）としては、例えば、-NH2、-NH-CH3、-N(CH3)2、及び下記式(i)〜(viii)に示される基等が好ましく挙げられ、中でも-NH2が特に好ましい。なお、下記式(vi)中、Yとしては、例えば、水素原子、アルキル基（炭素数１〜６）、及びアミノアルキル基（炭素数１〜６）等が挙げられる。
-(CH2)p1-NH- (4)
〔式(4)中、p1は1〜6（好ましくは2〜3）の整数を表す。〕
で示される基、又は下記一般式(5)：
-L2a-(CH2)q1-L3a- (5)
〔式(5)中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜6（好ましくは2〜3）の整数を表す。〕
で示される基を表す。
一般式(1)中、nは、PEG部分の繰り返し単位の数（重合度）を表し、具体的には、0〜500（好ましくは100〜400、より好ましくは200〜300）の整数を表す。
また、ポリカチオン部分を構成する各モノマー単位の重合度であるm1、m2及びm3については、それぞれ互いに独立して、0〜500（好ましくは0〜100、より好ましくは10〜100、さらに好ましくは20〜100、さらにより好ましくは30〜100）の整数を表す（但し、m1、m2及びm3の合計（m1+m2+m3）は、10〜500（好ましくは10〜300、より好ましくは20〜200、さらに好ましくは30〜150、さらに好ましくは40〜120、さらにより好ましくは50〜100、特に好ましくは60〜70）である。）。
さらに、ポリカチオン部分の側鎖中のメチレン基(-CH2-)の繰り返し単位数については、m4は1〜10（好ましくは1〜5、より好ましくは3〜4、さらに好ましくは1〜2）の整数を表し、m5は1〜10（好ましくは1〜5、より好ましくは3〜4、さらに好ましくは1〜2）の整数を表す。
以上より、一般式(1)で示されるカチオン性高分子は、以下の２つのブロック部分から構成されるポリマーであると言える。
・内包するタンパク質と静電結合する側鎖を持つブロック部分（側鎖にカチオン性基を有する重合度「m1+m2+m3」のブロック部分：ポリカチオン部分）
・親水性であり生体適合性に優れたポリエチレングリコール(PEG)鎖からなるブロック部分（重合度nのブロック部分：PEG部分）
一般式(1)で示されるカチオン性高分子の分子量（Mw）は、限定はされないが、23,000〜45,000であることが好ましく、より好ましくは28,000〜34,000である。また、個々のブロック部分については、PEG部分の分子量（Mw）は、8,000〜15,000であることが好ましく、より好ましくは10,000〜12,000であり、ポリカチオン部分の分子量（Mw）は、全体で15,000〜30,000であることが好ましく、より好ましくは18,000〜22,000である。
一般式(1)で示されるカチオン性高分子の製造方法は、限定はされないが、例えば、R1とPEG鎖のブロック部分とを含むセグメント（PEGセグメント）を予め合成しておき、このPEGセグメントの片末端（R1と反対の末端）に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖をカチオン性基を含むように置換又は変換する方法、あるいは、上記PEGセグメントと、カチオン性基を含む側鎖を有するブロック部分とを予め合成しておき、これらを互いに連結する方法などが挙げられる。当該製法における各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し適宜選択又は設定することができる。
上記PEGセグメントは、例えば、WO 96/32434号公報、WO 96/33233号公報及びWO 97/06202号公報等に記載のブロックコポリマーのPEGセグメント部分の製法を用いて調製することができる。PEGセグメントのうち-R1基と反対側の末端は、一般式(1)において「-L1」となる部分であり、-NH2、-COOH、下記一般式(6)：
-(CH2)p2-NH2 (6)
〔式(6)中、p2は1〜5（好ましくは2〜3）の整数を表す。〕
で示される基、又は一般式(7)：
-L2b-(CH2)q2-L3b (7)
〔式(7)中、L2bは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3bは、NH2又はCOOHを表す。q2は1〜6（好ましくは2〜3）の整数を表す。〕
で示される基であることが好ましい。
一般式(1)で示されるカチオン性高分子の具体的な製造方法としては、例えば、末端にアミノ基を有するPEGセグメント誘導体を用いて、そのアミノ末端に、β-ベンジル-L-アスパルテート（BLA）及びNε-Z-L-リシン等の保護アミノ酸のN-カルボン酸無水物（NCA）を重合させてブロックコポリマーを合成し、その後、各ブロック部分の側鎖が前述したカチオン性基を有する側鎖となるように、ジエチレントリアミン（DET）等で置換又は変換する方法が挙げられる。
(2) 荷電変換タンパク質
本発明のPICにおいて、コア部分の構成成分となるタンパク質としては、前述した本発明の電荷調節剤により全体としての電荷が変換されたタンパク質（荷電変換タンパク質）であればよく、具体的には、総荷電が、塩基性又は中性タンパク質の総荷電（プラス側又はニュートラルな状態）から酸性タンパク質の総荷電と同様にマイナス側となるように変換されたタンパク質であればよい。総荷電がマイナス側となるように変換されたタンパク質は、タンパク質全体としてはアニオン性の物質（ポリアニオン）であると言える。従って、前記カチオン性高分子中のポリカチオン部分との静電的相互作用により、もともと塩基性又は中性タンパク質では困難であったミセル状複合体を容易に形成することができる。
本発明に用いるタンパク質の種類としては、もともと塩基性又は中性タンパク質に含まれるものであればよく、限定はされない。本発明に用いるタンパク質は、単純タンパク質以外にも、糖タンパク質及び脂質タンパク質等も包含する。また、本発明に用いるタンパク質は、全長アミノ酸配列からなるものに限らず、その部分断片及びペプチド等も包含し、さらには、二分子（二量体）以上からなるタンパク質や、その部分配列又は全長配列どうしの融合タンパク質も包含する。また、本発明に用いるタンパク質は、天然アミノ酸から構成されているものに限定はされず、少なくとも一部に非天然アミノ酸を構成成分として含む修飾タンパク質も包含する。さらに、本発明に用いるタンパク質は、必要に応じて、適宜、各種標識物質等を付加したものも包含する。
本発明に用いるタンパク質の具体例としては、例えば、各種酵素、又は抗体（例えば、核膜孔複合体に対する抗体等）若しくは抗体断片等が挙げられる。ここで、抗体断片としては、限定はされないが、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2（(Fab’)2と表記することもある）、Fv（variable fragment of antibody）、一本鎖抗体（H鎖、L鎖、H鎖V領域、及びL鎖V領域等）、scFv、diabody（scFv二量体）、dsFv（ジスルフィド安定化V領域）、並びに、相補性決定領域（complementarity determining region：CDR）を少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。以下、抗体断片の調製について概要を述べる。
Fabは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、H鎖のN末端側約半分とL鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、抗体のFabをコードするDNAを、原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Fabを製造することもできる。
F(ab')2は、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、後述するFabをチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させて、作製することもできる。
Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した、分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、抗体のFab'断片をコードするDNAを、原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Fab'を製造することもできる。
scFvは、１本のH鎖V領域（VH）と１本のL鎖V領域（VL）とを適当なペプチドリンカー（P）を用いて連結した、VH-P-VLないしはVL-P-VHポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。scFvは、抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築して、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
diabodyは、scFvが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。diabodyは、抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAをPのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築して、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
dsFvは、VHおよびVL中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は、Reiterらにより示された方法（Protein Engineering, vol. 7, p. 697-704, 1994）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。dsFvは、抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築して、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
CDRを含むペプチドは、VH又はVLのCDRの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のCDRを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。CDRを含むペプチドは、抗体のVHおよびVLのCDRをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入して、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）及びtBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
本発明に用いる荷電変換タンパク質は、前述した式（I）で示される化合物又はその誘導体が、当該タンパク質に含まれるアミノ基と結合したものである。当該結合に関しては、前記１.項における説明が同様に適用できる。
前述したように、荷電変換タンパク質分子はポリアニオンとなるため、カチオン性高分子のポリカチオン部分の側鎖と静電的相互作用により結合することができる。
なお本発明においては、必要に応じ、上記荷電変換タンパク質と共に、細胞内で機能発現する様々な物質をコア部分に含有させることもできる。例えば、高分子量又は低分子量の「アニオン性物質」を用いることができ、具体的には、ペプチドホルモン、タンパク質、酵素及び核酸（DNA、RNA又はPNA）等の高分子物質、あるいは分子内に荷電性官能基を有する低分子物質（水溶性化合物）等が挙げられる。なお、当該アニオン性物質としては、複数の異なる帯電状態の官能基（アニオン性基及びカチオン性基）を有する分子について、pHを変化させることにより分子全体としての帯電状態をアニオン性に変化させることができるものも含む。これらアニオン性物質は、１種のみ用いてもよいし２種以上を併用してもよく、限定はされない。
(3) ポリイオンコンプレックス（PIC）
本発明のPICは、荷電変換タンパク質と、上述したカチオン性高分子中の一部（ポリカチオン部分）とが静電的相互作用をしてコア部分を形成し、当該カチオン性高分子中の他の部分（PEG部分を含む部分）がコア部分の周囲にシェル部分を形成したような状態の、コア−シェル型のミセル状複合体ということができる。
本発明のPICは、例えば、荷電変換タンパク質とカチオン性高分子とを任意のバッファー（例えばTrisバッファー等）中で混合することにより容易に調製することができる。
カチオン性高分子と荷電変換タンパク質との混合比は、限定はされないが、本発明においては、例えば、ブロックコポリマー中のカチオン性基（例えばアミノ基）の総数（N）と、荷電変換タンパク質中のカルボキシル基の総数（C）との比（N/C比）を、0.1〜200とすることができ、また0.5〜100としてもよく、さらに1〜50としてもよい。N/C比が上記範囲のときは、遊離のカチオン性高分子を低減できる等の点で好ましい。なお、上記カチオン性基（N）は、ミセルに内包する荷電変換タンパク質中のカルボキシル基と、静電的に相互作用してイオン結合を形成することができる基を意味する。
本発明のPICの大きさは、限定はされないが、例えば、動的光散乱測定法（DLS）による粒径が5〜200 nmであることが好ましく、より好ましくは10〜100 nmである。
本発明のPICは、細胞内に導入された後、内包していた前記荷電変換タンパク質を放出するが、この際、細胞質内におけるpH環境の変化（弱酸性環境下（例えばpH 5.5程度）に変化）の影響により、前記式（I）で示される化合物又はその誘導体が当該タンパク質から解離する（結合が切れる）。これにより、当該タンパク質の全体としての電荷（総荷電）が、当該タンパク質がもともと有する固有の電荷（総荷電）に回復するため、導入した細胞内においては、当該タンパク質をその構造及び活性等が再生した状態で存在させることができる。
３．タンパク質送達デバイス
本発明においては、上述したポリイオンコンプレックス（PIC）を含むタンパク質送達デバイスが提供される。本発明のタンパク質送達デバイスは、細胞内外の酸化還元環境の変化を利用し、PICのコア部分に内包した所望のタンパク質（電荷変換タンパク質）を、標的細胞内に効率的に導入する手段として使用できる。
具体的には、所望のタンパク質を内包したPICを含む溶液を被験動物に投与して、体内の標的細胞に取り込ませる。その後、細胞内に取り込まれたPICがエンドソームに到達すると、電荷調節剤がタンパク質より脱離し、PIC内の電荷のバランスが変化することによってPICが崩壊する。PICが崩壊すると、PICからタンパク質がリリースされ、それと同時にPICから解離したポリマーがエンドソーム膜を傷害する。それによってエンドソームが破壊されるために、リリースしたタンパク質の細胞質内へのデリバリーが達成される（図６参照）。
本発明のタンパク質送達デバイスは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ及びネコ等の各種哺乳動物に適用することができ、限定はされない。被験動物への投与方法は、通常、点滴静注などの非経口用法が採用され、投与量、投与回数及び投与期間などの各条件は、被験動物の種類及び状態に合わせて適宜設定することができる。
本発明のタンパク質送達デバイスは、各種疾患の原因となる細胞に所望のタンパク質を導入する治療（例えば、酵素補充療法や、抗体を用いた免疫治療等）に用いることができる。よって本発明は、前述したPICを含む医薬組成物（例えば、酵素補充療法用や免疫治療用等の医薬組成物）、及び、前述したPICを用いる各種疾患の治療方法（例えば、酵素補充療法や、抗体を用いた免疫治療法等）を提供することもできる。なお、投与の方法及び条件は前記と同様である。
上記医薬組成物については、薬剤製造上一般に用いられる賦形材、充填材、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。また、医薬組成物の形態は、通常、静脈内注射剤（点滴を含む）が採用され、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態等で提供される。
４．タンパク質送達用キット
本発明のタンパク質送達用キットは、前記特定のカチオン性高分子、及び前述した本発明の電荷調節剤を含むことを特徴とするものである。当該キットは、例えば、酵素補充療法や抗体を用いた免疫治療方法等の所望のタンパク質を用いた各種治療方法などに好ましく用いることができる。
本発明のキットにおいて、カチオン性高分子の保存状態は、限定はされず、その安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して溶液状又は粉末状等の状態を選択できる。
本発明のキットは、前記特定のカチオン性高分子及び電荷調節剤以外に、他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては、例えば、各種バッファー、細胞内に導入する各種タンパク質（電荷変換タンパク質）、溶解用バッファー及び使用説明書（使用マニュアル）等を挙げることができる。
本発明のキットは、標的細胞内に導入する所望のタンパク質をコア部分としたポリイオンコンプレックス（PIC）を調製するために使用され、調製したPICは、標的細胞へのタンパク質送達デバイスとして有効に用いることができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．材料
・N,N-ジメチルホルムアミド (DMF) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Japan)
・ジクロロメタン (DCM) (Wako, Japan)
・エチレンジアミン (1,2-ジアミノエタン) (Tokyo Chemical Industry Co. Ltd, Japan)
・ジエチレントリアミン (ビス(2-アミノエチル)アミン) (Tokyo Chemical Industry Co. Ltd, Japan)は、購入後、使用前に再蒸留した。
・酢酸, 無水シトラコン酸, 無水コハク酸及び塩酸(Wako, Japan)は、購入後、さらに精製はせずに使用した。
・1-メチル-2-ピロリジノン (NMP) 及び無水シス−アコニット酸は、アルドリッチ(USA)から購入した。
・α-メトキシ-ω-アミノポリ(エチレングリコール) (分子量=12,000) 及びβ-ベンジル-L-アスパラギン酸-N-カルボキシ-無水物 (BLA-NCA)は、日油株式会社より入手した。
・ウマ心臓シトクロムcは、Calbiochem (USA)より入手した。
２．カチオン性高分子の合成
以下の手順により、PEG部分及びポリカチオン部分を有するカチオン性高分子として、PEG-pAsp(DET) (PEG-{N-[N’-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide})を合成した（下記スキーム１参照）。
（１）PEG-PBLA (PEG-poly(β-benzyl-L-aspartate))（スキーム１中のB）の合成
PEG-PBLAは、α-メトキシ-ω-アミノポリ(エチレングリコール)（スキーム１中のA）の末端アミノ基より開始されたBLA-NCAの開環重合により得られる。このPEG macro-initiator (500 mg; 0.0417 mmol)を、5 mLのDMF/DCM (1:10)に溶解した。8 mLのDMF/DCM (1:10)中のBLA-NCA溶液(780 mg; 3.13 mmol)を、PEG macro-initiatorの溶液に添加し、反応混合物を、アルゴン雰囲気下、35℃で48時間撹拌した。得られたポリマーはジエチルエーテル(150 mL)中に沈殿した。この沈殿物をジエチルエーテルで２回洗浄して、1.1 gの白色粉末を得た。PEG-PBLAの分子量測定のため、PEG-PBLAを0.5M NaOHを用いてPEG-pAspに転換した（Harada, A. and Kataoka, K., J. Am. Chem. Soc., 2003, vol. 125, p. 15306-15307）。変換されたPEG-pAspのGPCクロマトグラムは、単一モードであり、Mw/MnはPEG標品の検量線から1.01であると決定した。1H NMR測定から（下記参照）、BLAユニットの重合度(DP)は68であると計算された。すべてのNMRスペクトルは、JEOL EX 300 spectrometerを用いて300MHzで記録した。化学シフトは、テトラメチルシランによるppmダウンフィールドにおいて報告された。
1H NMR (CDCl3): δ2.63 - 3.05 (136H, COCHCH2COOCH2Ph), δ3.32 (3H, CH3OCH2CH2), δ3.55 (1092H, OCH2CH2O), δ4.23 (68H, COCHNH), δ5.06 (136H, COOCH2Ph), δ7.20 (340H, COOCH2Ph), δ8.79 (68H, COCHNH).
（２）PEG-pAsp(DET)（スキーム１中の1）の合成
上記(1)で得られたPEG-PBLA(300 mg; 0.802 mmolのベンジルエステル)を、NMP (10 mL)に溶解させた。この溶液にジエチレントリアミン(40.1 mmol)を添加し、反応混合物を10℃で2時間撹拌した。得られた溶液を、10%酢酸水溶液(30 mL)に滴下した。中和溶液を0.01M塩酸(× 3)及び蒸留水(× 3)に対して4℃で透析した。凍結乾燥後の塩酸塩として、白色粉末のPEG-pAsp(DET)を得た。1H NMR（下記参照）では、ベンジル基のピークは確認されなかった。
1H NMR (D2O): δ2.63 (272H, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2, COCH2CHCONHCH2CH2NHCH2CH2NH2 and COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ2.76 (136H, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2),δ2.94 (136H, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ3.20-3.50 (139H, CH3OCH2CH2 and COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ3.53 (1092H, OCH2CH2O), δ4.57 (68H, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2 and COCH2CHCONHCH2CH2NHCH2CH2NH2)
３．シトクロムcの改変（総荷電の変換）
ウマ心臓シトクロムc(10 mg)を、0.5 M NaHCO3バッファー (pH 9.0, 5 mL)に溶解し、4°Cで30分撹拌した後、無水シトラコン酸(104 mg)をゆっくりと添加した。2時間撹拌後、混合物を、Amicon Ultra (MWCO=10,000; Millipore (Billerica, MA)) (3倍量の蒸留水使用)により精製した。生成産物として、上記シトクロムcに無水シトラコン酸を結合させてシトラコン酸アミドを有するようにしたシトクロムc誘導体（Cyt-Cit）を、凍結乾燥後の赤色粉末として得た（図１参照）。また、無水シトラコン酸の代わりに、無水シス−アコニット酸及び無水コハク酸を使用した以外は同様にして、上記シトクロムcに無水シス−アコニット酸を結合させてシス−アコニット酸アミドを有するようにしたシトクロムc誘導体（Cyt-Aco）、及び上記シトクロムcに無水コハク酸を結合させてコハク酸アミドを有するようにしたシトクロムc誘導体（Cyt- Suc）を得た（図１参照）。
野生型のウマ心臓シトクロムc（CytC）と、得られたシトクロムc誘導体（Cyt-Cit、Cyt-Aco）について電荷密度等を測定した結果を、下記表１に示した。
なお、表１中の電荷密度はシトクロムcのアミノ酸配列より算出し、粒径及び多分散度(PDI: polydispersity index)はZetasizer Nano ZS (Malvem Instruments Ltd., Malvem, UK)を用いて25℃で測定した。
４．PICの調製
上記２.により得られたカチオン性高分子（PEG-pAsp(DET)）と上記３.により得られたシトクロムc誘導体（Cyt-Cit，Cyt-Aco）を用いて、以下の手順により、PICミセルを調製した。
シトクロムc誘導体(0.50 mg/mL)と、上記カチオン性高分子(1.0 mg/mL)とを、それぞれ蒸留水に溶解させた。得られた各溶液を0.1μmシリンジフィルターにより濾過した後、特定のN/C比（具体的にはN/C=2）となるように混合することにより、上記シトクロムc誘導体（Cyt-Cit，Cyt-Aco）を内包したPICミセルを得た。なお、以下の実施例においては、上記混合後の液に、適宜、酢酸バッファー(pH 5.5)又はリン酸バッファー(pH 7.4)が添加された。混合液中のNaClの最終濃度は150 mMとした。
得られたPICミセルについて、原子間力顕微鏡（AMF）(Nanoscope IIIa multimode, Nippon Veeco Co. Tokyo Japan)を用いて、PICミセルの形のイメージングを行った。また、動的光散乱法（DLS）（Zetasizer Nano-ZS (green badge, ZEN3500, Malvern, Ltd. Malvern, U. K.)；532 nmの緑色レーザーを搭載）による粒径測定を行った。これらの結果を図２に示した。
５．原子間力顕微鏡（AMF）によるPICミセルの観察（図２）
上記４.で得られたPICミセルの溶液(PBS, pH 7.4, 150 mM NaCl)を2μl分、シリコンウェハーディスク上に置いた。室温で10分間吸着させた後、フィルター用紙により余分な溶液を取り除いて、室温下で表面を乾燥させた。AMFのイメージモードはタッピングモードにし、励起周波数の範囲は7.8〜7.9 kHzとして、AMFによるPICミセルの観察を行った。その結果を図２に示した。
６．動的光散乱法（DLS）によるPICミセルの粒径測定（図２）
上記４.で得られたPICミセルの溶液を、シトクロムc誘導体（Cyt-Cit，Cyt-Aco）の含有割合が0.125 mg/mLとなるように調整した後、37℃でインキュベートした。動的光散乱法（DLS）によるPICミセルの粒径測定（粒径分布の測定）は、532 nmの緑色レーザーを搭載したZetasizer Nano-ZS (green badge, ZEN3500, Malvern, Ltd. Malvern, U. K.)を用いて行った。その結果を図２に示した。
７．シトクロムc誘導体（Cyt-Cit，Cyt-Aco）におけるシトラコン酸アミド及びシス−アコニット酸アミドの分解（図３）
シトラコン酸アミドの分解率は、Fluorescamine法により測定した。Fluorescamineは、アミンに反応する蛍光色素（最大蛍光波長：465 nm）である。リシン基の主要なアミンが、シトクロムc誘導体におけるシトラコン酸アミド及びシス−アコニット酸アミドの分解後に暴露されるため、分解率はインキュベーション前後の蛍光を比較することで算出し得た。分析には、Nanodrop（登録商標） ND-3300 fluorospectrometer (NanoDrop Technologies; Wilmington, DE)を使用した。
シトクロムc誘導体のいずれのサンプルも、約1 mg/mLの濃度で蒸留水に溶解した。このストック溶液100μLを、pH 5.5の酢酸バッファー(10 mM) 100μLと混合した。この溶液を、37℃でインキュベートし、各サンプル10μLを、1時間ごとに、100μLのジメチルスルホキシド(DMSO) (2% triethylamine (TEA))に希釈した。この混合物をDMF (5 mg/mL)中に10μLのFluorescamine溶液で添加し、室温で10分間インキュベートした。その蛍光を、465 nmの蛍光波長で測定した。励起光源はfluorospectrometerのUV光(365 nm〜400 nm)を用いた。シトクロムc誘導体を0.01 M HCl中で一晩インキュベートしたサンプルの蛍光から、暴露されたアミンの全て（100％）を測定した。また、ネガティブコントロールとしてのブランクバッファー溶液の蛍光から、アミンが存在しない場合（0％）を測定した。
以上の結果を図３に示した。
８．シトクロムc誘導体の蛍光標識
蛍光標識したシトクロムc誘導体（Cyt-Cit, Cyt-Aco, Cyt-Suc）は、PICミセルの崩壊の測定、及び細胞内送達の観察のために調製した。ウマ心臓シトクロムcを0.1 M NaHCO3 バッファー(pH 8.5)に溶解し、4℃で30分間撹拌した。この溶液に、Alexa-Fluor 488 carboxylic acid, succinimidyl ester (Invitrogen, USA)（シトクロムcの5倍量；DMSO中に10 mg/mL）を添加し、4℃で2時間撹拌した。この反応混合物を、Amicon Ultra (MWCO=10,000; Millipore (Billerica, MA)) (×3 with distilled water)を用いて精製した。蛍光標識したシトクロムc誘導体は、凍結乾燥後に得た。なお、シトクロムc誘導体（Cyt-Cit, Cyt-Aco, Cyt-Suc）は、前記３.において得られたものを用いた。
９．PICミセルの崩壊（解離）（図４）
PICミセルの崩壊率を、プローブ−プローブ 消光−発光法（probe-probe quenching-dequenching method）により測定した。Alexa-Fluorで標識したシトクロムc誘導体とPEG-pAsp(DET)とのPICミセルを、前記４.で記載したように調製した。総蛍光強度（I）は、フリーのシトクロムcの強度(If)と、PICミセル内のシトクロムc誘導体の強度(Im)との合計であると仮定したときに、以下の計算式を得た。
（If0: ポリマーとの複合体を形成していない（フリーの）シトクロムcの蛍光強度；
Im0: PICミセル内のシトクロムc誘導体の初期蛍光強度；
x: フリーのシトクロムcの割合）
上記式より、リリース後のシトクロムcの割合(x)を算出することができる。バッファー(pH 5.5又はpH 7.4)中におけるPICミセルのインキュベート後、Nanodrop（登録商標） ND-3300 fluorospectrometerによりサンプルの蛍光を測定した。その結果を図４に示した。
１０．野生型シトクロムcとPICミセルからリリースされたシトクロムcとの活性の比較（図５、図６）
シトクロムcの電子伝達活性を、トリスバッファー中におけるABTS（2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)；Wako, Japan）の触媒転換試験により測定した。同量のシトクロムc及びシトクロムc誘導体（CytC-Cit）（タンパク質の量は、シトクロムcのソレー帯の紫外・可視吸収により測定した。）を蒸留水に溶解し、PICミセル形成のためにカチオン性高分子としてのPEG-pAsp(DET)を添加した。内包タンパク質を100％リリースさせるため、pH 5.5のバッファー中で48時間インキュベートし、その後、各サンプルをトリスバッファー (500μL)に添加した。最終のpH及びイオン強度は、それぞれ、7.4及び150 mMであった。混合物をポリスチレンのキュベットに入れ、トリスバッファーと同様に過酸化水素水(H2O2 conc. = 25 mM) (500μL)を添加した。続けて、トリスバッファー中のABTS溶液(ABTS conc. = 1 mg/mL) 500μLを添加した。酸化物の418 nmにおける吸光度(A)を、計2分間、5秒おきにモニタリングし、吸光度の経時変化を測定した。その結果を図５に示した。
１１．HuH-7細胞へのインビトロタンパク質送達（図７、図８）
ヒトパピローマ（HuH-7）細胞を、8チャンバーのカバーグラスに播種し、200μLのダルベッコ変法イーグル培地(DMEM) (10% FBS)中で一晩インキュベートした。野生型シトクロムc（CytC）及びシトクロムc誘導体（Cyt-Suc）を内包するミセル、シトクロムc誘導体（Cyt-Cit）を内包するミセル、並びにシトクロムc誘導体（Cyt-Aco）を内包するミセルを、前記４.に記載の方法と同様の方法で調製した。各サンプル(0.1μMのCytC) (20μL)をウェルに入れ、37℃でインキュベートした。24時間のインキュベート後、培地を除去し、細胞をPBSで2回洗浄した。細胞内への送達については、LysoTracker Red (Molecular Probes, USA)で染色した酸性の後期エンドソーム及びリソソームを、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）により観察した。CLSMによる観察は、40倍の対物レンズ (Plan-Apochromat, Carl Zeiss, Germany)を搭載したAxiovert 100M (Carl Zeiss, Germany)を使用し、488 nm (アルゴンレーザー) 及び633 nm (ヘリウム-ネオンレーザー)の励起波長を照射して行った。なお、488 nmの波長はAlexa Fluor 488の励起用として、633 nmの波長はLysoTraker Redの励起用として使用した。その結果、図７に示したように、生型シトクロムc(A)の細胞による取り込みは低く、低pH環境応答性を持たない無水コハク酸を用いた場合のPICミセル(B)は細胞に取り込まれるもののエンドソームからの脱出効率が低いことが確認されたが（緑の蛍光がLysoTrackerの赤の蛍光と共局在している）、低pH環境応答性の無水シス−アコニット酸及び無水シトラコン酸を用いた場合のPICミセル（それぞれCおよびD）は細胞質内に緑の蛍光が確認され、効率的にエンドソームから細胞質へと脱出することが確認された。また、より定量的な解析として、赤の蛍光のピクセル数／緑の蛍光のピクセル数の比を縦軸として表した結果を図８に示した。その結果、CとDにおいてこの比の減少が確認され、Alexa Fluor 488で標識されたシトクロムcがエンドソームから脱出していることが示された。
以上の結果は、細胞内に取り込まれたPICがエンドソームに到達すると、電荷調節剤の脱離に伴うPIC内の電荷のバランスの変化によってPICが崩壊し、ポリマーがエンドソーム膜を傷害する一方で、PICからリリースされたシトクロムcが細胞質へ移行することを示している。
１２．電荷変換された抗体タンパク質を内包したPICミセル（図９）
抗体タンパク質として、イムノグロブリンＧ（IgG；分子量：150kDa超）を用いた。IgGの電荷変換は、まず、(i) Alexa-Fluor 488で標識したIgGのストック溶液中のNaN3をゲルろ過カラムにより除去した。(ii) 当該IgGを0.1M NaHCO3 (pH 9.0)バッファーに溶解した。(iii) 当該溶液に無水シトラコン酸又は無水シス−アコニット酸を添加した。(iv) 得られた混合物をゲルろ過カラムにより精製した。総荷電が調節されたIgG誘導体（IgG-Cit，IgG-Aco）が得られた。
このIgG誘導体（IgG-Cit，IgG-Aco）を内包するタンパク質として、前記４.に記載の方法と同様にし、PICミセルを調製した。調製したPICミセルを細胞内に送達した。このPICミセルの調製の概略を図９に示した。
１３．電荷変換された抗体断片（F(ab’)2）を内包したPICミセル（図１０、図１１）
抗体断片であるF(ab’)2の電荷変換は、まず、(i) Alexa-Fluor 488で標識したF(ab’)2 のストック溶液中のNaN3 をゲルろ過カラムにより除去した。(ii) 当該F(ab’)2を0.1M NaHCO3 (pH 9.0)バッファーに溶解した。(iii) 当該溶液に無水シトラコン酸又は無水シス−アコニット酸を添加した。(iv) 得られた混合物をゲルろ過カラムにより精製した。総荷電が調節されたF(ab’)2誘導体（F(ab’)2-Cit，F(ab’)2-Aco）が得られた。
このF(ab’)2誘導体（F(ab’)2-Cit，F(ab’)2-Aco）を内包するタンパク質として、前記４.に記載の方法と同様にし、PICミセルを調製した。このPICミセルの調製の概略を図１０に示した。また、前記６.に記載の方法と同様にし、当該PICミセルの粒径測定（粒径分布の測定）を行った。その結果を図１１に示した。
また、図１２(A)に示す概略図のように、PICミセルによるF(ab’)2の細胞内送達を行った。具体的には、上記調製したPICミセルを用いてF(ab’)2をHeLa細胞内に送達し、送達後の細胞について、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）による観察を行った。その結果を図１２(B)に示した。
・N,N-ジメチルホルムアミド (DMF) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Japan)
・ジクロロメタン (DCM) (Wako, Japan)
・エチレンジアミン (1,2-ジアミノエタン) (Tokyo Chemical Industry Co. Ltd, Japan)
・ジエチレントリアミン (ビス(2-アミノエチル)アミン) (Tokyo Chemical Industry Co. Ltd, Japan)は、購入後、使用前に再蒸留した。
・酢酸, 無水シトラコン酸, 無水コハク酸及び塩酸(Wako, Japan)は、購入後、さらに精製はせずに使用した。
・1-メチル-2-ピロリジノン (NMP) 及び無水シス−アコニット酸は、アルドリッチ(USA)から購入した。
・α-メトキシ-ω-アミノポリ(エチレングリコール) (分子量=12,000) 及びβ-ベンジル-L-アスパラギン酸-N-カルボキシ-無水物 (BLA-NCA)は、日油株式会社より入手した。
・ウマ心臓シトクロムcは、Calbiochem (USA)より入手した。
２．カチオン性高分子の合成
以下の手順により、PEG部分及びポリカチオン部分を有するカチオン性高分子として、PEG-pAsp(DET) (PEG-{N-[N’-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide})を合成した（下記スキーム１参照）。
PEG-PBLAは、α-メトキシ-ω-アミノポリ(エチレングリコール)（スキーム１中のA）の末端アミノ基より開始されたBLA-NCAの開環重合により得られる。このPEG macro-initiator (500 mg; 0.0417 mmol)を、5 mLのDMF/DCM (1:10)に溶解した。8 mLのDMF/DCM (1:10)中のBLA-NCA溶液(780 mg; 3.13 mmol)を、PEG macro-initiatorの溶液に添加し、反応混合物を、アルゴン雰囲気下、35℃で48時間撹拌した。得られたポリマーはジエチルエーテル(150 mL)中に沈殿した。この沈殿物をジエチルエーテルで２回洗浄して、1.1 gの白色粉末を得た。PEG-PBLAの分子量測定のため、PEG-PBLAを0.5M NaOHを用いてPEG-pAspに転換した（Harada, A. and Kataoka, K., J. Am. Chem. Soc., 2003, vol. 125, p. 15306-15307）。変換されたPEG-pAspのGPCクロマトグラムは、単一モードであり、Mw/MnはPEG標品の検量線から1.01であると決定した。1H NMR測定から（下記参照）、BLAユニットの重合度(DP)は68であると計算された。すべてのNMRスペクトルは、JEOL EX 300 spectrometerを用いて300MHzで記録した。化学シフトは、テトラメチルシランによるppmダウンフィールドにおいて報告された。
1H NMR (CDCl3): δ2.63 - 3.05 (136H, COCHCH2COOCH2Ph), δ3.32 (3H, CH3OCH2CH2), δ3.55 (1092H, OCH2CH2O), δ4.23 (68H, COCHNH), δ5.06 (136H, COOCH2Ph), δ7.20 (340H, COOCH2Ph), δ8.79 (68H, COCHNH).
（２）PEG-pAsp(DET)（スキーム１中の1）の合成
上記(1)で得られたPEG-PBLA(300 mg; 0.802 mmolのベンジルエステル)を、NMP (10 mL)に溶解させた。この溶液にジエチレントリアミン(40.1 mmol)を添加し、反応混合物を10℃で2時間撹拌した。得られた溶液を、10%酢酸水溶液(30 mL)に滴下した。中和溶液を0.01M塩酸(× 3)及び蒸留水(× 3)に対して4℃で透析した。凍結乾燥後の塩酸塩として、白色粉末のPEG-pAsp(DET)を得た。1H NMR（下記参照）では、ベンジル基のピークは確認されなかった。
1H NMR (D2O): δ2.63 (272H, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2, COCH2CHCONHCH2CH2NHCH2CH2NH2 and COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ2.76 (136H, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2),δ2.94 (136H, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ3.20-3.50 (139H, CH3OCH2CH2 and COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ3.53 (1092H, OCH2CH2O), δ4.57 (68H, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2 and COCH2CHCONHCH2CH2NHCH2CH2NH2)
３．シトクロムcの改変（総荷電の変換）
ウマ心臓シトクロムc(10 mg)を、0.5 M NaHCO3バッファー (pH 9.0, 5 mL)に溶解し、4°Cで30分撹拌した後、無水シトラコン酸(104 mg)をゆっくりと添加した。2時間撹拌後、混合物を、Amicon Ultra (MWCO=10,000; Millipore (Billerica, MA)) (3倍量の蒸留水使用)により精製した。生成産物として、上記シトクロムcに無水シトラコン酸を結合させてシトラコン酸アミドを有するようにしたシトクロムc誘導体（Cyt-Cit）を、凍結乾燥後の赤色粉末として得た（図１参照）。また、無水シトラコン酸の代わりに、無水シス−アコニット酸及び無水コハク酸を使用した以外は同様にして、上記シトクロムcに無水シス−アコニット酸を結合させてシス−アコニット酸アミドを有するようにしたシトクロムc誘導体（Cyt-Aco）、及び上記シトクロムcに無水コハク酸を結合させてコハク酸アミドを有するようにしたシトクロムc誘導体（Cyt- Suc）を得た（図１参照）。
野生型のウマ心臓シトクロムc（CytC）と、得られたシトクロムc誘導体（Cyt-Cit、Cyt-Aco）について電荷密度等を測定した結果を、下記表１に示した。
４．PICの調製
上記２.により得られたカチオン性高分子（PEG-pAsp(DET)）と上記３.により得られたシトクロムc誘導体（Cyt-Cit，Cyt-Aco）を用いて、以下の手順により、PICミセルを調製した。
シトクロムc誘導体(0.50 mg/mL)と、上記カチオン性高分子(1.0 mg/mL)とを、それぞれ蒸留水に溶解させた。得られた各溶液を0.1μmシリンジフィルターにより濾過した後、特定のN/C比（具体的にはN/C=2）となるように混合することにより、上記シトクロムc誘導体（Cyt-Cit，Cyt-Aco）を内包したPICミセルを得た。なお、以下の実施例においては、上記混合後の液に、適宜、酢酸バッファー(pH 5.5)又はリン酸バッファー(pH 7.4)が添加された。混合液中のNaClの最終濃度は150 mMとした。
得られたPICミセルについて、原子間力顕微鏡（AMF）(Nanoscope IIIa multimode, Nippon Veeco Co. Tokyo Japan)を用いて、PICミセルの形のイメージングを行った。また、動的光散乱法（DLS）（Zetasizer Nano-ZS (green badge, ZEN3500, Malvern, Ltd. Malvern, U. K.)；532 nmの緑色レーザーを搭載）による粒径測定を行った。これらの結果を図２に示した。
５．原子間力顕微鏡（AMF）によるPICミセルの観察（図２）
上記４.で得られたPICミセルの溶液(PBS, pH 7.4, 150 mM NaCl)を2μl分、シリコンウェハーディスク上に置いた。室温で10分間吸着させた後、フィルター用紙により余分な溶液を取り除いて、室温下で表面を乾燥させた。AMFのイメージモードはタッピングモードにし、励起周波数の範囲は7.8〜7.9 kHzとして、AMFによるPICミセルの観察を行った。その結果を図２に示した。
６．動的光散乱法（DLS）によるPICミセルの粒径測定（図２）
上記４.で得られたPICミセルの溶液を、シトクロムc誘導体（Cyt-Cit，Cyt-Aco）の含有割合が0.125 mg/mLとなるように調整した後、37℃でインキュベートした。動的光散乱法（DLS）によるPICミセルの粒径測定（粒径分布の測定）は、532 nmの緑色レーザーを搭載したZetasizer Nano-ZS (green badge, ZEN3500, Malvern, Ltd. Malvern, U. K.)を用いて行った。その結果を図２に示した。
７．シトクロムc誘導体（Cyt-Cit，Cyt-Aco）におけるシトラコン酸アミド及びシス−アコニット酸アミドの分解（図３）
シトラコン酸アミドの分解率は、Fluorescamine法により測定した。Fluorescamineは、アミンに反応する蛍光色素（最大蛍光波長：465 nm）である。リシン基の主要なアミンが、シトクロムc誘導体におけるシトラコン酸アミド及びシス−アコニット酸アミドの分解後に暴露されるため、分解率はインキュベーション前後の蛍光を比較することで算出し得た。分析には、Nanodrop（登録商標） ND-3300 fluorospectrometer (NanoDrop Technologies; Wilmington, DE)を使用した。
シトクロムc誘導体のいずれのサンプルも、約1 mg/mLの濃度で蒸留水に溶解した。このストック溶液100μLを、pH 5.5の酢酸バッファー(10 mM) 100μLと混合した。この溶液を、37℃でインキュベートし、各サンプル10μLを、1時間ごとに、100μLのジメチルスルホキシド(DMSO) (2% triethylamine (TEA))に希釈した。この混合物をDMF (5 mg/mL)中に10μLのFluorescamine溶液で添加し、室温で10分間インキュベートした。その蛍光を、465 nmの蛍光波長で測定した。励起光源はfluorospectrometerのUV光(365 nm〜400 nm)を用いた。シトクロムc誘導体を0.01 M HCl中で一晩インキュベートしたサンプルの蛍光から、暴露されたアミンの全て（100％）を測定した。また、ネガティブコントロールとしてのブランクバッファー溶液の蛍光から、アミンが存在しない場合（0％）を測定した。
以上の結果を図３に示した。
８．シトクロムc誘導体の蛍光標識
蛍光標識したシトクロムc誘導体（Cyt-Cit, Cyt-Aco, Cyt-Suc）は、PICミセルの崩壊の測定、及び細胞内送達の観察のために調製した。ウマ心臓シトクロムcを0.1 M NaHCO3 バッファー(pH 8.5)に溶解し、4℃で30分間撹拌した。この溶液に、Alexa-Fluor 488 carboxylic acid, succinimidyl ester (Invitrogen, USA)（シトクロムcの5倍量；DMSO中に10 mg/mL）を添加し、4℃で2時間撹拌した。この反応混合物を、Amicon Ultra (MWCO=10,000; Millipore (Billerica, MA)) (×3 with distilled water)を用いて精製した。蛍光標識したシトクロムc誘導体は、凍結乾燥後に得た。なお、シトクロムc誘導体（Cyt-Cit, Cyt-Aco, Cyt-Suc）は、前記３.において得られたものを用いた。
９．PICミセルの崩壊（解離）（図４）
PICミセルの崩壊率を、プローブ−プローブ 消光−発光法（probe-probe quenching-dequenching method）により測定した。Alexa-Fluorで標識したシトクロムc誘導体とPEG-pAsp(DET)とのPICミセルを、前記４.で記載したように調製した。総蛍光強度（I）は、フリーのシトクロムcの強度(If)と、PICミセル内のシトクロムc誘導体の強度(Im)との合計であると仮定したときに、以下の計算式を得た。
Im0: PICミセル内のシトクロムc誘導体の初期蛍光強度；
x: フリーのシトクロムcの割合）
上記式より、リリース後のシトクロムcの割合(x)を算出することができる。バッファー(pH 5.5又はpH 7.4)中におけるPICミセルのインキュベート後、Nanodrop（登録商標） ND-3300 fluorospectrometerによりサンプルの蛍光を測定した。その結果を図４に示した。
１０．野生型シトクロムcとPICミセルからリリースされたシトクロムcとの活性の比較（図５、図６）
シトクロムcの電子伝達活性を、トリスバッファー中におけるABTS（2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)；Wako, Japan）の触媒転換試験により測定した。同量のシトクロムc及びシトクロムc誘導体（CytC-Cit）（タンパク質の量は、シトクロムcのソレー帯の紫外・可視吸収により測定した。）を蒸留水に溶解し、PICミセル形成のためにカチオン性高分子としてのPEG-pAsp(DET)を添加した。内包タンパク質を100％リリースさせるため、pH 5.5のバッファー中で48時間インキュベートし、その後、各サンプルをトリスバッファー (500μL)に添加した。最終のpH及びイオン強度は、それぞれ、7.4及び150 mMであった。混合物をポリスチレンのキュベットに入れ、トリスバッファーと同様に過酸化水素水(H2O2 conc. = 25 mM) (500μL)を添加した。続けて、トリスバッファー中のABTS溶液(ABTS conc. = 1 mg/mL) 500μLを添加した。酸化物の418 nmにおける吸光度(A)を、計2分間、5秒おきにモニタリングし、吸光度の経時変化を測定した。その結果を図５に示した。
１１．HuH-7細胞へのインビトロタンパク質送達（図７、図８）
ヒトパピローマ（HuH-7）細胞を、8チャンバーのカバーグラスに播種し、200μLのダルベッコ変法イーグル培地(DMEM) (10% FBS)中で一晩インキュベートした。野生型シトクロムc（CytC）及びシトクロムc誘導体（Cyt-Suc）を内包するミセル、シトクロムc誘導体（Cyt-Cit）を内包するミセル、並びにシトクロムc誘導体（Cyt-Aco）を内包するミセルを、前記４.に記載の方法と同様の方法で調製した。各サンプル(0.1μMのCytC) (20μL)をウェルに入れ、37℃でインキュベートした。24時間のインキュベート後、培地を除去し、細胞をPBSで2回洗浄した。細胞内への送達については、LysoTracker Red (Molecular Probes, USA)で染色した酸性の後期エンドソーム及びリソソームを、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）により観察した。CLSMによる観察は、40倍の対物レンズ (Plan-Apochromat, Carl Zeiss, Germany)を搭載したAxiovert 100M (Carl Zeiss, Germany)を使用し、488 nm (アルゴンレーザー) 及び633 nm (ヘリウム-ネオンレーザー)の励起波長を照射して行った。なお、488 nmの波長はAlexa Fluor 488の励起用として、633 nmの波長はLysoTraker Redの励起用として使用した。その結果、図７に示したように、生型シトクロムc(A)の細胞による取り込みは低く、低pH環境応答性を持たない無水コハク酸を用いた場合のPICミセル(B)は細胞に取り込まれるもののエンドソームからの脱出効率が低いことが確認されたが（緑の蛍光がLysoTrackerの赤の蛍光と共局在している）、低pH環境応答性の無水シス−アコニット酸及び無水シトラコン酸を用いた場合のPICミセル（それぞれCおよびD）は細胞質内に緑の蛍光が確認され、効率的にエンドソームから細胞質へと脱出することが確認された。また、より定量的な解析として、赤の蛍光のピクセル数／緑の蛍光のピクセル数の比を縦軸として表した結果を図８に示した。その結果、CとDにおいてこの比の減少が確認され、Alexa Fluor 488で標識されたシトクロムcがエンドソームから脱出していることが示された。
以上の結果は、細胞内に取り込まれたPICがエンドソームに到達すると、電荷調節剤の脱離に伴うPIC内の電荷のバランスの変化によってPICが崩壊し、ポリマーがエンドソーム膜を傷害する一方で、PICからリリースされたシトクロムcが細胞質へ移行することを示している。
１２．電荷変換された抗体タンパク質を内包したPICミセル（図９）
抗体タンパク質として、イムノグロブリンＧ（IgG；分子量：150kDa超）を用いた。IgGの電荷変換は、まず、(i) Alexa-Fluor 488で標識したIgGのストック溶液中のNaN3をゲルろ過カラムにより除去した。(ii) 当該IgGを0.1M NaHCO3 (pH 9.0)バッファーに溶解した。(iii) 当該溶液に無水シトラコン酸又は無水シス−アコニット酸を添加した。(iv) 得られた混合物をゲルろ過カラムにより精製した。総荷電が調節されたIgG誘導体（IgG-Cit，IgG-Aco）が得られた。
このIgG誘導体（IgG-Cit，IgG-Aco）を内包するタンパク質として、前記４.に記載の方法と同様にし、PICミセルを調製した。調製したPICミセルを細胞内に送達した。このPICミセルの調製の概略を図９に示した。
１３．電荷変換された抗体断片（F(ab’)2）を内包したPICミセル（図１０、図１１）
抗体断片であるF(ab’)2の電荷変換は、まず、(i) Alexa-Fluor 488で標識したF(ab’)2 のストック溶液中のNaN3 をゲルろ過カラムにより除去した。(ii) 当該F(ab’)2を0.1M NaHCO3 (pH 9.0)バッファーに溶解した。(iii) 当該溶液に無水シトラコン酸又は無水シス−アコニット酸を添加した。(iv) 得られた混合物をゲルろ過カラムにより精製した。総荷電が調節されたF(ab’)2誘導体（F(ab’)2-Cit，F(ab’)2-Aco）が得られた。
このF(ab’)2誘導体（F(ab’)2-Cit，F(ab’)2-Aco）を内包するタンパク質として、前記４.に記載の方法と同様にし、PICミセルを調製した。このPICミセルの調製の概略を図１０に示した。また、前記６.に記載の方法と同様にし、当該PICミセルの粒径測定（粒径分布の測定）を行った。その結果を図１１に示した。
また、図１２(A)に示す概略図のように、PICミセルによるF(ab’)2の細胞内送達を行った。具体的には、上記調製したPICミセルを用いてF(ab’)2をHeLa細胞内に送達し、送達後の細胞について、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）による観察を行った。その結果を図１２(B)に示した。
１．材料
・N,N-ジメチルホルムアミド (DMF) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Japan)
・ジクロロメタン (DCM) (Wako, Japan)
・テトラヒドロフラン(THF) (Wako, Japan)
・n-ヘキサン(Wako, Japan)
・トリエチルアミン (TEA) (Tokyo Chemical Industry Co. Ltd, Japan)
・ジエチレントリアミン (DET; ビス(2-アミノエチル)アミン) (Tokyo Chemical Industry Co. Ltd, Japan)は、購入後、使用前に再蒸留した。
・メタンスルホニルクロライド(MsCl) ,酢酸, 無水シトラコン酸, 無水コハク酸及び塩酸(Wako, Japan)は、購入後、さらに精製はせずに使用した。
・6-ブロモ-1-ヘキサノール, アジ化ナトリウム, 水酸化ナトリウム, 水素化アルミニウムリチウム(LAH), 1-メチル-2-ピロリジノン(NMP) 及び無水シス−アコニット酸は、アルドリッチ(USA)から購入した。
・α-メトキシ-ω-アミノポリ(エチレングリコール) (分子量=12,000) 及びβ-ベンジル-L-アスパラギン酸-N-カルボキシ-無水物 (BLA-NCA)は、日油株式会社より入手した。
・抗核膜孔複合体（NPC）抗体 (Clone 414) は、シグマ(USA)から購入した。
・Alexa Fluor 488で標識した抗マウスIgG (Fab’)2 フラグメントは、インビトロジェン(USA)から購入した。
２．カチオン性高分子の合成
以下の手順により、PEG部分及びポリカチオン部分を有するカチオン性高分子として、PEG-C6-pAsp(DET) (PEG-C6-{N-[N’-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide})を合成した（下記スキーム２参照）。
（１）PEG-Ms (PEG-mesylate)（スキーム２中のB）の合成
α-メトキシ-ω-アミノポリ(エチレングリコール) (分子量=12,000) (スキーム２中のA) (3.0 g; 0.25 mmol) をドライTHF (20 mL)に溶解させた。40°Cで30分攪拌後、この溶液中にTEA (1.13 mmol) を160 μL添加した。次いで、MsCl (68 μL; 0.875 mmol) を含むTHF 10 mLを上記溶液中に滴下した。40°Cで30分攪拌後、混合液をさらに室温で2.5 hr攪拌した。生成物（PEG-Ms）を450 mL ヘキサン中に沈殿させ、乾燥させた。収率は99%以上であった。
すべてのNMRスペクトルは、JEOL EX 300 spectrometerを用いて300MHzで記録した。化学シフトは、テトラメチルシランによるppmダウンフィールドにおいて報告された。
1H NMR (CDCl3): δ3.1 (3H, O3SCH3), δ3.4 (3H, CH3OCH2CH2), δ3.6 (1092H, OCH2CH2O), δ4.4 (2H, OCH2CH2O3SCH3).
（２）6-アジド-1-ヘキサノールの合成
6-ブロモ-1-ヘキサノール (5.00g, 27.6 mmol)を12 mLのDMFに溶解させた。この溶液にアジ化ナトリウム (4.00g, 61.5 mmol)を添加し、混合物を50°Cで3日間攪拌した。混合物を蒸発により濃縮し、蒸留水10 mL を加えた。この水溶液をジエチルエーテルを用いて6回抽出し、有機抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥した。その後、蒸発により生成物（6-アジド-1-ヘキサノール）を得た。収率は99%以上であった。
1H NMR (CDCl3): δ1.4-1.8 (9H, N3CH2(CH2)4CH2OH), δ3.3 (2H, N3CH2(CH2)4CH2OH), δ3.7 (2H, N3CH2(CH2)4CH2OH).
（３）PEG-C6-azide（スキーム２中のC）の合成
上記(2)で得られた6-アジド-1-ヘキサノールを、水素化ナトリウム(1.7 mmol) 68 mgを含むドライTHF (4 mL)に溶解させ、1 hr攪拌した。上記(1)で得られたPEG-Ms (1.3g, 0.11 mmol)を、ドライTHF (10 mL)に溶解させ、この溶液に、先に調製した6-アジド-1-ヘキサノールの溶液を添加した。50°Cで3日間攪拌した後、混合物に蒸留水20 mLを添加した。混合物をDCMを用いて抽出し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を20 mLまで濃縮した後、ヘキサン中に生成物（PEG-C6-azide）を沈殿させた。収率は88%以上であった。
1H NMR (CDCl3): δ1.4 (4H, PEG-OCH2CH2(CH2)2CH2CH2N3), δ1.7 (4H, PEG-OCH2CH2(CH2)2CH2CH2N3), δ3.3 (2H, PEG-O(CH2)5CH2N3), δ3.4 (3H, CH3OCH2CH2), δ3.5 (2H, PEG-OCH2(CH2)5N3), δ3.6 (1092H, OCH2CH2O).
（４）PEG-C6-amine（スキーム２中のD）の合成
上記(3)で得られたPEG-C6-azide (0.75g, 0.063 mmol)を、ドライTHF (7 mL)に溶解させた。この溶液に、LAH (166 mg)溶液を含むTHF (2 mL)を滴下し、室温で24 hr攪拌した。攪拌後の溶液に酢酸エチル(20 mL) を添加し、この混合物を大量のDCMで希釈した。沈殿物の濾過後、濾物を濃縮した。最終生成物（PEG-C6-amine）はエーテル中での沈澱により得られた。収率は約88%であった。
1H NMR (CDCl3): δ1.4-1.8 (10H, PEG-OCH2(CH2)4CH2NH2), δ2.9 (2H, PEG-O(CH2)5CH2NH2), δ3.4 (3H, CH3OCH2CH2), δ3.5 (2H, PEG-OCH2(CH2)5 NH2), δ3.6 (1092H, OCH2CH2O).
（５）PEG-C6-PBLA (PEG-C6-poly(β-benzyl-L-aspartate)) （スキーム２中のE）の合成
PEG-C6-PBLAは、上記(4)で得られたPEG-C6-amineの末端アミノ基より開始されたBLA-NCAの開環重合により得られる。このPEG macro-initiatorであるPEG-C6-amine (150 mg; 0.0125 mmol)を、2 mLのDCM中に溶解させた。The BLA-NCA (250 mg; 1.0 mmol)溶液を含む3 mLのDMF/DCM (1:5)を、PEG macro-initiator溶液に添加し、反応混合物を、アルゴン雰囲気下、35℃で48時間撹拌した。得られたポリマーはジエチルエーテル(100 mL)中に沈殿した。変換されたPEG-pAspのGPCクロマトグラムは、単一モードであり、Mw/Mn はPEG標品の検量線から1.16であると決定した。1H NMR測定から（下記参照）、BLAユニットの重合度(DP)は69であると計算された。
1H NMR (d6-DMSO): δ2.6 - 3.1 (138H, COCHCH2COOCH2Ph), δ3.6 (1092H, OCH2CH2O), δ4.7 (69H, COCHNH), δ5.0 (138H, COOCH2Ph), δ7.2 (345H, COOCH2Ph), δ8.2 (69H, COCHNH).
（６）PEG-C6-pAsp(DET)（スキーム２中のF）の合成
上記(5)で得られたPEG-C6-PBLA (100 mg; 0.27 mmol of benzyl ester)を、NMP (5 mL)中に溶解させた。この溶液に、ジエチレントリアミン(13 mmol)を添加し、混合物を10°Cで2 hr攪拌した。得られた溶液を、10%酢酸水溶液(10 mL)中に滴下した。中和溶液を0.01M塩酸(× 3)及び蒸留水(× 3)に対して4℃で透析した。凍結乾燥後の塩酸塩として、白色粉末のPEG-C6-pAsp(DET)を得た。1H NMR（下記参照）では、ベンジル基のピークは確認されなかった。
1H NMR (D2O): δ2.7 (276H, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2, COCH2CHCONHCH2CH2NHCH2CH2NH2 and COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ2.9 (138H, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ3.0 (138H, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ3.3 (141H, CH3OCH2CH2 and COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ3.6 (1092H, OCH2CH2O).
３．抗体等の改変（総荷電の変換）
抗核膜孔複合体（抗NPC）IgG抗体 (又はAlexa Fluor 488で標識された 抗マウス IgG (Fab’)2 フラグメント) (200〜300μg)を0.1 M NaHCO3バッファー (pH 9.0, 1 mL)に溶解し、4°Cで30分撹拌した後、無水シトラコン酸(1 mg)を添加した。2時間撹拌後、混合物を、Amicon Ultra (MWCO=10,000; Millipore (Billerica, MA)) (3倍量の蒸留水使用)により精製した。生成産物として、上記IgGに無水シトラコン酸を結合させてシトラコン酸アミドを有するようにしたIgG誘導体（IgG-Cit）を得た（図１３参照）。IgG-Citの濃縮物は、Micro BCATM Protein Assay Reagent Kit (Pierce)を用いて定量した。
また、無水シトラコン酸の代わりに、無水シス−アコニット酸及び無水コハク酸を使用した以外は同様にして、上記IgGに無水シス−アコニット酸を結合させてシス−アコニット酸アミドを有するようにしたIgG誘導体（IgG-Aco）、及び上記IgGに無水コハク酸を結合させてコハク酸アミドを有するようにしたIgG誘導体（IgG-Suc）を得た（図１３参照）。
なお、IgG抗体の代わりに、前記抗マウスIgG (Fab’)2 フラグメントを使用することにより、上記各IgG誘導体と同様、IgG (Fab’)2フラグメント誘導体（すなわち、(Fab’)2-Cit、(Fab’)2- Aco、(Fab’)2- Suc）を得た。
４．NPC認識の回復
ヒト肝癌(HuH-7)細胞を、8チャンバーのカバーグラスに播種し、200μLのDulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (10% FBS)中で、一晩インキュベートした。この細胞を、4% パラホルムアルデヒドで15 min固定し、0.2 % Triton X-100を5 min膜透過させた。固定された細胞は、非特異認識を避けるため1% BSA溶液で10 min処理し、上記３.で得られた各anti-NPC IgG 誘導体 (2μg/mL; 15 nM)等と1% BSA溶液中、37°Cで1 hrインキュベートした。当該細胞は、2次抗体としてのAlexa Fluor 488標識化 抗マウス IgG (Fab’)2 フラグメント (4μg/mL; 40 nM)により、1% BSA溶液中で、37°Cで1 hr処理した。細胞核をHoechst 33258で染色した。細胞を、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）により観察した。CLSMによる観察は、20倍の対物レンズ (Plan-Apochromat, Carl Zeiss, Germany)を搭載したAxiovert 100M (Carl Zeiss, Germany)を使用し、Alexa Fluor 488及びHoechst 33258のそれぞれの励起波長である488 nm (アルゴンレーザー) 及び364 nmの波長を照射して行った。その結果を図１４Ａ及び図１４Ｂに示した。
５．PICの調製
上記２.により得られたカチオン性高分子（PEG-C6-pAsp(DET)）と、上記３.により得られたIgG誘導体（IgG-Cit，IgG-Aco，IgG-Suc）又は 抗マウスIgG (Fab’)2フラグメント誘導隊（(Fab’)2-Cit，(Fab’)2- Aco，(Fab’)2- Suc）とを用いて、以下の手順により、PICミセルを調製した。
IgG誘導体等(0.10 mg/mL; 0.67〜1.0μM)と、PEG-C6-pAsp(DET) (0.5 mg/mL)とを、それぞれ蒸留水中に溶解させた。得られた各溶液を0.2μmシリンジフィルターにより濾過した後、それらを互いに特定のN/C比（具体的にはN/C=2）となるように混合することにより、上記IgG誘導体等を内包したPICミセルを得た。ここで、N/C比とは、ブロックコポリマー（本実施例ではPEG-C6-pAsp(DET)）中のカチオン性基（例えばアミノ基）の総数（N）と、荷電変換タンパク質（本実施例ではIgG誘導体等）中のカルボキシル基の総数（C）との比を意味する。
なお、以下の実施例においては、上記混合後の液に、適宜、酢酸バッファー(pH 5.5)又はリン酸バッファー(pH 7.4)が添加された。混合液中のNaClの最終濃度は150 mMとした。
６．動的光散乱法（DLS）によるPICミセルの粒径測定（図１５、１６）
上記５.で得られたPICミセルについて、動的光散乱法（DLS）による粒径測定（粒径分布の測定）を行うため、それぞれのIgG誘導体溶液の最終濃度を25μg/mL (0.17〜0.25 μM)に調整した。当該測定は、32 nmの緑色レーザーを搭載したZetasizer Nano-ZS (green badge, ZEN3500, Malvern, Ltd. Malvern, U. K.)を用いて、37°Cで行った。その結果を図１５、１６に示した。
また、動的光散乱法（DLS）による、PICミセルの粒径及び多分散度(PDI: polydispersity index)について、下記表にも結果を示した。
７．PICミセルの崩壊（解離）（図１７）
PICミセルの崩壊率を、プローブ−プローブ 消光−発光法（probe-probe quenching-dequenching method）により測定した。Alexa-Fluorで標識した 抗マウスIgG (Fab’)2フラグメント誘導体とPEG-C6-pAsp(DET)とのPICミセルを、前記５.で記載したように調製した。総蛍光強度（I）は、フリーのIgG (Fab’) 2 フラグメントの強度(If)と、PICミセル内のIgG (Fab’) 2 フラグメント誘導体の強度(Im)との合計であると仮定したときに、以下の計算式を得た。
（If0: ポリマーとの複合体を形成していない（フリーの）IgG (Fab’) 2 フラグメントの蛍光強度；
Im0: PICミセル内のIgG (Fab’) 2 フラグメント誘導体の初期蛍光強度；
x: フリーのIgG (Fab’) 2 フラグメントの割合）
上記式より、リリース後の抗体断片（IgG (Fab’)2フラグメント）の割合(x)を算出することができる。バッファー(pH 5.5又はpH 7.4)中におけるPICミセルのインキュベート後、Nanodrop（登録商標） ND-3300 fluorospectrometerによりサンプルの蛍光を測定した。その結果を図１７に示した。
８．抗体のエンドソームエスケープEndosomal escape
ヒト肝癌(HuH-7)細胞を、8チャンバーのカバーグラスに播種し、200μLのDulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (10% FBS)中で、一晩インキュベートした。Alexa-Fluorで標識した(Fab’)2-Cit , (Fab’)2-Aco又は(Fab’)2-Sucを内包するPICミセルを、前記５.で記載したように調製した。各サンプルをウェルに添加し、37°Cでインキュベートした。各(Fab’)2誘導体の最終濃度は5μg/mL (50 nM)とした。24 hrのインキュベート後、培地を除去し、PBSで細胞を3回洗浄した。LysoTracker Red (Molecular Probes, USA)で、酸性の後期エンドソーム及びリソソームを染色した後、細胞内での局在を共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）により観察した。CLSMによる観察は、20倍の対物レンズ (Plan-Apochromat, Carl Zeiss, Germany)を搭載したAxiovert 100M (Carl Zeiss, Germany)を使用し、Alexa Fluor 488及びLysoTraker Redのそれぞれの励起波長である488 nm (アルゴンレーザー) 及び633 nmの波長を照射して行った。その結果を図１８に示した。
９．HuH-7細胞内の抗体のNPC認識
ヒト肝癌(HuH-7)細胞を、8チャンバーのカバーグラスに播種し、200μLのDulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (10% FBS)中で、一晩インキュベートした。前記５.で記載したように調製したIgG誘導体 (final concentration of IgG: 5μg/mL (33 nM))を内包するPICミセルを、上記HuH-7細胞に添加した。37°Cで24 hrインキュベートした後、この細胞を、4% パラホルムアルデヒドで15 min固定し、0.2 % Triton X-100を5 min膜透過させ、固定された細胞を、非特異認識を避けるため1% BSA溶液で10 min処理した。IgG誘導体を検出するため、当該細胞を、2次抗体としてのAlexa Fluor 488標識化 抗マウスIgG (Fab’)2 フラグメント (4μg/mL; 40 nM)により、1% BSA溶液中で、37°Cで1 hr処理した。細胞核をHoechst 33258で染色した。細胞を、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）により観察した。CLSMによる観察は、20倍の対物レンズ (Plan-Apochromat, Carl Zeiss, Germany)を搭載したAxiovert 100M (Carl Zeiss, Germany)を使用し、Alexa Fluor 488及びHoechst 33258のそれぞれの励起波長である488 nm (アルゴンレーザー) 及び364 nmの波長を照射して行った。その結果を図１９（特にa〜c）に示した。
１０．抗体デリバリーにより細胞増殖のコントロール
HuH-7細胞の細胞増殖性を測定するため、当該細胞をPICミセル溶液 (IgGの最終濃度: 10μg/mL (67 nM))でインキュベートした。24 hr及び48 hrのインキュベート後、MTTアッセイ (Cell Counting Kit-9, Dojindo, Kumamoto, Japan)により、当該細胞の生存率を評価した。具体的には、それぞれのウェルについて、450 nmでの吸光度を（製造元が提供したプロトコールに準じて）測定することにより評価した。その結果を図１９（特にd）に示した。評価結果は、同時にPBS (pH 7.4)中でインキュベートした対照細胞（コントロール）に対する相対値（relative value (%)）として示した。
１１．考察
本発明者は、細胞増殖をコントロールするために細胞質内に生物学的活性を有するIgG抗体を送達することに成功した。IgG抗体が目的抗原対する優れた選択性を有することを考えると、電荷変換細胞内抗体の技術は、生細胞におけるバイオイメージングや、細胞内抗原に対する生物学的治療の高い潜在性を有する。さらには、電荷変換PICミセルは、PICミセルのシェル部分のPEGにより提供される長期血中安定性や高い生体適合性に基づく、タンパク質の静注送達に好ましく適用することができる。
・N,N-ジメチルホルムアミド (DMF) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Japan)
・ジクロロメタン (DCM) (Wako, Japan)
・テトラヒドロフラン(THF) (Wako, Japan)
・n-ヘキサン(Wako, Japan)
・トリエチルアミン (TEA) (Tokyo Chemical Industry Co. Ltd, Japan)
・ジエチレントリアミン (DET; ビス(2-アミノエチル)アミン) (Tokyo Chemical Industry Co. Ltd, Japan)は、購入後、使用前に再蒸留した。
・メタンスルホニルクロライド(MsCl) ,酢酸, 無水シトラコン酸, 無水コハク酸及び塩酸(Wako, Japan)は、購入後、さらに精製はせずに使用した。
・6-ブロモ-1-ヘキサノール, アジ化ナトリウム, 水酸化ナトリウム, 水素化アルミニウムリチウム(LAH), 1-メチル-2-ピロリジノン(NMP) 及び無水シス−アコニット酸は、アルドリッチ(USA)から購入した。
・α-メトキシ-ω-アミノポリ(エチレングリコール) (分子量=12,000) 及びβ-ベンジル-L-アスパラギン酸-N-カルボキシ-無水物 (BLA-NCA)は、日油株式会社より入手した。
・抗核膜孔複合体（NPC）抗体 (Clone 414) は、シグマ(USA)から購入した。
・Alexa Fluor 488で標識した抗マウスIgG (Fab’)2 フラグメントは、インビトロジェン(USA)から購入した。
２．カチオン性高分子の合成
以下の手順により、PEG部分及びポリカチオン部分を有するカチオン性高分子として、PEG-C6-pAsp(DET) (PEG-C6-{N-[N’-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide})を合成した（下記スキーム２参照）。
α-メトキシ-ω-アミノポリ(エチレングリコール) (分子量=12,000) (スキーム２中のA) (3.0 g; 0.25 mmol) をドライTHF (20 mL)に溶解させた。40°Cで30分攪拌後、この溶液中にTEA (1.13 mmol) を160 μL添加した。次いで、MsCl (68 μL; 0.875 mmol) を含むTHF 10 mLを上記溶液中に滴下した。40°Cで30分攪拌後、混合液をさらに室温で2.5 hr攪拌した。生成物（PEG-Ms）を450 mL ヘキサン中に沈殿させ、乾燥させた。収率は99%以上であった。
すべてのNMRスペクトルは、JEOL EX 300 spectrometerを用いて300MHzで記録した。化学シフトは、テトラメチルシランによるppmダウンフィールドにおいて報告された。
1H NMR (CDCl3): δ3.1 (3H, O3SCH3), δ3.4 (3H, CH3OCH2CH2), δ3.6 (1092H, OCH2CH2O), δ4.4 (2H, OCH2CH2O3SCH3).
（２）6-アジド-1-ヘキサノールの合成
6-ブロモ-1-ヘキサノール (5.00g, 27.6 mmol)を12 mLのDMFに溶解させた。この溶液にアジ化ナトリウム (4.00g, 61.5 mmol)を添加し、混合物を50°Cで3日間攪拌した。混合物を蒸発により濃縮し、蒸留水10 mL を加えた。この水溶液をジエチルエーテルを用いて6回抽出し、有機抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥した。その後、蒸発により生成物（6-アジド-1-ヘキサノール）を得た。収率は99%以上であった。
1H NMR (CDCl3): δ1.4-1.8 (9H, N3CH2(CH2)4CH2OH), δ3.3 (2H, N3CH2(CH2)4CH2OH), δ3.7 (2H, N3CH2(CH2)4CH2OH).
（３）PEG-C6-azide（スキーム２中のC）の合成
上記(2)で得られた6-アジド-1-ヘキサノールを、水素化ナトリウム(1.7 mmol) 68 mgを含むドライTHF (4 mL)に溶解させ、1 hr攪拌した。上記(1)で得られたPEG-Ms (1.3g, 0.11 mmol)を、ドライTHF (10 mL)に溶解させ、この溶液に、先に調製した6-アジド-1-ヘキサノールの溶液を添加した。50°Cで3日間攪拌した後、混合物に蒸留水20 mLを添加した。混合物をDCMを用いて抽出し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を20 mLまで濃縮した後、ヘキサン中に生成物（PEG-C6-azide）を沈殿させた。収率は88%以上であった。
1H NMR (CDCl3): δ1.4 (4H, PEG-OCH2CH2(CH2)2CH2CH2N3), δ1.7 (4H, PEG-OCH2CH2(CH2)2CH2CH2N3), δ3.3 (2H, PEG-O(CH2)5CH2N3), δ3.4 (3H, CH3OCH2CH2), δ3.5 (2H, PEG-OCH2(CH2)5N3), δ3.6 (1092H, OCH2CH2O).
（４）PEG-C6-amine（スキーム２中のD）の合成
上記(3)で得られたPEG-C6-azide (0.75g, 0.063 mmol)を、ドライTHF (7 mL)に溶解させた。この溶液に、LAH (166 mg)溶液を含むTHF (2 mL)を滴下し、室温で24 hr攪拌した。攪拌後の溶液に酢酸エチル(20 mL) を添加し、この混合物を大量のDCMで希釈した。沈殿物の濾過後、濾物を濃縮した。最終生成物（PEG-C6-amine）はエーテル中での沈澱により得られた。収率は約88%であった。
1H NMR (CDCl3): δ1.4-1.8 (10H, PEG-OCH2(CH2)4CH2NH2), δ2.9 (2H, PEG-O(CH2)5CH2NH2), δ3.4 (3H, CH3OCH2CH2), δ3.5 (2H, PEG-OCH2(CH2)5 NH2), δ3.6 (1092H, OCH2CH2O).
（５）PEG-C6-PBLA (PEG-C6-poly(β-benzyl-L-aspartate)) （スキーム２中のE）の合成
PEG-C6-PBLAは、上記(4)で得られたPEG-C6-amineの末端アミノ基より開始されたBLA-NCAの開環重合により得られる。このPEG macro-initiatorであるPEG-C6-amine (150 mg; 0.0125 mmol)を、2 mLのDCM中に溶解させた。The BLA-NCA (250 mg; 1.0 mmol)溶液を含む3 mLのDMF/DCM (1:5)を、PEG macro-initiator溶液に添加し、反応混合物を、アルゴン雰囲気下、35℃で48時間撹拌した。得られたポリマーはジエチルエーテル(100 mL)中に沈殿した。変換されたPEG-pAspのGPCクロマトグラムは、単一モードであり、Mw/Mn はPEG標品の検量線から1.16であると決定した。1H NMR測定から（下記参照）、BLAユニットの重合度(DP)は69であると計算された。
1H NMR (d6-DMSO): δ2.6 - 3.1 (138H, COCHCH2COOCH2Ph), δ3.6 (1092H, OCH2CH2O), δ4.7 (69H, COCHNH), δ5.0 (138H, COOCH2Ph), δ7.2 (345H, COOCH2Ph), δ8.2 (69H, COCHNH).
（６）PEG-C6-pAsp(DET)（スキーム２中のF）の合成
上記(5)で得られたPEG-C6-PBLA (100 mg; 0.27 mmol of benzyl ester)を、NMP (5 mL)中に溶解させた。この溶液に、ジエチレントリアミン(13 mmol)を添加し、混合物を10°Cで2 hr攪拌した。得られた溶液を、10%酢酸水溶液(10 mL)中に滴下した。中和溶液を0.01M塩酸(× 3)及び蒸留水(× 3)に対して4℃で透析した。凍結乾燥後の塩酸塩として、白色粉末のPEG-C6-pAsp(DET)を得た。1H NMR（下記参照）では、ベンジル基のピークは確認されなかった。
1H NMR (D2O): δ2.7 (276H, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2, COCH2CHCONHCH2CH2NHCH2CH2NH2 and COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ2.9 (138H, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ3.0 (138H, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ3.3 (141H, CH3OCH2CH2 and COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ3.6 (1092H, OCH2CH2O).
３．抗体等の改変（総荷電の変換）
抗核膜孔複合体（抗NPC）IgG抗体 (又はAlexa Fluor 488で標識された 抗マウス IgG (Fab’)2 フラグメント) (200〜300μg)を0.1 M NaHCO3バッファー (pH 9.0, 1 mL)に溶解し、4°Cで30分撹拌した後、無水シトラコン酸(1 mg)を添加した。2時間撹拌後、混合物を、Amicon Ultra (MWCO=10,000; Millipore (Billerica, MA)) (3倍量の蒸留水使用)により精製した。生成産物として、上記IgGに無水シトラコン酸を結合させてシトラコン酸アミドを有するようにしたIgG誘導体（IgG-Cit）を得た（図１３参照）。IgG-Citの濃縮物は、Micro BCATM Protein Assay Reagent Kit (Pierce)を用いて定量した。
また、無水シトラコン酸の代わりに、無水シス−アコニット酸及び無水コハク酸を使用した以外は同様にして、上記IgGに無水シス−アコニット酸を結合させてシス−アコニット酸アミドを有するようにしたIgG誘導体（IgG-Aco）、及び上記IgGに無水コハク酸を結合させてコハク酸アミドを有するようにしたIgG誘導体（IgG-Suc）を得た（図１３参照）。
なお、IgG抗体の代わりに、前記抗マウスIgG (Fab’)2 フラグメントを使用することにより、上記各IgG誘導体と同様、IgG (Fab’)2フラグメント誘導体（すなわち、(Fab’)2-Cit、(Fab’)2- Aco、(Fab’)2- Suc）を得た。
４．NPC認識の回復
ヒト肝癌(HuH-7)細胞を、8チャンバーのカバーグラスに播種し、200μLのDulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (10% FBS)中で、一晩インキュベートした。この細胞を、4% パラホルムアルデヒドで15 min固定し、0.2 % Triton X-100を5 min膜透過させた。固定された細胞は、非特異認識を避けるため1% BSA溶液で10 min処理し、上記３.で得られた各anti-NPC IgG 誘導体 (2μg/mL; 15 nM)等と1% BSA溶液中、37°Cで1 hrインキュベートした。当該細胞は、2次抗体としてのAlexa Fluor 488標識化 抗マウス IgG (Fab’)2 フラグメント (4μg/mL; 40 nM)により、1% BSA溶液中で、37°Cで1 hr処理した。細胞核をHoechst 33258で染色した。細胞を、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）により観察した。CLSMによる観察は、20倍の対物レンズ (Plan-Apochromat, Carl Zeiss, Germany)を搭載したAxiovert 100M (Carl Zeiss, Germany)を使用し、Alexa Fluor 488及びHoechst 33258のそれぞれの励起波長である488 nm (アルゴンレーザー) 及び364 nmの波長を照射して行った。その結果を図１４Ａ及び図１４Ｂに示した。
５．PICの調製
上記２.により得られたカチオン性高分子（PEG-C6-pAsp(DET)）と、上記３.により得られたIgG誘導体（IgG-Cit，IgG-Aco，IgG-Suc）又は 抗マウスIgG (Fab’)2フラグメント誘導隊（(Fab’)2-Cit，(Fab’)2- Aco，(Fab’)2- Suc）とを用いて、以下の手順により、PICミセルを調製した。
IgG誘導体等(0.10 mg/mL; 0.67〜1.0μM)と、PEG-C6-pAsp(DET) (0.5 mg/mL)とを、それぞれ蒸留水中に溶解させた。得られた各溶液を0.2μmシリンジフィルターにより濾過した後、それらを互いに特定のN/C比（具体的にはN/C=2）となるように混合することにより、上記IgG誘導体等を内包したPICミセルを得た。ここで、N/C比とは、ブロックコポリマー（本実施例ではPEG-C6-pAsp(DET)）中のカチオン性基（例えばアミノ基）の総数（N）と、荷電変換タンパク質（本実施例ではIgG誘導体等）中のカルボキシル基の総数（C）との比を意味する。
なお、以下の実施例においては、上記混合後の液に、適宜、酢酸バッファー(pH 5.5)又はリン酸バッファー(pH 7.4)が添加された。混合液中のNaClの最終濃度は150 mMとした。
６．動的光散乱法（DLS）によるPICミセルの粒径測定（図１５、１６）
上記５.で得られたPICミセルについて、動的光散乱法（DLS）による粒径測定（粒径分布の測定）を行うため、それぞれのIgG誘導体溶液の最終濃度を25μg/mL (0.17〜0.25 μM)に調整した。当該測定は、32 nmの緑色レーザーを搭載したZetasizer Nano-ZS (green badge, ZEN3500, Malvern, Ltd. Malvern, U. K.)を用いて、37°Cで行った。その結果を図１５、１６に示した。
また、動的光散乱法（DLS）による、PICミセルの粒径及び多分散度(PDI: polydispersity index)について、下記表にも結果を示した。
７．PICミセルの崩壊（解離）（図１７）
PICミセルの崩壊率を、プローブ−プローブ 消光−発光法（probe-probe quenching-dequenching method）により測定した。Alexa-Fluorで標識した 抗マウスIgG (Fab’)2フラグメント誘導体とPEG-C6-pAsp(DET)とのPICミセルを、前記５.で記載したように調製した。総蛍光強度（I）は、フリーのIgG (Fab’) 2 フラグメントの強度(If)と、PICミセル内のIgG (Fab’) 2 フラグメント誘導体の強度(Im)との合計であると仮定したときに、以下の計算式を得た。
Im0: PICミセル内のIgG (Fab’) 2 フラグメント誘導体の初期蛍光強度；
x: フリーのIgG (Fab’) 2 フラグメントの割合）
上記式より、リリース後の抗体断片（IgG (Fab’)2フラグメント）の割合(x)を算出することができる。バッファー(pH 5.5又はpH 7.4)中におけるPICミセルのインキュベート後、Nanodrop（登録商標） ND-3300 fluorospectrometerによりサンプルの蛍光を測定した。その結果を図１７に示した。
８．抗体のエンドソームエスケープEndosomal escape
ヒト肝癌(HuH-7)細胞を、8チャンバーのカバーグラスに播種し、200μLのDulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (10% FBS)中で、一晩インキュベートした。Alexa-Fluorで標識した(Fab’)2-Cit , (Fab’)2-Aco又は(Fab’)2-Sucを内包するPICミセルを、前記５.で記載したように調製した。各サンプルをウェルに添加し、37°Cでインキュベートした。各(Fab’)2誘導体の最終濃度は5μg/mL (50 nM)とした。24 hrのインキュベート後、培地を除去し、PBSで細胞を3回洗浄した。LysoTracker Red (Molecular Probes, USA)で、酸性の後期エンドソーム及びリソソームを染色した後、細胞内での局在を共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）により観察した。CLSMによる観察は、20倍の対物レンズ (Plan-Apochromat, Carl Zeiss, Germany)を搭載したAxiovert 100M (Carl Zeiss, Germany)を使用し、Alexa Fluor 488及びLysoTraker Redのそれぞれの励起波長である488 nm (アルゴンレーザー) 及び633 nmの波長を照射して行った。その結果を図１８に示した。
９．HuH-7細胞内の抗体のNPC認識
ヒト肝癌(HuH-7)細胞を、8チャンバーのカバーグラスに播種し、200μLのDulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (10% FBS)中で、一晩インキュベートした。前記５.で記載したように調製したIgG誘導体 (final concentration of IgG: 5μg/mL (33 nM))を内包するPICミセルを、上記HuH-7細胞に添加した。37°Cで24 hrインキュベートした後、この細胞を、4% パラホルムアルデヒドで15 min固定し、0.2 % Triton X-100を5 min膜透過させ、固定された細胞を、非特異認識を避けるため1% BSA溶液で10 min処理した。IgG誘導体を検出するため、当該細胞を、2次抗体としてのAlexa Fluor 488標識化 抗マウスIgG (Fab’)2 フラグメント (4μg/mL; 40 nM)により、1% BSA溶液中で、37°Cで1 hr処理した。細胞核をHoechst 33258で染色した。細胞を、共焦点レーザスキャン顕微鏡（CLSM）により観察した。CLSMによる観察は、20倍の対物レンズ (Plan-Apochromat, Carl Zeiss, Germany)を搭載したAxiovert 100M (Carl Zeiss, Germany)を使用し、Alexa Fluor 488及びHoechst 33258のそれぞれの励起波長である488 nm (アルゴンレーザー) 及び364 nmの波長を照射して行った。その結果を図１９（特にa〜c）に示した。
１０．抗体デリバリーにより細胞増殖のコントロール
HuH-7細胞の細胞増殖性を測定するため、当該細胞をPICミセル溶液 (IgGの最終濃度: 10μg/mL (67 nM))でインキュベートした。24 hr及び48 hrのインキュベート後、MTTアッセイ (Cell Counting Kit-9, Dojindo, Kumamoto, Japan)により、当該細胞の生存率を評価した。具体的には、それぞれのウェルについて、450 nmでの吸光度を（製造元が提供したプロトコールに準じて）測定することにより評価した。その結果を図１９（特にd）に示した。評価結果は、同時にPBS (pH 7.4)中でインキュベートした対照細胞（コントロール）に対する相対値（relative value (%)）として示した。
１１．考察
本発明者は、細胞増殖をコントロールするために細胞質内に生物学的活性を有するIgG抗体を送達することに成功した。IgG抗体が目的抗原対する優れた選択性を有することを考えると、電荷変換細胞内抗体の技術は、生細胞におけるバイオイメージングや、細胞内抗原に対する生物学的治療の高い潜在性を有する。さらには、電荷変換PICミセルは、PICミセルのシェル部分のPEGにより提供される長期血中安定性や高い生体適合性に基づく、タンパク質の静注送達に好ましく適用することができる。
本発明によれば、細胞（特に細胞質）への導入効率が高く、血清中での安定性に優れ、しかも汎用性の高いタンパク質送達手段（タンパク質内包高分子ミセル複合体等）を提供することができる。また、当該手段に用いるためのタンパク質に対する電荷調節剤を提供することができる。本発明は、特に、等電点がアルカリ性及び中性付近のタンパク質の細胞内送達を容易した点で優れている。
本発明のタンパク質送達手段は、例えば、抗体医薬及び酵素補充療法用医薬等のタンパク質製剤並びにワクチン接種用製剤等の各種医薬組成物への応用も可能な点で、極めて有用なものである。
本発明のタンパク質送達手段は、例えば、抗体医薬及び酵素補充療法用医薬等のタンパク質製剤並びにワクチン接種用製剤等の各種医薬組成物への応用も可能な点で、極めて有用なものである。
Claims (12)
- 少なくとも一部にポリカチオン部分を有するカチオン性高分子と、下記式（I）で示される化合物により全体としての電荷が変換されたタンパク質とを含むことを特徴とする、ポリイオンコンプレックス。
- ポリカチオン部分が、側鎖にカチオン性基を有するポリペプチドである、請求項１記載のポリイオンコンプレックス。
- カチオン性高分子が下記一般式(1)で示されるものである、請求項１又は２記載のポリイオンコンプレックス。
R3及びR4は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、
L1は、NH、CO、下記一般式(4)：
-(CH2)p1-NH- (4)
（式中、p1は1〜6の整数を表す。）
で示される基、又は下記一般式(5)：
-L2a-(CH2)q1-L3a- (5)
（式中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜6の整数を表す。）
で示される基を表し、
m1、m2及びm3は互いに独立して0〜500の整数を表し（但し、m1、m2及びm3の合計は10〜500の整数を表す。）、m4は1〜5の整数を表し、m5は1〜5の整数を表し、nは0〜500の整数を表す。
「/」の表記は、その左右に示された(m1+m2+m3)個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕 - 前記ポリマー中の-R3基及び／又は-R4基が、下記一般式(2)：
-NH-(CH2)r-X1 (2)
（式中、X1は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、rは0〜5の整数を表す。）
で示される基、又は下記一般式(3)：
-〔NH-(CH2)s〕t -X2 (3)
（式中、X2は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。s及びtは、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH2)s〕ユニット間で独立して、sは1〜5の整数を表し、tは2〜5の整数を表す。）
で示される基を表す、請求項３記載のポリイオンコンプレックス。 - 前記R3及び／又はR4が、-NH-NH2 又は -NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2 である、請求項４に記載のポリイオンコンプレックス。
- 前記式（I）で示される化合物が、下記式（Ia）〜（Ig）で示される化合物のうちの少なくとも１種である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックス。
- 前記電荷が変換されたタンパク質は、前記式（I）で示される化合物が、塩基性又は中性タンパク質に含まれるアミノ基と結合することにより、該塩基性又は中性タンパク質の全体としての電荷が酸性タンパク質の電荷に変換されたものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックス。
- 前記カチオン性高分子中のポリカチオン部分と前記電荷が変換されたタンパク質とが静電的相互作用により結合したものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックス。
- 前記カチオン性高分子が、さらにポリエチレングリコール部分を有する高分子であって、
前記タンパク質と前記カチオン性高分子中のポリカチオン部分とがコア部分を形成し、前記カチオン性高分子中のポリエチレングリコール部分が前記コア部分の周囲にシェル部分を形成したものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックス。 - 細胞内に導入後のポリイオンコンプレックスより放出された前記タンパク質から、前記式（I）で示される化合物が解離することにより、当該タンパク質の全体としての電荷が当該タンパク質の本来有する電荷に回復することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックス。
- 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックスを含むことを特徴とする、細胞内へのタンパク質送達デバイス。
- 少なくとも一部にポリカチオン部分を有するカチオン性高分子と、下記式（I）で示される化合物とを含む、細胞内へのタンパク質送達用キット。
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