CN114080412B - 蛋白质内包高分子胶束 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及：包含蛋白质和下述式(1)所示的嵌段共聚物的高分子复合体。
Description
技术领域
本发明涉及通过使用嵌段共聚物而能够提高在严酷的in vivo环境中的稳定性的蛋白质内包高分子胶束。就引用文献的全部公开内容而言，其全部都通过参照的形式而引入本说明书。
背景技术
蛋白质是存在于活体内的所有位置的生理活性物质，因此其在癌、自身免疫疾病或代谢障碍等各种难治性疾病的治疗中有所使用。然而，就蛋白质单体的全身给药而言，由于会受到酶分解或肾排泄、并且具有免疫原性，因此对于蛋白质的活体应用，需要开发运送载体。因此，正在进行将作为活体适合性高分子的聚(乙二醇)(PEG)导入到蛋白质中而得到的蛋白质-PEG偶联物的开发，通过抑制蛋白质分解酶、抑制与免疫细胞的相互作用和通过增大尺寸，可以克服蛋白质的问题[1-4]。实际上，大量的蛋白质-PEG偶联物被FD A所承认，其作为蛋白质制剂而具有数十亿美元的市场[5,6]。然而，在通过蛋白质的PEG化而抑制酶分解、肾排泄以及免疫原性[7,8]的同时，可以举出蛋白质的不可逆化学修饰导致的蛋白质的失活、以及蛋白质功能[6,9]的时空控制不充分等的问题。因此，目前正在开发通过使蛋白质介由可逆化学键进行制剂，而能够在抑制正常组织中的蛋白质的表达的同时，使其特异性地释放至目标组织[10]中的运送载体。
刺激响应性纳米载体可以通过感知目标组织[4,11]中的生理活性物质，而在保持蛋白质的活性的同时将其特异性地释放至目标组织中。在这样的纳米载体中，就通过嵌段共聚物和蛋白质的自动缔合而形成的核-壳型高分子胶束而言，通过向嵌段共聚物的核形成链导入环境响应性部位，可以响应外部刺激[4]而诱导蛋白质的释放。作为高分子胶束能够响应的外部刺激，可以举出pH，例如，大量疾病(例如，癌或自身免疫性疾病)表现出比正常组织(pH7.4)[12,13]低的pH(pH6.5～7.2)。
另一方面，本发明者到目前为止发现了，通过将PEG-聚阳离子添加至通过pH响应性马来酸酐衍生物[14-16]而使氨基转换为羧基的蛋白质中，能够制备聚离子复合物(PIC)型高分子胶束。该胶束成功地实现了：在正常组织的pH(pH7.4)中将蛋白质稳定地内包在核中，而在目标组织内的酸性pH(pH6.5～7.2)中，pH响应性马来酸酐衍生物开裂并释放蛋白质。
然而，在面向医疗应用时，通过提高血中滞留性而增大针对目标组织的集聚性是很重要的。
现有技术文献
非专利文献
[1]R.Langer,D.A.Tirrell,Nature 2004,428,487-492.
[2]B.Romberg,W.E.Hennink,G.Storm,Pharm.Res.2008,25,55-71.
[3]V.Torchilin,Adv.Drug Deliv.Rev.2011,63,131-135.
[4]H.Cabral,K.Miyata,K.Osada,K.Kataoka,Chem.Rev.2018,118,6844-6892.
[5]Y.Qi,A.Chilkoti,Curr.Opin.Chem.Biol.2015,28,181-193.
[6]S.N.S.Alconcel,A.S.Baas,H.D.Maynard,Polym.Chem.2011,2,1442-1448.
[7]F.M.Veronese,G.Pasut,Drug Discov.Today 2005,10,1451-1458.
[8]F.F.Abuchowski,A.,McCoy,J.R.,Palczuk,N.C.,van Es,T.,Davis,J.Biol.Chem.1977,252,3582-3586.
[9]J.L.Kaar,K.Matyjaszewski,A.J.Russell,C.M.Colina,A.Sim akova,B.S.Sumerlin,C.A.Figg,S.L.Baker,AIChE J.2018,64,3230-3245.
[10]Y.Lu,W.Sun,Z.Gu,J.Control.Release 2014,194,1-19.
[11]S.Mura,J.Nicolas,P.Couvreur,Nat.Mater.2013,12,991.
[12]L.E.Gerweck,K.Seetharaman,Cancer Res.1996,56,1194 LP-1198.
[13]G.Helmlinger,F.Yuan,M.Dellian,R.K.Jain,Nat.Med.1997,3,177-182.
[14]Y.Lee,T.Ishii,H.Cabral,H.J.Kim,J.H.Seo,N.Nishiyama,H.Oshima,K.Osada,K.Kataoka,Angew.Chemie-Int.Ed.2009,48,5309-5312.
[15]Y.Lee,T.Ishii,H.J.Kim,N.Nishiyama,Y.Hayakawa,K.Itaka,K.Kataoka,Angew.Chemie 2010,122,2606-2609.
[16]A.Kim,Y.Miura,T.Ishii,O.F.Mutaf,N.Nishiyama,H.Cabral,K.Kataoka,Biomacromolecules 2016,17,446-453.
[17]P.J.G.Butler,J.I.Harris,B.S.Hartley,R.Leberman,Biochem.J.1969,112,679-689.
[18]K.Maier,E.Wagner,J.Am.Chem.Soc.2012,134,10169-10173.
[19]Y.Liu,J.Du,C.Sun,C.Xu,Z.Cao,J.Wang,Angew.Chemie Int.Ed.2015,55,1010-1014.
[20]H.C.Yen,H.Cabral,P.Mi,K.Toh,Y.Matsumoto,X.Liu,H.Koori,A.Kim,K.Miyazaki,Y.Miura,et al.,ACS Nano 2014,8,11591-11602.
[21]D.B.Rozema,D.L.Lewis,D.H.Wakefield,S.C.Wong,J.J.Klein,P.L.Roesch,S.L.Bertin,T.W.Reppen,Q.Chu,A.V.Blokhin,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.2007,104,12982-12987.
[22]A.Kishimura,A.Koide,K.Osada,Y.Yamasaki,K.Kataoka,Ang ew.Chemie-Int.Ed.2007,46,6085-6088.
[23]K.Matsumoto,Y.；Nomoto,T.；Cabral,H.；Matsumoto,Y.；Watanabe,S.；Christie,R.J.；Miyata,K.；Oba,M.；Ogura,T.；Yamasaki,Y.；Nishiyama,N.；Yamasoba,T.；Kataoka,Biomed.Opt.Express 2010,1,1209.
[24]F.Chen,R.Raveendran,C.Cao,R.Chapman,M.H.Stenzel,Polym.Chem.2019,10,1221-1230.
[25]H.Takemoto,A.Ishii,K.Miyata,M.Nakanishi,M.Oba,T.Ishii,Y.Yamasaki,N.Nishiyama,K.Kataoka,Biomaterials 2010,31,8097-8105.
[26]M.Harada-Shiba,K.Yamauchi,A.Harada,I.Takamisawa,K.Shimokado,K.Kataoka,Gene Ther.2002,9,407.
[27]Y.Wang,K.Kimura,Q.Huang,P.L.Dubin,W.Jaeger,Macromolecules 1999,32,7128-7134.
[28]Q.C.Li,P.A.Mabrouk,J.Biol.Inorg.Chem.2003,8,83-94.
[29]M.C.Hsu,R.W.Woody,J.Am.Chem.Soc.1971,93,3515-3525.
[30]R.M.Esquerra,R.A.Goldbeck,D.B.Kim-Shapiro,D.S.Klige r,Biochemistry 1998,37,17527-17536.
[31]F.M.Veronese,A.Mero,BioDrugs 2008,22,315-329.
[32]T.Arvinte,C.Palais,E.Green-Trexler,S.Gregory,H.Mach,C.Narasimhan,M.Shameem,in MAbs,Taylor&Francis,2013,pp.491-500.
[33]L.J.Kagen,A.Butt,Clin.Chem.1977,23,1813-1818.
[34]R.Vanholder,M.S.Sever,E.Erek,N.Lameire,J.Am.Soc.Nep hrol.2000,11,1553-1561.
追加参照文献
[S1]L.R.Wetter,H.F.Deutsch,J.Biol.Chem.1951,192,237-42.
[S2]R.E.Canfield,J.Biol.Chem.1963,238,2698-2707.
[S3]Q.Shi,Y.Zhou,Y.Sun,Biotechnol.Prog.2005,21,516-523.
[S4]K.Hirayama,S.Akashi,M.Furuya,K.Fukuhara,Biochem.Biophys.Res.Commun.1990,173,639-646.
[S5]B.J.Radola,Biochim.Biophys.Acta-Protein Struct.1973,295,412-428.
[S6]P.D.Darbre,A.E.Romero-Herrera,H.Lehmann,Biochim.Bioph ys.Acta-Protein Struct.1975,393,201-204.
发明内容
本发明所解决的技术问题
因此，为了增大基于治疗用蛋白质的治疗效果，开发血中滞留性增大、并且能够在酸性条件中高效释放蛋白质的胶束是很重要的。
解决技术问题的技术手段
本发明通过将pH响应性马来酸酐衍生物导入到嵌段共聚物的核形成链中，与蛋白质的氨基形成可逆共价键，从而试图实现胶束的稳定性的增大和在酸性条件下的蛋白质的高效释放。此外，还试图通过基于嵌段共聚物的核形成链的氨基和蛋白质的羧基的PIC形成而实现胶束进一步的稳定化。本发明的目的在于：通过共价键和PIC形成而使胶束结构稳定化，增大血中滞留性。
即，本发明如下。
[1]一种高分子复合体，其包含蛋白质和下述式(1)所示的嵌段共聚物，
[化学式1]
〔式中，R1以及R2分别独立地表示氢原子、或任选进行了取代的碳原子数为1～12的直链状或分支状的烷基、或叠氮、胺、马来酰亚胺、配体或标记剂，
R3表示下述式(I)所示的化合物，
[化学式2]
(式中，Ra以及Rb分别独立地表示氢原子、或任选进行了取代的烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基、酰基、杂环基、杂环烷基、羟基、烷氧基或芳氧基，并且，Ra和Rb可以相互键合，与各自键合的碳原子一同形成芳香环或环烷环，Ra以及Rb各自键合的碳原子间的键可以是单键也可以是双键)
L1表示NH、CO或下述式(11)所示的基团，
-(CH2)p1-NH-(11)
(式中，p1表示1～6的整数)
或下述式(12)所示的基团，
-L2a-(CH2)q1-L3a-(12)
(式中，L2a表示OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH或COO，L3a表示NH或CO，q1表示1～6的整数)，
m1以及m2分别独立地表示0～500的整数(其中，m1以及m2的合计表示10～500的整数)，m3、m4以及m5分别独立地表示1～5的整数，n表示0～500的整数，
“/”的符号表示其左右所示的(m1+m2)个各单体单元的排列顺序是任意的〕。
[2]根据项[1]所述的复合体，其中，
式(I)所示的化合物为下述式(Ia)～(Ig)所示的化合物中的至少1种，
[化学式3]
[3]根据项[2]所述的复合体，其中，
式(I)所示的化合物为下述式(Ia)或(Ib)所示的化合物，
[化学式4]
[4]根据项[1]所述的复合体，其中，
式1所示的嵌段共聚物为下述式(2)所示的化合物，
[化学式5]
[5]根据项[1]所述的复合体，其中，
蛋白质与式1所示的嵌段共聚物进行了共价键合。
[6]根据项[5]所述的复合体，其中，
共价键合pH依赖性地发生断裂。
[7]一种针对选自细胞表面、细胞内以及细胞外中的任一者的蛋白质运送装置，其包含项[1]～[6]中任一项所述的聚合物复合体。
[8]一种针对选自细胞表面、细胞内以及细胞外中的任一者的蛋白质运送试剂盒，其包含下述式(1)所示的嵌段共聚物，
[化学式6]
〔式中，R1以及R2分别独立地表示氢原子、或任选进行了取代的碳原子数为1～12的直链状或分支状的烷基、或叠氮、胺、马来酰亚胺、配体或标记剂，
R3表示下述式(I)所示的化合物，
[化学式7]
(式中，Ra以及Rb分别独立地表示氢原子、或任选进行了取代的烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基、酰基、杂环基、杂环烷基、羟基、烷氧基或芳氧基，并且，Ra和Rb可以相互键合，与各自键合的碳原子一同形成芳香环或环烷环，Ra以及Rb各自键合的碳原子间的键可以是单键也可以是双键)
L1表示NH、CO或下述式(11)所示的基团，
-(CH2)p1-NH-(11)
(式中，p1表示1～6的整数)
或下述式(12)所示的基团，
-L2a-(CH2)q1-L3a-(12)
(式中，L2a表示OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH或COO，L3a表示NH或CO，q1表示1～6的整数)，
m1以及m2分别独立地表示0～500的整数(其中，m1以及m2的合计表示10～500的整数)，m3、m4以及m5分别独立地表示1～5的整数，n表示0～500的整数，
“/”的符号表示其左右所示的(m1+m2)个各单体单元的排列顺序是任意的〕。
[9]根据项[8]所述的试剂盒，其中，
式(I)所示的化合物为下述式(Ia)～(Ig)所示的化合物中的至少1种，
[化学式8]
[10]根据项[9]所述的试剂盒，其中，
式(I)所示的化合物为下述式(Ia)或(Ib)所示的化合物，
[化学式9]
[11]根据项[8]所述的试剂盒，其中，
式1所示的嵌段共聚物为下述式(2)所示的化合物，
[化学式10]
附图说明
[图1]表示基于聚离子复合物形成和pH响应性酰胺键的pH响应性蛋白质内包胶束的图。
[图2]表示在表现不同pH的缓冲液中的PEG-p(Lys-CDM)的自我组织化的图。a)通过在pH7.4下的PEG-p(Lys-CDM)的计数率而规格化了的计数率(derived count rate)。向包含150mM NaCl的10mM乙酸缓冲液(pH4或pH5)，或，包含150mM NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH6.5或pH7.4)中以1mg/mL的浓度添加PEG-p(Lys-CDM)，在1分钟的涡旋振荡后孵育1小时，进行了DLS测定。数据以平均±标准偏差(n＝3)的形式表示。b)在pH7.4下形成的Empty-PIC胶束(空胶束)的粒径分布。
[图3]表示在pH7.4的缓冲液中制备的空胶束的稳定性的图。将空胶束添加至包含150mM NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH6.5(灰色点)或7.4(黑色点))中，以使得最终浓度为0.5mg/mL的方式进行调整，进行了DLS测定。a)为粒径，b)为PDI，以及c)为通过稀释前的计数率而规格化了的计数率。
[图4]表示针对HEK 293细胞的、PEG-p(Lys-CDM)(灰色线)的in vitro细胞毒性的图(将细胞在不同的聚合物浓度下培养48小时后的图)。PEG-p(Ly s)(黑线)作为对照而使用。数据以平均±标准偏差(n＝4)的形式表示。
[图5]表示在表现不同pH的溶液中的蛋白质内包胶束的稳定性的图。pH6.5(灰色线)以及pH7.4(黑线)的10mM磷酸缓冲液中的myo/m(灰色圆以及黑圆)以及CC-myo/m(白圆)的粒径(a)以及PDI(b)。
[图6]表示用表现不同pH的包含600mM NaCl的10mM磷酸缓冲液稀释后的myo/m的稳定性的图。pH6.5(灰色线)以及pH7.4缓冲液(黑线)中的myo/m的粒径(a)，以及规格化了的计数率(b)。可以看出在pH6.5的缓冲液中myo/m崩解了。
[图7]表示在包含150mM NaCl的10mM磷酸缓冲液中的Alexa Fluor 647标记肌红蛋白从myo/m(pH7.4，pH6.5)中的释放的图。
[图8]表示肌红蛋白活性的评价的图。a)O2气体导入后的氧型肌红蛋白(灰色线)，以及Ar气体导入后的还原型肌红蛋白(黑线)的UV/Vis吸收光谱。插入图：从胶束中释放的肌红蛋白的500～600nm处的光谱。b)O2气体导入后的天然的氧型肌红蛋白(灰色线)，以及Ar气体导入后的还原型肌红蛋白(黑线)的UV/Vis吸收光谱。插入图：500～600nm处的天然肌红蛋白的光谱。c-d)表示将O2(正方形标记)/Ar(三角标记)气体交替导入时释放的肌红蛋白(c，白标记)以及天然肌红蛋白(d，黑标记)的414nm处的吸光度。
[图9]表示通过IV-CLSM测定的荧光标记肌红蛋白、CC-myo/m以及myo/m的血中滞留性的图。a)-c)使用Alexa Fluor 647标记肌红蛋白(红色)而制备的a)肌红蛋白单体、b)CC-myo/m以及c)myo/m。d)-e)使用Alexa Fluor 647标记聚合物(红色)而制备的d)CC-myo/m以及e)myo/m。使用刚施用样品时的显微镜图像(a～e，左面板)的静脉(红梯形)以及皮肤(绿梯形)中的荧光强度进行了规格化和定量(a～e，右面板)。
[图10]表示肾脏、肝脏以及脾脏中的荧光标记肌红蛋白、CC-myo/m以及myo/m的微分布的图。a)-c)使用Alexa Fluor 647标记肌红蛋白(红色)制备的a)肌红蛋白单体、b)CC-myo/m、c)myo/m。d)-e)使用Alexa Fluor 647标记聚合物(红色)制备的d)CC-myo/m、e)myo/m。细胞核使用Hoechst(cyan)进行了染色。比例尺：100μm。
[图11]表示PEG-p(Lys-TFA)的化学分析的图。a)DMSO-d6中的PEG-p(Lys-TFA)的1H-NMR谱，b)PEG-p(Lys-TFA)的GPC色谱，表现出了单峰性的峰和较窄的分子量分布(Mw/Mn＝1.03)。(流速:0.8mL/分钟，移动相:含有10mM LiCl的DMF溶液)。
[图12]表示PEG-p(Lys)的化学分析的图。a)D2O中的PEG-p(Lys)的1H-NMR谱，b)PEG-p(Lys)的GPC色谱。(流速:0.75mL/分钟，移动相:10mM乙酸盐以及500mM NaCl的乙酸缓冲食盐水(pH3.3))。
[图13]表示PEG-p(Lys-CDM)的特征标志的图。a)DMSO-d6中的PEG-p(Lys-CDM)的1H-NMR谱，b)PEG-p(Lys-CDM)的水相GPC色谱。(流速:0.75mL/分钟，洗脱液:10mM乙酸盐以及500mM NaCl的乙酸缓冲食盐水(pH 3.3))。
[图14]表示PEG-p(Lys-CDM)的特征标志的图。a)10mM氘化磷酸缓冲液(0.70ml)中的PEG-p(Lys-CDM)的1H-NMR谱(25℃，pH7.4)。可以认为由于胶束形成，聚合物中的质子的迁移率受到限制，因此聚氨基酸的质子来源的峰强度比根据PEG的质子来源的峰所预想的强度更低。b)添加2M氘盐酸(体积比1:35)孵育10分钟后的PEG-p(Lys-CDM)的1H-NMR谱。通过酸处理，聚氨基酸的质子来源的峰强度恢复约75％，这一点显示了由于在酸性条件下的胶束的崩解，聚合物中的质子的迁移率增加。
[图15]表示DMEM中的1mg/mL PEG-p(Lys-CDM)的尺寸分布的图。
[图16]溶菌酶(左)、肌红蛋白(中央)以及BSA内包胶束的(右)的TEM图像。比例尺:50nm。胶束的形态通过TEM(JEM-1400,JEOL)观察。用磷钨酸(PTA)(2％，w/v)染色蛋白质内包胶束，置于400目铜网上。图像以5万倍的倍率拍摄。
[图17]表示IL-12内包胶束的胶束的尺寸分布的图。
[图18]表示IL-12从IL-12内包胶束中的释放的图。
[图19]表示基于IL-12内包胶束的小鼠脾细胞中的INF-γ分泌量的图。
本发明的具体实施方式
治疗用蛋白质被期待用于难治性疾病的治疗，但就它们的全身给药而言，可以举出不稳定性、半减期短以及非特异性免疫反应等各种问题。因此，通过刺激响应性纳米载体而运送蛋白质的方法可能成为对目标组织中的蛋白质的活性进行组织选择性增强的有效策略。在本发明中，为了使搭载的蛋白质依赖pH而释放，而开发了具有在蛋白质和嵌段共聚物间形成聚离子复合物，介由可以在给定的pH条件下断裂的共价键而将蛋白质胶囊化的能力的高分子胶束。
羧基二甲基马来酸酐(CDM)-酰胺键在生理学的pH(pH7.4)下虽然是稳定的，但在pH6.5，即肿瘤以及炎症组织的病态生理学的pH下会断裂。因此，选择CDM作为pH响应性官能团。在本发明中，通过使用具有45％的CDM加成的聚(乙二醇)-聚(L-赖氨酸)嵌段共聚物，而以50％以上的效率内包具有各种分子量以及等电点的不同的蛋白质。通过使用肌红蛋白内包胶束(myo/m)作为模型，对生理学的条件下的胶束的稳定性、以及pH6.5下的胶束的崩解以及功能性肌红蛋白的释放进行了确认。并且myo/m与肌红蛋白单体、以及只通过不含共价键的静电相互作用而缔合的胶束相比，血中半减期提高。因此通过所述模型，表现出了用于对治疗用蛋白质进行in vivo运送的系统的有用性。
CDM-酰胺键在pH6.5[17-19]下不稳定，由此能够在病态学的pH下释放共轭氨基化合物，因此，在本发明中，选择CDM作为pH响应性部位。因此，得到的蛋白质内包胶束在生理学的pH下形成稳定的交联核，但在pH6.5下分解为游离嵌段共聚物以及活性蛋白质(图1)。因此在本发明中，对这些胶束内包各种蛋白质的能力进行了评价。并且本发明者通过使用内包有肌红蛋白或IL-12的胶束作为模型，对胶束的in vitro稳定性以及在不同pH下的蛋白质释放、以及全身给药后的in vivo下的血中滞留性进行了评价。
1.本发明的聚合物复合体
本发明的聚合物复合体为蛋白质内包高分子胶束复合体(聚离子复合物：PIC)，所述聚合物复合体包含特定的阳离子性聚合物(嵌段共聚物(也称为嵌段共聚体)、接枝共聚物等)、蛋白质(蛋白质的详细内容如后所述)。
(1)阳离子性聚合物
作为本发明的PIC的构成成分的特定的阳离子性高分子是在至少一部分上具有聚阳离子部分的阳离子性高分子。该阳离子性高分子例如可以是具有聚乙二醇(PEG)部分以及聚阳离子部分的嵌段共聚物或接枝聚合物，无特别限定。可以根据本发明的PIC的用途等而适宜选择优选的方式。
作为所述PEG以及聚阳离子，其结构(例如聚合度等)无特别限定，可以选择任意的结构。其中作为聚阳离子，优选在侧链上具有阳离子性基团的聚肽。此处的“阳离子性基团”不限于配位有氢离子而已成为阳离子的基团，也包含只要配位氢离子就成为阳离子的基团。作为这样的阳离子性基团，包含所有公知的阳离子性基团。在侧链上具有阳离子性基团的聚肽除了具有碱性侧链的公知的氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸等)进行肽键合而成的化合物之外，还包括各种氨基酸进行肽键合，而其侧链(例如天冬氨酸或谷氨酸的侧链)以具有阳离子性基团的形式进行了取代的化合物。
作为所述特定的阳离子性高分子，具体而言，例如，可以优选地举出下述通式(1)所示的嵌段共聚物。
[化学式11]
此处，在通式(1)的结构式中，重复单元数(聚合度)为n的嵌段部分为PEG部分，重复单元数为m1的部分和m2的部分组合起来的嵌段部分(在通式(1)中，为[]内所示的部分)为聚阳离子部分。此外，聚阳离子部分的结构式中的“/”的符号表示其左右所示的各单体单元的排列顺序是任意的。例如，在将由A以及B这样的单体单元所构成的嵌段部分表示为[-(A)a-/-(B)b-]的情况下，表示包含a个A和b个B的合计(a+b)个各单体单元可以随机地以任何顺序连接(其中，所有的A和B以直链状连接)。
通式(1)中，R1以及R2分别独立地表示氢原子、或任选进行了取代的碳原子数为1～12的直链状或分支状的烷基、或叠氮、胺、马来酰亚胺、配体或标记剂等官能团。
作为所述碳原子数为1～12的直链状或分支状的烷基，例如，可以举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、癸基以及十一烷基等。或作为所述烷基的取代基，例如，可以举出缩醛化甲酰基、氰基、甲酰基、羧基、氨基、碳原子数为1～6的烷氧基羰基、碳原子数为2～7的丙烯酰胺基、烷氧基、甲硅烷氨基、以及三烷基甲硅烷氧基(各烷基甲硅烷氧基分别独立，碳原子数为1～6)等。
配体分子是指为了靶向特定的活体分子而使用的化合物，例如，可以举出抗体、适体、蛋白质、氨基酸、低分子化合物、活体高分子的单体等。作为标记剂，例如可以举出稀土类荧光标记剂、香豆素、二甲基氨基磺酰基苯并噁二唑(DBD)、丹酰、硝基苯并噁二唑(NBD)、芘、荧光素、荧光蛋白质等的荧光标记剂，但不限于这些。
在所述取代基为被缩醛保护的甲酰基的情况下，该取代基在酸性的温和条件下水解时可以转化为作为其他取代基的甲酰基(或醛基；-CHO)。此外，在所述取代基(特别是R1中的取代基)为甲酰基、或羧基或氨基的情况下，例如，可以使其介由这些基团，与抗体或其片段或其它具有功能性或目标指向性的蛋白质等结合。
通式(1)中，R3表示下述通式(I)所示的化合物。
[化学式12]
所述式(I)中，Ra以及Rb分别独立地表示氢原子、或任选进行了取代的烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基、酰基、杂环基、杂环烷基、羟基、烷氧基或芳氧基。此外，Ra和Rb可以键合，与各自键合的碳原子一同形成芳香环或环烷环。此外，在式(I)中，Ra以及Rb各自键合的碳原子间的键可以是单键也可以是双键，无特别限定。式(I)中，为了将两种键形式一同表示，在该碳原子间以一根实线和另一根虚线表示。
L1表示NH、CO、下述通式(11)所示的基团，
-(CH2)p1-NH- (11)
(式中，p1表示1～6的整数)
或下述通式(12)所示的基团，
-L2a-(CH2)q1-L3a- (12)
(式中，L2a表示OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH或COO，L3a表示NH或CO，q1表示1～6的整数)。
在所述式(1)中，m1以及m2分别独立地表示0～500的整数(其中，m1以及m2的合计表示10～500的整数)，m3、m4以及m5分别独立地表示1～5的整数。所述式(1)中，n表示PEG部分的重复单元数(聚合度)，更具体而言表示1～500(优选为100～400，更优选为200～300)的整数。
通式(1)所示的阳离子性高分子的分子量(Mn)无特别限定，优选为23000～45000，更优选为28000～34000。此外，对于各个嵌段部分，PEG部分的分子量(Mw)优选为8000～15000，更优选为10000～12000，聚阳离子部分的分子量(Mn)优选整体为15000～30000，更优选为18000～22000。
通式(1)所示的阳离子性高分子的制造方法无特别限定，例如，可以举出预先合成包含R1和PEG链的嵌段部分的区段(PEG区段)，在该PEG区段的一个末端(与R1相反的末端)按顺序聚合给定的单体，然后根据需要以使得侧链包含阳离子性基团的形式进行取代或转换的方法，或，预先合成所述PEG区段和具有包含阳离子性基团的侧链的嵌段部分，使它们相互连接的方法等。该制法中的各种反应的方法以及条件可以考虑常规方法而适宜选择或设定。
在本发明的一个实施方式中，式(I)所示的化合物为下述式(Ia)～(Ig)所示的化合物的至少1种。
[化学式13]
在本发明的优选的方式中，式(I)所示的化合物为下述式(Ia)或(Ib)所示的化合物。
[化学式14]
在式(I)中，取代基为饱和或不饱和的非环式或环式烃基。在非环式烃基的情况下，可以是直链状或分支状中的任一种。作为烃基，例如可以举出C1-C20烷基、C2-C20烯基、C4-C20环烷基、C6-C18芳基、C6-C20芳烷基、C1-C20烷氧基、C6-C18芳氧基。
式(I)所示的化合物作为电荷调节剂而使用。式(I)所示的化合物将碱性或中性蛋白质的作为整体的电荷转换为酸性蛋白质的电荷。换言之，可以认为本发明的电荷调节剂对于总电荷处于正(+)侧或中性状态下的蛋白质，以使得其变为总电荷处于负(-)侧的蛋白质的形式，对电荷量进行控制而进行总电荷的转换。具体而言，所述总电荷的转换通过所述式(I)所示的化合物或其衍生物与蛋白质中包含的氨基(具有正电荷的基团)结合，使蛋白质整体为负电荷而进行。为了该目的，该结合例如是所述式(I)所示的化合物和蛋白质中的氨基结合(共价键合)，以下述式(I’)所示的结构而形成。
[化学式15]
关于所述结合，例如，在所述式(I)所示的化合物为所述式(Ib)以及(Ic)所示的化合物的情况下，该结合后的所述式(I’)所示的结构如下。
[化学式16]
在本发明的另一方式中，式1所示的嵌段共聚物如下述式2所示。
[化学式17]
(2)蛋白质
在本发明的PIC中，就作为核部分的构成成分的蛋白质而言，只要是通过所述式(I)所示的化合物而作为整体的电荷被转换了的蛋白质(电荷转换蛋白质)即可，具体而言，只要是总电荷从碱性或中性蛋白质的总电荷(正侧或中性的状态)被转换到与酸性蛋白质的总电荷同样地处于负侧的蛋白质即可。以使总电荷为负侧的形式进行了转换的蛋白质可以认为作为蛋白质整体而言是阴离子性的物质(聚阴离子)。因此，通过与所述阳离子性高分子中的聚阳离子部分的静电性相互作用，能够容易地形成胶束状复合体，而这对碱性或中性蛋白质而言是难以形成的。
作为本发明中使用的蛋白质的种类，只要是包含在原本为碱性或中性蛋白质中的蛋白质即可，无特别限定。本发明中使用的蛋白质除了单纯蛋白质以外，还包含糖蛋白以及脂质蛋白等。此外，本发明中使用的蛋白质不限于包含全长氨基酸序列的蛋白质，也包含其部分片段以及肽等，此外，也包含含有二分子(二聚体)以上的蛋白质、或其部分序列或全长序列彼此的融合蛋白质。此外，本发明中使用的蛋白质不限于由天然氨基酸构成的蛋白质，还包含至少一部分含有非天然氨基酸作为构成成分的修饰蛋白。此外，本发明中使用的蛋白质还包含根据需要而适宜添加有各种标记物质等的蛋白质。作为本发明中使用的蛋白质的具体例，例如，可以举出血红素蛋白、各种细胞因子、各种酶、或抗体(例如、针对核膜孔复合体的抗体等)或抗体片段等，但不限于这些。
(3)聚离子复合物(PIC)
本发明的PIC可以认为是如下的核-壳型的胶束状复合体：蛋白质和所述阳离子性高分子中的一部分(聚阳离子部分)进行静电性相互作用而形成核部分，该阳离子性高分子中的其他部分(包含PEG部分的部分)在核部分的周围形成壳部分的状态下的核-壳型的胶束状复合体。
本发明的PIC例如可以通过将蛋白质和阳离子性高分子在任意的缓冲液(例如Tris缓冲液等)中混合而容易地制备。阳离子性高分子和蛋白质的混合比无特别限定，在本发明中，例如，可以将嵌段共聚物中的阳离子性基团(例如氨基)的总数(N)和蛋白质中的羧基的总数(C)的比(N/C比)设为0.1～200，也可以设为0.5～100，也可以设为1～50。N/C比为所述范围时，出于能够减少游离的阳离子性高分子等的点，是优选的。需要说明的是，所述阳离子性基团(N)是指能够与内包在胶束内的蛋白质中的羧基通过静电性相互作用而形成离子键的基团。
本发明的PIC的大小无特别限定，例如，基于动态光散射测定法(DLS)的粒径优选为5～200nm，更优选为10～100nm。
本发明的PIC在被导入细胞内后，会释放内包的蛋白质，此时，通过细胞质内的pH环境的变化(变化为弱酸性环境下(例如pH5.5左右))，所述式(I)所示的化合物会从该蛋白质上解离(键断裂)。由此，该蛋白质的作为整体的电荷(总电荷)会恢复到该蛋白质原来具有的固有电荷(总电荷)，因此，在导入的细胞内，该蛋白质能够以其结构以及活性等得到再生的状态而存在。
2.蛋白质运送装置
在本发明中，提供包含所述聚离子复合物(PIC)的蛋白质运送装置。本发明的蛋白质运送装置可以作为实现以下目的的手段而使用：利用细胞内外的氧化还原环境的变化，将内包在PIC的核部分中的期望的蛋白质(电荷转换蛋白质)高效地导入至靶细胞的选自细胞表面、细胞内以及细胞外中的任一者。
具体而言，用包含内包期望的蛋白质的PIC的溶液对被验动物进行给药，使其被体内的靶细胞吸收。然后，在被吸入细胞内的PIC到达核内体时，式(I)所示的化合物从蛋白质上脱离，由于PIC内的电荷平衡变化，PIC崩解。PIC崩解时，蛋白质从PIC中解放，同时从PIC中解离的聚合物会使核内体膜受损。由于核内体会由此而被破坏，因而能够达成将释放的蛋白质运送至细胞质内。
例如如果是内包了IL-12等细胞因子的胶束，则为了在细胞外释放蛋白质而使蛋白质与细胞表面的受体结合，可以将细胞表面设为运送的对象。在以胶束运送在细胞内发挥功能的酶的情况下，为了在细胞内释放蛋白质而使酶发挥功能，可以将细胞内设为运送的对象。在运送抗体时，由于也存在以分泌至细胞外的蛋白质为目标的情况，因此也可以将细胞外设为运送的对象。当然，也可以将细胞表面、细胞内以及细胞外中的2个或3个的组合设为运送的对象。
本发明的蛋白质运送装置可以适用于人类、小鼠、大鼠、兔子、猪、狗以及猫等各种哺乳动物，无特别限定。对被验动物的给药方法通常采用静脉滴注等非经口用法，给药量、给药次数以及给药期间等各条件可以根据被验动物的种类以及状态而适宜设定。
本发明的蛋白质运送装置可以在将期望的蛋白质导入至作为各种疾病的原因的细胞中的治疗(例如，酶补充疗法、使用抗体的免疫疗法等)中使用。因此本发明也可以提供包含所述PIC的医药组合物(例如，酶补充疗法用或免疫治疗用等的医药组合物)，以及使用所述PIC的各种疾病的治疗方法(例如，酶补充疗法、使用抗体的免疫疗法等)。需要说明的是，给药的方法以及条件与上述同样。
关于所述医药组合物，可以适宜地选择并使用药剂制造上一般使用的赋形材料、充填材料、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂、分散剂、缓冲剂、保存剂、溶解辅助剂、防腐剂、矫味矫臭剂、舒缓剂、稳定化剂以及等渗化剂等，通过常规方法而制备。此外，医药组合物的形态通常采用静脉内注射剂(包含点滴)，例如，以单位给药量安瓿或多给药量容器的状态等进行提供。
3.蛋白质运送用试剂盒
本发明的蛋白质运送用试剂盒的特征在于包含所述嵌段共聚物。该试剂盒例如可以优选地用于酶补充疗法、使用了抗体的免疫治疗方法等使用了期望的蛋白质的各种治疗方法等。
本发明的试剂盒中，阳离子性高分子的保存状态无特别限定，可以考虑其稳定性(保存性)以及使用容易性等而选择溶液状或粉末状等状态。本发明的试剂盒可以在所述嵌段共聚物之外，包含其他构成要素。作为其他构成要素，例如，可以举出各种缓冲液、导入细胞内的各种蛋白质(电荷转换蛋白质)、溶解用缓冲液以及使用说明书(使用手册)等。本发明的试剂盒用于制备以导入靶细胞内的期望的蛋白质为核部分的聚离子复合物(PIC)，制备的PIC可以作为针对靶细胞的蛋白质运送装置而有效地使用。
实施例
以下将举出实施例对本发明进行更为具体的说明，但本发明不限于此。
1.材料以及方法
1.1.材料
从NOF公司(东京，日本)处购入了α-甲氧基-ω-氨基-聚(乙二醇)(MeO-PEG-NH2；Mn＝12000)。从中央化成品(株式会社)(东京，日本)处购入了N-三氟乙酰基-L-赖氨酸N-羧酸酐(Lys(TFA)-NCA)。从东京化学工业(株式会社)(东京，日本)处购入了草酰氯、2-丙酸-3-甲基马来酸酐、二氯甲烷(CH2CL2)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲苯、甲醇以及氧化氘(99.8原子％D)。从Thermo Fisher(Waltham,MA,U.S.A.)处购入了Alexa Fluor 647NHS酯(SuccinimidylEster)，从Sigma Aldrich(St.Louis,MO,U.S.A.)处购入了DMSO-d6以及Dulbecco的修饰eagle培养基(DMEM)，从大日本住友制药(大阪，日本)处购入了胎牛血清(FBS)。从同仁化学研究所(熊本，日本)处购入了细胞计数试剂盒-8(CCK-8)。从SpectrumLaboratories Inc.(Rancho Dominguez,CA,U.S.A.)处购入了透析膜，从Sartorius(Gottingen,Germany)处购入了Vivaspin 6离心分离过滤单元(包含1万MWCO(分子量断裂)、3万MWCO以及10万MWCO)。
1.2.仪器
质子核磁共振(1H-NMR)谱是使用具有400MHz的频率的JEOL ECS-400分光计(JOELLtd.，日本)而取得的，化学位移以百万分率(ppm)的形式进行计算。聚合物的分子量分布通过凝胶渗透色谱(GPC)而测定，有机相GPC在具备TSK凝胶G4000HHR以及G3000HHR柱的TOSOHHLC-8220系统(Tosoh，日本)上实施，使用聚(乙二醇)标准作为校正(PolymerLaboratories,Ltd.,UK)。水相GPC测定在JASCO LC-EXTREMA系统上实施，所述系统是搭载有尺寸排除柱Superdex 200-10/300GL(GE Healthcare；U.S.A.)的JASCO LC-EXT REMA系统(JASCO,日本)。尺寸分布以及Zeta电位分别通过动态光散射(DLS)以及激光多普勒电泳、使用Zetasizer Nano-ZS(Malvern,U.K.)而测定。来自荧光胺测定的荧光强度介由ND-3300Nanodrop荧光分光计(Thermo Fisher,U.S.A.)而测定。UV/Vis分光测定通过V-500分光光度计(JASCO，日本)进行。
1.3.PEG-poly(L-Lysine-CDM)嵌段共聚物的合成
就PEG-聚(L-赖氨酸)嵌段共聚物(PEG-p(Lys))而言，是通过对已报道[20]的方法进行少量变更而如下制备的。
使MeO-PEG-NH2(Mn＝12000)和Lys(TFA)-NCA反应，通过开环聚合而形成PEG-p(Lys-TFA)，然后使三氟乙酰基脱保护。简单来说，将MeO-PEG-NH2(1g，0.083mmol)以及Lys(TFA)-NCA(1.005g，3.75mmol)分别溶解在包含DMF的1M硫脲中后，将NCA溶液在氩气氛围下移至PEG溶液中，在35℃下搅拌3天。通过使聚合物在二乙醚中沉淀，在真空下干燥而以白色粉末的形式回收。聚合度通过1H-NMR法(DMSO-d6,80℃)求得，分子量分布使用GPC进行调查(移动相:包含DMF的10mM LiCl；温度:40℃；流速:0.8m L/min；检测器:折射率)。此外，保护基TFA通过在1M NaOH甲醇溶液中、在35℃下处理一晚，然后使用6～8kD MWCO透析膜相对于水进行透析而除去。冷冻干燥后，将最终生成物以白色粉末的形式而得到。脱保护的聚合物的成分通过1H-NMR法(D2O，25℃)进行分析。在1H-NMR谱中，通过PEG的-OCH 2CH 2以及赖氨酸的-C3 H 6的质子来源的峰的强度比，确定PEG-p(Lys)嵌段共聚物的组成。分子量分布通过GPC而分析(移动相：10mM乙酸盐以及500mM NaCl乙酸缓冲食盐水(pH3.3)；室温；流速：0.75mL/分钟；检测器：UV，波长220nm)。
PEG-p(Lys-CDM)通过使CDM的酰氯与PEG-p(Lys)反应而制备。首先，对已报道[21]的记载进行少量的修正而制备了CDM的酰氯(CDM-Cl)。将2-丙酸-3-甲基马来酸酐(CDM，200mg，1.09mmol)溶解到无水甲苯中，在真空下进行蒸发。将CDM溶解到无水CH2CL2(15mL)中，然后添加草酰氯(4mL，5.9g，46mmol)，使其与CDM在室温下反应12小时。接下来，将CH2CL2以及残留草酰氯通过蒸发而除去，得到透明的油。加入然后CH2CL2(4ml)使CDM-Cl溶解，另外，使用CH2CL2(20ml)溶解PEG-p(Lys)(200mg，0.011mmol)。接下来，将PEG-p(Lys)溶液移至CDM-Cl溶液中，将反应物在室温下搅拌。12小时后，通过二乙醚沉淀以及一晚的真空干燥而回收生成物。最终生成物通过1H-NMR以及GPC进行分析。
S1.化学反应方案，聚合物合成以及化学分析
[化学式18]
方案s1：酰氯-CDM以及PEG-p(Lys-CDM)嵌段共聚物的合成方案。
在方案S1中，n＝272、m＝37、x＝20、y＝17。
[化学式19]
方案S2：CDM衍生物与氨基反应，形成酰胺键，生成羧基。
[化学式20]
方案s3：PEG-p(Lys-CDM)与蛋白质中的羧基形成PIC，介由pH响应性CDM部分而与蛋白质中的氨基发生共价键合。
在方案S3中，n＝272、m＝37、x＝20、y＝17。
1.4.不内包蛋白质的核交联聚离子复合物(PIC)胶束(空PIC胶束)的制备，以及各种pH条件中的稳定性
在pH4或5的乙酸缓冲液、或pH6.5或7.4的磷酸缓冲液(具有150mM NaCl的10mM乙酸或磷酸)中制备聚合物溶液(1mg/mL)。将聚合物在不同的pH下溶解到缓冲液中(1分钟涡旋振荡，1小时孵育)。将溶液通过0.22μm针筒过滤器进行过滤，然后进行了DLS测定。此外，在氘化磷酸缓冲液(10mM)中、在pH7.4下制备聚合物溶液，在添加氘盐酸(DCl)的前后通过1H-NMR法进行了解析。
此外，在pH7.4的缓冲液中自动缔合的空PIC胶束在使用了聚合物的最终浓度为0.5mg/ml的150mM NaCl的pH6.5或7.4的10mM磷酸缓冲液中静置，通过DLS对这些条件下的空PIC胶束的稳定性进行了随时间推移的评价。对于基于强度的尺寸分布、多分散性指数(PDI)、以及计数率进行了评价。
1.5.In vitro细胞毒性
对PEG-p(Lys-CDM)的invitro细胞毒性以人类胎儿肾细胞293(HEK 293)细胞株为对象进行了评价。在该实验中使用PEG-p(Lys)作为对照。以具有10％FBS的DMEM培养基将细胞以每孔3000个的形式播种在96孔板上，在5％CO2，37℃下孵育24小时。接下来，将细胞暴露在各浓度的聚合物中。在与聚合物孵育48小时后，细胞毒性通过基于测定450nm下的甲臜吸光度的CCK-8测定进行评价。此外，将PEG-p(Lys-CDM)嵌段共聚物溶解在DMEM中(1分钟涡旋振荡，1小时孵育)，通过DLS对得到的溶液进行评价。
1.6.肌红蛋白内包胶束(myo/m)的制备以及物理化学性评价
将PEG-p(Lys-CDM)聚合物(3mg/mL)溶解在pH5的缓冲液(10mM乙酸盐)中抑制空PIC胶束的形成，在缓冲液(10mM磷酸盐,pH8)中制备0.1摩尔当量的肌红蛋白溶液。将2种溶液混合后，将溶液调整至pH7.4，搅拌6小时。接下来，使用pH7.4的磷酸缓冲食盐水(包含150mM NaCl的10mM磷酸盐)，使用100000MWCO的离心过滤器进行超滤，从而纯化胶束，除去未结合的蛋白质以及聚合物。此外，为了对内包效率进行评价，用Alexa Fluor 647琥珀酰亚胺酯标记肌红蛋白，通过GPC(作为移动相，pH7.4的包含150mM NaCl的10mM磷酸缓冲液；流速0.75mL/分钟；室温)对混合溶液进行分析。
在荧光检测设定中，设定了激发波长650nm、发光波长668nm。内包效率通过将被内包的蛋白质的量除以蛋白质的添加量而算出。此外，使用荧光相关分光法(FCS)，对平均每胶束中内包的Alexa Fluor 647标记肌红蛋白的量进行了定量。FCS实验使用装备了波长633nm的激光光束的MF-20(Olympus，日本)，在室温下实施。此外，溶菌酶以及白蛋白也通过相同的方法内包在胶束中，胶束的尺寸通过DLS确定。
1.7.CDM修饰肌红蛋白内包胶束(CC-myo/m)的制备以及物理化学性评价
CDM修饰肌红蛋白(CC-myo)内包胶束(CC-myo/m)依照对已报道[14,16]的方法进行少量修正的方法，作为对照胶束而制备。简单地说，将肌红蛋白溶解在0.1M的NaHCO3缓冲液中制作2mg/mL的溶液，在4℃下搅拌30分钟。接下来，将50摩尔当量的CDM缓缓地添加至该溶液中，在4℃下搅拌2小时。通过使用了10000MWCO的离心过滤器的超滤纯化该肌红蛋白溶液。通过使用了Nanodrop荧光光谱仪(Thermo Fisher,U.S.A.)的荧光胺法确定CDM修饰的效率，依照已报道的方法[16]算出转换了的胺的比例。然后，通过将PEG-p(Lys)与电荷转换肌红蛋白混合，制作CC-myo/m，以2:1的N/C(氨基/羧基)比在pH7.4的磷酸缓冲生理盐水中滴定。此外，以相同聚合物对蛋白质摩尔当量而使用PEG-p(Lys)以及天然肌红蛋白的混合物为对照。胶束的尺寸分布、多分散指数(PDI)以及Zeta电位通过Zetasizer Nano ZS进行分析。
1.8.针对不同的盐浓度以及不同的pH缓冲液的、肌红蛋白内包胶束的稳定性
为了对针对不同的pH条件的myo/m以及CC-myo/m的in vitro稳定性进行试验，而将样品稀释，使其为0.5mg/mL的聚合物浓度。在具有150mM的NaCl溶液的pH6.5或pH7.4的10mM磷酸缓冲液中孵育胶束，通过DLS进行了随时间推移的测定(25℃)。用Zetasizer NanoZS记录尺寸分布、PDI以及得到的计数率。此外，使用高浓度的盐缓冲液屏蔽静电相互作用，对胶束的稳定性进行了调查。制备myo/m以及CC-myo/m，以使得聚合物浓度为0.5mg/mL的方式进行稀释。在pH7.4以及pH6.5的包含600mM NaCl的5L的10mM磷酸缓冲液中、20000MWCO透析盒中对胶束溶液进行透析。在不同的时间点，从透析盒的内侧采集样品，通过使用了DLS的分析对胶束的崩解进行追踪。
1.9.在不同的pH条件下的肌红蛋白从myo/m中的释放
使用具有20000Da的MWCO的透析盒，在5L的10mM磷酸缓冲液以及150mM NaCl中，在pH7.4以及pH6.5、室温下对Alexa Fluor 647标记myo/m进行透析。在给定的时间点从透析盒的内侧采集样品，使用NanoD rop 3300荧光光谱仪对荧光强度进行了评价。
1.10.肌红蛋白活性的评价
将肌红蛋白在10mM磷酸缓冲液+150mM NaCl的稀释条件下、在pH 6.5下孵育一晚，然后通过以30000MWCO的离心过滤器进行超滤，使其从胶束中释放。收集过滤器通过物，接下来，通过使用了10000MWCO的离心过滤器的超滤浓缩至0.05mg/mL。肌红蛋白活性基于已报道的方法[22]进行了评价。分光测定是使用光学长度1cm的石英皿，以UV/Vis分光计进行的。被释放的肌红蛋白(0.05mg/mL)通过添加5当量的连二亚硫酸钠(NaS2O4)水溶液而还原。然后，被还原的肌红蛋白通过导入30分钟O2而氧化，并进一步通过氩气的2小时起泡而还原。依照已报道的方法步骤[22]而重复数次氧化/还原循环。作为对照，使用了相同浓度的天然肌红蛋白。
1.11.In vivo血中滞留性以及活体内分布
使用Alexa Fluor 647标记肌红蛋白，制备myo/m、CC-myo/m以及游离肌红蛋白，使用Nikon A1R活体内共焦点激光扫描显微镜(IV-CLSM)(Nikon，日本)对肌红蛋白的血中滞留性以及活体内分布进行了追踪。对于5周龄的Balb/c雌小鼠，通过尾静脉给药在麻醉下注射包含100μg/mL的荧光标记肌红蛋白的100μL的样品溶液，对耳朵毛细血管进行了观察[23]。对耳朵静脉以及皮肤中的荧光强度连续地进行测定。在注射的12小时后，使小鼠安乐死，采集器官(肾脏、肝脏以及脾脏)，并通过IV-CLSM在ex vivo下进行了图像化。需要说明的是，在安乐死以及脏器采集的30分钟前，为了进行核染色而将100μL的Hoechst 33342溶液介由尾静脉进行了给药。此外，使用Alexa Fluor 647标记聚合物以及非标记肌红蛋白，制备了用于对血液中的胶束中的聚合物的血中滞留性进行追踪的myo/m以及CC-myo/m。对于小鼠，使用具有2mg/mL的荧光标记聚合物的100μL的样品溶液进行尾静脉给药，在显微镜下对耳朵毛细血管进行图像化。需要说明的是，本试验的所有动物实验都是依照东京大学实验动物操作规则而实施的。
1.12.蛋白质以及聚合物的标记
以Alexa Fluor 647琥珀酰亚胺酯进行的蛋白质标记是对制造业者提供的方法进行修正而实施的。简单地说，将5mg/ml蛋白质溶解在0.15M重炭酸钠缓冲液中，另一方面，将0.5摩尔当量的Alexa Fluor 647琥珀酰亚胺酯溶解在DMF中而制作了10mg/ml溶液。将所述2种溶液混合，在室温下反应1小时。接下来，将该溶液过Sephadex G-25柱，进行基于凝胶渗透色谱的纯化。纯化后，为了进一步使用而将Alexa Fluor 647标记蛋白质冷冻干燥。PEG-p(Lys)的标记以及纯化以与蛋白质同样的方式进行。但是，由于PEG-p(Lys-CDM)具有自组装特性，因此标记在10mM磷酸缓冲液(pH6.5)中进行，为了除去游离色素而进行凝胶过滤后，将聚合物溶液在0.1N HCl下处理5分钟，之后立刻冷冻干燥。
1.13.荧光相关显微镜
荧光相关分光(FCS)实验在装备有波长633nm的激光光束的MF-20(Olympus，日本)上、在室温下进行。Alexa Fluor 647标记肌红蛋白、以及Alexa Fluor 647标记肌红蛋白内包胶束溶液以30μL/孔的量加入到进行了前处理的384孔玻璃底微孔板中。为了确定结构参数，也将具有652Da的分子量的标准633nm溶液(Olympus，日本)加入板中。以633nm的激光光束激发样品，分别在20秒间扫描5次。得到的数据通过软件的自动拟合功能而进行了拟合。
2.结果和考察
2.1.嵌段共聚物的合成以及化学分析
PEG-p(Lys-TFA)聚合物是以MeO-PEG-NH2 [20]的末端伯氨基为引发剂，通过Lys(TFA)-NCA的开环聚合而合成的。通过GPC对聚合而得的聚合物进行分析的结果，表现出了较窄的分子量分布(Mw/Mn＝1.03)(图11)。通过碱水解除去保护基TFA后，通过使用了PEG的-OCH2CH2-(δ＝3.5ppm)和p(Lys)的-C3H6(δ＝1.2ppm～1.8ppm)的质子比的1H-NMR对聚合度(DP)进行了确认，其结果，赖氨酸的DP为37。此外，进行了GPC(作为移动相，包含500mM NaCl的10mM乙酸盐的pH3.3乙酸缓冲食盐水；流速0.75mL/分钟)的结果，显示出了表现较窄分子量分布的单峰性峰(图12)。
接下来，通过使CDM-Cl与PEG-p(Lys)的伯胺反应而向聚合物中导入了CDM。并且，通过将CDM上的-CH3(δ＝2.0ppm)的峰强度与PEG上的亚甲基峰、以及赖氨酸的β、γ以及δ-亚甲基质子相比较，对CDM的导入量和导入率进行了确认。CDM单元计算为约17，CDM的添加率为约45％。此外，通过使用pH3.3的乙酸缓冲溶液(具有500mM NaCl的乙酸10mM)作为移动相的GPC，PEG-p(Lys-CDM)表现出了较窄的分子量分布(图13)。这些结果显示成功地以胶束制备所需要的品质对PEG-p(Lys-CDM)进行了合成。
2.2.不内包蛋白质的核交联聚离子复合物(PIC)胶束(空PIC胶束)的制备、以及在各种pH条件下的稳定性
PEG-p(Lys-CDM)由于具有胺部分以及胺反应性CDM单元双方，因此存在由于胺的质子化以及CDM环的形成而在酸性pH环境下为游离聚合物的形态的可能性。另一方面，在接近中性的pH下，CDM基与胺形成稳定的酰胺键，生成用于进一步形成聚离子复合物的羧基(方案S2)。因此，本发明者们将聚合物在不同的pH下孵育1小时后，通过DLS对PEG-p(Lys-CDM)的结构进行了评价。
本发明者们发现了PEG-p(Lys-CDM)在pH7.4(比其他pH高的pH)下自动缔合成胶束。计数率(derived count rate)通过DLS而确定，与大粒子或高浓度的粒子[24]的存在相关(图2a)。得到的胶束在pH7.4下表现出约40nm的尺寸以及0.2的PDI。另一方面，在小于6.5的pH下，计数率保持较低，从这一点可以看出，PEG-p(Lys-CDM)没有缔合成胶束。通过测定pH7.4的氘化磷酸缓冲液(10mM)中的聚合物的1H-NMR，发现PEG-p(Lys-CDM)的聚氨基酸以及侧链结构来源的质子峰消失了，从这一点可以看出，由于胺和CDM部分的结合而使聚氨基酸主链的迁移率降低(图14a)。将2M氘盐酸添加至所述溶液中后，通过10分钟的孵育，来源于聚氨基酸以及侧链结构的峰恢复至75％(图14b)。这显示了，在低pH条件下的聚氨基酸的游离。就PEG-p(Lys-CDM)的pH依赖性的胶束形成而言，需要注意避免在添加蛋白质前形成空胶束。
就在pH7.4下自动缔合的空PIC胶束的稳定性而言，在将胶束稀释到表现不同pH的溶液中后通过DLS进行了评价。在pH7.4下，空PIC胶束的尺寸在24小时中从43nm变为38nm(图3)，PDI的变动较小，计数率只减衰了20％。另一方面，在pH6.5下，空PIC胶束不稳定，表现出尺寸以及计数率的急速减少，并且在孵育的最初5小时中表现出PDI超过0.4的上升(图3)。在pH6.5下，就5小时后的胶束尺寸的测定而言，由于高PDI而无法信赖，因此省略。从这些结果可以看出，空PIC胶束会进行pH响应性的崩解。
2.3.针对HEK293细胞的PEG-p(Lys-CDM)的In vitro细胞毒性
面向蛋白质内包胶束的活体应用，确定PEG-p(Lys-CDM)是否能够安全地用作运送载体是很重要的。因此，通过将PEG-p(Lys-CDM)与HEK 293细胞一同培养48小时，对PEG-p(Lys-CDM)的细胞毒性进行了探讨。PEG-p(Lys)聚合物为PEG-p(Lys-CDM)的前体，由于其作为运送载体而被广泛使用，因此作为对照而使用。
如图4所示，PEG-(Lys-CDM)与PEG-p(Lys)相比在所有的聚合物浓度下，细胞毒性都更低，即使在1mg/mL的聚合物浓度下也保持了70％以上的细胞存活率。如DMEM中的PEG-(Lys-CDM)的DLS评价所显示的(图15)，PE G-(Lys-CDM)的低毒性可以认为是由于在培养基条件下会自动缔合成空PIC胶束。从这些结果可以看出PEG-p(Lys-CDM)是安全性高的运送载体。
2.4.基于pH的精密控制的蛋白质内包胶束的制备
蛋白质是具有不均匀地具有多个负电荷基团(谷氨酸、天冬氨酸、以及C末端的羧基)以及正电荷基团(赖氨酸、精氨酸、以及N末端胺)的带电表面的巨大分子。因此，PEG-p(Lys-CDM)能够与蛋白质中的羧基一同形成PIG，介由pH响应性CDM部分而与蛋白质中的伯氨基共价键合(方案S3)。此外，PEG-p(Lys-CDM)中的胺可以通过与未与蛋白质结合的CDM群反应，而进一步交联胶束的核。
如上述所观察到的(图2)，PEG-p(Lys-CDM)能够在培养基的pH下自动缔合成胶束。由于PEG-p(Lys-CDM)在pH5下以游离聚合物的形式而存在，因此将PEG-p(Lys-CDM)溶解在10mM乙酸缓冲液(pH5)中而制备聚合物溶液，从而抑制了空的PIG胶束的形成。此外，在10mM磷酸缓冲液中(pH8)制备蛋白质溶液，与所述聚合物溶液混合，从而进行了与PEG-p(Lys-CDM)中的赖氨酸残基的聚离子复合物的形成，并进行了介由与CDM部分形成酰胺而进行的自我组织化。在将聚合物溶液和蛋白质溶液混合后，将pH调整至7.4。由于游离蛋白质和胶束在GPC中表现不同的溶出时间，因此通过GPC确定了肌红蛋白内包效率。为了进行荧光检测而用Alexa Fluor 647对肌红蛋白进行了荧光标记。内包效率通过将被内包的蛋白质的量除以蛋白质的添加量而算出。
如表1所示，肌红蛋白(具有等电点7的17.6kDa蛋白质)以62％的效率和5重量％被胶束内包，得到了PDI为0.18的40nm尺寸的胶束。通过使用了磷酸缓冲生理盐水(pH7.4、具有150mM NaCl的10mM磷酸缓冲液)的超滤而对胶束进行纯化后，使用FCS，对平均每个胶束所内包的肌红蛋白的数量进行了定量。通过计算胶束和Alexa Fluor 647标记肌红蛋白之间的每分子的计数率的比，确认了平均每个胶束内包有约2个Alexa Fluor 647标记肌红蛋白(表2)。
[表1]
表1.myo/m和对照胶束的特征
aZ平均直径(通过DLS确定)
b通过DLS确定
c通过光散射电泳确定
d未确定
[表2]
表2.Alexa Fluor 647标记肌红蛋白内包胶束以及游离肌红蛋白的FCS测定结果
a通过FCS确定
除了肌红蛋白之外，就牛血清白蛋白(BSA)以及溶菌酶而言，由于它们具有与肌红蛋白不同的尺寸(分子量)以及净电荷(等电点)，因此也被选择用来对胶束的内包能力进行评价。其结果，PEG-p(Lys-CDM)表现出能够将这些蛋白质内包到胶束中(表3)。此外，通过TEM观察，确认了这些蛋白质内包胶束的粒子形态(图16)。这些结果表明，用于内包蛋白质的本发明的胶束系统具有通用性。
S4.聚合物胶束中内包不同的蛋白质
如表3所示，PEG-p(Lys-CDM)可以使用具有不同的分子量和等电点(pI)的各种蛋白质，而以较窄的粒径分布形成胶束。
[表3]
表3.蛋白质在高分子胶束中的内包。蛋白质的分子量以及等电点从已有的文献[S1-S6]中得到。蛋白质内包胶束的内包效率和尺寸分布通过实验确定。
a通过文献和厂商提供资料而得到。
b通过GPC测定。通过将蛋白质的内包量除以蛋白质的总供给量而确定。
c通过DLS而确定。
2.5.对照肌红蛋白内包胶束的制备
为了对在上一节中制备的myo/m的有效性进行评价，而构建了无共价键的对照胶束。本发明者们，为了制备对照胶束，首先，通过将CDM缓缓添加到肌红蛋白溶液中而对肌红蛋白进行了CDM修饰。CDM导入率基于荧光胺法为92.8％，CC-myo的Zeta电位为-29.5mV，与天然肌红蛋白的Zeta电位(-9.2mV)相比有所降低。这表示，通过导入CDM，电荷被转换了。然后，通过在磷酸缓冲生理盐水(包含150mM NaCl的10mM磷酸缓冲液，pH7.4)中，将PEG-p(Lys)以N/C(氨基/羧基)比2:1与CC-myo混合而制作PIC胶束，作为对照，将PEG-p(Lys)以及天然肌红蛋白的混合物以与上述相同的N/C比进行了制备。CC-myo介由静电相互作用，形成与PEG-p(Lys)的PIC胶束(表1)。但是，无CDM修饰的肌红蛋白未形成与PEG-p(Lys)的胶束。可以认为，这是因为肌红蛋白的不均匀的表面电荷对稳定的多离子复合体[4]而言是不利的。
2.6.胶束的稳定性
胶束的稳定性使用具有不同的盐浓度和pH的缓冲液进行了探讨。
首先，pH稳定性试验通过对在10mM磷酸缓冲生理盐水(pH6.5或pH7.4)中的包含PEG-p(Lys-CDM)的胶束(myo/m)以及对照胶束(CC-myo/m)的崩解进行评价而进行。胶束的尺寸以及PDI通过DLS每1小时测定一次。myo/m在pH7.4以及6.5这两者中，尺寸和PDI都没有变化，表现出具有高稳定性。CC-myo/m在pH7.4中，如图5所示表现出高稳定性。另一方面，在pH6.5中，CC-myo/m急速地不稳定化。此外，myo/m在pH6.5和pH7.4这两者中都具有盐耐性(图5)，而另一方面，空PIC胶束在相同条件下迅速崩解(图3)。从这一点可以看出，蛋白质使PEG-p(Lys-CDM)的胶束稳定化。
由于使胶束结构保持的静电相互作用会在血中滞留[25,26]期间解离，因此PIC胶束的活体应用非常困难。因此，由于高NaCl浓度(600mM)会完全抑制胶束中的静电相互作用[25,27]，因此对于pH7.4或6.5的包含600mM NaCl的10mM磷酸缓冲液5L，在稀释条件下通过使用了20000MWCO透析盒的透析，对胶束的稳定性进行了评价。随时间推移地采集样品，为了追踪胶束稳定性而进行了DLS分析。只基于PIC的对照CC-myo/m刚在高盐浓度下静置就解离了，另一方面，就myo/m而言，与pH7.4相比，在pH6.5中24小时后的尺寸以及计数率急速降低。这显示，其在酸性的病态学的pH中会发生急速的胶束分解，而另一方面，在生理学的pH中具有强稳定性(图6)。
2.7.肌红蛋白从myo/m中的释放
对于myo/m的从胶束中的释放，如下进行了评价：通过对Alexa Fluor 647标记myo/m内包胶束进行相对于pH7.4以及pH6.5的10mM磷酸缓冲生理盐水5L的透析。此处，对透析盒内的胶束的荧光强度进行了随时间推移的测定。在pH7.4下，myo/m所内包的蛋白质缓慢释放(图7)。另一方面，肌红蛋白从胶束中的释放在pH6.5下被促进，在24小时以内内包蛋白质的约70％被释放(图7)。这些结果有力地显示了，与在pH7.4下的胶束的稳定性以及在pH6.5下的迅速分解相关，胶束对于病态学的pH以及离子强度(150mM NaCl)进行响应。
2.8.肌红蛋白活性
肌红蛋白的氧化可以通过Soret带(380～460nm)和Q带(480～650nm)[22,28-30]的移动而确定。因此，通过UV/Vis分光法对在pH6.5下从myo/m中释放的肌红蛋白的活性进行了评价。如果将连二亚硫酸钠添加至被释放的肌红蛋白溶液中，则Soret带出现在434nm处。这与还原型肌红蛋白的带相当。此外，从434nm到414nm的Soret带的蓝移、以及Q带的峰分流在导入O2后被观察到了。这与氧化肌红蛋白[22,28,29]的带相当。
然后，如果以Ar气体起泡，则出现Soret带以及Q带的相反的变化，确认到了脱氧化(图8a)。此外，通过交替进行O2或氩气气体的起泡，被释放的肌红蛋白成功地进行了氧化和还原型的肌红蛋白的结构变化(图8c)。作为对照，使用了天然的肌红蛋白(图8b，d)。此外，在天然的肌红蛋白或从myo/m中释放的肌红蛋白之间，就氧化或脱氧化而言没有显著的差异。这些结果显示，内包在myo/m中的蛋白质在释放时能够保持它们的功能性。
2.9.In vivo下的血中滞留性以及活体内分布
大量的治疗用蛋白质会由于在血中的凝聚以及急速的肾排泄[31,32]而使得血中滞留性降低。在本实施例中，为了对基于PEG-p(Lys-CDM)的胶束的改善蛋白质的药物动态的性能进行试验，而使用了已知会在血中凝聚并引起肾排泄[34]的肌红蛋白作为模型蛋白质。以Alexa Fluor 647荧光标记肌红蛋白，内包到胶束中，对in vivo血中滞留以及活体内分布进行了调查。
荧光标记myo/m表现出与非标记胶束同样的尺寸分布。静脉注射后，通过实时IV-CLSM对荧光标记胶束的血中滞留性进行了记录。如图9a～c所示，通过共价键而稳定化的myo/m表现出了超过120分钟的半减期，而CC-myo/m(10分钟)以及游离肌红蛋白(9分钟)表现出了较短的半减期。此外，CC-myo/m以及游离肌红蛋白在皮肤实组织中表现出了较强的荧光信号，而myo/m未游离出现至皮肤。这表示内包的肌红蛋白在血中未从胶束中漏出。
接下来，使用由Alexa Fluor 647标记聚合物以及非标记肌红蛋白制备的myo/m以及CC-myo/m，对in vivo血中滞留性以及聚合物的活体内分布进行了评价。myo/m在对肌红蛋白进行了标记的情况下同样地表现出了120分钟以上的半减期，而CC-myo/m的半减期仅为1分钟，5分钟后就无法在血中检测到了。由于PEG-p(Lys)会在数分钟以内从血中急速被排泄掉，可以认为CC-myo/m在血中不稳定。这一点与CC-myo中的荧光标记肌红蛋白的半减期与肌红蛋白单体的半减期相近(图9a,b)这点相对应，显示了进行了电荷转换的肌红蛋白胶束在血中会急速分解。另一方面，myo/m表现出在血中的高稳定性(图9c，e)。这是因为荧光标记聚合物PEG-p(Lys-CDM)的血中滞留性与荧光标记蛋白的血中滞留性相对应。
对于肌红蛋白、CC-myo/m以及myo/m的活体内分布，在给药12小时后，在与纳米粒子的排泄关联的主要器官，即肾脏、肝脏以及脾脏中进行了评价。
通过在图像化的30分钟前使用Hoechst进行尾静脉给药而对细胞核进行了染色。接下来，采集肾脏、肝脏以及脾脏，通过ex vivo荧光成像法进行观察。如图10a-c所示，游离肌红蛋白以及CC-肌红蛋白对肾脏表现出高集聚性，这与游离肌红蛋白以及CC-myo/m从血中迅速被排泄一致。另一方面，myo/m胶束与CC-myo/m以及肌红蛋白相比，向肾脏的集聚被抑制，而集聚到肝脏。
此外，关于使用Alexa Fluor 647标记PEG-p(Lys)进行追踪的CC-myo/m，由于聚合物的迅速排泄，在肾脏、肝脏以及脾脏中几乎未检测到荧光信号(图10d)。另一方面，来自使用Alexa Fluor 647标记PEG-p(Lys-CDM)追踪的my o/m的信号主要在肝脏处被观察到(图10e)，这与内包荧光标记肌红蛋白的my o/m的分布一致(图10c)。这些结果证实了血中的myo/m的高稳定性，显示了用于制备以in vivo运送为目的的蛋白质内包胶束的PEG-p(Lys-CDM)是有用的。
3.结论
本发明者使用通过聚离子复合物以及pH响应性酰胺键的组合而能够内包蛋白质的新型高分子PEG-p(Lys-CDM)，成功地开发了用于蛋白质内包的pH响应性高分子胶束。通过使用myo/m作为模型，显示了这些胶束在pH7.4下稳定而在pH6.5下急速崩解。此外，内包肌红蛋白的本发明的胶束，与游离肌红蛋白以及通过PIC形成而单独集合而成的胶束相比，在in vivo中表现出了更优异的血中滞留性。此外，在pH6.5下从胶束中释放的肌红蛋白表现出与天然的肌红蛋白具有同样的氧化以及还原能力，显示了本发明的胶束能够保持蛋白质的功能。这些发现显示了，本发明的胶束作为对以病理学的组织为目标、在in vivo下对蛋白质活性进行时空性的控制而有效的蛋白质纳米载体的可能性。
实施例2
1.IL-12内包胶束的制备
在本实施例中，通过对pH进行精密控制而制备了IL-12内包胶束。简单地说，将2.5mg的PEG-P(Lys-CDM)溶解在0.5mL的20mM磷酸缓冲液(pH5)中，为了抑制聚合物自动缔合而形成空胶束而静置了1小时。将10μg的IL-12溶解在0.5mL的20mM磷酸缓冲液(pH8)中。将IL-12溶液以5μL/分钟的速度、在搅拌(振荡)下添加到聚合物溶液中，然后连续搅拌(振荡)6小时。接下来，将1mL的缓冲液(pH8)添加到混合物中，搅拌(振荡)混合溶液一晚。
内包效率通过ELISA法测定。通过ELISA试剂盒检测混合物中的未被内包的游离IL-12的浓度，并计算被内包的IL-12的量。
其结果，2mL混合溶液中的游离IL-12的浓度为1.6μg/mL。IL-12的总浓度为5μg/mL，因此内包效率为68％。
2.IL-12内包胶束的纯化和特性确定
纯化通过透析法进行。将混合溶液装填到包含100kDa的MWCO的透析盒中，相对于10mM磷酸缓冲液(pH7.4)以及150mM NaCl，在4℃下透析一晚。接下来，为了进行基于Zetasizer的尺寸和Zeta电位的测定，而对纯化胶束溶液的浓度进行了精密调整(以使其具有1mg/mL的聚合物浓度的方式进行调整)。
其结果，基于DLS的z平均尺寸为43nm，PDI为0.229(图17)。胶束的表面稍许带负电，Zeta电位为-4.1±1.0mV。
3.In vitro药物释放实验
在本节中，再次使用了透析法。将纯化胶束溶液装填至具有100kDa的MWCO的透析盒中，相对于500mL的10mM磷酸缓冲液(pH7.4)+150mM NaCl、和500mL的10mM磷酸缓冲液(pH6.5)+150mM NaCl，在室温下分别进行透析。在给定的时间点从盒的外侧采集溶液，通过ELISA法确定了样品中的IL-12浓度。
其结果，胶束表现出了pH响应性。30小时后，pH6.5下的IL-12的释放量为pH7.4下的释放量的约4倍(图18)。
4.In vitro细胞实验
在本节中，为了对胶束以及释放的IL-12的生理活性进行评价而测定了来自小鼠脾细胞的INF-γ分泌量。
处死9周龄的BALB小鼠，从脾脏采集脾细胞。接下来，将采集的脾细胞以每孔1×105细胞的浓度播种到96孔板中。使胶束溶液相对于缓冲液(pH5)进行透析，接下来，为了调整浓度，通过对外部溶液进行超离心分离，而分离出从胶束中释放的IL-12。将胶束以及释放的IL-12以不同的浓度添加到孔中，使用天然IL-12作为标准。静置24小时以及48小时后除去各孔中的上清，通过ELISA试剂盒测定了INF-γ浓度。
其结果，在24小时后，在IL-12内包胶束的情况下，与释放的IL-12相比，显著地抑制了INF-γ浓度的增加，这一点显示了：通过胶束化，使IL-12对受体的结合受到了抑制(图19)。释放的IL-12与天然的IL-12之间的差异不显著，显示了胶束化对内包的蛋白质的生理活性没有影响。在48小时后，3组间的差异减少。该现象是胶束的崩解所引起的。
Claims (15)
1.一种高分子复合体，其包含蛋白质和下述式(1)所示的嵌段共聚物，
[化学式21]
式(1)中，R1以及R2分别独立地表示氢原子、或任选进行了取代的碳原子数为1～12的直链状或分支状的烷基、或叠氮、胺、马来酰亚胺、配体或标记剂，
R3表示下述式(Ia)～(Ig)所示的化合物中的至少一种，
L1表示NH、CO或下述式(11)所示的基团、或下述式(12)所示的基团，
-(CH2)p1-NH-(11)
式(11)中，p1表示1～6的整数，
-L2a-(CH2)q1-L3a-(12)
式(12)中，L2a表示OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CO NH或COO，L3a表示NH或CO，q1表示1～6的整数，
m1以及m2分别独立地表示1～500的整数，其中，m1以及m2的合计表示10～500的整数，m3、m4以及m5分别独立地表示1～5的整数，n表示1～500的整数，
“/”的符号表示其左右所示的(m1+m2)个各单体单元的排列顺序是任意的。
2.根据权利要求1所述的复合体，其中，
式(I)所示的化合物为下述式(Ia)或(Ib)所示的化合物，
[化学式24]
3.根据权利要求1所述的复合体，其中，
式1所示的嵌段共聚物为下述式(2)所示的化合物，
[化学式25]
4.根据权利要求1所述的复合体，其中，
蛋白质与式1所示的嵌段共聚物进行了共价键合。
5.根据权利要求4所述的复合体，其中，
共价键合pH依赖性地发生断裂。
6.根据权利要求1所述的复合体，其中，
蛋白质为IL-12，即白细胞介素-12。
7.根据权利要求1所述的复合体，其中，
式(1)所示的嵌段共聚物的分子量为23000～45000。
8.根据权利要求7所述的复合体，其中，
式(1)所示的嵌段共聚物的分子量为28000～34000。
9.根据权利要求1所述的复合体，其中，
式(1)所示的嵌段共聚物中的阳离子性基团的总数(N)与蛋白质中的羧基的总数(C)的比(N/C比)为0.1～200。
10.根据权利要求9所述的复合体，其中，
式(1)所示的嵌段共聚物中的阳离子性基团的总数(N)与蛋白质中的羧基的总数(C)的比(N/C比)为0.5～100。
11.根据权利要求9所述的复合体，其中，
式(1)所示的嵌段共聚物中的阳离子性基团的总数(N)与蛋白质中的羧基的总数(C)的比(N/C比)为1～50。
12.一种针对选自细胞表面、细胞内以及细胞外中的任一者的蛋白质运送装置，其包含权利要求1～11中任一项所述的聚合物复合体。
13.一种针对选自细胞表面、细胞内以及细胞外中的任一者的蛋白质运送试剂盒，其包含下述式(1)所示的嵌段共聚物，
[化学式26]
式(1)中，R1以及R2分别独立地表示氢原子、或任选进行了取代的碳原子数为1～12的直链状或分支状的烷基、或叠氮、胺、马来酰亚胺、配体或标记剂，
R3表示下述式(Ia)～(Ig)所示的化合物中的至少一种，
L1表示NH、CO或下述式(11)所示的基团、或下述式(12)所示的基团，
-(CH2)p1-NH-(11)
式(11)中，p1表示1～6的整数，
-L2a-(CH2)q1-L3a-(12)
式(12)中，L2a表示OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CO NH或COO，L3a表示NH或CO，q1表示1～6的整数，
m1以及m2分别独立地表示1～500的整数，其中，m1以及m2的合计表示10～500的整数，m3、m4以及m5分别独立地表示1～5的整数，n表示1～500的整数，
“/”的符号表示其左右所示的(m1+m2)个各单体单元的排列顺序是任意的。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，
式(I)所示的化合物为下述式(Ia)或(Ib)所示的化合物，
[化学式29]
15.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，
式1所示的嵌段共聚物为下述式(2)所示的化合物，
[化学式30]
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