CN101970541A - 包含非荷电性亲水性嵌段以及侧链的一部分引入了疏水性基团的阳离子性聚氨基酸嵌段的共聚物、及其使用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了嵌段共聚物，其是含有非荷电性亲水性聚合物链嵌段以及阳离子性聚氨基酸链嵌段的嵌段共聚物。该嵌段共聚物中，亲水性聚合物链嵌段通过共价键而结合在该聚氨基酸链嵌段的主链的任意一方的末端，并且，疏水性基团通过共价键而结合在该聚氨基酸链嵌段中的氨基酸单元的10％以上、70％以下的侧链上。本发明提供该共聚物与作为小分子核酸的siRNA形成的在生理条件下稳定的聚集体。

Description

包含非荷电性亲水性嵌段以及侧链的一部分引入了疏水性基团的阳离子性聚氨基酸嵌段的共聚物、及其使用
技术领域
本发明涉及嵌段共聚物，以及由该共聚物和核酸分子形成的复合体，尤其涉及胶束型粒子，所述嵌段共聚物包含亲水性聚合物链嵌段以及侧链的一部分引入了疏水性基团的阳离子性聚氨基酸链嵌段。
背景技术
以小干扰RNA(siRNA)、反义寡聚核苷酸为代表的具有生理活性的核酸医药品，被期待用作针对癌症、病毒性疾病等的新一代治疗药。但是，这些核酸本质上在生物体内不稳定，并且生物利用率低，因此目前其应用受到限制。为了将核酸医药品应用于更广泛疾病的治疗，需要能够全身给药的有效且安全的核酸传递系统(参照下述非专利文献1和2)。已知病毒载体可高效地将核酸传递至靶部位，但因免疫原性、致癌性等而使其临床应用受到限制(参照下述非专利文献3和4)。因此，由阳离子性聚合物、阳离子性脂质构成的非病毒载体逐渐受到关注(参照下述非专利文献5和6)。
阳离子性聚合物通过静电相互作用与核酸形成复合体，但正因此而在能够有效传递至靶的粒径的控制和在血液中的稳定性方面存在问题，因此提出了在阳离子性聚合物上结合聚乙二醇(PEG)等生物体亲和性高的水溶性高分子的方法(参照下述专利文献1、专利文献2、专利文献3、非专利文献7及8)。这些复合体形成具有含PEG的亲水性壳体与结合有核酸的芯体的芯-壳型粒子，因而能够控制粒径，但有报告说这种复合体在用于静脉给药时，会迅速从血液中消除(参照下述非专利文献9和10)，因而期待更加稳定的复合体。
概括来说，专利文献1记载了例如将包含亲水性片段和荷电性片段的嵌段共聚物作为荷电分子即DNA的靶传递用载体，但由该共聚物所形成的核酸复合体有时存在如上所述的血液中的稳定性问题。专利文献2为了改善上述问题，具体而言，为了使水性溶剂中的由该嵌段共聚物的多个分子所形成的高分子胶束稳定等，而在该嵌段共聚物的荷电片段中引入巯基，以使该聚合物分子间形成二硫键。并且，专利文献3中提供了例如通过聚-L-赖氨酸的侧链的ε-氨基，而引入作为亲水基的PEG链与作为疏水性基团的棕榈酰基而得的接枝聚合物。
另一方面，提出了将作为侧链的疏水性基团即胆固醇，接枝在一端引入了PEG链的阳离子性聚合物(例如，PEG化的聚(N-甲基二乙烷胺癸二酸酯、N-methyl diethanamine sebacate))上，以使聚合物胶束稳定的方法(参照下述非专利文献11)。该文献中虽未报道对血中滞留性的评价，但认为粒子会因疏水性基团的引入而受到一定程度的稳定。但是，配制该聚合物需要采用非常严格的条件(120℃、24小时)，并且发生聚合物的分解，因此认为难以稳定控制聚合物的分子量、以及PEG和胆固醇的引入率。此外，该方法中，必须在pH值为4.6的酸性条件下配制与核酸的复合体，而DNA在这样的酸性条件下不稳定(参照下述非专利文献12)。从这些方面出发，在使用该聚合物时可能会产生制剂方面的问题。此外，该文献所使用的PEG的分子量最大为2000，并且聚合物中的PEG含量为1.8～8.2％。认为在该条件下，亲水性壳体的形成不充分，与DNA的复合体的粒径为200nm以上，较大，并且粒子的ζ电位(zeta potential)反映了芯体的性质，显示为负值或者正值。该性质成为实现高血中滞留性的障碍(参照下述非专利文献6以及13～17，其也包含与该技术领域相关的其它信息)。
专利文献1：日本特开平8-188541号公报
专利文献2：日本特开2001-146556号公报
专利文献3：WO 99/61512
非专利文献1：C.D.Novina，et al.，Nature，2004，430，161-164.
非专利文献2：W.Pun，et al.，Journal of Cellular Biochemistry，2006，98，14-35.
非专利文献3：R.G.Crystal，et al.，Science，1995，270，404-410.
非专利文献4：S.K.Tripathy，et al.，Nature Medicine，19962，545-550.
非专利文献5：A.de Fougerolles，et al.，Nature Review Drug Discovery，2007，6，443-453.
非专利文献6：S.Akhtar，et al.，Journal of Clinical Investigation，2007，117，3623-3632.
非专利文献7：R.M.Schiffelers，et al.，Nucleic Acids Research，2004，32，e149.
非专利文献8：S.Hu-Lieskovan，et al.，Cancel Research，2005，65，8984-8992.
非专利文献9：H.K.de Wolf，et al.，International Journal of Pharmaceutics，2007，331，167-175.
非专利文献10：J.D.Heidel，et al.，proceedings of the National Academy of Sciences，2007，104，5715-5721.
非专利文献11：Y.Wang，et al.，Biomaterials，2007，28，5358-5368.
非专利文献12：E.Walter，et al.，Journal of Controlled Release，1999，61，361-374.
非专利文献13：C.Nicolazzi，et al.，Journal of Controlled Release，2003，88，429-443.
非专利文献14：B.Thompson，et al.，Bioconjugate Chemistry，2005，16，608-614.
非专利文献15：D.Oupicky，et al.，Gene Therapy，2001，8，713-724.
非专利文献16：Y.Takakura，et al.，International Journal of Pharmaceutics，1994，105，19-29.
非专利文献17：Y.Yamasaki，et al.，Journal of Pharmacology and
Experimental Therapeutics，2002，301，467-477.
发明内容
如上所述，至今仍在对病毒载体以外的核酸的载体进行各种各样的研究开发或努力。但是，仍然存在对能够有效用作医疗用材料并且能够将核酸有效传递至目标的载体(vectors或carriers)的需要。例如，非专利文献11中所记载的PEG化的聚(N-甲基二乙烷胺癸二酸酯)-共聚-((胆固醇基氧代羰基酰胺乙基)甲基双(亚乙基)溴化铵癸二酸酯((cholesteryloxocarbonylamidoethyl)methylbis(ethylene)ammonium bromide sebacate))所形成的胶束型粒子具有一定的稳定性，但是，从提供能够容易确立医药品用材料所要求的材料均质性、以及药品本身的均质性的体系的观点出发，进一步的改良受到期待。
本发明的一部分发明人等，按照上述专利文献2的记载，明确了通过在该共聚物分子间形成二硫键(形成共价键)，可大幅提高由共聚物所形成的高分子胶束(或者胶束型粒子)的稳定性。但是，为了实现材料的多样性，本发明人等探索了更多不同的核酸传递用材料。
结果发现，专利文献2所记载的包含非荷电性亲水性聚合物链嵌段以及阳离子性聚氨基酸链嵌段的嵌段共聚物，与非专利文献11所记载的共聚物之间的结构虽有本质区别，但在聚氨基酸重复单元(unit)的侧链的一部分引入疏水性基团进行修饰的嵌段共聚物，能够赋予高分子胶束以下情况以上的优点，即，在上述嵌段共聚物分子的聚合物主链之间进行二硫键结合的情况。
由此，本发明提供嵌段共聚物，其是包含非荷电性亲水性聚合物链嵌段以及阳离子性聚氨基酸链嵌段的嵌段共聚物，亲水性聚合物链嵌段通过共价键而结合在该聚氨基酸链嵌段的主链的任意一方的末端，并且，疏水性基团通过共价键而结合在该聚氨基酸链嵌段中氨基酸单元的10％以上、70％以下的侧链上。
另外，本发明还提供上述共聚物与核酸的复合体。
附图说明
图1是实施例2中合成的PPLC1的1H NMR的谱图。应予说明，图中a为来自聚乙二醇的亚甲基的峰，b为来自胆固醇基中的甲基的峰。
图2是实施例2中合成的PPLS1的1H NMR的谱图。应予说明，图中a为来自聚乙二醇的亚甲基的峰，b为来自硬脂酰基中的甲基的峰。
图3是使用PPLC1～PPLC4以及PEG-P(Lys)的各聚合物和siRNA，得到的在各N/P比下形成的粒子溶液的电泳结果的照片(其中，N/P比为0是指仅siRNA进行了电泳的泳道)。
图4是表示通过动态光散射法测定的使用PPLC1～PPLC4以及PEG-P(Lys)的各聚合物和siRNA形成的聚集物的多分散度(PDI)的图。
图5是表示通过动态光散射法测定的使用PPLC1～PPLC4以及PEG-P(Lys)的各聚合物和siRNA形成的聚集物的累积量粒径(diameter)的图。
图6是表示通过动态光散射法测定的使用PPLC2以N/P比为6而与siRNA形成的粒径分布的直方图。
图7表示由PPLC2与siRNA构成的聚集体的ζ电位(zeta potential)的测定结果的图。
图8表示对使用PPLC2以N/P比为6而配制的粒子、使用PPLS1与siRNA以N/P比为6而配制的粒子、以及未粒子化的siRNA(空白(naked))在给药后1小时的血中滞留性进行评价的结果的图。
图9表示对使用PPLC1～4以及PEG-PLys以N/P比为6而配制的粒子、以及未粒子化的siRNA(空白)在给药后2小时的血中滞留性进行评价的结果的图。
图10表示对使用PPLZ以N/P比为8而配制的粒子、使用PPLZb以N/P比为8而配制的粒子、以及未粒子化的siRNA(空白)在给药后2小时的血中滞留性进行评价的结果的图。
图11表示对使用PPLC2以N/P比为6而配制的粒子、以及未粒子化的siRNA(空白)在给药后15分钟～4小时的血中滞留性进行评价的结果的图。
具体实施方式
本发明所使用的用语或者技术用语，如没有特别说明则可以理解为具有该技术领域所使用的常用含义。
非荷电性亲水性聚合物链嵌段，来自于包含聚乙二醇(或者聚(氧乙烯))的水溶性聚合物。聚氨基酸链嵌段可以来自于选自聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚精氨酸、聚高精氨酸、或聚组氨酸中的聚合物。上述非荷电性亲水性聚合物链嵌段的分子量，只要嵌段共聚物可形成内包药物的高分子胶束，则没有特殊限定，但约为2500～200,000Da，优选为5,000～20,000Da，更优选为8,000～15,000Da，氧乙烯的重复单元的数量为55～4,500的整数，优选为110～450，更优选为180～340的整数。
作为嵌段共聚物的另一种嵌段的聚氨基酸链嵌段，可以包含来自于选自聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚精氨酸、聚高精氨酸、或聚组氨酸中的聚合物的重复单元，或者可以由该重复单元组成。这些嵌段是该重复单元为10～100的整数，优选为20～80的整数，更优选为20～60的整数。该聚氨基酸链嵌段的氨基酸残基中，相当于全部重复单元数量(n表示整数)的10％～70％数量的氨基酸残基，将疏水性基团担载于其侧链上。担载疏水性基团的氨基酸残基在聚氨基酸嵌段中可以任意配置，例如可以列举：无序或者随机配置的情况、以及作为嵌段配置的情况(即，由聚乙二醇嵌段、担载疏水性基团的聚氨基酸的嵌段以及不担载疏水性基团的聚氨基酸的嵌段所形成的三嵌段的情况)。作为疏水性基团，可列举甾醇衍生物的残基或者C4-24烃基。甾醇是指以环戊酮氢菲环(cyclopentanone hydrophenanthrene ring)为基础的天然、半合成或者合成的化合物，例如，作为天然的甾醇没有限定，但可列举胆固醇、胆甾烷醇、二氢胆甾醇、胆酸等；作为其半合成或合成的化合物，可以是它们的天然物的例如合成前体(根据需要，在存在的情况下，包含一定的官能基团、部分或全部羟基被该技术领域公知的羟基保护基保护、或者羧基被羧基保护基保护的化合物)。另外，甾醇衍生物是指在不影响本发明目的的范围内，可以在环戊酮氢菲环中引入C1-12烷基、卤原子例如氯、溴、氟，该环系统可以为饱和、部分非饱和等。甾醇衍生物的残基优选为胆固醇、胆甾烷醇、二羟基胆甾醇的3位羟基的氢原子被除去后的基团。进一步优选为胆固醇的3位羟基的氢原子被除去后的基团。C4-24烃基所谓的烃基是指，由碳原子和氢原子构成，直链或支链的C4-24，优选为C12-24烷基；直链或支链的C4-24，优选为C12-24烯基；直链或支链的C4-24，优选为C12-24炔基；C4-24，优选为C12-24的笼状化合物，例如金刚烷基等；以及芳基烷基，芳基是苯基或者萘基，烷基为C1～C5，例如可列举苄基等。但优选为，直链或支链的C4-20，更优选为C12-20烷基；直链或支链的C4-20，优选为C12-20烯基；以及苄基。应予说明，上述烯基和炔基上可含有多个不饱和键。
作为这种嵌段共聚物的更具体的例子，可列举通式I或II所表示的共聚物。
上式中，式中，A表示氢原子、或者由式R1(R2)CH(CH2)q-所表示的基团；R1及R2独立地表示氢原子、C1-6烷氧基、芳氧基、芳基C1-3氧基、氰基、羧基、氨基、C1-6烷氧基羰基、C2-7酰胺基(acylamidegroup)、三-C1-6烷基甲硅烷氧基、甲硅烷氧基、甲硅烷氨基；或者R1及R2合在一起表示经C1-3烷基取代或者未取代的亚乙基二氧基(ethylenedioxy group)或亚丙基二氧基(propylenedioxy group)；或者R1及R2与它们所结合的＝CH-基合在一起表示甲酰基；
q表示0～10的整数；
L表示-(CH2)rNH-、-NHCH2CH2NH-、-NHCH2CH2CH2NH-或者-COCH2CH2-NH-，其中r表示0～5的整数；
L’表示-CO-、-OCO-(CH2)r’-CO-以及-NHCO-(CH2)r’-CO-，其中r’表示1～5的整数；
B表示通过-NH-、-NHCOO-、-NHCO-或者式III所表示的取代基而结合的甾醇衍生物残基、或者C4-24烃基；
Figure BPA00001216393000081
Q表示NH2、-NHC(＝NH)NH2或者式IV所表示的取代基；
Figure BPA00001216393000082
Z为氢原子、C2-12烷基羰基、C3-12烯基羰基、C3-12烯基羰基、芳基羰基、芳基氧基羰基、芳基C1-3羰基或者对B规定的基团；
Z’表示-NH-R3，其中，R3为未取代或者取代的直链或支链的C1-12烷基；
m表示55～5,000的整数；
n表示10～100的整数；
p表示1、3或者4的整数；
x是具有聚氨基酸链嵌段中所含的取代基Q的单元的数目；y是具有聚氨基酸链嵌段中所含的取代基B的单元的数目；x+y＝n，y是占n的10％以上、70％以下的整数。
作为上式中的C1-12烷基、C1-3烷基、或者本说明书中所谓的烷基，分别具有与之相应的碳原子数，例如可以列举：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己烷、正庚烷癸烷(n-heptanedecane)、十一烷基等的直链或支链的烷基。
以上式中的B为氢原子的嵌段共聚物作为代表的、引入疏水性基团之前的嵌段共聚物的一部分其本身是公知的，或者可以采用其本身公知的方法制造。一般来说，本发明可使用的嵌段共聚物，其自身公知的或者市售的具有非荷电性亲水性聚合物链的聚合物以及具有阳离子性具氨基酸链的聚合物，可以直接耦合，或者根据需要，在进行纯化以使分子量分布变小后，采用其本身公知的方法进行耦合而制造。在聚氨基酸侧链引入疏水性基团，可以在通过与非荷电性亲水性聚合物链进行耦合来制备嵌段共聚物之前进行，或者也可以在之后进行。在这些情况下，共聚物的构造为通式I或II。作为其它方法，例如，在非荷电性亲水性聚合物链为聚乙二醇链，聚氨基酸链为赖氨酸或鸟氨酸的情况下，前者例如，通过使用能够提供通式I的A的引发剂，进行阴离子活性聚合来制造，接着，在延伸末端侧引入氨基，自该氨基末端使Nε-TFA-L-赖氨酸、Nε-Z-L-赖氨酸、Nδ-Z-L-鸟氨酸、1-苄基-L-组氨酸、Nδ-Nω-二-Z-L-精氨酸等受保护的氨基酸的N-羧酸酸酐(NCA)发生聚合，而合成嵌段共聚物，然后，通过在聚氨基酸侧链引入疏水性基团，可提供本发明的嵌段共聚物。此时共聚物的构造为通式I。并且，根据需要，在引入上述侧链基团的同时，也可以引入氢原子以外的与该侧链基团相同的基团，作为通式I的Z基。
并且，当Z为氢原子、该侧链基团以外的基团时，可以使用相应的酸酐等作为反应物，通过其自身公知的缩合反应引入目标基团作为Z基。
上述式中的Q表示NH2、-NHC(＝NH)NH2或者式III所表示的取代基，但这些基团也可以在同一分子中混合存在。
作为上式中的在Q中引入-C(＝NH)NH2所表示的取代基的方法，例如，可以使用对嵌段共聚物中的赖氨酸及鸟氨酸残基的侧链所存在的氨基进行3，5-二甲基-1-吡唑基硝酸甲脒(3，5-Dimethyl-1-pyrazolyformaminidium nitrate)反应的方法，或者在氢氧化铵等碱存在下，进行O-甲基异脲反应的方法。这些反应，可以在B中引入疏水性基团之前进行，也可以在引入之后进行。
由此可提供的本发明的嵌段共聚物，由于具有阳离子荷电性基团，因而可与例如阴离子荷电性化合物、核酸或者阴离子荷电性药物形成离子络合物。这种离子络合物能够在水性溶剂中自发聚集形成胶束，即所谓的高分子胶束。上述胶束，可以是芯体部内包有核酸或药物，壳体部具有非荷电性亲水性聚合物链的芯-壳型结构。根据需要，可以在嵌段共聚物上，通过通式I所表示的嵌段共聚物的R1R2CH-所表示的特定的官能基团，例如甲酰基、氨基或者羧基，根据需要，引入具有活性酯基、马来酰亚胺基等结合基团后，与针对特定受体蛋白质等的配体或抗体(其片段：F(ab’)2、F(ab)等)结合，而赋予该胶束以目标靶向性。
上述能够生成离子络合物的核酸或药物，只要可以增强稳定性则在使用上没有任何限制。但是，优选为使用核酸，为了使说明简洁，以下对核酸进行说明。本发明所谓的核酸，是以包含嘌呤或者碱基、戊糖、磷酸的核苷酸为基本单元的多聚或寡聚核苷酸，可列举寡聚或多聚双链RNA、寡聚或多聚双链DNA、寡聚或多聚单链DNA、寡聚或多聚单链RNA，还包括在同一链上RNA和DNA混合存在的寡聚或多聚双链核酸、寡聚或多聚单链核酸。此外，核酸中含有的核苷酸可以是天然型核苷酸，也可以是经化学修饰的非天然型核苷酸，并且也可以加成氨基、硫醇基、荧光化合物等分子。对该核酸的碱基没有限定，但该核酸可含有4～20,000个碱基、优选为10～10,000个碱基、更优选为18～30个碱基。此外，如果考虑功能或者作用，则可列举：质粒DNA、siRNA、微RNA(microRNA)、反义核酸、诱饵核酸(decoynucleic acid)、适体(aptamer)以及核酶。对作为靶的基因或者多聚核苷酸，siRNA可使用以公知方法设计的所有siRNA。siRNA可以是长度为核苷酸约18～30个的单链或双链中的任一种，包括该技术领域公知的化合物，还包括具有相同作用和功能的所有核苷酸。虽无特别限定，但siRNA的具体例，可以参照作为基因疗法的对象的基因而设计。作为这种基因虽没有限定，但可以列举：与非小细胞肺癌等有关的PKCα，与恶性黑色肿瘤等有关的BCL-2，与克隆病有关的ICAM-1，与C型肝炎有关的HCV，与类风湿性关节炎或牛皮癣有关的TNFα，与哮喘有关的腺苷AI受体，由卵巢癌等有关的c-raf激酶，与胰腺癌等有关的H-ras，与冠状动脉疾病有关的c-myc，与大肠癌有关的PKARia，与艾滋病有关的HIV，与实体瘤有关的DNA甲基转移酶，与癌症有关的VEGF受体，与肾癌有关的核糖核苷酸还原酶，与CMV性视网膜炎有关的CMV IE2，与前列腺癌有关的MMP-9，与恶性胶质瘤有关的TGFβ2，与多发性骨髓瘤有关的CD49d，与糖尿病有关的PTP-1B，与癌症有关的c-myb，与乳腺癌等有关的EGFR，与癌症有关的mdrl、autotaxin以及GLUT-1的基因。
反义核酸也可以使用该技术领域中公知的或者具有与它们相同功能或作用的所有反义核酸。上述功能是，对mRNA形成杂交，形成双链分子，而阻碍基因的翻译。另一方面，核酶是指具有能够特异性分解DNA限制性内切核酸酶相同的其它单链RNA能力的RNA分子。
作为形成本发明的嵌段共聚物与核酸的复合体的方法，可以使用降低溶解有嵌段共聚物和核酸的、含有极性有机溶剂的水溶液中的极性有机溶剂的含量的方法。作为该极性有机溶剂没有限定，但可以使用选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮、甲基乙基酮、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、2-丁醇、2-甲基-2-丙醇、四氢呋喃、二
Figure BPA00001216393000111
烷中的一种或多种。作为降低含有极性有机溶剂的水溶液中的极性有机溶剂的含量的方法，没有限定，但可以列举基于透析或馏去的方法，或用水溶液稀释后，根据需要通过超滤等方法进行浓缩的方法等。
形成本发明的复合体时的嵌段共聚物与核酸，优选混合为使以“嵌段共聚物中的阳离子残基的摩尔浓度”/“核酸中的磷酸基的摩尔浓度”定义的N/P比为1～50，更优选为2～20，进一步优选为4～10。其中，嵌段共聚物中的阳离子残基的摩尔浓度是指，嵌段共聚物中的聚氨基酸链嵌段中含有的可以计算出的赖氨酸残基的摩尔数、鸟氨酸残基的摩尔数、精氨酸残基的摩尔数、高精氨酸残基的摩尔数以及组氨酸残基的摩尔数、在赖氨酸残基上结合疏水性基团且通过结合生成二级氨基的情况下该疏水性基团所结合的赖氨酸或鸟氨酸残基的摩尔数、在组氨酸残基结合疏水性基团的情况下该疏水性基团所结合的组氨酸残基的摩尔数的总和。例如，嵌段共聚物为通式I或II所表示的情况的阳离子残基的摩尔浓度，可以由以下的总和计算出：Q中NH2所表示的取代基的摩尔数、-NHC(＝NH)NH2所表示的取代基的摩尔数、式IV所表示的取代基的摩尔数、B中通过-NH-与聚氨基酸嵌段结合的疏水性取代基的摩尔数、B中通过式III所表示的取代基与聚氨基酸嵌段结合的疏水性取代基的摩尔数。
Figure BPA00001216393000121
本发明的嵌段共聚物与核酸的复合体，优选平均粒径为10～300nm的粒子，更优选平均粒径为20nm～200nm。
本发明的嵌段共聚物与核酸的复合体，优选ζ电位为-10～10mV。更优选为-5～5mV。
根据本发明，嵌段共聚物与核酸的复合体，具有以下特性和优点。
特性
可与核酸在缓和条件下配制，因此，不会使核酸不稳定而能够稳定地进行生产。并且由于与核酸的结合状态是可逆的，因此，不会伴随核酸的化学结构变化，从而不会损害核酸所具有的特性、作用。
优点
由于制造简单，故工业生产率优异，因此在医疗经济方面具有优点。在生物体内等的稳定性高，例如作为显著改善了注射剂给药后的有效利用率因而给药量大幅减小，从而期待医疗经济方面的改善、有效的药理作用的发现。给药量的减小，在核酸的免疫应答的引起、化学修饰寡聚核酸导致的对血液凝固系统的影响等的副作用的抑制等的观点上，也有用。
以下，例举具体例对本发明进行进一步说明，但这些具体例是为了容易理解本发明，对本发明没有限定作用。
实施例1：聚乙二醇-聚(L-赖氨酸)嵌段共聚物的合成及该聚合物的胆固醇基的引入
(1)将Mw(重均分子量)12000的α-甲氧基-ω-氨基聚(乙二醇)(日油株式会社)1.5g溶解于二甲基亚砜22.5ml，加入ε-三氟乙酰-L-赖氨酸的N-羧酸酸酐(NCA)1.5g(相对于聚乙二醇为45当量)的二甲基亚砜溶液22.5ml，35℃下进行48小时反应。通过将由此得到的聚(乙二醇)-嵌段-聚(ε-三氟乙酰-L-赖氨酸)(PEG-P(Lys(TFA)))溶解于甲醇300ml、1N NaOH 30ml中，35℃下搅拌6小时，进行脱保护(deprotection)。通过使用馏分分子量6000～8000的再生纤维素透析管(Spetra/Por 1、Spectrum Laboratories)，相对于0.01N HCl进行3次透析，来纯化该溶液。对透析膜内的溶液进行冷冻干燥，得到2.2g的聚(乙二醇)-嵌段-聚(L-赖氨酸)(PEG-P(Lys))的盐酸盐。根据1H-NMR的解析，P(Lys)部分的聚合度为40。
(2)胆固醇基的引入(其1)
将PEG-P(Lys)的盐酸盐50mg溶解于甲醇2.5ml，加入氯甲酸胆固醇酯(cholesteryl chloroformate)4.8mg(相对于赖氨酸单元的摩尔分率10％)的二氯甲烷溶液2.5ml，再添加三乙胺30μl后，在室温下搅拌24小时。通过将反应溶液滴入二乙醚溶液150ml中，使聚合物析出。通过减压过滤回收该聚合物后，加入0.01N的盐酸水溶液5ml和甲醇5ml使其溶解，使用馏分分子量为6000～8000的透析膜，对500ml的0.01N盐酸水溶液进行两次2小时透析。将透析外液替换为500ml的水，再进行2小时透析后，通过对透析膜内的溶液进行冷冻干燥，得到白色固体的目标物质即PEG-PLys(胆固醇)的盐酸盐38mg(以下称为PPLC1)。
得到的聚合物的结构，通过1H-NMR进行分析(谱图参照图1)。
使用以体积比1∶1混合甲醇-d4和氯仿-d而得的混合液，作为NMR用的溶剂。通过来自胆固醇基的甲基的质子(CH3：0.6ppm)和PEG的亚甲基的质子(OCH2CH2：3.5ppm)的峰强度比，计算出胆固醇基的引入率。本实施例得到的PPLC 1中，相对于全部赖氨酸单元中的11％，引入了胆固醇基。
实施例2：对聚乙二醇-聚(L-赖氨酸)嵌段共聚物的胆固醇基的引入(其2)
除了改变氯甲酸胆固醇酯的添加量之外，采用与实施例2相同的方法，得到PPLC(2)～(5)。氯甲酸胆固醇酯的添加量、氯甲酸胆固醇酯相对于赖氨酸单元的摩尔分率以及通过1H-NMR所分析的相对于赖氨酸单元的胆固醇基的引入率，如表1所示。应予说明，相对于赖氨酸单元添加氯甲酸胆固醇酯70％而得的PPLC5，不溶解于NMR溶剂，因而无法计算出引入量。
表1：
Figure BPA00001216393000141
实施例3：对聚乙二醇-聚(L-赖氨酸)嵌段共聚物的硬脂酰基的引入
将硬脂酸1.87g溶解于二氯甲烷50ml中，添加N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)0.76g以及1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐1.25g，于室温下搅拌24小时。在反应后的溶液中加入水100ml，用分液漏斗进行分液。得到的有机层加入硫酸镁进行脱水，用蒸发器进行浓缩。通过将该溶液滴入20倍体积的乙醇中，生成白色沉淀。通过过滤回收沉淀，进行减压干燥，得到N-琥珀酰亚胺基硬脂酸酯(N-succinimidyl stearate)。
将PEG-P(Lys)的盐酸盐50mg溶解于甲醇2.5ml中，加入N-琥珀酰亚胺基硬脂酸酯16.4mg(相对于赖氨酸单元的摩尔分率为40％)的二氯甲烷溶液2.5ml，再添加二异丙基乙胺37.5μl后，于室温下搅拌24小时。通过将反应溶液滴入二乙醚溶液600ml，使聚合物析出。通过减压过滤回收该聚合物后，加入0.01N的盐酸水溶液5ml和甲醇5ml使其溶解，使用馏分分子量为6000～8000的透析膜，对500ml的0.01N盐酸水溶液进行两次2小时透析。将透析外液替换为500ml的水，再进行2小时透析后，通过对透析膜内的溶液进行冷冻干燥，得到白色固体的目标物质即PEG-PLys(硬脂酰基)的盐酸盐(以下，称作PPLS1)。
与实施例1同样，通过1H-NMR对PPLS1进行分析(谱图参照图2)。通过甲基的质子(CH3：0.8ppm)和PEG的亚甲基的质子(OCH2CH2：3.5ppm)的峰强度比，计算出硬脂酰基的引入率。本实施例得到的PPLS1中，相对于全部赖氨酸单元中的40％，引入了硬脂酰基。
实施例4：聚乙二醇-聚(L-赖氨酸-ε-苄氧基羰基)-聚(L-赖氨酸)嵌段共聚物的合成
(1)将Mw(重均分子量)12000的α-甲氧基-ω-氨基聚(乙二醇)(日油株式会社)1.5g溶解于二甲基亚砜二甲基亚砜22.5ml，加入ε-苄氧基羰基-L-赖氨酸的N-羧酸酸酐(NCA)1.03g(相对于聚乙二醇为27当量)以及ε-三氟乙酰-L-赖氨酸的N-羧酸酸酐(NCA)603mg(相对于聚乙二醇为18当量)的二甲基亚砜溶液24.5ml，35℃下进行48小时反应。通过将由此得到的聚(乙二醇)-嵌段-聚(ε-苄氧基羰基-L-赖氨酸/ε-三氟乙酰-L-赖氨酸)(PEG-P(Lys(Z)/Lys(TFA))溶解于甲醇300ml、1N NaOH 30ml中，35℃下搅拌6小时，进行脱保护。通过使用馏分分子量6000～8000的再生纤维素透析管(Spetra/Por1、Spectrum Laboratories)，相对于0.01N HCl进行3次透析，来纯化该溶液。对透析膜内的溶液进行冷冻干燥，作为聚氨基酸嵌段，得到ε-苄氧基羰基-L-赖氨酸基与L-赖氨酸基随机聚合的聚(乙二醇)-嵌段-聚(ε-苄氧基羰基-L-赖氨酸/L-赖氨酸)(PEG-P(Lys(Z)/Lys)的盐酸盐2.0g(以下称作PPLZ)。根据1H-NMR的解析，每个聚合物的ε-苄氧基羰基-L-赖氨酸单元的含有数为24，L-赖氨酸单元的含有数为16。
实施例5：聚乙二醇-聚(L-赖氨酸-ε-苄氧基羰基)-聚(L-赖氨酸)嵌段共聚物的合成
(1)将Mw(重均分子量)12000的α-甲氧基-ω-氨基聚(乙二醇)(日油株式会社)1.5g溶解于二甲基亚砜22.5ml，加入ε-苄氧基羰基-L-赖氨酸的N-羧酸酸酐(NCA)1.03g(相对于聚乙二醇为27当量)的二甲基亚砜溶液15.5ml，35℃下进行24小时反应后，加入ε-三氟乙酰-L-赖氨酸的N-羧酸酸酐(NCA)603mg(相对于聚乙二醇为18当量)的二甲基亚砜溶液9ml，35℃下进一步反应24小时。通过将由此得到的聚(乙二醇)-嵌段-聚(ε-苄氧基羰基-L-赖氨酸)-嵌段-聚(ε-三氟乙酰-L-赖氨酸)(PEG-PLys(Z)-block-PLys(TFA))溶解于甲醇300ml、1N NaOH 30ml中，35℃下搅拌6小时，进行脱保护。通过使用馏分分子量6000～8000的再生纤维素透析管(Spetra/Por 1、Spectrum Laboratories)，相对于0.01N HCl进行3次透析，来纯化该溶液。对透析膜内的溶液进行冷冻干燥，得到由聚(乙二醇)、聚(ε-苄氧基羰基-L-赖氨酸)以及聚(L-赖氨酸)所形成的三嵌段的聚(乙二醇)-嵌段-聚(ε-苄氧基羰基-L-赖氨酸)-嵌段-聚(L-赖氨酸)(PEG-PLys(Z)-PLys)的盐酸盐2.0g(以下称作PPLZb)。根据1H-NMR的解析，聚(ε-苄氧基羰基-L-赖氨酸)部分的聚合度为24，聚(L-赖氨酸)的聚合度为16。
实施例4：粒子的配制
本实施例所使用siRNA，是将海萤火虫荧光素酶基因(the sea firefly luciferase gene)作为靶而设计的，使用5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3’作为有义链(sense strand)，使用5’-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3’作为反义链，按照常用方法形成双链，委托株式会社日本イ一ジ一テイ一合成，购入的。
将siRNA溶解于pH7.4的10mM Tris HCl缓冲液(1.0ml)中，配制成20μM。向该siRNA溶液250μl，加入以满足目标的N/P比的方式配制浓度的PPLC 1的DMF溶液250μl，并混合。应予说明，N/P比是指“嵌段共聚物中的阳离子残基的浓度”/“核酸中的磷酸根浓度”。使用馏分分子量10000的透析试剂盒(Slide-A-Lyzer Dialysis CassetPierce)，相对于pH7.4的10mM Tris HCl缓冲液进行三次4小时的透析，得到内包有siRNA的粒子的溶液。粒子的溶液，通过pH7.4的10mM Tris HCl缓冲液进行稀释，或者通过离心过滤单元(Amicon Ultra，Millipore)进行浓缩，配制适当浓度。
并且，对PPLC2～PPLC4、PPLS1、PPLZ、PPLZb以及PEG-P(Lys)也采用同样方法配制粒子。
实施例5：利用电泳的定性(characterization)
在聚丙烯酰胺凝胶(Novex 20％ TBE Gel Invitrogen)中，加载含100ng siRNA的各粒子的溶液，使用TBE溶液作为电泳缓冲液，在外加电压100V、电泳时间1小时的条件下进行电泳。结束后，用SYBR(注册商标)Green II(Invitrogen)进行染色，用Molecelar Imager FX(Bio-Rad)进行图像化。
结果如图3所示。siRNA进入粒子中时，由于电泳中的电泳度小，导致来自自由siRNA的条带消失。在所有的聚合物中，N/P比为1.5以上时，来自自由siRNA的条带无法确认，几乎所有的siRNA进入粒子。
实施例6：利用动态光散射法(DLS)的定性
使用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)，利用动态光散射法对各粒子的多分散度(PDI)、累积量(cumulant)平均粒径以及粒径分布的直方图的进行测定。所使用的各粒子溶液，分别配制成siRNA浓度为5μM。
结果如图4～6所示。由图4结果可知，使用不具有疏水性基团的PEG-PLys，形成的粒子的PDI大，形成不均匀的聚集体，与之相对，使用PPLC1～PPLC4形成的粒子的PDI值小，形成分布更小的聚集体。特别是在使用相对于赖氨酸单元引入了24％以上的胆固醇基的PPLC2～4形成的粒子时，PDI为0.25以下，能够得到单分散的粒子。
并且，由图5的结果可知，使用PPLC1～PPLC4形成的粒子中，所有的N/P比中的累积量平均粒径均为40～100nm。作为代表例，使用PPLC2与siRNA以N/P比为6形成的粒子的粒径分布的直方图如图6所示。
实施例7：通过ζ电位测定进行的定性
使用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)，使用PPLC2形成的粒子的ζ电位测定的结果如图7所示。N/P比为1时显示负值，但是N/P比为1.5～10时，ζ电位的绝对值非常小，几乎接近0mV。由此可知，即使在阳离子电荷过量的情况下，ζ电位也保持低值，因此粒子表面存在PEG层，可以将粒子内部的电荷几乎完全遮蔽。
实施例8：血中滞留性的评价
本实施例所使用的siRNA，是将海萤火虫荧光素酶基因作为靶而设计的siRNA，是在反义链5’-末端进行了Cy3标记的siRNA，使用5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3’作为有义链，使用5’-Cy3-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3’作为反义链，按照常用方法形成双链，委托株式会社日本イ一ジ一テイ一合成，购入的。
使用各聚合物，与实施例5同样，得到内包有Cy3标记siRNA的粒子的溶液。通过对该溶液添加1/20体积的3M氯化钠水溶液，形成含有150mM的氯化钠的等渗溶液，并将其用于评价。
对Balb/c小鼠(日本チャ一ルズリバ一)，通过尾静脉给予含有Cy3修饰siRNA 20μl的粒子溶液，一定时间后，从大静脉(lower aorta)取血200μl。接着以4℃、2000G对血液进行离心10分钟，从上清液得到70μl血浆。向该血浆中加入5μl的1/400N聚乙烯基硫酸钾溶液(和光纯药工业)后，通过Fluoroskan Ascent FL system(Labsystems)，对荧光强度进行测定(激发波长544nm、荧光波长590nm)。由该荧光强度进行血液中残留的Cy3的定量，对血中滞留性进行评价。应予说明，血浆中相对于给药量的残留率，是将小鼠血液量作为体重的80％计算出的。
使用PPLC2以N/P比为1.5～10配制的粒子、使用PPLS1以N/P比为6配制的粒子以及未粒子化的siRNA(空白)在给药1小时后对血中滞留性的评价结果如表2和图8所示。与PPLC2中以N/P比为1.5～4相比，以6～10形成的粒子，显示了高滞留性。并且，使用PPLS1以N/P比为6形成的粒子，虽然略差于PPLC2，但也显示了良好的滞留性。
表2：
使用PPLC1～4和PEG-PLys，以N/P比为6配制的粒子以及未粒子化的siRNA(空白)在给药2小时后对血中滞留性的评价结果如表3和图9所示。与空白、PEG-PLys相比，各PPLC显示了高滞留性。并且，与PPLC1相比，PPLC2～4显示了更高的滞留性。
表3：
Figure BPA00001216393000192
使用PPLZ和PPLZb，以N/P比为8配制的粒子以及未粒子化的siRNA(空白)在给药2小时后对血中滞留性的评价结果如表4和图10所示。在聚赖氨酸单元中随机引入了苄氧基羰基的PPLZ，显示了相对于空白约20倍的高滞留性。另一方面，作为三嵌段聚合物即PPLZb显示了100倍以上的非常高的滞留性。使用PPLZb配制的粒子中，认为在由聚乙二醇制成的壳层的内侧，形成由疏水性聚氨基酸嵌段制成的保护层，在其内侧进一步担载siRNA，因此可稳定地保持siRNA。
表4：
Figure BPA00001216393000201
使用PPLC2，以N/P比为6配制的粒子以及未粒子化的siRNA(空白)在给药15分钟～4小时后对血中滞留性的评价结果如表5和图11所示。PPLC2中粒子化的siRNA，至少直至给药后2小时，显示了比空白高的滞留性。
表5：
Figure BPA00001216393000202
产业适用性
根据本发明，含有亲水性聚合物链嵌段以及侧链的一部分引入疏水性基团的阳离子性聚氨基酸链嵌段的嵌段共聚物，均具有上述优点，例如，为小分子核酸，与siRNA形成稳定的聚集体，并且这样的聚集体形成平均粒径为数十纳米至数百纳米之间的单分散性粒子，且在血流中显示长时间滞留性，同时显示高细胞导入效率。因此，没有限定，但可用作治疗用基因的靶细胞的传送载体，可在制药或医疗产业方面进行利用。

Claims (12)

1.嵌段共聚物，其是含有非荷电性亲水性聚合物链嵌段以及阳离子性聚氨基酸链嵌段的嵌段共聚物，其中，
亲水性聚合物链嵌段通过共价键而结合在该聚氨基酸链嵌段的主链的任意一方的末端，并且，
疏水性基团通过共价键而结合在该聚氨基酸链嵌段中的氨基酸单元的10％以上、70％以下的侧链上。
2.权利要求1所述的嵌段共聚物，其中，非荷电性亲水性聚合物链嵌段，来自于包含聚乙二醇(或聚(氧乙烯))的水溶性聚合物；聚氨基酸链嵌段来自于选自聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚精氨酸、聚高精氨酸、聚组氨酸中的聚合物，并且疏水性基团为甾醇衍生物残基或者C4-24烃基。
3.权利要求1所述的嵌段共聚物，由通式I或通式II所表示，
Figure FPA00001216392900011
其中，
A表示氢原子、或者由R1(R2)CH(CH2)q-所表示的基团；R1及R2独立地表示氢原子、C1-6烷氧基、芳氧基、芳基C1-3氧基、氰基、羧基、氨基、C1-6烷氧基羰基、C2-7酰胺基、三-C1-6烷基甲硅烷氧基、甲硅烷氧基、甲硅烷氨基；或者R1及R2合在一起表示经C1-3烷基取代或者未取代的亚乙基二氧基或亚丙基二氧基；或者R1及R2与它们所结合的CH基合在一起表示甲酰基；
q表示0～10的整数；
L表示-(CH2)rNH-、-NHCH2CH2NH-、-NHCH2CH2CH2NH-或者-COCH2CH2-NH-，其中r表示0～5的整数；
L’表示-CO-、-OCO-(CH2)r’-CO-以及-NHCO-(CH2)r’-CO-，其中r’表示1～5的整数；
B表示通过-NH-、-NHCOO-、-NHCO-或者式III所表示的取代基而结合的甾醇衍生物残基、或者C4-24烃基；
Figure FPA00001216392900021
Q表示NH2、-NHC(＝NH)NH2或者式IV所表示的取代基；
Figure FPA00001216392900022
Z为氢原子、C2-12烷基羰基、C3-12烯基羰基、C3-12烯基羰基、芳基羰基、芳基氧基羰基、芳基C1-3羰基或者对B规定的基团；
Z’表示-NH-R3，其中，R3为未取代或者取代的直链或支链的C1-12烷基；
m表示55～5,000的整数；
n表示10～100的整数；
p表示1、3或者4的整数；
x是具有聚氨基酸链嵌段中所含的取代基Q的单元的数目；
y是具有聚氨基酸链嵌段中所含的取代基B的单元的数目；x+y＝n，y是占n的10％以上、70％以下的整数。
4.权利要求3所述的嵌段共聚物，其中，甾醇衍生物残基来自选自胆固醇、胆甾烷醇、二羟基胆甾醇、胆酸中的化合物。
5.权利要求3所述的嵌段共聚物，其中，烃基选自C12-20烷基。
6.权利要求3所述的嵌段共聚物，其中，烃基选自苯基、萘基和包含苯基和C1～C5的烷基的芳基烷基。
7.核酸与权利要求1～6中任一项所述的嵌段共聚物的复合体。
8.权利要求7所述的复合体，其中，核酸选自寡聚或多聚双链RNA、寡聚或多聚双链DNA、寡聚或多聚单链DNA、以及寡聚或多聚单链RNA。
9.权利要求8所述的复合体，其中，核酸选自质粒DNA、siRNA、微RNA、反义核酸、诱饵核酸、适体以及核酶。
10.权利要求7～9中任一项所述的复合体，其具有芯-壳型高分子胶束结构，芯部内包有核酸。
11.权利要求7～10中任一项所述的复合体，其特征在于：含有嵌段共聚物和核酸，以使“嵌段共聚物中的阳离子残基的摩尔浓度”/“核酸中的磷酸基的摩尔浓度”定义的N/P比为1～50。
12.权利要求7～11中任一项所述的复合体，其是平均粒径为10～300nm的粒子。
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