WO2004105799A1

WO2004105799A1 - 安定化高分子ミセル

Info

Publication number: WO2004105799A1
Application number: PCT/JP2004/007583
Authority: WO
Inventors: Kazunori Kataoka; Yuichi Yamasaki; Xiao Fei Yuan; Atsushi Harada; Jaturanpinyo Montree
Original assignee: Toudai Tlo, Ltd.
Priority date: 2003-05-29
Filing date: 2004-05-26
Publication date: 2004-12-09
Also published as: JP4763459B2; JPWO2004105799A1

Abstract

本発明は、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセルであって該ミセルの内核に前記荷電性セグメントと反対の荷電を有する薬物を担持させたものを、架橋剤と反応させることを特徴とする薬物担持高分子ミセルの製造方法を提供する。

Description

明細書安定化高分子ミセル技術分野

本発明は、安定化高分子ミセルに関する。詳しくは、本発明は、薬物運搬システム（DDS)等の分野において有用なタンパク質又は DNA等の荷電性薬物を安定に保持する静電結合型高分子ミセルに関する。背景技術

最近、医薬品医療の分野において、薬物や遺伝子の体内分布を時間的又は空間的に正確に制御することによって、「必要なとき（t iming)に、必要な部位 (locat ion)で、必要な薬物治療 (act ion)」を最小限の副作用で達成する高精度夕ーゲティング治療に対する関心が高まっている。この治療法を首尾よく達成するためには、ナノスケールで精密設計された高機能化薬物運搬体（ドラッグキャリァ）の開発が最も重要な課題となっている。

これまでに、共有結合又は非共有結合（疎水性相互作用、静電相互作用など）を介して、薬物をさまざまなキヤリヤーに担持させる試みが活発に行われており、リボソーム、微粒子、各種水溶性高分子がキヤリヤーとして用いられてきた（橋田充：新バイオサイエンスシリーズ「ドラッグデリバリーシステム、 -創薬と治療への新たなる挑戦-」、化学同人、 1995年)。

そして、ポリイオンコンプレックス（PIC)ミセルと呼ばれるポリエチレンダリコール-ポリ（， /3 -ァスパラギン酸）ブロック共重合体を用いて荷電性薬物を担持させた、静電結合性型高分子ミセル担持剤も知られている（特許第 2690276号)。この静電結合性型高分子ミセル担持剤は、薬物の疎水性、親水性の区別にかかわりなく、薬物を担持させることができるものであった。

しかしながら、静電結合性型高分子ミセル担持剤において、荷電性薬物は高分子ミセル内に静電結合によって担持されているため、同じ系に塩を添加することにより、ミセルが不安定化する場合がある。従って、塩の添加に際してはミセルの安定性を考慮しなければならない。発明の開示

そこで、安定して存在できる高分子ミセルを提供することが望まれていた。本発明は、上記の課題を解決するものとして完成されたものである。

すなわち、本発明は、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するプロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセルであって該ミセルの内核に前記荷電性セグメントと反対の荷電を有する薬物を担持させたものを、架橋剤と反応させることを特徴とする薬物担持高分子ミセルの製造方法である。

また、本発明は、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するプロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセルに、前記荷電性セグメントと反対の荷電を有する薬物と架橋剤とを添加することを特徴とする薬物担持高分子ミセルの製造方法である。

さらに、本発明は、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセルであって該ミセルの内核に前記荷電性セグメントと反対の荷電を有する薬物を担持させたものを、架橋剤と反応させることを特徴とする薬物担持高分子ミセルの安定化方法である。

さらに、本発明は、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するプロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセルに、前記荷電性セグメントと反対の荷電を有する薬物と架橋剤とを添加することを特徴とする薬物担持高分子ミセルの安定化方法である。

ここで、架橋剤としては例えばダルタルアルデヒドが挙げられる。また、架橋剤と薬物分子中の反応性官能基とのモル比は、例えば 2 ： 1〜1 0 0 0 ： 1である。さらに、非荷電性セグメントはポリエチレングリコール由来のもの、荷電性セグメントはポリアミノ酸由来のものである。そして、荷電性セグメントの末端がァミノ基であることが好ましい。さらに、薬物としては、タンパク質、酵素、核酸及び荷電性官能基を有する水溶性化合物からなる群から選択される。酵素としては、例えばトリプシン又はリゾチームが挙げられる。図面の簡単な説明

図 1は、ダルタルアルデヒドを添加したときの添加比とミセルの時間経過に対する安定性を示す図である。

図 2は、ミセルの粒径の分布を示す図である。

図 3は、ダルタルアルデヒドを添加したときのミセルの塩（NaCl)濃度に対する安定性を示す図である。

図 4は、ダルタルアルデヒドを添加したときのミセルの塩 (NaCl)濃度に対する安定性を示す図である。

図 5は、ダルタルアルデヒドを添加したときのミセルの時間経過に対する安定性を示す図である。

図 6は、ブロック共重合体中のアミノ基をァセチル化させたときのミセルの安定性を示す図である。

図 7は、ミセルの粒径の分布を示す図である。

図 8は、ミセルに内包させたピリルビンォキシダーゼの活性の安定化を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。

上記の通り、本発明は、従来の静電結合型高分子ミセル型薬剤を改良するために本発明の発明者による検討の結果なされたものである。そして、静電結合型高分子ミセル型薬剤と架橋剤とを反応させることによって、ミセル内の凝集力を増強させ、極めて安定したミセル型薬剤を提供するものである。

本発明におけるミセルは、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとからなる静電結合型高分子ミセル担体を使用し、両セグメントともに各種のものが本発明に包含される。

非荷電性セグメントとしては、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール、ポリアルキレンォキシド、ポリサッカライド、ポリアクリルアミド、ポリ置換アクリルアミド、ポリメタクリルァミド、ポリ置換メタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクルル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、非荷電性ポリアミノ酸、又はそれらの誘導体由来の各種のセグメント等が例示される。

荷電性セグメントとしては、例えば荷電性側鎖を有するポリアミノ酸、より具体的には、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン等が、あるいはポリリンゴ酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレンィミン、ポリビニルァミン、ポリアリルァミン、ポリビニルイミダゾール等が挙げられる。さらに、これらのポリアミノ酸の誘導体由来のセグメント等が例示されている。

ミセル内の凝集力をより増強させる観点から、荷電性セグメントの側鎖が架橋剤と反応性を有さない場合には、荷電性セグメントの末端は、架橋剤に対して反応性の高い官能基が用いられる。このような官能基としては、例えば、 1級アミノ基（一 NH ₂) であることが好ましい。

これらのセグメントから構成される本発明のブロック共重合体については、例えば次のものが例として挙げられる。

すなわち、ポリエチレングリコ一ルーポリアスパラギン酸ブロック共重合体、ポリエチレンォキシドーポリダル夕ミン酸ブロック共重合体、ポリエチレングリコール一ポリアルギニンブロック共重合体、ポリエチレングリコール一ポリヒスチジンブロック共重合体、ポリエチレングリコール—ポリメタクリル酸ブロック共重合体、ポリエチレングリコ一ルーポリエチレンィミンブロック共重合体、ポリエチレングリコ一ルーポリビニルァミンブロック共重合体、ポリエチレングリコ一ルーポリアリルアミンブロック共重合体、ポリエチレンォキシドーポリアスパラギン酸ブロック共重合体、ポリエチレンォキシドーポリグルタミン酸ブロック共重合体、ポリエチレンォキシド—ポリリジンブロック共重合体、ポリエチレンォキシド—ポリアクリル酸プロック共重合体、ポリエチレンォキシドーポリビ二ルイミダゾールブロック共重合体、ポリアクリルアミドーポリアスパラギン酸ブロック共重合体、ポリアクリルアミドーポリヒスチジンブロック共重合体、ポリメタクリルアミド—ポリアクリル酸、ポリメ夕クリルアミドーポリビニルアミンブロック共重合体、ポリビエルピロリドン一ポリメ夕クリル酸ブロック共重合体、ポリビニルアルコールーポリアスパラギン酸ブロック共重合体、ポリビニルアルコール一ポリアルギニンブロック共重合体、ポリアクリル酸エステル一ポリグル夕ミン酸ブロック共重合体、ポリアクリル酸エステル—ポリヒスチジンプロック共重合体、ポリメタクリル酸エステル—ポリビニルアミンブロック共重合体、ポリメ夕クリル酸一ポリビニルイミダゾールブロック共重合体等である。

これらのブロック共重合体としては、例えば、次式（I)又は（II)： — (OCH₂CH₂) _m— R₂— (COCHNH) _n._x-(COCH₂CHNH) _x— R₄

CH2 R3

R₃

R-,— (OCH₂CH₂) _m— R₂— (NHCHCO) _n._x-(NHCHCH₂CO)~ R₄ (II)

CH₂ R₃

R₃

で示される。

上記式中、は、水素原子、炭化水素基若しくは官能基、又は官能基置換炭化水素基を表し、 R₂は、 NH、 CO、又は R₆ (CH₂) _QR₇ (R₆は、〇CO、 OC ONH、 NHCO、 NHCOO、 NHCONH、 CONH又は COOを表し、 R₇ は、 NH又は COを表し、 Qは 1以上の整数を表す。）を表す。

また、 R₃は、カルボキシル基、力ルポキシル基置換炭化水素基、アミノ基置換炭化水素基、ヒドラジノ基置換炭化水素基又は（CH₂) p— NHCNHNH₂基 (Pは 1以上の整数を表す。）を表す。あるいは、 R₃は含窒素複素環基又は含窒素複素環基置換炭化水素基を表す。

R₄は、水素原子、ヒドロキシル基又はその結合末端に CO、 NH若しくは〇のいずれかを有する炭化水素基を表す。

mは、 4〜2500、 nは 1〜300、 xは 0〜300であり、 xぐ nである。本発明においては、上記式中、 R₃が、一 C〇O H、 —C H₂ C O OH、

H₂ ) ₃—NH₂、一 (C H₂ ) ₂ NH C NHNH₂、又は次式（III) ：

で示される複素環基であることが好ましい。

これらのブロック共重合体としては、例えば、その代表的構造としていわゆる A B型ブロック共重合体がある。より具体的には、次式（IV) ：

H₃C-(OCH₂CH₂) _m—NH— (COCHNH) _n._x-(COCH₂CHNH) _x - H (IV)

CH₂COOH COOH

で示されるポリエチレングリコール誘導体由来の非荷電性セグメントとポリアスパラギン酸を荷電性セグメントとする A B型ブロック共重合体が挙げられる。上記共重合体は、例えばポリエチレングリコールとポリ（α， β—ァスパラギン酸）から得られるポリエチレングリコール一ポリ（α , /3—ァスパラギン酸）ブロック共重合体であることが好ましい。この共重合体は、まず、 /3—ベンジル一 L一ァスパルテートー Ν—力ルポン酸無水物を、片末端一級アミノ基のポリェチレングリコール（分子量約 200〜250000) を開始剤として重合することにより合成される。このポリエチレングリコール—ポリ（i3—ベンジル一 L—ァスパルテート）ブロック共重合体における ( β —ベンジル、 L—ァスパルテート）部分の分子量は約 205〜62000まで可変である。この共重合体をアル力リ処理して脱べンジル化を行うことにより、ポリエチレングリコール一ポリ（ひ， /3—ァスパラギン酸）ブロック共重合体を得ることができる。

また、ブロック共重合体としてカチオン性セグメントを有する次式 (V)： H₃C— (OCH₂CH₂) _m— (C ) _n — H _(V)

で示されるポリエチレングリコール一ポリリシンブロック共重合体の場合には、まず、 ε—力ルポベンゾキシ—L一リシン無水物を、片末端一級ァミノ基のポリエチレングリコール（分子量 200〜250000) を開始剤として重合させることにより合成される。得られたポリエチレングリコール—ポリ（ε—力ルポベンゾキシ一 L一リシン）ブロック共重合体を、メタンスルホン酸を用いて脱保護反応を行うことで、ポリエチレングリコール一ポリリシンブロック共重合体を得ることができる。

本発明において、上記ブロック共重合体からなる高分子ミセル中に静電的に担持させることのできる薬物としては、特にその種類に限定されるものではない。ここで、「薬物」'とは、前記荷電性セグメントとは反対の荷電性を有する低分子又は高分子物質を意味し、例えばペプチドホルモン、タンパク質、酵素、核酸（DNA 又は RNA) 等の高分子性薬物、アドリアマイシン、ダラノマイシン等の分子内に荷電性官能基を有する低分子性薬物（水溶性化合物）等が例示される。反対荷電とは、分子の一方が正に、他方が負に帯電していることを意味し、複数の異なる帯電状態の官能基を有する分子の場合は、 ρΗを変化させることによって分子全体としての帯電状態の正、負を変化させる場合も含む。同じ荷電を有する場合は、反対荷電を有する官能基を有する化合物を反応させ、分子の帯電状態を変化させる処理をすることにより、一方の分子を他方の分子に対して反対荷電にすることができる。

これらの薬物を、高分子ミセルに担持させる際には、ブロック共重合体と薬物又はその溶液とを混合することを基本としているが、さらには、透析、攪拌、希釈、濃縮、超音波処理、温度制御、 ρ Η制御、有機溶媒の添加等の操作を適宜付加することができる。

例えば、上記式（IV)により示されるポリエチレングリコール一ポリ（ひ， β— ァスパラギン酸）プロック共重合体にトリプシンやリゾチ一ム等の酵素を封入させる場合には、共重合体の水溶液を適切な混合比、イオン強度及び p H等の条件に設定し、共重合体の水溶液に上記酵素水溶液を混合すればよい。

また、上記式（V)により示されるポリエチレングリコ一ルーポリリシンブロック共重合体に DNAを担持させる場合には、適切な混合比、イオン強度及び p H等の条件を設定し、共重合体の水溶液に DM溶液を混合し、 DNAを担持することができる。

以上の通り、本発明の静電結合型高分子ミセルは、安定な高分子ミセル構造となり、その内核に効率よく夕ンパク質や DNA等の荷電物質を取り込むことができる。このため、生体内で分解されやすい荷電性薬物を安定化して体内投与することができる。

本発明において、架橋の対象となる薬物（酵素）としては以下のものが挙げられる。

(1) 血液中生物の定量に使用可能な酵素（表 1 )

表 1

(2) タンパク質分解酵素 ·

本発明において、ミセルに内包させることができるタンパク質分解酵素としては、塩基性アミノ酸（Lys、 Arg) の C末側を切断するエンドべプチダーゼを例示することができる。そのようなタンパク質分解酵素としては以下のものが挙げられる。

(i) トリプシン、プラスミン、カリクレイン、トロンビン、第 Xa因子、ァクロシン、ェンテロべプチダーゼ、ゥロキナーゼ、コクナーゼ、プレモフエノールモノォキシゲナーゼ活性化酵素、大腸菌（E. col i) プロテアーゼ、マウス顎下腺プ口テアーゼ、へビ毒トロンビン様酵素、カテブシン、フイシン、クロストリジゥム ·ヒストリカム（Clostridium histolyicum) プロテア一ゼ、ミクソバクタ一 (Myxobacter) AL-1 プロテアーゼ II、ァ一ミリアリア ·メレア（Amil l iaria mellea) プロテアーゼ

(i i) また、ェキソぺプチダ一ゼには、 C末端から分解する力ルポキシぺプチダーゼと N末端から分解するアミノぺプチダーゼがあるが、ダルタルアルデヒドは 1 級ァミノ基と高い反応性を有していることから、以下のアミノぺプチダ一ゼに関しても有効である。 part iculateアミノぺプチダーゼ

アミノぺプチダーゼ B

小腸表面アミノぺプチダ一ゼ

酵母アミノぺプチダ一ゼ I

ァスペルギルス（Aspergi l lus)アミノぺプチダーゼ

アミノアシルプロリンァミノべプチダ一ゼ

バチルス ·ステア口サ一モフィルス（Baci l lus stearot ermophi lus)アミノぺプチダ一ゼ

クロストリジゥム ·ヒストリカム（Clostridium histolyt icum) アミノぺプチダ —ゼ

ァエロモナス（Aeromonas) アミノぺプチダーゼ

ストレプトミセス ·グリセウス（Streptomyces griseus)アミノぺプチダーゼトリチラキゥム ·アルバム ·リンパー（Tri t irachium album Limber)アミノぺプチダ一ゼ

ァシルアミノ酸遊離酵素

ピロリドニルぺプチダ一ゼ

(i i i) さらに、ダルタルアルデヒド以外の架橋剤を使用する場合は、その反応性基が反応する部位が活性部位であるェンドぺプチダーゼにも有効である。そのようなエンドべプチダ一ゼとして、以下に示すセリンプロテア一ゼ、チオールプ口テアーゼ、カルボキシルプロテアーゼなどを使用することができる。

(a)上記以外のセリンプロテアーゼ

キモトリプシン

メトリジゥム（Metridium)プロティナーゼ A

大腸菌 (E. col i)プロテア一ゼ I

カテブシン G

エラスターゼ

α-リテイクプロテア一ゼ

サーモマイコリン

プロティナーゼ Κ

ストレプトミセス ·グリセウス（Streptomyces griseus)プロテア一ゼ 3 スタフィロコッカル（Staphylococal)プロティナ一ゼ

テネブリオ（Tenebrio) ひ -プロティナーゼ

ァルスロバクタ一（Arthrobacter)セリンプロティナーゼ

好熱性ストレプトミセス（Streptomyces)アル力リプロティナーゼ

アルタ一ナリァ（Al ternaria)ェンドぺプチダーゼ

カンジダ · リボリティカ（Candida l ipolyt ica)アルカリプロティナ一ゼスブチリシン

その他微生物セリンプロティナ一ゼ

(b) チォ一ルプロテアーゼ

パパイン

ブロメラインキモパパイン

ストレプトコッカル（Streptococcal)プロティナ一ゼ

カテブシン L

酵母プロティナーゼ B

カテブシン S

PZ -ぺプチダーゼ

(c) 力ルポキシルプロテア一ゼ

ペプシン

カテブシン B

レニン

キモシン

酵母プロティナーゼ A

カテブシン E

ぺニシ口ペプシン

その他微生物カルボキシルプロテアーゼ本発明においては、薬物を担持させた静電結合型高分子ミセルに架橋剤を添加して反応させる。

このような架橋剤として分子内に複数個のアルデヒド基を有するダルタルアルデヒド、スクシンアルデヒド、パラホルムアルデヒド、フタリックジカルポキシアルデヒド（フタルアルデヒド）など、分子内にマレイミド基と活性エステル基を有する N- [ Q! -メレイミドアセトキシ]スクシンイミドエステル、 N- [ j3 -マレイミドプロピルォキシ]スクシンイミドエステル、 Ν- [ ε -マレイミドカプロイルォキシ]スクシンイミドエステル、 Ν- [ァ-マレイミドブチリルォキシ]スクシンイミドエステル、スクシ二ミジル- 4- [Ν-マレイミドメチル]シクロへキサン-トカルポキシ - [6-アミドカプロエート]、 m-マレイミドベンゾィル -N-ヒドロキシスクシンィミドエステル、スクシ二ミジル- 4- [N-マレイミドメチル]シクロへキサン- 1-カルポキシレート、スクシ二ミジル- 4- [P-メレイミドフエニル]プチレート、スクシ二ミジル- 6- [ ( /3 -マレイミドプロピオンアミド）へキサノエート]など、分子内に活性エステルとニトロフエニルアジド基を有する N- 5-アジド- 2-二トロベンゾィルォキシスクシンイミド、 N-スクシ二ミジル- 6- [4' -アジド- 2， -ニトロフエニルァミノ]へキサノエートなど、分子内にフエニルアジド基とフエニルダリォキサル基を有する P-アジドフエニルダリオキサルなど、分子内に複数個のマレイミド基を有する 1, 4-ビス-マレイミドブタン、ビス-マレイミドエタン、ビス-マレイミドへキサン、 1， 4 -ビス-マレイミジル - 2, 3-ジハイドロブタン、 1， 8 -ビス-マレイミドトリエチレングリコール、 1， 11 -ビス-マレイミドテトラエチレングリコール、ビス [2- (スクシンィミジルォキシカルポニルォキシ)ェチル]スルホン、トリス- [2- マレイミドエチル]ァミンなど、分子内に複数個のスルホ活性エステル基を有するビス [スルホスクシンィミジル]スべレート、ビス [2- (スルフォスクシニミドキシカルボニルォキシ）ェチル]スルホン、ジスルホスクシニミジルタートレート、ェチレングリコールビス [スルホスクシニミジルスクシネート]、トリス -スルホスクシニジルァミノトリアセテートなど、分子内に複数個のァリルハラィド基を有する 1, 5-ジフルォロ- 2， 4-ジニトロベンゼンなど、分子内に複数個のイミドエステル基を有するジメチルアジピミデート、ジメチルビメリミデート、ジメチルスべリミデートなど、分子内に複数個のピリジルジチォ基を有する 1, 4-ジ - [3 ' - (2 ' -ピリジルジチォ）プロピオンアミド]ブタンなど、分子内に複数個の活性エステル基を有するジスクシ二ミジルダル夕レート、ジスクシニミジルスべレート、ジスクシ二ミジルタートレート、エチレングリコ一ルビス [スクシミジルスクシネート]など、分子内に複数個のビニルスルホン基を有する 1， 6-へキサン -ビス-ピニルスルホンなど、分子内にピリジルジチォ基と活性エステル基を有するスクシ二ミジル- 6- [3- (2-ピリジルジチォ）プロピオンアミド]へキサノエート、 4 - スクシ二ミジルォキシ力ルポニル-メチル -ひ- [2-ピリジルジチォ]トルエン、 N- スクシ二ミジル- 3- [2-ピリジルジチォ]プロピオネートなど、分子内にヒドロキシフエニルアジド基と活性エステル基を有する N-ヒドロキシスクシ二ミジル- 4-ァジドサリサィリック酸など、分子内にマレイミド基とイソシァネ一ト基を有する N- [P-マレイミドフエニル]イソシァネートなど、分子内にマレイミド基とスルホ活性エステル基を有する N- [ ε -マレイミドカプロイルォキシ]スルホスクシンィミドエステル、 Ν- [ァ-マレイミドブチリルォキシ]スルホスクシンイミドエステル、 Ν-ヒドロキシスルホスクシニミジル- 4-ァジドベンゾエート、 Ν- [ κ -マレイミドウンデカノィルォキシ]スルホスクシンイミドエステル、 m -マレイミドベンゾィル - N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、スルホスクシ二ミジル- 4- [N-マレィミドメチル]シクロへキサン- 1-カルポキシレート、スルホスクシ二ミジル -4- [P-マレイミドフエニル]プチレートなど、分子内にピリジルジチォ基とスルホ活性エステル基を有するスルホスクシニミジル- 6 - [3 ' 一 (2-ピリジルジチォ）プロピオンアミド]へキサノエート、スルホスクシニミジル -6- [ a; -メチル- - (2-ピリジルジチォ）トルアミド]へキサノエ一トなど、分子内にヒドロキシフエニルアジド基とスルホ活性エステル基を有するスルホスクシ二ミジル [4-アジドサリサイルアミド]へキサノエートなど、分子内にニトロフエニルアジド基とスルホ活性ェステル基を有するスルホスクニミジル- 6- [4' -アジド- 2， -ニトロフエニルアミノ]へキサノエートなど、分子内にビニルスルホン基と活性エステル基を有する N-スクシニミジル- [4-ビニルスルホニル]ベンゾエートなどを用いることができ、ダルタルアルデヒドを用いることが特に好ましい。また、架橋剤をダルタルアルデヒド以外のものとした場合は、その反応性官能基が反応する部位が活性部位であるエンドべプチダーゼの場合にも安定化が可能である。

架橋剤の添加比、すなわち、架橋剤と薬物の反応性官能基のモル比は、 2 ： 1 〜： 1 0 0 0 ： 1であり、 5 ：：!〜 5 0 0 ： 1であることが好ましく、 5 0 ： 1〜 5 0 0 : 1であることがさらに好ましい。

架橋剤と高分子ミセルを反応させる際には、薬物を内包した高分子ミセルと架橋剤とを混合することを基本としている。但し、薬物を内包していない高分子ミセルと、架橋剤及び薬物の混合物とを混合して反応させることもできる。なお、透析、攪拌、希釈、濃縮、超音波処理、温度制御、 p H制御、有機溶媒の添加等の操作を適宜に付加することができる。

本発明において作成されたミセルは、温度、 pH等に安定である。安定温度範囲は、例えば 1 5 °C〜4 5 °Cであり、安定 pH範囲は、例えば ρΗ 6〜ρΗ 1 0である。以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。

〔実施例 1〕ダルタルアルデヒドで架橋されたタンパク質を内包するミセルの作製（1)

ポリエチレングリコール-ポリ（ひ， ]3 -ァスパラギン酸）ブロック共重合体（ポリエチレンダリコール分子量 12000、プロック共重合体 1本鎖当たり重合度 63のポリアスパラギン酸、 5. 4mg) をリン酸緩衝液 (塩濃度 10 、 pH7. 4、 3. OmL) に、牛膝臓由来トリプシン（30. Omg)をリン酸緩衝液 (12. OmL)に溶解した後、この各々の溶液を混合した。混合溶液を 2. 5虬ずつ 6つに分取した。それぞれに 70%ダルタルアルデヒド水溶液（0、 2. 6、 12. 9、 26、 129、 260 L) を添加した。その際、トリプシン中のリシン残基の総数に対するダルタルアルデヒド溶液中のアルデヒド基の総数として定義されるダルタルアルデヒド架橋度（GR) を、 0. 00、 10. 00、 50. 00、 100. 00、 500. 00、 1000. 00とした。架橋したミセル溶液を 4°Cで 24時間置き、ダルタルアルデヒド中のアルデヒド基とトリプシン中のリシン残基との間の架橋を完全なものにした。

得られた水溶液について、動的光散乱測定により平均粒径を測定し、静的光散乱測定により混合直後の散乱強度に対する所定時間後の相対散乱強度を測定した (波長 488nm、検出角 90度、温度 25°C、動的レーザー散乱スぺクトロメーター DLS-7000 (大塚エレクトロニクス社)）。

結果を図 1に示す。図 1において、（a)は相対散乱強度の変化を、（b)は平均粒径の変化を示す。図 1において、 GRはそれぞれ以下の通りである。

GR=0 (△)、 10 (令）、 50 (口）、 100 (血）、 500 (き)、 1000 (◊)

ダルタルアルデヒド水溶液を添加したものについては、混合 30分後において平均粒径 lOOnm以下のトリプシン内包高分子ミセルが観測された（図 1 b)。混合 6 時間後においては、ダルタルアルデヒドを添加しなかった水溶液については、動的光散乱測定で検出可能な高分子ミセルは存在せず、相対散乱強度が 1%以下まで減少し、高分子ミセルが存在しないことが確認された。これに対し、グルタルアルデヒド水溶液を添加したものについては、混合 48 時間後においても平均粒径に変化は認められず、相対散乱強度も 70%以上を維持しており（図 l a)、トリプシン内包高分子ミセルがダルタルアルデヒド水溶液の添加により安定化されていることが確認された。

なお、トリプシンを内包させたときのミセル、ダルタルアルデヒドの架橋度を GR= 100 としたときのミセル、及び塩化ナトリウムを添加したときのミセルについて、それぞれ粒径の分布を測定した。

その結果、図 2に示すように、ミセルのサイズ分布は一定であった（多分散度 1以下）。図 2において、（a)はトリプシンを内包させたときのミセルでダルタルアルデヒドを添加する前のミセル、（b)はダルタルアルデヒドの架橋度を GR= 100 としたときのミセル（NaCl添加前)、（c)は NaCl (0. 15M)を添加した後のミセルの粒径分布図である。架橋反応によってミセルの構造に変化や凝集はなく、ミセルの安定性が示された。〔実施例 2〕塩存在下におけるミセルの安定性試験

実施例 1で調製したポリエチレングリコール-ポリ（a, j8 -ァスパラギン酸）ブロック共重合体に、牛膝臓由来トリプシン及びダルタルアルデヒドを混合して混合溶液（10. OmL)を調製し、得られた溶液を 2. 5mLずつ 4つに分取した。そのうち 3つに塩化ナトリゥム水溶液を添加し、混合後の塩化ナトリゥムの濃度が 0、0. 15、 0. 3、 0. 6Mとなるように 4つの溶液を調製した。これらの溶液について、動的光散乱測定により平均粒径を測定し、静的光散乱測定により塩化ナトリゥム濃度が 0の水溶液の散乱強度に対する各溶液の相対散乱強度を測定した（検出角 90度、温度 25°C)。

結果を図 3に示す。図 3において、各 GRはそれぞれ以下の通りである。

GR=0 (Δ) , 10 (令）、 50 (口）、 100 (▲)、 500 (拿）、 1000 (◊)

ダルタルアルデヒド水溶液を添加しなかったもの以外は、いずれの塩化ナトリゥム濃度の水溶液においてもミセルの平均粒径に変化は認められず（図 3 b)、 100%以上の相対散乱強度を維持しており（図 3 a)、ダルタルアルデヒド水溶液添加によい卜リプシン内包高分子ミセルが安定化されていることが確認された。塩濃度に対する安定性をさらに調べるため、ダルタルアルデヒドの添加量が

GR=2、 4、 10、 20、 30となるようにし、混合後の塩化ナトリウムの濃度が 0、 0. 05、 0. 1、 0. 15、 0. 2M となるように溶液を調製した。これらの溶液について、動的光散乱測定により平均粒径を測定し、静的光散乱測定により塩化ナトリゥム濃度が 0の水溶液の散乱強度に対する各溶液の相対散乱強度を測定した。

その結果、ダルタルアルデヒドの添加量が 2倍以上では、散乱光強度と粒径がほぼ変化せず、ダルタルアルデヒド無添加と比較して極めて安定であることがわかった（図 4 )。

図 4において、各 GRはそれぞれ以下の通りである。

GR=0 (〇）、 2 (▲)、 4 (口）、 10 (◊)、 20 (拿)、 30 (△)

〔実施例 3〕

ポリエチレングリコール-ポリ（a , i3 -ァスパラギン酸）ブロック共重合体 ( 1. 8mg) をリン酸緩衝液（l. OmL)に溶解した溶液と、牛膝臓由来トリプシン (10. Omg)をリン酸緩衝液 (4 OmL)に溶解した溶液とを混合し、混合液を 2. 5mLずつ 2つに分取した。この一方にダルタルアルデヒド水溶液（26 L)を添加することにより、ダルタルアルデヒド水溶液添加高分子ミセル溶液、及びダルタルアルデヒド水溶液未添加高分子ミセル溶液を調製した。また、牛膝臓由来トリプシン (5. Omg)をリン酸緩衝液 (2. 5mL)に溶解した溶液（非ミセル化酵素溶液）も調製した。ダルタルアルデヒド水溶液を添加したものについては、リン酸緩衝液に対して透析することによって、余剰のダルタルアルデヒドを除去した。なお、余剰グルタルアルデヒドの除去の確認は、 3-メチル -2_ベンゾチアゾリノンヒドラゾンを用いて行った。これら 3つの溶液について、 410nmの吸光度の時間変化から単位時間当たりの基質の分解速度を測定することによって、トリプシンの酵素活性を測定した。基質は、 L-リシン P-二トロア二リンを用い、調製直後、 1 週間後、 2 週間後、 3週間後に酵素活性を測定した。

その結果、トリプシンのみの溶液とダルタルアルデヒド未添加高分子ミセル溶液については、 1週間後には、リン酸緩衝液に溶解直後のトリプシンの活性の 1/3 まで低下していた。これに対し、ダルタルアルデヒド添加高分子ミセル溶液は、 3 週間後においても溶解直後のトリプシンと同程度の活性を維持していた（図 5 )。〔比較例〕

ポリエチレングリコール-ポリ（a , j6 -ァスパラギン酸）ブロック共重合体において、ポリ（α , /3 -ァスパラギン酸）の末端の 1級ァミノ基にァセチル基を導入したものを作製し、ダルタルアルデヒドとブロック共重合体とを反応させないようにした。ミセルに内包させるトリプシン濃度は 2mg/mL、温度 25°Cとし、塩化ナトリウムの濃度が 0、 0. 05、 0. 1、 0. 15、 0. 2Mとなるように溶液を調製した。これらの溶液について、静的光散乱測定により塩化ナトリゥム濃度が 0の水溶液の散乱強度に対する各溶液の相対散乱強度を測定した。

その結果、ァセチル基を導入したミセルは、塩濃度 0. 05Mにおいて沈殿した（図 6 )。

実施例 2で確認された塩化ナ卜リゥム濃度増加に対する安定性は認められず、安定化のためにはブロック共重合体にもダルタルアルデヒド等の架橋剤と反応する官能基を有している必要があることが確認された。

〔実施例 4〕ダルタルアルデヒドで架橋されたタンパク質を内包するミセルの作製（2)

本実施例は、実施例 1で使用した牛滕臓由来卜リプシンの代わりにピリルビンォキシダ一ゼ（B0)、ポリエチレングリコール-ポリ（α， j8 -ァスパラギン酸）プロック共重合体の代わりにポリエチレングリコール-ポリリシンブロック共重合体 (ポリエチレングリコール分子量 12000、ブロック共重合体 1本鎖当たり重合度 48のリシン）を使用し実施例 1と同様にしてミセル粒径を測定した。

また、 B0の酵素活性は、基質としてピリルビンを用いて実施例 2に準じて測定した。

結果を図 7及び図 8に示す。図 7の結果より、ダルタルアルデヒドの添加後においても単峰性のピークは維持されており、複合体構造を維持したまま架橋構造が導入されていることが示された。

また、図 8より、ダルタルアルデヒドを添加し構造の安定化を図ることによつて、内包 B0の活性の保存安定性が著しく向上することが確認された。産業上の利用可能性

本発明により、安定化したタンパク質内包高分子ミセルが提供される。本発明の方法により安定化されたミセルは、温度や PHに不安定な薬物を内包させることができるため、バイオナノリアクタ一やバイオナノリザ一バーとして有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するプロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセルであって該ミセルの内核に前記荷電性セグメントと反対の荷電を有する薬物を担持させたものを、架橋剤と反応させることを特徴とする薬物担持高分子ミセルの製造方法。

2 . 非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するプロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセルに、前記荷電性セグメントと反対の荷電を有する薬物と架橋剤とを添加することを特徴とする薬物担持高分子ミセルの製造方法。

3 . 非荷電性セグメン卜と荷電性セグメントとを有するプロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセルであって該ミセルの内核に前記荷電性セグメントと反対の荷電を有する薬物を担持させたものを、架橋剤と反応させることを特徴とする薬物担持高分子ミセルの安定化方法。

4. 非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセルに、前記荷電性セグメントと反対の荷電を有する薬物と架橋剤とを添加することを特徴とする薬物担持高分子ミセルの安定化方法。

5 . 架橋剤がダルタルアルデヒドである請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。

6 . 架橋剤の反応性官能基と薬物分子中の反応性官能基とのモル比が、 2 ： 1〜 1 0 0 0 : 1である請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。

7 . 非荷電性セグメン卜がポリエチレングリコール由来のものである請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の方法。

8 . 荷電性セグメントがポリアミノ酸由来のものである請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。

9 . 荷電性セグメントの末端がアミノ基である請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の方法。

. 薬物が、タンパク質、酵素、核酸及び荷電性官能基を有する水溶性化合物からなる群から選択されるものである請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。

. 酵素がトリプシン又はリゾチームである請求項 10記載の方法。