WO2018174158A1 - 細胞質送達ペプチド - Google Patents

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WO2018174158A1
WO2018174158A1 PCT/JP2018/011406 JP2018011406W WO2018174158A1 WO 2018174158 A1 WO2018174158 A1 WO 2018174158A1 JP 2018011406 W JP2018011406 W JP 2018011406W WO 2018174158 A1 WO2018174158 A1 WO 2018174158A1
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acid
peptide
iwltalx
flgx
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史朗 二木
健太郎 坂本
美沙穂 秋柴
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国立大学法人京都大学
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/06—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a lysosomal/endosomal localisation signal

Definitions

  • the present invention relates to a peptide for delivering a target substance to the cytoplasm, a cytoplasmic delivery agent and a substance introduction agent.
  • Non-patent Document 1 various biosensors utilizing the recognition ability of natural proteins have been developed (Non-patent Document 1), and application to intracellular measurement is expected.
  • Non-patent Document 1 When introducing such chemically modified proteins from the outside of the cell into the cell, a considerable amount of the protein added from the outside of the cell is retained in the endosome and is not released or diffused into the cytoplasm. In many cases, the desired function of intracellular visualization and measurement of these proteins cannot be exhibited.
  • Examples of typical endosomal destabilizing peptides that release proteins and drugs encapsulated in endosomes into the cytoplasm include GALA (Non-patent Document 2), influenza hemagglutinin HA2 protein-derived peptides (Non-patent Document 3), and the like. These are pH-dependent membrane fusion peptides that exhibit membrane fusion properties when the pH in the endosome reaches about 5, damage the endosomal membrane, and release inclusions into the cytoplasm.
  • Non-patent Document 4 a conjugate of HIV-1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Tat peptide and HA2 peptide known as a membrane-permeable peptide (Non-patent Document 4) has been reported, and is used for intracellular introduction of physiologically active proteins such as a fusion protein of Cre and Tat. Examples have been reported.
  • Patent Document 2 discloses a peptide capable of introducing a protein such as an antibody into a living cell, but there is room for improvement in its introduction efficiency.
  • physiologically active proteins, nucleic acids, drugs, or fluorescently labeled proteins or sensor molecules introduced from outside the cell can be introduced into the cytoplasm where the function and activity are expressed. Is desirable.
  • the conventional method has a problem in that these molecules taken up by endocytosis, which is a physiological uptake mechanism of cells, cannot be released from the endosome into the cytoplasm with satisfactory efficiency. From the viewpoint of delivery of biopharmaceuticals into cells, it is expected to effectively deliver proteins, nucleic acids, and pharmaceuticals such as antibodies incorporated by endocytosis to the cytoplasm. No method has been reported that can release the drug into the cytoplasm with satisfactory efficiency.
  • An object of the present invention is to deliver a target substance such as a protein, a nucleic acid, and a drug incorporated by endocytosis to the cytoplasm with high efficiency.
  • the present inventor can enhance the release of target substances such as antibodies, sensor molecules, nucleic acids, drugs, etc. from the endosome into the cytoplasm by substituting some of the amino acids of the basic amphiphilic peptide Lycotoxin with acidic amino acids. I found.
  • the present invention provides the following cytoplasmic delivery agents and substance introduction agents for target substances such as peptides, proteins, nucleic acids, and pharmaceuticals.
  • Item 1 The following formula (I): R 1 -IWLTALX 5 FLGX 6 X 1 AAX 7 X 2 X 3 AX 8 QX 4 LSX 9 LR 2 (I) (In the formula, X 1 and X 2 are the same or different and each represents H or A.
  • X 3 represents E, L-2-aminoadipic acid (Aad), 2-aminopimelic acid or 2-aminosuberic acid.
  • X 4 represents Q, L-2-aminoadipic acid (Aad), 2-aminopimelic acid, 2-aminosuberic acid or E.
  • X 5 to X 9 are the same or different, and Lys (K), Arg (R) , Homoarginine, ornithine, homolysine or 2-amino-7-guanidinoheptanoic acid.
  • X 1 H
  • X 2 H
  • X 3 E
  • X 4 Q
  • X 5 to X 9 K
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group, an acyl group, an alkoxycarbonyl group, an aralkyloxycarbonyl group, an aryloxycarbonyl group or a target substance.
  • R 2 represents a hydroxyl group (OH), an amino group (NH 2 ), a monoalkylamino group, a monoarylamino group, a monocycloalkylamino group, a dialkylamino group, an alkoxy group, an aralkyloxy group, an aryloxy group, or a target substance.
  • OH hydroxyl group
  • NH 2 amino group
  • Item 2. The peptide according to Item 1, represented by any one of the following (Ia) to (Ie): R 1 -IWLTALX 5 FLGX 6 AAAX 7 AEAX 8 QELSX 9 LR 2 (Ia) R 1 -IWLTALX 5 FLGX 6 HAAX 7 HXAX 8 QQLSX 9 LR 2 (Ib) R 1 -IWLTALX 5 FLGX 6 AAAX 7 AXAX 8 QXLSX 9 LR 2 (Ic) R 1 -IWLTALX 5 FLGX 6 AAAX 7 AEAX 8 QQLSX 9 LR 2 (Id) R 1 -IWLTALX 5 FLGX 6 HAAX 7 HXAX 8 QXLSX 9 LR 2 (Ie) (X represents L-2-aminoadipic acid (Aad), 2-aminopimelic acid or 2-aminosuberic acid, and R 1 represents a hydrogen atom, alkyl group, acyl group, alkoxy
  • R 2 represents a hydroxyl group (OH), amino group (NH 2 ), monoalkylamino group, monoarylamino group, monocycloalkylamino, dialkylamino group, alkoxy group, aralkyloxy group, aryloxy X 5 to X 9 are the same or different and each represents Lys (K), Arg (R), homoarginine, ornithine, homolysine or 2-amino-7-guanidinoheptanoic acid.
  • Item 3. The peptide according to Item 2, represented by any one of the following (Ia) to (Ic): R 1 -IWLTALX 5 FLGX 6 AAAX 7 AEAX 8 QELSX 9 LR 2 (Ia) R 1 -IWLTALX 5 FLGX 6 HAAX 7 HXAX 8 QQLSX 9 LR 2 (Ib) R 1 -IWLTALX 5 FLGX 6 AAAX 7 AXAX 8 QXLSX 9 LR 2 (Ic) (X represents L-2-aminoadipic acid (Aad), 2-aminopimelic acid or 2-aminosuberic acid, and R 1 represents a hydrogen atom, alkyl group, acyl group, alkoxycarbonyl group, aralkyloxycarbonyl group, aryloxycarbonyl.
  • R 2 represents a hydroxyl group (OH), amino group (NH 2 ), monoalkylamino group, monoarylamino group, monocycloalkylamino, dialkylamino group, alkoxy group, aralkyloxy group, aryloxy X 5 to X 9 are the same or different and each represents Lys (K), Arg (R), homoarginine, ornithine, homolysine or 2-amino-7-guanidinoheptanoic acid.
  • Item 4 A cytoplasmic delivery agent comprising the peptide according to any one of items 1 to 3.
  • Item 5 A substance introduction agent targeting the cytoplasm, comprising the peptide according to any one of items 1 to 3 in a vector.
  • Item 6 A substance introduction agent targeting the cytoplasm, wherein the peptide according to any one of Items 1 to 3 and the target substance are covalently bonded directly or via a spacer.
  • Item 7 A substance that targets the cytoplasm, wherein the peptide according to any one of Items 1 to 3 and the target substance form a non-covalent complex directly or through another molecule that interacts with the target substance. Introducing agent.
  • Item 8. The substance introduction agent targeting the cytoplasm according to [5], wherein the target substance is encapsulated in a vector.
  • Item 9 The substance introducing agent according to Item 5, wherein the peptide is bound to a vector component directly or via a spacer.
  • Item 10 The substance introduction agent according to Item 4, 5, 6 or 7, comprising a conjugate of the peptide and a molecule that increases the affinity of the peptide for target cells.
  • Item 11 The substance introduction agent according to Item 5, 8 or 9, wherein the peptide is encapsulated in a vector together with a target substance.
  • the vector is a liposome, a lipid microsphere, a polymer micelle, a polymer hollow carrier, a nanogel, a high density lipoprotein (HDL), a synthetic polymer, a self-assembled nucleic acid-derived vector, a virus outer shell protein-derived vector or a nanoparticle.
  • Item 10 The substance introduction agent according to Item 5, 8 or 9.
  • Item 13 The substance introduction agent according to Item 9, wherein the component of the vector is cholesterol or phospholipid, and the vector contains a complex containing cholesterol or phospholipid and the peptide according to any one of Items 1 to 3.
  • X 5 to X 9 are the same or different, and Lys (K), Arg (R) , Homoarginine, ornithine, homolysine or 2-amino-7-guanidinoheptanoic acid.
  • X 1 H
  • X 2 H
  • X 3 E
  • X 4 Q
  • X 5 to X 9 K
  • one or both of X 1 and X 2 is A.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group, an acyl group, an alkoxycarbonyl group, an aralkyloxycarbonyl group, an aryloxycarbonyl group, an alkoxy group, an aralkyloxy group, an aryloxy group, or a target substance.
  • R 2 represents a hydroxyl group (OH), an amino group (NH 2 ), a monoalkylamino group, a monoarylamino group, a monocycloalkylamino group, a dialkylamino group, an alkoxy group, an aralkyloxy group, an aryloxy group, or a target substance.
  • Y represents a single bond or a spacer.
  • n is 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • Z- (R a ) m (IB) (Wherein, Z represents a branched polyvalent linker, and R a is the same or different and represents R 1 -IWLTALX 5 FLGX 6 X 1 AAX 7 X 2 X 3 AX 8 QX 4 LSX 9 LY- Y-IWLTALX 5 FLGX 6 X 1 AAX 7 X 2 X 3 AX 8 QX 4 LSX 9 LR 2 X 1 and X 2 are the same or different and represent H or A.
  • X 3 is E, L- 2-aminoadipic acid (Aad), 2-aminopimelic acid or 2-aminosuberic acid
  • X 4 represents Q, L-2-aminoadipic acid (Aad), 2-aminopimelic acid, 2-aminosuberic acid or E
  • X 5 to X 9 are the same or different and each represents Lys (K), Arg (R), homoarginine, ornithine, homolysine or 2-amino-7-guanidinoheptanoic acid.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group, an acyl group, an alkoxycarbonyl group, an aralkyloxycarbonyl group, an aryloxycarbonyl group, an alkoxy group, an aralkyloxy group, an aryloxy group, or a target substance.
  • R 2 represents a hydroxyl group (OH), an amino group (NH 2 ), a monoalkylamino group, a monoarylamino group, a monocycloalkylamino group, a dialkylamino group, an alkoxy group, an aralkyloxy group, an aryloxy group, or a target substance.
  • Y represents a single bond or a spacer.
  • m is an integer of 2 to 8.
  • the peptide of the present invention has an effect of being incorporated into endosomes together with a target substance (intracellularly introduced molecule) such as a protein such as an antibody, a nucleic acid, and a medicine by effectively interacting with the cell surface.
  • a target substance intracellularly introduced molecule
  • a protein such as an antibody, a nucleic acid, and a medicine
  • the peptide of the present invention induces destabilization of the endosomal membrane with a decrease in pH within the endosome and a change in membrane constituents accompanying endosomal maturation, and the antibody, sensor molecule, nucleic acid, or pharmaceutical that migrates into the endosome together with the peptide It has the effect of promoting the release of the target substance into the cytoplasm.
  • the peptide of the present invention allows the intracellular localization and behavior of the target substance, such as proteins and sensor molecules subjected to chemical modification including fluorescent labeling, into the cytoplasm, and the intracellular environment. There is an effect that enables measurement and control.
  • the peptide of the present invention has an effect of delivering a physiologically active substance having a large size such as an antibody or a nucleic acid into the cytoplasm.
  • the first preferred embodiment of the present invention is alanine substitution of the histidine residues at positions 12 and 16.
  • Patent Document 2 L17E contains two histidines (H). It is thought that histidine is not charged at extracellular pH, but is positively charged at endosomal pH. The endosomal membrane-selective cytotoxicity of L17E was thought to be improved by the positive charge of histidine, but unexpectedly, it was found to be decreased by histidine residues. For this reason, the histidine residues at positions 12 and 16 were substituted with alanine to improve the endosomal membrane-selective damage.
  • HA / E1 in which two histidine residues are substituted with alanine has higher helix properties than L17E (Fig. 1), and the release activity of Alexa488-dextran as a macromolecular drug model from endosomes is greatly improved (Fig. 2). .
  • H12Q / H16Q / L17E / Q21E and H12S / H16S / L17E / Q21E in which histidines at positions 12 and 16 are substituted with hydrophilic amino acids other than alanine (glutamine, serine) are inferior to L17E, and histidine It was concluded that a substitution of alanine is desirable.
  • the second preferred embodiment of the present invention is substitution of 2-aminoadipic acid (Aad), 2-aminopimelic acid or 2-aminosuberic acid at positions 17 (E) and 21 (Q).
  • Glutamic acid (E) at position 17 in L17E which plays an important role in selective destabilization of the endosomal membrane relative to the cell membrane, is expected in order to further stabilize the helix structure of the peptide and improve membrane affinity.
  • a derivative (L17Aad) substituted with 2-aminoadipic acid (Aad) with one side chain methylene chain was synthesized. Since the histidine residue is present in the sequence, the helix content of L17Aad itself did not improve much (Fig. 1), but the endosome inclusion release activity was significantly higher than that of L17E as shown in Fig. 3. It became clear to show.
  • the histidine residues at positions 12 and 16 are alanine substituted, and the glutamic acid residue at position 17 is 2-aminoadipic acid (Aad) 2-aminopimelic acid or 2-aminosuberine. Substitution with acid.
  • a peptide HAad in which histidine of L17E was substituted with alanine and glutamic acid at position 17 was substituted with aminoadipic acid was synthesized.
  • HAad was found to show a high helix in the presence of acidic lipid membrane, and as shown in Fig. 4 and Examples, the drug incorporated into endosomes was significantly more effective in cytoplasm than L17E. It became clear that it has the activity to release.
  • a fourth preferred embodiment of the present invention is the substitution of 5 Lys (K) residues with Arg (R), homoarginine, ornithine, homolysine or 2-amino-7-guanidinoheptanoic acid.
  • the peptide of the present invention is the following derivative of L17E described in Patent Document 2.
  • L17E IWLTALX 5 FLGX 6 HAAX 7 HEAX 8 QQLSX 9 L-amide (SEQ ID NO: 1) (Wherein X 5 to X 9 are Lys (K).)
  • the peptides of the present invention corresponds to X 1 of Lycotoxin 1 12 position H (His), 16 position H (His) corresponding to X 2, corresponding to the X 3 17 position E ( Glu), a peptide in which at least one of Q (Gln) at position 21 corresponding to X 4 is substituted.
  • H (His) at 12 and 16 positions may be replaced by A (Ala), E (Glu) at 17 position and Q (Gln) at 21 position are X (L-2-aminoadipic acid, Aad, 2 -Aminopimelic acid or 2-aminosuberic acid).
  • Five Lys (K) residues may be substituted with Arg (R), homoarginine, ornithine, homolysine or 2-amino-7-guanidinoheptanoic acid residue.
  • the peptide of the general formula (I) of the present invention includes the following 17 kinds of peptides (I-1) to (I-17).
  • Preferred peptides of the present invention are the following five peptides.
  • X, R 1 , R 2 , X 5 , X 6 , X 7 , X 8 , X 9 are as defined above].
  • peptides of the present invention are the following three peptides.
  • X, R 1 , R 2 , X 5 , X 6 , X 7 , X 8 , X 9 are as defined above].
  • Each amino acid of the peptide of the present invention represented by a one-letter code may be an L-type amino acid or a D-type amino acid.
  • the number of D-type amino acids may be 1 or 2 or more, but preferably all amino acids are L-type amino acids or all amino acids are D-type amino acids . Since G (Gly) does not have an asymmetric carbon, it is treated as an L-type amino acid in this specification.
  • the peptide of the present invention can release the target substance from the endosome into the cytoplasm with high efficiency.
  • R 1 is a hydrogen atom
  • the N-terminus is an amino group (NH 2 )
  • R 1 is an alkyl group, an acyl group, an alkoxycarbonyl group, an aralkyloxycarbonyl group, or an aryloxycarbonyl group
  • It becomes urethane such as alkylamino, acylamino, alkoxycarbonylamino, aralkyloxycarbonylamino, and aryloxycarbonylamino.
  • the N-terminus of the peptide of the present invention may be a dialkylamino group substituted with two alkyl groups.
  • R 2 is a hydroxyl group (OH)
  • the C terminal is a carboxyl group (COOH)
  • R 2 is an amino group (NH 2 )
  • the C terminal is an amide group (CONH 2 ).
  • R 1 is preferably a hydrogen atom (H), an alkyl group, an alkoxycarbonyl group or an acyl group, more preferably a hydrogen atom.
  • Preferred R 2 is a hydroxyl group (OH), an alkoxy group or an amino group (NH 2 ).
  • alkyl group examples include linear or branched alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl and the like. It is done.
  • the monoalkylamino group is linear or branched such as methylamino, ethylamino, n-propylamino, isopropylamino, n-butylamino, isobutylamino, sec-butylamino, tert-butylamino, pentylamino, hexylamino, etc.
  • an amino group substituted with an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms having the following formula.
  • dialkylamino group examples include linear chains such as dimethylamino, diethylamino, di-n-propylamino, diisopropylamino, di-n-butylamino, diisobutylamino, disec-butylamino, ditert-butylamino, dipentylamino, and dihexylamino.
  • an amino group disubstituted with a branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms can be used.
  • acyl group examples include acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, isovaleryl, pivaloyl, lauroyl, myristoyl, palmitoyl, stearoyl, isostearoyl, oleoyl, linoloyl, etc., straight chain having 2 to 22, preferably 2 to 18 carbon atoms.
  • the acyl group which has a branch is mentioned. Further, it may be an acyl group containing an aromatic group such as 1-pyreneacetyl and 1-pyrenebutyryl.
  • alkoxycarbonyl group examples include cholesteryloxycarbonyl group, tert-butyloxycarbonyl group, phytosteryloxycarbonyl group, stearyloxycarbonyl group, palmityloxycarbonyl group, 2-octyldodecyloxycarbonyl group, and behenyloxycarbonyl group. Can be mentioned.
  • Aralkyloxycarbonyl group includes benzyloxycarbonyl group, phenethyloxycarbonyl group, fluorenylmethyloxycarbonyl group, anthrylmethyloxycarbonyl group, biphenylylmethyloxycarbonyl group, tetrahydronaphthylmethyloxycarbonyl group, chromanylmethyloxy Examples thereof include a carbonyl group, 2,3-dihydro-1,4-dioxanaphthalenylmethyloxycarbonyl group, indanylmethyloxycarbonyl group, phenanthrylmethyloxycarbonyl group and the like.
  • aryloxycarbonyl group fluorenyloxycarbonyl group, phenyloxycarbonyl group, naphthyloxycarbonyl group, anthryloxycarbonyl group, biphenylyloxycarbonyl group, tetrahydronaphthyloxycarbonyl group, chromanyloxycarbonyl group, 2, Examples include 3-dihydro-1,4-dioxanaphthalenyloxycarbonyl group, indanyloxycarbonyl group, and phenanthryloxycarbonyl group.
  • Monoarylamino groups include phenylamino, naphthylamino, anthrylamino, biphenylylamino, tetrahydronaphthylamino, chromanylamino, fluorenylamino, 2,3-dihydro-1,4-dioxanaphthalenylamino , Indanylamino and phenanthrylamino.
  • monocycloalkylamino examples include cycloalkylamino having 3 to 8 carbon atoms such as cyclopropylamino, cyclobutylamino, cyclopentylamino, cyclohexylamino, cycloheptylamino, cyclooctylamino and the like.
  • the alkoxycarbonyl group, aralkyloxycarbonyl group or aryloxycarbonyl group may be directly bonded to the peptide of the present invention, but PEG (polyethylene glycol), amide group (-CONH-, -NHCO-), ester group (- COO-,-O-CO-), ether group (-O-), amino group (-NH-), alkylene (methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, hexylene, etc.), amino acid (for example, 20 kinds of natural
  • the peptide of the present invention may be bound via a suitable spacer such as an amino acid.
  • a cholesteryl group or a phospholipid may be bound to the peptide of the present invention via a spacer, and the conjugate may constitute a constituent component of a vector such as a liposome.
  • R 2 When R 2 is a hydroxyl group, the C-terminus is COOH, when R 2 is an amino group, the C-terminus is CONH 2 , and when R 2 is alkoxy, aralkyloxy, or aryloxy, the C-terminus is the corresponding ester. .
  • R 2 is a monoalkylamino group, a monoarylamino group, a monocycloalkylamino group or a dialkylamino group
  • the C-terminus is a corresponding amide.
  • alkoxy group examples include cholesteryloxy group, phytosteryloxy group, stearyloxy group, palmityloxy group, 2-octyldodecyloxy group, and behenyloxy group.
  • Aralkyloxy groups include benzyloxy, phenethyloxy, fluorenylmethyloxy, anthrylmethyloxy, biphenylylmethyloxy, tetrahydronaphthylmethyloxy, chromanylmethyloxy, 2,3-dihydro Examples include a 1,4-dioxanaphthalenylmethyloxy group, an indanylmethyloxy group, and a phenanthrylmethyloxy group.
  • Aryloxy groups include fluorenyloxy, phenyloxy, naphthyloxy, anthryloxy, biphenylyloxy, tetrahydronaphthyloxy, chromanyloxy, 2,3-dihydro-1,4- Examples include a dioxanaphthalenyloxy group, an indanyloxy group, and a phenanthryloxy group.
  • Examples of the target substance to be delivered to the cytoplasm include physiologically active substances such as proteins, peptides, nucleic acids, drugs, sugars or labeling substances thereof, synthetic polymers, liposomes, organic / inorganic / semiconductor fine particles, and the like.
  • physiologically active substances such as proteins, peptides, nucleic acids, drugs, sugars or labeling substances thereof, synthetic polymers, liposomes, organic / inorganic / semiconductor fine particles, and the like.
  • Physiologically active substances such as proteins, peptides, nucleic acids, pharmaceuticals, sugars, or labeling substances, synthetic polymers, liposomes, organic / inorganic / semiconductor fine particles, and the like are linked to IWLTALX 5 FLGX 6 X 1 AAX 7 X via an appropriate spacer. It may be linked to the N-terminus or C-terminus of the peptide moiety represented by 2 X 3 AX 8 QX 4 LSX 9 L.
  • physiologically active substance may be directly bound to the N-terminal or C-terminal of the peptide part represented by IWLTALX 5 FLGX 6 X 1 AAX 7 X 2 X 3 AX 8 QX 4 LSX 9 L without a spacer. Good.
  • the peptides of the present invention in which one or both of R 1 and R 2 are target substances may include the following: (Bioactive substance) -IWLTALX 5 FLGX 6 X 1 AAX 7 X 2 X 3 AX 8 QX 4 LSX 9 L- (Bioactive substance) (Bioactive substance)-(Spacer) -IWLTALX 5 FLGX 6 X 1 AAX 7 X 2 X 3 AX 8 QX 4 LSX 9 L- (Spacer)-(Bioactive substance) (Bioactive substance)-(Spacer) -IWLTALX 5 FLGX 6 X 1 AAX 7 X 2 X 3 AX 8 QX 4 LSX 9 L- (Bioactive substance) (Bioactive substance) -IWLTALX 5 FLGX 6 X 1 AAX 7 X 2 X 3 AX 8 QX 4 LSX 9 L- (Bioactive substance) (Bioactive substance) -IWLTALX 5 FLGX 6 X 1 AAX 7 X 2
  • Proteins include antibodies, enzymes, cell signaling factors, transcription factors, DNA or RNA binding proteins, intracellular organ components such as nuclei, mitochondria, and cytoskeleton, ubiquitin-proteasome related proteins such as ubiquitin and heat shock proteins, and caspases. Apoptosis-related proteins such as p53, cell cycle regulatory proteins such as p53, and lectins. In addition, proteins having gene cutting / recombination ability such as Cre recombinase, TALEN, and Cas9 are also included. Regarding antibodies, in addition to immunoglobulins, fragment proteins thereof and single chain antibodies derived from camelids are also included.
  • targets for these antibodies include kinases, transcription factors such as HIF-1, cytoskeletal proteins such as microtubules, and the like.
  • peptides include helical peptides and cyclic peptides that regulate intracellular protein interactions, fragment peptides of intracellular proteins, DNA / RNA binding peptides, various enzyme substrates / inhibitors, and antigenic peptides for cancer vaccine production. It is done.
  • the drug include an antitumor agent and an antiviral agent
  • examples of the sugar include dextran and sialic acid
  • examples of the nucleic acid include DNA and RNA (preferably siRNA, miRNA, shRNA, rRNA, ribozyme, antisense RNA, etc.
  • DNA / RNA aptamers and chemically modified products thereof.
  • a complex of a protein such as Cas9 / sgRNA and a nucleic acid is also included in the physiologically active substance. It is also possible to introduce a derivative obtained by chemically modifying the above physiologically active substance as necessary into the cell as a target substance in order to improve the physiological activity and function in the cell.
  • bioactive substances such as the above proteins and nucleic acids are modified with fluorophores, quantum dots, radioisotopes, fluorescent proteins, luciferases, photocrosslinkers, etc.
  • Stable isotope-labeled proteins for intracellular NMR measurement and the like are also mentioned as target substances.
  • the fluorophore can be modified with a fluorophore whose fluorescence characteristics change according to the intracellular environment, if necessary.
  • the target substance to be introduced into the cell is not particularly limited to the above, and it can be used in combination with other cell introduction agents such as membrane-permeable peptides and various transfection reagents to further improve the efficiency of translocation into the cytoplasm. It is also possible to use the present invention for further improvement.
  • the peptide of the present invention in which R 1 and R 2 are not both target substances may be administered to vertebrates, preferably mammals including humans, as a composition, preferably a pharmaceutical composition, in combination with the target substance.
  • the target substance is composed of protein, peptide, nucleic acid, medicine, sugar or labeling substance thereof, synthetic polymer, liposome, organic / inorganic / semiconductor fine particles, etc., and spacer Not included.
  • the peptide of the present invention is 1 to 10,000 parts by weight, preferably 5 to 200 parts by weight, more preferably 10 to 200 parts per 100 parts by weight of the target substance. Including parts by mass.
  • the peptide of the present invention may be covalently bound to the target substance directly or via an appropriate spacer, or may be bound to the target substance non-covalently or directly through another molecule that interacts with the target substance. May be formed. Furthermore, it may be contained in a vector (cell introduction agent) encapsulated in endosomes. For example, the peptide of the present invention may be contained inside a vector, and may be bound directly to a component of the vector or via a spacer. Alternatively, the peptide of the present invention may be included on the surface of a vector by forming a complex non-covalently via another molecule that interacts with a component of the vector.
  • the peptide of the present invention can be encapsulated in the vector together with the target substance, and the transition from the endosome to the cytoplasm can be promoted after the target substance is taken into the endosome.
  • a complex in which the peptide of the present invention and the target substance are non-covalently bound is included in the composition or pharmaceutical composition of the present invention.
  • the peptides of the present invention may be in the form of dimers or multimers.
  • the dimer or multimer is represented, for example, by the following formula (IA).
  • R 1- IWLTALX 5 FLGX 6 X 1 AAX 7 X 2 X 3 AX 8 QX 4 LSX 9 LY) n -R 2 (IA)
  • R 1 , R 2 , X 1 , X 2 , X 3 , X 4 , X 5 , X 6 , X 7 , X 8 , X 9 are as defined above.
  • n is 2,3,4,5,6,7,8,9 or 10, preferably an integer of 2 to 6, more preferably 2 to 4.
  • ester bond (—CO—O—, —O—CO—), ether bond (—O—), amide bond (NHCO, CONH), sugar chain linker, polyethylene glycol linker, peptide A linker etc.
  • peptide linkers include linkers containing at least one of the 20 natural amino acids that constitute proteins, and the number of amino acids in the peptide linker is 1-20, 1-15, 1-12, Examples thereof include, but are not limited to, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, or 1 to 4.
  • Peptide linkers include arginine dimer, arginine trimer, arginine tetramer, lysine dimer, lysine trimer, lysine tetramer, glycine dimer, glycine trimer, glycine tetramer, glycine pentamer, glycine hexamer, alanine-alanine-tyrosine (AAY), isoleucine- Examples include leucine-alanine (ILA), arginine-valine-lysine-arginine (RVKR) and the like.
  • the spacer may be divalent or multivalent.
  • the peptide of the present invention When the peptide of the present invention is a multimer, it may be linked with a branched polyvalent linker such as a dendrimer or a metal complex.
  • a dendrimer is represented by the following formula
  • Z- (R a ) m (IB) (Wherein, Z represents a branched polyvalent linker, and R a is the same or different and represents R 1 -IWLTALX 5 FLGX 6 X 1 AAX 7 X 2 X 3 AX 8 QX 4 LSX 9 LY- Y-IWLTALX 5 FLGX 6 X 1 AAX 7 X 2 X 3 AX 8 QX 4 Indicates LSX 9 LR 2.
  • R 1 , R 2 , X 1 , X 2 , X 3 , X 4 , X 5 , X 6 , X 7 , X 8 , X 9 and Y are as defined above, and m is 3, 4 or 5.
  • Examples of branched polyvalent linkers represented by Z include diethylenetriamine, spermine, spermidine, triethanolamine, ethylenediaminetetraacetate (EDTA), pentaerythritol, azido-propyl (alkyl) amine, lysine, ornithine, aspartic acid, glutamic acid, Multifunctional peptides (dipeptides containing lysine, ornithine, aspartic acid or glutamic acid, tripeptides or tetrapeptides), organic polyvalent amino compounds (eg poly (amidoamine) (PAMAM), tris (ethyleneamine) ammonia, poly (propylene) Imine) (Astramol TM)
  • m is an integer of 2 to 8, preferably an integer of 2 to 6, more preferably an integer of 2 to 4, such as 3 or 4.
  • a dimer obtained by linking N-terminals (or C-terminals) of peptides represented by IWLTALX 5 FLGX 6 X 1 AAX 7 X 2 X 3 AX 8 QX 4 LSX 9 L is included in the dendrimer of the present invention.
  • the dendrimer of the present invention also includes a tetramer obtained by further linking “the dimer by connecting the N-terminal sides of the peptide” and “the dimer by connecting the C-terminals”.
  • the target substance can be introduced into the cytoplasm of a specific cell by supplying the peptide of the present invention and the target substance to the target cell by DDS, or by combining the cell-specific vector and the peptide of the present invention.
  • cell-specific vectors include vectors in which cell-specific antibodies, ligands and the like are introduced on the surface.
  • the vector consists of block copolymers including liposomes (cationic liposomes, anionic liposomes), lipid microspheres, lipofectamines, hydrophilic segments and inner core-forming segments (hydrophobic segments, cationic segments, metal complex forming segments, etc.)
  • Polymer micelle polymer hollow carrier (drug carrier comprising polysarcosine derivative described in Patent No. 5142313, electrostatic coupling comprising block copolymer having uncharged segment and charged segment described in WO2004 / 105799 Type polymer micelles), nanogels, high density lipoprotein (HDL), synthetic polymers and nanoparticles. It may be a self-assembled nucleic acid-derived vector or a viral coat protein-derived vector.
  • the vector when the vector is a liposome, either by using the acyl group having 10 or more carbon atoms as R 1, lipophilic large groups such as cholesteryl oxycarbonyl group or C-terminal to the cholesteryl group at the N-terminus, or phosphatidylethanolamine, etc.
  • the liposome containing the peptide of the present invention can be obtained by binding the phospholipid of the present invention with an ester bond or an amide bond via an appropriate spacer as required.
  • Spacers include PEG (polyethylene glycol), amide groups (-CONH-, -NHCO-), ester groups (-COO-, -O-CO-), ether groups (-O-), amino groups (-NH- ), Alkylene (methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, hexylene, etc.), amino acids and the like. Amino acids may be linked via the side chain COOH or NH 2 groups.
  • the virus (outer protein) -derived vector include a retrovirus vector, an adenovirus vector, and a Sendai virus vector.
  • the self-assembled nucleic acid-derived vector include those described in WO 2012144560 A1 and WO2016 / 006628.
  • the peptide of the present invention is transferred and accumulated more efficiently / effectively in the endosome of the cell.
  • “Molecules that enhance the affinity of the peptides of the present invention for target cells” include receptors (folate receptors, transferrin receptors, receptors for sugars such as glucose, epidermal growth factor ( EGF) and ligands that bind to growth factor receptors (such as vascular endothelial growth factor (VEGF)), basic peptides such as fatty acids, hydrophobic peptides, polyarginine, and sugar chains.
  • receptors farnes, transferrin receptors, receptors for sugars such as glucose, epidermal growth factor ( EGF) and ligands that bind to growth factor receptors (such as vascular endothelial growth factor (VEGF)
  • basic peptides such as fatty acids, hydrophobic peptides, polyarginine, and sugar chains.
  • the peptide of the present invention and the target substance can form a non-covalent complex directly or via another molecule that interacts with the target substance.
  • non-covalent complexes include: (a) Complex of [Peptide showing affinity for antibody (selected using phage display system) and conjugate of peptide of the present invention] and antibody (b) Non-covalent complex of nucleic acid and peptide of the present invention (c) Non-covalent complex of [conjugate of peptide of the present invention and nucleic acid interacting molecule] and nucleic acid.
  • the organism species to which the target substance is to be delivered to the cell is a vertebrate, preferably a mammal.
  • mammals include humans, monkeys, cows, sheep, goats, horses, pigs, rabbits, dogs, cats, rats, mice, guinea pigs, and the like.
  • R 2 is NH 2.
  • X is L-2-aminoadipic acid (Aad).
  • X 5 to X 9 are Lys (K).)
  • Example 2 Helix content
  • FIG. 1 shows the CD spectrum (left) and helix content (right).
  • Example 3 Introduction of macromolecular drug model (10 kDa dextran) into cells
  • (1) In the presence or absence (control, no peptide) of the peptides (L17E, L17E / Q21E, HA / E1, HA / E2) (40 ⁇ M) obtained in Example 1, HeLa cells and Alexa488-dextran (Molecular Probes, 10 kDa) (200 ⁇ g / mL) was treated in ⁇ -MEM ( ⁇ ) for 1 h, the cells were washed, and observed with a confocal microscope. The results are shown in FIG.
  • Alexa488-dextran (10 kDa) ⁇ showed significant outflow and diffusion into the cytoplasm.
  • Example 4 Introduction of macromolecular drug model (10 kDa dextran) into cells (2) HeLa cells and Alexa488-dextran (Molecular Probes, 10 kDa) (200 ⁇ g / mL) in the presence or absence (control, no peptide) of the peptides (L17E, L17Aad) (40 ⁇ M) obtained in Example 1 The cells were washed for 1 h in ⁇ -MEM ( ⁇ ), and observed with a confocal microscope. The results are shown in FIG.
  • Embodiment 5 Introduction of macromolecular drug model (10 kDa dextran) into cells (3) HeLa cells and Alexa488-dextran (Molecular Probes, 10 kDa) in the presence or absence (control, no peptide) of the peptides (HAad, HA / E2, L17Aad, L17E) (40 ⁇ M) obtained in Example 1 ( 200 ⁇ g / mL) was treated in ⁇ -MEM ( ⁇ ) for 1 h, cells were washed, and observed with a confocal microscope. The results are shown in FIG.
  • Example 6 Comparison of intracellular release efficiency of dextran (10 kDa) (1) Approximately 75% by incubating HeLa cells in the presence of HAad (40 ⁇ M) for 1 h in Alexa488-dextran (10 kDa) (200 ⁇ g / mL) as a macromolecular drug model in ⁇ -MEM (-) medium Release of Alexa488-dextran into the cell (cytosol). On the other hand, when L17E was used, it was about 50%.
  • the peptide concentration required to detect the signal of Alexa488-dextran released into the cells in 50% of the cells was 20 ⁇ M for HAad, whereas L17E was 40 ⁇ M (EC 50 was 1). / 2).
  • Example 7 Comparison of intracellular release efficiency of dextran (10 kDa) (2) In NIH3T3 cells, in which dextran release into cells is more difficult than in HeLa cells, cells and dextran (10 kDa) were combined with DMEM (10 kDa) in the presence of HAad, HA / E2, and L17E (each 40 ⁇ M) as in Example 6. -) Incubation in medium for 1 h showed about 35%, 25%, and 17% of the cells to release dextran into the cells (the intracellular release by HAad treatment was twice that of L17E) ).
  • Example 8 FIG. Comparison of release efficiency of human immunoglobulin (IgG, ⁇ 160 kDa) (1) As in Example 6, human immunoglobulin (IgG, ⁇ 160 kDa) (500 ⁇ g / mL) fluorescently labeled with Alexa488 in the presence of HAad, HA / E2, and L17E (40 ⁇ M each) was added to ⁇ -MEM (500 ⁇ g / mL). -) When incubated for 1 h in the medium, human immunoglobulin was released into about 70%, 45% and 35% of the cells, respectively (Fig. 7, intracellular release by HAad treatment) (Twice that of L17E).
  • Example 9 Comparison of intracellular release efficiency of human immunoglobulin (IgG, ⁇ 160 kDa) (2) In Example 8, it was confirmed that HAad has a high ability to release endosome-encapsulated IgG into cells. Based on this, it was examined whether the amount of IgG to be administered can be reduced.
  • IgG human immunoglobulin
  • Example 10 Comparison of intracellular release efficiency of human immunoglobulin (IgG, ⁇ 160 kDa) (3)
  • IgG human immunoglobulin
  • HAad has a high ability to release endosomally-encapsulated IgG into cells even at a lower IgG dose. Based on this, it was examined whether the amount of peptide to be administered can be reduced.
  • Example 11 Cell killing assay by intracellular delivery of toxin protein saporin Saporin is known as a cytotoxin that kills cancer cells by intracellular delivery. Incubate RAW264.7 cells and saporin (10 ⁇ g / mL) in ⁇ -MEM (-) medium for 1 h in the presence of HAad, HA / E2, L17E (40 ⁇ M each), and then wash the cells. Was replaced with DMEM (+) and further incubated for 6 hours. Cell viability was assayed by WST-8 assay (FIG. 10).
  • the survival rate of cells treated with saporin in the presence of HAad and HA / E2 was significantly reduced compared to the survival rate in the presence of 4, 6% and L17E, respectively (16%), and in the presence of HAad.
  • the survival rate was 1/4 in the presence of L17E.
  • Example 12 Gene Recombination Assay by Intracellular Delivery of Cre Protein
  • HeLa cells transfected with a plasmid encoding loxP-DsRed-loxP-EGFP prepared in the same manner as in the example of Patent Document 2 were subjected to His-tag fusion Cre (Cre- His 6 ) (10 ⁇ M) was incubated in ⁇ -MEM ( ⁇ ) for 1 h in the presence of HAad, HA / E2, and L17E (40 ⁇ M each).
  • This system is designed to express EGFP when gene recombination is induced by the release of Cre protein into the cell.
  • the cells were washed, cultured with ⁇ -MEM (+) for 24 h, and then observed with a confocal microscope (FIG. 11).
  • the proportion of EGFP-expressing cells was significantly increased compared to the control cell group (administered only with Cre-His 6 ).
  • the percentages of GFP-expressing cells upon treatment with HAad, HA / E2, and L17E were 41%, 36%, and 30%, respectively.
  • the EGFP expression efficiency when the release peptide was not administered was 9%, it was possible to consider that genetic recombination increased by 32, 27, and 22% when the peptide was administered compared to when the peptide was not administered. Occasionally, genetic recombination was significantly promoted compared to L17E administration.
  • Example 13 Damage to mitochondria in peptide treatment Since the mitochondrial membrane is said to be richer in acidic lipid than the cell membrane, the effect of the above peptide on the mitochondrial membrane was examined by JC-1 assay.
  • the JC-1 reagent is red when the mitochondrial membrane is healthy and the membrane potential is maintained (J-aggregate), and green when the mitochondrial membrane is damaged and the membrane potential is not kept normal (J -monomer).
  • HeLa cells were incubated with HAad, HA / E2, and L17E (40 ⁇ M) in ⁇ -MEM (-) for 1 h, then JC-1 assay was performed, and the percentage of cells emitting red fluorescence was assayed by flow cytometry .
  • Uncoupling agent that inhibits ATP synthesis carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone, FCCP
  • FCCP carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone
  • Example 14 Nuclear Accumulation of Nuclear Localization Signal Fusion Green Fluorescent Protein (NLS-EGFP)
  • NLS-EGFP Nuclear Localization Signal Fusion Green Fluorescent Protein
  • cells and NLS-EGFP (10 ⁇ M) were added in the presence of HAad, L17E (40 ⁇ M each) in the presence of ⁇ . -Incubated for 1 h in MEM (-) medium. If NLS-EGFP is released into the cell while maintaining its activity, it is observed that green fluorescence is localized in the nucleus by NLS. As a result, localization of NLS-EGFP to the nucleus was observed in about 84% and 56% of the cells, respectively (FIG. 13). High endosomal inclusion release activity of HAad could be confirmed in this system.
  • Example 15 Evaluation of cell viability 24 hours after treatment with peptide in the presence of serum HAd, HA / E2, L17E (each 10, 20, 40 ⁇ M) cells were incubated in ⁇ -MEM (+) medium for 24 h. Later cell viability was assessed by WST-8 assay (FIG. 14). The survival rate after 24 hours at any concentration of any peptide was almost 100% and, like L17E, there was no significant toxicity in HA / E2 and HAad.

Abstract

本発明は、下記式（Ｉ）： R１-IWLTALX５FLGX６X１AAX７X２X３AX８QX４LSX９L-R２　（Ｉ） （式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｒ１、Ｒ２は、明細書に定義されるとおりである。） で表されるペプチドを提供するものである。

Description

細胞質送達ペプチド
　本発明は、目的物質を細胞質に送達するためのペプチド、細胞質送達剤及び物質導入剤に関するものである。
　タンパク質、核酸の生細胞内への導入は細胞機能の計測・解析や細胞機能の調節に非常に有用なアプローチである。例えば、現在、蛍光タンパク質との融合により、種々の細胞内タンパク質の局在や挙動の観察が行われている。しかし、蛍光タンパク質の融合による細胞内局在や挙動への影響やタンパク質活性への影響は捨てきれず、また、融合タンパク質の細胞内発現量の調節も難しい。従って、これらの厳密な評価においては、複数の方法での検証が望ましい。融合する蛍光タンパク質の蛍光特性にも制約があり、適切な蛍光団で化学標識したタンパク質を細胞内に導入できればこの問題の解決に資する。また、近年、天然タンパク質の認識能を活用した種々のバイオセンサーが開発されてきており（非特許文献１）、細胞内計測への応用が期待されている。しかし、このような化学修飾されたタンパク質を細胞外から細胞内へと導入しようとする際に、細胞外から加えたタンパク質の少なからぬ量がエンドソームに保持され、細胞質へと放出・拡散しないために、これらのタンパク質の細胞内可視化や計測の所望の機能を発揮できない場合が多い。
　一方、近年、種々のバイオ高分子医薬品の開発が急速に進んでいる。中でも抗体は非常に高い標的特異性を持つため、低分子医薬品に代わる分子標的薬として世界中で開発が進められている。しかし、一般に抗体は細胞質内に移行しないため、その標的は細胞膜上の受容体もしくは細胞外の疾患関連因子に限られているのが現状である。細胞質中には細胞骨格関連タンパク質や、キナーゼ関連因子など種々の疾病治療に際して標的となりうるものが多い。そのため、高分子の効率的細胞内導入法が確立すれば、抗体医薬の適用範囲は大幅に拡大する。さらにsiRNAなどの核酸(DNA、RNA)、医薬も細胞内導入の目的物質である。
　以上により、抗体を始めとする生理活性タンパク質、核酸、医薬を生細胞の細胞質へ効果的に導入する方法の確立が求められている。
　エンドソームに内包されたタンパク質や薬物を細胞質に放出する代表的なエンドソーム不安定化ペプチドとして、GALA（非特許文献２）、インフルエンザ・ヘマグルチニンHA2タンパク質由来ペプチド（非特許文献３）などが挙げられる。これらは、pH依存的膜融合ペプチドであり、エンドソーム内のpHが5程度になると膜融合性を発揮し、エンドソーム膜を傷害し、内包物を細胞質に放出するとされる。また、膜透過ペプチドとして知られるHIV-1 TatペプチドとHA2ペプチドの連結体（非特許文献４）なども報告されており、CreとTatの融合タンパク質等の生理活性タンパク質の細胞内導入に用いられた例が報告されている。
　また、高い膜傷害性を有するハチ毒メリチンにおいて、塩基性アミノ酸のリジンをpH感受性のマレイン酸誘導体で保護し、エンドソーム内でのpH低下により保護基が脱離することにより、エンドソーム膜を選択的に損傷させ、エンドソーム内包物を細胞質に放出される試みも報告されている（非特許文献５）。
　さらに、ポリエチレンイミンなどのポリカチオン性ポリマーのプロトン化の程度がpHの低下に伴い上昇することにより、エンドソームの膨潤を誘起し、内容物（核酸など）を細胞質に放出することが報告されている（プロトンスポンジ効果：非特許文献６）。また種々のpH感受性ポリマーが遺伝子導入に用いられている（特許文献１）。
　特許文献２は、抗体をはじめとするタンパク質を生細胞に導入することができるペプチドを開示しているが、その導入効率に改善の余地があった。
特開2009-007547 WO2016/052442
Takaokaら、Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 4088 Subbaraoら、Biochemistry 1987, 26, 2964 Maedaら、PNAS 1981, 78, 4133 Wadiaら、Nature Med. 2004, 10, 310 Rozemaら、Bioconjug. Chem., 2003, 14, 51 Boussifら、PNAS 1995, 92, 7297
　効果的な細胞機能の計測・解析のためには、細胞外から導入する生理活性タンパク質、核酸、医薬、あるいは蛍光標識タンパク質やセンサー分子の大部分が機能・活性発現の場である細胞質に導入できることが望ましい。しかし、従来の方法では、細胞の生理的取込機構であるエンドサイトーシスにより取り込まれたこれらの分子を、満足できる効率でエンドソームから細胞質へ放出することができないことが問題点であった。バイオ医薬品の細胞内への送達という観点からも、エンドサイトーシスで取り込まれた抗体などのタンパク質、核酸、医薬を効果的に細胞質に送達することが期待されるが、抗体などのタンパク質、核酸、医薬を満足できる効率で細胞質に放出できる方法は報告されていない。
　本発明は、エンドサイトーシスで取り込まれたタンパク質、核酸、医薬などの目的物質を高効率で細胞質に送達することを目的とする。
　本発明者は、塩基性両親媒性ペプチドLycotoxinのアミノ酸の一部を酸性アミノ酸と置換することで、抗体やセンサー分子、核酸、医薬などの目的物質のエンドソームから細胞質への放出を亢進させ得ることを見出した。
　本発明は以下のペプチド、タンパク質、核酸、医薬などの目的物質の細胞質送達剤及び物質導入剤を提供するものである。
項１．　下記式（Ｉ）：
R１-IWLTALX５FLGX６X１AAX７X２X３AX８QX４LSX９L-R２　　　（Ｉ）
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なってH又はAを示す。Ｘ３はE、L-2-aminoadipic acid (Aad) 、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示す。Ｘ４はQ、L-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸、2-アミノスベリン酸又はEを示す。Ｘ５～Ｘ９は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。
但しＸ１＝H、Ｘ２＝H、Ｘ３＝E、Ｘ４＝Q、かつ、Ｘ５～Ｘ９＝Kの場合を除く、並びに、
Ｘ４＝E、かつ、Ｘ５～Ｘ９＝Kのとき、Ｘ１とＸ２の一方または両方がAである。
　Ｒ１は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基又は目的物質を示す。Ｒ２は水酸基（OH）、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。）
で表されるペプチド。
項２．　下記の（Ｉａ）～（Ｉｅ）のいずれかで表される項１に記載のペプチド。
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AEAX８QELSX９L-R２　(Ｉａ)
R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７HXAX８QQLSX９L-R２　(Ｉｂ)
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AXAX８QXLSX９L-R２ 　(Ｉｃ)
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AEAX８QQLSX９L-R２ (Ｉｄ)
R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７HXAX８QXLSX９L-R２　（Ｉｅ）
  （XはL-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示し、Ｒ１は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基又は目的物質を示す。Ｒ２は水酸基（OH）、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Ｘ５～Ｘ９は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。）
項３．　下記の（Ｉａ）～（Ｉｃ）のいずれかで表される項２に記載のペプチド。
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AEAX８QELSX９L-R２　(Ｉａ)
R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７HXAX８QQLSX９L-R２　(Ｉｂ)
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AXAX８QXLSX９L-R２ 　(Ｉｃ)
（XはL-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示し、Ｒ１は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基又は目的物質を示す。Ｒ２は水酸基（OH）、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Ｘ５～Ｘ９は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。）
項４．　項１～３のいずれか１項に記載のペプチドからなる細胞質送達剤。
項５．　項１～３のいずれか１項に記載のペプチドをベクターに含む、細胞質を標的とする物質導入剤。
項６．　項１～３のいずれか１項に記載のペプチドと目的物質が直接あるいはスペーサーを介して共有結合されてなる、細胞質を標的とする物質導入剤。
項７．　項１～３のいずれか１項に記載のペプチドと目的物質が直接、あるいは目的物質と相互作用する他分子を介して非共有結合的な複合体を形成してなる、細胞質を標的とする物質導入剤。
項８．　目的物質をベクターに内包する、項５に記載の細胞質を標的とする物質導入剤。
項９．　前記ペプチドがベクターの構成成分に直接又はスペーサーを介して結合されている、項５に記載の物質導入剤。
項１０．　前記ペプチドと前記ペプチドの標的細胞へ親和性を高める分子とのコンジュゲートを含む、項４，５，６又は７に記載の物質導入剤。
項１１．　前記ペプチドが目的物質とともにベクターに内包されている、項５、８又は９に記載の物質導入剤。
項１２．　前記ベクターが、リポソーム、リピッドマイクロスフェア、高分子ミセル、高分子中空キャリア、ナノゲル、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、合成ポリマー、自己集合型核酸由来ベクター、ウイルス外殻タンパク質由来ベクター又はナノ粒子である、項５、８又は９に記載の物質導入剤。
項１３．　ベクターの構成成分がコレステロールあるいはリン脂質であり、前記ベクターがコレステロールあるいはリン脂質と項１～３のいずれか１項に記載のペプチドを含む複合体を含む、項９に記載の物質導入剤。
項１４．　下記式（IA）
R1-(IWLTALX５FLGX６X1AAX７X2X3AX８QX4LSX９L-Y)n-R2   (IA)
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なってH又はAを示す。Ｘ３はE、L-2-aminoadipic acid (Aad) 、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示す。Ｘ４はQ、L-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸、2-アミノスベリン酸又はEを示す。Ｘ５～Ｘ９は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。
但しＸ１＝H、Ｘ２＝H、Ｘ３＝E、Ｘ４＝Q、かつ、Ｘ５～Ｘ９＝Kの場合を除く、並びに、
Ｘ４＝E、かつ、Ｘ５～Ｘ９＝Kのとき、Ｘ１とＸ２の一方または両方がAである。
　Ｒ１は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Ｒ２は水酸基（OH）、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Yは単結合またはスペーサーを示す。ｎは２，３，４，５，６，７，８，９または１０である。）
で表されるペプチド。
項１５．　下記式（IB）：
　Ｚ－（Ｒａ）ｍ　　　(IB) 
（式中、Ｚは分岐型の多価リンカーを示し、Ｒａは、同一または異なって、R1-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-Y-を示すか、Y-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-R2を示す。Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なってH又はAを示す。Ｘ３はE、L-2-aminoadipic acid (Aad) 、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示す。Ｘ４はQ、L-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸、2-アミノスベリン酸又はEを示す。Ｘ５～Ｘ９は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。
但しＸ１＝H、Ｘ２＝H、Ｘ３＝E、Ｘ４＝Q、かつ、Ｘ５～Ｘ９＝Kの場合を除く、並びに、
Ｘ４＝E、かつ、Ｘ５～Ｘ９＝Kのとき、Ｘ１とＸ２の一方または両方がAである。　Ｒ１は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Ｒ２は水酸基（OH）、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Yは単結合またはスペーサーを示す。ｍは２～８の整数である。）
　本発明のペプチドは、細胞表面と効果的に相互作用することにより、抗体などのタンパク質、核酸、医薬などの目的物質（細胞内導入分子）とともに、エンドソーム内に取り込まれる効果を奏する。
　本発明のペプチドは、エンドソーム内におけるpHの減少ならびにエンドソーム成熟化に伴う膜構成成分の変化に伴いエンドソーム膜の不安定化を誘起し、ペプチドとともにエンドソーム内に移行した抗体やセンサー分子、核酸、医薬などの目的物質の細胞質への放出を促進する効果を奏する。
　本発明のペプチドは、蛍光標識をはじめとした化学修飾を施したタンパク質やセンサー分子などの目的物質の細胞質内への送達を通して、当該目的物質の細胞内局在や挙動、また、細胞内環境の計測・制御を可能にする効果を奏する。
　本発明のペプチドは、抗体、核酸のようなサイズの大きな生理活性物質を細胞質内に送達する効果を奏する。
　本発明の第1の好ましい実施形態は、12位と16位のヒスチジン残基のアラニン置換である。
　特許文献2のL17Eは二つのヒスチジン(H)を含んでいる。ヒスチジンは細胞外のpHでは荷電せず、エンドソーム内のpHでは正に荷電すると考えられる。L17Eのエンドソーム膜選択的な傷害性は、ヒスチジンの正電荷により向上すると考えられたが、意外にもヒスチジン残基により低下することが分かった。このため、12位と16位のヒスチジン残基をアラニンで置換することでエンドソーム膜選択的な傷害性の向上を図った。
　2つのヒスチジン残基をアラニンで置換したHA/E1はL17Eに比べ高いヘリックス性を示し(図1)、高分子薬物モデルとしてのAlexa488-dextranのエンドソームからの放出活性は大きく向上した(図2)。
　さらに、21位をGlu(E)で置換したH12A/H16A/L17E/Q21E置換体（=HA/E2）は、酸性脂質膜存在下で高いヘリックス性を示し(図1)、HA/E1と同等のエンドソーム内包物放出活性を有していた(図2)。また、L17Eに比べて有意に高いエンドソーム内包物放出活性を有していた。
　12位、16位のヒスチジンをアラニン以外の親水性アミノ酸（グルタミン、セリン）に置換したH12Q/H16Q/L17E/Q21E、H12S/H16S/L17E/Q21Eの活性はL17Eに比べて劣るものであり、ヒスチジンの置換は、アラニンが望ましいと結論された。
　本発明の第2の好ましい実施形態は、17位(E)、21位(Q)の2-アミノアジピン酸(Aad)、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸への置換である。
　さらなるペプチドのヘリックス構造の安定化と膜親和性の向上を期待して、細胞膜に対してのエンドソーム膜の選択的不安定化に重要な役割を担うL17E中の17位のグルタミン酸(E)を、側鎖のメチレン鎖が一つ多い2-アミノアジピン酸(Aad)に置換した誘導体(L17Aad)を合成した。ヒスチジン残基が配列中に存在しているために、L17Aadのヘリックス含量自体はあまり向上しなかったが(図1)、図3に示すようにL17Eに比べて有意に高いエンドソーム内包物放出活性を示すことが明らかとなった。
　本発明の第3の好ましい実施形態は、12位と16位のヒスチジン残基をアラニン置換し、さらに17位のグルタミン酸残基の2-アミノアジピン酸(Aad) 2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸への置換である。
　第1及び第2の好ましい実施形態で得られた結果を基に、L17Eのヒスチジンをアラニンに置換すると共に17位のグルタミン酸をアミノアジピン酸に置換したペプチドHAadを合成した。HAadは図1に示すように酸性脂質膜存在下に高いヘリックス性を示すことが明らかとなり、図4ならびに実施例に示すようにL17Eに比べてエンドソームに取り込まれた薬物を格段に効果的に細胞質に放出する活性を有することが明らかとなった。
　本発明の第４の好ましい実施形態は、５個のLys(K)残基のArg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidへの置換である。
ペプチドのPOPC/POPG (3:1)リポソーム存在下でのCDスペクトル(左)とヘリックス含量(右)。ヘリックス含量はY H Chen et al, 1972の方法により、222 nmのモル楕円率([θ]222)をもとにHelicity (%)= -([θ]222+2340)/30300*100を用いて計算した。 細胞質へのモデル高分子薬物Alexa488-dextran (10 kDa)の放出が見られた細胞(%). Cells; HeLa, peptides; 40 μM, Alexa488-dextran (10kDa); 200 μg/mL, treatment; 1hr in α-MEM(-). Results are presented as means ±SE (n=3). ***; p<0.001, ****; p<0.0001, n.s.; not significantly different (One-way ANOVA followed by Tukey-Kramer honestly significant difference test (post hoc test)) 細胞質へのモデル高分子薬物Alexa488-dextran (10 kDa)の放出が見られた細胞(%). Cells; HeLa, peptides; 40 μM, Alexa488-dextran (10kDa); 200 μg/mL, treatment; 1hr in α-MEM(-). Results are presented as means ±SE (n=3). **; p<0.01 (Student’s t-test) 細胞質へのモデル高分子薬物Alexa488-dextran (10 kDa)の放出が見られた細胞(%). HAad、HA/E2、L17AadはL17Eに比べてより高いエンドソーム内容物放出活性を有していた．Cells; HeLa, peptides; 40 μM, Alexa488-dextran (10kDa); 200 μg/mL, treatment; 1hr in α-MEM(-). Results are presented as means ±SE (n=3). *; p<0.05, **; p<0.01, ***; p<0.001 (One-way ANOVA followed by Tukey-Kramer honestly significant difference test (post hoc test)) デキストラン(10 kDa)の細胞内放出効率比較 (1) デキストラン(10 kDa)の細胞内放出効率比較 (2) ヒト免疫グロブリン(IgG、～160 kDa)の細胞内放出効率比較 (1) ヒト免疫グロブリン(IgG、～160 kDa)の細胞内放出効率比較 (2) ヒト免疫グロブリン(IgG、～160 kDa)の細胞内放出効率比較 (3) 毒素タンパク質saporinの細胞内送達による殺細胞アッセイ Creタンパク質の細胞内送達による遺伝子組換えアッセイ ペプチド処理におけるミトコンドリアに対する傷害性 NLS-EGFPの核集積。核局在化シグナル(NLS)と緑色蛍光タンパク質(EGFP)との融合タンパク質(細胞内に移行したタンパク質を核に集積させることで内在化を確認):HAadの高いエンドソーム内包物放出活性をこの系でも確認 血清存在下ペプチド処理24時間後の細胞生存率の評価 実施例１６で得られたペプチドによるAlexa488-dextran (10 kDa)の細胞質への放出活性
　本発明のペプチドは、特許文献２に記載の以下のL17Eの誘導体である。
L17E:   IWLTALX５FLGX６HAAX７HEAX８QQLSX９L-amide（配列番号1）
(式中、X５～X９はLys(K)である。)
　具体的には、本発明のペプチドは、Lycotoxin 1のX１に対応する12位のH(His)、X2に対応する16位のH(His)、X3に対応する１７位のE(Glu)、X4に対応する２１位のQ(Gln)の少なくとも１種を置換したペプチドである。12位と16位のH(His)はA(Ala)に置換されてもよく、17位のE(Glu)と21位のQ(Gln)はX (L-2-aminoadipic acid, Aad、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸)に置換されてもよい。また、５個のLys(K)残基はArg（R）、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acid残基で置換されてもよい。
　本発明の一般式（Ｉ）のペプチドは、以下の17種のペプチド(I-1)～(I-17)を含む。
R１-IWLTALX５FLGX６X１AAX７X２X３AX８QX４LSX９L-R２　　　（Ｉ）
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７HEAX８QQLSX９L-R２　　　（I-1）
R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７AEAX８QQLSX９L-R２　　　（I-2）
R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７HXAX８QQLSX９L-R２　　　（I-3）
R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７HEAX８QXLSX９L-R２　　　（I-4）
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AEAX８QQLSX９L-R２　　　（I-5）
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AEAX８QELSX９L-R２　　　（I-6）
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７HXAX８QQLSX９L-R２　　　（I-7）
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７HEAX８QXLSX９L-R２　　　（I-8）
R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７AXAX８QQLSX９L-R２　　　（I-9）
R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７AEAX８QXLSX９L-R２　　　（I-10）
R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７HXAX８QXLSX９L-R２　　　（I-11）
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AXAX８QQLSX９L-R２　　　（I-12）
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AXAX８QELSX９L-R２　　　（I-13）
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AEAX８QXLSX９L-R２　　　（I-14）
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７HXAX８QXLSX９L-R２　　　（I-15）
R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７AXAX８QXLSX９L-R２　　　（I-16）
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AXAX８QXLSX９L-R２　　　（I-17）
（式中、Ｘ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３ 、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｒ１、Ｒ２は前記に定義される通りである。）
　本発明の好ましいペプチドは、以下の5種のペプチドである。
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AEAX８QELSX９L-R２　(I-6)
R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７HXAX８QQLSX９L-R２　(I-3)
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AXAX８QXLSX９L-R２ 　(I-17)
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AEAX８QQLSX９L-R２ (I-5)
R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７HXAX８QXLSX９L-R２　（I-11）
　［式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９は、前記に定義されるとおりである。］
　本発明のさらに好ましいペプチドは、以下の3種のペプチドである。
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AEAX８QELSX９L-R２　(I-6)
R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７HXAX８QQLSX９L-R２　(I-3)
R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AXAX８QXLSX９L-R２ 　(I-17)
　［式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９は、前記に定義されるとおりである。］
　本発明の特に好ましいペプチドを以下に示す。
HA/E2:  IWLTALX５FLGX６AAAX７AEAX８QELSX９L-amide
L17Aad:  IWLTALX５FLGX６HAAX７HXAX８QQLSX９L-amide
HAad:   IWLTALX５FLGX６AAAX７AXAX８QXLSX９L-amide 
HA/E1:  IWLTALX５FLGX６AAAX７AEAX８QQLSX９L-amide
L17Aad /Q21Aad:  IWLTALX５FLGX６HAAX７HXAX８QXLSX９L-amide
[X=L-2-aminoadipic acid (Aad)、X５～X９＝Lys(K)]
HAad-homoR:   IWLTALX５FLGX６AAAX７AXAX８QXLSX９L-amide 
[X=L-2-aminoadipic acid (Aad)、X５～X９＝ホモアルギニン]
　本発明の最も好ましいペプチドを以下に示す。
HA/E2:  IWLTALX５FLGX６AAAX７AEAX８QELSX９L-amide
L17Aad:  IWLTALX５FLGX６HAAX７HXAX８QQLSX９L-amide
HAad:   IWLTALX５FLGX６AAAX７AXAX８QXLSX９L-amide 
[X=L-2-aminoadipic acid (Aad)、X５～X９＝Lys(K)]
HAad-homoR:   IWLTALX５FLGX６AAAX７AXAX８QXLSX９L-amide 
[X=L-2-aminoadipic acid (Aad)、X５～X９＝ホモアルギニン]
　１文字記号で表される本発明のペプチドの各アミノ酸はＬ型アミノ酸でもよく、Ｄ型アミノ酸でもよい。本発明のペプチドがＤ型アミノ酸を含む場合、Ｄ型アミノ酸の数は１個でも２個以上でもよいが、好ましくは全てのアミノ酸がＬ型アミノ酸であるか、全てのアミノ酸がＤ型アミノ酸である。なお、G(Gly)は不斉炭素を有しないので、本明細書においてL型アミノ酸として扱う。
　本発明のペプチドはエンドソームから細胞質に目的物質を高効率で放出させることができる。
　Ｒ１が水素原子のとき、Ｎ末端はアミノ基（ＮＨ２）であり、Ｒ１がアルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基のときＮ末端は、各々モノアルキルアミノ、アシルアミノ、或いはアルコキシカルボニルアミノ、アラルキルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノなどのウレタンになる。
　本発明のペプチドのＮ末端は２個のアルキル基で置換されたジアルキルアミノ基であってもよい。
　Ｒ２が水酸基（OH）のときＣ末端はカルボキシル基（COOH）であり、Ｒ２がアミノ基(NH2)のとき、Ｃ末端はアミド基(CONH2)になる。
　好ましいＲ１は、水素原子（H）、アルキル基、アルコキシカルボニル基又はアシル基であり、より好ましくは水素原子である。
　好ましいＲ２は、水酸基（OH）、アルコキシ基又はアミノ基(NH2)である。
　アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ-プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシルなどの直鎖又は分岐を有する炭素数１～６のアルキル基が挙げられる。
　モノアルキルアミノ基としては、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ-プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ｎ-ブチルアミノ、イソブチルアミノ、ｓｅｃ－ブチルアミノ、ｔｅｒｔ－ブチルアミノ、ペンチルアミノ、へキシルアミノなどの直鎖又は分岐を有する炭素数１～６のアルキル基で置換されたアミノ基が挙げられる。
　ジアルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジｎ-プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジｎ－ブチルアミノ、ジイソブチルアミノ、ジｓｅｃ－ブチルアミノ、ジｔｅｒｔ－ブチルアミノ、ジペンチルアミノ、ジヘキシルアミノなどの直鎖又は分岐を有する炭素数１～６のアルキル基でジ置換されたアミノ基が挙げられる。
　アシル基としては、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、イソステアロイル、オレオイル、リノロイルなどの炭素数２～２２、好ましくは２～１８の直鎖又は分岐を有するアシル基が挙げられる。また、1-ピレンアセチル、1-ピレンブチリルなどのように芳香族基を含むアシル基であってもよい。
　アルコキシカルボニル基としては、コレステリルオキシカルボニル基、tert-ブチルオキシカルボニル基、フィトステリルオキシカルボニル基、ステアリルオキシカルボニル基、パルミチルオキシカルボニル基、２－オクチルドデシルオキシカルボニル基、ベヘニルオキシカルボニル基などが挙げられる。
　アラルキルオキシカルボニル基としては、ベンジルオキシカルボニル基、フェネチルオキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基、アントリルメチルオキシカルボニル基、ビフェニリルメチルオキシカルボニル基、テトラヒドロナフチルメチルオキシカルボニル基、クロマニルメチルオキシカルボニル基、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルメチルオキシカルボニル基、インダニルメチルオキシカルボニル基及びフェナントリルメチルオキシカルボニル基などが挙げられる。
　アリールオキシカルボニル基としては、フルオレニルオキシカルボニル基、フェニルオキシカルボニル基、ナフチルオキシカルボニル基、アントリルオキシカルボニル基、ビフェニリルオキシカルボニル基、テトラヒドロナフチルオキシカルボニル基、クロマニルオキシカルボニル基、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルオキシカルボニル基、インダニルオキシカルボニル基及びフェナントリルオキシカルボニル基などが挙げられる。
　モノアリールアミノ基としては、フェニルアミノ、ナフチルアミノ、アントリルアミノ、ビフェニリルアミノ、テトラヒドロナフチルアミノ、クロマニルアミノ、フルオレニルアミノ、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルアミノ、インダニルアミノ及びフェナントリルアミノが挙げられる。
　モノシクロアルキルアミノとしては、シクロプロピルアミノ、シクロブチルアミノ、シクロペンチルアミノ、シクロヘキシルアミノ、シクロへプチルアミノ、シクロオクチルアミノなどの炭素数３～８のシクロアルキルアミノが挙げられる。
　アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基又はアリールオキシカルボニル基は、本発明のペプチドと直接結合してもよいが、PEG(ポリエチレングリコール)、アミド基(-CONH-、-NHCO-)、エステル基（-COO-,-O-CO-）、エーテル基(-O-)、アミノ基(-NH-)、アルキレン（メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレンなど）、アミノ酸(例えば天然の２０種のアミノ酸)などの適当なスペーサーを介して本発明のペプチドと結合してもよい。例えば、コレステリル基、あるいはリン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）がスペーサーを介して本発明のペプチドに結合され、その結合体がリポソームなどのベクターの構成成分を構成してもよい。
　Ｒ２が水酸基のとき、Ｃ末端はＣＯＯＨであり、Ｒ２がアミノ基のときＣ末端はＣＯＮＨ２になり、Ｒ２がアルコキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシのとき、Ｃ末端は対応するエステルになる。Ｒ２がモノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基のとき、Ｃ末端は対応するアミドになる。
　アルコキシ基としては、コレステリルオキシ基、フィトステリルオキシ基、ステアリルオキシ基、パルミチルオキシ基、２－オクチルドデシルオキシ基、ベヘニルオキシ基などが挙げられる。
　アラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ基、フェネチルオキシ基、フルオレニルメチルオキシ基、アントリルメチルオキシ基、ビフェニリルメチルオキシ基、テトラヒドロナフチルメチルオキシ基、クロマニルメチルオキシ基、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルメチルオキシ基、インダニルメチルオキシ基及びフェナントリルメチルオキシ基などが挙げられる。
　アリールオキシ基としては、フルオレニルオキシ基、フェニルオキシ基、ナフチルオキシ基、アントリルオキシ基、ビフェニリルオキシ基、テトラヒドロナフチルオキシ基、クロマニルオキシ基、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルオキシ基、インダニルオキシ基及びフェナントリルオキシ基などが挙げられる。
　細胞質に送達する目的物質としては、生理活性物質、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、医薬、糖あるいはこれらの標識物質、また、合成高分子、リポソーム、有機／無機／半導体微粒子などが挙げられる。タンパク質、ペプチド、核酸、医薬、糖あるいはこれらの標識物質、合成高分子、リポソーム、有機／無機／半導体微粒子などの生理活性物質は、適当なスペーサーを介して、IWLTALX５FLGX６X１AAX７X２X３AX８QX４LSX９Lで表されるペプチド部分のN末端又はC末端に結合されていてもよい。また、生理活性物質は、IWLTALX５FLGX６X１AAX７X２X３AX８QX４LSX９Lで表されるペプチド部分のN末端又はC末端にスペーサーを介さずに直接結合されていてもよい。
　Ｒ１とＲ２の一方又は両方が目的物質である本発明のペプチドは、以下のものを含み得る：
(生理活性物質)-IWLTALX５FLGX６X１AAX７X２X３AX８QX４LSX９L-(生理活性物質)
(生理活性物質)-(スペーサー)-IWLTALX５FLGX６X１AAX７X２X３AX８QX４LSX９L-(スペーサー)- (生理活性物質)　
(生理活性物質)-(スペーサー)-IWLTALX５FLGX６X１AAX７X２X３AX８QX４LSX９L- (生理活性物質)　
(生理活性物質)-IWLTALX５FLGX６X１AAX７X２X３AX８QX４LSX９L-(スペーサー)- (生理活性物質)　
(生理活性物質) -(スペーサー)-IWLTALX５FLGX６X１AAX７X２X３AX８QX４LSX９L- R２ (R2≠目的物質)
R１-IWLTALX５FLGX６X１AAX７X２X３AX８QX４LSX９L-(スペーサー) -(生理活性物質) (R1≠目的物質)
(生理活性物質)-IWLTALX５FLGX６X１AAX７X２X３AX８QX４LSX９L- R２ (R2≠目的物質)
R１-IWLTALX５FLGX６X１AAX７X２X３AX８QX４LSX９L-(生理活性物質) (R1≠目的物質)
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３ 、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９は前記に定義される通りである。Ｒ１、Ｒ２は、目的物質以外の前記に定義されるものである。）
　タンパク質としては抗体、酵素、細胞情報伝達因子、転写因子、ＤＮＡあるいはＲＮＡ結合タンパク質、核・ミトコンドリア・細胞骨格などの細胞内器官構成タンパク質、ユビキチンや熱ショックタンパク質などのユビキチン-プロテアソーム系関連タンパク質やカスパーゼなどのアポトーシス関連タンパク質、ｐ５３などの細胞周期調節タンパク質、レクチンなどが挙げられる。また、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓ９などの遺伝子切断・組み換え能を有するタンパク質も含まれる。抗体に関しては、免疫グロブリンに加え、その断片タンパク質やラクダ科動物由来の一本鎖抗体も含まれる。これらの抗体の標的としては、キナーゼ類、ＨＩＦ-１などの転写因子類、微小管などの細胞骨格タンパク質類などが挙げられる。ペプチドとしては、細胞内タンパク質相互作用を調節するヘリックスペプチドや環状ペプチド、細胞内タンパク質の断片ペプチド、ＤＮＡ／ＲＮＡ結合ペプチド、各種酵素基質・阻害剤、がんワクチン産生のための抗原ペプチドなどが挙げられる。医薬としては抗腫瘍剤、抗ウイルス剤などが挙げられ、糖としてはデキストラン、シアル酸などが挙げられ、核酸としてはＤＮＡ、ＲＮＡ（好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡなど）、ＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーならびにこれらの化学修飾体が挙げられる。また、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡなどのタンパク質と核酸の複合体も生理活性物質に含まれる。また、細胞内での生理活性や機能の向上のために上記の生理活性物質に必要に応じて化学修飾を施した誘導体を目的物質として細胞内に導入することも可能である。
　細胞内可視化・計測・相互作用解析のために上記のタンパク質や核酸などの生理活性物質を蛍光団、量子ドット、放射性同位元素、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、光架橋団等で修飾を行ったものや、細胞内ＮＭＲ測定などのための安定同位体標識タンパク質も目的物質として挙げられる。蛍光団としては、必要に応じて細胞内環境に応じて蛍光特性が変化する蛍光団で修飾することも可能である。
　細胞内に導入される目的物質は特に以上のものに限定される必要はなく、膜透過性を有するペプチド、各種トランスフェクション試薬など他の細胞導入剤と併用し、これらの細胞質内移行効率の更なる向上のために本発明を用いることも可能である。
　Ｒ１とＲ２がともに目的物質ではない本発明のペプチドは、目的物質と組み合わせて組成物、好ましくは医薬組成物として脊椎動物、好ましくはヒトを含む哺乳動物に投与してもよい。目的物質が本発明のペプチドに結合していない場合、目的物質はタンパク質、ペプチド、核酸、医薬、糖あるいはこれらの標識物質、合成高分子、リポソーム、有機／無機／半導体微粒子などから構成され、スペーサーを含まない。
　本発明のペプチドと目的物質を含む組成物または医薬組成物において、目的物質１００質量部に対し、本発明のペプチドを１～１００００質量部、好ましくは５～２００質量部、より好ましくは１０～２００質量部含む。
　本発明のペプチドは、目的物質に直接あるいは適当なスペーサーを介して共有結合的に結合してもよく、直接あるいは目的物質と相互作用する他分子を介して非共有結合的に結合して複合体を形成してもよい。さらに、エンドソームに内包されるベクター(細胞導入剤)に含ませてもよい。例えば、本発明のペプチドは、ベクターの内部に含まれていてもよく、ベクターの構成成分に直接又はスペーサーを介して結合されていてもよい。あるいは、本発明のペプチドがベクターの構成成分と相互作用する他分子を介して非共有結合的に複合体を形成することで、ベクターの表面に含ませてもよい。さらにベクターの内部に目的物質とともに本発明のペプチドを内包させて、目的物質がエンドソームに取り込まれた後に、エンドソームから細胞質への移行を促進することができる。本発明のペプチドと目的物質が非共有結合的に結合した複合体は、本発明の組成物または医薬組成物に包含される。
　本発明のペプチドは、二量体あるいは多量体の形態であってもよい。二量体あるいは多量体は、例えば以下の式（IA）で表わされる。
R1-(IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-Y)n-R2   (IA)
（式中、R1、R2、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9は、前記に定義される通りである。Yは単結合またはスペーサーを示す。ｎは２，３，４，５，６，７，８，９または１０であり、好ましくは２～６、より好ましくは２～４の整数である。）
　本明細書において、スペーサーとしては、エステル結合（-CO-O-、-O-CO-）、エーテル結合（-O-）、アミド結合（NHCO, CONH）、糖鎖リンカー、ポリエチレングリコールリンカー、ペプチドリンカーなどが挙げられる。ペプチドリンカーとしては、タンパク質を構成する天然の２０種のアミノ酸の少なくとも１種を含むリンカーが挙げられ、ペプチドリンカーのアミノ酸の数としては、１～２０個、１～１５個、１～１２個、１～１０個、１～８個、１～６個あるいは１～４個が挙げられるがこれらに限定されない。ペプチドリンカーとして、アルギニンダイマー、アルギニントリマー、アルギニンテトラマー、リジンダイマー、リジントリマー、リジンテトラマー、グリシンダイマー、グリシントリマー、グリシンテトラマー、グリシンペンタマー、グリシンヘキサマー、アラニン-アラニン-チロシン（AAY）、イソロイシン-ロイシン-アラニン（ILA）、アルギニン-バリン-リジン-アルギニン（RVKR）等が例示される。スペーサーは２価であっても多価であってもよい。　　　
　本発明のペプチドが多量体の場合、デンドリマーのような分岐型の多価リンカー、あるいは金属錯体等で連結されたものであってもよい。デンドリマーは、例えば以下の式（IB）で表わされる。
　Ｚ－（Ｒａ）ｍ　　　(IB)
（式中、Ｚは分岐型の多価リンカーを示し、Ｒａは、同一または異なって、R1-IWLTALX５FLGX６X1AAX７X2X3AX８QX4LSX9L-Y-を示すか、Y-IWLTALX５FLGX６X1AAX７X2X3AX８QX4LSX9L-R2を示す。R1、R2、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、Yは、前記に定義される通りである。ｍは３、４又は５である。）
　Ｚで表わされる分岐型の多価リンカーとしては、ジエチレントリアミン、スペルミン、スペルミジン、トリエタノールアミン、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、ペンタエリスリトール、アジド-プロピル(アルキル)アミン、リジン、オルニチン、アスパラギン酸、グルタミン酸、多官能性ペプチド（リジン、オルニチン、アスパラギン酸又はグルタミン酸を含むジペプチド、トリペプチド又はテトラペプチド）、有機多価アミノ化合物（例えば、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、トリス（エチレンアミン）アンモニア、ポリ（プロピレンイミン）（Ａｓｔｒａｍｏｌ（商標））など）が挙げられる。ｍは、２～８の整数、好ましくは２～６の整数、さらに好ましくは２～４の整数、例えば３又は４である。例えば、IWLTALX５FLGX６X１AAX７X２X３AX８QX４LSX９Lで表わされるペプチドのＮ末端（あるいはＣ末端）同士を連結したダイマーは、本発明のデンドリマーに包含される。さらに、前記ペプチドのN末端側同士をつないでダイマーとしたもの」と「Ｃ末端同士をつないでダイマーとしたもの」を更に連結した４量体も本発明のデンドリマーに包含される。
　本発明のペプチドを目的物質と共存させると、目的物質のエンドソームから細胞質への移行を促進することができるが、特定の細胞へ導入するための特異性はない。したがって、本発明のペプチドと目的物質をＤＤＳにより標的細胞に供給するか、細胞特異的なベクターと本発明のペプチドを組み合わせることにより、特定細胞の細胞質に目的物質を導入することができる。細胞特異的なベクターとして、細胞特異的な抗体、リガンドなどが表面に導入されたベクターが例示される。ベクターとしてはリポソーム（カチオニックリポソーム、アニオニックリポソーム）、リピッドマイクロスフェア、リポフェクタミン、親水性セグメントと内核形成セグメント（疎水性セグメント、カチオン性セグメント、金属錯体形成セグメント等）を含むブロックコポリマーから構成される高分子ミセル、高分子中空キャリア（特許第5142313号に記載のポリサルコシン誘導体を含む薬物担体、WO2004/105799に記載の非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセルなど）、ナノゲル、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、合成ポリマーやナノ粒子などが挙げられる。自己集合型核酸由来ベクター、ウイルス外殻タンパク質由来ベクターであってもよい。例えばベクターがリポソームの場合には、Ｒ１として炭素数１０以上のアシル基を使用するか、Ｎ末端にコレステリルオキシカルボニル基やＣ末端にコレステリル基などの脂溶性の大きい基、あるいはホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質を必要に応じて適当なスペーサーを介してエステル結合又はアミド結合で本発明のペプチドと結合させることで、本発明のペプチドを含むリポソームを得ることができる。スペーサーとしては、PEG(ポリエチレングリコール)、アミド基(-CONH-、-NHCO-)、エステル基（-COO-,-O-CO-）、エーテル基(-O-)、アミノ基(-NH-)、アルキレン（メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレンなど）、アミノ酸などが挙げられる。アミノ酸は側鎖のCOOHまたはNH2基を介して結合してもよい。ウイルス（外殻タンパク質）由来ベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が挙げられる。自己集合型核酸由来ベクターとしては、例えばWO 2012144560 A1、WO2016/006628に記載のものが挙げられる。「本発明のペプチドの標的細胞へ親和性を高める分子」と本発明のペプチドとのコンジュゲ－ションにより、当該細胞のエンドソーム内に本発明のペプチドをより効率的／効果的に移行・蓄積させることで、エンドソーム膜の不安定化効果と目的物質の細胞質への送達効果を高めることも可能である。「本発明のペプチドの標的細胞への親和性を高める分子」としては、細胞の表面に提示される受容体（葉酸受容体、トランスフェリン受容体、グルコース等の糖類の受容体、上皮細胞増殖因子（EGF）や血管内皮増殖因子（VEGF）などの増殖因子受容体等）に結合するリガンド、あるいは脂肪酸、疎水性ペプチド、ポリアルギニンなどの塩基性ペプチド、糖鎖などがある。
　さらに、本発明のペプチドと目的物質は、直接、あるいは目的物質と相互作用する他分子を介して非共有結合的な複合体を形成することができる。このような非共有結合的な複合体としては、
(a)［抗体と親和性を示すペプチド（ファージディスプレイ系などを用いて選択）と本発明のペプチドのコンジュゲート］と抗体との複合体
(b)核酸と本発明のペプチドとの非共有結合的な複合体
(c)［本発明のペプチドと核酸相互作用分子とのコンジュゲート］と核酸との非共有結合的な複合体
等が挙げられる。
　目的物質を細胞に送達すべき生物種は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。
　以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
１．ペプチドの構造及び製造
L17E (L17):         IWLTALX５FLGX６HAAX７HEAX８QQLSX９L-amide（配列番号１、R1=H, R2=NH2）
L17E/Q21E (L17Q21): IWLTALX５FLGX６HAAX７HEAX８QELSX９L-amide（配列番号２、R1=H, R2=NH2）
HA/E2:  R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AEAX８QELSX９L-R２　(I-6)
L17Aad:  R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７HXAX８QQLSX９L-R２　(I-3)
HAad:   R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AXAX８QXLSX９L-R２ 　(I-17)
HA/E1:  R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AEAX８QQLSX９L-R２ (I-5)
L17Aad /Q21Aad:  R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７HXAX８QXLSX９L-R２　（I-11）
(式中、R１はHである。R2はNH2である。XはL-2-aminoadipic acid (Aad)である。X５～X９はLys(K)である。)
　特許文献２の実施例に記載のL17Eの配列中の12位、16位、17位、21位のアミノ酸を置換することにより、エンドソーム膜選択的に不安定化するペプチドを得た。ペプチドは、固相合成により得た。得られたペプチドの物性値を以下に示す。
L17E (L17)の物性値(MALDI-TOFMS): 理論値(M+H)+ 2860.6; 実測値 2860.5
L17E/Q21Eの物性値: 理論値(M+H)+ 2861.4; 実測値 2860.4
HA/E2の物性値: 理論値(M+H)+ 2727.6; 実測値 2727.4
L17Aadの物性値: 理論値(M+H)+ 2873.7; 実測値 2873.5
HAadの物性値: 理論値(M+H)+ 2755.7; 実測値 2755.6
HA/E1の物性値: 理論値(M+H)+ 2726.6; 実測値 2726.2
L17Aad /Q21Aadの物性値: 理論値(M+H)+ 2887.7; 実測値 2886.7
実施例２．ヘリックス含量
　実施例１で得たペプチド（L17E、L17E/Q21E、L17Aad、HA/E1、HA/E2、HAad）について、Y H Chen et al, 1972の方法により、222 nmのモル楕円率([θ]222)をもとにHelicity (%)= -([θ]222+2340)/30300*100を用いて、POPC/POPG (3:1)リポソーム存在下でのヘリックス含量を計算し、さらにCDスペクトルを測定した。図１にCDスペクトル(左)とヘリックス含量(右)を示す。
実施例３．高分子薬物モデル(10 kDa dextran)の細胞内導入(1)
　実施例１で得られたペプチド（L17E、L17E/Q21E、HA/E1、HA/E2） (40 μM)存在下又は非存在下（コントロール、no peptide）、HeLa細胞とAlexa488-dextran (Molecular Probes、10 kDa) (200 μg/mL)をα-MEM(-)中1 h処理、細胞を洗浄し、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図２に示す。
　本発明のペプチド存在下ではAlexa488-dextran (10 kDa) の有意な細胞質への流出・拡散が見られた。
実施例４．高分子薬物モデル(10 kDa dextran)の細胞内導入(2)
　実施例１で得られたペプチド（L17E、L17Aad）(40 μM)存在下又は非存在下（コントロール、no peptide）、HeLa細胞とAlexa488-dextran (Molecular Probes、10 kDa) (200 μg/mL)をα-MEM(-)中1 h処理、細胞を洗浄し、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図３に示す。
　本発明のペプチド（L17Aad）存在下では、公知のL17Eに対しAlexa488-dextran (10 kDa) の有意な細胞質への流出・拡散が見られた。
実施例５．高分子薬物モデル(10 kDa dextran)の細胞内導入(3)
　実施例１で得られたペプチド（HAad、HA/E2、L17Aad、L17E）(40 μM)存在下又は非存在下（コントロール、no peptide）、HeLa細胞とAlexa488-dextran (Molecular Probes、10 kDa) (200 μg/mL)をα-MEM(-)中1 h処理、細胞を洗浄し、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図４に示す。
　本発明のペプチド（HAad、HA/E2、L17Aad）存在下では、公知のL17Eに対しAlexa488-dextran (10 kDa) の有意な細胞質への流出・拡散が見られた。
実施例６．デキストラン(10 kDa)の細胞内放出効率比較 (1) 
　HAad (40 μM)存在下にHeLa細胞を高分子薬物モデルとしてのAlexa488-dextran (10 kDa)(200 μg/mL)とα-MEM(-)培地中で1 hインキュベーションすることにより、約75％の細胞内（サイトゾル）へのAlexa488-dextranの放出が見られた。一方、L17Eを用いた際には約50%であった。
　細胞内に放出されたAlexa488-dextranのシグナルを50%の細胞に対して認めるために必要なペプチド濃度は、HAadが20 μMであるのに対し、L17Eは40 μMであった(EC50が1/2)。
実施例７．デキストラン(10 kDa)の細胞内放出効率比較 (2)
　HeLa細胞に較べて細胞内へのデキストランの放出が難しいNIH3T3細胞において、実施例６と同様に、HAad、HA/E2、L17E (各40 μM)存在下に細胞とデキストラン(10 kDa)をDMEM(-)培地中で1 hインキュベーションしたところ、全体のそれぞれ約35%、25％、17％の細胞で細胞内へのデキストランの放出が認められた(HAad処理による細胞内放出はL17Eによるものの2倍)。
実施例８．ヒト免疫グロブリン(IgG、～160 kDa)の細胞内放出効率比較 (1)
　実施例６と同様に、HAad、HA/E2、L17E (各40 μM)存在下に細胞とAlexa488で蛍光標識したヒト免疫グロブリン(IgG、～160 kDa)(500 μg/mL)をα-MEM(-)培地中で1 hインキュベーションしたところ、全体のそれぞれ約70%、45％、35％の細胞で細胞内へのヒト免疫グロブリンの放出が認められた(図７、HAad処理による細胞内放出はL17Eによるものの2倍)。
実施例９．ヒト免疫グロブリン(IgG、～160 kDa)の細胞内放出効率比較 (2)
　実施例８で、HAadが高いエンドソーム内包IgGの細胞内への放出能を有することが確認された。これを基に、投与するIgG量の低減可能かに関して検討した。
　HAad、L17E (各40 μM)存在下に細胞とAlexa488で蛍光標識したヒト免疫グロブリン(IgG、～160 kDa)(50 μg/mL:実施例８の1/10量)をα-MEM(-)培地中で1 hインキュベーションしたところ、HAadで処理した細胞では、全体の約50%の細胞で細胞内へのヒト免疫グロブリンの放出が認められたのに対し、L17Eで処理した場合は約10%の細胞でしかこれが認められなかった(図８，HAad処理による細胞内放出はL17Eによるものの5倍。また、50%の細胞内でIgGの放出が認められるのに必要なIgG量は1/10)。
実施例１０．ヒト免疫グロブリン(IgG、～160 kDa)の細胞内放出効率比較 (3)
　実施例８及び９で、HAadがより低いIgG投与量でも高いエンドソーム内包IgGの細胞内への放出能を有することが確認された。これを基に、投与するペプチド量が低減可能かに関して検討した。
　HAad、L17E (各20 μM:実施例８及び９の1/2量)存在下に細胞とAlexa488で蛍光標識したヒト免疫グロブリン(IgG、～160 kDa)(500 μg/mL:実施例８と同量)をα-MEM(-)培地中で1 hインキュベーションしたところ、HAad 20 μMで処理した細胞では、全体の約37%の細胞で細胞内へのヒト免疫グロブリンの放出が認められたのに対し、L17Eで処理した場合は約15%の細胞でしかこれが認められなかった(図９，低濃度におけるHAad処理による細胞内放出はL17Eによるものの2.5倍。また、細胞内に放出されたヒト免疫グロブリンのシグナルを35%の細胞に対して認めるために必要なペプチド濃度は、L17Eが40 μMであるのに対し、HAadはその半分の20 μMである)。
実施例１１．毒素タンパク質saporinの細胞内送達による殺細胞アッセイ
　細胞内への送達によりがん細胞を死滅される細胞毒としてsaporinが知られている。HAad、HA/E2、L17E (各40 μM)存在下にRAW264.7細胞とsaporin (10 μg/mL) をα-MEM(-)培地中で1 hインキュベーションし、その後、細胞を洗浄し、培地をDMEM(+)に交換し更に6 hインキュベーションした。WST-8 assayで細胞生存率を検定した(図１０)。この結果、HAadおよびHA/E2存在下でsaporinを処理した細胞の生存率はそれぞれ4、6％とL17E存在下での生存率 (16%)と比較して有意に減少し、またHAad存在下の生存率は、L17E存在下の1/4であった。
実施例１２． Creタンパク質の細胞内送達による遺伝子組換えアッセイ
　特許文献２の実施例と同様にして作製したloxP-DsRed-loxP-EGFPをコードするプラスミドをトランスフェクションしたHeLa細胞に、His-tag融合Cre （Cre-His6） (10 μM)をHAad、HA/E2、L17E (各40 μM)存在下、α-MEM(-)中1 hインキュベーションした。この系は、Creタンパク質が細胞内に放出されることで遺伝子組換えが誘起されるとEGFPが発現するように設計してある。細胞を洗浄し、α-MEM(+)で24 h培養後、共焦点顕微鏡観察した(図１１)。ペプチド処理細胞群では、コントロール細胞群 (Cre-His6のみ投与)に比べ有意にEGFP発現細胞の割合が増加した。HAad、HA/E2、L17E処理時のGFP発現細胞の割合はそれぞれ41%、36%、30%であった。放出ペプチド非投与時のEGFP発現効率は9%であったことを考慮すると、ペプチド投与時には遺伝子組換えが、非投与時に較べ32、27、22%上昇したと考えることが可能であり、HAad投与時にはL17E投与時にくらべ有意に遺伝子組換えが促進された。
実施例１３．ペプチド処理におけるミトコンドリアに対する傷害性
　ミトコンドリア膜は細胞膜に比べより酸性脂質に富んでいると言われていることから、上記のペプチドのミトコンドリア膜への影響をJC-1アッセイにより調べた。JC-1試薬はミトコンドリア膜が健常に保たれ、膜電位が保たれている場合は赤色(J-aggregate)の、ミトコンドリア膜が傷害され、膜電位が正常に保たれていない場合は緑色(J-monomer)の蛍光を発する。HeLa細胞をα-MEM(-)中、HAad、HA/E2、L17E (40 μM)と1 hインキュベーションした後、JC-1アッセイを行い、フローサイトメトリーにより赤色蛍光を発する細胞の割合を検定した。ATP合成を阻害する脱共役剤(carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone, FCCP) [α-MEM(-)中、40μM、1 hインキュベーション]、カチオン性の遺伝子のトランスフェクション試薬であるリポフェクタミン LTXとpCI vector (空ベクター)との複合体（標準プロトコルに従いα-MEM(+)中、一夜インキュベーション）の影響に関しても同様に検討した(図１２)。
　結果として、FCCP処理の細胞ではほとんどの細胞が緑色の蛍光を発するように変化した。一方、L17E処理細胞では赤色を示す細胞の割合がペプチド未処理の場合と比べて僅かに低下したのに対して、HA/E2、HAad処理した場合には未処理の場合と有意な差が見られなかった。したがって、これらのペプチドのミトコンドリア膜に対しての影響はほとんど無く、HA/E2、HAadの傷害性はL17Eよりも一層低いことが示唆された。汎用されているリポフェクタミンには若干のミトコンドリア傷害活性を有するが、本発明のペプチドHA/E2、HAadにはミトコンドリア傷害性がみられないことが示された。
実施例１４. 核局在化シグナル融合緑色蛍光タンパク質 (NLS-EGFP) の核集積
　実施例６と同様に、HAad, L17E (各40 μM) 存在下に細胞とNLS-EGFP (10 μM) をα-MEM(－)培地中で1 hインキュベーションした。NLS-EGFPが活性を保持したまま細胞内に放出されていれば、NLSにより緑色の蛍光が核に局在する様子が観察される。結果として、全体のそれぞれ約84%、56％の細胞で核へのNLS-EGFPの局在が認められた (図１３)。HAadの高いエンドソーム内包物放出活性をこの系でも確認することができた。
実施例１５. 血清存在下ペプチド処理24時間後の細胞生存率の評価
　HAad, HA/E2, L17E (各10, 20, 40 μM) で細胞をα-MEM(＋)培地中で24 hインキュベーションした後の細胞生存率をWST-8 assayにより評価した (図１４)。どのペプチドのどの濃度においても24時間後の生存率はほぼ100%で、L17Eと同様に、HA/E2およびHAadに顕著な毒性は見られなかった。
実施例１６
１）H-IWLTALZFLGZAAAZAXAZQXLSZL-amide [HAad-homoR] (Z=homoarginine、X= L-2-aminoadipic acid)の調製
　Francesco L. Brancia., et al., Anal. Chem., 2004, 76 (10), 2748-2755に従って標記化合物を合成した。ヘミ硫酸O-メチルイソ尿素(1.23 g)の水溶液にアンモニア水を添加しpH 11.0とする。HAad[H-IWLTALKFLGKAAAKAXAKQXLSKL-amide]の水溶液(1.3 mM, 38 μL)をこれに加え、ヘミ硫酸O-メチルイソ尿素、1cの最終濃度がそれぞれ0.5M、5 μM、総液量10 mLとする。室温一夜反応。1% トリフルオロ酢酸水溶液を同体積加えて反応停止後、凍結乾燥、逆相HPLCで精製し、質量分析(MALDI TOFMS)で目的物が得られたことを確認した[実測値2965.8; 理論値 2965.8 (M+H)+]。
２）H-IWLTALZFLGZAAAZAXAZQXLSZL-amideのAlexa488-dextran (10 kDa)の細胞質への放出活性
　HeLa細胞とAlexa488-dextran (Molecular Probes、10 kDa) (200 μg/mL)とHAad、あるいはHAad-homoR (20 μM)をα-MEM(-)中1 h処理、細胞を洗浄し、共焦点顕微鏡で観察した。HAad処理細胞では約40%の細胞で細胞質へのAlexa488-dextranの放出が見られたのに対し、HAad-homoR処理細胞では75%の細胞でこれが観察された。
　５個のLys(K)のアミノ基をグアニジノ基に変換してホモアルギニンにすることにより、細胞内に導入されたタンパク質の細胞質への放出活性が顕著に増大することが明らかになった。
１．生細胞へのタンパク質・生理活性物質導入試薬・導入キット
２．分子細胞生物学・医学分野における基礎研究（細胞内可視化、計測、相互作用解析、細胞活性制御等）
３．創薬分野における抗体医薬品・バイオ医薬品等の細胞内活性評価のための基礎研究（バイオ医薬品設計支援手法）
４．抗体医薬品・核酸医薬品・バイオ医薬品のex vivo・in vivo細胞内送達

Claims (15)

  1. 下記式（Ｉ）：
    R１-IWLTALX５FLGX６X１AAX７X２X３AX８QX４LSX９L-R２　　　（Ｉ）
    （式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なってH又はAを示す。Ｘ３はE、L-2-aminoadipic acid (Aad) 、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示す。Ｘ４はQ、L-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸、2-アミノスベリン酸又はEを示す。Ｘ５～Ｘ９は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。
    但しＸ１＝H、Ｘ２＝H、Ｘ３＝E　、Ｘ４＝Q、かつ、Ｘ５～Ｘ９＝Kの場合を除く、並びに、
    Ｘ４＝E、かつ、Ｘ５～Ｘ９＝Kのとき、Ｘ１とＸ２の一方または両方がAである。　Ｒ１は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Ｒ２は水酸基（OH）、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。）
    で表されるペプチド。
  2. 下記の（Ｉａ）～（Ｉｅ）のいずれかで表される請求項１に記載のペプチド。
    R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AEAX８QELSX９L-R２　(Ｉａ)
    R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７HXAX８QQLSX９L-R２　(Ｉｂ)
    R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AXAX８QXLSX９L-R２ 　(Ｉｃ)
    R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AEAX８QQLSX９L-R２ (Ｉｄ)
    R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７HXAX８QXLSX９L-R２　（Ｉｅ）
    （XはL-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示し、Ｒ１は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基又は目的物質を示す。Ｒ２は水酸基（OH）、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Ｘ５～Ｘ９は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。）
  3. 下記の（Ｉａ）～（Ｉｃ）のいずれかで表される請求項２に記載のペプチド。
    R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AEAX８QELSX９L-R２　(Ｉａ)
    R１-IWLTALX５FLGX６HAAX７HXAX８QQLSX９L-R２　(Ｉｂ)
    R１-IWLTALX５FLGX６AAAX７AXAX８QXLSX９L-R２ 　(Ｉｃ)
    （XはL-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示し、Ｒ１は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基又は目的物質を示す。Ｒ２は水酸基（OH）、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Ｘ５～Ｘ９は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。）
  4. 請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドからなる細胞質送達剤。
  5. 請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドをベクターに含む、細胞質を標的とする物質導入剤。
  6. 請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドと目的物質が直接あるいはスペーサーを介して共有結合されてなる、細胞質を標的とする物質導入剤。
  7. 請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドと目的物質が直接、あるいは目的物質と相互作用する他分子を介して非共有結合的な複合体を形成してなる、細胞質を標的とする物質導入剤。
  8. 目的物質をベクターに内包する、請求項５に記載の細胞質を標的とする物質導入剤。
  9. 前記ペプチドがベクターの構成成分に直接又はスペーサーを介して結合されている、請求項５に記載の物質導入剤。
  10. 前記ペプチドと前記ペプチドの標的細胞へ親和性を高める分子とのコンジュゲートを含む、請求項４，５，６又は７に記載の物質導入剤。
  11. 前記ペプチドが目的物質とともにベクターに内包されている、請求項５、８又は９に記載の物質導入剤。
  12. 前記ベクターが、リポソーム、リピッドマイクロスフェア、高分子ミセル、高分子中空キャリア、ナノゲル、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、合成ポリマー、自己集合型核酸由来ベクター、ウイルス外殻タンパク質由来ベクター又はナノ粒子である、請求項５、８又は９に記載の物質導入剤。
  13. ベクターの構成成分がコレステロールあるいはリン脂質であり、前記ベクターがコレステロールあるいはリン脂質と請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドを含む複合体を含む、請求項９に記載の物質導入剤。
  14. 下記式（IA）
    R1-(IWLTALX５FLGX６X1AAX７X2X3AX８QX4LSX９L-Y)n-R2   (IA)
    （式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なってH又はAを示す。Ｘ３はE、L-2-aminoadipic acid (Aad) 、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示す。Ｘ４はQ、L-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸、2-アミノスベリン酸又はEを示す。Ｘ５～Ｘ９は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。
    但しＸ１＝H、Ｘ２＝H、Ｘ３＝E　、Ｘ４＝Q、かつ、Ｘ５～Ｘ９＝Kの場合を除く、並びに、
    Ｘ４＝E、かつ、Ｘ５～Ｘ９＝Kのとき、Ｘ１とＸ２の一方または両方がAである。　Ｒ１は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Ｒ２は水酸基（OH）、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Yは単結合またはスペーサーを示す。ｎは２，３，４，５，６，７，８，９または１０である。）
    で表されるペプチド。
  15. 下記式（IB）：
    　Ｚ－（Ｒａ）ｍ　　　(IB)
    （式中、Ｚは分岐型の多価リンカーを示し、Ｒａは、同一または異なって、R1-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-Y-を示すか、Y-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-R2を示す。Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なってH又はAを示す。Ｘ３はE、L-2-aminoadipic acid (Aad) 、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示す。Ｘ４はQ、L-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸、2-アミノスベリン酸又はEを示す。Ｘ５～Ｘ９は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。
    但しＸ１＝H、Ｘ２＝H、Ｘ３＝E、Ｘ４＝Q、かつ、Ｘ５～Ｘ９＝Kの場合を除く、並びに、
    Ｘ４＝E、かつ、Ｘ５～Ｘ９＝Kのとき、Ｘ１とＸ２の一方または両方がAである。　Ｒ１は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Ｒ２は水酸基（OH）、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Yは単結合またはスペーサーを示す。ｍは２～８の整数である。）
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