JP7068711B2 - 細胞質送達ペプチド - Google Patents
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Description
R1-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-R2 (I)
(式中、X1及びX2は、同一又は異なってH又はAを示す。X3はE、L-2-aminoadipic acid (Aad) 、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示す。X4はQ、L-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸、2-アミノスベリン酸又はEを示す。X5~X9は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。
但しX1=H、X2=H、X3=E、X4=Q、かつ、X5~X9=Kの場合を除く、並びに、
X4=E、かつ、X5~X9=Kのとき、X1とX2の一方または両方がAである。
R1は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基又は目的物質を示す。R2は水酸基(OH)、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。)
で表されるペプチド。
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AEAX8QELSX9L-R2 (Ia)
R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7HXAX8QQLSX9L-R2 (Ib)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AXAX8QXLSX9L-R2 (Ic)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AEAX8QQLSX9L-R2 (Id)
R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7HXAX8QXLSX9L-R2 (Ie)
(XはL-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示し、R1は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基又は目的物質を示す。R2は水酸基(OH)、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。X5~X9は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AEAX8QELSX9L-R2 (Ia)
R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7HXAX8QQLSX9L-R2 (Ib)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AXAX8QXLSX9L-R2 (Ic)
(XはL-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示し、R1は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基又は目的物質を示す。R2は水酸基(OH)、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。X5~X9は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。)
R1-(IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-Y)n-R2 (IA)
(式中、X1及びX2は、同一又は異なってH又はAを示す。X3はE、L-2-aminoadipic acid (Aad) 、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示す。X4はQ、L-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸、2-アミノスベリン酸又はEを示す。X5~X9は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。
但しX1=H、X2=H、X3=E、X4=Q、かつ、X5~X9=Kの場合を除く、並びに、
X4=E、かつ、X5~X9=Kのとき、X1とX2の一方または両方がAである。
R1は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。R2は水酸基(OH)、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Yは単結合またはスペーサーを示す。nは2,3,4,5,6,7,8,9または10である。)
で表されるペプチド。
Z-(Ra)m (IB)
(式中、Zは分岐型の多価リンカーを示し、Raは、同一または異なって、R1-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-Y-を示すか、Y-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-R2を示す。X1及びX2は、同一又は異なってH又はAを示す。X3はE、L-2-aminoadipic acid (Aad) 、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示す。X4はQ、L-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸、2-アミノスベリン酸又はEを示す。X5~X9は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。
但しX1=H、X2=H、X3=E、X4=Q、かつ、X5~X9=Kの場合を除く、並びに、
X4=E、かつ、X5~X9=Kのとき、X1とX2の一方または両方がAである。 R1は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。R2は水酸基(OH)、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Yは単結合またはスペーサーを示す。mは2~8の整数である。)
L17E: IWLTALX5FLGX6HAAX7HEAX8QQLSX9L-amide(配列番号1)
(式中、X5~X9はLys(K)である。)
具体的には、本発明のペプチドは、Lycotoxin 1のX1に対応する12位のH(His)、X2に対応する16位のH(His)、X3に対応する17位のE(Glu)、X4に対応する21位のQ(Gln)の少なくとも1種を置換したペプチドである。12位と16位のH(His)はA(Ala)に置換されてもよく、17位のE(Glu)と21位のQ(Gln)はX (L-2-aminoadipic acid, Aad、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸)に置換されてもよい。また、5個のLys(K)残基はArg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acid残基で置換されてもよい。
R1-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-R2 (I)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7HEAX8QQLSX9L-R2 (I-1)
R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7AEAX8QQLSX9L-R2 (I-2)
R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7HXAX8QQLSX9L-R2 (I-3)
R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7HEAX8QXLSX9L-R2 (I-4)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AEAX8QQLSX9L-R2 (I-5)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AEAX8QELSX9L-R2 (I-6)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7HXAX8QQLSX9L-R2 (I-7)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7HEAX8QXLSX9L-R2 (I-8)
R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7AXAX8QQLSX9L-R2 (I-9)
R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7AEAX8QXLSX9L-R2 (I-10)
R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7HXAX8QXLSX9L-R2 (I-11)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AXAX8QQLSX9L-R2 (I-12)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AXAX8QELSX9L-R2 (I-13)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AEAX8QXLSX9L-R2 (I-14)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7HXAX8QXLSX9L-R2 (I-15)
R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7AXAX8QXLSX9L-R2 (I-16)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AXAX8QXLSX9L-R2 (I-17)
(式中、X、X1、X2、X3 、X4、X5、X6、X7、X8、X9、R1、R2は前記に定義される通りである。)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AEAX8QELSX9L-R2 (I-6)
R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7HXAX8QQLSX9L-R2 (I-3)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AXAX8QXLSX9L-R2 (I-17)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AEAX8QQLSX9L-R2 (I-5)
R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7HXAX8QXLSX9L-R2 (I-11)
[式中、X、R1、R2、X5、X6、X7、X8、X9は、前記に定義されるとおりである。]
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AEAX8QELSX9L-R2 (I-6)
R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7HXAX8QQLSX9L-R2 (I-3)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AXAX8QXLSX9L-R2 (I-17)
[式中、X、R1、R2、X5、X6、X7、X8、X9は、前記に定義されるとおりである。]
HA/E2: IWLTALX5FLGX6AAAX7AEAX8QELSX9L-amide
L17Aad: IWLTALX5FLGX6HAAX7HXAX8QQLSX9L-amide
HAad: IWLTALX5FLGX6AAAX7AXAX8QXLSX9L-amide
HA/E1: IWLTALX5FLGX6AAAX7AEAX8QQLSX9L-amide
L17Aad /Q21Aad: IWLTALX5FLGX6HAAX7HXAX8QXLSX9L-amide
[X=L-2-aminoadipic acid (Aad)、X5~X9=Lys(K)]
HAad-homoR: IWLTALX5FLGX6AAAX7AXAX8QXLSX9L-amide
[X=L-2-aminoadipic acid (Aad)、X5~X9=ホモアルギニン]
HA/E2: IWLTALX5FLGX6AAAX7AEAX8QELSX9L-amide
L17Aad: IWLTALX5FLGX6HAAX7HXAX8QQLSX9L-amide
HAad: IWLTALX5FLGX6AAAX7AXAX8QXLSX9L-amide
[X=L-2-aminoadipic acid (Aad)、X5~X9=Lys(K)]
HAad-homoR: IWLTALX5FLGX6AAAX7AXAX8QXLSX9L-amide
[X=L-2-aminoadipic acid (Aad)、X5~X9=ホモアルギニン]
1文字記号で表される本発明のペプチドの各アミノ酸はL型アミノ酸でもよく、D型アミノ酸でもよい。本発明のペプチドがD型アミノ酸を含む場合、D型アミノ酸の数は1個でも2個以上でもよいが、好ましくは全てのアミノ酸がL型アミノ酸であるか、全てのアミノ酸がD型アミノ酸である。なお、G(Gly)は不斉炭素を有しないので、本明細書においてL型アミノ酸として扱う。
(生理活性物質)-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-(生理活性物質)
(生理活性物質)-(スペーサー)-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-(スペーサー)- (生理活性物質)
(生理活性物質)-(スペーサー)-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L- (生理活性物質)
(生理活性物質)-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-(スペーサー)- (生理活性物質)
(生理活性物質) -(スペーサー)-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L- R2 (R2≠目的物質)
R1-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-(スペーサー) -(生理活性物質) (R1≠目的物質)
(生理活性物質)-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L- R2 (R2≠目的物質)
R1-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-(生理活性物質) (R1≠目的物質)
(式中、X1、X2、X3 、X4、X5、X6、X7、X8、X9は前記に定義される通りである。R1、R2は、目的物質以外の前記に定義されるものである。)
タンパク質としては抗体、酵素、細胞情報伝達因子、転写因子、DNAあるいはRNA結合タンパク質、核・ミトコンドリア・細胞骨格などの細胞内器官構成タンパク質、ユビキチンや熱ショックタンパク質などのユビキチン-プロテアソーム系関連タンパク質やカスパーゼなどのアポトーシス関連タンパク質、p53などの細胞周期調節タンパク質、レクチンなどが挙げられる。また、Creリコンビナーゼ、TALEN、Cas9などの遺伝子切断・組み換え能を有するタンパク質も含まれる。抗体に関しては、免疫グロブリンに加え、その断片タンパク質やラクダ科動物由来の一本鎖抗体も含まれる。これらの抗体の標的としては、キナーゼ類、HIF-1などの転写因子類、微小管などの細胞骨格タンパク質類などが挙げられる。ペプチドとしては、細胞内タンパク質相互作用を調節するヘリックスペプチドや環状ペプチド、細胞内タンパク質の断片ペプチド、DNA/RNA結合ペプチド、各種酵素基質・阻害剤、がんワクチン産生のための抗原ペプチドなどが挙げられる。医薬としては抗腫瘍剤、抗ウイルス剤などが挙げられ、糖としてはデキストラン、シアル酸などが挙げられ、核酸としてはDNA、RNA(好ましくはsiRNA、miRNA、shRNA、rRNA、リボザイム、アンチセンスRNAなど)、DNA/RNAアプタマーならびにこれらの化学修飾体が挙げられる。また、Cas9/sgRNAなどのタンパク質と核酸の複合体も生理活性物質に含まれる。また、細胞内での生理活性や機能の向上のために上記の生理活性物質に必要に応じて化学修飾を施した誘導体を目的物質として細胞内に導入することも可能である。
R1-(IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-Y)n-R2 (IA)
(式中、R1、R2、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9は、前記に定義される通りである。Yは単結合またはスペーサーを示す。nは2,3,4,5,6,7,8,9または10であり、好ましくは2~6、より好ましくは2~4の整数である。)
本明細書において、スペーサーとしては、エステル結合(-CO-O-、-O-CO-)、エーテル結合(-O-)、アミド結合(NHCO, CONH)、糖鎖リンカー、ポリエチレングリコールリンカー、ペプチドリンカーなどが挙げられる。ペプチドリンカーとしては、タンパク質を構成する天然の20種のアミノ酸の少なくとも1種を含むリンカーが挙げられ、ペプチドリンカーのアミノ酸の数としては、1~20個、1~15個、1~12個、1~10個、1~8個、1~6個あるいは1~4個が挙げられるがこれらに限定されない。ペプチドリンカーとして、アルギニンダイマー、アルギニントリマー、アルギニンテトラマー、リジンダイマー、リジントリマー、リジンテトラマー、グリシンダイマー、グリシントリマー、グリシンテトラマー、グリシンペンタマー、グリシンヘキサマー、アラニン-アラニン-チロシン(AAY)、イソロイシン-ロイシン-アラニン(ILA)、アルギニン-バリン-リジン-アルギニン(RVKR)等が例示される。スペーサーは2価であっても多価であってもよい。
(式中、Zは分岐型の多価リンカーを示し、Raは、同一または異なって、R1-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-Y-を示すか、Y-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-R2を示す。R1、R2、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、Yは、前記に定義される通りである。mは3、4又は5である。)
Zで表わされる分岐型の多価リンカーとしては、ジエチレントリアミン、スペルミン、スペルミジン、トリエタノールアミン、エチレンジアミンテトラアセテート(EDTA)、ペンタエリスリトール、アジド-プロピル(アルキル)アミン、リジン、オルニチン、アスパラギン酸、グルタミン酸、多官能性ペプチド(リジン、オルニチン、アスパラギン酸又はグルタミン酸を含むジペプチド、トリペプチド又はテトラペプチド)、有機多価アミノ化合物(例えば、ポリ(アミドアミン)(PAMAM)、トリス(エチレンアミン)アンモニア、ポリ(プロピレンイミン)(Astramol(商標))など)が挙げられる。mは、2~8の整数、好ましくは2~6の整数、さらに好ましくは2~4の整数、例えば3又は4である。例えば、IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9Lで表わされるペプチドのN末端(あるいはC末端)同士を連結したダイマーは、本発明のデンドリマーに包含される。さらに、前記ペプチドのN末端側同士をつないでダイマーとしたもの」と「C末端同士をつないでダイマーとしたもの」を更に連結した4量体も本発明のデンドリマーに包含される。
(a)[抗体と親和性を示すペプチド(ファージディスプレイ系などを用いて選択)と本発明のペプチドのコンジュゲート]と抗体との複合体
(b)核酸と本発明のペプチドとの非共有結合的な複合体
(c)[本発明のペプチドと核酸相互作用分子とのコンジュゲート]と核酸との非共有結合的な複合体
等が挙げられる。
実施例1
1.ペプチドの構造及び製造
L17E (L17): IWLTALX5FLGX6HAAX7HEAX8QQLSX9L-amide(配列番号1、R1=H, R2=NH2)
L17E/Q21E (L17Q21): IWLTALX5FLGX6HAAX7HEAX8QELSX9L-amide(配列番号2、R1=H, R2=NH2)
HA/E2: R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AEAX8QELSX9L-R2 (I-6)
L17Aad: R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7HXAX8QQLSX9L-R2 (I-3)
HAad: R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AXAX8QXLSX9L-R2 (I-17)
HA/E1: R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AEAX8QQLSX9L-R2 (I-5)
L17Aad /Q21Aad: R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7HXAX8QXLSX9L-R2 (I-11)
(式中、R1はHである。R2はNH2である。XはL-2-aminoadipic acid (Aad)である。X5~X9はLys(K)である。)
特許文献2の実施例に記載のL17Eの配列中の12位、16位、17位、21位のアミノ酸を置換することにより、エンドソーム膜選択的に不安定化するペプチドを得た。ペプチドは、固相合成により得た。得られたペプチドの物性値を以下に示す。
L17E (L17)の物性値(MALDI-TOFMS): 理論値(M+H)+ 2860.6; 実測値 2860.5
L17E/Q21Eの物性値: 理論値(M+H)+ 2861.4; 実測値 2860.4
HA/E2の物性値: 理論値(M+H)+ 2727.6; 実測値 2727.4
L17Aadの物性値: 理論値(M+H)+ 2873.7; 実測値 2873.5
HAadの物性値: 理論値(M+H)+ 2755.7; 実測値 2755.6
HA/E1の物性値: 理論値(M+H)+ 2726.6; 実測値 2726.2
L17Aad /Q21Aadの物性値: 理論値(M+H)+ 2887.7; 実測値 2886.7
実施例1で得たペプチド(L17E、L17E/Q21E、L17Aad、HA/E1、HA/E2、HAad)について、Y H Chen et al, 1972の方法により、222 nmのモル楕円率([θ]222)をもとにHelicity (%)= -([θ]222+2340)/30300*100を用いて、POPC/POPG (3:1)リポソーム存在下でのヘリックス含量を計算し、さらにCDスペクトルを測定した。図1にCDスペクトル(左)とヘリックス含量(右)を示す。
実施例1で得られたペプチド(L17E、L17E/Q21E、HA/E1、HA/E2) (40 μM)存在下又は非存在下(コントロール、no peptide)、HeLa細胞とAlexa488-dextran (Molecular Probes、10 kDa) (200 μg/mL)をα-MEM(-)中1 h処理、細胞を洗浄し、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図2に示す。
実施例1で得られたペプチド(L17E、L17Aad)(40 μM)存在下又は非存在下(コントロール、no peptide)、HeLa細胞とAlexa488-dextran (Molecular Probes、10 kDa) (200 μg/mL)をα-MEM(-)中1 h処理、細胞を洗浄し、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図3に示す。
実施例1で得られたペプチド(HAad、HA/E2、L17Aad、L17E)(40 μM)存在下又は非存在下(コントロール、no peptide)、HeLa細胞とAlexa488-dextran (Molecular Probes、10 kDa) (200 μg/mL)をα-MEM(-)中1 h処理、細胞を洗浄し、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図4に示す。
HAad (40 μM)存在下にHeLa細胞を高分子薬物モデルとしてのAlexa488-dextran (10 kDa)(200 μg/mL)とα-MEM(-)培地中で1 hインキュベーションすることにより、約75%の細胞内(サイトゾル)へのAlexa488-dextranの放出が見られた。一方、L17Eを用いた際には約50%であった。
HeLa細胞に較べて細胞内へのデキストランの放出が難しいNIH3T3細胞において、実施例6と同様に、HAad、HA/E2、L17E (各40 μM)存在下に細胞とデキストラン(10 kDa)をDMEM(-)培地中で1 hインキュベーションしたところ、全体のそれぞれ約35%、25%、17%の細胞で細胞内へのデキストランの放出が認められた(HAad処理による細胞内放出はL17Eによるものの2倍)。
実施例6と同様に、HAad、HA/E2、L17E (各40 μM)存在下に細胞とAlexa488で蛍光標識したヒト免疫グロブリン(IgG、~160 kDa)(500 μg/mL)をα-MEM(-)培地中で1 hインキュベーションしたところ、全体のそれぞれ約70%、45%、35%の細胞で細胞内へのヒト免疫グロブリンの放出が認められた(図7、HAad処理による細胞内放出はL17Eによるものの2倍)。
実施例8で、HAadが高いエンドソーム内包IgGの細胞内への放出能を有することが確認された。これを基に、投与するIgG量の低減可能かに関して検討した。
実施例8及び9で、HAadがより低いIgG投与量でも高いエンドソーム内包IgGの細胞内への放出能を有することが確認された。これを基に、投与するペプチド量が低減可能かに関して検討した。
細胞内への送達によりがん細胞を死滅される細胞毒としてsaporinが知られている。HAad、HA/E2、L17E (各40 μM)存在下にRAW264.7細胞とsaporin (10 μg/mL) をα-MEM(-)培地中で1 hインキュベーションし、その後、細胞を洗浄し、培地をDMEM(+)に交換し更に6 hインキュベーションした。WST-8 assayで細胞生存率を検定した(図10)。この結果、HAadおよびHA/E2存在下でsaporinを処理した細胞の生存率はそれぞれ4、6%とL17E存在下での生存率 (16%)と比較して有意に減少し、またHAad存在下の生存率は、L17E存在下の1/4であった。
特許文献2の実施例と同様にして作製したloxP-DsRed-loxP-EGFPをコードするプラスミドをトランスフェクションしたHeLa細胞に、His-tag融合Cre (Cre-His6) (10 μM)をHAad、HA/E2、L17E (各40 μM)存在下、α-MEM(-)中1 hインキュベーションした。この系は、Creタンパク質が細胞内に放出されることで遺伝子組換えが誘起されるとEGFPが発現するように設計してある。細胞を洗浄し、α-MEM(+)で24 h培養後、共焦点顕微鏡観察した(図11)。ペプチド処理細胞群では、コントロール細胞群 (Cre-His6のみ投与)に比べ有意にEGFP発現細胞の割合が増加した。HAad、HA/E2、L17E処理時のGFP発現細胞の割合はそれぞれ41%、36%、30%であった。放出ペプチド非投与時のEGFP発現効率は9%であったことを考慮すると、ペプチド投与時には遺伝子組換えが、非投与時に較べ32、27、22%上昇したと考えることが可能であり、HAad投与時にはL17E投与時にくらべ有意に遺伝子組換えが促進された。
ミトコンドリア膜は細胞膜に比べより酸性脂質に富んでいると言われていることから、上記のペプチドのミトコンドリア膜への影響をJC-1アッセイにより調べた。JC-1試薬はミトコンドリア膜が健常に保たれ、膜電位が保たれている場合は赤色(J-aggregate)の、ミトコンドリア膜が傷害され、膜電位が正常に保たれていない場合は緑色(J-monomer)の蛍光を発する。HeLa細胞をα-MEM(-)中、HAad、HA/E2、L17E (40 μM)と1 hインキュベーションした後、JC-1アッセイを行い、フローサイトメトリーにより赤色蛍光を発する細胞の割合を検定した。ATP合成を阻害する脱共役剤(carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone, FCCP) [α-MEM(-)中、40μM、1 hインキュベーション]、カチオン性の遺伝子のトランスフェクション試薬であるリポフェクタミン LTXとpCI vector (空ベクター)との複合体(標準プロトコルに従いα-MEM(+)中、一夜インキュベーション)の影響に関しても同様に検討した(図12)。
実施例6と同様に、HAad, L17E (各40 μM) 存在下に細胞とNLS-EGFP (10 μM) をα-MEM(-)培地中で1 hインキュベーションした。NLS-EGFPが活性を保持したまま細胞内に放出されていれば、NLSにより緑色の蛍光が核に局在する様子が観察される。結果として、全体のそれぞれ約84%、56%の細胞で核へのNLS-EGFPの局在が認められた (図13)。HAadの高いエンドソーム内包物放出活性をこの系でも確認することができた。
HAad, HA/E2, L17E (各10, 20, 40 μM) で細胞をα-MEM(+)培地中で24 hインキュベーションした後の細胞生存率をWST-8 assayにより評価した (図14)。どのペプチドのどの濃度においても24時間後の生存率はほぼ100%で、L17Eと同様に、HA/E2およびHAadに顕著な毒性は見られなかった。
1)H-IWLTALZFLGZAAAZAXAZQXLSZL-amide [HAad-homoR] (Z=homoarginine、X= L-2-aminoadipic acid)の調製
Francesco L. Brancia., et al., Anal. Chem., 2004, 76 (10), 2748-2755に従って標記化合物を合成した。ヘミ硫酸O-メチルイソ尿素(1.23 g)の水溶液にアンモニア水を添加しpH 11.0とする。HAad[H-IWLTALKFLGKAAAKAXAKQXLSKL-amide]の水溶液(1.3 mM, 38 μL)をこれに加え、ヘミ硫酸O-メチルイソ尿素、1cの最終濃度がそれぞれ0.5M、5 μM、総液量10 mLとする。室温一夜反応。1% トリフルオロ酢酸水溶液を同体積加えて反応停止後、凍結乾燥、逆相HPLCで精製し、質量分析(MALDI TOFMS)で目的物が得られたことを確認した[実測値2965.8; 理論値 2965.8 (M+H)+]。
2)H-IWLTALZFLGZAAAZAXAZQXLSZL-amideのAlexa488-dextran (10 kDa)の細胞質への放出活性
HeLa細胞とAlexa488-dextran (Molecular Probes、10 kDa) (200 μg/mL)とHAad、あるいはHAad-homoR (20 μM)をα-MEM(-)中1 h処理、細胞を洗浄し、共焦点顕微鏡で観察した。HAad処理細胞では約40%の細胞で細胞質へのAlexa488-dextranの放出が見られたのに対し、HAad-homoR処理細胞では75%の細胞でこれが観察された。
2.分子細胞生物学・医学分野における基礎研究(細胞内可視化、計測、相互作用解析、細胞活性制御等)
3.創薬分野における抗体医薬品・バイオ医薬品等の細胞内活性評価のための基礎研究(バイオ医薬品設計支援手法)
4.抗体医薬品・核酸医薬品・バイオ医薬品のex vivo・in vivo細胞内送達
Claims (14)
- 下記の(Ia)~(Ie)のいずれかで表されるペプチド。
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AEAX8QELSX9L-R2 (Ia)
R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7HXAX8QQLSX9L-R2 (Ib)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AXAX8QXLSX9L-R2 (Ic)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AEAX8QQLSX9L-R2 (Id)
R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7HXAX8QXLSX9L-R2 (Ie)
(XはL-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示し、R1は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基又は目的物質を示す。R2は水酸基(OH)、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。X5~X9は、同一又は異なって、Lys(K)、ホモアルギニン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。) - 下記の(Ia)~(Ic)のいずれかで表される請求項1に記載のペプチド。
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AEAX8QELSX9L-R2 (Ia)
R1-IWLTALX5FLGX6HAAX7HXAX8QQLSX9L-R2 (Ib)
R1-IWLTALX5FLGX6AAAX7AXAX8QXLSX9L-R2 (Ic)
(XはL-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示し、R1は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基又は目的物質を示す。R2は水酸基(OH)、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。X5~X9は、同一又は異なって、Lys(K)、ホモアルギニン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。) - 請求項1又は2に記載のペプチドからなる細胞質送達剤。
- 請求項1又は2に記載のペプチドをベクターに含む、細胞質を標的とする物質導入剤。
- 請求項1又は2に記載のペプチドと目的物質が直接あるいはスペーサーを介して共有結合されてなる、細胞質を標的とする物質導入剤。
- 請求項1又は2に記載のペプチドと目的物質が直接、あるいは目的物質と相互作用する他分子を介して非共有結合的な複合体を形成してなる、細胞質を標的とする物質導入剤。
- 目的物質をベクターに内包する、請求項4に記載の細胞質を標的とする物質導入剤。
- 前記ペプチドがベクターの構成成分に直接又はスペーサーを介して結合されている、請求項4に記載の物質導入剤。
- 前記ペプチドと前記ペプチドの標的細胞へ親和性を高める分子とのコンジュゲートを含む、請求項4~8のいずれか1項に記載の物質導入剤。
- 前記ペプチドが目的物質とともにベクターに内包されている、請求項4、7、8又は9に記載の物質導入剤。
- 前記ベクターが、リポソーム、リピッドマイクロスフェア、高分子ミセル、高分子中空キャリア、ナノゲル、高密度リポタンパク質(HDL)、合成ポリマー、自己集合型核酸由来ベクター、ウイルス外殻タンパク質由来ベクター又はナノ粒子である、請求項4、7、8又は9に記載の物質導入剤。
- ベクターの構成成分がコレステロールあるいはリン脂質であり、前記ベクターがコレステロールあるいはリン脂質と請求項1又は2に記載のペプチドを含む複合体を含む、請求項7、8、9、10又は11に記載の物質導入剤。
- 下記式(IA)
R1-(IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-Y)n-R2 (IA)
(式中、X 1 ~X 4 は、
X 1 =A、かつ、X 2 =A、かつ、X 3 =E、かつ、X 4 =E、又は、
X 1 =H、かつ、X 2 =H、かつ、X 3 =X、かつ、X 4 =Q、又は、
X 1 =A、かつ、X 2 =A、かつ、X 3 =X、かつ、X 4 =X、又は、
X 1 =A、かつ、X 2 =A、かつ、X 3 =E、かつ、X 4 =Q、又は、
X 1 =H、かつ、X 2 =H、かつ、X 3 =X、かつ、X 4 =Xである。
X 5 ~X 9 は、同一又は異なって、Lys(K)、ホモアルギニン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。
XはL-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示す。R1は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。R2は水酸基(OH)、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Yは単結合またはスペーサーを示す。nは2,3,4,5,6,7,8,9または10である。)
で表されるペプチド。 - 下記式(IB):
Z-(Ra)m (IB)
(式中、Zは分岐型の多価リンカーを示し、
Raは、同一または異なって、R1-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-Y-を示すか、Y-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-R2を示す。
X 1 ~X 4 は、
X 1 =A、かつ、X 2 =A、かつ、X 3 =E、かつ、X 4 =E、又は、
X 1 =H、かつ、X 2 =H、かつ、X 3 =X、かつ、X 4 =Q、又は、
X 1 =A、かつ、X 2 =A、かつ、X 3 =X、かつ、X 4 =X、又は、
X 1 =A、かつ、X 2 =A、かつ、X 3 =E、かつ、X 4 =Q、又は、
X 1 =H、かつ、X 2 =H、かつ、X 3 =X、かつ、X 4 =Xである。
X 5 ~X 9 は、同一又は異なって、Lys(K)、ホモアルギニン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。
XはL-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示す。R1は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。R2は水酸基(OH)、アミノ基(NH2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Yは単結合またはスペーサーを示す。mは2~8の整数である。)
で表されるペプチド。
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坂本健太郎ほか,エンドソーム不安定化ペプチドL17Eの活性向上に向けた設計と評価,日本薬学会年会要旨集,2017年03月05日,Vol.137,NO.25R-pm02S,全文 |
坂本健太郎ほか,ヒスチジン残基に注目したエンドソーム不安定化ペプチドの活性向上とその評価,日本薬学会年会要旨集,2018年03月05日,Vol.138,NO.26V-pm13S,全文 |
秋柴美沙穂ほか,エンドソーム不安定化ぺプチドを用いた細胞内への機能性タンパク質の導入,日本薬学会年会要旨集,2018年03月05日,Vol.138,NO.GS02-7,全文 |
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