TW202342497A - 肽類樹枝狀大分子及其使用方法 - Google Patents

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羅納德 詹姆士 克立斯提
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Abstract

本說明書關於包含一或多個源自具有式 (I)的經修飾離胺酸的殘基的肽類樹枝狀大分子、包含該等肽類樹枝狀大分子的藥物遞送系統、含有該等肽類樹枝狀大分子的藥物組成物，以及該等肽類樹枝狀大分子、藥物遞送系統和藥物組成物在療法中之用途。

Description

肽類樹枝狀大分子及其使用方法
本說明書關於包含一或多個源自經修飾離胺酸的殘基之肽類樹枝狀大分子，以及該等肽類樹枝狀大分子用於將藥物活性劑，特別是遺傳物質遞送到細胞中之用途。本說明書進一步關於該等肽類樹枝狀大分子在療法中之用途。
基因療法屬於聚焦於將（外來）遺傳物質（例如DNA和RNA）以治療為目的遞送到患者細胞中以治療疾病的醫學領域。迄今為止，包括Luxturna®（RPE65突變誘導的目盲）和Kymriah®（嵌合抗原受體T細胞療法）在內的幾種基因療法已經獲得了針對多種不同醫學病症的監管批准。
基因遞送係用於將遺傳物質引入細胞的過程。為了成功，遺傳物質必須在運輸過程中保持穩定並最終內化到靶細胞中。當遺傳物質係DNA時，必須將其內化到靶細胞中並遞送到細胞核中。基因遞送需要載體，合適的載體一般分為兩類：病毒載體和非病毒載體。
病毒介導的基因遞送利用病毒將其DNA注入宿主細胞的能力。為了形成病毒載體，可將遺傳物質包裝成複製缺陷型病毒顆粒。病毒方法雖然高效，但可能誘導免疫響應。此外，該等方法只能將非常小塊的遺傳物質遞送入細胞，生產病毒載體需要消耗大量勞力，並且存在隨機插入位點、細胞病變效應和誘變的風險。
在結構通用性和可規模化方面，合成載體在基因遞送應用中與病毒載體相比具有多個優勢；且合成載體可單獨且特定設計以實現某一所希望的目的。可以設計該等物質以將遺傳物質包裝成奈米顆粒或囊泡，該等奈米顆粒或囊泡被工程化來克服與細胞攝取、運輸到細胞溶質以及（如果需要）遞送到細胞核相關的生物屏障。常見的方法係用材料（例如聚合物、肽或脂質，包含與陰離子核酸締合的正電荷）將遺傳物質包裝成多分子組件。正負電荷之間的靜電相互作用促使自組裝成奈米結構或微粒結構，該等粒子的大小和形狀可以由材料類型和冷凝條件控制（Park等人, Adv Drug Del Rev [先進藥物遞送評論], 2006, 58(4):467-86）。
例如，將DNA配製成合適的載體（如奈米顆粒）顯著提高對DNA的細胞攝取（與對未配製的DNA的攝取相比）。DNA太大且帶負電荷，無法藉由被動過程（例如穿過細胞膜的擴散）自行內化到細胞（其也具有淨負電荷）中。未配製的DNA也易引發導致其降解的免疫響應。將DNA配製成合適載體可以中和其負電荷，並且保護其免於在細胞外空間降解。
為了使載體被有效內化，必須使其經由稱為內吞作用的過程運輸到細胞中。在這個過程期間，載體被細胞膜的區域包圍，然後其在細胞內出芽形成內體。必須設計載體以允許該過程發生，但隨後要降低被溶酶體截留（即隔離到酸性膜結合的溶酶體室中）的可能性。實現這一點的一種方法係確保在溶酶體運輸發生前內體破裂。這可以藉由載體緩衝內體pH（細胞攝取後內體變得愈發呈酸性）來實現，直到產生的滲透梯度導致內體破裂並將遺傳物質釋放到可以將其用於進行轉錄/翻譯的細胞質中。在內體緩衝範圍（pH 7.4-pH 5.0）上具有有效的緩衝能力的合適的載體材料可以藉由接受質子來減緩對內體的酸化，其導致更多的質子和相反離子從細胞溶質中流入。
目前的合成基因遞送系統在體內受到遺傳物質的低穩定性、高毒性和低效的細胞質進入的限制。將適用於基因遞送的多功能材料工程化（在保持高遞送效率的同時，實現配製物特性（大小、電荷等）、穩定性、緩衝能力和毒性之間的最佳平衡）已被證明是困難且複雜的，但這樣將顯著簡化最終配製物。
肽類樹枝狀大分子（PD）係包含胺基酸殘基的3維結構，其中殘基之一的側鏈，例如離胺酸的ɛ-胺用於形成分支或代，從而將分子構建成三維（3-D）大分子。肽類樹枝狀大分子通常是使用固相肽合成產生的，允許在明確的結構內精確控制胺基酸殘基序列和幾何形狀。最終產品係單分散的，具有高度可客製化特性（即疏水性、電荷密度和分子量），可實現多功能優化和靈活應用。
已對肽類樹枝狀大分子進行了廣泛探索，但生產成本和低蛋白水解穩定性阻礙了臨床成功。Kwok等人（ACS Nano [美國化學會奈米期刊], 2013年5月28日;7(5):4668-82, doi: 10.1021/nn400343z和ChemBioChem [化學生物化學雜誌], 2016, 17(23), 2223-2229）探索了肽類樹枝狀大分子/脂質雜合系統作為DNA和RNA轉染試劑，但由於合成限制、限制性材料功能和體內功效而僅限於二肽分支。
本申請描述了包含一或多個源自經修飾離胺酸的殘基的某些肽類樹枝狀大分子。該等肽類樹枝狀大分子 i) 具有增強的緩衝特性，可對該等特性加以調整以在細胞內化和溶酶體運輸過程中發生的pH轉換期間實現質子化，ii) 由於藉由靜電和非靜電（例如π-π堆積）相互作用增加的核酸結合而更加穩定，iii) 當使用天然存在的且不太可能具有毒性或免疫原性的基於代謝物的核心單元時，具有增加的生物相容性，且/或iv) 藉由特定的細胞內酶降解（組織蛋白酶-B）實現響應性核酸釋放。該等肽類樹枝狀大分子與包括質體DNA、mRNA、siRNA和反義寡核苷酸（ASO）在內的多種核酸形式形成奈米顆粒（約25-100 nm，球體、棒體和超環狀體），並在向小鼠靜脈注射後血清穩定性升高且血液循環延長，無相關毒性。它們已表現出一定能力，能夠成功遞送和/或共同遞送多種多樣核酸形式（包括DNA、mRNA、siRNA和ASO），並能夠保護封裝的遺傳物質在進入細胞之前不會輕易解離。此外，RNA/DNA在同一奈米顆粒中的共同遞送允許控制蛋白質表現動力學（即增效治療劑的表現），並將奈米顆粒的應用擴展到需要多種組分的領域，例如CRISPR。
本說明書部分地描述了肽類樹枝狀大分子，其包含一或多個源自具有式 (I)的經修飾離胺酸的殘基： (I)其中： A係鍵、C 1-6伸烷基、碳環基或雜環基；其中所述碳環基或雜環基可視需要地在碳上被一或多個R 2取代；並且其中如果所述雜環基含有-NH-部分，則氮可視需要地被選自R A的基團取代； Q係鍵、碳環基或雜環基；其中所述碳環基或雜環基可視需要地在碳上被一或多個R 3取代；並且其中如果所述雜環基含有-NH-部分，則氮可視需要地被選自R B的基團取代； 環 B係𠰌啉基或硫代𠰌啉基；其中如果所述𠰌啉基或硫代𠰌啉基含有-NH-部分，則氮可視需要地被選自R C的基團取代； R 1 、 R 2 和 R 3 各自獨立地選自鹵代、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、胺基、羧基、胺甲醯基、巰基、胺磺醯基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、乙醯基、乙醯氧基、甲基胺基、乙基胺基、二甲基胺基、二乙基胺基、N-甲基-N-乙基胺基、乙醯基胺基、N-甲基胺甲醯基、N-乙基胺甲醯基、N,N-二甲基胺甲醯基、N,N-二乙基胺甲醯基、N-甲基-N-乙基胺甲醯基、甲基硫代、乙基硫代、甲基亞磺醯基、乙基亞磺醯基、甲磺醯基、乙基磺醯基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基胺磺醯基、N-乙基胺磺醯基、N,N-二甲基胺磺醯基、N,N-二乙基胺磺醯基以及N-甲基-N-乙基胺磺醯基； n係0-4； R A 、 R B 和 R C 獨立地選自甲基、乙基、丙基、異丙基、乙醯基、甲磺醯基、乙基磺醯基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基、胺甲醯基、N-甲基胺甲醯基、N-乙基胺甲醯基、N,N-二甲基胺甲醯基、N,N-二乙基胺甲醯基和N-甲基-N-乙基胺甲醯基。
本說明書還部分地描述了如本文所述之肽類樹枝狀大分子，其用於將藥物活性劑遞送到細胞中。
本說明書還部分地描述了藥物組成物，其包含如本文所述之一或多種肽類樹枝狀大分子和藥物活性劑。
本說明書還部分地描述了基因療法方法，該方法包括向所述動物投與有效量的如本文所述之藥物組成物。
相關申請的交叉引用
本申請要求2021年10月8日提交的美國臨時申請案號63/262,269的優先權權益，該臨時申請出於所有目的藉由援引以其全文併入本文。
許多實施方式在整個說明書中詳細描述並且對於本領域技術讀者將是顯而易見的。本揭露不被解釋為受限於任何所闡述的實施方式。
「一個/種（a）」意指「至少一個/種」。在任何實施方式中，在使用「一個/種（a）」表示給定材料或元素時，「一個/種（a）」可以意指一個/種。
「包含」意指給定材料或元素可含有其他材料或元素。在任何實施方式中，在提及「包含」時，給定材料或元素可由該材料或元素的至少1% w/w、至少5% w/w、至少10% w/w、至少20% w/w、至少30% w/w、或至少40% w/w組成。「包含」還可以意指「由給定材料或元素組成」（「consisting of」或「consists of」）或「基本上由給定材料或元素組成」（「consisting essentially of」或「consists essentially of」）。
「由……組成（「consisting of」或「consists of」）」意指給定材料或元素完全由該材料或元素組成。在任何實施方式中，在提及「由……組成（「consisting of」或「consists of」）」時，給定材料或元素可以由該材料或元素的100% w/w組成。
「基本上由……組成（「consisting essentially of」或「consists essentially of」）」意指給定材料或元素幾乎完全由該材料或元素組成。在任何實施方式中，在提及「基本上由……組成（「consisting essentially of」或「consists essentially of」）」時，給定材料或元素可以由該材料或元素的至少50% w/w、至少60% w/w、至少70% w/w、至少80% w/w、至少90% w/w、至少95% w/w或至少99% w/w組成。
在任何實施方式中，在用「係」或「可為」來定義材料或元素時，「係」或「可為」可以意指該材料或元素「由該材料或元素組成」或「基本上由該材料或元素組成」。
在本說明書之任何實施方式中，在提及「約」時，「約」可以意指所引用數字的 +/- 0%（即無差異）、+/- 0.01%、+/- 0.05%、+/- 0.1%、+/- 0.5%、+/- 1%、+/- 2%、+/-5%、+/- 10%或 +/- 20%。當一個數字被引用時，在另一實施方式中這進一步係指大約為所引用的數字。
請求項係實施方式。
本文揭露了肽類樹枝狀大分子，其包含一或多個源自具有式 (I)的經修飾離胺酸的殘基： (I)其中A、Q、B、R 1和n如本文所述。
在一個實施方式中，A係鍵。
在一個實施方式中，A係C 1-6伸烷基。
在一個實施方式中，A係亞甲基。
在一個實施方式中，A係碳環基；其中所述碳環基可視需要地在碳上被一或多個R 2取代。
在一個實施方式中，A係雜環基；其中所述雜環基可視需要地在碳上被一或多個R 2取代；並且其中如果所述雜環基含有-NH-部分，則氮可視需要地被選自R A的基團取代。
在一個實施方式中，A係雜環基。
在一個實施方式中，A係吡啶基。
在一個實施方式中，A係鍵、C 1-6伸烷基或雜環基。
在一個實施方式中，A係鍵、亞甲基或吡啶基。
在一個實施方式中，Q係鍵。
在一個實施方式中，Q係碳環基；其中所述碳環基可視需要地在碳上被一或多個R 3取代。
在一個實施方式中，Q係雜環基；其中所述雜環基可視需要地在碳上被一或多個R 3取代；並且其中如果所述雜環基含有-NH-部分，則氮可視需要地被選自R B的基團取代。
在一個實施方式中，環B係𠰌啉基。
在一個實施方式中，環B係𠰌啉基；其中如果所述𠰌啉基含有-NH-部分，則氮可視需要地被選自R C的基團取代。
在一個實施方式中，環B係硫代𠰌啉基。
在一個實施方式中，環B係硫代𠰌啉基；其中如果所述硫代𠰌啉基含有-NH-部分，則氮可視需要地被選自R C的基團取代。
在一個實施方式中，R 1係鹵代。
在一個實施方式中，n係0。
在一個實施方式中，n係1。
在一個實施方式中，n係2。
在一個實施方式中，n係3。
在一個實施方式中，n係4。
在一個實施方式中，提供了肽類樹枝狀大分子，其包含一或多個源自具有式 (I)的經修飾離胺酸的殘基，其中： A係鍵、C 1-6伸烷基或雜環基； Q係鍵； 環B係𠰌啉基或硫代𠰌啉基；並且 n係0。
在一個實施方式中，提供了肽類樹枝狀大分子，其包含一或多個源自具有式 (I)的經修飾離胺酸的殘基，其中： A係鍵、亞甲基或吡啶基； Q係鍵； 環B係𠰌啉基或硫代𠰌啉基；並且 n係0。
在一個實施方式中，具有式 (I)的經修飾離胺酸係具有式 (IA)的經修飾離胺酸： (IA)其中A、Q、B、R 1和n如本文所述。具有式 (IA)的經修飾離胺酸也可稱為經修飾D-離胺酸。
在一個實施方式中，具有式 (I)的經修飾離胺酸係具有式 (IB)的經修飾離胺酸： (IB)其中A、Q、B、R 1和n如本文所述。具有式 (IB)的經修飾離胺酸也可稱為經修飾L-離胺酸。
在一個實施方式中，具有式 (I)的經修飾離胺酸選自： 2-胺基-6-{[6-(𠰌啉-4-基)吡啶-3-羰基]胺基}己酸； 2-胺基-6-[(硫代𠰌啉-3-羰基)胺基]己酸；以及 2-胺基-6-[2-(𠰌啉-4-基)乙醯胺基]己酸。
在一個實施方式中，具有式 (I)的經修飾離胺酸選自： (R)-2-胺基-6-{[6-(𠰌啉-4-基)吡啶-3-羰基]胺基}己酸； (R)-2-胺基-6-[(硫代𠰌啉-3-羰基)胺基]己酸；以及 (R)-2-胺基-6-[2-(𠰌啉-4-基)乙醯胺基]己酸。
在一個實施方式中，具有式 (I)的經修飾離胺酸選自： (S)-2-胺基-6-{[6-(𠰌啉-4-基)吡啶-3-羰基]胺基}己酸； (S)-2-胺基-6-[(硫代𠰌啉-3-羰基)胺基]己酸；以及 (S)-2-胺基-6-[2-(𠰌啉-4-基)乙醯胺基]己酸。
如本文所用，術語「取代的」當指化學基團時，意指該化學基團具有一或多個氫原子，該一或多個氫原子被去除並被取代基替代。如本文所用，術語「取代基」具有本領域已知的普通含義，並且係指共價附接到親本基團的化學部分。如本文所用，術語「視需要地取代的」意指化學基團可不具有取代基（即未取代的）或可具有一或多個取代基（即取代的）。應理解的是，給定原子處的取代受價限制。在視需要的取代基選自基團的清單的情況下，應理解的是，該定義包括選自指定基團之一的所有取代基或選自兩個或更多個指定基團的取代基。在可能存在不止一個相同取代基的情況下，例如R 2，應理解的是，該定義還包括選自指定基團之一的所有此類取代基或選自兩個或更多個指定基團的取代基。
如本文所用，術語「C i-j」表示碳原子數的範圍，其中i和j係整數，並且碳原子數的範圍包括端點（即i和j）和介於兩者之間的每個整數點，並且其中j大於i。例如，C 1-6表示一到六個碳原子的範圍，包括一個碳原子、兩個碳原子、三個碳原子、四個碳原子、五個碳原子和六個碳原子。在一些實施方式中，術語「C 1-6」表示1到6、1到5、1到4、1到3或1到2個碳原子。
如本文所用，術語「烷基」（無論是作為另一個術語的一部分還是獨立地使用）係指飽和烴鏈。上述烴鏈可為直鏈或支鏈。術語「C i-j烷基」係指具有i到j個碳原子的烷基。C 1-6烷基的實例包括但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、三級丁基、異丁基、二級丁基；更高級的同系物，例如2-甲基-1-丁基、正戊基、3-戊基、正己基、1,2,2-三甲基丙基等。對「丁基」等基團的提及（未作進一步限制）係指所有形式的丁基，例如正丁基和三級丁基等。
如本文所用，術語「伸烷基」（無論是作為另一個術語的一部分還是獨立地使用）係指飽和烴鏈。上述烴鏈可為直鏈或支鏈。術語「C i-j伸烷基」係指具有i到j個碳原子的烷基。C 1-6伸烷基的實例包括但不限於亞甲基（-CH 2-）、伸乙基（-CH 2-CH 2-）、亞丙基（-CH 2-CH 2-CH 2-）和亞丁基（-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-和-CH 2-CH(CH 3)-CH 2-等）等。
如本文所用，術語「鹵代」係指氟、氯、溴和碘。
「雜環基」係含有4-12個原子的飽和的、部分飽和的或不飽和的單環或雙環，該4-12個原子中之至少一個原子選自氮、硫或氧，除非另有規定，否則該雜環基可為碳或氮連接的，其中，-CH 2-基團可視需要地被-C(O)-替代，並且環硫原子可視需要地氧化形成S-氧化物。術語「雜環基」的實例和合適的值係𠰌啉代、哌啶基、吡啶基、哌喃基、吡咯基、吡唑基、異噻唑基、吲哚基、喹啉基、噻吩基、1,3-苯并二氧雜環戊烯基、噻二唑基、哌𠯤基、四氫噻唑基、吡咯啶基、硫代𠰌啉代、吡咯啉基、高哌𠯤基、3,5-二氧雜哌啶基、四氫哌喃基、咪唑基、嘧啶基、吡𠯤基、嗒𠯤基、異㗁唑基、N-甲基吡咯基、4-吡啶酮、1-異喹啉酮、2-吡咯啶酮和4-四氫噻唑酮。術語「雜環基」的具體實例係吡啶基。在一個實施方式中，「雜環基」係含有5或6個原子的飽和的、部分飽和的或不飽和的單環，該5或6個原子中之至少一個原子選自氮、硫或氧，除非另有規定，否則該雜環基可為碳或氮連接的，-CH 2-基團可視需要地被-C(O)-替代，並且環硫原子可視需要地氧化形成S-氧化物。
「碳環基」係含有3-12個原子的飽和的、部分飽和的或不飽和的單環或雙環碳環；其中-CH 2-基團可視需要地被-C(O)-替代。在一個實施方式中，「碳環基」係含有5或6個原子的單環或含有9或10個原子的雙環。「碳環基」的合適的值包括環丙基、環丁基、1-側氧基環戊基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、苯基、萘基、萘滿基、二氫茚基或1-側氧基二氫茚基。「碳環基」的具體實例係苯基。
本揭露之「化合物」涵蓋化合物中的原子的所有同位素。原子的同位素包括原子數相同但質量數不同的原子。例如，除非另有規定，本揭露「化合物」中的氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴或碘還旨在包括其同位素，例如但不限於： 1H、 2H、 3H、 11C、 12C、 13C、 14C、 14N、 15N、 16O、 17O、 18O、 31P、 32P、 32S、 33S、 34S、 36S、 17F、 19F、 35Cl、 37Cl、 79Br、 81Br、 127I和 131I。在一些實施方式中，氫包括氕、氘和氚。在一些實施方式中，氫係指氕。在一些實施方式中，氫係指氘。在一些實施方式中，氫係指氚。在一些實施方式中，術語「被氘取代」或「氘取代的」係用氘替代化學基團中的氫的其他同種型（例如氕）。在一些實施方式中，碳包括 12C和 13C。 殘基
本文所述之肽類樹枝狀大分子中的胺基酸經由α-胺基基團和羧基基團之間的肽鍵連接在一起形成鏈。一旦在鏈中連接，單獨的胺基酸被稱為「殘基」。「殘基」源自胺基酸。「殘基」也可用於描述僅經由α-胺基基團或羧基基團連接的末端胺基酸；視需要地其中末端胺基基團係經修飾的胺基基團或末端羧基基團係經修飾的羧基基團（如下文所述）。本文對特定胺基酸（例如「離胺酸」）的提及可能係指胺基酸本身或殘基，這取決於上下文。 經修飾離胺酸
在任何實施方式中，在提及經修飾離胺酸或源自經修飾離胺酸的殘基時，該等係指根據式 (I)修飾的離胺酸及其實施方式。
在任何實施方式中，在提及經修飾離胺酸或源自經修飾離胺酸的殘基時，這可以指經修飾D-離胺酸。
在任何實施方式中，在提及經修飾離胺酸或源自經修飾離胺酸的殘基時，這可以指經修飾L-離胺酸。 鹽形式
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指鹽形式的肽類樹枝狀大分子。
如本文所用，「鹽形式」係指本文所述之肽類樹枝狀大分子的衍生物，其中藉由將一或多個現有的酸性部分（例如羧基等）和/或鹼性部分（例如胺、鹼等）轉化為其鹽形式來修飾親體化合物。在許多情況下，由於胺基和/或羧基基團或與其類似的基團的存在，本揭露之化合物能夠形成酸鹽和/或鹼鹽。特定的鹽形式係藥學上可接受的鹽。如本文所用，「藥學上可接受的鹽」係安全且有效地用於在哺乳動物，特別是人類中使用的鹽。
本文所述之肽類樹枝狀大分子的合適的鹽形式包括例如酸加成鹽，該酸加成鹽可源自例如無機酸（例如，鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等）或有機酸（例如，甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、順丁烯二酸、丙二酸、琥珀酸、反丁烯二酸、酒石酸、均苯三甲酸、檸檬酸、乳酸、苯乙酸、苯甲酸、苦杏仁酸、甲磺酸、萘二磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、三氟乙酸、水楊酸、磺柳酸等）。特定的酸加成鹽係鹽酸鹽。
本文所述之肽類樹枝狀大分子的合適的鹽形式包括例如鹼加成鹽，該鹼加成鹽可源自例如無機鹼（例如，鈉、鉀、銨鹽和來自週期表第I至XII列的金屬（例如鈣、鎂、鐵、銀、鋅、銅等）的氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽）或有機鹼（例如一級胺、二級胺和三級胺、取代胺（包括天然存在的取代胺）、環胺、鹼性離子交換樹脂等）。某些有機胺包括但不限於異丙基胺、苄乙二胺青黴素（benzathine）、膽鹼鹽（cholinate）、二乙醇胺、二乙胺、離胺酸、葡甲胺、哌𠯤和三木甲胺。另外的合適鹽的列表可以例如見於以下中：「Remington's Pharmaceutical Sciences [雷明頓藥物科學]」, 第20版, Mack Publishing Company [麥克出版公司], Easton, Pa.[賓夕法尼亞州伊斯頓], (1985)；也見於Stahl和Wermuth的「Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use [藥用鹽手冊：特性、選擇和使用]」（約翰威立國際出版公司（Wiley-VCH）, 德國魏因海姆（Weinheim, Germany）, 2002）。 本文使用的肽類樹枝狀大分子術語
本申請描述了一種肽類樹枝狀大分子，其包含一或多個源生自如本文所述之具有式 (I)的經修飾離胺酸的殘基。在本文中提及肽類樹枝狀大分子時，這係指包含胺基酸殘基的3維結構，其中殘基之一的側鏈，例如離胺酸的ɛ-胺形成分支點，從而產生後續代，將分子構建成三維大分子。肽類樹枝狀大分子包含至少一個分支點，形成具有至少一代（G1）的非線性分子。
本文使用了以下術語： • 第 0 代：肽類樹枝狀大分子內第一分支點之前的胺基酸殘基序列。 • 分支點：側鏈因開始新一代的胺基酸殘基的新增而被修飾的胺基酸殘基。 • 代：分支點之間的胺基酸殘基，其中每個後續系列代被編號（G1、G2、G3…）。 • 靶向基團：對特定細胞類型或器官具有親和力的部分，例如基於糖、小分子、肽和/或抗體的部分。
按照慣例，先繪製肽的N末端胺基酸，最後繪製C末端胺基酸（從左到右書寫）。
除非另有說明，離胺酸（LYS）係指未經修飾的離胺酸。
在胺基酸可為手性的任何實施方式中，這可以指D-胺基酸。
在胺基酸可為手性的任何實施方式中，這可以指L-胺基酸。
在胺基酸可為手性的任何實施方式中，胺基酸可為L-胺基酸和D-胺基酸之混合物。 肽類樹枝狀大分子
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指經由允許精確控制其組成物和純度的技術合成的肽類樹枝狀大分子。合適的技術包括固相肽合成。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指其中分支點、第0代和後續代一起包含少於120個胺基酸殘基之肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指其中分支點、第0代和後續代一起包含少於100個胺基酸殘基之肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指其中分支點、第0代和後續代一起包含少於80個胺基酸殘基之肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指其中分支點、第0代和後續代一起包含少於60個胺基酸殘基之肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指其中分支點、第0代和後續代一起包含約52個胺基酸殘基之肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指其中分支點、第0代和後續代一起包含52個胺基酸殘基之肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，肽類樹枝狀大分子可呈鹽形式。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，肽類樹枝狀大分子包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、以及一或多個白胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，肽類樹枝狀大分子包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、以及一或多個精胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，肽類樹枝狀大分子包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、以及一或多個離胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，肽類樹枝狀大分子包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、一或多個精胺酸殘基、以及一或多個離胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，肽類樹枝狀大分子包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、一或多個白胺酸殘基、以及一或多個離胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，肽類樹枝狀大分子包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、一或多個精胺酸殘基、以及一或多個白胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，至少一代包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、以及一或多個白胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，至少一代包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、以及一或多個精胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，至少一代包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、以及一或多個離胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，至少一代包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、一或多個精胺酸殘基、以及一或多個離胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，至少一代包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、一或多個白胺酸殘基、以及一或多個離胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，至少一代包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、一或多個精胺酸殘基、以及一或多個白胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，一代或多代包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、以及一或多個白胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，一代或多代包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、以及一或多個精胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，一代或多代包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、以及一或多個離胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，一代或多代包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、一或多個精胺酸殘基、以及一或多個離胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，一代或多代包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、一或多個白胺酸殘基、以及一或多個離胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，一代或多代包含一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、一或多個精胺酸殘基、以及一或多個白胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，側鏈pKa ＞ 7.4的胺基酸%為25%-50%。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，側鏈pKa ＞ 7.4的胺基酸%為25%-30%。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，側鏈pKa ＞ 7.4的胺基酸%為30%-35%。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，側鏈pKa ＞ 7.4的胺基酸%為35%-40%。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，側鏈pKa ＞ 7.4的胺基酸%為40%-45%。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，側鏈pKa ＞ 7.4的胺基酸%為45%-50%。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，側鏈pKa = 4.0-6.5的胺基酸%為25%-50%。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，側鏈pKa = 4.0-6.5的胺基酸%為25%-30%。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，側鏈pKa = 4.0-6.5的胺基酸%為30%-35%。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，側鏈pKa = 4.0-6.5的胺基酸%為35%-40%。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，側鏈pKa = 4.0-6.5的胺基酸%為40%-45%。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，側鏈pKa = 4.0-6.5的胺基酸%為45%-50%。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，在後續代的胺基酸殘基中，側鏈pKa ＞ 7.4的%為25%-50%，且側鏈pKa = 4.0-6.5的%為25%-50%。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，肽類樹枝狀大分子包含具有式 (II)的肽類樹枝狀大分子： ({X 3}{X 2}{X 1}) 8( {BP} {X 3}{X 2}{X 1}) 4( {BP} {X 3}{X 2}{X 1}) 2 {BP} (II)其中： X 1、X 2、或X 3之一係鹼性胺基酸殘基； X 1、X 2、或X 3中的另一個係疏水性胺基酸殘基； X 1、X 2、或X 3中的剩餘者係源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基；並且 BP係分支點胺基酸殘基。
在式 (II)中，一個X 1基團附接到BP胺基酸的α-胺，另一個附接到側鏈上的反應基團上，例如胺基基團，例如附接到離胺酸的ɛ-胺。具有式 (II)的肽類樹枝狀大分子具有以下結構： 。
在具有式 (II)的肽類樹枝狀大分子中，同一代內的X 1胺基酸殘基可能相同或不同，且/或不同代間的X 1胺基酸殘基可能相同或不同。同樣分別適用於X 2和X 3。
在一個實施方式中，X 1係鹼性胺基酸殘基。
在一個實施方式中，X 1係疏水性胺基酸殘基。
在一個實施方式中，X 1係源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基。
在一個實施方式中，X 2係鹼性胺基酸殘基。
在一個實施方式中，X 2係疏水性胺基酸殘基。
在一個實施方式中，X 2係源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基。
在一個實施方式中，X 3係鹼性胺基酸殘基。
在一個實施方式中，X 3係疏水性胺基酸殘基。
在一個實施方式中，X 3係源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基。
在一個實施方式中： X 1係鹼性胺基酸殘基； X 2係疏水性胺基酸殘基；並且 X 3係源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基。
在一個實施方式中： X 3係鹼性胺基酸殘基； X 2係疏水性胺基酸殘基；並且 X 1係源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基。
X 1、X 2、或X 3之一係鹼性胺基酸殘基。鹼性胺基酸殘基係具有能夠攜帶正電荷的側鏈的胺基酸殘基。
在一個實施方式中，鹼性胺基酸殘基選自精胺酸、鳥胺酸和離胺酸。
在一個實施方式中，鹼性胺基酸殘基係精胺酸。
在一個實施方式中，鹼性胺基酸殘基係鳥胺酸。
在一個實施方式中，鹼性胺基酸殘基係離胺酸。
在一個實施方式中，X 1選自精胺酸、鳥胺酸和離胺酸。
在一個實施方式中，X 1係精胺酸。
在一個實施方式中，X 1係鳥胺酸。
在一個實施方式中，X 1係離胺酸。
在一個實施方式中，X 2選自精胺酸、鳥胺酸和離胺酸。
在一個實施方式中，X 2係精胺酸。
在一個實施方式中，X 2係鳥胺酸。
在一個實施方式中，X 2係離胺酸。
在一個實施方式中，X 3選自精胺酸、鳥胺酸和離胺酸。
在一個實施方式中，X 3係精胺酸。
在一個實施方式中，X 3係鳥胺酸。
在一個實施方式中，X 3係離胺酸。
X 1、X 2、或X 3之一係疏水性胺基酸殘基。疏水性胺基酸殘基係側鏈主要由碳和氫構成的胺基酸殘基，具有排斥水的傾向。
在一個實施方式中，疏水性胺基酸殘基選自丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸和纈胺酸。
在一個實施方式中，疏水性胺基酸殘基係丙胺酸。
在一個實施方式中，疏水性胺基酸殘基係異白胺酸。
在一個實施方式中，疏水性胺基酸殘基係白胺酸。
在一個實施方式中，疏水性胺基酸殘基係苯丙胺酸。
在一個實施方式中，疏水性胺基酸殘基係色胺酸。
在一個實施方式中，疏水性胺基酸殘基係酪胺酸。
在一個實施方式中，疏水性胺基酸殘基係甲硫胺酸。
在一個實施方式中，疏水性胺基酸殘基係纈胺酸。
在一個實施方式中，X 1選自丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸和纈胺酸。
在一個實施方式中，X 1係丙胺酸。
在一個實施方式中，X 1係異白胺酸。
在一個實施方式中，X 1係白胺酸。
在一個實施方式中，X 1係苯丙胺酸。
在一個實施方式中，X 1係色胺酸。
在一個實施方式中，X 1係酪胺酸。
在一個實施方式中，X 1係甲硫胺酸。
在一個實施方式中，X 1係纈胺酸。
在一個實施方式中，X 2選自丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸和纈胺酸。
在一個實施方式中，X 2係丙胺酸。
在一個實施方式中，X 2係異白胺酸。
在一個實施方式中，X 2係白胺酸。
在一個實施方式中，X 2係苯丙胺酸。
在一個實施方式中，X 2係色胺酸。
在一個實施方式中，X 2係酪胺酸。
在一個實施方式中，X 2係甲硫胺酸。
在一個實施方式中，X 2係纈胺酸。
在一個實施方式中，X 3選自丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸和纈胺酸。
在一個實施方式中，X 3係丙胺酸。
在一個實施方式中，X 3係異白胺酸。
在一個實施方式中，X 3係白胺酸。
在一個實施方式中，X 3係苯丙胺酸。
在一個實施方式中，X 3係色胺酸。
在一個實施方式中，X 3係酪胺酸。
在一個實施方式中，X 3係甲硫胺酸。
在一個實施方式中，X 3係纈胺酸。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，肽類樹枝狀大分子包含如本文定義的具有式 (II)的肽類樹枝狀大分子，其中： X 1係精胺酸； X 2係白胺酸； X 3係源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基；並且 BP係離胺酸。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，肽類樹枝狀大分子包含如本文定義的具有式 (II)的肽類樹枝狀大分子，其中： X 1係源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基； X 2係白胺酸； X 3係精胺酸；並且 BP係離胺酸。 第 0 代
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，肽類樹枝狀大分子包含與肽類樹枝狀大分子中的第一分支點胺基酸附接的稱為「第0代」的胺基酸殘基序列。第0代胺基酸殘基序列可以在C末端、或N末端，特別是C末端。例如，具有第0代胺基酸殘基序列的肽類樹枝狀大分子可以說明如下： 其中第一分支點係離胺酸，上圖中的第0代序列可以如下附接： 其中「 ..」代表分子的其餘部分。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，肽類樹枝狀大分子在第一代之前的分支點胺基酸的C末端包含第0代胺基酸序列。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，肽類樹枝狀大分子在第一代之前的分支點胺基酸的N末端包含第0代胺基酸序列。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列包含一或多個甘胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列包含一個甘胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列包含兩個甘胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列包含三個甘胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列包含一或多個纈胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列包含纈胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列包含一或多個瓜胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列包含瓜胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列包含一或多個絲胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列包含絲胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列包含一或多個半胱胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列包含半胱胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列可以終止於半胱胺酸殘基。末端半胱胺酸允許藉由硫醇化學進行額外的功能化。在另一個實施方式中，第0代序列可以終止於離胺酸、絲胺酸、酪胺酸和/或胺基酸的反應性衍生物例如疊氮苯基丙胺酸。胺基酸的其他反應性衍生物包括含有疊氮化物、炔烴、環戊二烯和四𠯤基團的那些。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列終止於半胱胺酸殘基，其中末端羧基基團已被醯胺化形成C(O)NH 2基團。醯胺化使COOH基團呈惰性並降低肽的總電荷並更好地模擬天然肽。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列包含甘胺酸、纈胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、丙胺酸、離胺酸、苯丙胺酸和/或半胱胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列包含甘胺酸、纈胺酸、瓜胺酸、絲胺酸和/或半胱胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列包含甘胺酸、纈胺酸、瓜胺酸、絲胺酸和半胱胺酸殘基。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列由GLY-VAL-CIT-GLY-GLY-SER-CYS（SEQ ID NO 5）組成。
在任何實施方式中，在提及第0代胺基酸序列時，第0代序列包含序列VAL-CIT、VAL-ALA、LYS-PHE、GLY-GLY-PHE-GLY（SEQ ID NO 1）或GLY-PHE-LEU-GLY（SEQ ID NO 2）。 分支點
分支點係側鏈因開始新一代的胺基酸殘基的新增而被修飾的胺基酸殘基。分支點在下圖中標記為BP： 當分支點係離胺酸時，離胺酸可以形成上圖中的分支點，如下所示： 其中「 ..」代表分子的其餘部分。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，肽類樹枝狀大分子內的分支點可為相同或不同的胺基酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，肽類樹枝狀大分子內的分支點可為相同的胺基酸殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指其中離胺酸形成一或多個分支點的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指其中離胺酸形成所有分支點的肽類樹枝狀大分子。 代
肽類樹枝狀大分子包含多代。代可以說明如下： 其中G1代表第1代，G2代表第2代，G3代表第3代，它們統稱為代。可以藉由向G3代中的末端X 3基團添加另一個分支點（BP）胺基酸然後添加G4代胺基酸殘基序列（例如另外的X 3-X 2-X 1基團），以此類推來添加另一代。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由5個胺基酸殘基組成的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由4個胺基酸殘基組成的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由3個胺基酸殘基組成的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由2個胺基酸殘基組成的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由4個或更多個胺基酸殘基組成的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由3個或更多個胺基酸殘基組成的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由2個或更多個胺基酸殘基組成的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由多達5個胺基酸殘基組成的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由多達4個胺基酸殘基組成的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由多達3個胺基酸殘基組成的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由相同肽鏈組成的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由每代中相同肽鏈組成的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由不同肽鏈組成的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由每代中不同肽鏈組成的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含含有鹼性胺基酸殘基的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含含有疏水性胺基酸殘基的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含含有鹼性胺基酸殘基和疏水性胺基酸殘基的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含含有鹼性胺基酸殘基、疏水性胺基酸殘基和源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含含有一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、以及一或多個白胺酸殘基的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含含有一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、以及一或多個精胺酸殘基的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含含有一或多個源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基、一或多個精胺酸殘基以及一或多個白胺酸殘基的多代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含含有ARG-LEU-LYS（經修飾）的一代或多代的肽類樹枝狀大分子，其中LYS（經修飾）係源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由ARG-LEU-LYS（經修飾）組成的一代或多代的肽類樹枝狀大分子，其中LYS（經修飾）係源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含含有ARG-LEU-LYS（經修飾）的所有代的肽類樹枝狀大分子，其中LYS（經修飾）係源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由ARG-LEU-LYS（經修飾）組成的所有代的肽類樹枝狀大分子，其中LYS（經修飾）係源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含含有LYS（經修飾）-LEU-ARG的一代或多代的肽類樹枝狀大分子，其中LYS（經修飾）係源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由LYS（經修飾）-LEU-ARG組成的一代或多代的肽類樹枝狀大分子，其中LYS（經修飾）係源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含含有LYS（經修飾）-LEU-ARG的所有代的肽類樹枝狀大分子，其中LYS（經修飾）係源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含由LYS（經修飾）-LEU-ARG組成的所有代的肽類樹枝狀大分子，其中LYS（經修飾）係源自如本文定義的經修飾離胺酸的殘基。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含一代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含兩代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含三代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含四代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含五代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指一代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指兩代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指三代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指四代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指五代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含多於一代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含多於兩代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含多於三代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含多於四代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含少於六代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含少於五代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含少於四代的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及肽類樹枝狀大分子時，這可以指包含少於三代的肽類樹枝狀大分子。 聚乙二醇肽類樹枝狀大分子
在另一實施方式中，本文所述之肽類樹枝狀大分子可進一步包含生物相容的親水聚合物，例如聚乙二醇或聚肌胺酸基團。
聚乙二醇（PEG）係由(OCH2CH2) n-重複亞基組成的聚合物，其中通常n ＞ 3且 ＜ 250。通常使用環氧乙烷的開環聚合進行合成。PEG聚合物可為線性的或支鏈的。支鏈PEG通常具有三到三十個從中心核心基團發出的PEG鏈。
在一個實施方式中，本文所述之肽類樹枝狀大分子可包含聚乙二醇基團，在本文稱為「聚乙二醇肽類樹枝狀大分子」或「PEG肽類樹枝狀大分子」。PEG基團可以幫助穩定奈米顆粒並形成「隱形層」，藉由空間遮罩減少非特異性蛋白質相互作用。
PEG基團可以如下視需要地藉由連接基團附接到肽類樹枝狀大分子的第0代胺基酸序列中的末端胺基酸殘基：
PEG基團可以藉由末端-O-基團或藉由PEG的末端-CH 2-基團附接到肽類樹枝狀大分子；並且可以視需要地藉由連接基團附接到第0代胺基酸序列中末端胺基酸殘基的胺或羧基。PEG基團還可以視需要地藉由連接基團附接到末端胺基酸殘基側鏈上的反應基團，例如末端半胱胺酸側鏈上的-SH基團，特別地其中末端半胱胺酸的末端羧基基團也被醯胺化。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇肽類樹枝狀大分子時，在未附接到肽類樹枝狀大分子的PEG基團之末端可以有修飾，或者該末端可為氫。聚乙二醇基團末端合適的修飾係例如C 1-4烷基，例如甲基；或C 1-4烷氧基，例如甲氧基。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇肽類樹枝狀大分子時，在未附接到肽類樹枝狀大分子的PEG基團之末端可以有反應基團，或者該末端可為氫。合適的反應基團包括順丁烯二醯亞胺、疊氮化物、炔烴（例如C 2-6炔烴）和環戊二烯。在PEG軛合到肽類樹枝狀大分子之前或之後，該反應基團可用於附接放射性標記、染料和靶向細胞的配體等種類。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇肽類樹枝狀大分子時，在聚乙二醇基團和肽類樹枝狀大分子之間可存在連接基團。合適的連接基團為C 1-4烷基胺基，例如-CH 2-CH 2-NH-（形成例如PEG-CH 2-CH 2-NH-PD或PEG-NH-CH 2-CH 2-PD）；或C 1-4伸烷基，例如-CH 2-CH 2-（形成例如PEG-CH 2-CH 2-PD）；其中PD係肽類樹枝狀大分子。
當聚乙二醇基團附接到 末端胺基酸殘基側鏈上的反應基團，例如末端半胱胺酸側鏈上的-SH基團時，可以採用各種方法來附接聚乙二醇基團。通常這使得聚乙二醇基團藉由連接基基團 附接到肽類樹枝狀大分子。例如，用藉由醯胺鍵連接到聚乙二醇的3-順丁烯二醯亞胺基丙酸官能基官能化的聚乙二醇係硫醇反應性試劑。聚乙二醇分子的另一端可為以甲基終止的。使用這種性質的官能化聚乙二醇基團在PEG基團和肽類樹枝狀大分子之間產生連接基基團的反應可以說明如下： 其中「PD-SH」中的「SH」係指半胱胺酸側鏈上的硫醇，PD係肽類樹枝狀大分子，「n」係-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的數量。
包含支鏈PEG基團的進一步官能化PEG基團的實例包括： 這種包含支鏈PEG基團的肽類樹枝狀大分子的實例係： 其中n係-CH 2CH 2O-重複亞基的數量，並且其中∑ n（所有n個基團組合起來的總和）為4-250。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指分子量範圍在0.5-30 kDa之間的聚合物。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指分子量範圍在2-20 kDa之間的聚合物。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指分子量範圍在4-11 kDa之間的聚合物。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指分子量範圍在1-6 kDa之間的聚合物。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指分子量範圍為約2 kDa的聚合物。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指分子量範圍為約5 kDa的聚合物。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指分子量範圍為約10 kDa的聚合物。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＞ 3。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＞ 10。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＞ 20。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＞ 30。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＞ 50。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＞ 100。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＞ 150。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＞ 200。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＞ 250。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＜ 300。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＜ 250。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＜ 200。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＜ 150。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＜ 100。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＜ 50。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＜ 40。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＜ 30。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＜ 20。
在任何實施方式中，在提及聚乙二醇時，這可以指 包含-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的聚合物，其中n ＜ 10。 靶向基團
在另一實施方式中，本文所述之 肽類樹枝狀大分子可進一步包含靶向基團。靶向基團係指與細胞結合和/或促進細胞內化的靶向部分。靶向基團可以如下視需要地藉由連接基團附接至肽類樹枝狀大分子的PEG基團：
在任何實施方式中，在提及靶向基團時，靶向基團可以選自肽、抗體、糖或小分子。
可視需要地藉由連接基團附接到PEG基團的合適靶向肽包括： •   轉移受體靶向肽，例如Ac-KGGGAWSIID CSMNY CLYIEG（SEQ ID NO 3）（其中粗體「 C」表示半胱胺酸藉由二硫鍵交聯）（例如https://doi.org/10.21954/ou.ro.0000d744）； •   環狀RGD肽，例如靶向腫瘤和發炎脈管系統中的a 3b 5整合素的那些，例如Cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys)（SEQ ID NO 4）： ；以及 •   肌肉靶向肽，例如ASSLNIA（SEQ ID NO 6）（T I Samoylova 1, B F Smith. Muscle Nerve [肌肉與神經].1999年4月;22(4):460-6; doi: 10.1002/(sici)1097-4598(199904)22:4＜460::aid-mus6＞3.0.co;2-l）。
合適的靶向抗體包括： •   T細胞靶向抗體，例如抗CD3 Fab（Van Wauwe等人 J Immunol [免疫學雜誌], 1980, 124(6):2708-2713）；以及 •   胞膜窖靶向抗體，例如Meca32單體FC（例如以下中所述之抗體：Gabriela M. Marchetti,等人 Commun Biol.[通訊-生物] 2019; 2: 92; 於2019年3月7日線上發表.doi: 10.1038/s42003-019-0337-2及類似文獻） 合適的靶向糖包括那些靶向肝臟中無唾液酸醣蛋白受體的糖，例如含有例如如下分子的GalNac和Tri-GalNac： 和
合適的小分子靶向劑包括葉酸。
對於一些靶向基團，可以使用靶向基團上的-SH基團來附接到PEG基團，使用的方法為與上述PEG基團的附接所述類似的方法。通常這使得靶向基團藉由連接基基團附接到聚乙二醇基團。有利的試劑係可以藉由硫醇化學與肽類樹枝狀大分子和靶向基團軛合的雙功能PEG試劑。一種這樣的試劑係PEG試劑，其中分子的兩端都被順丁烯二醯亞胺基丙酸酯基團官能化。使用這種性質的雙官能化聚乙二醇基團在PEG基團和肽類樹枝狀大分子之間以及在PEG基團和靶向基團之間產生連接基基團的反應之簡化版本可以說明如下： 其中「PD-SH」中的「SH」係指半胱胺酸側鏈上的硫醇，「TG-SH」中的「SH」係指靶向基團中的反應性硫醇，PD係肽類樹枝狀大分子，TG係靶向基團，「n」係-(OCH 2CH 2) n-重複亞基的數量。
肽靶向基團或具有反應性胺（例如胺官能化糖）的另一個靶向基團可以使用可替代的活化PEG試劑附接到PEG基團。通常這也使得靶向基團藉由連接基基團附接到聚乙二醇基團。有利的試劑係雙功能PEG試劑，其可以藉由硫醇化學與肽類樹枝狀大分子軛合，藉由醯胺鍵與肽靶向基團軛合。一種這樣的試劑係PEG試劑，其中分子的一端用順丁烯二醯亞胺基丙酸酯基團官能化，而另一端用四氟苯基（TFP）酯官能化。使用這種性質的雙官能化聚乙二醇基團的反應之簡化版本可以說明如下： 末端胺基基團可視需要地為經修飾的胺基基團
在一個實施方式中，肽類樹枝狀大分子的末端胺基基團可為未經修飾的。未經修飾的末端胺基基團意指該基團係-NH 2基團。
在一個實施方式中，肽類樹枝狀大分子的末端胺基基團可為經修飾的胺基基團。
修飾通常是化學修飾，其包括但不限於添加化學基團、產生新鍵和去除化學基團。經修飾的胺基基團為熟悉該項技術者所熟知，並且包括但不限於乙醯化、脫胺基、N-低級烷基、N-二低級烷基、受限烷基（例如支鏈、環狀、稠合、金剛烷基）和N-醯基修飾。經修飾的胺基基團還可包括但不限於內部醯胺鍵，該內部醯胺鍵涉及N-末端（例如焦麩胺酸（pyroGlu））保護的胺基基團或者附接放射性標記、螢光標籤或親和標籤（例如生物素）。經修飾的胺基基團還可以包括但不限於緩衝基團(2-胺基-6-{[6-(𠰌啉-4-基)吡啶-3-羰基]胺基}己酸；2-胺基-6-[(硫代𠰌啉-3-羰基)胺基]己酸；和2-胺基-6-[2-(𠰌啉-4-基)乙醯胺基]己酸，以及交聯基團（即環戊二烯）。
胺基基團的合適保護基團係，例如醯基基團，例如烷醯基基團，例如乙醯基；烷氧基羰基基團，例如甲氧基羰基、乙氧基羰基或三級丁氧基羰基基團；芳基甲氧基羰基基團，例如苯甲氧基羰基；或芳醯基基團，例如苯甲醯基。特定的經修飾胺基基團係醯胺基。特定的經修飾胺基基團係乙醯胺基。
低級烷基為C 1-4烷基，包括三級丁基、丁基、丙基、異丙基、乙基和甲基。 末端羧基基團可視需要地為經修飾的羧基基團
在一個實施方式中，肽類樹枝狀大分子的末端羧基基團為未經修飾的。未經修飾的末端羧基基團意指該基團係-C(O)OH基團。
在一個實施方式中，肽類樹枝狀大分子的末端羧基基團為經修飾的羧基基團。
修飾通常是化學修飾，其包括但不限於添加化學基團、產生新鍵和去除化學基團。改性羧基基團為熟悉該項技術者所熟知，並且包括但不限於醯胺、低級烷基醯胺、受限烷基（例如支鏈、環狀、稠合、金剛烷基）、二烷基醯胺和低級烷基酯改性。改性羧基基團還可包括但不限於受保護的羧基基團或者附接放射性標記、螢光標籤或親和標籤（例如生物素）或靶向細胞的配體。羧基基團的合適保護基團係，例如酯化基團，例如甲基乙基基團、三級丁基基團或苄基基團。特定的改性羧基基團係-CO 2NH 2。特定的改性羧基基團係C-末端醯胺化。特定的改性羧基基團係甲醯胺基團。特定的改性羧基基團係 N-(C 1-4烷基)胺甲醯基基團。 藥物活性劑
本文所述之組成物和方法適用於遞送藥物活性劑。藥物活性劑係能夠對人體或動物體發揮藥理作用，從而導致治療結果的任何物質。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自遺傳物質、經化學修飾的核酸、寡核苷酸、治療性肽、化療劑、蛋白質、蛋白質軛合物、顯像劑、與CRISPR技術相關的蛋白質核酸、以及天然病毒組分，如衣殼或酶。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自遺傳物質。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自核酸。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自遺傳物質（例如DNA或RNA）。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自遺傳物質（例如DNA和RNA）。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自遺傳物質（例如DNA和/或RNA）。
在任何實施方式中，在提及DNA時，這可為質體、線性DNA、短單股或雙股DNA、微環和微串等最小化載體、折疊DNA（包括髮夾結構和十字形DNA）、以及病毒衍生DNA。
在任何實施方式中，在提及RNA時，這可為mRNA或siRNA。
在任何實施方式中，在提及RNA時，這可為mRNA、gRNA和/或siRNA。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自DNA。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自RNA。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自DNA和mRNA。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自mRNA和gRNA。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自DNA和gRNA。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自DNA、mRNA和gRNA。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自寡核苷酸。
在任何實施方式中，在提及寡核苷酸時，這可為反義寡核苷酸（ASO）、RNA干擾（RNAi）和適體RNA。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，該藥物活性劑可選自化學改性核酸。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，該藥物活性劑可選自治療性肽。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，該藥物活性劑可選自化療劑。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，該藥物活性劑可選自蛋白質。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自蛋白質軛合物。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自顯像劑。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自與CRISPR技術相關的蛋白質核酸。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自與CRISPR技術相關的DNA、gRNA和/或mRNA。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自天然病毒組分，如衣殼或酶。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自編碼治療性蛋白質（例如單株抗體）的核酸（即質體和mRNA），例如，阿昔單抗（abciximab）、阿達木單抗（adalimumab）、阿法塞特（alefacept）、阿侖單抗（alemtuzumab）、巴厘昔單抗（basiliximab）、貝利木單抗（belimumab）、貝洛托舒單抗（bezlotoxumab）、卡那單抗（canakinumab）、賽妥珠單抗（certolizumab pegol）、西妥昔單抗（cetuximab）、達克珠單抗（daclizumab）、地諾單抗（denosumab）、依法利珠單抗（efalizumab）、戈利木單抗（golimumab）、英夫利昔單抗（inflectra）、伊匹單抗（ipilimumab）、依奇珠單抗（ixekizumab）、那他珠單抗（natalizumab）、納武單抗（nivolumab）、奧拉單抗（olaratumab）、奧馬珠單抗（omalizumab）、帕利珠單抗（palivizumab）、帕尼單抗（panitumumab）、派姆單抗（pembrolizumab）、利妥昔單抗（rituximab）、托珠單抗（tocilizumab）、曲妥珠單抗（trastuzumab）、蘇金單抗（secukinumab）、以及優特克單抗（ustekinumab）；酶，例如，阿加糖酶β（agalsidase beta）、伊米苷酶（imiglucerase）、維拉苷酶α（velaglucerase alfa）、他利苷酶（taliglucerase）、阿葡醣苷酶α（alglucosidase alfa）、阿葡醣苷酶α、拉羅尼酶（laronidase）、靜脈注射艾杜硫酶（idursulfase intravenous）、以及加硫酶（galsulfase）；生長因子；和細胞介素，例如IL-2和IFN-α。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自編碼治療性蛋白質（例如單株抗體）的核酸（即質體和mRNA）；酶；生長因子；和細胞介素。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自編碼治療性蛋白質（例如單株抗體）的核酸（即質體和mRNA）；酶；生長因子；轉錄因子；和細胞介素。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自編碼單株抗體的核酸（即質體和mRNA）。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自編碼MEDI8852和STK11的核酸（即質體和mRNA）。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自編碼單株抗體的核酸（即質體和mRNA），該單株抗體可選自阿昔單抗、阿達木單抗、阿法塞特、阿侖單抗、巴厘昔單抗、貝利木單抗、貝洛托舒單抗、卡那單抗、賽妥珠單抗、西妥昔單抗、達克珠單抗、地諾單抗、依法利珠單抗、戈利木單抗、英夫利昔單抗、伊匹單抗、依奇珠單抗、那他珠單抗、納武單抗、奧拉單抗、奧馬珠單抗、帕利珠單抗、帕尼單抗、派姆單抗、利妥昔單抗、托珠單抗、曲妥珠單抗、蘇金單抗、以及優特克單抗。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自編碼酶的核酸（即質體和mRNA）。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自編碼酶的核酸（即質體和mRNA），該酶可選自阿加糖酶β、伊米苷酶、維拉苷酶α、他利苷酶、阿葡醣苷酶α、阿葡醣苷酶α、拉羅尼酶、靜脈注射艾杜硫酶、以及加硫酶。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自編碼生長因子的核酸（即質體和mRNA）。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自編碼轉錄因子的核酸（即質體和mRNA）。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自編碼轉錄因子HNF-4α的核酸（即質體和mRNA）。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自編碼細胞介素的核酸（即質體和mRNA）。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自編碼選自IL-2和IFN-α的細胞介素的核酸（即質體和mRNA）。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自siRNA。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自mRNA。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自gRNA。
在任何實施方式中，在提及藥物活性劑時，藥物活性劑可選自siRNA，該siRNA用於降低包括調節致癌基因、生長因子和細胞介素表現的應用中的蛋白質表現。
在任何實施方式中，在藥物活性劑選自核酸時，肽類樹枝狀大分子鹼性胺基酸殘基:核酸磷酸鹽（N:P）的比率為約2 : 1。
在任何實施方式中，在藥物活性劑選自核酸時，肽類樹枝狀大分子鹼性胺基酸殘基:核酸磷酸鹽（N:P）的比率為約4 : 1。
在任何實施方式中，在藥物活性劑選自核酸時，肽類樹枝狀大分子鹼性胺基酸殘基:核酸磷酸鹽（N:P）的比率為約6 : 1。
在任何實施方式中，在藥物活性劑選自DNA時，肽類樹枝狀大分子鹼性胺基酸殘基:DNA磷酸鹽（N:P）的比率為約2 : 1。
在任何實施方式中，在藥物活性劑選自DNA時，肽類樹枝狀大分子鹼性胺基酸殘基:DNA磷酸鹽（N:P）的比率為約4 : 1。
在任何實施方式中，在藥物活性劑選自DNA時，肽類樹枝狀大分子鹼性胺基酸殘基:DNA磷酸鹽（N:P）的比率為約6 : 1。
在任何實施方式中，在藥物活性劑選自RNA時，肽類樹枝狀大分子鹼性胺基酸殘基:RNA磷酸鹽（N:P）的比率為約2 : 1。
在任何實施方式中，在藥物活性劑選自RNA時，肽類樹枝狀大分子鹼性胺基酸殘基:RNA磷酸鹽（N:P）的比率為約4 : 1。
在任何實施方式中，在藥物活性劑選自RNA時，肽類樹枝狀大分子鹼性胺基酸殘基:RNA磷酸鹽（N:P）的比率為約6 : 1。
在任何實施方式中，在藥物活性劑選自RNA時，肽類樹枝狀大分子鹼性胺基酸殘基:DNA和RNA磷酸鹽（N:P）的比率為約2 : 1。
在任何實施方式中，在藥物活性劑選自RNA時，肽類樹枝狀大分子鹼性胺基酸殘基:DNA和RNA磷酸鹽（N:P）的比率為約4 : 1。
在任何實施方式中，在藥物活性劑選自RNA時，肽類樹枝狀大分子鹼性胺基酸殘基:DNA和RNA磷酸鹽（N:P）的比率為約6 : 1。 藥物遞送系統
在一個實施方式中，提供了藥物遞送系統，其包含含有一或多個源自如本文所述之經修飾離胺酸的殘基之肽類樹枝狀大分子。藥物遞送系統係可用於將藥物活性劑遞送到人體或動物體內例如細胞內的遞送系統。
在一個實施方式中，提供了肽類樹枝狀大分子在藥物遞送系統中之用途，該肽類樹枝狀大分子包含一或多個源自如本文所述之經修飾離胺酸的殘基。
在一個實施方式中，提供了用作藥物遞送系統的肽類樹枝狀大分子，該肽類樹枝狀大分子包含一或多個源自如本文所述之經修飾離胺酸的殘基。
在一個實施方式中，提供了用於藥物活性劑的遞送系統，該遞送系統包含含有一或多個源自如本文所述之經修飾離胺酸的殘基之肽類樹枝狀大分子。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可以包含一或多種不同的肽類樹枝狀大分子，例如兩種不同的肽類樹枝狀大分子。可以使用肽類樹枝狀大分子的混合物來摻入靶向部分、穩定奈米顆粒和/或增效地組合不同的特性。
在一個實施方式中，提供了藥物遞送系統，其包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及「一或多種肽類樹枝狀大分子」時，這可以指一種肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及「一或多種肽類樹枝狀大分子」時，這可以指兩種不同肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在提及「一或多種肽類樹枝狀大分子」時，這可以指多於一種不同的肽類樹枝狀大分子。
在一個實施方式中，提供了用於藥物活性劑的遞送系統，該遞送系統包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含含有聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子，以及含有聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含約1 : 50的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含高於1 : 50的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含低於1 : 50的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含約1 : 20的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含高於1 : 20的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含低於1 : 20的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含約1 : 15的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含高於1 : 15的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含低於1 : 15的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含約1 : 10的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含高於1 : 10的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含低於1 : 10的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含約1 : 5的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含高於1 : 5的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含低於1 : 5的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含約2 : 4的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含高於2 : 4的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含低於2 : 4的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含約1 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含約4 : 2的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含高於4 : 2的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含低於4 : 2的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含約5 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含高於5 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含低於5 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含約10 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含高於10 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含低於10 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含約15 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含高於15 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含低於15 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含約20 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含高於20 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含低於20 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含約50 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含高於50 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物遞送系統可包含低於50 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
如本文所述之肽類樹枝狀大分子與藥物活性劑可以組合，同時在生理等滲緩衝液（例如5%海藻糖或蔗糖、20 mM HEPES或磷酸鹽緩衝液（PBS））中輕輕混合以形成奈米顆粒。該等配製物可立即遞送、儲存在4°C或冷凍乾燥用於長期儲存。
如本文所述之肽類樹枝狀大分子可以如下形式製備：適用於口服投與的形式，例如，作為片劑或膠囊；適用於腸胃外注射（包括靜脈內、皮下、皮內、肌肉內、血管內注射或輸注）的形式；適用於局部投與的形式，如軟膏或乳膏；或適用於直腸投與的形式，如栓劑。特別地，如本文所述之肽類樹枝狀大分子可以以適用於注射（例如，藉由靜脈內、皮下、皮內或肌肉內注射）的形式製備。 另外的賦形劑
在一個實施方式中，可以將另外的賦形劑添加到包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子和藥物活性劑的配製物和組成物中。該等可以增強奈米顆粒的穩定性並增強核酸包裝，從而改善細胞遞送和轉染。
在一個實施方式中，提供了配製物，其包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子和脂質。
在一個實施方式中，提供了配製物，其包含選自1 : 1（w/w）的N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨（DOTMA）和二油醯基磷脂醯乙醇胺（DOPE）的一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子和脂質。
在一個實施方式中，提供了配製物，其包含選自N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨（DOTMA）和二油醯基磷脂醯乙醇胺（DOPE）、(6Z,9Z,28Z,31Z)-庚卅烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基胺基)丁酸酯（MC3）、二硬脂醯磷脂醯膽鹼（DSPC）、二肉豆蔻醯甘油（DMG）、和十七烷酯-9-基8-((2-羥乙基)(6-側氧基-6-(十一烷基氧基)己基)胺基)辛酸酯（SM-102）或膽固醇的混合物的一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子和脂質。 用途
如本文所述之肽類樹枝狀大分子可以用於遞送適合治療廣泛疾病的藥物活性劑，該等疾病包括代謝障礙、免疫學障礙、激素障礙、癌症、血液障礙、遺傳障礙、傳染性疾病、心臟疾病、骨障礙、呼吸障礙、神經障礙、輔助療法、眼部障礙、吸收不良障礙。治療性應用可包括：蛋白質（即用於病毒治療的抗體）的系統表現或靶向遞送（即轉移性腫瘤，體內CAR-T）。
在一個實施方式中，提供了用於療法的藥物遞送系統，其包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子。
在一個實施方式中，提供了用於療法的用於藥物活性劑的遞送系統，該遞送系統包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子。
在一個實施方式中，提供了肽類樹枝狀大分子，其用於將藥物活性劑遞送到細胞。
在一個實施方式中，提供了包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子的藥物遞送系統，該系統用於在治療代謝障礙、免疫學障礙、激素障礙、癌症、血液障礙、遺傳障礙、傳染性疾病、心臟疾病、骨障礙、呼吸障礙、神經障礙、輔助療法、眼部障礙、或吸收不良障礙中使用。
在一個實施方式中，提供了包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子的用於藥物活性劑的遞送系統，該系統用於在治療代謝障礙、免疫學障礙、激素障礙、癌症、血液障礙、遺傳障礙、傳染性疾病、心臟疾病、骨障礙、呼吸障礙、神經障礙、輔助療法、眼部障礙、或吸收不良障礙中使用。
在一個實施方式中，提供了用於基因療法的用於藥物活性劑的遞送系統，該遞送系統包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子。
如本文所用，如本文所述之術語「治療（treatment和treat）」係指逆轉、緩解、延遲疾病或障礙或其一或多種症狀的發作或抑制疾病或障礙或其一或多種症狀的進展。在一些實施方式中，可以在一或多個症狀已經出現之後進行治療。在其他實施方式中，可以在沒有症狀的情況下進行治療。例如，可在症狀發作之前（例如，以症狀的病史為根據和/或以遺傳或其他易感因素為根據）對易感個體進行治療。症狀消退後也可繼續治療，例如以防止或延遲它們復發。 藥物組成物
在一個實施方式中，提供了藥物組成物，其包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在藥物組成物包含一或多種肽類樹枝狀大分子時，藥物組成物可以包含一種肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在藥物組成物包含「一或多種肽類樹枝狀大分子」時，藥物組成物可以包含多於一種不同的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在藥物組成物包含「一或多種肽類樹枝狀大分子」時，藥物組成物可以包含兩種不同的肽類樹枝狀大分子。
在任何實施方式中，在藥物組成物包含「一或多種肽類樹枝狀大分子」時，藥物組成物可以包含至少兩種不同的肽類樹枝狀大分子。
在一個實施方式中，提供了藥物組成物，其包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子和藥物活性劑。
在一個實施方式中，提供了藥物組成物，其包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子。
在一個實施方式中，提供了藥物組成物，其包含兩個或更多個不同的肽類樹枝狀大分子。
在一個實施方式中，提供了組成物，其包含藥物活性劑和一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含含有聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子，以及含有聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含約1 : 50的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含高於1 : 50的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含低於1 : 50的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含約1 : 20的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含高於1 : 20的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含低於1 : 20的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含約1 : 15的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含高於1 : 15的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含低於1 : 15的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含約1 : 10的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含高於1 : 10的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含低於1 : 10的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含約1 : 5的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含高於1 : 5的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含低於1 : 5的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含約2 : 4的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含高於2 : 4的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含低於2 : 4的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含約1 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含約4 : 2的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含高於4 : 2的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含低於4 : 2的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含約5 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含高於5 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含低於5 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含約10 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含高於10 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含低於10 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含約15 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含高於15 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含低於15 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含約20 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含高於20 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含低於20 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含約50 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含高於50 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，如本文所述之藥物組成物可包含低於50 : 1的包含聚乙二醇基團的肽類樹枝狀大分子: 包含聚乙二醇基團和靶向基團兩者的肽類樹枝狀大分子的比率。
在一個實施方式中，提供了用於療法的藥物組成物，其包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子。
在一個實施方式中，提供了用於療法的藥物組成物，其包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子、和藥物活性劑。
在一個實施方式中，提供了包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子的藥物組成物，該藥物組成物用於在治療代謝障礙、免疫學障礙、激素障礙、癌症、血液障礙、遺傳障礙、傳染性疾病、心臟疾病、骨障礙、呼吸障礙、神經障礙、輔助療法、眼部障礙、或吸收不良障礙中使用。
在一個實施方式中，提供了包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子和藥物活性劑的藥物組成物，該藥物組成物用於在治療代謝障礙、免疫學障礙、激素障礙、癌症、血液障礙、遺傳障礙、傳染性疾病、心臟疾病、骨障礙、呼吸障礙、神經障礙、輔助療法、眼部障礙、或吸收不良障礙中使用。
在一個實施方式中，提供了用於基因療法的藥物組成物，其包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子、和藥物活性劑。
在一個實施方式中，提供了用於基因療法的藥物組成物，其包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子。 治療方法
在一個實施方式中，提供了治療代謝障礙、免疫學障礙、激素障礙、癌症、血液障礙、遺傳障礙、傳染性疾病、心臟疾病、骨障礙、呼吸障礙、神經障礙、輔助療法、眼部障礙、或吸收不良障礙的方法，該方法包括向所述動物投與有效量的藥物組成物，該藥物組成物包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子。
在一個實施方式中，提供了治療代謝障礙、免疫學障礙、激素障礙、癌症、血液障礙、遺傳障礙、傳染性疾病、心臟疾病、骨障礙、呼吸障礙、神經障礙、輔助療法、眼部障礙、或吸收不良障礙的方法，該方法包括向所述動物投與有效量的藥物組成物，該藥物組成物包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子和藥物活性劑。
在一個實施方式中，提供了基因療法方法，該方法包括投與一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子。
在一個實施方式中，提供了基因療法方法，該方法包括投與一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子和藥物活性劑。 藥物組成物之用途
在一個實施方式中，提供了包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子的藥物組成物在製造用於治療代謝障礙、免疫學障礙、激素障礙、癌症、血液障礙、遺傳障礙、傳染性疾病、心臟疾病、骨障礙、呼吸障礙、神經障礙、輔助療法、眼部障礙、或吸收不良障礙的藥物中之用途。
在一個實施方式中，提供了包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子和藥物活性劑的藥物組成物在製造用於治療代謝障礙、免疫學障礙、激素障礙、癌症、血液障礙、遺傳障礙、傳染性疾病、心臟疾病、骨障礙、呼吸障礙、神經障礙、輔助療法、眼部障礙、或吸收不良障礙的藥物中之用途。
在一個實施方式中，提供了包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子的藥物組成物用於基因療法之用途。
在一個實施方式中，提供了包含一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子和藥物活性劑的藥物組成物用於基因療法之用途。 套組（ kit ）
在一個實施方式中，提供了套組，該套組包括： a) 第一單元中之一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子； b) 第二單位中的藥物活性劑；以及 c) 含有所述第一和第二單元的容器裝置。
在一個實施方式中，提供了套組，該套組包括： a) 第一單元中之一或多種如本文所述之肽類樹枝狀大分子； b) 第二單位中的藥物活性劑；以及 c) 含有所述第一和第二單元的容器裝置。 d) 使用說明書。
無
[ 圖 1] ：如實例2中所述之肽類樹枝狀大分子（PD）合成的代表性示意圖。
[ 圖 2A 和圖 2B] ：如實例7中所述，肽奈米顆粒（PNP）抗陰離子解離的穩定性（A）和組織蛋白酶B降解性（B）的結果。奈米顆粒的穩定性對於將完整的核酸有效遞送到靶細胞中至關重要；然而，核酸必須在細胞攝取後釋放才能發揮其功能。為此，PD被設計為在細胞攝取後酶促降解。確定了具有刺激響應性釋放的物質具有增強的功效和較低的毒性。結果表明，與使用在硫酸聚葡萄醣濃度超過50 µg/mL時容易釋放DNA的PD1、未經修飾的（NM）PD和PD3(His)配製的奈米顆粒相比，PD3(MN)和PD3(TM)奈米顆粒對陰離子解離的抗性明顯更強。此外，相對於未經修飾的PD3和所有PD2配製物，PD3(M)、PD3(MN)、和PD3(TM)響應於組織蛋白酶B活性容易釋放DNA。
[ 圖 3A 、圖 3B 和圖 3C]：如實例8中所述從體外轉染篩選獲得的結果。不同細胞系的評估如圖3A) 人非小肺癌細胞系H1299和圖3B) 小鼠肌管細胞系C2C12所示。一式四份收集發光並表示為平均值 +/- 標準偏差。在圖3C中，在各種細胞系（H1299、C2C12、HEK393、和HEPG2）中篩選了兩種不同的NP配製物PD3(MN)和PD3(TM)，以確定不同應用的最佳表現者。該等結果表明，MN修飾在肺細胞（H1299，源自淋巴的人非小細胞肺癌細胞系）和肌肉細胞（C2C12，小鼠成肌細胞）中具有優勢。可替代地，TM修飾在源自包括腎臟（HEK393，人胎腎細胞）和肝臟（HEPG2，人肝細胞瘤細胞系）在內的過濾器官的細胞系中表現最好。
[ 圖 4]：從實例9中所述之螢光素酶mRNA小鼠表現實驗獲得的結果。DNA NP翻譯的體內翻譯在小鼠肌肉內表現研究中進行了測試。表現了報告蛋白螢光素酶以允許即時跟蹤表現。觀察到表現並確定表現在1個月的監測期內係一致的。每週使用IVIS評估表現，並一式四份收集發光並表示為平均值 +/- 標準偏差。結果表明，MeO-PEG-PD(MN) 藉由IM注射在體內有效地遞送DNA，從而穩定表現一個月。
[ 圖 5A 和圖 5B] .從實例10中所述之治療性表現實驗獲得的結果。圖5A顯示了抗流感mAb MEDI8852的結果，且圖5B顯示了腫瘤抑制因子 絲胺酸/蘇胺酸激酶11（STK11）的結果。MEDI8852藉由間接ELISA進行量化，並一式三份收集表現水平，並表示為平均值 +/- 標準偏差。質譜被用作表現的額外確認。使用西方墨點法對STK11進行量化。NP的目標係使用宿主細胞表現治療性蛋白質。該等結果表明，NP能夠針對治療劑的作用模式在目的細胞系中體內表現多種治療劑，包括mAb（即MEDI8852（抗流感mAb））和酶（即腫瘤抑制劑絲胺酸/蘇胺酸激酶11（STK11））。
[ 圖 6A 、圖 6B和 圖 6C] 。如實例11中所述，從體外靶向DNA NP轉染獲得的結果。靶向PD奈米顆粒在各種細胞系中進行了測試，並確定其促進轉染。在H1299中，相對於商業轉染對照聚乙烯亞胺（PEI），TfR（圖6A）和cRGD（圖6B）增強了總體表現水平（遞送GFP，螢光）和動力學（遞送Gwiz螢光素酶；發光）。相對於非靶向NP，在C2C12和CT26中觀察到類似的轉染改善（圖6C）。靶向DNA遞送可用於提高轉染效率和/或實現細胞特異性表現。PD平臺經過精心設計，具有靈活的靶向策略，允許結合一系列基於肽和抗體的靶向配體（如實例3和5所示），從而顯著促進轉染。此外，藉由聚乙二醇化和靶向，實現了高度特異性表現。該等結果表明靶向可用於增強多種非常不同的細胞系中的表現。
[ 圖 7]：從實例12中所述之靶向肺的NP體內實驗獲得的結果。將靶向PV1的奈米顆粒IV投與於BALB/C小鼠，並藉由IVIS對螢光素酶的表現進行8天監測。第3天和第8天的離體成像表明，具有優化配體密度的奈米顆粒僅在靶向的肺內具有顯著表現。細胞特異性遞送極大地拓寬了基於核酸的療法的潛在應用。該等結果表明，基於抗體的靶向部分可用於生成靶向PD NP，且PV1靶向可用於靶向肺。在該實例中，靶向PV1的NP被證明可以在小鼠肺內實現為期至少8天的高度特異性表現。
[ 圖 8]：如實例13中所述，從用pDNA與mRNA PD3(MN) 奈米顆粒轉染H1299細胞獲得的結果。用mRNA或pDNA製備的奈米顆粒處理H1299細胞。使用Incucyte對細胞進行螢光成像以即時監測轉染動力學，並使用儀器軟體量化總紅色螢光強度作為轉染的量度。mRNA不需要複雜的核定位即可成功表現轉基因，並且已被證明比遞送DNA時促進更快的表現動力學。我們的NP被證明可以成功地包裝和遞送mRNA，並有望實現比遞送DNA時更快的表現動力學。該等結果表明mRNA表現明顯更快，但是到48小時時，表現水平與遞送pDNA時相似。
[ 圖 9]：從實例14中所述之螢光素酶mRNA小鼠表現實驗獲得的結果。用與MeO PEG-PD3(MN) 複合的pDNA或mRNA對CD小鼠進行肌肉內治療。使用IVIS評估表現。一式四份收集發光並表示為平均值 +/- 標準偏差。該等結果表明，mRNA和pDNA都可以使用PD平臺在體內肌肉內遞送，其中mRNA NP具有更快的表現動力學。
[ 圖 10]：如實例15中所述，從小鼠實驗中的抗流感mAb MEDI8852表現獲得的結果。藉由IV注射用mRNA NP處理BALB/c小鼠，並藉由ELISA量化MEDI8852的表現。該等結果表明在8天內檢測到顯著水平的 mAb，並證實了PD在體內表現治療性蛋白質的能力。
[ 圖 11]：如實例16中所述，用具有不同抗CD3靶向fab展示的mCherry mRNA/PD3(MN) NP轉染未活化的原代T細胞獲得的結果。該等結果表明非靶向NP具有轉染T細胞的能力；然而，當靶向fab以低（25%）到中等（50%）水平顯示時，CD3靶向顯著增強了遞送。
[ 圖 12]：如實例17中所述，藉由報告基因測定和西方墨點法監測CTNNB1緘默化而獲得的結果。在靶向癌基因CTNNB1的結腸癌細胞系SW480中證明了NP遞送siRNA的能力。藉由西方墨點法，證明1%（w/w）DOPE : DOTMA = 1 : 1的PD3(MN)和PD3(TM)可在至少5天內有效地緘默化CTNNB1。該等結果表明PD NP可以有效地將siRNA遞送至靶細胞。
[ 圖 13A 、圖 13B和 圖 13C] ：如實例18中所述，用具有不同靶向肽cRGD展示的PD3(MN) NP緘默化鏈蛋白-B獲得的結果。CTNNB1報告基因活性SW480 TopFlash（圖13A）、CTNNB1蛋白質水平SW480（圖13B）和Colo205增殖（圖13C）。對於許多應用，需要定位遞送。為了確定是否可以使用NP平臺實現「開/關」遞送，製備了具有不同量的cRGD展示的聚乙二醇化NP，並用於轉染結腸癌細胞系SW480和Colo205。確定聚乙二醇化可停止或減少緘默化，而在NP上安裝cRGD恢復了NP活性。該等結果表明聚乙二醇化可用於減少非特異性細胞攝取，而靶向可用於恢復NP活性。
[ 圖 14]：如實例18中所述，從小鼠轉移性結腸癌模型中的腫瘤體積獲得的結果。在第8、9、15和16天（用黑色箭頭表示），向具有已建立結腸癌細胞系Colo205腫瘤的小鼠靜脈內投與具有不同程度cRGD靶向的NP。組包括未處理組（A）、投與非靶向NP小鼠組（B）和投與具有中等（C）至高cRGD（D）展示的靶向奈米顆粒的小鼠組，其中每個數據集代表一隻小鼠。還確定了隨時間變化的平均值（E）和研究的最後一天（F）。在小鼠模型中評估了靶向siRNA NP的體內翻譯。與非靶向NP相比，確定高水平的cRGD展示顯著減緩腫瘤生長。該等結果表明靶向cRGD的NP可以實現增強的siRNA遞送，並突出了靶向配體密度的重要性。
[ 圖 15]：如實例19中所述，用螢光標記的DNA（Cy5）和mRNA（Cy5）配製的NP的螢光譜。帶有Cy5標記的DNA（圖1）的NP不會被藍色LED激發，因此在其發射波長（650-700 nm）處未檢測到螢光。帶有Cy3標記的mRNA（圖2）的NP在其發射峰約550-600被激發並發出螢光。同樣，用Cy5標記的DNA製備的NP與帶有Cy3標記的mRNA的NP組合（圖3）在Cy3發射峰發出螢光。重要的是，用Cy5標記的DNA和Cy3標記的mRNA的1 : 1混合物製備的NP（圖4）顯示在約560-700 nm的Cy5發射處的發射增加，而在約550-600 nm的Cy3發射峰處的螢光強度相應降低。這表明樣本4中的DNA和mRNA非常接近（＜ 5 nm），從而使mRNA上的Cy3螢光團的螢光共振能量轉移（FRET）能夠激發標記DNA上的Cy5螢光團。這係mRNA和DNA共封裝於肽類樹枝狀大分子NP中的證據。
[ 圖 16]：mRNA/DNA雜合PDID NP在H1299細胞中的表現動力學如實例19中所述。DNA表現用GFP螢光面積測量，mRNA表現用mCherry螢光面積測量。GFP表現在100小時內增加，而mRNA表現在60小時左右達到峰值。藉由重疊螢光訊息量化的DNA/mRNA共表現量與mRNA表現具有相似的動力學，在65小時左右達到峰值。該等結果表明DNA和mRNA成功地共同遞送至細胞。
[ 圖 17]：mRNA/DNA雜合PDID NP在已分化C2C12細胞中的表現動力學如實例19中所述。已分化C2C12肌肉細胞融合到肌管中並且不分裂，使該等細胞難以轉染。DNA表現用GFP螢光面積測量，mRNA表現用mCherry表現面積測量。GFP表現在75小時內增加，隨後是平臺訊息。mRNA表現在60小時左右達到峰值，然後緩慢下降。藉由重疊螢光訊息量化的DNA/mRNA共表現量與mRNA表現具有相似的動力學，在60小時左右達到峰值。該等結果表明DNA和mRNA成功地共同遞送至無分裂細胞。 實例 本文所使用的縮寫•   NP：奈米顆粒； •   PD：肽類樹枝狀大分子； •   PDID：肽類樹枝狀大分子細胞內遞送 •   胺基酸「CIT」：瓜胺酸 •   本文用以下縮寫來表示經修飾的離胺酸： LYS(MN) 或K(MN) LYS(TM) 或K(TM) LYS(M) 或K(M)
以下聚合物和配體摻入肽類樹枝狀大分子中：
否 名稱 結構 與含 PEG 基團的附接點
1 MeO PEG m-dPEG® 36-MAL；量子生物設計公司（Quanta BioDesign），俄亥俄州普萊恩城（Plain City Ohio） N/A
2 Mal-PEG Bis-Mal-PEG 19（BroadPharm公司，加利福尼亞州聖地牙哥（San Diego, CA）） N/A
3 TfR Ac-KGGGAWSIID CSMNY CLYIEG（SEQ ID NO 3，其中粗體「 C」表示半胱胺酸藉由二硫鍵交聯） 離胺酸ɛ-胺
4 cRGD Cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys)（SEQ ID NO 4） 離胺酸ɛ-胺
5 抗CD3 Van Wauwe等人 J Immunol [免疫學雜誌], 1980, 124(6):2708-2713 環戊二烯
6 Meca32 由Gabriela M. Marchetti等人改良：Commun Biol.[通訊-生物] 2019; 2: 92; 2019年3月7日線上發表. doi: 10.1038/s42003-019-0337-2 環戊二烯
7 GalNac N-乙醯半乳糖胺配體：β-GalNAc-PEG3-胺（薩塞克斯研究公司（Sussex Research），加拿大安大略省（Ontario Canada）） 胺
8 Tri-GalNac （薩塞克斯研究公司，加拿大安大略省） 胺
[表1] 摻入PD中的靶向部分的匯總。 實例 1經修飾離胺酸的製備 方法1：1-{[(𠰌啉-4-基)乙醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮的合成
將(𠰌啉-4-基)乙酸（1 g，6.89 mmol）溶解於二氯甲烷（DCM）（25 mL）中，且添加N-羥基丁二醯亞胺（NHS）（872 mg，7.58 mmol）和N-乙基-N′-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）（1.60 g，8.35 mmol）。將該反應在室溫下攪拌1 h，然後通過2” x 3”矽膠墊過濾。用DCM（3 x 25 mL）洗滌該墊，並合併濾液和洗滌液並濃縮以給出呈白色固體的1-{[(𠰌啉-4-基)乙醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮（1.3 g，78%）。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) d 3.75 (d, J=3.6 Hz, 4H), 3.57 (s, 2H), 2.85 (s, 4H), 2.67 (d, J=4.2 Hz, 4H); MS (ESI) 計算值：242.09，實測值：243.3 (M+1)。 方法2：1-{[6-(𠰌啉-4-基)吡啶-3-羰基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮的合成
將6-(𠰌啉-4-基)吡啶-3-羧酸（350 mg，1.68 mmol）在室溫下伴隨攪拌溶解於DCM（25 mL）中。添加NHS（213 mg，1.85 mmol），隨後添加EDC·HCl（418 mg，2.18 mmol）。將該反應混合物在室溫下攪拌1 h，並且然後通過2” x 3”矽膠墊過濾。用DCM（3 x 25 mL）和乙酸乙酯（25 mL）洗滌該墊。合併濾液和洗滌液並濃縮以給出呈白色固體的1-{[6-(𠰌啉-4-基)吡啶-3-羰基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮（325 mg，63%）。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) d 8.89 (s, 1H), 8.07 (dd, J = 9.3 Hz, 1.5 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 3.80 (d, J = 4.2 Hz, 4H) 3.72 (d, J = 4.2 Hz, 4H), 2.89 (s, 4H)。MS (ESI) 計算值：305.1，實測值：306.3 (M+1)。 方法3：三級丁基3-{[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]羰基}硫代𠰌啉-4-甲酸酯的合成
將4-(三級丁氧基羰基)硫代𠰌啉-3-羧酸（1 g，4.04 mmol）在室溫下伴隨攪拌溶解於DCM（25 mL）中。添加NHS（511 mg，4.44 mmol），隨後添加EDC·HCl（1.01 g，5.25 mmol）。將該反應混合物在室溫下攪拌1 h，並且然後通過2” x 3”矽膠墊過濾。用DCM（3 x 25 mL）洗滌該墊，並合併濾液和洗滌液並濃縮以給出呈白色固體的三級丁基3-{[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]羰基}硫代𠰌啉-4-甲酸酯（1.3 g，93.4%）。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) d 5.38 (br s, 1H), 4.43-4.22 (m, 1H), 3.46-3.21 (m, 1H), 3.19-3.10 (m, 1 H), 3.06-2.97 (m, 1H), 2.85 (s, 4H), 2.81-2.62 (m, 1H), 2.61-2.42 (m, 1H), 1.47 (s, 9H)。MS (ESI) 計算值：345.4 (M+1)。 方法4：N2-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)-N6-(6-𠰌啉代菸鹼醯基)-L-離胺酸之合成
將茀甲氧羰基氯L-離胺酸（Fmoc-Lys-OH）（15.3 g，41.53 mmol，1.2當量）在室溫下在機械攪拌下溶解於THF-水（1 : 1，800 mL）中。一次性添加上述製備的酯（方法2）在DCM中的溶液，隨後添加DIPEA（10.73 g，82.99 mmol，2.4當量）。將反應在室溫下進一步攪拌直至起始材料（TLC，2 h）耗盡，然後添加乙酸乙酯（EtOAc）（250 mL）。將混合物用HCl（1 M，200 mL）酸化，倒入分液漏斗，並分離各層。用EtOAc（2 x 250 mL）萃取水層。將有機層合併，用鹽水（200 mL）洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾並在真空下濃縮。獲得呈淺棕色油狀殘餘物的粗產物，將其溶解於THF中，吸附在矽膠上，並經矽膠柱（7” x 3”）藉由急速層析法純化。將柱用在己烷中的50%乙酸乙酯和100%乙酸乙酯洗滌，以在真空抽吸下洗脫產物。將含有所需產物的級分合併並在真空下濃縮以提供呈灰白色固體的N2-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)-N6-(6-𠰌啉代菸鹼醯基)-L-離胺酸（12.6 g，65%）。 1H NMR (500 MHz, CDCl 3) δ 9.26 (br s, 1H), 8.62 (d, J = 1.5Hz, 1H), 7.93 (dd, J = 2.5, 9Hz, 1H), 7.71 (d, J = 7.5Hz, 2H), 7.53 (dd, J = 4.5, 7.5Hz, 2H), 7.35 (t, J = 7.5Hz, 2H), 7.23 (q, J = 6.5Hz, 2H), 6.59 (t, J = 5Hz, 1H), 6.48 (d, J = 9Hz, 1H), 5.99 (d, J = 8Hz, 1H), 4.41 (dd, J = 7.5, 12.5Hz, 1H), 4.31 (dd, J = 12, 18Hz, 2H), 4.15 (d, J = 7Hz, 1H), 3.71 (t, = 4.5Hz, 4H), 3.56-3.32 (m, 6H), 1.98-1.87 (m, 1H), 1.86-1.75 (m, 1H), 1.71-1.57 (m, 2H), 1.56-1.39 (m, 2H) ppm；13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 175.2, 166.6, 159.9, 156.6, 146.9, 144.1, 143.9, 141.4, 137.7, 127.9, 127.3, 125.3, 120.1, 119.5, 106.3, 67.2, 66.6, 53.8, 47.3, 45.3, 39.5, 32.0, 28.9, 22.4 ppm；C31H34N4O6 [M+H]+的MS (ESI) 準確質量計算值：559.26，實測值：559.35。 方法5：(2S)-2-胺基-6-{[6-(𠰌啉-4-基)吡啶-3-羰基]胺基}己酸(N6-(6-𠰌啉代菸鹼醯基)-L-離胺酸)的合成（LYS(MN)） 程序1
N2-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)-N6-(6-𠰌啉代菸鹼醯基)-L-離胺酸（方法4）的Fmoc保護基團可例如使用DMF中20%的哌啶藉由本領域已知的標準程序去除。 程序2
將經修飾離胺酸溶解在700 µL的NMP（15 mg，26.87 µmol）中。隨後伴隨攪拌將300 µL哌啶添加到溶液（哌啶 : NMP = 7 : 3；1 mL）中。將反應在室溫下攪拌30分鐘。隨後使用離心（4000 g，10分鐘，4°C）使經修飾離胺酸沈澱並在冷二乙醚（10 mL）中洗滌3次。使用 1H NMR (500 MHz, CDCl 3)確認Fmoc去除 1H NMR (500 MHz, CDl3) δ 11.89 (s, 1H), 8.85 (dd, 1H), 7.89 (dd, 1H), 7.34 (dd, 1H), 3.52-3.71(m, 8H), 3.35 (t, 1H), 2.72-2.61 (t, 2H), 2.01-1.57 (m, 6H) ppm。MS (ESI)準確質量計算值[M+H2O]+：352.55，實測值：352.04。 方法6：N2-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)-N6-(4-(三級丁氧基羰基)硫代𠰌啉-3-羰基)-L-離胺酸之合成
將Fmoc-L-Lys-OH（8.94 g，24.26 mmol，1.2當量）在室溫下在機械攪拌下溶解於THF-水（1 : 1，800 mL）中。一次性添加上述製備的活化酯（方法3）在DCM中的溶液，隨後添加DIPEA（6.27 g，48.53 mmol，2.4當量）。將反應在室溫下進一步攪拌直至起始材料（TLC，2 h）消耗，然後添加EtOAc（250 mL）。將混合物用HCl（1 M，200 mL）酸化，倒入分液漏斗，並分離各層。用EtOAc（2 x 250 mL）萃取水層。將有機層合併，用鹽水（200 mL）洗滌，經無水Na2SO4乾燥，過濾並在真空下濃縮。獲得呈淡黃色油狀殘餘物的粗產物，將其溶解於DCM中，吸附在矽膠上，並經矽膠柱（7” x 3”）藉由急速層析法純化。將柱用在己烷中的50%-70%乙酸乙酯洗滌，以在真空抽吸下洗脫產物。將含有所需產物的級分合併並在真空下濃縮以提供呈灰白色固體的N2-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)-N6-(4-(三級丁氧基羰基)硫代𠰌啉-3-羰基)-L-離胺酸（9.1 g，75%）。 1H NMR (500 MHz, CDCl 3) δ 7.75 (d, J = 7.5Hz, 2H), 7.63-7.51 (m, 2H), 7.38 (t, J = 7.5Hz, 2H), 7.29 (t, J = 7.5Hz, 2H), 5.71 (dd, J = 7.5, 23Hz, 1H), 4.97 (br s, 1H), 4.57-4.23 (m, 4H), 4.20 (t, J = 7Hz, 1H), 3.51-3.18 (m, 3H), 3.17-2.96 (br s, 1H), 2.77 (d, J = 12.5Hz, 1H), 2.70-2.58 (m, 1H), 2.38 (d, J = 12.5Hz, 1H), 1.98-1.86 (m, 1H), 1.85-1.73 (m, 1H), 1.66-1.53 (m, 2H), 1.46 (br s, 12H) ppm；13C NMR (125 MHz, CDCl 3) δ 175.0, 156.4, 155.8, 143.9, 141.4, 127.9, 127.3, 125.3, 120.1, 67.3, 60.6, 53.8, 47.3, 39.2, 31.5, 29.1, 28.5, 26.7, 22.3 ppm；C 31H 39N 3O 7S [M+Na]+的MS (ESI)準確質量計算值：620.24，實測值：620.35。 方法7：(2S)-2-胺基-6-[(硫代𠰌啉-3-羰基)胺基]己酸 (N6-(硫代𠰌啉-3-羧基)-L-離胺酸)的合成（LYS(TM)） 程序1
N2-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)-N6-(4-(三級丁氧基羰基)硫代𠰌啉-3-羰基)-L-離胺酸（方法6）的Fmoc保護基團可例如使用DMF中20%哌啶藉由本領域已知的標準程序去除。類似地，Boc保護基團可例如使用在DCM中的30% TFA藉由本領域已知的標準程序去除。 程序2
將經修飾離胺酸溶解在700 µL的NMP（15 mg，25.12 µmol）中。隨後伴隨攪拌將300 µL哌啶添加到溶液（哌啶 : NMP = 7 : 3；1 mL）中。將反應在室溫下攪拌30分鐘以去除Fmoc保護基團。隨後使用離心（4000 g，10分鐘，4°C）使經修飾離胺酸沈澱並在冷二乙醚（10 mL）中洗滌3次。在過夜風乾後，將產物溶解在50% TFA : DCM（1 mL）中並在室溫下攪拌15分鐘。使用旋轉蒸發儀去除TFA:DCM溶液，並沈澱並在冷乙醚中洗滌2次。使用 1H NMR確認Fmoc去除：δ 11.56-12.04 (1H, br), 7.34 (s, 1H), 3.65-3.76 (dd, 2H), 3.42 (t, J= 7.3 Hz, 1H), 3.01-3.15 (m, 2H), 2.70-2.89(m, 2H), 2.55-2.61 (t, J= 5.6 Hz, 2H),  2.06-2.18 (m, 2H), 1.74-1.85 (m, 2H), 1.58-1.64 (q, 2H) 1.05 (1H, s) ppm，和MS (ESI) 準確質量計算值[M+H2O]+：279.22，實測值：279.62。 方法8：N2(1-{[(𠰌啉-4-基)乙醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮)-L-離胺酸之合成
可採用以下程序來產生N2(1-{[(𠰌啉-4-基)乙醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮)-L-離胺酸，可在室溫下在機械攪拌下將Fmoc-L-Lys-OH（1.2當量）溶解於THF-水（1 : 1，800 mL）中。可以一次性添加上述製備的活化酯在DCM中的溶液，隨後添加DIPEA（2.4當量）。可將反應在室溫下進一步攪拌直至起始材料（TLC，2 h）消耗，然後可添加EtOAc（250 mL）。可將混合物用HCl（1 M，200 mL）酸化，倒入分液漏斗，並分離各層。可將水層用EtOAc（2 x 250 mL）萃取。可將有機層合併，用鹽水（200 mL）洗滌，經無水Na2SO4乾燥，過濾並在真空下濃縮。可將粗產物溶解於DCM中，吸附在矽膠上，並經矽膠柱（7” x 3”）藉由急速層析法純化。可將柱用在己烷中的50%-70%乙酸乙酯洗滌，以在真空抽吸下洗脫產物。可將含有所需產物的級分合併並在真空下濃縮以提供N2-(N2(1-{[(𠰌啉-4-基)乙醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮)-L-離胺酸。 方法9：(2S)-2-胺基-6-[2-(𠰌啉-4-基)乙醯胺基]己酸(N6-(2-𠰌啉代乙醯基)-L-離胺酸)的合成（LYS(M)） 程序1
N2(1-{[(𠰌啉-4-基)乙醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮)-L-離胺酸（方法8）的Fmoc保護基團可例如使用DMF中的20%哌啶藉由本領域已知的標準程序去除。 程序2
將經修飾離胺酸溶解在700 µL的NMP（15 mg，25.02 µmol）中。隨後伴隨攪拌將300 µL哌啶添加到溶液（哌啶 : NMP = 7 : 3；1 mL）中。將反應在室溫下攪拌30分鐘。隨後使用離心（4000 g，10分鐘，4°C）使經修飾離胺酸沈澱並在冷二乙醚（10 mL）中洗滌3次。使用H-NMR確認Fmoc去除：1H NMR (500 MHz, CDl3) δ 12.01 (br s, 1H), 3.62-3.74 (m, 4H), 3.40 (t, 1H), 3.29 (s, 2H), 3.10 (t, 1H), 2.59-2.70 (m, 4H), 1.88-2.01 (m, 2H), 1.58-1.65 (m, 2H), and 1.46-1.56 (q, 2H)和MS (ESI) 準確質量計算值[M+H2O]+：273.17，實測值：273.33。 實例 2含經修飾的離胺酸的肽類樹枝狀大分子的合成
合成了一系列肽類樹枝狀大分子（表2）。經修飾的離胺酸在肽合成過程中使用上述方法5、7和9中合成的經修飾離胺酸（在表中標記為「*」）直接摻入，或者它們隨後在樹脂裂解後的溶液中利用N-羥基丁二醯亞胺化學和上述方法1-3中合成的化合物藉由離胺酸側鏈的修飾（ε-胺）摻入。合成PD1-PD3和PD3(His) 用於比較，並含有未經修飾的離胺酸（PD 1-3）或代替離胺酸的組胺酸（PD3(His)）。
肽類樹枝狀大分子 序列 隨附序列表中的 WIPO 標準 ST.26 序列片段（序列 ID ） （ X = 非標準胺基酸）
PD1 ({LEU}{ARG}) 8( {LYS} {LEU}{ARG}) 4( {LYS} {LEU}{ARG}) 2 {LYS} {GLY}{VAL}{CIT}{GLY}{GLY}{SER}{CYS} LRKLRKLRKGVXGGSC（SEQ ID NO 7） LRKLRKLR（SEQ ID NO 8） LRKLR（SEQ ID NO 9）
PD2 ({ARG}{LEU}{LYS}) 8( {LYS} {ARG}{LEU}{LYS}) 4( {LYS} {ARG}{LEU}{LYS}) 2 {LYS} {GLY}{VAL}{CIT}{GLY}{GLY}{SER}{CYS} RLKKRLKKRLKKGVXGGSC（SEQ ID NO 10） RLKKRLKKRLK（SEQ ID NO 11） RLKKRLK（SEQ ID NO 12）
PD3 ({LYS}{LEU}{ARG}) 8( {LYS} {LYS}{LEU}{ARG}) 4( {LYS} {LYS}{LEU}{ARG}) 2 {LYS} {GLY}{VAL}{CIT}{GLY}{GLY}{SER}{CYS} KLRKKLRKKLRKGVXGGSC（SEQ ID NO 13） KLRKKLRKKLR（SEQ ID NO 14） KLRKKLR（SEQ ID NO 15）
PD3(His) ({HIS}{LEU}{ARG}) 8( {LYS} {HIS}{LEU}{ARG}) 4( {LYS} {HIS}{LEU}{ARG}) 2 {LYS} {GLY}{VAL}{CIT}{GLY}{GLY}{SER}{CYS} HLRKHLRKHLRKGVXGGSC（SEQ ID NO 16） HLRKHLRKHLR（SEQ ID NO 17） HLRKHLR（SEQ ID NO 18）
PD1(M) ({LEU}{LYS(M)}) 8( {LYS} {LEU}{LYS(M)}) 4( {LYS} {LEU}{LYS(M)}) 2 {LYS} {GLY}{VAL}{CIT}{GLY}{GLY}{SER}{CYS} LXKLXKLXKGVXGGSC（SEQ ID NO 19） LXKLXKLX（SEQ ID NO 20）
PD1(MN) ({LEU}{LYS(MN)}) 8( {LYS} {LEU}{LYS(MN)}) 4( {LYS} {LEU}{LYS(MN)}) 2 {LYS} {GLY}{VAL}{CIT}{GLY}{GLY}{SER}{CYS} LXKLXKLXKGVXGGSC（SEQ ID NO 21） LXKLXKLX（SEQ ID NO 22）
PD1(TM) ({LEU}{LYS(TM)}) 8( {LYS} {LEU}{LYS(TM)}) 4( {LYS} {LEU}{LYS(TM)}) 2 {LYS} {GLY}{VAL}{CIT}{GLY}{GLY}{SER}{CYS} LXKLXKLXKGVXGGSC（SEQ ID NO 23） LXKLXKLX（SEQ ID NO 24）
PD2(M) ({ARG}{LEU}{LYS(M)}) 8( {LYS} {ARG}{LEU}{LYS(M)}) 4( {LYS} {ARG}{LEU}{LYS(M)}) 2 {LYS} {GLY}{VAL}{CIT}{GLY}{GLY}{SER}{CYS} RLXKRLXKRLXKGVXGGSC（SEQ ID NO 25） RLXKRLXKRLX（SEQ ID NO 26） RLXKRLX（SEQ ID NO 27）
PD2(MN) ({ARG}{LEU}{LYS(MN)}) 8( {LYS} {ARG}{LEU}{LYS(MN)}) 4( {LYS} {ARG}{LEU}{LYS(MN)}) 2 {LYS} {GLY}{VAL}{CIT}{GLY}{GLY}{SER}{CYS} RLXKRLXKRLXKGVXGGSC（SEQ ID NO 28） RLXKRLXKRLX（SEQ ID NO 29） RLXKRLX（SEQ ID NO 30）
PD2(TM) ({ARG}{LEU}{LYS(TM)}) 8( {LYS} {ARG}{LEU}{LYS(TM)}) 4( {LYS} {ARG}{LEU}{LYS(TM)}) 2 {LYS} {GLY}{VAL}{CIT}{GLY}{GLY}{SER}{CYS} RLXKRLXKRLXKGVXGGSC（SEQ ID NO 31） RLXKRLXKRLX（SEQ ID NO 32） RLXKRLX（SEQ ID NO 33）
PD3(M) ({LYS(M)}{LEU}{ARG}) 8( {LYS} {LYS(M)}{LEU}{ARG}) 4( {LYS} {LYS(M)}{LEU}{ARG}) 2 {LYS} {GLY}{VAL}{CIT}{GLY}{GLY}{SER}{CYS} XLRKXLRKXLRKGVXGGSC（SEQ ID NO 34） XLRKXLRKXLR（SEQ ID NO 35） XLRKXLR（SEQ ID NO 36）
PD3(MN) ({LYS(MN)}{LEU}{ARG}) 8( {LYS} {LYS(MN)}{LEU}{ARG}) 4( {LYS} {LYS(MN)}{LEU}{ARG}) 2 {LYS} {GLY}{VAL}{CIT}{GLY}{GLY}{SER}{CYS} XLRKXLRKXLRKGVXGGSC（SEQ ID NO 37） XLRKXLRKXLR（SEQ ID NO 38） XLRKXLR（SEQ ID NO 39）
PD3(TM) ({LYS(TM)}{LEU}{ARG}) 8( {LYS} {LYS(TM)}{LEU}{ARG}) 4( {LYS} {LYS(TM)}{LEU}{ARG}) 2 {LYS} {GLY}{VAL}{CIT}{GLY}{GLY}{SER}{CYS} XLRKXLRKXLRKGVXGGSC（SEQ ID NO 40） XLRKXLRKXLR（SEQ ID NO 41） XLRKXLR（SEQ ID NO 42）
PD3(MN)* ({LYS(MN)}{LEU}{ARG}) 8( {LYS} {LYS(MN)}{LEU}{ARG}) 4( {LYS} {LYS(MN)}{LEU}{ARG}) 2 {LYS} {GLY}{VAL}{CIT}{GLY}{GLY}{SER}{CYS} XLRKXLRKXLRKGVXGGSC（SEQ ID NO 43） XLRKXLRKXLR（SEQ ID NO 44） XLRKXLR（SEQ ID NO 45）
PD3(TM)* ({LYS(TM)}{LEU}{ARG}) 8( {LYS} {LYS(TM)}{LEU}{ARG}) 4( {LYS} {LYS(TM)}{LEU}{ARG}) 2 {LYS} {GLY}{VAL}{CIT}{GLY}{GLY}{SER}{CYS} XLRKXLRKXLRKGVXGGSC（SEQ ID NO 46） XLRKXLRKXLR（SEQ ID NO 47） XLRKXLR（SEQ ID NO 48）
[表2].粗體、斜體 {LYS} 係分支點的肽類樹枝狀大分子匯總。*表示肽係用經修飾的離胺酸直接合成的。 程序 a) 藉由直接摻入經修飾的離胺酸或組胺酸的肽類樹枝狀大分子合成
使用標準固相肽合成法藉由在Rink Amide樹脂上的片段縮合來合成肽類樹枝狀大分子。每個片段都是在2-氯三苯甲基樹脂（高度酸不穩定樹脂）上用Fmoc化學合成的，並用三氟乙醇從樹脂中去除，以保持側鏈和N末端上的所有保護基團。然後使用片段和Nα,Nε-二-Fmoc-L-離胺酸作為分支點構建肽類樹枝狀大分子，隨後用三氟乙酸（TFA）從樹脂上切割，導致C末端醯胺化。組裝在圖1中示意性地顯示，其中肽類樹枝狀大分子具有PD3鹼基序列，例如PD3(M)、PD3(MN)、和PD3(TM)。在切割步驟中去除所有保護基團。粗肽藉由高壓液相層析法（HPLC）用水:乙腈梯度純化。純度和質量藉由HPLC和電子噴霧電離（ESI）質譜確認。使用解摺積工具來解釋ESI質譜，其中包含呈不同電荷狀態形式的相同種類。多電荷種類被計算為其單電荷形式，並根據m/z值和峰寬分組在一起，並以原子質量單位（amu）表示。PD1：MW 4540.1 [4540.2 amu]. PD2：MW 7097.1 [7097.5 amu]. PD3：MW 7097.1 [7097.5 amu]. PD3(His)：MW 7223.1 [7223.1 amu]. PD3(MN)*：MW 9760.0 [9759.9 amu]. PD3(TM)*：MW 8905.5 [8905.5 amu]. 程序 b) 在從樹脂上切割樹枝狀大分子中間體後，藉由修飾肽離胺酸 ε- 胺的肽類樹枝狀大分子合成
將2 µmol肽類樹枝狀大分子（PD1、PD2或PD3）懸浮在新製備的0.1 M碳酸氫鈉（pH 8.0）中。將混合物超音波處理10分鐘。在DMAC中製備40 mM的NHS功能化中間體（方法1-3），並在攪拌下逐滴添加到肽溶液（0.5 mM）中。將NHS功能化中間體以1.5莫耳過量添加到每個肽的離胺酸中，以確保100%的離胺酸ε-醯胺轉化。將反應液在室溫下攪拌0.5小時，隨後藉由超速離心（MWCO 3.0 kDa）去除未反應的中間體。電灑游離質譜用於確認修飾。使用解摺積工具來解釋ESI質譜，其中包含呈不同電荷狀態形式的相同種類。多電荷種類被計算為其單電荷形式，並根據m/z值和峰寬分組在一起，並以原子質量單位（amu）表示。PD2(M): MW 9904.9 [9904.9 amu]. PD2(MN)：MW 9759.9 [9808.1 amu (MW+甲酸)]. PD2(TM)：MW 8905.5 [8905.5 amu]. PD3(M)：MW 9904.8 [9905.0 amu]. PD3(MN)：MW 9759.9 [9808.1 amu (MW+甲酸)]. PD3(TM)：MW 8905.5 [8905.6 amu]. 實例 3將靶向部分或聚乙二醇（PEG）結合到肽類樹枝狀大分子上 a) 甲氧基-PEG和Mal-PEG肽類樹枝狀大分子的製備
用順丁烯二醯亞胺功能化的甲氧基-PEG（n = 36）（m-dPEG® 36-MAL；量子生物設計公司，俄亥俄州普萊恩城）和雙順丁烯二醯亞胺PEG（n = 19）（Bis-Mal-PEG 19（BroadPharm公司，加利福尼亞州聖地牙哥））（來自表1的化合物#1和#2）分別製備為在pH 5.5的20 mM檸檬酸鈉緩衝液中的1.25和5 mM溶液。將相同緩衝液中的等體積肽類樹枝狀大分子溶液（按照實例2製備，1 mM）與PEG溶液分別以1.25倍和5倍莫耳過量混合。將反應在室溫攪拌2小時並藉由質譜確認。對於Mal-PEG-PD軛合物，藉由在PBS和水中或在20 mM檸檬酸鈉（pH 5.5）中透析去除過量PEG。電灑游離質譜用於確認修飾。MeO-PEG(36)-PD2(MN) MW 11528.2 (11528.2 amu)、MeO-PEG(36)-PD3(TM): MW 10673.9 (10674.1 amu)、MeO-PEG(36)-PD2(MN): MW 11528.2 (11529.2 amu)、MeO-PEG(36)-PD3(TM): MW 10674.2 (10673.9 amu). Mal-PEG(19)-PD1: MW 8296.4 (8297.2 amu)、Mal-PEG(19)-PD2(MN): MW 10959.3 (10960.3 amu)、Mal-PEG(19)-PD3(MN): MW 10959.3 (10960.3 amu)、和Mal-PEG(19)-PD2(MN): MW 10959.3 (10960.3 amu). b) 靶向PEG-肽類樹枝狀大分子軛合物的製備
靶向肽（表1中的化合物#3-#6）係使用Fmoc化學的標準固相肽合成製備的。在從樹脂上切割之前，用DMF中的10%乙酸酐進行N末端乙醯化。將TFP-PEG（n = 36）-順丁烯二醯亞胺（量子生物設計公司，俄亥俄州普萊恩城）（5 mM）和醯化肽（7.5 mM）溶解在新製備的0.1 M碳酸氫鈉緩衝液（pH 8.0）中，並將肽溶液添加到1.25莫耳過量的PEG溶液。將反應在室溫下攪拌30分鐘，然後將pH降低至5.5，並使用質譜確認軛合。使用Vivaspin柱MWCO 3.5 kDa（西格瑪奧德里奇公司（Sigma Aldrich），密蘇里州聖路易斯（St. Louis, MO））將緩衝液更換為20 mM檸檬酸鈉緩衝液（pH 5.5）。隨後將純化的產物以2倍過量的20 mM檸檬酸鈉緩衝液（pH 5.5）在室溫下添加到肽類樹枝狀大分子（如實例2中製備）中2 h。電灑游離質譜用於確認修飾。使用解摺積工具來解釋ESI質譜，其中包含呈不同電荷狀態形式的相同種類。多電荷種類被計算為其單電荷形式，並根據m/z值和峰寬分組在一起，並以原子質量單位（amu）表示。TfR-PEG-PD3(MN)*: 13855.0 MW (13856.7 amu). cRGD-PEG-PD3(MN)*: 12188.5 MW (12188.2 amu). TfR-PEG-PD3(TM)*: MW 13855.0 MW (13856.7 amu). cRGD-PEG-PD3(TM)*: 12188.5 MW (12188.6 amu). c) 糖-PEG-Mal軛合物的製備
在室溫下，將N,N-二異丙基乙胺（DIPEA）（0.0860 mmol）添加到胺官能化單或三乙醯半乳糖胺（GalNAc）（表1中的化合物#7和8；薩塞克斯研究公司，加拿大安大略省）（0.01620 mmol）和MAL-dPEG®₃₆-TFP酯（量子生物設計公司，俄亥俄州普萊恩城）（0.020261 mmol）在N,N-二甲基甲醯胺（6 mmol）中的溶液中。將反應液在室溫下攪拌1 h並藉由HPLC-MS確認軛合。隨後使用逆相HPLC純化產物。隨後將純化的產物以2倍過量的20 mM檸檬酸鈉緩衝液（pH 5.5）在室溫下添加到肽類樹枝狀大分子（如實例2中製備）中2 h。電灑游離質譜用於確認修飾。使用解摺積工具（安捷倫Mass Hunter定量分析（Agilent Mass Hunter Quantitative Analysis））來解釋ESI質譜，其中包含呈不同電荷狀態形式的相同種類。多電荷種類被計算為其單電荷形式，並根據m/z值和峰寬分組在一起，並以原子質量單位（amu）表示。GalNAc-PD3(TM)* MW 11708.6（片段化：11506.6）[11506.6 amu]. Tri GalNAc-PD3(TM)*: MW 12679.1（片段化：12071.2）[11507.0 amu]. 實例 4肽類樹枝狀大分子/DNA奈米顆粒（NP）自組裝成單分散奈米顆粒
陽離子肽類樹枝狀大分子（PD）與陰離子核酸自組裝成奈米顆粒。使用包括穿透式電子顯微術和動態光散射在內的標準奈米顆粒技術確定NP介於球形之間，直徑為50-75 nm。 a) NP製備
在20 mM HEPES（pH 7.0）中製備等體積DNA（40 µg/mL；Gwiz螢光素酶質體（6732 bp）（Genlantis公司，加利福尼亞州聖地牙哥））和肽類樹枝狀大分子（如實例2製備）溶液。以對應於肽類樹枝狀大分子精胺酸:DNA磷酸鹽（N:P）為2 : 1的濃度製備肽溶液。將DNA溶液逐滴添加到肽溶液中，同時輕輕旋轉以確保顆粒均勻。使DNA/肽奈米顆粒（NP）在室溫下複合30分鐘。NP溶液中DNA的最終濃度為20 µg/mL。 b) 動態光散射
使用Zetasizer ZS（瑪律文公司（Malvern））、Green Laser和ZEN2112石英比色皿收集動態光散射數據。藉由累積擬合分析推導流體動力學直徑和多分散性指數（PDI）。所有數據點代表如表3中所示的三個或更多個單獨製備的樣本的平均值。 c) 穿透式電子顯微術（TEM）
將樣本施加到輝光放電的400目formva塗層銅網格上，用1%乙酸鈾醯負染色，風乾並在透射電子顯微鏡（Tecnai T12，賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific））中在80 kV的工作電壓下進行檢查。使用AMT底部安裝CCD相機和AMT600軟體採集數字圖像。形態學測定如表3所示。
配製物 直徑（ nm ） 形態學
PD1 NP 61.2 +/- 5.4 球體
PD2 NP 69.2 +/- 7.1 球體
PD2(M) NP 91.0 +/- 4.3 球體
PD2(MN) NP 65.3 +/- 6.9 球體
PD2(TM) NP 78.7 +/- 8.2 球體
PD3 NP 65.8 +/- 8.9 球體
PD3(M) NP 90.1 +/- 6.5 球體
PD3(MN) NP 62.0 +/- 5.4 球體
PD3(TM) NP 61.4 +/- 7.4 球體
PD3(His) NP 75.1+/- 5.9 球體
[表3].肽類樹枝狀大分子DNA奈米顆粒（NP）的表徵。所有測量值均來自使用累積擬合分析的強度相關函數。一式三份收集測量值並表示為平均值 +/- 標準偏差。 實例 5肽類樹枝狀大分子/RNA奈米顆粒（NP）自組裝成單分散奈米顆粒
陽離子肽類樹枝狀大分子（PD）與陰離子核酸自組裝成奈米顆粒。使用包括動態光散射在內的標準奈米顆粒技術確定NP直徑為約50 nm。 a) NP製備
在20 mM HEPES（pH 7.0）中製備等體積RNA（40 µg/mL）和肽溶液（如實例2製備）。具體而言，製備了編碼mcherry的cleancap mRNA（Trilink公司，加利福尼亞州聖地牙哥）和靶向CTNNB1的siRNA（Dharmacon公司/Horizon Discovery公司，科羅拉多州拉斐特（Lafayette, CO））。以對應於肽類樹枝狀大分子精胺酸:mRNA磷酸鹽（N:P）比率為4 : 1的濃度製備肽溶液。將RNA溶液逐滴添加到肽溶液中，同時輕輕旋轉以確保顆粒均勻。使RNA/肽奈米顆粒或NP在室溫下複合30分鐘。NP溶液中RNA的最終濃度為20 µg/mL。作為視需要步驟，將Lipofectin®（DOTMA : DOPE（% w/w）= 1）（賽默飛世爾科技公司，麻塞諸塞州沃爾珊）添加到配製物中。Lipofectin®在20 mM HPES（pH 7.0）中稀釋，對應於與RNA的介於1和4之間的w/w %。如前所述，在添加RNA溶液之前立即將Lipofectin®溶液添加到肽類樹枝狀大分子溶液中。含有Lipofectin®的奈米顆粒被標記為「脂質」。 b) 動態光散射
使用Zetasizer ZS（瑪律文公司（Malvern））、Green Laser和ZEN2112石英比色皿收集動態光散射數據。藉由累積擬合分析推導流體動力學直徑和多分散性指數（PDI）。所有數據點代表三個或更多個單獨製備的樣本的平均值。結果如表4所示。
流體動力學直徑（ nm ）
配製物 mRNA siRNA
PD2 NP 55.8 +/- 6.1 50.5 +/- 4.8
PD2(M) NP 73.1 +/- 5.2 59.1 +/- 3.1
PD2(MN) NP 60.1 +/- 4.8 54.7 +/- 5.0
PD2(TM) NP 53.4 +/- 5.4 54.6 +/- 5.2
PD3 NP 58.3 +/- 2.7 57.2 +/- 3.1
PD3(M) NP 71.2 +/- 3.9 66.2 +/- 5.9
PD3(MN) NP 63.1+/- 5.2 60.2 +/- 4.5
PD3(TM) NP 52.3 +/- 3.7 63.0 +/- 3.9
PEG-PD2 NP 77.5 +/- 8.9 56.9+/- 9.1
PEG-PD2(M) NP 85.2 +/- 5.4 65.0 +/- 5.8
PEG-PD2(MN) NP 67.2 +/- 6.9 60.1 +/- 3.3
PEG-PD2(TM) NP 71.2 +/- 5.8 65.4 +/- 5.6
PEG-PD3 NP 80.0 +/- 4.9 76.6 +/- 2.8
PEG-PD3(M) NP 82.8 +/- 6.0 73.7 +/- 5.4
PEG-PD3(MN) NP 61.0 +/- 5.7 51.2 +/- 7.9
PD2 NP，脂質 50.9 +/- 3.2 45.0 +/- 4.5
PD2(M) NP，脂質 61.0 +/- 5.6 59.2 +/- 2.1
PD2(MN) NP，脂質 55.5 +/- 4.5 42.5 +/- 3.9
PD2(TM) NP，脂質 53.8 +/- 5.9 40.6 +/- 4.7
PD3 NP，脂質 61.1 +/- 3.0 43.9 +/- 8.4
PD3(M) NP，脂質 60.1 +/- 3.5 56.0 +/- 9.9
PD3(MN) NP，脂質 50.1 +/- 5.0 41.8 +/- 6.0
PD3(TM) NP，脂質 54 +/- 4.5 42.3 +/- 6.4
[表4].用含和不含脂質的PD3(MN)製備的RNA NP的流體動力學直徑。所有測量值均來自使用累積擬合分析的強度相關函數。一式三份收集測量值並表示為平均值+/-標準偏差。 實例 6靶向NP奈米顆粒的產生 a) 包含甲氧基-PEG肽類樹枝狀大分子和靶向PEG-肽類樹枝狀大分子軛合物和DNA或RNA的混合物的奈米顆粒的製備
在20 mM HEPES（pH 7.0）中，用不同比率的肽類樹枝狀大分子（如實例2製備）或甲氧基-PEG樹枝狀大分子（如實例3a製備）和靶向PEG肽軛合物（如實例3b製備）製備肽溶液。將相同緩衝液中的DNA（gwiz螢光素酶）（Genlantis公司，加利福尼亞州聖地牙哥）或RNA（clean cap mcherry）（Trilink公司，加利福尼亞州聖地牙哥）溶液（40 µg/mL）逐滴添加到PD混合物中，同時渦旋，使肽類樹枝狀大分子精胺酸:核酸磷酸鹽（N:P）的最終比率為4 : 1（DNA）和6 : 1（RNA）。使核酸/肽奈米顆粒在室溫下複合30分鐘。奈米顆粒溶液中核酸的最終濃度為20 µg/mL。作為視需要步驟，將Lipofectin®（DOTMA:DOPE（% w/w）= 1）（賽默飛世爾科技公司，麻塞諸塞州沃爾珊）添加到配製物中。Lipofectin®在20 mM HPES（pH 7.0）中稀釋，對應於與RNA的介於1和4之間的w/w %。如前所述，在添加RNA溶液之前立即將Lipofectin®溶液添加到肽類樹枝狀大分子溶液中。 b) 包含甲氧基-PEG肽類樹枝狀大分子和靶向PEG-抗體軛合物和DNA或RNA的混合物的奈米顆粒的製備
對於基於抗體的靶向配體，製備mal-PEG PD奈米顆粒，然後軛合至抗體（表1的化合物#5和#6，按下文修改）。在20 mM HEPES（pH 7.0）中，用不同比率的甲氧基-PEG樹枝狀大分子（實例3a）和mal-PEG樹枝狀大分子（實例3a）製備肽溶液。將相同緩衝液中的DNA（gwiz螢光素酶）（Genlantis公司，加利福尼亞州聖地牙哥）或RNA（clean cap mcherry）（Trilink公司，加利福尼亞州聖地牙哥）溶液（40 µg/mL）逐滴添加到PD混合物中，同時渦旋，使肽類樹枝狀大分子精胺酸:核酸磷酸鹽（N:P）的比率為4 : 1（DNA）和6 : 1（RNA）。使核酸/肽奈米顆粒在室溫下複合30分鐘。奈米顆粒溶液中核酸的最終濃度為20 µg/mL。
Fab和/或半聚體（一條輕鏈和一條重鏈）在重鏈內經非天然胺基酸取代工程化： （Nnaa CP1）
非天然胺基酸在其側鏈中含有環戊二烯（Nnaa CP1），可作為狄耳士-阿德爾反應（Diels-Alder reaction）的反應手柄。使用中國倉鼠卵巢（CHO）細胞將Nnaa CP1基因編碼到抗體序列中，該CHO細胞表現馬氏甲烷八聯球菌屬吡咯離胺酸tRNA合成酶/tRNA (PylRS)/tRNA(Pyl) 對，該對響應於琥珀終止（TAG）密碼子遞送Nnaa CP1。（Amant等人 Angew Chem [應用化學], 2019, 58(25):8489-93）。
在室溫下將工程化的基於抗體的靶向部分以相對於順丁烯二醯亞胺1.25莫耳過量的方式添加到核酸/肽奈米顆粒溶液中2 h，如實例6中所述。隨後藉由添加N-乙醯半胱胺酸（10倍莫耳過量）來淬滅混合物。使用超速離心（MWCO 100 kDa）去除過量抗體，並使用A260/A280比率和動態光散射確認反應。 c) 動態光散射
使用Zetasizer ZS（瑪律文公司（Malvern））、Green Laser和ZEN2112石英比色皿收集動態光散射數據。藉由累積擬合分析推導流體動力學直徑和多分散性指數（PDI）。所有數據點代表三個或更多個單獨製備的樣本的平均值。
靶向 PEG- 肽類樹枝狀大分子軛合物 靶向的 MeO-PEG 肽類樹枝狀大分子軛合物 :MeO-PEG-PD3(MN) 的莫耳 % 比率
0 12.5 25 50 100
PD3(MN)-Tfr 75.1 +/- 5.0 83.2 +/- 5.6 83.0 +/- 7.3 85.8 +/-9.1 85.4 +/-9.0
PD3(MN)-cRGD 78.3 +/- 4.3 81.2 +/- 7.3 78.2 +/- 5.1 81.8 +/-6.0 84.9 +/- 7.9
PD3(MN)-抗CD3 79.1 +/- 6.7 85.3 +/- 9.8 101.9 +/- 8.9 105.2 +/- 4.2 105.6 +/- 3.3
PD3(MN)-MECA32 79.1 +/- 6.7 91.0 +/- 8.7 102.1 +/- 7.6 105.8 +/- 7.1 110.1+/- 5.9
[表5].靶向DNA NP的動態光散射。所有測量值均來自使用累積擬合分析的強度相關函數。一式三份收集測量值並表示為平均值+/-標準偏差。
非靶向 NP cRGD-PEG-PD3(MN):MeO-PEG-PD3(MN) 的莫耳 % 比率
0 12.5 33.3 66.6 100
PD3(MN) 57.2 nm 56.9 nm 60.2 nm 63.1 nm 66.8 nm
PD3(MN)，脂質 50.5 nm 59.3 nm 55.4 nm 61.2 nm 60.4 nm
PEG-PD3(MN) 59.1 nm 61.2 nm 60.3 nm 65.3 nm 66.9 nm
PEG-PD3(MN)，脂質 54.7 nm 56.2 nm 60.1 nm 61.9 nm 64.9 nm
[表6].靶向siRNA NP的動態光散射直徑。所有數據一式三份收集並表示為具有標準偏差的平均值。使用累積擬合分析的強度相關函數 實例 7NP產生具有刺激響應DNA釋放的穩定奈米顆粒 a) 陰離子穩定性測定
在20 mM HEPES中製備硫酸聚葡萄醣（DS）溶液並添加到NP溶液（如實例4製備）中，因此最終DS濃度在100 mg/mL與1000 mg/mL之間，並且DNA濃度為10 µg/mL。在15分鐘的去複合期後，將15 µL的每種配製物添加到含溴化乙錠的2% E-凝膠中並運行10分鐘。使用ImageJ（NIH，馬里蘭州貝塞斯達（Bethesda, Maryland））計算pDNA釋放，結果如圖2A所示，其中完整奈米顆粒的百分比被繪製為DS濃度的函數。 b) 酶促DNA釋放
如實例4製備NP，但在8 mM L-半胱胺酸HCl緩衝液（pH 6）中，最終DNA濃度為0.1 μg/μl。隨後添加組織蛋白酶-B儲備溶液（60單位/mL）。Cat-B NP溶液在37°C下孵育長達4小時。在適當的時間點取出等分試樣並藉由瓊脂糖凝膠電泳分析以觀察釋放的DNA。以不同濃度製備DNA稀釋液作為對照，並同樣添加到相同的瓊脂糖凝膠中，以便隨後使用伯樂公司（bio-rad）強度軟體分析進行量化，結果如圖2B所示。
DNA 釋放（ % ）
修飾 未經修飾 M MN TM 組胺酸
PD1 0 0 0 0 -
PD2 0 26 0 22 -
PD3 0 83 98 11 5.2
[表7]. pDNA的程式化酶促釋放。該表總結了使用不同NP配製物進行組織蛋白酶-B處理1 h後pDNA釋放%。 實例 8NP在體外轉染中顯示出細胞特異性 a) 體外轉染
將H1299、C2C12、HEK393、和HEPG2細胞系接種在96孔板中，在24小時內靶向80%匯合。隨後將C2C12在杜爾貝科改良伊格爾培養基（DMEM）中孵育7天，培養基中補充2%馬血清以從成肌細胞分化成肌管。在24小時恢復期後，在OPTI-MEM（1 : 10稀釋）中以0.2 µg/孔向細胞中添加NP（如實例2製備）。16小時時間段後，去除補充NP的培養基，並添加新鮮的培養基。使用Incucyte（埃森生物科學公司（EssenBio））對GFP成像，並使用ONE-Glo™ + Tox螢光素酶報告儀（普洛麥格公司（Promega））的標準方案對螢光素酶/活力進行量化。結果如圖3A、3B、和3C所示。 實例 9肌肉內DNA NP體內轉染 a) 肌肉內遞送
BALB/C小鼠每肢用5 µg pDNA（Gwiz螢光素酶）（Genlantis公司，加利福尼亞州聖地牙哥）與MeO-PEG-PD(MN)（如實例5製備）複合處理。每週使用IVIS（珀金埃爾默公司（Perkin Elmer））評估表現。一式四份收集發光並表示為平均值 +/- 標準偏差。結果如圖4所示。 實例 10DNA NP治療性表現 a) 編碼MEDI8852和STK11的PD奈米顆粒的製備
如實例4中所述用PD3(MN) 和編碼治療劑MEDI8852和STK11的質體製備奈米顆粒。對於MED8852表現，還使用TfR-PEG-PD3(MN) 和MeO-PD3(MN)（肽類樹枝狀大分子精胺酸:核酸磷酸鹽N : P 4 : 1）製備NP，其中25%的肽係TfR-PEG-PD3(MN)。等體積DNA（40 µg/mL；MEDI8852質體（以與來自密蘇里州聖路易斯的西格瑪-奧德里奇公司的Minimal CMV表現質體類似的方式製備）或STK11（Origene公司，馬里蘭州羅克維爾市（Rockville MD））質體）和肽類樹枝狀大分子溶液在20 mM HEPES（pH 7.0）中製備。以對應於肽類樹枝狀大分子精胺酸:核酸磷酸鹽（N:P）為4 : 1的濃度製備肽類樹枝狀大分子溶液。將DNA溶液逐滴添加到肽溶液中，同時輕輕旋轉以確保顆粒均勻。使DNA/肽奈米顆粒在室溫下複合30分鐘。NP溶液中DNA的最終濃度為20 µg/mL。作為對照，MEDI8852質體也使用製造商的方案用lipofectamine-2000（賽默飛世爾科技公司，麻塞諸塞州沃爾珊）製備。 b) 治療性編碼奈米顆粒的體外轉染研究
將H1299（6,600個細胞/孔）、HEPG2（50,000個細胞/孔）和C2C12（12,000個細胞/孔細胞）接種在96孔板中的RPMI培養基或DMEM（分別補充有10%胎牛血清（FBS）和1%青黴素-鏈黴素（P/S））中。在24小時恢復期後，用100 µL的PBS洗滌細胞兩次，用培養基洗滌一次。然後在培養基中以每孔0.2 µg（H1299）或0.5 µg（HEPG2和C2C12）將奈米顆粒添加到細胞中。16小時時間段後，去除補充奈米顆粒的培養基，並添加新鮮的培養基。MEDI8852表現使用如下 (c) 所述之ELISA進行量化，STK11表現藉由如下 (d) 所述之西方墨點法檢測。結果分別如圖5A和5B所示。 c) MEDI8852 ELISA
向NUNCTM MaxiSorpTM 96孔微孔板塗覆100 µL/孔的在碳酸氫鹽緩衝液中的1 µg/mL抗MEDI8852抗體（Ali, S等人 Antimicrob Agents Chemother.[抗微生物劑與化學療法] 2018年11月; 62(11): e00694-18.）。將板在4°C下孵育過夜，然後在第二天早上用300 µL PBS-T（磷酸鹽緩衝液（PBS）+ 0.1% Tween 20）洗滌三次。所有標準品、品質控制樣本和測試樣本均在0.5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS + 0.1% Tween 20中按1 : 250稀釋。將100 µL稀釋樣本裝入每個孔中並孵育2小時。孵育後，用300 µL PBS-T洗滌板三次。將二級抗體生物素化抗MEDI8852（Ali, S等人 Antimicrob Agents Chemother.[抗微生物劑與化學療法] 2018年11月; 62(11): e00694-18.）在PBS-T中稀釋至2 µg/mL，並在每個孔中添加100 uL，並在37°C孵育1小時。然後用PBS-T將板洗滌四次，並添加100 µL的1 : 40稀釋的卵白素-HRP複合物（傑克遜免疫研究實驗室公司（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.），代碼016-030-084）。用PBS-T將板洗滌四次，並將100 µL室溫平衡的SureBlue TMB底物（賽默飛世爾科技公司）添加到所有孔中。在黑暗中15分鐘後，使用100 µL的TMB停止溶液（賽默飛世爾科技公司）來淬滅反應。使用BMG Labtech PHERAstar FSX微讀板器在450 nm處讀取每個孔的光密度（OD）。結果如圖5A所示。 e) STK11西方墨點法
轉染後使用補充有蛋白酶和磷酸酶抑制劑（皮爾斯公司（Pierce）#78442）的RIPA裂解緩衝液（泰克諾瓦公司（Teknova），目錄號R3792）裂解細胞，並在12,000xg下離心5 min。收集上清液並使用BCA測定法（Thermo prod# 23227）進行定量。然後使用SDS-聚丙烯醯胺電泳以200 mA電流分解每個樣本的10 µg的提取的蛋白質，持續90 min，然後藉由iBlot系統轉移到PVDF膜上。隨後用補充有5% BSA的TBS-T（20 mM Tris-HCl，pH 7.6）封閉膜。將兔抗STK11（細胞傳訊公司目錄號D60C5）和抗GAPDH（細胞傳訊公司目錄號14C10）一級抗體以1 : 10,000稀釋度雜合過夜。將膜洗滌30 min，然後與HRP軛合的山羊抗兔IgG雜合30 min。孵育後，洗滌膜以消除任何非特異性結合，並與皮爾斯公司SuperSignal West Pico化學發光試劑（皮爾斯公司目錄號34579）一起孵育。使用Image Quant LAS 4000檢測條帶。結果如圖5B所示。 實例 11體外靶向DNA NP轉染 a) 體外轉染
將H1299（6,600個細胞/孔）、CT26（10,000個細胞/孔）和C2C12（12,000個細胞/孔細胞）接種在96孔板中的RPMI培養基或DMEM（分別補充有10%胎牛血清（FBS）和1%青黴素-鏈黴素（P/S））中。在轉染前，允許H1299和CT26細胞有24 h的恢復期，而藉由將C2C12成肌細胞在補充有2%的馬血清的DMEM中孵育至少7天分化成肌管。隨後將細胞用100 µL PBS洗滌兩次，並用培養基洗滌一次。如實例6所述，用Gwiz螢光素酶質體（Genlantis公司，加利福尼亞州聖地牙哥）製備靶向和非靶向奈米顆粒。用MeO-PEG-PD(MN):TfR-PEG-PD(MN)或cRGD-PEG-PD(MN)的混合物（在實例3 a) 和b) 中製備的材料）製備TfR-和cRGD靶向NP，其中使用0、10%和50% TfR-PEG-PD(MN)和0、5%、10%、20%和30% cRGD-PEG-PD(MN)。在培養基中以每孔0.2 µg（1 : 10稀釋）將NP添加到細胞中。16小時時間段後，去除補充奈米顆粒的培養基，並添加新鮮的培養基。GFP的表現用Incucyte（埃森生物科學公司（Essen BioScience），安娜堡，密西根州）成像，並且螢光素酶/活力用ONE-Glo™ + Tox螢光素酶報告儀（普洛麥格公司，麥迪森，威斯康辛州）和PHERAstarFSX儀器（BMG實驗室技術公司（BMG Lab Tech），凱裡，北卡羅來納州）的標準方案定量。結果如圖6A-C中所示。 實例 12a) 奈米顆粒製備
如實例6所述，靶向PV1的MECA32被工程化並表現為在重鏈內具有非天然胺基酸取代的半聚體（一條輕鏈和一條重鏈）。使用實例6中所述之方案，用PD3(MN) PEG軛合物（如實例6製備）和Gwiz螢光素酶質體（Genlantis公司，加利福尼亞州聖地牙哥）在5%海藻糖緩衝液中製備NP，其中肽類樹枝狀大分子精胺酸:核酸磷酸鹽（N : P）比率為4 : 1（75% MeO-PEG-PD3(MN): 25% Mal-PEG-PD3(MN)）。基於順丁烯二醯亞胺的莫耳數，以1.25倍莫耳過量添加CP1-MECA32（Gabriela M. Marchetti,等人 Commun Biol.[通訊-生物] 2019; 2: 92; 於2019年3月7日線上發表 doi: 10.1038/s42003-019-0337-2），並在室溫下孵育過夜。藉由添加N-乙醯半胱胺酸（10倍莫耳過量）淬滅反應，並使用超速離心（MWCO 100 kDa）去除過量抗體。 b) 小鼠的肺靶向遞送
BALB/C小鼠用20 µg的與PD(MN) 複合的Gwiz螢光素酶pDNA進行靜脈內治療。10%的pDNA用Cy-5標記（12個標記/質體）。在第1、3和8天使用IVIS（珀金埃爾默公司）評估表現和生物分佈。一式四份進行每個處理，且定量數據表示為平均值 +/- 標準偏差。結果如圖7所示。 實例 13體內mRNA NP轉染 a) DNA和mRNA NP製備
在20 mM HEPES（pH 7.0）中製備肽類樹枝狀大分子溶液PD3(MN)（如實例4和5所述製備）。將編碼mCherry的DNA（Origene公司，馬里蘭州羅克維爾市）或mRNA（Trilink公司，加利福尼亞州聖地牙哥）在相同的緩衝液（40 µg/mL）中稀釋，並在渦旋的同時逐滴添加到PD混合物中，使得肽類樹枝狀大分子精胺酸:核酸磷酸鹽（N : P）的最終比率為2 : 1（DNA）或4 : 1（mRNA）。使核酸/肽奈米顆粒在室溫下複合15分鐘。奈米顆粒溶液中核酸的最終濃度為20 µg/mL。如實例4（DNA）和5（mRNA）中所述，使用DLS表徵NP。 b) 體外轉染
將H1299接種在96孔板中，在24小時內靶向80%匯合。在24小時恢復期後，在培養基（1 : 10稀釋）中以0.2 µg/孔向細胞中添加NP。4小時時間段後，去除補充NP的培養基，並添加新鮮的培養基。使用Incucyte（埃森生物科學公司）對mCherry成像。結果如圖8所示。 實例 14體內pDNA和mRNA轉染 肌肉內遞送
如實例4和5所述，用MeO PEG-PD3(MN)製備NP。BALB/C小鼠每肢用5 µg編碼螢光素酶的複合cleancap mRNA（Trilink公司，加利福尼亞州聖地牙哥）或Gwiz DNA（Genlantis公司，加利福尼亞州聖地牙哥）處理。每週使用IVIS（珀金埃爾默公司（Perkin Elmer））評估表現。一式四份收集發光並表示為平均值 +/- 標準偏差。結果如圖9所示。 實例 15體內mRNA治療性表現 靜脈內遞送
如實例5所述，用MeO-PD3(MN)和編碼MEDI8852的mRNA製備NP。向BALB/C小鼠藉由尾靜脈注射（每隻小鼠20 µg）靜脈內投與NP。每週使用IVIS（珀金埃爾默公司（Perkin Elmer））評估表現。一式四份收集發光並表示為平均值 +/- 標準偏差。結果如圖10所示。 實例 16原代T細胞的mRNA靶向轉染 T細胞靶向NP製備和表徵 體外轉染
將新鮮的原代T細胞（類似於可從麻塞諸塞州洛厄爾（Lowell, MA）的Cellero公司獲得的那些，但新鮮的未冷凍）接種在24孔板（3e6/孔）中的RPMI1640培養基（西格瑪公司）中。在24小時的恢復期後，然後在OPTI-MEM中以每孔100 µM將NP添加到細胞中。如實例6所述用編碼mcherry的cleancap mRNA（Trilink公司，加利福尼亞州聖地牙哥）以及PD3(MN)和Mal-PEG-PD3(MN)的混合物製備NP。用0、25%、50%、和100% Mal-PEG-PD3(MN)製備NP，然後如實例6所述與抗CD3 fab軛合。4小時時間段後，去除補充NP的培養基，並添加新鮮的培養基。RFP使用Incucyte（埃森生物科學公司）成像，並使用流動式細胞分析術進行量化。結果如圖11所示，其中A) 表示平均mcherry強度，B) 為轉染細胞的百分比且C) 為CD3的表面表現。 實例 17siRNA轉染體外研究 a) 細胞培養
Colo205和SW480細胞系獲自ATTC（維吉尼亞州馬納沙斯（Manassas, Virginia））。在37°C和5% CO2下，將培養物維持在補充有10%胎牛血清（FBS）的 洛斯維派克紀念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）生長培養基（吉博科公司（Gibco））中。Colo205和SW480 CTNNB1 shRNA細胞系係藉由去氧羥四環素誘導型人CTNNB1 shRNA（Dharmacon公司/Horizon Discovery公司，科羅拉多州拉斐特）的慢病毒轉導產生的。 b) TopFlash CTNNB1報告基因測定和西方墨點法
SW480腫瘤細胞（ATCC，維吉尼亞州馬納沙斯）用TCF1 TopFlash螢光素酶報告基因（EMD密理博公司（EMD Millipore），麻塞諸塞州柏林頓（Burlington, MA））穩定轉導。SW480 TopFlash細胞以每孔2.0 x 105個細胞的密度接種在6孔培養皿中，並如上所述用膽固醇軛合的siRNA（Accell siRNA）或siRNA NP處理48-72小時。如實例5所述，使用具有0、33%、66%或100% cRGD靶向的PD3(MN)或MeO-PEG-PD(MN)和cRGD-PEG-PD(MN)的混合物製備奈米顆粒。使用BrightGlo試劑（普洛麥格公司，威斯康辛州麥迪森（Madison WI））裂解和處理細胞，轉移至96孔板，並使用Envision X（珀金埃爾默公司，麻塞諸塞州沃爾珊）測量螢光素酶報告基因活性。PD3(MN)的TopFlash結果：cRGD-PEG-PD3(MN)如圖12所示。MeO-PEG-PD3(MN)的TopFlash結果：cRGD-PEG-PD3(MN)如圖13A所示。如圖13B所示，還使用標準西方墨點法方案在5天後評估細胞裂解物的CTNNB1表現。 c) CTNNB1西方墨點法和細胞增殖測定
將Colo205細胞以每孔2.0 x 105個細胞的密度鋪板在6孔板中。作為對照，膽固醇軛合的siRNA用於處理細胞。具體而言，在每孔購自Dharmacon公司/Horizon Discovery公司（ 科羅拉多州拉斐特）的Accell轉染培養基中，向細胞添加1 ml的500 nM的Accell對照非靶向siRNA和Accell CTNNB1 siRNA。膽固醇軛合可促進高濃度siRNA的遞送。轉染48小時後，每孔添加2 ml的RPMI + 10% FBS。對於用封裝NP的CTNNB1 siRNA處理Colo205細胞的實驗，將細胞以每孔2.0 x 105個細胞的密度接種在6孔板中。如實例5所述，使用MeO-PEG-PD(MN)和cRGD-PEG-PD(MN)與0或66% cRGD-PD和1%（w/w siRNA）脂質體的混合物製備奈米顆粒。將生長培養基更換為900 µl的最佳最低必需培養基（OPTIMEM），且每孔添加100 µl的NP配製物（每孔100 µM的mRNA）。轉染16小時後，每孔添加2 ml的RPMI + 10% FBS。對於細胞增殖測定，在轉染後72至96小時收穫細胞並使用ViCell XR細胞計數器計數，如圖13C所示。 實例 18靶向siRNA轉染體內研究 a) 體內腫瘤生長抑制測定
七週齡的雌性裸鼠皮下注射200 µl的PBS中的5.0 x 106個Colo205細胞。當平均腫瘤體積達到約100 mm 3時，將小鼠隨機分為治療組並連續三天接受靜脈注射NP（0、33%和66% cRGD PD (MN):PEG-PD(MN)，如實例6中製備的），接著一週後連續注射兩天。在實驗期間，每週記錄兩次或三次腫瘤測量值和小鼠體重。當腫瘤達到2000 mm 3大小或表現出潰瘍覆蓋超過50%的腫瘤表面時，對小鼠實施安樂死。結果如圖14所示。 實例 19雜合RNA/DNA肽類樹枝狀大分子奈米顆粒（NP）自組裝 a) NP製備
編碼mCherry的Cleancap mRNA（Trilink公司，加利福尼亞州聖地牙哥）和編碼GFP的gWiz™ DNA（Aldevron公司，北達科他州法戈（Fargo, ND））在20 mM HEPES（pH 7.0）中以1 : 1質量比製備，最終濃度為40 µg/mL。在20 mM HEPES（pH 7.0）中製備PD3(MN)溶液（如實例2製備），濃度對應於最終肽類樹枝狀大分子精胺酸:核酸磷酸鹽（N : P）比率4 : 1。將核酸溶液以1 : 1的體積比添加到PD3(MN)溶液中，並藉由吸移徹底混合。使NP在室溫下複合30分鐘。NP溶液中核酸的最終濃度為20 µg/mL（10 µg/mL mRNA和µg/mL DNA）。對照NP僅用DNA和mRNA製備，最終核酸濃度為20 µg/mL。 b) 動態光散射
使用Zetasizer ZS（瑪律文公司（Malvern））、Green Laser和ZEN2112石英比色皿收集動態光散射（DLS）數據。藉由累積擬合分析推導流體動力學直徑和多分散性指數（PDI）。所有數據點代表三個或更多個單獨製備的樣本的平均值。結果如表8所示。
遺傳物質 流體動力學直徑（ nm ） 多分散性指數
DNA NP 56 ± 2 0.177 ± 0.005
mRNA NP 33 ± 2 0.190 ± 0.008
DNA mRNA NP 49 ± 2 0.1870.003
[表8].如實例19所述，用PD3(MN)和DNA、mRNA或1 : 1比率的DNA和mRNA製備的NP的流體動力學直徑。一式三份收集所有測量值並表示為平均值 +/- 標準偏差。 c) 藉由螢光共振能量轉移（FRET）評估共封裝
使用Label IT®核酸標記套組（Mirus Bio公司，威斯康辛州麥迪森），將編碼GFP的gWiz™ DNA（Aldevron公司，北達科他州法戈）用Cy5標記，編碼mCherry的Cleancap mRNA（Trilink公司，加利福尼亞州聖地牙哥）用Cy3標記。以下奈米顆粒用如上所述PD3(MN)配製，最終核酸濃度為20 µg/mL： 1.  Cy5 DNA + 無標記DNA（1 : 1）共封裝的NP 2.  Cy3 mRNA + 無標記mRNA（1 : 1）共封裝的NP 3.  Cy5 DNA NP + Cy3 mRNA NP（1 : 1），分開封裝的。 4.  Cy5 DNA + Cy3 mRNA（1 : 1）共封裝的NP
在螢光分析之前，使NP複合10分鐘。上面列出的3中的NP分別配製，使其複合10分鐘，然後在螢光分析之前以1 : 1的比率混合。使用NanoDrop™ 3300螢光光譜儀（賽默飛世爾科技公司，麻塞諸塞州沃爾珊）進行螢光分析。將2 µL的NP樣本載入到基座上，並使用藍色LED激發樣本。在450和750 nm波長之間測量螢光發射（相對螢光單位，RFU）。該等NP樣本的螢光譜如圖15所示。 d) H1299細胞中mRNA和DNA的表現
如a) 所述，用1 : 1重量比的PD3(MN)與GFP DNA和mCherry mRNA配製NP，最終核酸濃度為20 µg/mL。在處理前24 h，H1299細胞以10,000個細胞/孔鋪板在組織培養處理的96孔板中。在處理之前，立即去除生長培養基並更換100 µL Opti-MEM™ I減少的血清培養基（賽默飛世爾公司（ThermoFisher），麻塞諸塞州沃爾珊）。向每個孔中添加10 µL奈米顆粒溶液（200 ng/孔核酸劑量）。將奈米顆粒與細胞一起孵育4小時，然後去除Opti-MEM和奈米顆粒並更換為生長培養基。使用Incucyte即時細胞分析系統（賽多利斯公司，德國哥廷根（Göttingen, Germany））監測GFP和mCherry蛋白的表現，該分析系統每4小時捕獲一次細胞的螢光影像。使用Incucyte軟體分析圖像以確定綠色（GFP）和紅色（mCherry）通道中的螢光面積以及紅色和綠色訊息重疊的面積。將訊息歸一化為峰值訊息面積以監測表現動力學。結果如圖16所示。 e) C2C12細胞中mRNA和DNA的表現
C2C12細胞以20,000個細胞/孔鋪板在組織培養處理的96孔板中。將生長培養基更換為低血清分化培養基（DMEM + 2%馬血清）並培養7天，直到形成融合的細長肌管。如a) 所述，用1 : 1重量比的PD3(MN)與GFP DNA和mCherry mRNA配製奈米顆粒，最終核酸濃度為50 µg/mL。將Lipofectin®（DOTMA:DOPE（% w/w）= 1）（賽默飛世爾科技公司，麻塞諸塞州沃爾珊）添加到配製物中。Lipofectin®在20 mM HPES（pH 7.0）中稀釋，對應於與核酸的1% w/w。如前所述，在添加RNA溶液之前立即將Lipofectin®溶液添加到PD3(MN)溶液中。在處理之前，立即去除培養基並更換100 µL Opti-MEM™ I減少的血清培養基（賽默飛世爾公司，麻塞諸塞州沃爾珊）。向每個孔中添加10 µL奈米顆粒溶液（200 ng/孔核酸劑量）。將奈米顆粒與細胞一起孵育4小時，然後去除Opti-MEM和奈米顆粒並更換為生長培養基。如所述，使用Incucyte即時細胞分析監測GFP和mCherry蛋白的表現。結果如圖17所示。
無
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Claims (27)

  1. 一種肽類樹枝狀大分子，其包含一或多個源自具有式 (I)的經修飾離胺酸的殘基： (I)其中： A係鍵、C 1-6伸烷基、碳環基或雜環基；其中所述碳環基或雜環基可視需要地在碳上被一或多個R 2取代；並且其中如果所述雜環基含有-NH-部分，則氮可視需要地被選自R A的基團取代； Q係鍵、碳環基或雜環基；其中所述碳環基或雜環基可視需要地在碳上被一或多個R 3取代；並且其中如果所述雜環基含有-NH-部分，則氮可視需要地被選自R B的基團取代； 環 B係𠰌啉基或硫代𠰌啉基；其中如果所述𠰌啉基或硫代𠰌啉基含有-NH-部分，則氮可視需要地被選自R C的基團取代； R 1 、 R 2 和 R 3 各自獨立地選自鹵代、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、胺基、羧基、胺甲醯基、巰基、胺磺醯基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、乙醯基、乙醯氧基、甲基胺基、乙基胺基、二甲基胺基、二乙基胺基、N-甲基-N-乙基胺基、乙醯基胺基、N-甲基胺甲醯基、N-乙基胺甲醯基、N,N-二甲基胺甲醯基、N,N-二乙基胺甲醯基、N-甲基-N-乙基胺甲醯基、甲基硫代、乙基硫代、甲基亞磺醯基、乙基亞磺醯基、甲磺醯基、乙基磺醯基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基胺磺醯基、N-乙基胺磺醯基、N,N-二甲基胺磺醯基、N,N-二乙基胺磺醯基以及N-甲基-N-乙基胺磺醯基； n係0-4； R A 、 R B 和 R C 獨立地選自甲基、乙基、丙基、異丙基、乙醯基、甲磺醯基、乙基磺醯基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基、胺甲醯基、N-甲基胺甲醯基、N-乙基胺甲醯基、N,N-二甲基胺甲醯基、N,N-二乙基胺甲醯基和N-甲基-N-乙基胺甲醯基。
  2. 如請求項1所述之肽類樹枝狀大分子，其中 A係鍵、C 1-6伸烷基或雜環基。
  3. 如請求項1或請求項2所述之肽類樹枝狀大分子，其中 Q係鍵。
  4. 如請求項1-3中任一項所述之肽類樹枝狀大分子，其中 n係0。
  5. 如請求項1-4中任一項所述之肽類樹枝狀大分子，其中 環 B係𠰌啉基。
  6. 如請求項1-4中任一項所述之肽類樹枝狀大分子，其中 環 B係硫代𠰌啉基。
  7. 如請求項1-4中任一項所述之肽類樹枝狀大分子，其中： A係鍵、亞甲基或吡啶基； Q係鍵； 環 B係𠰌啉基或硫代𠰌啉基；並且 n係0。
  8. 如請求項1-7中任一項所述之肽類樹枝狀大分子，其中該源自經修飾離胺酸的殘基具有式 (IB)： (IB) 。
  9. 如請求項1-4、7或8中任一項所述之肽類樹枝狀大分子，其中該源自經修飾離胺酸的殘基係： (S)-2-胺基-6-{[6-(𠰌啉-4-基)吡啶-3-羰基]胺基}己酸； (S)-2-胺基-6-[(硫代𠰌啉-3-羰基)胺基]己酸；以及 (S)-2-胺基-6-[2-(𠰌啉-4-基)乙醯胺基]己酸。
  10. 如前述請求項中任一項所述之肽類樹枝狀大分子，其中該樹枝狀大分子包含少於六代。
  11. 如前述請求項中任一項所述之肽類樹枝狀大分子，其中該肽類樹枝狀大分子包含分支點、第0代和後續代，並且其中該等分支點、第0代和後續代一起包含少於100個胺基酸殘基。
  12. 如前述請求項中任一項所述之肽類樹枝狀大分子，其中該肽類樹枝狀大分子包含具有式 (II)的肽類樹枝狀大分子： ({X 3}{X 2}{X 1}) 8( {BP} {X 3}{X 2}{X 1}) 4( {BP} {X 3}{X 2}{X 1}) 2 {BP} (II)其中： X 1、X 2、或X 3之一係鹼性胺基酸殘基； X 1、X 2、或X 3中的另一個係疏水性胺基酸殘基； X 1、X 2、或X 3中的剩餘者係源自如請求項1-9中任一項所定義的經修飾離胺酸的殘基；並且 BP係分支點胺基酸殘基。
  13. 如請求項12所述之肽類樹枝狀大分子，其中該鹼性胺基酸殘基選自精胺酸。
  14. 如請求項12或請求項13所述之肽類樹枝狀大分子，其中該疏水性胺基酸殘基選自白胺酸。
  15. 如請求項12-14中任一項所述之肽類樹枝狀大分子，其中BP係離胺酸。
  16. 如前述請求項中任一項所述之肽類樹枝狀大分子，其進一步包含與該肽類樹枝狀大分子的第一分支點胺基酸附接的第0代胺基酸殘基序列。
  17. 如請求項16所述之肽類樹枝狀大分子，其中該第0代序列由GLY-VAL-CIT-GLY-GLY-SER-CYS（SEQ ID NO 5）組成，其中末端CYS羧基基團被醯胺化形成C(O)NH 2基團。
  18. 如前述請求項中任一項所述之肽類樹枝狀大分子，其進一步包含由-(OCH 2CH 2) n-重複亞基組成的聚乙二醇基團，其中n ＞ 3。
  19. 如前述請求項中任一項所述之肽類樹枝狀大分子，其進一步包含選自肽、抗體、糖或小分子靶向基團的靶向基團。
  20. 如前述請求項中任一項所述之肽類樹枝狀大分子用於將藥物活性劑遞送到細胞中之用途。
  21. 一種藥物組成物，其包含一或多種如前述請求項中任一項所述之肽類樹枝狀大分子、和藥物活性劑。
  22. 如請求項20或請求項21所述之用途或藥物組成物，其中該藥物活性劑係遺傳物質。
  23. 如請求項22所述之用途或藥物組成物，其中該遺傳物質係DNA。
  24. 如請求項22所述之用途或藥物組成物，其中該遺傳物質係RNA。
  25. 如請求項22所述之用途或藥物組成物，其中該遺傳物質係DNA和RNA。
  26. 如請求項20-25中任一項所述之用途或藥物組成物，其進一步包含脂質。
  27. 一種基因療法方法，該方法包括向所述動物投與有效量的如請求項21-26中任一項所述之藥物組成物。
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