KR20240082404A - 펩티드 덴드론 및 이의 사용 방법 - Google Patents

펩티드 덴드론 및 이의 사용 방법 Download PDF

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모르간 오드리 우렐로
로날드 제임스 크리스티
한나 본
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아스트라제네카 아베
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Abstract

본 명세서는 하기 화학식 I:
[화학식 I]
의 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론, 이들 펩티드 덴드론을 포함하는 제약적 전달 시스템, 이를 함유하는 제약 조성물, 및 요법에서의 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

펩티드 덴드론 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 10월 8일자로 출원된 미국 가출원 제63/262,269호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 명세서는 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론, 및 제약적 활성제, 특히 유전 물질을 세포 내로 전달하기 위한 이들 펩티드 덴드론의 용도에 관한 것이다. 본 명세서는 추가로 요법에서의 이들 펩티드 덴드론의 용도에 관한 것이다.
유전자 요법은 질환을 치료하기 위해 환자 세포에 (외래) 유전 물질(예컨대 DNA 및 RNA)을 치료적으로 전달하는 것에 중점을 둔 의학 분야이다. 지금까지, Luxturna®(RPE65 돌연변이-유발 실명) 및 Kymriah®(키메라 항원 수용체 T 세포 요법)을 비롯한 여러 유전자 요법이 다수의 상이한 의학적 병태용으로 규제 승인을 받았다.
유전자 전달은 세포에 유전 물질을 도입하기 위해 사용되는 과정이다. 성공적으로 되기 위해, 유전 물질은 수송 동안에 안정하게 남아있어야 하고, 궁극적으로는 표적화된 세포에 내재화되어야 한다. 유전 물질이 DNA일 때, 이는 표적화된 세포에 내재화되고 핵에 전달되어야 한다. 유전자 전달은 벡터를 필요로 하며, 적합한 벡터는 일반적으로 다음의 2가지 범주에 속한다: 바이러스 및 비바이러스 벡터.
바이러스 매개 유전자 전달은 숙주 세포 내부로 바이러스의 DNA를 주입하는 바이러스의 능력을 이용한다. 유전 물질은 바이러스 벡터를 형성하기 위해 복제-결함 바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 바이러스 방법은 고도로 효율적이지만, 면역 반응을 유발할 수 있다. 더욱이, 이들은 유전 물질의 매우 작은 조각만을 세포 내로 전달할 수 있어서, 이를 생산하는 것은 노동 집약적이며, 무작위 삽입 부위, 세포변성 효과 및 돌연변이유발의 위험이 존재한다.
합성 벡터는 구조적 범용성(versatility) 및 확장성에 관해 유전자 전달 응용분야에 있어서 바이러스에 비해 여러 장점을 제공하며; 이들은 하나의 원하는 목적을 달성하기 위해 단독으로 그리고 특이적으로 설계될 수 있다. 이들 물질은 세포 흡수, 세포질 내로의 수송, 및 (원하는 경우) 핵 내로의 전달과 연관된 생물학적 장벽을 극복하도록 조작된 나노입자 또는 소포에 유전 물질을 패키징하도록 설계될 수 있다. 통상적인 접근법은 음이온성 핵산과 회합되는 양전하를 포함하는 중합체, 펩티드 또는 지질과 같은 물질과의 다중 분자 조립체에 유전 물질을 패키징하는 것이다. 양전하와 음전하 사이의 정전기적 상호작용은 자가 조립체를 나노- 또는 마이크로입자 구조로 유도하고, 이들 입자의 크기 및 형상은 물질 유형 및 축합 조건에 의해 제어될 수 있다(Park et al. Adv Drug Del Rev, 2006, 58(4):467-86).
예를 들어, 나노입자와 같은 적합한 벡터로의 DNA의 제형화는 비제형화된 DNA의 흡수와 비교할 때 DNA의 세포 흡수를 유의하게 개선시킨다. DNA는 너무 크고 음전하를 띠고 있어서 세포막을 통한 확산과 같은 수동적 과정에 의해 자체적으로 세포(또한 순 음전하를 가짐)로 내재화될 수 없다. 비제형화된 DNA는 또한 면역 반응을 촉발하는 경향이 있는데, 이는 DNA의 분해를 초래한다. 적합한 벡터로의 DNA의 제형화는 이의 음전하를 중화시킬 수 있고, 세포외 공간에서의 분해로부터 이를 보호할 수 있다.
벡터가 효과적으로 내재화되기 위해서는 엔도사이토시스(endocytosis)로 칭해지는 과정을 통해 세포 내로 수송되어야 한다. 이 과정 동안에, 벡터는 세포막 영역으로 둘러싸이고, 그 후 이는 세포 내부에서 분리되어 나와서 엔도솜을 형성한다. 벡터는 이 과정이 일어나도록, 그러나 그 후에 리소좀 포획, 즉, 산성 막-결합 리소좀 구획으로의 격리 가능성을 완화시키도록 설계되어야 한다. 이를 달성하는 한 방법은 리소좀 수송이 일어날 수 있기 전에 엔도솜 파열을 보장하는 것이다. 이는 생성된 삼투 구배가 엔도솜을 파열시키고 유전 물질이 전사/번역에 사용될 수 있는 세포질 내로 유전 물질을 방출시킬 때까지 엔도솜 pH를 완충시키는 벡터에 의해 달성될 수 있다(엔도솜은 세포 흡수 후에 점점 더 산성이 됨). 엔도솜 완충 범위(pH 7.4 내지 pH 5.0) 이상으로 효율적인 완충 능력을 갖는 적합한 벡터 물질은 양성자를 수용함으로써 엔도솜의 산성화를 늦출 수 있고, 이는 세포질로부터의 추가적인 양성자 및 반대이온의 유입을 야기한다.
현재의 합성 유전자 전달 시스템은 유전 물질의 낮은 안정성, 높은 독성 및 비효율적인 세포질 유입에 의해 생체 내에서 제한된다. 높은 전달 효율을 유지하면서 제형 특성(크기, 전하 등), 안정성, 완충 능력과 독성 간의 최적의 균형을 달성하는 유전자 전달에 적합한 다기능성 물질을 조작하는 것은 어렵고 복잡한 것으로 판명되었지만, 생성된 제형을 유의하게 단순화시킬 것이다.
펩티드 덴드론(PD)은 아미노산 잔기를 포함하는 3차원 구조이며, 여기서, 상기 잔기 중 하나의 측쇄, 예를 들어 라이신의 ε-아민은 분지체 또는 세대를 형성하여 분자를 3-D 거대분자로 만드는 데 사용된다. 펩티드 덴드론은 전형적으로 잘 정의된 구조 내에서 아미노산 잔기 서열 및 지오메트리(geometry)를 정밀하게 제어할 수 있는 고상 펩티드 합성을 사용하여 생성된다. 최종 생성물은 단분산성이며 고도로 맞춤가능한 특성(즉, 소수성, 전하 밀도 및 분자량)을 가져서 다기능적 최적화 및 유연한 응용이 가능하다.
펩티드 덴드론은 널리 탐구되어 왔지만 생산 비용 및 낮은 단백질 분해 안정성에 의해 임상적 성공이 방해되었다. Kwok 등(ACS Nano, 2013 May 28;7(5):4668-82, doi: 10.1021/nn400343z 및 ChemBioChem, 2016, 17(23), 2223-2229)은 DNA 및 RNA 형질감염 시약으로서 펩티드 덴드리머/지질 하이브리드 시스템을 탐구하였지만, 합성 제한으로 인해 디펩티드 분지체로 한정되어 물질의 기능성 및 생체 내 효능이 한정되었다.
본 출원에서는 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기를 포함하는 특정 펩티드 덴드론이 기술되어 있다. 이들 펩티드 덴드론은 i) 세포 내재화 및 리소좀 수송 동안 발생된 pH 전이 동안 양성자화를 가능하게 하도록 조정된 향상된 완충 특성을 보유하고/하거나, ii) 정전기적 및 비정전기적(예를 들어, 파이-파이 스태킹) 상호작용을 통한 증가된 핵산 결합으로 인해 더 안정하게 되고/되거나, iii) 자연적으로 발생하며 독성 또는 면역원성일 가능성이 더 적은 대사물질-기반 코어 단위가 사용되는 경우 증가된 생체적합성을 갖고/갖거나, iv) 특정 세포내 효소 분해(카텝신-B)를 통해 반응성 핵산 방출을 달성한다. 이들은 플라스미드 DNA, mRNA, siRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)(대략 25~100 nm, 구체, 로드(rod) 및 토로이드(toroid))를 포함한 다수의 핵산 형식을 갖는 나노입자를 형성하며, 마우스에서 정맥내 주사 후 더 높은 혈청 안정성 및 연장된 혈액 순환을 관련 독성 없이 보여준다. 이들은 DNA, mRNA, siRNA 및 ASO를 포함한 광범위한 핵산 형식을 성공적으로 전달 및/또는 공동전달하고 세포 내부가 될 때까지는 쉽게 해리되지 않음으로써 캡슐화된 유전 물질을 보호하는 능력을 보여주었다. 또한, 동일한 나노입자 내의 RNA/DNA의 공동전달은 단백질 발현 동역학, 상승적 치료제들의 발현을 제어할 수 있으며, 나노입자 응용을 CRISPR와 같이 다수의 구성요소가 필요한 분야로 확장한다.
본 명세서는 부분적으로 하기 화학식 I의 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론을 기술한다:
[화학식 I]
(여기서,
A는 결합, C1-6알킬렌, 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴로서, 상기 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴은 하나 이상의 R2에 의해 탄소 상에서 선택적으로 치환될 수 있으며, 상기 헤테로시클릴이 -NH- 모이어티를 포함하는 경우 해당 질소는 RA로부터 선택되는 기로 선택적으로 치환될 수 있고;
Q는 결합, 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴로서, 상기 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴은 하나 이상의 R3에 의해 탄소 상에서 선택적으로 치환될 수 있으며, 상기 헤테로시클릴이 -NH- 모이어티를 포함하는 경우 해당 질소는 RB로부터 선택되는 기로 선택적으로 치환될 수 있고;
고리 B는 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐로서, 상기 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐이 -NH- 모이어티를 포함하는 경우 해당 질소는 RC로부터 선택되는 기로 선택적으로 치환될 수 있고;
R 1 , R 2 및 R 3 은 각각 독립적으로 할로, 니트로, 시아노, 히드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로메틸, 아미노, 카르복시, 카르바모일, 메르캅토, 술파모일, 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시, 아세틸, 아세톡시, 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, N-메틸-N-에틸아미노, 아세틸아미노, N-메틸카르바모일, N-에틸카르바모일, N,N-디메틸카르바모일, N,N-디에틸카르바모일, N-메틸-N-에틸카르바모일, 메틸티오, 에틸티오, 메틸술피닐, 에틸술피닐, 메실, 에틸술포닐, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, N-메틸술파모일, N-에틸술파모일, N,N-디메틸술파모일, N,N-디에틸술파모일 및 N-메틸-N-에틸술파모일로부터 선택되고;
n은 0 내지 4이고;
R A , R B 및 R C 는 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 아세틸, 메실, 에틸술포닐, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, 프로폭시카르보닐, 부톡시카르보닐, 카르바모일, N-메틸카르바모일, N-에틸카르바모일, N,N-디메틸카르바모일, N,N-디에틸카르바모일 및 N-메틸-N-에틸카르바모일로부터 선택됨).
본 명세서는 또한, 부분적으로는, 제약 활성제를 세포 내로 전달하는 데 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 펩티드 덴드론을 기술한다.
본 명세서는 또한, 부분적으로는, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론 및 제약 활성제를 포함하는 제약 조성물을 기술한다.
본 명세서는 또한, 부분적으로는, 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 유전자 요법의 방법을 기술한다.
다수의 실시 형태들은 본 명세서 전반에 걸쳐 상세히 설명되고, 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 열거된 임의의 실시 형태에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
"단수"는 "적어도 하나"를 의미한다. 주어진 물질 또는 요소를 나타내기 위해 단수가 사용된 임의의 실시 형태에서, 단수는 하나를 의미할 수 있다.
"포함하는"은 주어진 물질 또는 요소가 다른 물질 또는 요소를 함유할 수 있다는 것을 의미한다. "포함하는"이 언급된 임의의 실시 형태에서, 주어진 물질 또는 요소는 적어도 1% w/w, 적어도 5% w/w, 적어도 10% w/w, 적어도 20% w/w, 적어도 30% w/w, 또는 적어도 40% w/w의 해당 물질 또는 요소로 형성될 수 있다. "포함하는"은 또한, 주어진 물질 또는 요소"로 이루어진"(또는 "로 이루어진다") 또는 "로 본질적으로 이루어진"(또는 "로 본질적으로 이루어진다")을 의미할 수 있다.
"~로 이루어진" 또는 "~로 이루어진다"는 주어진 물질 또는 요소가 완전히 해당 물질 또는 요소로 형성된다는 것을 의미한다. "~로 이루어진" 또는 "~로 이루어진다"가 언급된 임의의 실시 형태에서, 주어진 물질 또는 요소는 100% w/w의 해당 물질 또는 요소로 형성될 수 있다.
"~로 본질적으로 이루어진" 또는 "~로 본질적으로 이루어진다"는 주어진 물질 또는 요소가 거의 완전히 해당 물질 또는 요소로 이루어진다는 것을 의미한다. "~로 본질적으로 이루어진" 또는 "~로 본질적으로 이루어진다"가 언급된 임의의 실시 형태에서, 주어진 물질 또는 요소는 적어도 50% w/w, 적어도 60% w/w, 적어도 70% w/w, 적어도 80% w/w, 적어도 90% w/w, 적어도 95% w/w, 또는 적어도 99% w/w의 해당 물질 또는 요소로 형성될 수 있다.
물질 또는 요소를 정의하기 위해 "이다" 또는 "일 수 있다"가 사용되는 임의의 실시 형태에서, "이다" 또는 "일 수 있다"는 물질 또는 요소가 해당 물질 또는 해당 요소로 "이루어진다" 또는 "본질적으로 이루어진다"는 것을 의미할 수 있다.
"약"이 언급된 본 명세서의 임의의 실시 형태에서, "약"은 인용된 수치의 +/- 0(즉, 분산 없음), +/- 0.01, +/- 0.05, +/- 0.1, +/- 0.5, +/- 1, +/- 2, +/-5, +/- 10 또는 +/- 20%를 의미할 수 있다. 수치가 인용되는 경우, 추가 실시 형태에서, 이는 추가로 대략적 인용 수치를 지칭한다.
청구범위는 실시 형태이다.
하기 화학식 I의 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론이 본원에 개시된다:
[화학식 I]
(여기서, A, Q, B, R1 및 n은 본원에 기술된 바와 같음).
일 실시 형태에서, A는 결합이다.
일 실시 형태에서, A는C1-6알킬렌이다.
일 실시 형태에서, A는 메틸렌이다.
일 실시 형태에서, A는 카르보시클릴로서, 상기 카르보시클릴은 하나 이상의 R2에 의해 탄소 상에서 선택적으로 치환될 수 있다.
일 실시 형태에서, A는 헤테로시클릴로서, 상기 헤테로시클릴은 하나 이상의 R2에 의해 탄소 상에서 선택적으로 치환될 수 있고; 상기 헤테로시클릴이 NH- 모이어티를 포함하는 경우, 해당 질소는 RA로부터 선택되는 기로 선택적으로 치환될 수 있다.
일 실시 형태에서, A는 헤테로시클릴이다.
일 실시 형태에서, A는 피리딜이다.
일 실시 형태에서, A는 결합, C1-6알킬렌 또는 헤테로시클릴이다.
일 실시 형태에서, A는 결합, 메틸렌 또는 피리딜이다.
일 실시 형태에서, Q는 결합이다.
일 실시 형태에서, Q는 카르보시클릴로서, 상기 카르보시클릴은 하나 이상의 R3에 의해 탄소 상에서 선택적으로 치환될 수 있다.
일 실시 형태에서, Q는 헤테로시클릴로서, 상기 헤테로시클릴은 하나 이상의 R3에 의해 탄소 상에서 선택적으로 치환될 수 있고; 상기 헤테로시클릴이 NH- 모이어티를 포함하는 경우, 해당 질소는 RB로부터 선택되는 기로 선택적으로 치환될 수 있다.
일 실시 형태에서, 고리 B는 모르폴리닐이다.
일 실시 형태에서, 고리 B는 모르폴리닐로서, 상기 모르폴리닐이 -NH- 모이어티를 포함하는 경우, 해당 질소는 RC로부터 선택되는 기로 선택적으로 치환될 수 있다.
일 실시 형태에서, 고리 B는 티오모르폴리닐이다.
일 실시 형태에서, 고리 B는 티오모르폴리닐로서, 상기 티오모르폴리닐이 -NH- 모이어티를 포함하는 경우, 해당 질소는 RC로부터 선택되는 기로 선택적으로 치환될 수 있다.
일 실시 형태에서, R1은 할로이다.
일 실시 형태에서, n은 0이다.
일 실시 형태에서, n은 1이다.
일 실시 형태에서, n은 2이다.
일 실시 형태에서, n은 3이다.
일 실시 형태에서, n은 4이다.
일 실시 형태에서, 화학식 I의 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론이 제공되며, 여기서,
A는 결합, C1-6알킬렌 또는 헤테로시클릴이고;
Q는 결합이고;
고리 B는 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐이고;
n은 0이다.
일 실시 형태에서, 화학식 I의 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론이 제공되며, 여기서,
A는 결합, 메틸렌 또는 피리딜이고;
Q는 결합이고;
고리 B는 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐이고;
n은 0이다.
일 실시 형태에서, 화학식 I의 변형된 라이신은 하기 화학식 IA의 변형된 라이신이다:
[화학식 IA]
(여기서, A, Q, B, R1 및 n은 본원에 기술된 바와 같음). 화학식 IA의 변형된 라이신은 또한 변형된 D-라이신으로도 지칭될 수 있다.
일 실시 형태에서, 화학식 I의 변형된 라이신은 하기 화학식 IB의 변형된 라이신이다:
[화학식 IB]
(여기서, A, Q, B, R1 및 n은 본원에 기술된 바와 같음). 화학식 IB의 변형된 라이신은 또한 변형된 L-라이신으로도 지칭될 수 있다.
일 실시 형태에서, 화학식 I의 화합물은 하기로부터 선택된다:
2-아미노-6-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카르보닐]아미노}헥산산;
2-아미노-6-[(티오모르폴린-3-카르보닐)아미노]헥산산; 및
2-아미노-6-[2-(모르폴린-4-일)아세트아미도]헥산산.
일 실시 형태에서, 화학식 I의 화합물은 하기로부터 선택된다:
(R)-2-아미노-6-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카르보닐]아미노}헥산산;
(R)-2-아미노-6-[(티오모르폴린-3-카르보닐)아미노]헥산산; 및
(R)-2-아미노-6-[2-(모르폴린-4-일)아세트아미도]헥산산.
일 실시 형태에서, 화학식 I의 화합물은 하기로부터 선택된다:
(S)-2-아미노-6-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카르보닐]아미노}헥산산;
(S)-2-아미노-6-[(티오모르폴린-3-카르보닐)아미노]헥산산; 및
(S)-2-아미노-6-[2-(모르폴린-4-일)아세트아미도]헥산산.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치환된"은, 화학기를 지칭할 때, 제거되고 치환체로 대체되는 하나 이상의 수소 원자를 화학기가 가짐을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치환체"는 당업계에 알려진 보통의 의미를 갖고, 모 기에 공유 부착된 화학적 모이어티를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "선택적으로 치환된"은 화학기가 치환체를 갖지 않을 수도 있거나(즉, 비치환됨) 하나 이상의 치환체를 가질 수 있다(즉, 치환됨)는 것을 의미한다. 주어진 원자에서의 치환은 원자가로 제한된다는 것이 이해되어야 한다. 선택적 치환체가 기의 목록으로부터 선택되는 경우, 이 정의는 모든 치환체가 특정된 기 중 하나로부터 선택되거나 또는 상기 치환체가 특정된 기 중 둘 이상으로부터 선택되는 것을 포함함이 이해되어야 한다. 하나 초과의 상기 치환체, 예를 들어, R2가 있을 수 있는 경우에, 본 정의는 또한 모든 이러한 치환체가 특정된 기 중 하나로부터 선택되거나 또는 상기 치환체가 특정된 기 중 둘 이상으로부터 선택되는 것을 포함함이 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Ci-j"는 탄소 원자수의 범위를 나타내며, 여기서, i 및 j는 정수이고, 탄소 원자수의 범위는 종점(즉, i 및 j)과 그 사이의 각 정수 지점을 포함하며, j는 i보다 크다. 예를 들어, C1-6은 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자, 4개의 탄소 원자, 5개의 탄소 원자 및 6개의 탄소 원자를 포함하여 1 내지 6개의 범위의 탄소 원자를 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 용어 "C1-6"은 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3 또는 1 내지 2개의 탄소 원자를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "알킬"은 또 다른 용어의 일부로서 사용되든 독립적으로 사용되든, 포화 탄화수소쇄를 지칭한다. 상기 언급한 탄화수소쇄는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. 용어 "Ci-j알킬"은 i 내지 j개의 탄소 원자를 갖는 알킬을 지칭한다. C1-6알킬의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, tert-부틸, 이소부틸, sec-부틸; 보다 고차의 상동체, 예컨대, 2-메틸-1-부틸, n-펜틸, 3-펜틸, n-헥실, 1,2,2-트리메틸프로필 등을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. "부틸"과 같은 기에 대한 언급은 추가 단서 없이, 모든 형태의 부틸, 예를 들어, n-부틸 및 tert-부틸 등을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "알킬렌"은 또 다른 용어의 일부로서 사용되든 독립적으로 사용되든, 포화 탄화수소쇄를 지칭한다. 상기 언급한 탄화수소쇄는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. 용어 "Ci-j알킬렌"은 i 내지 j개의 탄소 원자를 갖는 알킬을 지칭한다. C1-6알킬렌의 예는 메틸렌(-CH2-), 에틸렌(-CH2-CH2-), 프로필렌(-CH2-CH2-CH2-) 및 부틸렌 (-CH2-CH2-CH2-CH2- 및 -CH2-CH(CH3)-CH2- 등) 등을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 지칭한다.
"헤테로시클릴"은 4 내지 12개의 원자를 포함하는 포화, 부분 포화 또는 불포화, 단환식 또는 이환식 고리이며, 이 중 적어도 하나의 원자는 질소, 황 또는 산소로부터 선택되며, 이는 달리 구체화되지 않는 한, 탄소 또는 질소 연결될 수 있고, 여기서, -CH2- 기는 선택적으로 -C(O)-로 대체될 수 있고, 고리 황 원자는 선택적으로 산화되어 S-옥시드를 형성할 수 있다. 용어 "헤테로시클릴"의 예 및 적합한 값으로는 모르폴리노, 피페리딜, 피리딜, 피라닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이소티아졸릴, 인돌릴, 퀴놀릴, 티에닐, 1,3-벤조디옥솔릴, 티아디아졸릴, 피페라지닐, 티아졸리디닐, 피롤리디닐, 티오모르폴리노, 피롤리닐, 호모피페라지닐, 3,5-디옥사피페리디닐, 테트라히드로피라닐, 이미다졸릴, 피리미딜, 피라지닐, 피리다지닐, 이속사졸릴, N-메틸피롤릴, 4-피리돈, 1-이소퀴놀론, 2-피롤리돈 및 4-티아졸리돈이 있다. 용어 "헤테로시클릴"의 특정 예로는 피리딜이 있다. 일 실시 형태에서, "헤테로시클릴"은 5 또는 6개 원자를 포함하는 포화, 부분 포화 또는 불포화, 단환식 고리이며, 이 중 적어도 하나의 원자는 질소, 황 또는 산소로부터 선택되고, 이는 달리 구체화되지 않는 한, 탄소 또는 질소 연결될 수 있고, -CH2- 기는 -C(O)-로 선택적으로 대체될 수 있으며, 고리 황 원자는 선택적으로 산화되어 S-옥시드를 형성할 수 있다.
"카르보시클릴"은 3 내지 12개의 원자를 포함하는 포화, 부분 포화 또는 불포화, 단환식 또는 이환식 탄소 고리이며; 여기서, -CH2- 기는 -C(O)-로 선택적으로 대체될 수 있다. 일 실시 형태에서, "카르보시클릴"은 5 또는 6개의 원자를 포함하는 단환식 고리 또는 9 또는 10개의 원자를 포함하는 이환식 고리이다. "카르보시클릴"에 대한 적합한 값은 시클로프로필, 시클로부틸, 1-옥소시클로펜틸, 시클로펜틸, 시클로펜테닐, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 페닐, 나프틸, 테트라리닐, 인다닐 또는 1-옥소인다닐을 포함한다. "카르보시클릴"의 특정 예로는 페닐이 있다.
본 발명의 "화합물"은 화합물에서 원자의 모든 동위원소를 포함한다. 원자의 동위원소는 원자 번호가 동일하지만 질량수가 상이한 원자를 포함한다. 예를 들어, 달리 구체화되지 않는 한, 본 발명의 "화합물"에서 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 불소, 염소, 브로마이드 또는 요오드는 하기와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 이들의 동위원소를 또한 포함하는 것으로 의도된다: 1H, 2H, 3H, 11C, 12C, 13C, 14C, 14N, 15N, 16O, 17O, 18O, 31P, 32P, 32S, 33S, 34S, 36S, 17F, 19F, 35Cl, 37Cl, 79Br, 81Br, 127I 및 131I. 일부 실시 형태에서, 수소는 경수소, 중수소 및 삼중수소를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 수소는 경수소를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 수소는 중수소를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 수소는 삼중수소를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 용어 "중수소로 치환된" 또는 "중수소 치환된"은 화학기에서 수소의 다른 이소형(예를 들어, 경수소)을 중수소로 대체한 것. 일부 실시 형태에서, 탄소는 12C 및 13C를 포함한다.
잔기
본원에 기술된 펩티드 덴드론에서 아미노산은 함께 연결되어 α-아미노 기와 카르복시 기 사이의 펩티드 결합을 통해 사슬을 형성한다. 일단 사슬에서 연결되면, 개개의 아미노산은 "잔기"로서 지칭된다. "잔기"는 아미노산으로부터 유도된다. "잔기"는 또한 α-아미노 기 또는 카르복시 기를 통해서만 연결된 말단 아미노산을 설명하는 데 사용될 수 있으며; 선택적으로, 말단 아미노 기는 변형된 아미노 기이거나 또는 말단 카르복시 기는 변형된 카르복시 기이다(하기 본원에 기술된 바와 같음). 본원에서 특정 아미노산(예를 들어 "라이신")에 대한 언급은 문맥에 따라 아미노산 자체 또는 잔기를 지칭할 수 있다.
변형된 라이신
변형된 라이신 또는 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기가 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 화학식 I에 따른 변형된 라이신 및 이의 실시 형태를 지칭한다.
변형된 라이신 또는 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기가 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 변형된 D-라이신을 지칭할 수 있다.
변형된 라이신 또는 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기가 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 변형된 L-라이신을 지칭할 수 있다.
염 형태
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 염 형태의 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "염 형태"는 본원에 기술된 펩티드 덴드론의 유도체를 지칭하며, 여기서, 모 화합물은 하나 이상의 존재하는 산성 모이어티(예를 들어, 카르복실 등) 및/또는 염기 모이어티(예를 들어, 아민, 알칼리 등)를 이의 염 형태로 전환시킴으로써 변형된다. 다수의 경우에, 본 발명의 화합물은 아미노 및/또는 카르복실 기 또는 이와 유사한 기의 존재로 인해 산 및/또는 염기 염을 형성할 수 있다. 특정 염 형태는 제약상 허용가능한 염이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "제약상 허용가능한 염"은 포유류, 특히 인간에서 사용하기에 안전하고 효과적인 염이다.
본원에 기술된 펩티드 덴드론의 적합한 염 형태는, 예를 들어, 무기 산(예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등) 또는 유기 산(예를 들어, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 트리메스산, 시트르산, 락트산, 페닐아세트산, 벤조산, 만델산, 메탄술폰산, 나파디실산, 에탄술폰산, 톨루엔술폰산, 트리플루오로아세트산, 살리실산, 술포살리실산 등)으로부터 유도될 수 있는 산 부가 염을 포함한다. 특정 산 부가 염은 히드로클로라이드이다.
본원에 기술된 펩티드 덴드론의 적합한 염 형태는, 예를 들어, 무기 염기(예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄 염 및 주기율표 I족 내지 XII족으로부터의 금속, 예컨대, 칼슘, 마그네슘, 철, 은, 아연, 구리 등의 히드록시드, 카르보네이트, 바이카르보네이트 염) 또는 유기 염기(예를 들어, 1차, 2차 및 3차 아민, 자연적으로 발생되는 치환된 아민을 포함한 치환된 아민, 환형 아민, 염기성 이온 교환 수지 등)로부터 유도될 수 있는 염기 부가 염을 포함한다. 특정 유기 아민은 이소프로필아민, 벤자틴, 콜리네이트, 디에탄올아민, 디에틸아민, 라이신, 메글루민, 피페라진 및 트로메타민을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 추가의 적합한 염의 목록은 예를 들어 "Remington's Pharmaceutical Sciences," 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985); 및 "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)에서 찾을 수 있다.
본원에서 사용된 펩티드 덴드론 용어
본 출원에서는 본원에 기술된 바와 같은 화학식 I의 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론이 기술되어 있다. 본원에서 펩티드 덴드론이 언급되는 경우, 이는 아미노산 잔기를 포함하는 3차원 구조를 지칭하며, 여기서, 잔기 중 하나의 측쇄, 예를 들어 라이신의 ε-아민은 다음 세대를 생성하는 분지점을 형성하여 분자를 3-D 거대분자로 만든다. 펩티드 덴드론은 적어도 하나의 분지점을 포함하여 적어도 한 세대(G1)를 갖는 비선형 분자를 형성한다.
하기 용어가 본원에서 사용된다:
· 0세대: 펩티드 덴드론 내의 제1 분지점 앞에 있는 아미노산 잔기의 서열.
· 분지점: 새로운 세대를 시작하는 아미노산 잔기의 부가에 의해 변형된 측쇄가 있는 아미노산 잔기.
· 세대: 각각의 연속 시리즈의 세대가 넘버링된 분지점 사이의 아미노산 잔기(G1, G2, G3…).
· 표적화 기: 특정 세포 유형 또는 기관에 대한 친화성을 갖는 모이어티(예를 들어 당, 소분자, 펩티드 및/또는 항체 기반).
관례에 따라, 펩티드는 N-말단 아미노산이 먼저 그려지고 C-말단 아미노산이 끝에 그려진다(왼쪽에서 오른쪽으로 작성).
라이신(LYS)은 달리 명시되지 않는 한 비변형 라이신을 지칭한다.
아미노산이 키랄일 수 있는 임의의 실시 형태에서, 이는 D-아미노산을 지칭할 수 있다.
아미노산이 키랄일 수 있는 임의의 실시 형태에서, 이는 L-아미노산을 지칭할 수 있다.
아미노산이 키랄일 수 있는 임의의 실시 형태에서, 아미노산은 L- 및 D-아미노산의 혼합물일 수 있다.
펩티드 덴드론
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 조성 및 순도에 대해 정확한 제어를 가능하게 하는 기술을 통해 합성된 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다. 적합한 기술은 고상 펩티드 합성을 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 분지점, 0세대 및 연속적인 세대가 함께 120개 미만의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 분지점, 0세대 및 연속적인 세대가 함께 100개 미만의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 분지점, 0세대 및 연속적인 세대가 함께 80개 미만의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 분지점, 0세대 및 연속적인 세대가 함께 60개 미만의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 분지점, 0세대 및 연속적인 세대가 함께 약 52개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 분지점, 0세대 및 연속적인 세대가 함께 52개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론은 염 형태로 존재할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 및 하나 이상의 류신 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 및 하나 이상의 아르기닌 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 및 하나 이상의 라이신 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 하나 이상의 아르기닌 잔기, 및 하나 이상의 라이신 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 하나 이상의 류신 잔기, 및 하나 이상의 라이신 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 하나 이상의 아르기닌 잔기 및 하나 이상의 류신 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 적어도 하나의 세대는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 및 하나 이상의 류신 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 적어도 하나의 세대는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 및 하나 이상의 아르기닌 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 적어도 하나의 세대는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 및 하나 이상의 라이신 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 적어도 하나의 세대는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 하나 이상의 아르기닌 잔기, 및 하나 이상의 라이신 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 적어도 하나의 세대는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 하나 이상의 류신 잔기, 및 하나 이상의 라이신 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 적어도 하나의 세대는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 하나 이상의 아르기닌 잔기 및 하나 이상의 류신 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 세대(들)는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 및 하나 이상의 류신 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 세대(들)는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 및 하나 이상의 아르기닌 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 세대(들)는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 및 하나 이상의 라이신 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 세대(들)는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 하나 이상의 아르기닌 잔기, 및 하나 이상의 라이신 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 세대(들)는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 하나 이상의 류신 잔기, 및 하나 이상의 라이신 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 세대(들)는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 하나 이상의 아르기닌 잔기 및 하나 이상의 류신 잔기를 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 측쇄 pKa>7.4를 갖는 아미노산 %는 25~50%이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 측쇄 pKa>7.4를 갖는 아미노산 %는 25~30%이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 측쇄 pKa>7.4를 갖는 아미노산 %는 30~35%이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 측쇄 pKa>7.4를 갖는 아미노산 %는 35~40%이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 측쇄 pKa>7.4를 갖는 아미노산 %는 40~45%이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 측쇄 pKa>7.4를 갖는 아미노산 %는 45~50%이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 측쇄 pKa=4.0~6.5를 갖는 아미노산 %는 25~50%이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 측쇄 pKa=4.0~6.5를 갖는 아미노산 %는 25~30%이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 측쇄 pKa=4.0~6.5를 갖는 아미노산 %는 30~35%이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 측쇄 pKa=4.0~6.5를 갖는 아미노산 %는 35~40%이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 측쇄 pKa=4.0~6.5를 갖는 아미노산 %는 40~45%이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 측쇄 pKa=4.0~6.5를 갖는 아미노산 %는 45~50%이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 연속적인 세대의 아미노산 잔기 중, 측쇄 pKa>7.4를 갖는 %는 25~50%이고 측쇄 pKa=4.0~6.5를 갖는 %는 25~50%이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론은 하기 화학식 II의 펩티드 덴드론을 포함한다:
[화학식 II]
(여기서,
X1, X2, 또는 X3 중 하나는 염기성 아미노산 잔기이고;
또 다른 X1, X2, 또는 X3은 소수성 아미노산 잔기이고;
나머지 X1, X2, 또는 X3은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기이고;
BP는 분지점 아미노산 잔기임).
화학식 II에서 하나의 X1 기는 BP 아미노산의 α-아민에 부착되고, 다른 하나는 측쇄 상의 반응기, 예를 들어 아미노 기, 예를 들어 라이신의 ε-아민에 부착된다. 화학식 II의 펩티드 덴드론은 하기 구조를 갖는다:
.
화학식 II의 펩티드 덴드론에서, 동일한 세대 내의 X1 아미노산 잔기는 동일하거나 상이할 수 있고/있거나, 상이한 세대들에서의 X1 아미노산 잔기는 동일하거나 상이할 수 있다. 동일한 것이 각각 X2 및 X3에 적용된다.
일 실시 형태에서, X1은 염기성 아미노산 잔기이다.
일 실시 형태에서, X1은 소수성 아미노산 잔기이다.
일 실시 형태에서, X1은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기이다.
일 실시 형태에서, X2는 염기성 아미노산 잔기이다.
일 실시 형태에서, X2는 소수성 아미노산 잔기이다.
일 실시 형태에서, X2는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기이다.
일 실시 형태에서, X3은 염기성 아미노산 잔기이다.
일 실시 형태에서, X3은 소수성 아미노산 잔기이다.
일 실시 형태에서, X3은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기이다.
일 실시 형태에서,
X1은 염기성 아미노산 잔기이고;
X2는 소수성 아미노산 잔기이고;
X3은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기이다.
일 실시 형태에서,
X3은 염기성 아미노산 잔기이고;
X2는 소수성 아미노산 잔기이고;
X1은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기이다.
X1, X2, 또는 X3 중 하나는 염기성 아미노산 잔기이다. 염기성 아미노산 잔기는 양전하를 지닐 수 있는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기이다.
일 실시 형태에서 염기성 아미노산 잔기는 아르기닌, 오르니틴 및 라이신으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서 염기성 아미노산 잔기는 아르기닌이다.
일 실시 형태에서 염기성 아미노산 잔기는 오르니틴이다.
일 실시 형태에서 염기성 아미노산 잔기는 라이신이다.
일 실시 형태에서 X1은 아르기닌, 오르니틴 및 라이신으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서 X1은 아르기닌이다.
일 실시 형태에서 X1은 오르니틴이다.
일 실시 형태에서 X1은 라이신이다.
일 실시 형태에서 X2는 아르기닌, 오르니틴 및 라이신으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서 X2는 아르기닌이다.
일 실시 형태에서 X2는 오르니틴이다.
일 실시 형태에서 X2는 라이신이다.
일 실시 형태에서 X3은 아르기닌, 오르니틴 및 라이신으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서 X3은 아르기닌이다.
일 실시 형태에서 X3은 오르니틴이다.
일 실시 형태에서 X3은 라이신이다.
X1, X2, 또는 X3 중 하나는 소수성 아미노산 잔기이다. 소수성 아미노산 잔기는, 대부분 탄소와 수소로 구성된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로서, 물로부터 반발되는 경향이 있다.
일 실시 형태에서 소수성 아미노산 잔기는 알라닌, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 메티오닌 및 발린으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서 소수성 아미노산 잔기는 알라닌이다.
일 실시 형태에서 소수성 아미노산 잔기는 이소류신이다.
일 실시 형태에서 소수성 아미노산 잔기는 류신이다.
일 실시 형태에서 소수성 아미노산 잔기는 페닐알라닌이다.
일 실시 형태에서 소수성 아미노산 잔기는 트립토판이다.
일 실시 형태에서 소수성 아미노산 잔기는 티로신이다.
일 실시 형태에서 소수성 아미노산 잔기는 메티오닌이다.
일 실시 형태에서 소수성 아미노산 잔기는 발린이다.
일 실시 형태에서 X1은 알라닌, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 메티오닌 및 발린으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서 X1은 알라닌이다.
일 실시 형태에서 X1은 이소류신이다.
일 실시 형태에서 X1은 류신이다.
일 실시 형태에서 X1은 페닐알라닌이다.
일 실시 형태에서 X1은 트립토판이다.
일 실시 형태에서 X1은 티로신이다.
일 실시 형태에서 X1은 메티오닌이다.
일 실시 형태에서 X1은 발린이다.
일 실시 형태에서 X2는 알라닌, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 메티오닌 및 발린으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서 X2는 알라닌이다.
일 실시 형태에서 X2는 이소류신이다.
일 실시 형태에서 X2는 류신이다.
일 실시 형태에서 X2는 페닐알라닌이다.
일 실시 형태에서 X2는 트립토판이다.
일 실시 형태에서 X2는 티로신이다.
일 실시 형태에서 X2는 메티오닌이다.
일 실시 형태에서 X2는 발린이다.
일 실시 형태에서 X3은 알라닌, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 메티오닌 및 발린으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서 X3은 알라닌이다.
일 실시 형태에서 X3은 이소류신이다.
일 실시 형태에서 X3은 류신이다.
일 실시 형태에서 X3은 페닐알라닌이다.
일 실시 형태에서 X3은 트립토판이다.
일 실시 형태에서 X3은 티로신이다.
일 실시 형태에서 X3은 메티오닌이다.
일 실시 형태에서 X3은 발린이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론은 본원에 정의된 바와 같은 화학식 II의 펩티드 덴드론을 포함하며, 여기서,
X1은 아르기닌이고;
X2는 류신이고;
X3은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기이고;
BP는 라이신이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론은 본원에 정의된 바와 같은 화학식 II의 펩티드 덴드론을 포함하며, 여기서,
X1은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기이고;
X2는 류신이고;
X3은 아르기닌이고;
BP는 라이신이다.
0세대
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론은 펩티드 덴드론에서 첫 번째 분지점 아미노산에 부착된 "0세대"로 지칭되는 아미노산 잔기의 서열을 포함한다. 아미노산 잔기의 0세대 서열은 C-말단 또는 N-말단, 특히 C-말단에 있을 수 있다. 예를 들어, 아미노산 잔기의 0세대 서열을 갖는 펩티드 덴드론은 다음과 같이 예시될 수 있다:
.
첫 번째 분지점이 라이신인 경우 상기 다이어그램에서의 0세대 서열은 다음과 같이 부착될 수 있다:
(여기서, ".."은 분자의 나머지를 나타냄).
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론은 1세대 이전의 분지점 아미노산의 C-말단에 아미노산의 0세대 서열을 포함한다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론은 1세대 이전의 분지점 아미노산의 N-말단에 아미노산의 0세대 서열을 포함한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 하나 이상의 글리신 잔기를 포함한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 하나의 글리신 잔기를 포함한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 2개의 글리신 잔기를 포함한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 3개의 글리신 잔기를 포함한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 하나 이상의 발린 잔기를 포함한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 하나의 발린 잔기를 포함한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 하나 이상의 시트룰린 잔기를 포함한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 하나의 시트룰린 잔기를 포함한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 하나 이상의 세린 잔기를 포함한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 하나의 세린 잔기를 포함한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 하나의 시스테인 잔기를 포함한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 시스테인 잔기에서 종결될 수 있다. 말단 시스테인은 티올 화학을 통한 추가적인 작용화를 허용한다. 또 다른 실시 형태에서, 0세대 서열은 라이신, 세린, 티로신 및/또는 아미노산의 반응성 유도체, 예컨대 아지도페닐 알라닌에서 종결될 수 있다. 아미노산의 다른 반응성 유도체는 아지드, 알킨, 시클로펜타디엔 및 테트라진 기를 포함하는 것들을 포함한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 시스테인 잔기에서 종결되며, 여기서, 말단 카르복시 기는 아미드화되어 C(O)NH2 기를 형성한다. 아미드화는 COOH 기를 불활성으로 만들고 전체 펩티드 전하를 감소시키며 천연 펩티드를 더 잘 모방한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 글리신, 발린, 시트룰린, 세린, 알라닌, 라이신, 페닐알라닌 및/또는 시스테인 잔기를 포함한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 글리신, 발린, 시트룰린, 세린 및/또는 시스테인 잔기를 포함한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 글리신, 발린, 시트룰린, 세린 및 시스테인 잔기를 포함한다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 GLY-VAL-CIT-GLY-GLY-SER-CYS(서열번호 5)으로 이루어진다.
아미노산의 0세대 서열이 언급된 임의의 실시 형태에서, 0세대 서열은 서열 VAL-CIT, VAL-ALA, LYS-PHE, GLY-GLY-PHE-GLY(서열 번호 1) 또는 GLY-PHE-LEU-GLY(서열 번호 2)을 포함한다.
분지점
분지점은 새로운 세대를 시작하는 아미노산 잔기의 부가에 의해 변형된 측쇄가 있는 아미노산 잔기이다. 하기 다이어그램에서 분지점은 BP로 표시된다:
.
분지점이 라이신인 경우, 라이신은 다음과 같이 상기 다이어그램에서 분지점을 형성할 수 있다:
(여기서, ".."은 분자의 나머지를 나타냄).
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론 내의 분지점은 동일하거나 상이한 아미노산 잔기일 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론 내의 분지점은 동일한 아미노산 잔기일 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 라이신이 하나 이상의 분지점을 형성하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 라이신이 모든 분지점을 형성하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
세대
펩티드 덴드론은 세대들을 포함한다. 세대는 다음과 같이 설명될 수 있다:
(여기서, G1은 1세대, G2는 2세대, G3은 3세대를 나타내며, 이는 세대로 총칭됨). 추가 세대는 G3 세대의 말단 X3 기에 추가적인 분지점(BP) 아미노산을 부가하고 이어서 아미노산 잔기의 G4 세대 서열을 부가하는 것(예를 들어 추가적인 X3-X2-X1 기) 등을 통해 부가될 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 5개의 아미노산 잔기로 이루어진 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 4개의 아미노산 잔기로 이루어진 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 3개의 아미노산 잔기로 이루어진 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 2개의 아미노산 잔기로 이루어진 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 4개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 3개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 2개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 5개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 4개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 3개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 동일 펩티드 사슬로 이루어진 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 각각의 세대에서 동일 펩티드 사슬로 이루어진 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 상이한 펩티드 사슬로 이루어진 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 각각의 세대에서 상이한 펩티드 사슬로 이루어진 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 염기성 아미노산 잔기를 포함하는 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 소수성 아미노산 잔기를 포함하는 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 염기성 아미노산 잔기 및 소수성 아미노산 잔기를 포함하는 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 염기성 아미노산 잔기, 소수성 아미노산 잔기 및 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기를 포함하는 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 및 하나 이상의 류신 잔기를 포함하는 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 및 하나 이상의 아르기닌 잔기를 포함하는 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기, 하나 이상의 아르기닌 잔기 및 하나 이상의 류신 잔기를 포함하는 세대들을 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 ARG-LEU-LYS(변형)을 포함하는 하나 이상의 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있으며, 여기서, LYS(변형)은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 ARG-LEU-LYS(변형)으로 이루어진 하나 이상의 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있으며, 여기서, LYS(변형)은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 ARG-LEU-LYS(변형)을 포함하는 모든 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있으며, 여기서, LYS(변형)은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 ARG-LEU-LYS(변형)으로 이루어진 모든 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있으며, 여기서, LYS(변형)은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 LYS(변형)-LEU-ARG을 포함하는 하나 이상의 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있으며, 여기서, LYS(변형)은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 LYS(변형)-LEU-ARG으로 이루어진 하나 이상의 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있으며, 여기서, LYS(변형)은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 LYS(변형)-LEU-ARG을 포함하는 모든 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있으며, 여기서, LYS(변형)은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 LYS(변형)-LEU-ARG으로 이루어진 모든 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있으며, 여기서, LYS(변형)은 본원에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기이다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 하나의 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 2개의 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 3개의 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 4개의 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 5개의 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 하나의 세대의 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 2개의 세대의 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 3개의 세대의 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 4개의 세대의 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 5개의 세대의 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 하나 초과의 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 2개 초과의 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 3개 초과의 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 4개 초과의 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 6개 미만의 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 5개 미만의 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 4개 미만의 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 3개 미만의 세대를 포함하는 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜 펩티드 덴드론
추가 실시 형태에서, 본원에 기술된 펩티드 덴드론은 생체적합성, 친수성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리사르코신 기를 추가로 포함할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛으로 이루어진 중합체이며, 여기서, 전형적으로 n은 3 초과 250 미만이다. 이는 전형적으로 에틸렌 옥시드의 개환 중합을 이용하여 합성된다. PEG 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지형 PEG는 전형적으로 중앙 코어 기에서 나오는 3 내지 30개의 PEG 사슬을 갖는다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 펩티드 덴드론은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함할 수 있으며, 이는 본원에서 "폴리에틸렌 글리콜 펩티드 덴드론" 또는 "PEG 펩티드 덴드론"으로 지칭된다. PEG 기는 나노입자를 안정화하는 데 도움을 주고 입체 차폐를 통해 비특이적 단백질 상호작용을 감소시키는 "스텔스(stealth) 층"을 형성할 수 있다.
PEG 기는, 선택적으로 연결기를 통해 다음과 같이 펩티드 덴드론의 아미노산의 0세대 서열의 말단 아미노산 잔기에 부착될 수 있다:
PEG 기는 말단 -O- 기를 통해 또는 PEG의 말단 -CH2- 기를 통해 펩티드 덴드론에 부착될 수 있으며; 선택적으로 연결기를 통해 아미노산의 0세대 서열의 말단 아미노산 잔기의 아민 또는 카르복시에 부착될 수 있다. PEG 기는 또한 말단 아미노산 잔기의 측쇄 상의 반응기, 예를 들어 말단 시스테인의 측쇄 상의 -SH 기에, 선택적으로 연결기를 통해 부착될 수 있다(특히 말단 시스테인의 말단 카르복시 기가 또한 아미드화된 경우).
폴리에틸렌 글리콜 펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론에 부착되지 않은 PEG 기의 말단 단부에 변형이 있을 수 있거나, 상기 말단 단부가 수소일 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 기의 말단 단부에 대한 적합한 변형은, 예를 들어, C1-4알킬, 예를 들어, 메틸; 또는 C1-4알콕시, 예를 들어, 메톡시이다.
폴리에틸렌 글리콜 펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론에 부착되지 않은 PEG 기의 말단 단부에 반응기가 있을 수 있거나, 상기 말단 단부가 수소일 수 있다. 적합한 반응기는 말레이미드, 아지드, 알킨(예를 들어, C2-6알킨) 및 시클로펜타디엔을 포함한다. 이러한 반응기는 펩티드 덴드론에 대한 PEG 콘쥬게이션 전 또는 후에 방사성표지, 염색제 및 세포 표적화 리간드와 같은 화학종을 부착시키는 데 사용될 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜 펩티드 덴드론이 언급된 임의의 실시 형태에서, 폴리에틸렌 글리콜 기와 펩티드 덴드론 사이에 연결기가 있을 수 있다. 적합한 연결기는, 예를 들어, PEG-CH2-CH2-NH-PD 또는 PEG-NH-CH2-CH2-PD를 형성하는 C1-4알킬아미노, 예를 들어, -CH2-CH2-NH-; 또는, 예를 들어, PEG-CH2-CH2-PD를 형성하는 C1-4알킬렌, 예를 들어 -CH2-CH2-이다.
폴리에틸렌 글리콜 기가 말단 아미노산 잔기의 측쇄 상의 반응기, 예를 들어 말단 시스테인의 측쇄 상의 -SH 기에 부착되는 경우, 폴리에틸렌 글리콜 기를 부착시키기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 전형적으로, 이로 인해 폴리에틸렌 글리콜 기가 링커 기를 통해 펩티드 덴드론에 부착된다. 예를 들어, 아미드 결합을 통해 폴리에틸렌 글리콜에 연결되는 3-말레이미도 프로판산 작용기로 작용화된 폴리에틸렌 글리콜은 티올 반응성 시약이다. 폴리에틸렌 글리콜 분자의 다른 말단은 메틸 종결될 수 있다. 이러한 성질의 작용화 폴리에틸렌 글리콜 기가 PEG 기와 펩티드 덴드론 사이의 링커 기로 이어지는 것을 사용한 반응은 다음과 같이 예시될 수 있다:
여기서, "PD-SH"의 "SH"는 시스테인 측쇄 상의 티올을 지칭하고, PD는 펩티드 덴드론이고, "n"은 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛의 수이다.
분지형 PEG 기를 포함하는 추가로 작용화된 PEG 기의 예는 다음을 포함한다:
.
분지형 PEG 기를 포함하는 이러한 펩티드 덴드론의 예로는 다음이 있다:
여기서, n은 -CH2CH2O- 반복 서브유닛의 수이고, ∑n(모든 n개의 기를 합한 합계)은 4~250이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 분자량 범위가 0.5~30 kDa인 중합체를 지칭할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 분자량 범위가 2~20 kDa인 중합체를 지칭할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 분자량 범위가 4~11 kDa인 중합체를 지칭할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 분자량 범위가 1~6 kDa인 중합체를 지칭할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 분자량 범위가 약 2 kDa인 중합체를 지칭할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 분자량 범위가 약 5 kDa인 중합체를 지칭할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 분자량 범위가 약 10 kDa인 중합체를 지칭할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n >3이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n >10이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n >20이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n >30이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n >50이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n >100이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n >150이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n >200이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n >250이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n <300이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n <250이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n <200이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n <150이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n <100이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n <50이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n <40이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n <30이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n <20이다.
폴리에틸렌 글리콜이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 지칭할 수 있으며, 여기서, n <10이다.
표적화 기
추가 실시 형태에서, 본원에 기술된 펩티드 덴드론은 표적화 기를 추가로 포함할 수 있다. 표적화 기는 세포에 결합하고/하거나 세포 내재화를 촉진하는 표적화 모이어티를 지칭한다. 표적화 기는, 선택적으로 연결 기를 통해 다음과 같이 펩티드 덴드론의 PEG 기에 부착될 수 있다:
표적화 기가 언급된 임의의 실시 형태에서, 표적화 기는 펩티드, 항체, 당 또는 소분자로부터 선택될 수 있다.
선택적으로 연결기를 통해 PEG 기에 부착될 수 있는 적합한 표적화 펩티드는 다음을 포함한다:
· 전달 수용체 표적화 펩티드, 예를 들어 Ac-KGGGAWSIIDCSMNYCLYIEG(서열 번호 3)(여기서, 볼드체 "C"는 시스테인이 디술피드 결합을 통해 가교결합됨을 나타냄)(예를 들어 https://doi.org/10.21954/ou.ro.0000d744);
· 환형 RGD 펩티드, 예를 들어 염증이 있는 혈관계 및 종양에서 a3b5 인테그린을 표적화하는 것, 예를 들어 시클로(-Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys)(서열 번호 4):
; 및
· 근육 표적화 펩티드, 예를 들어 ASSLNIA(서열 번호 6)(T I Samoylova 1, B F Smith. Muscle Nerve. 1999 Apr;22(4):460-6; doi: 10.1002/(sici)1097-4598(199904)22:4<460::aid-mus6>3.0.co;2-l).
적합한 표적화 항체는 다음을 포함한다:
· T 세포 표적화 항체, 예를 들어 항-CD3 Fab(Van Wauwe et al. J Immunol, 1980, 124(6):2708-2713); 및
· 포낭 표적화 항체, 예를 들어 Meca32 단량체성 FC(예를 들어, 다음에 기술된 바와 같은 항체: Gabriela M. Marchetti,et al. Commun Biol. 2019; 2: 92; 2019년 3월 7일 온라인 공개. doi: 10.1038/s42003-019-0337-2 및 이와 유사한 것)
적합한 표적화 당은 간의 아시알로당단백질 수용체를 표적화하는 것, 예를 들어 GalNac 및 트리-GalNac 함유 분자, 예를 들어 다음을 포함한다:
.
적합한 소분자 표적화제는 폴레이트를 포함한다.
일부 표적화 기의 경우, 상기 PEG 기의 부착에 대해 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 표적화 기 상의 -SH 기를 사용하여 PEG 기에 부착할 수 있다. 전형적으로 이는 링커 기를 통해 표적화 기가 폴리에틸렌 글리콜 기에 부착되는 것으로 이어진다. 유리한 시약은 티올 화학을 통해 펩티드 덴드론 및 표적화 기에 콘쥬게이션될 수 있는 이중작용성 PEG 시약이다. 하나의 이러한 시약으로는 분자의 양 말단이 말레이미도프로피오네이트 기로 작용화된 PEG 시약이 있다. PEG 기 및 펩티드 덴드론과 PEG 기 및 표적화 기 사이에 링커 기를 생성하는 이러한 성질의 이중작용화된 폴리에틸렌 글리콜 기를 사용하는 반응의 단순화된 버전은 다음과 같이 예시될 수 있다:
여기서, "PD-SH"의 "SH"는 시스테인 측쇄 상의 티올을 지칭하고, "TG-SH"의 "SH"는 표적화 기의 반응성 티올을 지칭하고, PD는 펩티드 덴드론이고, TG는 표적 기이고, "n"은 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛의 수이다.
펩티드 표적화 기, 또는 또는 또 다른 표적화 기(반응성 아민을 가짐)(예를 들어, 아민 작용화된 당)는 대안적인 활성화 PEG 시약을 사용하여 PEG 기에 부착될 수 있다. 전형적으로 이는 또한 링커 기를 통해 표적화 기가 폴리에틸렌 글리콜 기에 부착되는 것으로 이어진다. 유리한 시약은 티올 화학을 통해 펩티드 덴드론에 콘쥬게이션되고 아미드 결합을 통해 펩티드 표적화 기에 콘쥬게이션될 수 있는 이중작용성 PEG 시약이다. 하나의 이러한 시약으로는 분자의 한 말단이 말레이미도프로피오네이트 기로 작용화되고 다른 하나가 테트라플루오로페닐(TFP) 에스테르로 작용화된 PEG 시약이 있다. 이러한 성질의 이중작용화된 폴리에틸렌 글리콜 기를 사용하는 반응의 단순화된 버전은 다음과 같이 설명될 수 있다:
말단 아미노 기는 선택적으로 변형 아미노 기일 수 있음
일 실시 형태에서, 펩티드 덴드론의 말단 아미노 기는 비변형될 수 있다. 비변형 말단 아미노 기는 이것이 -NH2 기라는 것을 의미한다.
일 실시 형태에서, 펩티드 덴드론의 말단 아미노 기는 변형된 아미노 기일 수 있다.
변형은 전형적으로 화학기 부가, 새로운 결합의 생성 및 화학기의 제거를 포함하지만 이에 한정되지 않는 화학적 변형이다. 변형된 아미노 기는 당업자에게 잘 공지되어 있고, 아세틸화, 데스아미노, N-저급 알킬, N-디 저급 알킬, 제약된(constrained) 알킬(예를 들어, 분지형, 환형, 융합, 아다만틸) 및 N-아실 변형을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 변형된 아미노 기는 또한 N-말단(예를 들어, pyroGlu) 보호된 아미노 기를 수반하는 내부 아미드 결합 또는 방사성표지, 형광 태그 또는 친화성 태그(예를 들어, 비오틴)의 부착을 포함할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 변형된 아미노 기는 또한 완충 기(2-아미노-6-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카르보닐]아미노}헥산산; 2-아미노-6-[(티오모르폴린-3-카르보닐)아미노]헥산산; 및 2-아미노-6-[2-(모르폴린-4-일)아세트아미도]헥산산, 및 가교결합 기(즉 실로코펜타디엔)를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
아미노 기에 대한 적합한 보호기는, 예를 들어 아실 기, 예를 들어 알카노일 기, 예컨대 아세틸, 알콕시카르보닐 기, 예를 들어, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐 또는 t-부톡시카르보닐 기, 아릴메톡시카르보닐 기, 예를 들어 벤질옥시카르보닐, 또는 아로일 기, 예를 들어 벤조일이다. 특정 변형 아미노 기는 아실아미노이다. 특정 변형 아미노 기는 아세틸아미노이다.
저급 알킬은 t-부틸, 부틸, 프로필, 이소프로필, 에틸 및 메틸을 포함하는, C1-4알킬이다.
말단 카르복시 기는 선택적으로 변형 카르복시 기일 수 있음
일 실시 형태에서, 펩티드 덴드론의 말단 카르복시 기는 비변형된다. 비변형 말단 카르복시 기는 이것이 -C(O)OH 기라는 것을 의미한다.
일 실시 형태에서, 펩티드 덴드론의 말단 카르복시 기는 변형된 카르복시 기이다.
변형은 전형적으로 화학기 부가, 새로운 결합의 생성 및 화학기의 제거를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 화학적 변형이다. 변형된 카르복시 기는 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 아미드, 저급 알킬 아미드, 제약된 알킬(예를 들어, 분지형, 환형, 융합, 아다만틸), 디알킬 아미드 및 저급 알킬 에스테르 변형을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 변형된 카르복시 기는 또한 보호된 카르복시 기 또는 방사성표지, 형광 태그 또는 친화성 태그(예를 들어, 비오틴)의 부착 또는 세포-표적화 리간드를 포함할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 카르복시 기에 대한 적합한 보호기는, 예를 들어, 에스테르화 기, 예를 들어, 메틸 에틸 기, t-부틸 기 또는 벤질 기이다. 특정 변형 카르복시 기는 -CO2NH2이다. 특정 변형 카르복시 기는 C-말단 아미드화이다. 특정 변형 카르복시 기는 카르복스아미드 기이다. 특정 변형 카르복시 기는 N-(C1-4알킬)카르바모일 기이다.
제약 활성제
본원에 기술된 조성물 및 방법은 제약 활성제를 전달하기에 적합하다. 제약 활성제는 인간 또는 동물 신체 상에서 약리학적 효과를 발휘하여 치료적 결과를 초래할 수 있는 임의의 물질이다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 유전 물질, 화학적으로 변형된 핵산, 올리고뉴클레오티드, 치료 펩티드, 화학요법제, 단백질, 단백질 콘쥬게이트, 조영제, CRISPR 기술과 관련된 단백질 핵산 및 천연 바이러스 성분, 예컨대, 캡시드 또는 효소로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 유전 물질로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 핵산으로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 유전 물질, 예컨대, DNA 또는 RNA로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 유전 물질, 예컨대, DNA 및 RNA로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 유전 물질, 예컨대, DNA 및/또는 RNA로부터 선택될 수 있다.
DNA가 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 플라스미드, 선형 DNA, 짧은 단일 또는 이중 가닥 DNA, 최소화된 벡터, 예컨대, 미니-서클 및 미니-스트링, 헤어핀 및 십자형 DNA를 비롯한 폴딩된 DNA, 및 바이러스 유래 DNA일 수 있다.
RNA가 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 mRNA 또는 siRNA일 수 있다.
RNA가 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 mRNA, gRNA 및/또는 siRNA일 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 DNA로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 RNA로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 DNA 및 mRNA로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 mRNA 및 gRNA로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 DNA 및 gRNA로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 DNA 및 mRNA 및 gRNA로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 올리고뉴클레오티드로부터 선택될 수 있다.
올리고뉴클레오티드가 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), RNA 간섭(RNAi) 및 압타머 RNA일 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 화학적으로 변형된 핵산으로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 치료 펩티드로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 화학요법제로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 단백질로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 단백질 콘쥬게이트로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 조영제로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 CRISPR 기술과 관련된 단백질 핵산으로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 CRISPR 기술과 관련된 mRNA, gRNA 및/또는 DNA로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 천연 바이러스 성분, 예컨대, 캡시드 또는 효소로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 치료 단백질, 예컨대, 단클론 항체, 예를 들어, 압식시맙, 아달리무맙, 알레파셉트, 알렘투주맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 베즐로톡수맙, 카나키누맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 다클리주맙, 데노수맙, 에팔리주맙, 골리무맙, 인플렉트라, 이필리무맙, 익세키주맙, 나탈리주맙, 니볼루맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 리툭시맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 세쿠키누맙 및 우스테키누맙; 효소, 예를 들어, 아갈시다아제 베타, 이미글루세라아제, 벨라글루세라아제 알파, 탈리글루세라아제, 알글루코시다아제 알파, 알글루코시다아제 알파, 라로니다아제, 이두르술파아제 정맥내 및 갈술파아제; 성장 인자; 및 사이토카인, 예를 들어, IL-2 및 IFN-α를 코딩하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 치료 단백질, 예컨대, 단클론 항체; 효소; 성장 인자; 및 사이토카인을 코딩하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 치료 단백질, 예컨대, 단클론 항체; 효소; 성장 인자; 전사 인자; 및 사이토카인을 코딩하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 단클론 항체를 코딩하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 MEDI8852 및 STK11을 코딩하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 압식시맙, 아달리무맙, 알레파셉트, 알렘투주맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 베즐로톡수맙, 카나키누맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 다클리주맙, 데노수맙, 에팔리주맙, 골리무맙, 인플렉트라, 이필리무맙, 익세키주맙, 나탈리주맙, 니볼루맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 리툭시맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 세쿠키누맙 및 우스테키누맙으로부터 선택되는 단클론 항체를 코딩하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 효소를 코딩하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 아갈시다아제 베타, 이미글루세라아제, 벨라글루세라아제 알파, 탈리글루세라아제, 알글루코시다아제 알파, 알글루코시다아제 알파, 라로니다아제, 이두술파아제 정맥내 및 갈술파아제로부터 선택되는 효소를 코딩하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 성장 인자를 코딩하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 전사 인자를 코딩하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 전사 인자 HNF-4α를 코딩하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 사이토카인을 코딩하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 IL-2 및 IFN-α로부터 선택되는 사이토카인을 코딩하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 siRNA로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 mRNA로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 gRNA로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 언급된 임의의 실시 형태에서, 제약 활성제는 종양유전자, 성장 인자 및 사이토카인 발현의 조절을 포함하는 응용분야에서 단백질 발현을 감소시키기 위해 사용되는 siRNA로부터 선택될 수 있다.
제약 활성제가 핵산으로부터 선택되는 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론 염기성 아미노산 잔기 : 핵산 포스페이트(N:P)의 비는 약 2:1이다.
제약 활성제가 핵산으로부터 선택되는 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론 염기성 아미노산 잔기 : 핵산 포스페이트(N:P)의 비는 약 4:1이다.
제약 활성제가 핵산으로부터 선택되는 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론 염기성 아미노산 잔기 : 핵산 포스페이트(N:P)의 비는 약 6:1이다.
제약 활성제가 DNA로부터 선택되는 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론 염기성 아미노산 잔기 : DNA 포스페이트(N:P)의 비는 약 2:1이다.
제약 활성제가 DNA로부터 선택되는 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론 염기성 아미노산 잔기 : DNA 포스페이트(N:P)의 비는 약 4:1이다.
제약 활성제가 DNA로부터 선택되는 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론 염기성 아미노산 잔기 : DNA 포스페이트(N:P)의 비는 약 6:1이다.
제약 활성제가 RNA로부터 선택되는 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론 염기성 아미노산 잔기 : RNA 포스페이트(N:P)의 비는 약 2:1이다.
제약 활성제가 RNA로부터 선택되는 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론 염기성 아미노산 잔기 : RNA 포스페이트(N:P)의 비는 약 4:1이다.
제약 활성제가 RNA로부터 선택되는 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론 염기성 아미노산 잔기 : RNA 포스페이트(N:P)의 비는 약 6:1이다.
제약 활성제가 RNA로부터 선택되는 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론 염기성 아미노산 잔기 : DNA 및 RNA 포스페이트(N:P)의 비는 약 2:1이다.
제약 활성제가 RNA로부터 선택되는 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론 염기성 아미노산 잔기 : DNA 및 RNA 포스페이트(N:P)의 비는 약 4:1이다.
제약 활성제가 RNA로부터 선택되는 임의의 실시 형태에서, 펩티드 덴드론 염기성 아미노산 잔기 : DNA 및 RNA 포스페이트(N:P)의 비는 약 6:1이다.
제약적 전달 시스템
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론을 포함하는 제약적 전달 시스템이 제공된다. 제약적 전달 시스템은 인간 또는 동물 신체 내로, 예를 들어 세포 내로 제약 활성제를 전달하는 데 사용될 수 있는 전달 시스템이다.
일 실시 형태에서, 제약적 전달 시스템에서의 본원에 기술된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론의 용도가 제공된다.
일 실시 형태에서, 제약적 전달 시스템으로 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론이 제공된다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론을 포함하는 제약 활성제용 전달 시스템이 제공된다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 하나 이상의 상이한 펩티드 덴드론, 예를 들어 2개의 상이한 펩티드 덴드론을 포함할 수 있다. 펩티드 덴드론의 혼합물을 사용하여 표적화 모이어티를 혼입하고/하거나, 나노입자를 안정화하고/하거나 상이한 특성들을 상승적으로 조합할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론을 포함하는 제약적 전달 시스템이 제공된다.
"하나 이상의 펩티드 덴드론"이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 하나의 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
"하나 이상의 펩티드 덴드론"이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 2개의 상이한 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
"하나 이상의 펩티드 덴드론"이 언급된 임의의 실시 형태에서, 이는 하나 초과의 상이한 펩티드 덴드론을 지칭할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론을 포함하는 제약 활성제용 전달 시스템이 제공된다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론, 및 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 1:50인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:50 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:50 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 1:20인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:20 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:20 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 1:15인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:15 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:15 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 1:10인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:10 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:10 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 1:5인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:5 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:5 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 2:4인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 2:4 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 2:4 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 1:1인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 4:2인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 4:2 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 4:2 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 5:1인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 5:1 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 5:1 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 10:1인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 10:1 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 10:1 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 15:1인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 15:1 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 15:1 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 20:1인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 20:1 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 20:1 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 50:1인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 50:1 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약적 전달 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 50:1 미만인 것을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 펩티드 덴드론은 생리적 등장 완충제(예를 들어, 5% 트레할로스 또는 수크로스, 20 mM HEPES 또는 인산염 완충 식염수(PBS))에서 부드럽게 혼합되면서 조합되어 나노입자를 형성할 수 있다. 이들 제형은 즉시 전달될 수 있거나, 4℃에서 보관되거나 또는 장기간 보관을 위해 동결건조될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 펩티드 덴드론은 경구 투여용, 예를 들어, 정제 또는 캡슐로서, 비경구 주사용(정맥내, 피하, 피내, 근육내, 혈관내 또는 주입을 포함), 연고 또는 크림으로서 국소 투여용 또는 좌약으로서 직장 투여용에 적합한 형태로 제조될 수 있다. 특히, 본원에 기술된 바와 같은 펩티드 덴드론은 주사용, 예를 들어, 정맥내, 피하, 피내 또는 근육내 주사에 적합한 형태로 제조될 수 있다.
추가 부형제
일 실시 형태에서 추가 부형제가 본원에 기술된 하나 이상의 펩티드 덴드론 및 제약 활성제를 포함하는 제형 및 조성물에 첨가될 수 있다. 이는 나노입자 안정성을 향상시키고 핵산 패키징을 향상시켜 세포 전달 및 형질감염을 향상시킬 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론 및 지질을 포함하는 제형이 제공된다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론, 및 1:1(w/w)의 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-n,n,n-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA) 및 디올레오일 포포티딜에탄올아민(DOPE)으로부터 선택되는 지질을 포함하는 제형이 제공된다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론, 및 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-n,n,n-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)와 디올레오일 포포티딜에탄올아민(DOPE)의 혼합물, (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘트-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(MC3), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디미리스토일 글리세롤(DMG), 및 헵타데칸-9-일 8-((2-히드록시에틸)(6-옥소-6-(운데실옥시)헥실)아미노)옥타노에이트(SM-102) 또는 콜레스테롤로부터 선택되는 지질을 포함하는 제형이 제공된다.
용도
본원에 기술된 바와 같은 펩티드 덴드론은 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애, 흡수불량 장애를 포함하는 광범위한 질병을 치료하는 데 적합한 제약 활성제를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 치료적 응용은 단백질의 전신 발현(즉, 바이러스 치료를 위한 항체) 또는 표적화된 전달(즉, 전이성 종양, 생체 내 CAR-T)을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 요법에서 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론을 포함하는 제약적 전달 시스템이 제공된다.
일 실시 형태에서, 요법에서 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론을 포함하는 제약 활성제용 전달 시스템이 제공된다.
일 실시 형태에서, 제약 활성제를 세포에 전달하는 데 사용하기 위한 펩티드 덴드론이 제공된다.
일 실시 형태에서, 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애 또는 흡수불량 장애의 치료에서 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론을 포함하는 제약적 전달 시스템이 제공된다.
일 실시 형태에서, 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애 또는 흡수불량 장애의 치료에서 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론을 포함하는 제약 활성제용 전달 시스템이 제공된다.
일 실시 형태에서, 유전자 요법에서 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론을 포함하는 제약 활성제용 전달 시스템이 제공된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료"는 본원에 기술된 바와 같은 질환 또는 장애, 또는 이의 하나 이상의 증상의 발생을 역전시키거나, 완화시키거나, 지연시키거나, 진행을 억제하는 것을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 치료는 하나 이상의 증상이 발생된 후에 수행될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 치료는 증상이 없을 때 수행될 수 있다. 예를 들어, 치료는 (예를 들어, 증상의 병력 및/또는 유전적 요인이나 기타 감수성 요인에 비추어) 증상의 발생 전에 감수성 개체에 대해 수행될 수 있다. 치료는 또한, 예를 들어 증상의 재발을 나타내거나 지연시키기 위해, 증상이 해소된 후에도 계속될 수 있다.
제약 조성물
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론을 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
제약 조성물이 하나 이상의 펩티드 덴드론을 포함하는 임의의 실시 형태에서, 제약 조성물은 하나의 펩티드 덴드론을 포함할 수 있다.
제약 조성물이 "하나 이상의 펩티드 덴드론"을 포함하는 임의의 실시 형태에서, 제약 조성물은 하나 초과의 상이한 펩티드 덴드론을 포함할 수 있다.
제약 조성물이 "하나 이상의 펩티드 덴드론"을 포함하는 임의의 실시 형태에서, 제약 조성물은 2개의 상이한 펩티드 덴드론을 포함할 수 있다.
제약 조성물이 "하나 이상의 펩티드 덴드론"을 포함하는 임의의 실시 형태에서, 제약 조성물은 적어도 2개의 상이한 펩티드 덴드론을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론 및 제약 활성제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론을 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
일 실시 형태에서, 2개 이상의 상이한 펩티드 덴드론을 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론 및 제약 활성제를 포함하는 조성물이 제공된다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론, 및 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 1:50인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:50 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:50 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 1:20인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:20 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:20 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 1:15인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:15 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:15 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 1:10인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:10 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:10 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 1:5인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:5 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 1:5 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 2:4인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 2:4 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 2:4 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 1:1인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 4:2인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 4:2 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 4:2 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 5:1인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 5:1 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 5:1 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 10:1인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 10:1 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 10:1 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 15:1인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 15:1 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 15:1 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 20:1인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 20:1 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 20:1 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 약 50:1인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 50:1 초과인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하는 펩티드 덴드론 : 폴리에틸렌 글리콜 기와 표적화 기 둘 모두를 포함하는 펩티드 덴드론의 비가 50:1 미만인 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 요법에서 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론을 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
일 실시 형태에서, 요법에서 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론 및 제약 활성제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
일 실시 형태에서, 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애 또는 흡수불량 장애의 치료에서 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론을 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
일 실시 형태에서, 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애 또는 흡수불량 장애의 치료에서 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론 및 제약 활성제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
일 실시 형태에서, 요법에서 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론 및 제약 활성제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
일 실시 형태에서, 유전자 요법에서 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론을 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
치료 방법
일 실시 형태에서, 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애 또는 흡수불량 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 이는 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시 형태에서, 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애 또는 흡수불량 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 이는 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론 및 제약 활성제를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론을 투여하는 단계를 포함하는, 유전자 요법의 방법이 제공된다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론 및 제약 활성제를 투여하는 단계를 포함하는, 유전자 요법의 방법이 제공된다.
제약 조성물의 용도
일 실시 형태에서, 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애 또는 흡수불량 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론을 포함하는 제약 조성물의 용도가 제공된다.
일 실시 형태에서, 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애 또는 흡수불량 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론 및 제약 활성제를 포함하는 제약 조성물의 용도가 제공된다.
일 실시 형태에서, 유전자 요법에서의 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론을 포함하는 제약 조성물의 용도가 제공된다.
일 실시 형태에서, 유전자 요법에서의 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론 및 제약 활성제를 포함하는 제약 조성물의 용도가 제공된다.
키트
일 실시 형태에서 하기를 포함하는 키트가 제공된다:
a) 제1 유닛에서 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론;
b) 제2 유닛에서 제약 활성제; 및
c) 상기 제1 유닛 및 제2 유닛을 포함하기 위한 용기 수단.
일 실시 형태에서 하기를 포함하는 키트가 제공된다:
a) 제1 유닛에서 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 덴드론;
b) 제2 유닛에서 제약 활성제; 및
c) 상기 제1 유닛 및 제2 유닛을 포함하기 위한 용기 수단.
d) 사용 설명서.
[도면의 간단한 설명]
도 1: 실시예 2에 기술된 바와 같은 펩티드 덴드론(PD)의 합성의 대표적인 개략도.
도 2a 및 도 2b: 실시예 7에 기술된 바와 같은 음이온 해리(도 2a) 및 카텝신 B 분해성(도 2b)에 대한 펩티드 나노입자(PNP) 안정성의 결과. 나노입자 안정성은 무손상 핵산을 표적 세포 내로로 효율적으로 전달하는 데 필수적이지만; 상기 핵산은 그 기능을 수행하기 위해 세포 흡수시 방출되어야 한다. 이를 위해 PD는 세포 흡수시 효소적으로 분해되도록 설계되었다. 자극에 반응하여 방출되는 물질은 향상된 효능 및 더 낮은 독성을 갖는 것으로 결정되었다. 결과는 PD3(MN) 및 PD3(TM) 나노입자가 PD1, 비변형(NM) PD 및 PD3(His)으로 제형화된 나노입자(50 μg/mL를 초과하는 덱스트란 술페이트 농도에서 DNA를 쉽게 방출함)에 비해 음이온 해리에 훨씬 더 저항성이 있었음을 보여준다. 더욱이, PD3(M), PD3(MN) 및 PD3(TM)은 비변형 PD3 및 모든 PD2 제형에 비해 카텝신-B 활성에 반응하여 쉽게 DNA를 방출하였다.
도 3a, 도 3b, 및 도 3c: 실시예 8에 기술된 바와 같은 시험관 내 형질감염 스크리닝으로부터 얻은 결과. 도 3a) 인간 비소세포폐암 세포주 H1299 및 도 3b) 마우스 근관 세포주 C2C12에 도시된 바와 같이 상이한 세포주들을 평가하였다. 발광을 4회 수집하여 평균 +/- 표준 편차로서 제시하였다. 도 3c에서, 2가지 상이한 NP 제형인 PD3(MN) 및 PD3(TM)을 다양한 세포주(H1299, C2C12, HEK393 및 HEPG2)에서 스크리닝하여 상이한 응용분야들에 대한 최고 수행자를 확인하였다. 이들 결과는 MN 변형이 폐(H1299; 림프로부터 유래된 인간 비소세포 폐암종 세포주) 및 근육 세포(C2C12; 마우스 근아세포)에서 탁월하였음을 보여준다. 대안적으로, TM 변형은 신장(HEK393; 인간 배아 신장 세포) 및 간(HEPG2; 인간 간암 세포주)을 포함한 여과 기관으로부터 유래된 세포주에서 가장 잘 수행하였다.
도 4: 실시예 9에 기술된 루시퍼라아제 mRNA 마우스 발현 실험으로부터 얻은 결과. DNA NP 번역 생체 내 번역을 마우스 근육내 발현 연구에서 테스트하였다. 리포터 단백질 루시퍼라아제가 발현되어 발현의 실시간 추적이 가능해졌다. 발현이 관찰되었으며 이는 1개월의 모니터링 기간 동안 일관된 것으로 결정되었다. IVIS를 사용하여 매주 발현을 평가하고, 발광을 4회 수집하여 평균 +/- 표준 편차로 제시하였다. 결과는 MeO-PEG-PD(MN)가 생체 내에서 IM 주입을 통해 DNA를 효율적으로 전달하여 1개월 동안 안정적으로 발현된다는 것을 보여준다.
도 5a 및 도 5b. 실시예 10에 기술된 치료적 발현 실험으로부터 얻은 결과. 도 5a는 항-독감 mAb MEDI8852를 사용한 결과를 보여주고, 도 5b는 종양 억제 인자 세린/트레오닌 키나아제 11(STK11)을 사용한 결과를 보여준다. 간접 ELISA를 통해 MEDI8852를 정량화하고, 발현 수준을 3회 수집하여 평균 +/- 표준 편차로 제시하였다. 발현의 추가 확인으로서 질량 분석법을 사용하였다. 웨스턴 블롯을 사용하여 STK11을 정량화하였다. NP의 목표는 숙주 세포를 사용하여 치료 단백질을 발현시키는 것이다. 이들 결과는 NP가 치료제 작용 방식에 대해 관심있는 세포주에서 생체 내에서 mAb(즉 MEDI8852(항-독감 mAb)) 및 효소(즉 종양 억제자 세린/트레오닌 키나아제 11(STK11))를 비롯한 다양한 치료제를 발현시키는 능력을 가짐을 보여준다.
도 6a, 도 6b, 및 도 6c. 실시예 11에 기술된 바와 같이 시험관 내에서의 표적화된 DNA NP 형질감염으로부터 얻은 결과. 표적화된 PD 나노입자를 다양한 세포주에서 테스트하였으며, 이는 형질감염을 부스팅하는 것으로 결정되었다. H1299에서 TfR(도 6a) 및 cRGD(도 6b)는 상업용 형질감염 대조군 폴리에틸렌이민(PEI)에 비해 전반적인 발현 수준(GFP 전달, 전달) 및 동역학(Gwiz Luciferase 전달, 발광)을 향상시켰다. 비표적화 NP에 비해 C2C12 및 CT26에서 유사한 형질감염 개선이 관찰되었다(도 6c). 표적화된 DNA 전달을 사용하여 형질감염 효율을 증가시키고/시키거나 세포 특이적 발현을 달성할 수 있다. PD 플랫폼은 형질감염을 유의하게 부스팅하는 펩티드 및 항체 기반의 다양한 표적화 리간드(실시예 3 및 실시예 5에 예시된 바와 같음)의 혼입을 허용하는 유연한 표적화 전략을 이용하여 의도적으로 설계되었다. 더욱이, 페길화 및 표적화를 통해 고도로 특이적인 발현이 달성되었다. 이들 결과는 표적화를 사용하여 매우 다른 다수의 세포주에서 발현을 향상시킬 수 있음을 보여준다.
도 7: 실시예 12에 기술된 바와 같은 폐 표적화 NP 생체 내 실험으로부터 얻은 결과. PV1 표적화 나노입자를 BALB/C 마우스에 IV 투여하고, 루시퍼라아제 발현을 IVIS를 통해 8일 동안 모니터링하였다. 3일차 및 8일차의 생체 외 이미징에 의하면 최적화된 리간드 밀도를 갖는 나노입자만이 표적화 폐 내에서 유의한 발현을 가짐이 입증되었다. 세포 특이적 전달은 핵산 기반 요법의 잠재적인 응용을 크게 확장시킨다. 이들 결과는 항체 기반 표적화 모이어티가 표적화된 PD NP를 생성하는 데 사용될 수 있고 PV1 표적화가 폐를 표적화하는 데 사용될 수 있음을 보여준다. 이 예에서 PV1 표적화 NP는 최소 8일 동안 마우스 폐 내에서 고도로 특이적인 발현을 달성하는 것으로 입증되었다.
도 8: 실시예 13에 기술된 바와 같이 pDNA 대 mRNA PD3(MN) 나노입자를 사용한 H1299 세포의 형질감염으로부터 얻은 결과. H1299 세포를 mRNA 또는 pDNA로 제조된 나노입자로 처리하였다. 형질감염 동역학은 Incucyte를 사용하여 실시간으로 모니터링하여 세포를 형광 이미징하고 기기 소프트웨어를 사용하여 형질감염의 척도로서 총 적색 형광 강도를 정량화하였다. mRNA는 성공적인 트랜스진 발현을 위한 복잡한 핵 국소화를 필요로 하지 않으며 DNA가 전달되는 경우보다 더 빠른 발현 동역학을 촉진하는 것으로 입증되었다. 본 발명의 NP는 mRNA를 성공적으로 패키징하고 전달하는 것으로 입증되었으며 예상대로 DNA가 전달된 경우보다 더 빠른 발현 동역학을 달성한다. 이들 결과는 mRNA 발현이 유의하게 더 빠르지만 48시간이 지나면 pDNA가 전달되는 경우와 유사한 수준의 발현이 달성됨을 보여준다.
도 9: 실시예 14에 기술된 루시퍼라아제 마우스 발현 실험으로부터 얻은 결과. pDNA 또는 mRNA가 MeO PEG-PD3(MN)과 복합체를 형성한 것을 이용하여 근육내로 CD 마우스를 처리하였다. IVIS를 사용하여 발현을 평가하였다. 발광을 4회 수집하여 평균 +/- 표준 편차로서 제시하였다. 이들 결과는 mRNA NP가 더 빠른 발현 동역학을 갖는 PD 플랫폼을 사용하여 mRNA 및 pDNA 둘 모두를 생체 내에서 근육내로 전달할 수 있음을 보여준다.
도 10: 실시예 15에 기술된 바와 같이 마우스 실험에서 항-독감 mAb MEDI8852 발현으로부터 얻은 결과. IV 주사 및 MEDI8852 발현을 통해 mRNA NP로 처리된 BALB/c 마우스를 ELISA를 통해 정량화하였다. 이들 결과는 8일의 기간에 걸쳐 유의한 수준의 mAb가 검출되었음을 보여주며, 생체 내에서 치료 단백질을 발현하는 PD의 능력을 확인시켜 준다.
도 11: 실시예 16에 기술된 바와 같이 항-CD3 표적화 Fab의 상이한 디스플레이들을 갖는 mCherry mRNA/PD3(MN) NP로 비활성화 일차 T 세포를 형질감염시켜 얻은 결과. 이들 결과는 비표적화 NP가 T 세포를 형질감염시키는 능력을 갖지만; CD3 표적화는 표적화 fab가 낮은(25%) 수준~중간(50%) 수준으로 디스플레이되는 경우 전달을 유의하게 향상시킴을 보여준다.
도 12: CTNNB1 침묵화로부터 얻은 결과는 실시예 17에 기술된 바와 같이 리포터 분석 및 웨스턴 블롯을 통해 모니터링되었다. siRNA를 전달하는 NP의 능력은 종양유전자 CTNNB1을 표적화하는 결장암 세포주 SW480에서 입증되었다. 1%(w/w)의 1:1의 DOPE:DOTMA를 갖는 PD3(MN) 및 PD3(TM)은 웨스턴 블롯을 통해 최소 5일에 걸쳐 CTNNB1을 효과적으로 침묵화하는 것으로 입증되었다. 이들 결과는 PD NP가 siRNA를 표적 세포에 효율적으로 전달할 수 있음을 보여준다.
도 13a, 도 13b, 및 도 13c: 실시예 18에 기술된 바와 같이 표적화 펩티드 cRGD의 상이한 디스플레이들을 갖는 PD3(MN) NP에 의한 카테닌-B의 침묵화로부터 얻은 결과. CTNNB1 리포터 활성 SW480 TopFlash(도 13a), CTNNB1 단백질 수준 SW480(도 13b) 및 Colo205 증식(도 13c). 많은 응용분야에 있어서 국소화된 전달이 필요하다. NP 플랫폼을 사용하여 "온/오프" 전달이 달성될 수 있는지를 결정하기 위해, 상이한 양의 cRGD 디스플레이를 사용하여 페길화 NP를 제조하고 이를 사용하여 결장암 세포주 SW480 및 Colo205를 형질감염시켰다. 페길화는 침묵화를 중지시키거나 감소시키는 것으로 결정된 반면, NP에 cRGD를 설치하면 NP 활성이 복원되었다. 이들 결과는 페길화를 사용하여 비특이적 세포 흡수를 감소시킬 수 있고 표적화를 사용하여 NP 활성을 복원할 수 있음을 보여준다.
도 14: 실시예 18에 기술된 바와 같이 마우스 전이성 결장암 모델에서 종양 부피로부터 얻은 결과. 확립된 결장암 세포주 Colo205 종양을 갖는 마우스에게 8일차, 9일차, 15일차 및 16일차에 다양한 정도의 cRGD 표적화를 갖는 NP를 정맥내 투여하였다(흑색 화살표로 표시). 군은 비치료(A), 비표적화 NP를 투여한 마우스(B), 중간(C) 내지 고 cRGD(D) 디스플레이를 갖는 표적화 나노입자를 투여한 마우스를 포함하며, 여기서, 각각의 데이터 세트는 1마리의 마우스를 나타낸다. 시간 경과에 따른 평균(E) 및 연구 마지막 날(F)도 결정되었다. 표적화된 siRNA NP의 생체 내 번역을 마우스 모델에서 평가하였다. 높은 수준의 cRGD 디스플레이는 비표적화 NP에 비해 종양 성장을 유의하게 늦추는 것으로 결정되었다. 이들 결과는 cRGD 표적화 NP가 향상된 siRNA 전달을 달성할 수 있음을 보여주며 표적화 리간드 밀도의 중요성을 강조한다.
도 15: 실시예 19에 기술된 바와 같이 형광 표지된 DNA(Cy5) 및 mRNA(Cy5)로 제형화된 NP에 대한 형광 스펙트럼. Cy5 표지된 DNA가 있는 NP(그래프 1)는 청색 LED에 의해 여기되지 않으므로 형광이 그의 방출 파장(650~700 nm)에서 검출되지 않는다. Cy3 표지된 mRNA가 있는 NP(그래프 2)는 대략 550~600의 그의 방출 피크에서 여기되어 형광 발광한다. 이와 유사하게, Cy5 표지된 DNA로 제조된 NP가 Cy3 표지된 mRNA가 있는 NP와 조합된 것(그래프 3)은 Cy3 방출 피크에서 형광 발광한다. 중요한 것은 Cy5 표지된 DNA와 Cy3 표지된 mRNA의 1:1 혼합물로 제조된 NP(그래프 4)가 대략 560~700 nm의 Cy5 방출에서 방출의 증가를 보여주며, 이때 대략 550~600 nm의 Cy3 방출 피크에서 형광 강도가 이에 상응하여 감소한다. 이는 샘플 4의 DNA 및 mRNA가 근접해 있어(<5 nm), mRNA 상의 Cy3 형광단으로부터의 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 가능하게 하여 표지된 DNA의 Cy5 형광단을 여기시킴을 나타낸다. 이는 펩티드 덴드론 NP에서의 mRNA와 DNA의 공동캡슐화의 증거이다.
도 16: 실시예 19에 기술된 바와 같은 H1299 세포에서의 mRNA/DNA 하이브리드 PDID NP의 발현 동역학. DNA 발현을 GFP 형광 면적으로 측정하고, mRNA 발현을 mCherry 형광 면적으로 측정한다. GFP 발현은 100시간에 걸쳐 증가하는 반면, mRNA 발현은 대략 60시간에 최고조에 달한다. 중첩 형광 신호에 의해 정량화된 DNA/mRNA 공동발현의 양은 mRNA 발현과 유사한 동역학을 가지며, 이는 대략 65시간에 최고조에 달한다. 이들 결과는 DNA와 mRNA가 세포에 성공적으로 공동전달됨을 보여준다.
도 17: 실시예 19에 기술된 바와 같은 분화된 C2C12 세포에서의 mRNA/DNA 하이브리드 PDID NP의 발현 동역학. 분화된 C2C12 근육 세포는 근관으로 융합되고 비분열성이어서, 이들 세포를 형질감염시키기 어렵게 만든다. DNA 발현을 GFP 형광 면적으로 측정하고, mRNA 발현을 mCherry 발현 면적으로 측정한다. GFP 발현은 75시간에 걸쳐 증가하고, 이어서 플래토된(plateaued) 신호가 뒤따른다. mRNA 발현은 대략 60시간에 최고조에 달하고 서서히 감소한다. 중첩 형광 신호에 의해 정량화된 DNA/mRNA 공동발현의 양은 mRNA 발현과 유사한 동역학을 가지며, 이는 대략 60시간에 최고조에 달한다. 이들 결과는 DNA와 mRNA가 비분열 세포에 성공적으로 공동전달됨을 보여준다.
실시예
본원에서 사용한 약어
· NP: 나노입자;
· PD: 펩티드 덴드론;
· PDID: 펩티드 덴드론 세포간 전달
· 아미노산 "CIT": 시트룰린
· 본원에서 하기 약어가 변형된 라이신에 대해 사용된다:
하기 중합체 및 리간드를 펩티드 덴드론 내로 혼입하였다:
표 1. PD 내로 혼입된 표적화 모이어티의 요약.
실시예 1
변형된 라이신의 제조
방법 1: 1-{[(모르폴린-4-일)아세틸]옥시}피롤리딘-2,5-디온의 합성
(모르폴린-4-일)아세트산(1 g, 6.89 mmol)을 디클로로메탄(DCM)(25 mL) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)(872 mg, 7.58 mmol)에 용해시키고, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC·HCl)(1.60 g, 8.35 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반한 후 실리카 겔의 2" x 3" 패드를 통해 여과시켰다. 패드를 DCM(3 x 25 mL)으로 세척하고, 여과액과 세척액을 합하고, 농축시켜 1-{[(모르폴린-4-일)아세틸]옥시}피롤리딘-2,5-디온(1.3 g, 78%)을 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 3.75 (d, J=3.6 Hz, 4H), 3.57 (s, 2H), 2.85 (s, 4H), 2.67 (d, J=4.2 Hz, 4H); MS (ESI) 이론치:242.09, 실측치:243.3 (M+1).
방법 2: 1-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카르보닐]옥시}피롤리딘-2,5-디온의 합성
6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카르복실산(350 mg, 1.68 mmol)을 실온에서 교반하면서 DCM(25 mL)에 용해시켰다. NHS(213 mg, 1.85 mmol), 이어서 EDC·HCl(418 mg, 2.18 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 이어서, 실리카 겔의 2" x 3" 패드를 통해 여과시켰다. 패드를 DCM(3 x 25 mL) 및 에틸 아세테이트(25 mL)로 세척하였다. 여과액과 세척액을 합하고, 농축시켜 1-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카르보닐]옥시}피롤리딘-2,5-디온(325 mg, 63%)을 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.89 (s, 1H), 8.07 (dd, J = 9.3 Hz, 1.5 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 3.80 (d, J = 4.2 Hz, 4H) 3.72 (d, J = 4.2 Hz, 4H), 2.89 (s, 4H). MS (ESI) 이론치: 305.1, 실측치: 306.3 (M+1).
방법 3: tert-부틸 3-{[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]카르보닐}티오모르폴린-4-카르복실레이트의 합성
4-(tert-부톡시카르보닐)티오모르폴린-3-카르복실산(1 g, 4.04 mmol)을 교반하면서 실온에서 DCM(25 mL)에 용해시켰다. NHS(511 mg, 4.44 mmol)를 첨가한 후에 EDC·HCl(1.01 g, 5.25 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 이어서, 실리카 겔의 2" x 3" 패드를 통해 여과시켰다. 패드를 DCM(3 x 25 mL)으로 세척하고, 여과액과 세척액을 합하고, 농축시켜 tert-부틸 3-{[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]카르보닐}티오모르폴린-4-카르복실레이트(1.3 g, 93.4%)를 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 5.38 (br s, 1H), 4.43-4.22 (m, 1H), 3.46-3.21 (m, 1H), 3.19-3.10 (m, 1 H), 3.06-2.97 (m, 1H), 2.85 (s, 4H), 2.81-2.62 (m, 1H), 2.61-2.42 (m, 1H), 1.47 (s, 9H). MS (ESI) 이론치: 345.4 (M+1).
방법 4: N2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)-N6-(6-모르폴리노니코티노일)-L-라이신의 합성
플루오레닐메틸옥시카르보닐 클로라이드 L-라이신(Fmoc-Lys-OH)(15.3 g, 41.53 mmol, 1.2 eq)을 실온에서 기계적 교반 하에 THF-물(1:1, 800 mL)에 용해시켰다. DCM 중 상기 제조한 에스테르의 용액(방법 2)을 한 번에 첨가하고, 이어서 DIPEA(10.73 g, 82.99 mmol, 2.4 eq)가 뒤따랐다. 출발 물질이 소모될 때까지(TLC, 2시간) 반응물을 추가로 실온에서 교반하고, 이어서 에틸 아세테이트(EtOAc)(250 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 HCl(1 M, 200 mL)로 산성화시키고, 분별 깔때기에 붓고, 층들을 분리시켰다. 수성 층을 EtOAc(2 x 250 mL)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 염수(200 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 연한 갈색의 유성 잔사로서 얻었고, 이를 THF에 용해시키고, 실리카 겔 상에 흡착시키고, 실리카 겔 컬럼(7″ x 3″)에서 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 컬럼을 헥산 중 50% 에틸 아세테이트 및 100% 에틸 아세테이트로 세척하여 생성물을 용리시켰다(진공 흡인 하에). 필요한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 진공 하에 농축시켜 N2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)-N6-(6-모르폴리노니코티노일)-L-라이신(12.6 g, 65%)을 회백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.26 (br s, 1H), 8.62 (d, J = 1.5Hz, 1H), 7.93 (dd, J = 2.5, 9Hz, 1H), 7.71 (d, J = 7.5Hz, 2H), 7.53 (dd, J = 4.5, 7.5Hz, 2H), 7.35 (t, J = 7.5Hz, 2H), 7.23 (q, J = 6.5Hz, 2H), 6.59 (t, J = 5Hz, 1H), 6.48 (d, J = 9Hz, 1H), 5.99 (d, J = 8Hz, 1H), 4.41 (dd, J = 7.5, 12.5Hz, 1H), 4.31 (dd, J = 12, 18Hz, 2H), 4.15 (d, J = 7Hz, 1H), 3.71 (t, = 4.5Hz, 4H), 3.56-3.32 (m, 6H), 1.98-1.87 (m, 1H), 1.86-1.75 (m, 1H), 1.71-1.57 (m, 2H), 1.56-1.39 (m, 2H) ppm; 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 175.2, 166.6, 159.9, 156.6, 146.9, 144.1, 143.9, 141.4, 137.7, 127.9, 127.3, 125.3, 120.1, 119.5, 106.3, 67.2, 66.6, 53.8, 47.3, 45.3, 39.5, 32.0, 28.9, 22.4 ppm; MS (ESI) C31H34N4O6에 대한 정확한 질량 이론치 [M+H]+: 559.26, 실측치: 559.35.
방법 5: (2S)-2-아미노-6-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카르보닐]아미노}헥산산 (N6-(6-모르폴리노니코티노일)-L-라이신)(LYS(MN))의 합성
절차 1
N2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)-N6-(6-모르폴리노니코티노일)-L-라이신(방법 4)의 Fmoc 보호기를 당업계에 공지된 표준 절차에 의해, 예를 들어, DMF 중 20% 피페리딘을 이용하여, 제거할 수 있다.
절차 2
변형된 라이신을 700 μL의 NMP(15 mg, 26.87 μmol)에 용해시켰다. 300 μL의 피페리딘을 후속적으로, 교반하면서 상기 용액(피페리딘:NMP=7:3; 1 mL)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 변형된 라이신을 후속적으로 침전시키고, 원심분리(4000g, 10분, 4℃)를 이용하여 냉 디에틸 에테르(10 mL)에서 3회 세척하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3)을 사용하여 Fmoc 제거를 확인하였다 1H NMR (500 MHz, CDl3) δ 11.89 (s, 1H), 8.85 (dd, 1H), 7.89 (dd, 1H), 7.34 (dd, 1H), 3.52-3.71(m, 8H), 3.35 (t, 1H), 2.72-2.61 (t, 2H), 2.01-1.57 (m, 6H) ppm. MS (ESI) 정확한 질량 이론치 [M+H2O]+: 352.55, 실측치: 352.04.
방법 6: N2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)-N6-(4-(tert-부톡시카르보닐)티오모르폴린-3-카르보닐)-L-라이신의 합성
Fmoc-L-Lys-OH(8.94 g, 24.26 mmol, 1.2 eq)를 실온에서 기계적 교반 하에 THF-물(1:1, 800 mL)에 용해시켰다. DCM 중 상기 제조한 활성화된 에스테르의 용액(방법 3)을 한 번에 첨가하고, 이어서 DIPEA (6.27 g, 48.53 mmol, 2.4 eq)가 뒤따랐다. 출발 물질이 소모될 때까지(TLC, 2시간) 반응물을 추가로 실온에서 교반하고, 이어서 EtOAc(250 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 HCl(1 M, 200 mL)로 산성화시키고, 분별 깔때기에 붓고, 층들을 분리시켰다. 수성 층을 EtOAc(2 x 250 mL)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 염수(200 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 연한 황색의 유성 잔사로서 얻었고, 이를 DCM에 용해시키고, 실리카 겔 상에 흡착시키고, 실리카 겔 컬럼(7″ x 3″)에서 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 컬럼을 헥산 중 50% 내지 70%의 에틸 아세테이트로 세척하여 생성물을 용리시켰다(진공 흡인 하에). 필요한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 진공 하에 농축시켜 N2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)-N6-(4-(tert-부톡시카르보닐)티오모르폴린-3-카르보닐)-L-라이신(9.1 g, 75%)을 회백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.75 (d, J = 7.5Hz, 2H), 7.63-7.51 (m, 2H), 7.38 (t, J = 7.5Hz, 2H), 7.29 (t, J = 7.5Hz, 2H), 5.71 (dd, J = 7.5, 23Hz, 1H), 4.97 (br s, 1H), 4.57-4.23 (m, 4H), 4.20 (t, J = 7Hz, 1H), 3.51-3.18 (m, 3H), 3.17-2.96 (br s, 1H), 2.77 (d, J = 12.5Hz, 1H), 2.70-2.58 (m, 1H), 2.38 (d, J = 12.5Hz, 1H), 1.98-1.86 (m, 1H), 1.85-1.73 (m, 1H), 1.66-1.53 (m, 2H), 1.46 (br s, 12H) ppm; 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 175.0, 156.4, 155.8, 143.9, 141.4, 127.9, 127.3, 125.3, 120.1, 67.3, 60.6, 53.8, 47.3, 39.2, 31.5, 29.1, 28.5, 26.7, 22.3 ppm; MS (ESI) C31H39N3O7S에 대한 정확한 질량 이론치 [M+Na]+: 620.24, 실측치: 620.35.
방법 7: (2S)-2-아미노-6-[(티오모르폴린-3-카르보닐)아미노]헥산산 (N6-(티오모르폴린-3-카르보닐)-L-라이신)(LYS(TM))의 합성
절차 1
N2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)-N6-(4-(tert-부톡시카르보닐)티오모르폴린-3-카르보닐)-L-라이신(방법 6)의 Fmoc 보호기를 당업계에 공지된 표준 절차에 의해, 예를 들어, DMF 중 20% 피페리딘을 이용하여, 제거할 수 있다. 이와 유사하게, Boc 보호기를 당업계에 공지된 표준 절차에 의해, 예를 들어, DCM 중 30% TFA를 이용하여 제거할 수 있다.
절차 2
변형된 라이신을 700 μL의 NMP(15 mg, 25.12 μmol)에 용해시켰다. 300 μL의 피페리딘을 후속적으로, 교반하면서 용액(피페리딘:NMP=7:3; 1 mL)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 변형된 라이신을 후속적으로 침전시키고, 원심분리(4000g, 10분, 4℃)를 이용하여 냉 디에틸 에테르(10 mL)에서 3회 세척하였다. 하룻밤 공기 건조시킨 후, 생성물을 50% TFA:DCM(1 mL)에 용해시키고 실온에서 15분 동안 교반시켰다. 상기 TFA:DCM 용액을 회전 증발기를 사용하여 제거하고 침전시키고 냉 에틸 에테르로 2회 세척하였다. Fmoc 제거를 다음을 사용하여 확인하였다: 1H NMR: δ 11.56-12.04 (1H, br), 7.34 (s, 1H), 3.65-3.76 (dd, 2H), 3.42 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 3.01-3.15 (m, 2H), 2.70-2.89(m, 2H), 2.55-2.61 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.06-2.18 (m, 2H), 1.74-1.85 (m, 2H), 1.58-1.64 (q, 2H) 1.05 (1H, s) ppm 및 MS (ESI) 정확한 질량 이론치 [M+H2O]+: 279.22, 실측치: 279.62.
방법 8: N2(1-{[(모르폴린-4-일)아세틸]옥시}피롤리딘-2,5-디온)-L-라이신의 합성
하기 절차를 사용하여 N2(1-{[(모르폴린-4-일)아세틸]옥시}피롤리딘-2,5-디온)-L-라이신을 생성할 수 있었으며, Fmoc-L-Lys-OH 1.2 eq)를 실온에서 기계적 교반 하에 THF-물(1:1, 800 mL)에 용해시킬 수 있다. DCM 중 상기 제조한 활성화된 에스테르의 용액을 한 번에 첨가하고, 이어서 DIPEA(2.4 eq)가 뒤따를 수 있다. 출발 물질이 소모될 때까지(TLC, 2시간) 반응물을 추가로 실온에서 교반할 수 있고, 이어서 EtOAc(250 mL)를 첨가할 수 있다. 혼합물을 HCl(1 M, 200 mL)로 산성화시키고, 분별 깔때기에 붓고, 층들을 분리시킬 수 있다. 수성 층을 EtOAc(2 x 250 mL)로 추출할 수 있다. 유기 층을 합하고, 염수(200 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시킬 수 있다. 조 생성물을 DCM에 용해시키고, 실리카 겔 상에 흡착시키고, 실리카 겔 컬럼(7″ x 3″)에서 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 컬럼을 헥산 중 50% 내지 70%의 에틸 아세테이트로 세척하여 생성물을 용리시킬 수 있다(진공 흡인 하에). 필요한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 진공 하에 농축시켜 N2-(N2(1-{[(모르폴린-4-일)아세틸]옥시}피롤리딘-2,5-디온)-L-라이신을 제공할 수 있다.
방법 9: (2S)-2-아미노-6-[2-(모르폴린-4-일)아세트아미도]헥산산 (N6-(2-모르폴리노아세틸)-L-라이신)(LYS(M))의 합성
절차 1
N2(1-{[(모르폴린-4-일)아세틸]옥시}피롤리딘-2,5-디온)-L-라이신(방법 8)의 Fmoc 보호기를 당업계에 공지된 표준 절차에 의해, 예를 들어, DMF 중 20% 피페리딘을 이용하여, 제거할 수 있다.
절차 2
변형된 라이신을 700 μL의 NMP(15 mg, 25.02 μmol)에 용해시켰다. 300 μL의 피페리딘을 후속적으로, 교반하면서 상기 용액(피페리딘:NMP=7:3; 1 mL)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 변형된 라이신을 후속적으로 침전시키고, 원심분리(4000g, 10분, 4℃)를 이용하여 냉 디에틸 에테르(10 mL)에서 3회 세척하였다. 다음을 이용하여 Fmoc 제거를 확인하였다: H-NMR: 1H NMR (500 MHz, CDl3) δ 12.01 (br s, 1H), 3.62-3.74 (m, 4H), 3.40 (t, 1H), 3.29 (s, 2H), 3.10 (t, 1H), 2.59-2.70 (m, 4H), 1.88-2.01 (m, 2H), 1.58-1.65 (m, 2H), 및 1.46-1.56 (q, 2H) 및 MS (ESI) 정확한 질량 이론치 [M+H2O]+: 273.17, 실측치: 273.33.
실시예2
변형된 라이신을 이용한 펩티드 덴드론의 합성
일련의 펩티드 덴드론을 합성하였다(표 2). 변형된 라이신은 상기 방법 5, 7 및 9에서 합성된 변형된 라이신(이들은 표에서 "*"로 표시됨)을 사용하여 펩티드 합성 중에 직접 혼입되거나, 또는 이것은 수지 절단 후 용액 중 상기 방법 1~3에서 합성된 화합물 및 N-히드록시숙신이미드 화학을 이용하여 라이신 측쇄(ε-아민)를 변형하는 것을 통해 후속적으로 혼입되었다. PD1-PD3 및 PD3(His)를 비교를 위해 합성하였으며, 이들은 라이신(PD3(His)) 대신 비변형 라이신(PD 1-3) 또는 히스티딘을 포함한다.
표 2. 볼드체, 이탤릭체 {LYS} 가 분지점인 펩티드 덴드론의 요약. *는 펩티드가 변형된 라이신을 사용하여 직접 합성되었음을 나타냄.
절차 a) 변형된 라이신 또는 히스티딘의 직접 혼입을 통한 펩티드 덴드론 합성
링크 아미드 수지 상에서의 단편 축합에 의한 표준 고상 펩티드 합성을 사용하여 펩티드 덴드론을 합성하였다. 각각의 단편을 Fmoc 화학을 사용하여 2-클로로트리틸 수지(고도로 산 불안정성인 수지) 상에서 합성하고, 트리플루오로에탄올을 사용하여 수지로부터 제거하여 측쇄 및 N-말단의 모든 보호기를 유지하였다. 이어서 상기 단편 및 N α,N ε-디-Fmoc-L-라이신(분지점으로서)을 사용하여 펩티드 덴드론을 만들고, 후속적으로 트리플루오로아세트산(TFA)을 이용하여 수지로부터 절단하여 C-말단 아미드화를 생성하였다. 조립은 PD3 염기 서열을 갖는 펩티드 덴드론, 예를 들어 PD3(M), PD3(MN) 및 PD3(TM)으로 예시된 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 절단 단계 동안 모든 보호기를 제거하였다. 조 펩티드를 물:아세토니트릴 구배를 사용하여 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 통해 정제하였다. 순도 및 질량을 HPLC 및 전자 분무 이온화(ESI) 질량 분석법을 통해 확인하였다. 상이한 전하 상태의 형태의 동일 화학종을 포함하는 ESI 질량 스펙트럼을 해석하기 위해 디콘볼루션 도구를 사용하였다. 다중 하전 화학종을 그의 단일 하전 형태로 계산하고, m/z 값 및 피크 폭에 따라 함께 그룹화하고, 원자 질량 단위(amu)로 표시하였다. PD1: MW 4540.1 [4540.2 amu]. PD2: MW 7097.1 [7097.5 amu]. PD3: MW 7097.1 [7097.5 amu]. PD3(His): MW 7223.1 [7223.1 amu]. PD3(MN)*: MW 9760.0 [9759.9 amu]. PD3(TM)*: MW 8905.5 [8905.5 amu].
절차 b) 수지로부터의 덴드론 중간체의 절단 후 펩티드 라이신 ε-아민의 변형을 통한 펩티드 덴드론 합성
2 μmole의 펩티드 덴드론(PD1, PD2 또는 PD3)을 새로 제조한 0.1 M 중탄산나트륨(pH 8.0)에 현탁시켰다. 혼합물을 10분 동안 초음파 처리하였다. 40 mM NHS 작용화 중간체(방법 1~3)를 DMAC에서 제조하고 교반하면서 펩티드 용액(0.5 mM)에 적가하였다. 라이신 ε-아미드의 100% 전환을 보장하기 위해 NHS 작용화 중간체를 펩티드당 라이신에 1.5몰 과량으로 첨가하였다. 반응물을 실온에서 0.5시간 동안 교반하고, 그 후 초원심분리(MWCO 3.0 kDa)를 통해 비반응 중간체를 제거하였다. 전기분무 이온화 질량 분석법을 사용하여 변형을 확인하였다. 상이한 전하 상태의 형태의 동일 화학종을 포함하는 ESI 질량 스펙트럼을 해석하기 위해 디콘볼루션 도구를 사용하였다. 다중 하전 화학종을 그의 단일 하전 형태로 계산하고, m/z 값 및 피크 폭에 따라 함께 그룹화하고, 원자 질량 단위(amu)로 표시하였다. PD2(M): MW 9904.9 [9904.9 amu]. PD2(MN): MW 9759.9 [9808.1 amu (MW+포름산)]. PD2(TM): MW 8905.5 [8905.5 amu]. PD3(M): MW 9904.8 [9905.0 amu]. PD3(MN): MW 9759.9 [9808.1 amu (MW+포름산)]. PD3(TM): MW 8905.5 [8905.6 amu].
실시예 3
펩티드 덴드론 상의 표적화 모이어티 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 혼입
a) 메톡시-PEG 및 Mal-PEG 펩티드 덴드론의 제조
말레이미드로 작용화된 메톡시-PEG(n=36)(m-dPEG®36-MAL; Quanta BioDesign, 미국 오하이오주 플레인 시티 소재) 및 비스-말레이미드 PEG(n=19)(비스-Mal-PEG19(BroadPharm, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재))(표 1의 화합물 #1 및 #2)를 20 mM 시트르산나트륨 완충액(pH 5.5)에서 각각 1.25 mM 및 5 mM 용액으로 제조하였다. 상기 완충액 중 등부피의 펩티드 덴드론 용액(실시예 2에 따라 제조, 1 mM)을 각각 1.25배 및 5배 몰 과량으로 상기 PEG 용액과 혼합하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하고 질량 분석법을 통해 확인하였다. 여분의 PEG를 PBS 및 물에서 또는 20 mM 시트르산나트륨(pH 5.5)에서(Mal-PEG-PD 콘쥬게이트의 경우) 투석을 통해 제거하였다. 전기분무 이온화 질량 분석법을 사용하여 변형을 확인하였다. MeO-PEG(36)-PD2(MN) MW 11528.2 (11528.2 amu), MeO-PEG(36)-PD3(TM): MW 10673.9 (10674.1 amu), MeO-PEG(36)-PD2(MN): MW 11528.2 (11529.2 amu), MeO-PEG(36)-PD3(TM): MW 10674.2 (10673.9 amu). Mal-PEG(19)-PD1: MW 8296.4 (8297.2 amu), Mal-PEG(19)-PD2(MN): MW 10959.3 (10960.3 amu), Mal-PEG(19)-PD3(MN): MW 10959.3 (10960.3 amu), 및 Mal-PEG(19)-PD2(MN): MW 10959.3 (10960.3 amu).
b) 표적화된 PEG-펩티드 덴드론 콘쥬게이트의 제조
Fmoc 화학을 사용하여 표준 고상 펩티드 합성을 사용하여 표적화 펩티드(표 1의 화합물 #3~#6)를 제조하였다. N-말단 아세틸화를 수지로부터의 절단 전에 DMF 중 10% 아세트산 무수물로 수행하였다. TFP-PEG(n= 36)-말레이미드(Quanta BioDesign, 미국 오하이오주 플레인 시티 소재)(5 mM) 및 아실화된 펩티드(7.5 mM)를 새로 제조한 0.1 M 중탄산나트륨 완충액(pH 8.0)에 용해시키고 펩티드 용액을 상기 PEG 용액에 1.25 몰 과량으로 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반한 후 pH를 5.5로 낮추고 질량 분석법을 사용하여 콘쥬게이션을 확인하였다. Vivaspin 컬럼 MWCO 3.5 kDa(Sigma Aldrich, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)을 사용하여 완충액을 20 mM 시트르산나트륨 완충액(pH 5.5)으로 교환하였다. 그 후, 정제된 생성물을 실온에서 2시간 동안 20 mM 시트르산나트륨 완충액(pH 5.5) 중 2배 과량으로 펩티드 덴드론(실시예 2에서와 같이 제조)에 첨가하였다. 전기분무 이온화 질량 분석법을 사용하여 변형을 확인하였다. 상이한 전하 상태의 형태의 동일 화학종을 포함하는 ESI 질량 스펙트럼을 해석하기 위해 디콘볼루션 도구를 사용하였다. 다중 하전 화학종을 그의 단일 하전 형태로 계산하고, m/z 값 및 피크 폭에 따라 함께 그룹화하고, 원자 질량 단위(amu)로 표시하였다. TfR-PEG-PD3(MN)*: 13855.0 MW (13856.7 amu). cRGD-PEG-PD3(MN)*: 12188.5 MW (12188.2 amu). TfR-PEG-PD3(TM)*: MW 13855.0 MW (13856.7 amu). cRGD-PEG-PD3(TM)*: 12188.5 MW (12188.6 amu).
c) 당-PEG-Mal 콘쥬게이트의 제조
N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)(0.0860 mmol)을 실온에서 N,N-디메틸포름아미드(6 mmol) 중 아민 작용화 모노 또는 트리 아세틸갈락토사민(GalNAc)(표 1의 화합물 #7 및 8; Sussex Research, 캐나다 온타리오주 소재)(0.01620 mmol) 및 MAL-dPEG® 36-TFP 에스테르(Quanta BioDesign, 미국 오하이오주 플레인 시티 소재)(0.020261 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, HPLC-MS를 통해 콘쥬게이션을 확인하였다. 그 후 생성물을 역상 HPLC를 사용하여 정제하였다. 그 후, 정제된 생성물을 실온에서 2시간 동안 20 mM 시트르산나트륨 완충액(pH 5.5) 중 2배 과량으로 펩티드 덴드론(실시예 2에서와 같이 제조)에 첨가하였다. 전기분무 이온화 질량 분석법을 사용하여 변형을 확인하였다. 상이한 전하 상태의 형태의 동일 화학종을 포함하는 ESI 질량 스펙트럼을 해석하기 위해 디콘볼루션 도구(Agilent Mass Hunter Quantitative Analysis)를 사용하였다. 다중 하전 화학종을 그의 단일 하전 형태로 계산하고, m/z 값 및 피크 폭에 따라 함께 그룹화하고, 원자 질량 단위(amu)로 표시하였다. GalNAc-PD3(TM)* MW 11708.6 (단편화: 11506.6) [11506.6 amu]. 트리 GalNAc-PD3(TM)*: MW 12679.1 (단편화: 12071.2) [11507.0 amu].
실시예 4
단분산 나노입자로의 펩티드 덴드론/DNA 나노입자(NP) 자가 조립
양이온성 펩티드 덴드론(PD)은 음이온성 핵산과 자가 조립되어 나노입자를 형성한다. NP는 투과 전자 현미경 및 동적 광산란을 포함하는 표준 나노입자 기술을 사용할 경우 직경 50~75 nm와 구형 사이인 것으로 결정되었다.
a) NP 제조
등부피의 DNA(40 μg/mL; Gwiz Luciferase 플라스미드(6732 bp)(Genlantis, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)) 및 펩티드 덴드론(실시예 2에서와 같이 제조) 용액을 20 mM HEPES(pH 7.0)에서 제조하였다. 펩티드 용액들을 2:1의 펩티드 덴드론 아르기닌:DNA 포스페이트(N:P)에 상응하는 농도로 만들었다. 균질한 입자를 보장하기 위해 부드럽게 볼텍싱하면서 DNA 용액을 펩티드 용액에 적가하였다. DNA/펩티드 나노입자(NP)는 실온에서 30분 동안 복합체가 형성되게 하였다. NP 용액 중 DNA의 최종 농도는 20 μg/mL였다.
b) 동적 광산란
Zetasizer ZS(Malvern), Green Laser 및 ZEN2112 Quartz 큐벳을 사용하여 동적 광산란 데이터를 수집하였다. 누적 적합 분석(cumulant fit analysis)을 이용하여 유체역학적 직경 및 다분산성 지수(PDI)를 도출하였다. 모든 데이터 지점은 표 3에 예시된 바와 같이 3개 이상의 개별적으로 제조된 샘플의 평균을 나타낸다.
c) 투과 전자 현미경(TEM)
샘플을 글로우 방전된 400메시 포름바 코팅 구리 그리드에 적용하고, 1% 우라닐 아세테이트로 음성 염색하고, 공기 건조시키고, 80 kV의 작동 전압에서 투과 전자 현미경(Tecnai T12, Thermo Fisher Scientific)으로 검사하였다. AMT 하단 장착 CCD 카메라와 AMT600 소프트웨어를 사용하여 디지털 이미지를 획득하였다. 형태는 표 3에 예시된 바와 같이 결정되었다.
표 3. 펩티드 덴드리머 DNA 나노입자(NP)의 특성화. 모든 측정값은 누적 적합 분석을 사용하여 강도 상관 함수로부터 도출되었다. 측정값을 3회 수집하여 평균 +/- 표준 편차로 제시하였다.
실시예 5
단분산 나노입자로의 펩티드 덴드론/RNA 나노입자(NP) 자가 조립
양이온성 펩티드 덴드론(PD)은 음이온성 핵산과 자가 조립되어 나노입자를 형성한다. NP는 동적 광산란을 포함하는 표준 나노입자 기술을 사용할 경우 직경이 약 50 nm인 것으로 결정되었다.
a) NP 제조
등부피의 RNA(40 μg/mL) 및 펩티드 용액(실시예 2에서와 같이 제조)을 20 mM HEPES(pH 7.0)에서 제조하였다. 구체적으로, mcherry를 코딩하는 cleancap mRNA(Trilink, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 및 CTNNB1을 표적화하는 siRNA(Dharmacon/Horizon Discovery, 미국 콜로라도주 라파예트 소재)를 준비하였다. 펩티드 용액들을 4:1의 펩티드 덴드론 아르기닌:RNA 포스페이트(N:P)에 상응하는 농도로 만들었다. 균질한 입자를 보장하기 위해 부드럽게 볼텍싱하면서 RNA 용액을 펩티드 용액에 적가하였다. RNA/펩티드 나노입자 또는 NP는 실온에서 30분 동안 복합체가 형성되게 하였다. NP 용액 중 RNA의 최종 농도는 20 μg/mL였다. 선택적 단계로서 Lipofectin®(DOTMA:DOPE(% w/w) =1)(Thermo Fischer Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)을 제형에 첨가하였다. Lipofectin®은 RNA를 사용하여 1~4 w/w %에 상응하도록 20 mM HPES(pH 7.0)에 희석시켰다. 이전에 설명한 바와 같이 RNA 용액을 첨가하기 직전에 Lipofectin® 용액을 펩티드 덴드론 용액에 첨가하였다. Lipofectin®을 함유하는 나노입자를 "지질"로 표시한다.
b) 동적 광산란
Zetasizer ZS(Malvern), Green Laser 및 ZEN2112 Quartz 큐벳을 사용하여 동적 광산란 데이터를 수집하였다. 누적 적합 분석을 이용하여 유체역학적 직경 및 다분산성 지수(PDI)를 도출하였다. 모든 데이터 지점은 3회 이상 개별적으로 제조된 샘플의 평균을 나타낸다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
표 4. 지질이 있거나 없는 PD3(MN)으로 제조된 RNA NP의 유체역학적 직경. 모든 측정값은 누적 적합 분석을 사용하여 강도 상관 함수로부터 도출되었다. 측정값을 3회 수집하여 평균 +/- 표준 편차로 제시하였다.
실시예 6
표적화 NP 나노입자의 생성
a) DNA 또는 RNA 및 메톡시-PEG 펩티드 덴드론과 표적화 PEG-펩티드 덴드론 콘쥬게이트의 혼합물을 포함하는 나노입자의 제조
20 mM HEPES(pH 7.0)에서 상이한 비의 펩티드 덴드론(실시예 2로 제조) 또는 메톡시-PEG 덴드론(실시예 3a로 제조) 및 표적화 PEG 펩티드 콘쥬게이트(실시예 3b로 제조)를 사용하여 펩티드 용액을 제조하였다. 상기 완충액 중 DNA(gwiz 루시퍼라아제)(Genlantis, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 또는 RNA(clean cap mcherry)(Trilink, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 용액(40 μg/mL)을 볼텍싱하면서 PD 혼합물에 적가하여 펩티드 덴드론 아르기닌:핵산 포스페이트(N:P)의 최종 비가 4:1(DNA) 및 6:1(RNA)이 되게 하였다. 핵산/펩티드 나노입자는 실온에서 30분 동안 복합체가 형성되게 하였다. 나노입자 용액 중 핵산의 최종 농도는 20 μg/mL였다. 선택적 단계로서, Lipofectin®(DOTMA:DOPE(% w/w) =1)(Thermo Fischer Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)을 제형에 첨가하였다. Lipofectin®은 RNA를 사용하여 1~4 w/w %에 상응하도록 20 mM HPES(pH 7.0)에 희석시켰다. 이전에 설명한 바와 같이 RNA 용액을 첨가하기 직전에 Lipofectin® 용액을 펩티드 덴드론 용액에 첨가하였다.
b) DNA 또는 RNA 및 메톡시-PEG 펩티드 덴드론과 표적화 PEG-항체 콘쥬게이트의 혼합물을 포함하는 나노입자의 제조
항체 기반 표적화 리간드의 경우, mal-PEG PD 나노입자를 제조하고, 이어서 항체(아래에 따라 변형된 표 1의 화합물 #5 및 #6)에 콘쥬게이션시켰다. 20 mM HEPES(pH 7.0)에서 상이한 비의 메톡시-PEG 덴드론(실시예 3a)과 mal-PEG 덴드론(실시예 3a)을 사용하여 펩티드 용액을 제조하였다. 상기 완충액 중 DNA(gwiz 루시퍼라아제)(Genlantis, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 또는 RNA(clean cap mcherry)(Trilink, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 용액(40 μg/mL)을 볼텍싱하면서 PD 혼합물에 적가하여 4:1(DNA) 및 6:1(RNA)의 펩티드 덴드론 아르기닌:핵산 포스페이트(N:P)의 비를 제공하였다. 핵산/펩티드 나노입자는 실온에서 30분 동안 복합체가 형성되게 하였다. 나노입자 용액 중 핵산의 최종 농도는 20 μg/mL였다.
Fab 및/또는 하프머(1개의 경쇄 및 1개의 중쇄)를 중쇄 내의 비천연 아미노산 치환으로 조작하였다:
비천연 아미노산은 측쇄 내에 Diels-Alder 반응을 위한 반응성 핸들로서의 역할을 할 수 있는 시클로펜타디엔(Nnaa CP1)을 포함한다. Nnaa CP1은 앰버(amber) 정지(TAG) 코돈에 반응하여 Nnaa CP1을 전달하는 메타노사르시나 마제이(Methanosarcina mazei) 피롤라이신 tRNA 신테타아제/tRNA(PylRS)/tRNA(Pyl) 쌍을 발현하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 사용하여 항체 서열로 유전적으로 코딩되었다. (Amant et al. Angew Chem, 2019, 58(25):8489-93).
조작된 항체 기반 표적화 모이어티를 실온에서 2시간 동안 말레이미드에 대해 1.25 몰 과량으로 핵산/펩티드 나노입자 용액에 첨가하였다. 그 후 N-아세틸 시스테인(10배 몰 과량)의 첨가를 통해 혼합물을 켄칭하였다. 초원심분리(MWCO 100 kDa)를 사용하여 여분의 항체를 제거하고 A260/A280 비 및 동적 광산란을 사용하여 반응을 확인하였다.
c) 동적 광산란
Zetasizer ZS(Malvern), Green Laser 및 ZEN2112 Quartz 큐벳을 사용하여 동적 광산란 데이터를 수집하였다. 누적 적합 분석을 이용하여 유체역학적 직경 및 다분산성 지수(PDI)를 도출하였다. 모든 데이터 지점은 3회 이상 개별적으로 제조된 샘플의 평균을 나타낸다.
표 5. 표적화 DNA NP의 동적 광산란. 모든 측정값은 누적 적합 분석을 사용하여 강도 상관 함수로부터 도출되었다. 측정값을 3회 수집하여 평균 +/- 표준 편차로 제시하였다.
표 6. 표적화 siRNA NP의 동적 광산란 직경. 모든 데이터를 3회 수집하여 표준 편차와 함께 평균으로서 제시하였다. 누적 적합 분석을 이용한 강도 상관 함수
실시예 7
NP는 자극-반응 DNA 방출에서 안정적인 나노입자를 생성하였다
a) 음이온 안정성 분석
덱스트란 술페이트(DS) 용액을 20 mM HEPES에서 제조하고 NP 용액(실시예 4에서와 같이 제조)에 첨가하여 최종 DS 농도가 100 mg/mL 내지 1000 mg/mL이 되게 하고 DNA 농도가 10 μg/mL가 되게 하였다. 15분의 탈복합체화 기간 후, 각각의 제형 15 μL를 에티듐 브로마이드가 포함된 2% E-겔에 첨가하고 10분 동안 러닝시켰다(run). ImageJ(NIH, 미국 메릴랜드주 베세즈다 소재)를 사용하여 pDNA 방출을 계산하였으며, 결과는 도 2a에 예시되어 있고, 여기서, 무손상 나노입자의 %가 DS 농도의 함수로 도시되어 있다.
b) 효소적 DNA 방출
NP는 0.1 μg/μl의 최종 DNA 농도로 8 mM L-시스테인 HCl 완충액(pH 6)에서 제조한 것을 제외하고는 실시예 4에서와 같이 제조하였다. 그 후 카텝신-B 스톡 용액(60 단위/mL)을 첨가하였다. Cat-B NP 용액을 37℃에서 최대 4시간 동안 인큐베이션하였다. 분취물을 적절한 시점에 꺼내고 아가로스 겔 전기영동을 통해 분석하여 방출된 DNA를 시각화하였다. DNA 희석액들을 대조군으로서 상이한 농도들로 제조하였으며 마찬가지로 bio-rad 강도 소프트웨어 분석을 사용한 후속 정량화를 위해 상기 아가로스 겔에 첨가하였으며, 결과는 도 2b에 예시되어 있다.
표 7. pDNA의 프로그래밍된 효소적 방출. 표에는 상이한 NP 제형들에서의 카텝신-B 처리 1시간 후 pDNA 방출 %가 요약되어 있다.
실시예 8
NP는 시험관 내 형질감염에서 세포 특이성을 보여준다.
a) 시험관 내 형질감염
H1299, C2C12, HEK393 및 HEPG2 세포주를 24시간 이내에 80% 컨플루언시를 목표로 96웰 플레이트에 시딩하였다. 그 후 C2C12를 2% 말 혈청이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM)에서 7일 동안 인큐베이션하여 근아세포로부터 근관으로 분화시켰다. 24시간의 회복 기간 후, NP(실시예 2에서와 같이 제조)를 OPTI-MEM(1:10 희석)에 웰당 0.2 μg으로 세포에 첨가하였다. 16시간의 기간 후에, NP 보충 배지를 제거하고, 신선한 배양 배지를 첨가하였다. GFP는 Incucyte(EssenBio)를 사용하여 이미징하고 ONE-Glo™+Tox Luciferase Reporter(Promega)에 대한 표준 프로토콜을 사용하여 루시퍼라아제/생존율을 정량화하였다. 결과는 도 3a, 도 3b 및 도 3c에 예시되어 있다.
실시예 9
근육내 DNA NP 생체 내 형질감염
a) 근육내 전달
BALB/C 마우스를 사지당 5 μg의, MeO-PEG-PD(MN)(실시예 5에서와 같이 제조)와 복합체 형성된 pDNA(Gwiz Luciferase)(Genlantis, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)로 처리하였다. IVIS(Perkin Elmer)를 사용하여 발현을 매주 평가하였다. 발광을 4회 수집하여 평균 +/- 표준 편차로서 제시하였다. 결과가 도 4에 예시되어 있다.
실시예 10
DNA NP의 치료적 발현
a) MEDI8852 및 STK11 코딩된 PD 나노입자의 제조
PD3(MN) 및 치료제 MEDI8852 및 STK11을 코딩하는 플라스미드를 사용하여 실시예 4에 기술된 바와 같이 나노입자를 제조하였다. MED8852 발현을 위해, NP를 또한 TfR-PEG-PD3(MN) 및 MeO-PD3(MN)(펩티드 덴드론 아르기닌:핵산 포스페이트 N:P 4:1)을 사용하여 제조하였으며, 여기서, 25%의 펩티드는 TfR-PEG- PD3(MN)이었다. 등부피의 DNA(40 μg/mL; MEDI8852 플라스미드(Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)의 Minimal CMV Expression 플라스미드와 유사한 방식으로 제조) 또는 STK11(Origene, 미국 메릴랜드주 록빌 소재) 플라스미드) 및 펩티드 덴드론 용액을 20 mM HEPES(pH 7.0)에서 제조하였다. 펩티드 덴드론 용액들을 4:1의 펩티드 덴드론 아르기닌:RNA 포스페이트(N:P)에 상응하는 농도로 만들었다. 균질한 입자를 보장하기 위해 부드럽게 볼텍싱하면서 DNA 용액을 펩티드 용액에 적가하였다. DNA/펩티드 나노입자는 실온에서 30분 동안 복합체가 형성되게 하였다. NP 용액 중 DNA의 최종 농도는 20 μg/mL였다. 대조군으로서 MEDI8852 플라스미드를 또한 제조사의 프로토콜을 사용하여 리포펙타민-2000(ThermoFisher, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)을 사용하여 제조하였다.
b) 치료제 코딩 나노입자를 이용한 시험관 내 형질감염 연구
H1299(6,600개의 세포/웰), HEPG2(50,000개의 세포/웰) 및 C2C12(12,000개의 세포/웰 세포)를 96웰 플레이트에서 각각 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)이 보충된 DMEM에 또는 RPMI 배지에 시딩하였다. 24시간의 회복 기간 후, 세포를 100 μL의 PBS로 2회, 배양 배지로 1회 세척하였다. 이어서 나노입자를 배양 배지 중 웰당 0.2 μg(H1299) 또는 0.5 μg(HEPG2 및 C2C12)으로 세포에 첨가하였다. 16시간의 기간 후, 나노입자 보충 배지를 제거하고, 신선한 배양 배지를 첨가하였다. MEDI8852 발현은 아래 설명된 바와 같이(c) ELISA를 사용하여 정량화하고, STK11 발현은 아래 설명된 바와 같이(d) 웨스턴 블롯으로 검출하였다. 결과는 각각 도 5a 및 도 5b에 예시되어 있다.
c) MEDI8852 ELISA
NUNCTM MaxiSorpTM 96웰 마이크로플레이트를 중탄산염 완충액 중 1 μg/mL의 항-MEDI8852 항체(100 μL/웰)로 코팅하였다(Ali, S et al. Antimicrob Agents Chemother. 2018 Nov; 62(11): e00694-18.). 플레이트를 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하고, 이어서 다음날 아침 300 μL의 PBS-T(인산염 완충 식염수(PBS) + 0.1% Tween 20)로 3회 세척하였다. 모든 표준, 품질 관리 샘플 및 테스트 샘플을 PBS + 0.1% Tween 20 중 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)에 1:250으로 희석시켰다. 100 μL의 희석된 샘플을 각각의 웰에 로딩하고 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 300 μL의 PBS-T로 3회 세척하였다. 이차 항체인 비오티닐화 항-MEDI8852(Ali, S et al. Antimicrob Agents Chemother. 2018 Nov; 62(11): e00694-18.)를 PBS-T에서 2 μg/mL까지 희석하고 100 uL를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하고 1:40으로 희석된 스트렙타비딘-HRP 복합체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., 코드 016-030-084) 100 μL를 첨가하였다. 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하고 실온에서 평형화된 SureBlue TMB Substrate(Thermo Fischer Scientific) 100 μL를 모든 웰에 첨가하였다. 암소에서 15분 후, 100 μL의 TMB Stop Solution(Thermo Fischer Scientific)을 사용하여 반응물을 켄칭하였다. 각각의 웰의 광학 밀도(OD)는 BMG Labtech PHERAstar FSX 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 판독하였다. 결과는 도 5a에 예시되어 있다.
e) STK11 웨스턴 블롯
형질감염 후 프로테아제 및 포스파타아제 억제제(Pierce #78442)가 보충된 RIPA 용해 완충액(Teknova 카탈로그 번호 R3792)을 사용하여 세포를 용해시키고 12,000xg에서 5분 동안 스핀다운시켰다. 상청액을 수집하고 BCA assay(Thermo 제품 # 23227)를 사용하여 정량화하였다. 이어서 샘플당 10 μg의 추출된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동을 사용하여 90분 동안 200 mA 전류로 해상하고, 이어서 iBlot 시스템을 통해 PVDF 막으로 옮겼다. 그 후 막을 5% BSA가 보충된 TBS-T(20 mM Tris-HCl, pH 7.6)로 차단하였다. 토끼 항-STK11(Cell Signaling 카탈로그 번호 D60C5) 및 항-GAPDH(Cell Signaling 카탈로그 번호 14C10) 일차 항체를 1:10,000으로 희석시켜 하룻밤 혼성화하였다. 막을 30분 동안 세척하고, 이어서 HRP-콘쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG에 30분 동안 혼성화시켰다. 인큐베이션 후, 막을 세척하여 비특이적 결합을 제거하고 Pierce SuperSignal West Pico 화학발광 시약(Pierce 카탈로그 번호 34579)과 함께 인큐베이션하였다. Image Quant LAS 4000을 사용하여 밴드를 탐지하였다. 결과는 도 5b에 예시되어 있다.
실시예 11
시험관 내에서의 표적화 DNA NP 형질감염
a) 시험관 내 형질감염
H1299(6,600개의 세포/웰), CT26(10,000개의 세포/웰) 및 C2C12(12,000개의 세포/웰 세포)를 96웰 플레이트에서 각각 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)이 보충된 DMEM에 또는 RPMI 배지에 시딩하였다. 형질감염 전에, H1299 및 CT26 세포에 24시간의 회복 기간이 허용되는 한편 최소 7일 동안 2%의 말 혈청이 보충된 DMEM에서의 인큐베이션을 통해 C2C12 근아세포가 근관세포로 분화되었다. 그 후, 세포를 100 μL의 PBS로 2회 및 배양 배지로 1회 세척하였다. 표적화 및 비표적화 나노입자를 실시예 6에 기술된 바와 같이 Gwiz Luciferase 플라스미드(Genlantis, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)를 사용하여 제조하였다. TfR- 및 cRGD 표적화 NP를 MeO-PEG-PD(MN):TfR-PEG-PD(MN) 또는 cRGD-PEG-PD(MN)(실시예 3의 a) 및 b)에서 제조된 물질)의 혼합물로 제조하였으며, 여기서, 0, 10 및 50%의 TfR-PEG-PD(MN) 및 0, 5, 10, 20, 및 30%의 cRGD-PEG-PD(MN)를 사용하였다. NP를 배양 배지(1:10 희석) 중 웰당 0.2 μg으로 세포에 첨가하였다. 16시간의 기간 후, 나노입자 보충 배지를 제거하고, 신선한 배양 배지를 첨가하였다. Incucyte (Essen BioScience, 미국 미시간주 앤아버 소재)를 이용하여 GFP 발현을 이미징하고, ONE-Glo™ + Tox Luciferase Reporter(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 및 PHERAstarFSX 기기(BMG Lab Tech, 미국 노스캐롤라이나주 캐리 소재)에 대한 표준 프로토콜을 이용하여 루시퍼라아제/생존율을 정량화하였다. 결과는 도 6a~도 6c에 예시되어 있다.
실시예 12
a) 나노입자 제조
PV1 표적화된 MECA32를 실시예 6에 기술된 바와 같이 중쇄 내에 비천연 아미노산 치환을 갖는 하프머(1개의 경쇄 및 1개의 중쇄)로서 조작하고 발현시켰다. 실시예 6에 기술된 프로토콜을 사용하여, 펩티드 덴드론 아르기닌:핵산 포스페이트(N:P) 비를 4:1(75% MeO-PEG-PD3(MN):25% Mal-PEG-PD3(MN))로 하여, 5% 트레할로스 완충액 중 Gwiz Luciferase 플라스미드(Genlantis, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 및 PD3(MN) PEG 콘쥬게이트(실시예 6에서와 같이 제조)를 사용하여 NP를 제조하였다. CP1-MECA32(Gabriela M. Marchetti,et al. Commun Biol. 2019; 2: 92; 2019년 3월 7일 온라인 공개. doi: 10.1038/s42003-019-0337-2)를 말레이미드의 몰을 기준으로 1.25배 몰 과량으로 첨가하고 실온에서 하룻밤 인큐베이션하였다. N-아세틸 시스테인(10배 몰 과량)의 첨가를 통해 반응물을 켄칭하고, 초원심분리(MWCO 100 kDa)를 사용하여 여분의 항체를 제거하였다.
b) 마우스에서의 폐 표적화 전달
BALB/C 마우스를 PD(MN)와 복합체를 형성한 Gwiz 루시퍼라아제 pDNA 20 μg으로 정맥내 처리하였다. 10%의 pDNA를 Cy-5(12개 표지/플라스미드)로 표지하였다. 발현 및 생체분포를 IVIS(Perkin Elmer)를 사용하여 1일차, 3일차 및 8일차에 평가하였다. 각각의 처리를 4회 반복 수행하였으며 정량적 데이터를 평균 +/- 표준 편차로 제시한다. 결과는 도 7에 예시되어 있다.
실시예 13
시험관 내에서의 mRNA NP 형질감염
a) DNA 및 mRNA NP 제조
펩티드 덴드론 용액을 20 mM HEPES(pH 7.0)에서 PD3(MN)(실시예 4 및 5에서와 같이 제조)으로 제조하였다. mCherry를 코딩하는 DNA(Origene, 미국 메릴랜드주 록빌 소재) 또는 mRNA(Trilink, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)를 상기 완충액에 희석하고(40 μg/mL), 볼텍싱하면서 PD 혼합물에 적가하여 펩티드 덴드론 아르기닌:핵산 포스페이트(N:P)의 최종 비가 2:1(DNA) 또는 4:1(mRNA)이 되게 하였다. 핵산/펩티드 나노입자는 실온에서 15분 동안 복합체가 형성되게 하였다. 나노입자 용액 중 핵산의 최종 농도는 20 μg/mL였다. NP를 실시예 4(DNA) 및 실시예 5(mRNA)에 기술된 바와 같이 DLS를 사용하여 특성화하였다.
b) 시험관 내 형질감염
H1299를 24시간 이내에 80% 컨플루언시를 목표로 96웰 플레이트에 시딩하였다. 24시간의 회복 기간 후, NP를 배양 배지 중 웰당 0.2 μg(1:10 희석)으로 세포에 첨가하였다. 4시간의 기간 후, NP 보충 배지를 제거하고, 신선한 배양 배지를 첨가하였다. Incucyte(EssenBio)를 사용하여 mCherry를 이미징하였다. 결과는 도 8에 예시되어 있다.
실시예 14
생체 내에서의 pDNA 및 mRNA 형질감염
근육내 전달
NP를 실시예 4 및 실시예 5에 기술된 바와 같이 MeO PEG-PD3(MN)으로 제조하였다. BALB/C 마우스를 사지당 5 μg의, 복합체 형성 cleancap mRNA(Trilink, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 또는 Gwiz DNA(Genlantis, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)(루시퍼라아제를 코딩함)로 처리하였다. IVIS(Perkin Elmer)를 사용하여 발현을 매주 평가하였다. 발광을 4회 수집하여 평균 +/- 표준 편차로서 제시하였다. 결과는 도 9에 예시되어 있다.
실시예 15
생체 내에서의 mRNA의 치료적 발현
정맥내 전달
NP를 실시예 5에 기술된 바와 같이 MeO-PD3(MN) 및 MEDI8852를 코딩하는 mRNA로 제조하였다. BALB/C 마우스에 트레일 정맥 주사(마우스당 20 μg)를 통해 NP를 정맥내로 투여하였다. IVIS(Perkin Elmer)를 사용하여 발현을 매주 평가하였다. 발광을 4회 수집하여 평균 +/- 표준 편차로서 제시하였다. 결과는 도 10에 예시되어 있다.
실시예 16
일차 T 세포의 mRNA 표적화 형질감염
T 세포 표적화 NP의 제조 및 특성화
시험관 내 형질감염
신선한 일차 T 세포(미국 매사추세츠주 로웰 소재의 Cellero로부터 획득가능한 것과 유사하지만 냉동되지 않은 신선한 것)를 24웰 플레이트(3e6/웰)에 RPMI1640 배지(Sigma) 중에 시딩하였다. 24시간의 회복 기간 후, 이어서 NP를 OPTI-MEM 중 웰당 100 μM로 세포에 첨가하였다. NP는 mcherry를 코딩하는 cleancap mRNA(Trilink, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 및 PD3(MN)과 Mal-PEG-PD3(MN)의 혼합물을 사용하여 실시예 6에 기술된 바와 같이 제조하였다. NP를 0, 25, 50 및 100%의 Mal-PEG-PD3(MN)으로 제조하고, 그 후 항-CD3 fab와 콘쥬게이션시켰으며, 이는 실시예 6에 기술된 바와 같았다. 4시간의 기간 후에, NP 보충 배지를 제거하고, 신선한 배양 배지를 첨가하였다. RFP를 Incucyte(EssenBio)를 사용하여 이미징하고 유세포 분석법을 사용하여 정량화하였다. 결과는 도 11에 예시되어 있으며, 여기서, A)는 평균 mcherry 강도를 나타내고, B)는 형질감염된 세포의 %를 나타내고 C)는 CD3의 표면 발현을 나타낸다.
실시예 17
시험관 내 siRNA 형질감염 연구
a) 세포 배양
Colo205 및 SW480 세포주를 ATTC(미국 버지니아주 매너서스 소재)로부터 획득하였다. 배양물을 37℃ 및 5% CO2에서 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 성장 배지(Gibco)에서 유지하였다. Colo205 및 SW480 CTNNB1 shRNA 세포주를 독시사이클린 유도성 인간 CTNNB1 shRNA(Dharmacon/Horizon Discovery, 미국 콜로라도주 라파예트 소재)의 렌티바이러스 형질도입을 통해 생성하였다.
b) TopFlash CTNNB1 리포터 분석 및 웨스턴 블롯
SW480 종양 세포(ATCC, 미국 버지니아주 매너서스 소재)는 TCF1 TopFlash 루시퍼라아제 리포터(EMD Millipore, 미국 매사추세츠주 벌링턴 소재)를 사용하여 안정적으로 형질도입하였다. SW480 TopFlash 세포를 6웰 디쉬에 웰당 2.0x105개의 세포의 밀도로 시딩하고 콜레스테롤 콘쥬게이션된 siRNA(Accell siRNA) 또는 siRNA NP(위에 기술된 바와 같음)로 48~72시간 동안 처리하였다. 0, 33, 66 또는 100%의 cRGD-표적화를 갖는 PD3(MN) 또는 MeO-PEG-PD(MN) 및 cRGD-PEG-PD(MN)의 혼합물을 사용하여 실시예 5에 기술된 바와 같이 나노입자를 제조하였다. 세포를 용해시키고 BrightGlo 시약(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 사용하여 프로세싱하고, 96웰 플레이트로 옮기고, Envision X(Perkin Elmer, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)를 사용하여 루시퍼라아제 리포터 활성을 측정하였다. PD3(MN):cRGD-PEG-PD3(MN)에 대한 TopFlash 결과는 도 12에 예시되어 있다. MeO-PEG-PD3(MN):cRGD-PEG-PD3(MN)에 대한 TopFlash 결과는 도 13a에 예시되어 있다. 세포 용해물을 또한 도 13b에 예시된 바와 같이 표준 웨스턴 블롯 프로토콜을 사용하여 CTNNB1 발현에 대해 5일 후에 평가하였다.
c) CTNNB1 웨스턴 블롯 및 세포 증식 분석
Colo205 세포를 6웰 플레이트에 웰당 2.0x105개의 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 대조군으로서 콜레스테롤 콘쥬게이션된 siRNA를 사용하여 세포를 처리하였다. 구체적으로, 500 nM의 Accell 대조 비표적화 siRNA 및 Accell CTNNB1 siRNA를 Dharmacon/Horizon Discovery(미국 콜로라도주 라파예트 소재)에서 구입한 웰당 1 ml의 Accell 형질감염 배지 중 세포에 첨가하였다. 콜레스테롤 콘쥬게이션은 고농도에서 siRNA 전달을 촉진한다. 형질감염 48시간 후 웰당 RPMI + 10% FBS 2 ml를 첨가하였다. Colo205 세포를 CTNNB1 siRNA 캡슐화 NP로 처리한 실험의 경우, 세포를 6웰 플레이트에 웰당 2.0x105개의 세포의 밀도로 시딩하였다. MeO-PEG-PD(MN) 및 cRGD-PEG-PD(MN)과 0 또는 66%의 cRGD-PD 및 1%(w/w siRNA)의 리포펙틴의 혼합물을 사용하여 실시예 5에 기술된 바와 같이 나노입자를 제조하였다. 성장 배지를 900 μl의 최적-최소 필수 배지(OPTIMEM)로 교체하고 웰당 100 μl의 NP 제형을 첨가하였다(웰당 100 μM의 mRNA). 형질감염 16시간 후 웰당 RPMI + 10% FBS 2 ml를 첨가하였다. 세포 증식 분석을 위해, 세포를 수확하고 도 13c에 예시된 바와 같이 ViCell XR 세포 계수기를 사용하여 형질감염시킨지 72 내지 96시간 후에 계수하였다.
실시예 18
생체 내 표적화 siRNA 형질감염 연구
a) 생체 내 종양 성장 억제 분석
7주령 암컷 누드 마우스에 PBS 200 μl 중 5.0x106개의 Colo205 세포를 피하 주사하였다. 평균 종양 부피가 약 100 mm3에 도달했을 때, 마우스를 치료군으로 무작위로 나누고 3일 연속 정맥내 NP(실시예 6에서와 같이 제조된 0, 33 및 66%의 cRGD PD(MN):PEG-PD(MN)) 주사를 투여하고, 이어서 일주일 후 이틀 연속 주사가 뒤따른다. 종양 측정 및 마우스 체중을 실험 기간 동안 주당 2회 또는 3회 기록하였다. 종양이 2000 mm3의 크기에 도달하거나 종양 표면의 50%를 초과하여 차지하는 궤양이 나타났을 때 마우스를 안락사시켰다. 결과는 도 14에 예시되어 있다.
실시예 19
하이브리드 RNA/DNA 펩티드 덴드론 나노입자(NP) 자가 조립
a) NP 제조
mCherry를 코딩하는 Cleancap mRNA(Trilink, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 및 GFP를 코딩하는 gWiz™ DNA(Aldevron, 미국 노스다코타주 파고 소재)를 20 mM HEPES(pH 7.0)에서 1:1 질량비로 제조하여 최종 농도가 40 μg/mL이 되게 하였다. PD3(MN) 용액(실시예 2에서와 같이 제조)을 4:1의 최종 펩티드 덴드론 아르기닌:핵산 포스페이트(N:P) 비에 상응하는 농도로 20 mM HEPES(pH 7.0)에서 제조하였다. 핵산 용액을 PD3(MN) 용액에 1:1 부피비로 첨가하고 피펫팅에 의해 철저히 혼합하였다. NP는 실온에서 30분 동안 복합체가 형성되게 하였다. NP 용액 중 핵산의 최종 농도는 20 μg/mL(10 μg/mL mRNA 및 μg/mL DNA)였다. 대조 NP는 DNA와 mRNA만으로 제조하였다(20 μg/mL의 최종 핵산 농도).
b) 동적 광산란
Zetasizer ZS(Malvern), Green Laser 및 ZEN2112 Quartz 큐벳을 사용하여 동적 광산란(DLS) 데이터를 수집하였다. 누적 적합 분석을 이용하여 유체역학적 직경 및 다분산성 지수(PDI)를 도출하였다. 모든 데이터 지점은 3개 이상의 개별적으로 제조된 샘플의 평균을 나타낸다. 결과는 표 8에 예시되어 있다.
표 8. 실시예 19에 기술된 바와 같이 1:1의 비의 DNA 및 mRNA, 또는 PD3(MN)과 DNA, mRNA로 제조된 NP의 유체역학적 직경. 모든 측정값을 3회 수집하여 평균 +/- 표준 편차로 제시하였다.
c) 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 의한 공동캡슐화의 평가
GFP를 코딩하는 gWiz™ DNA(Aldevron, 미국 노스다코타주 파고 소재)를 Cy5로 표지하고, mCherry를 코딩하는 Cleancap mRNA(Trilink, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)를 Label IT® Nucleic Acid Labelling Kits(Mirus Bio, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 사용하여 Cy3으로 표지하였다. 하기 나노입자는 위에서 기술된 바와 같이 PD3(MN)을 사용하여 20 μg/mL의 최종 핵산 농도로 제형화하였다:
1. Cy5 DNA + 비표지 DNA(1:1) 공동캡슐화 NP
2. Cy3 mRNA + 비표지 mRNA(1:1) 공동캡슐화 NP
3. 개별적으로 캡슐화된 Cy5 DNA NP + Cy3 mRNA NP(1:1).
4. Cy5 DNA + Cy3 mRNA(1:1) 공동캡슐화 NP
NP는 형광 분석 전에 10분 동안 복합체가 형성되게 하였다. 위에 열거된 3의 NP는 개별적으로 제형화되고, 10분 동안 복합체가 형성되게 하고, 이어서 형광 분석 직전에 1:1 비로 조합하였다. NanoDrop™ 3300 Fluorospectrometer(ThermoFisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)를 사용하여 형광 분석을 수행하였다. 2 μL의 NP 샘플을 페데스탈 상에 로딩하고 청색 LED를 사용하여 샘플을 여기시켰다. 형광 방출(상대 형광 단위, RFU)은 450~750 nm 파장 사이에서 측정하였다. 이들 NP 샘플의 형광 스펙트럼은 도 15에 예시되어 있다.
d) H1299 세포에서의 mRNA 및 DNA의 발현
NP는 a)에 기술된 바와 같이 PD3(MN)을 사용하여 GFP DNA 및 mCherry mRNA를 1:1의 중량비로 사용하여 20 μg/mL의 최종 핵산 농도로 제형화하였다. H1299 세포를 처리 24시간 전에 조직 배양 처리 96웰 플레이트에 10,000개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 처리 직전에 성장 배지를 제거하고 100 μL의 Opti-MEM™ I Reduced-Serum Medium(ThermoFisher, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)으로 교체하였다. 10 μL의 나노입자 용액을 각각의 웰에 첨가하였다(200 ng/웰의 핵산 용량). 나노입자를 세포와 함께 4시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 Opti-MEM 및 나노입자를 제거하고 성장 배지로 교체하였다. GFP 및 mCherry 단백질의 발현은 4시간마다 세포의 형광 이미지를 캡처하는 Incucyte Live-Cell Analysis System(Sartorius, 독일 괴팅겐 소재)을 사용하여 모니터링하였다. 이미지를 Incucyte 소프트웨어를 사용하여 분석하여 녹색(GFP) 및 적색(mCherry) 채널에서의 형광 면적과, 적색 및 녹색 신호가 중첩되는 면적을 결정하였다. 신호를 피크 신호 면적에 대해 정규화하여 발현 동역학을 모니터링하였다. 결과는 도 16에 예시되어 있다.
e) C2C12 세포에서의 mRNA 및 DNA의 발현
C2C12 세포를 조직 배양 처리 96웰 플레이트에 20,000개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 성장 배지를 저혈청 분화 배지(DMEM + 2% 말 혈청)로 교체하고 융합된 신장된 근관이 형성될 때까지 7일 동안 배양하였다. 나노입자는 a)에 기술된 바와 같이 PD3(MN)을 사용하여 GFP DNA 및 mCherry mRNA를 1:1의 중량비로 사용하여 50 μg/mL의 최종 핵산 농도로 제형화하였다. Lipofectin®(DOTMA:DOPE(% w/w) =1)(Thermo Fischer Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)을 제형에 첨가하였다. Lipofectin®은 핵산을 사용하여 1% w/w에 상응하도록 20 mM HPES(pH 7.0)에 희석시켰다. 이전에 설명한 바와 같이 RNA 용액을 첨가하기 직전에 Lipofectin® 용액을 PD3(MN) 용액에 첨가하였다. 처리 직전에 배지를 제거하고 100 μL의 Opti-MEM™ I Reduced-Serum Medium(ThermoFisher, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)으로 교체하였다. 10 μL의 나노입자 용액을 각각의 웰에 첨가하였다(200 ng/웰의 핵산 용량). 나노입자를 세포와 함께 4시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 Opti-MEM 및 나노입자를 제거하고 성장 배지로 교체하였다. 기술된 바와 같이 Incucyte Live-Cell Analysis를 사용하여 GFP 및 mCherry 단백질의 발현을 모니터링하였다. 결과는 도 17에 예시되어 있다.
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Claims (27)

  1. 하기 화학식 I의 변형된 라이신으로부터 유도된 하나 이상의 잔기를 포함하는 펩티드 덴드론:
    [화학식 I]

    (여기서,
    A는 결합, C1-6알킬렌, 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴로서, 상기 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴은 하나 이상의 R2에 의해 탄소 상에서 선택적으로 치환될 수 있으며, 상기 헤테로시클릴이 -NH- 모이어티를 포함하는 경우 해당 질소는 RA로부터 선택되는 기로 선택적으로 치환될 수 있고;
    Q는 결합, 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴로서, 상기 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴은 하나 이상의 R3에 의해 탄소 상에서 선택적으로 치환될 수 있으며, 상기 헤테로시클릴이 -NH- 모이어티를 포함하는 경우 해당 질소는 RB로부터 선택되는 기로 선택적으로 치환될 수 있고;
    고리 B는 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐로서, 상기 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐이 -NH- 모이어티를 포함하는 경우 해당 질소는 RC로부터 선택되는 기로 선택적으로 치환될 수 있고;
    R 1 , R 2 및 R 3 은 각각 독립적으로 할로, 니트로, 시아노, 히드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로메틸, 아미노, 카르복시, 카르바모일, 메르캅토, 술파모일, 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시, 아세틸, 아세톡시, 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, N-메틸-N-에틸아미노, 아세틸아미노, N-메틸카르바모일, N-에틸카르바모일, N,N-디메틸카르바모일, N,N-디에틸카르바모일, N-메틸-N-에틸카르바모일, 메틸티오, 에틸티오, 메틸술피닐, 에틸술피닐, 메실, 에틸술포닐, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, N-메틸술파모일, N-에틸술파모일, N,N-디메틸술파모일, N,N-디에틸술파모일 및 N-메틸-N-에틸술파모일로부터 선택되고;
    n은 0 내지 4이고;
    R A , R B 및 R C 는 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 아세틸, 메실, 에틸술포닐, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, 프로폭시카르보닐, 부톡시카르보닐, 카르바모일, N-메틸카르바모일, N-에틸카르바모일, N,N-디메틸카르바모일, N,N-디에틸카르바모일 및 N-메틸-N-에틸카르바모일로부터 선택됨).
  2. 제1항에 있어서, A는 결합, C1-6알킬렌 또는 헤테로시클릴인, 펩티드 덴드론.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Q는 결합인, 펩티드 덴드론.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, n은 0인, 펩티드 덴드론.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 고리 B는 모르폴리닐인, 펩티드 덴드론.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 고리 B는 티오모르폴리닐인, 펩티드 덴드론.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    A는 결합, 메틸렌 또는 피리딜이고;
    Q는 결합이고;
    고리 B는 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐이고;
    n은 0인, 펩티드 덴드론.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기는 하기 화학식 IB의 것인, 펩티드 덴드론:
    [화학식 IB]
    .
  9. 제1항 내지 제4항, 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기는
    (S)-2-아미노-6-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카르보닐]아미노}헥산산;
    (S)-2-아미노-6-[(티오모르폴린-3-카르보닐)아미노]헥산산; 및
    (S)-2-아미노-6-[2-(모르폴린-4-일)아세트아미도]헥산산인, 펩티드 덴드론.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 6개 미만의 세대를 포함하는, 펩티드 덴드론.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드 덴드론은 분지점, 0세대 및 연속 세대들을 포함하고, 상기 분지점, 0세대 및 연속 세대들은 함께 100개 미만의 아미노산 잔기를 포함하는, 펩티드 덴드론.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식 II의 펩티드 덴드론을 포함하는, 펩티드 덴드론:
    [화학식 II]

    (여기서,
    X1, X2, 또는 X3 중 하나는 염기성 아미노산 잔기이고;
    또 다른 X1, X2, 또는 X3은 소수성 아미노산 잔기이고;
    나머지 X1, X2, 또는 X3은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 변형된 라이신으로부터 유도된 잔기이고;
    BP는 분지점 아미노산 잔기임).
  13. 제12항에 있어서, 염기성 아미노산 잔기는 아르기닌으로부터 선택되는, 펩티드 덴드론.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 소수성 아미노산 잔기는 류신으로부터 선택되는, 펩티드 덴드론.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, BP는 라이신인, 펩티드 덴드론.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 덴드론의 첫 번째 분지점 아미노산에 부착된 아미노산 잔기의 0세대 서열을 추가로 포함하는, 펩티드 덴드론.
  17. 제16항에 있어서, 0세대 서열은 GLY-VAL-CIT-GLY-GLY-SER-CYS(서열번호 5)로 이루어지고, 여기서, 말단 CYS 카르복시 기는 아미드화되어 C(O)NH2 기를 형성한, 펩티드 덴드론.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛(여기서, n > 3)으로 이루어진 폴리에틸렌 글리콜 기를 추가로 포함하는, 펩티드 덴드론.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드, 항체, 당 또는 소분자 표적화 기로부터 선택되는 표적화 기를 추가로 포함하는, 펩티드 덴드론.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 활성제를 세포 내로 전달하는 데 사용하기 위한, 펩티드 덴드론.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 펩티드 덴드론 및 제약 활성제를 포함하는 제약 조성물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 제약 활성제는 유전 물질인, 용도 또는 제약 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 유전 물질은 DNA인, 용도 또는 제약 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 유전 물질은 RNA인, 용도 또는 제약 조성물.
  25. 제22항에 있어서, 유전 물질은 DNA 및 RNA인, 용도 또는 제약 조성물.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 지질을 추가로 포함하는, 용도 또는 제약 조성물.
  27. 유전자 요법의 방법으로서, 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물의 유효량을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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