TW202227136A - 寡核酸共軛物 - Google Patents

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TW202227136A
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diseases
oligonucleotide
oligonucleotide conjugate
dendrimer
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TW110137627A
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上坂晃弘
牧田尚樹
竹田昌史
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日商大日本住友製藥股份有限公司
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Abstract

本發明之目的在於使細胞內化促進劑與靶細胞效率良好地相互作用而提高寡核酸向細胞質內之遞送量。本發明之寡核酸共軛物包含樹狀聚合物、複數個寡核酸、一個或複數個細胞內化促進劑、及一個或複數個親水性連接子，各寡核酸直接或經由連接子結合於上述樹狀聚合物，各細胞內化促進劑經由上述親水性連接子結合於上述樹狀聚合物。

Description

寡核酸共軛物
本發明關於一種寡核酸共軛物。
能夠對細胞內表現之各種基因產物之表現進行直接控制之核酸醫藥可成為應對先前之醫藥品無法適用之疾病的治療藥，因此其醫療應用備受期待。然而，核酸醫藥由於核酸分子本身之分子量較大、帶有較多負電荷、且親水性較高，故而無法自發穿透細胞膜。關於用以將核酸分子遞送至表現其作用之位置，即細胞質內之方法，已知有於核酸分子上修飾疏水性分子、糖等細胞內化促進劑之方法、以及將核酸分子內包於功能性奈米粒子中之方法。
例如，專利文獻1及非專利文獻1中揭示有藉由使核酸分子與細胞內化促進劑共價結合於聚合物上而製備奈米結構體，向細胞質內遞送核酸分子之方法。 [先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：國際公開第2013/062982號 [非專利文獻]
非專利文獻1：Charles L. McCormick等人, Biomacromolecules, vol. 11, p.505-514 (2010)
[發明所欲解決之問題]
專利文獻1及非專利文獻1之技術於使細胞內化促進劑與靶細胞高效地相互作用之方面存在改善餘地。本發明之主要目的在於使細胞內化促進劑與靶細胞高效地相互作用而提高寡核酸向細胞質內之遞送量。 [解決問題之技術手段]
本發明者等人經過不懈努力，結果研究開發出一種能夠高效率地向細胞內遞送寡核酸之技術。本發明提供一種作為包含細胞內化促進劑之功能性奈米粒子的寡核酸共軛物、及其製造方法。
即，本發明之一態樣提供一種寡核酸共軛物，其係包含作為中心之樹狀聚合物與配置於中心周圍之複數個寡核酸、一個或複數個親水性連接子、及一個或複數個細胞內化促進劑的由單分子構成之奈米粒子，寡核酸及親水性連接子與中心較佳為經由共價鍵結合，細胞內化促進劑與親水性連接子較佳為經由共價鍵結合。於本發明之另一態樣中，形成中心之樹狀聚合物所具有之反應性官能基除了用於與寡核酸及親水性連接子結合，亦用於與封端劑結合。於本發明之又一態樣中，親水性連接子之直線長度比寡核酸之分子長度長、或親水性連接子之空間範圍(旋轉半徑)未被寡核酸之空間範圍完全包圍在內，藉此易將細胞內化促進劑呈現於功能性奈米粒子之最外層，而容易與靶細胞相互作用。
即，本發明如下所述。 [1]一種寡核酸共軛物，其包含樹狀聚合物、複數個寡核酸、一個或複數個細胞內化促進劑、及一個或複數個親水性連接子， 各寡核酸直接或經由連接子結合於上述樹狀聚合物， 各細胞內化促進劑經由上述親水性連接子結合於上述樹狀聚合物。 [2]如[1]記載之寡核酸共軛物，其中上述樹狀聚合物與上述寡核酸之結合、上述樹狀聚合物與上述親水性連接子之結合、上述樹狀聚合物與上述連接子之結合、上述細胞內化促進劑與上述親水性連接子之結合、及上述連接子與上述寡核酸之結合為共價結合、金屬配位或賓主相互作用。 [3]如[1]記載之寡核酸共軛物，其中上述樹狀聚合物與上述寡核酸之結合、上述樹狀聚合物與上述親水性連接子之結合、上述樹狀聚合物與上述連接子之結合、上述細胞內化促進劑與上述親水性連接子之結合、及上述連接子與上述寡核酸之結合為共價結合或金屬配位。 [4]如[1]記載之寡核酸共軛物，其中上述樹狀聚合物與上述寡核酸之結合、上述樹狀聚合物與上述親水性連接子之結合、上述樹狀聚合物與上述連接子之結合、上述細胞內化促進劑與上述親水性連接子之結合、及上述連接子與上述寡核酸之結合為共價結合。 [5]如[1]至[4]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中上述樹狀聚合物之反應性官能基之至少一部分被封端劑封端。 [6]如[5]記載之寡核酸共軛物，其中上述封端劑為選自由親水性分子及疏水性分子所組成之群中之1種以上之分子。 [7]如[6]記載之寡核酸共軛物，其中上述封端劑為親水性分子。 [8]如[6]記載之寡核酸共軛物，其中上述封端劑為選自由電中性親水性分子、酸性條件下質子化之極性分子、陰離子性分子及陽離子性分子所組成之群中之1種以上之親水性分子。 [9]如[6]記載之寡核酸共軛物，其中上述封端劑為選自由電中性親水性分子、酸性條件下質子化之極性分子、及陰離子性分子所組成之群中之1種以上之親水性分子。 [10]如[6]記載之寡核酸共軛物，其中上述封端劑為疏水性分子。 [11]如[6]記載之寡核酸共軛物，其中上述封端劑為選自由脂肪族化合物、芳香族化合物、三烷基胺及類固醇所組成之群中之1種以上之分子。 [12]如[6]記載之寡核酸共軛物，其中上述封端劑為脂肪族化合物。 [13]如[1]至[12]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中上述樹狀聚合物為樹枝狀接枝物(dendrigraft)或樹枝狀聚合物(dendrimer)。 [14]如[1]至[12]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中上述樹狀聚合物中之單體彼此經由醯胺鍵、酯鍵或糖苷鍵結合。 [15]如[1]至[9]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中上述樹狀聚合物中之單體彼此經由醯胺鍵或酯鍵結合。 [16]如[1]至[12]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中上述樹狀聚合物為聚-L-離胺酸樹枝狀接枝物、聚醯胺胺樹枝狀聚合物、或2,2-雙(羥基甲基)丙酸樹枝狀聚合物。 [17]如[1]至[16]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中上述寡核酸為基因表現控制劑。 [18]如[17]記載之寡核酸共軛物，其中上述基因表現控制劑為抑制mRNA(messenger RNA，信使核糖核酸)之表現之分子。 [19]如[17]記載之寡核酸共軛物，其中上述基因表現控制劑為RNA干擾誘導核酸或反義核酸。 [20]如[1]至[19]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中各親水性連接子之末端間直線距離之平均值為上述寡核酸之長度的五分之一以上。 [21]如[1]至[19]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中各親水性連接子之末端間直線距離之平均值為上述寡核酸之長度的四分之一以上。 [22]如[1]至[19]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中各親水性連接子之末端間直線距離之平均值為上述寡核酸之長度的三分之一以上。 [23]如[1]至[19]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中各親水性連接子之末端間直線距離之平均值為上述寡核酸之長度的五分之二以上。 [24]如[1]至[19]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中各親水性連接子之末端間直線距離之平均值為上述寡核酸之長度的一半以上。 [25]如[1]至[24]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中上述親水性連接子為選自由聚乙二醇、聚(2-烷基-2-㗁唑啉)、多肽及聚類肽所組成之群中之1種以上之親水性連接子。 [26]如[1]至[24]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中上述親水性連接子為選自由聚乙二醇、聚(2-甲基-2-㗁唑啉)、EK肽及聚肌胺酸所組成之群中之1種以上之親水性連接子。 [27]如[1]至[26]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中上述細胞內化促進劑為選自由低分子配體、多肽、適體、抗體或其片段、糖鏈及脂質所組成之群中之1種以上之細胞內化促進劑。 [28]如[1]至[26]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中上述細胞內化促進劑為低分子配體。 [29]如[1]至[26]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中上述細胞內化促進劑為多肽。 [30]如[1]至[26]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中上述細胞內化促進劑為適體。 [31]如[1]至[26]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中上述細胞內化促進劑為抗體或其片段。 [32]如[1]至[26]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中上述細胞內化促進劑為糖鏈。 [33]如[1]至[26]中任一項記載之寡核酸共軛物，其中上述細胞內化促進劑為脂質。 [34]一種醫藥組合物，其含有如[1]至[33]中任一項記載之寡核酸共軛物作為有效成分。 [35]一種針對選自由先天性代謝異常症、先天性內分泌疾病、單基因疾病、神經退化性疾病、神經疾病、肌肉疾病、腦膜炎、腦炎、腦病、溶酶體貯積病、惡性贅生物、纖維化症、炎症性疾病、免疫缺乏疾病、自體免疫疾病及感染症所組成之群中之疾病之治療劑或預防劑，其含有如[1]至[33]中任一項記載之寡核酸共軛物作為有效成分。 [36]一種用於治療及/或預防選自由先天性代謝異常症、先天性內分泌疾病、單基因疾病、神經退化性疾病、神經疾病、肌肉疾病、腦膜炎、腦炎、腦病、溶酶體貯積病、惡性贅生物、纖維化症、炎症性疾病、免疫缺乏疾病、自體免疫疾病及感染症所組成之群中之疾病之方法，其包括投予治療上有效量之如[1]至[33]中任一項記載之寡核酸共軛物。 [37]一種如[1]至[33]中任一項記載之寡核酸共軛物之用途，其用於製造針對選自由先天性代謝異常症、先天性內分泌疾病、單基因疾病、神經退化性疾病、神經疾病、肌肉疾病、腦膜炎、腦炎、腦病、溶酶體貯積病、惡性贅生物、纖維化症、炎症性疾病、免疫缺乏疾病、自體免疫疾病及感染症所組成之群中之疾病之治療劑及/或預防劑。 [38]如[1]至[33]中任一項記載之寡核酸共軛物，其用於治療及/或預防選自由先天性代謝異常症、先天性內分泌疾病、單基因疾病、神經退化性疾病、神經疾病、肌肉疾病、腦膜炎、腦炎、腦病、溶酶體貯積病、惡性贅生物、纖維化症、炎症性疾病、免疫缺乏疾病、自體免疫疾病及感染症所組成之群中之疾病。 [39]一種醫藥，其包含如[1]至[33]中任一項記載之寡核酸共軛物、與 針對疾病之1種以上之治療劑及/或1種以上之預防劑的組合， 上述疾病選自由先天性代謝異常症、先天性內分泌疾病、單基因疾病、神經退化性疾病、神經疾病、肌肉疾病、腦膜炎、腦炎、腦病、溶酶體貯積病、惡性贅生物、纖維化症、炎症性疾病、免疫缺乏疾病、自體免疫疾病及感染症所組成之群。 [40]如[1]至[33]中任一項記載之寡核酸共軛物，其用於與針對疾病之1種以上之治療劑及/或1種以上之預防劑併用而治療疾病， 上述疾病選自由先天性代謝異常症、先天性內分泌疾病、單基因疾病、神經退化性疾病、神經疾病、肌肉疾病、腦膜炎、腦炎、腦病、溶酶體貯積病、惡性贅生物、纖維化症、炎症性疾病、免疫缺乏疾病、自體免疫疾病及感染症所組成之群。 [41]一種如[1]至[33]中任一項記載之寡核酸共軛物之製造方法，其包括如下步驟：使複數個寡核酸及一個或複數個親水性連接子與樹狀聚合物結合；以及 使各親水性連接子與細胞內化促進劑結合。 [42]如[41]記載之寡核酸共軛物之製造方法，其進而包括如下步驟：使封端劑與上述樹狀聚合物結合。 [發明之效果]
根據本發明，能夠使細胞內化促進劑與靶細胞效率良好地相互作用，因此，能夠高效率地向細胞內遞送寡核酸，從而能夠提高寡核酸向細胞質內之遞送量。又，根據本發明，能夠避免先前作為功能性奈米粒子之代表的自締合型奈米粒子之結構缺陷。例如，利用脂質體或微胞之功能性奈米粒子於結構上不穩定，可能因為有機溶劑、界面活性劑、稀釋、剪應力、或與生物體成分之相互作用等而被破壞。又，該等粒子難以將尺寸嚴格控制於未達50 nm。相對於此，本發明之寡核酸共軛物具有穩定之結構，且可容易地控制其尺寸。
以下對本發明之較佳實施方式進行詳細說明。
本發明之一態樣之寡核酸共軛物包含樹狀聚合物、複數個寡核酸、一個或複數個細胞內化促進劑、及一個或複數個親水性連接子，各寡核酸直接或經由連接子結合於樹狀聚合物，各細胞內化促進劑經由親水性連接子結合於樹狀聚合物。本說明書中，所謂寡核酸共軛物，意指藉由寡核酸與其他分子結合而形成之單一分子。
本說明書中，所謂樹狀聚合物，意指自中心呈樹狀地進行分支、且分支具有規則性之聚合物。樹狀聚合物可為樹枝狀聚合物、樹枝狀基元(dendron)或樹枝狀接枝物。樹枝狀聚合物一般為具有樹狀結構之高度三維分支之分子，其形狀近似球狀。樹枝狀基元具有樹枝狀聚合物之中心部之至少一個官能基未分支之結構。樹枝狀聚合物及樹枝狀基元具有規則之分支結構，將其重複單元稱為「代數」。樹枝狀接枝物中，成為主鏈之分子鏈之側鏈上呈梳狀地結合分子鏈，進而於梳狀之分子鏈之側鏈上呈梳狀地結合分子鏈，藉此形成呈放射狀擴展之結構。樹枝狀接枝物之情形時，將梳狀之重複單元稱為「代數」。
樹狀聚合物之代數較佳為第三代～第二十代。例如，具有乙二胺中心之聚醯胺胺(PAMAM)樹枝狀聚合物之情形時，代數較佳為第五代～第二十代，更佳為第五代～第十代。聚離胺酸樹枝狀接枝物之情形時，代數較佳為第三代～第六代，更佳為第三代～第五代。2,2-雙(羥基甲基)丙酸(Bis-MPA)樹枝狀聚合物之情形時，代數較佳為第四代～第二十代，更佳為第四代～第十代。
樹狀聚合物之平均直徑(換言之平均粒徑)較佳為5 nm以上，更佳為5 nm～25 nm，進而較佳為5 nm～15 nm。本說明書中，樹狀聚合物之平均粒徑意指藉由動態光散射法獲得之粒度分佈中之平均粒徑。
上述樹狀聚合物中之單體彼此可藉由例如單鍵、雙鍵、三鍵、碳-矽鍵、醯胺鍵、糖苷鍵、酯鍵、醚鍵、胺基甲酸酯鍵、縮醛鍵、磷酸酯鍵、硫醚鍵、硫酯鍵、雙硫鍵、三唑鍵、腙鍵、醯肼鍵、亞胺或肟鍵、脲或硫脲鍵、脒鍵、磺醯胺鍵等結合方式結合，但結合方式並不限於該等。可採用該等結合方式中之任意結合方式，就安全性之觀點而言，較佳為可被酵素切斷之結合、或者於酸性條件下或還原環境等生物體內之環境下可被切斷之結合。結合方式之較佳例為醯胺鍵、酯鍵或糖苷鍵，但不限於該等。
作為樹狀聚合物之較佳例，可列舉：聚離胺酸樹枝狀聚合物、聚離胺酸樹枝狀接枝物、PAMAM樹枝狀聚合物、Bis-MPA樹枝狀聚合物或葡萄糖樹枝狀聚合物，但不限於該等。樹狀聚合物例如可為聚-L-離胺酸樹枝狀聚合物，亦可為聚-L-離胺酸樹枝狀接枝物。
本說明書中，所謂寡核酸，意指以包含鹼基、糖及磷酸之核苷酸作為重複單元之聚合物。寡核酸之種類並無特別限定，寡核酸共軛物可包含1種或2種以上之寡核酸。作為寡核酸，例如可列舉包含RNA、DNA、或該等之組合之單鏈或雙鏈，其中亦包括於同一鏈上混合存在RNA與DNA之寡核酸。寡核酸所含有之核苷酸可為天然型核苷酸，亦可為經過化學修飾之非天然型核苷酸，又，亦可為附加有胺基、硫醇基、或螢光化合物等之分子之核苷酸。寡核酸可為非天然型寡核酸，主鏈具有肽結構之肽核酸(PNA)、主鏈具有嗎啉環之嗎啉基核酸等與天然型寡核酸一樣地具有控制基因表現之作用之人工分子亦屬於非天然型寡核酸之範疇。
寡核酸之功能或作用並無限定，作為寡核酸，例如可列舉：反義核酸、sgRNA(single guide RNA，單鏈向導核糖核酸)、RNA編輯核酸、miRNA(microRNA，小分子核糖核酸)、siRNA(small interfering RNA，小分子干擾核糖核酸)、saRNA(small activating RNA，小激活核糖核酸)、shRNA(short hairpin RNA，小髮夾核糖核酸)、或Dicer受質RNA。
寡核酸例如可為基因表現控制劑。所謂基因表現控制劑係指使特定之基因產物之合成增加或減少之化合物。作為基因產物，例如可列舉：mRNA或其前驅物、miRNA或其前驅物、ncRNA(non-coding RNA，非編碼核糖核酸)、酵素、抗體、或其他蛋白。作為基因表現控制劑，例如可列舉：正向或負向控制mRNA之表現(即，促進或抑制表現)之分子、或者編輯RNA或DNA之分子。作為此種基因表現控制劑，例如可列舉：miRNA、siRNA等誘導RNA干擾(RNAi)之核酸(RNAi誘導核酸)、反義核酸、miRNA抑制劑、RNA活化核酸、RNA編輯誘導核酸、或基因組編輯誘導核酸，但基因表現控制劑不限於該等。
寡核酸之長度例如可為4～200個鹼基(對)、7～100個鹼基(對)、或12～30個鹼基(對)。
寡核酸共軛物中之寡核酸之數量並無特別限定，例如可為1個以上、2個以上、6個以上、10個以上、18個以上、20個以上、21個以上、25個以上、26個以上、28個以上、35個以上、或50個以上，且可為400個以下、200個以下或100個以下。於寡核酸經由共價鍵與樹狀聚合物結合之情形時，寡核酸之數量例如可為1個以上、或者樹狀聚合物所具有之反應性官能基之0.5%以上、1%以上、或2%以上，較佳為樹狀聚合物所具有之反應性官能基之3%以上或5%以上。寡核酸共軛物中之寡核酸之數量例如可藉由如下方式求出：測定包含寡核酸共軛物之溶液中之樹狀聚合物之濃度及寡核酸之濃度，由該等值計算寡核酸相對於樹狀聚合物之比率。包含寡核酸共軛物之溶液中之樹狀聚合物之濃度例如可藉由高效液相層析法(HPLC)測定。寡核酸之濃度例如可根據使用紫外可見分光光度計測定之260 nm下之吸光度而求出。
寡核酸可藉由公知方法製造。例如藉由基於亞磷醯胺法或三酯法之固相合成法或液相合成法，利用核酸自動合成機或手動地製造寡核酸。
各寡核酸直接或經由連接子結合於樹狀聚合物。連接樹狀聚合物與寡核酸之連接子並無特別限定，可為聚乙二醇(PEG)等公知之連接子。寡核酸共軛物可包含作為該連接子之1種或2種以上之連接子。就使細胞內化促進劑與靶細胞效率良好地相互作用、提高寡核酸共軛物向細胞內之遞送效率之觀點而言，連接樹狀聚合物與寡核酸之連接子之末端間直線距離之平均值較佳為小於連接樹狀聚合物與細胞內化促進劑之親水性連接子之末端間直線距離之平均值。作為一例，於連接樹狀聚合物與寡核酸之連接子為PEG之情形時，其數量平均分子量可為1000以下、800以下、600以下、或300以下。
本說明書中，親水性連接子係用以連接樹狀聚合物與細胞內化促進劑之親水性分子。所謂親水性分子，意指具有易與水之間形成氫鍵、易溶解於水或易與水混合之性質之分子。親水性分子可為帶電分子或不帶電之高極性分子。帶電分子之帶電基可為帶正電之基(陽離子)、帶負電之基(陰離子)、或該等之組合。若用以連接樹狀聚合物與細胞內化促進劑之連接子為親水性，則有利於抑制寡核酸共軛物凝集、提高溶解性、避免被網狀內皮系統吞噬、避免與生物體成分發生非特異性相互作用、及改善藥物代謝動力(即延長血中滯留時間)。作為親水性連接子，例如可列舉：PEG、聚(2-烷基-2-㗁唑啉)、多肽、聚類肽、或聚甜菜鹼，但本發明中之親水性連接子並不限於該等。寡核酸共軛物可包含1種或2種以上之親水性連接子。親水性連接子較佳為選自由PEG、聚(2-甲基-2-㗁唑啉)(pMeOx)、聚肌胺酸(pSar)及EK肽所組成之群中之1種或2種以上。EK肽係麩胺酸與離胺酸交替排列構成之肽。
一條親水性連接子可具有複數個鏈段。作為具有複數個鏈段之親水性連接子，例如可列舉由EK肽與PEG結合而成之聚合物，但不限於此。親水性連接子可具有線狀結構或分支結構。
作為一例，於長度為12～30個鹼基(對)之寡核酸與樹狀聚合物直接結合或經由數量平均分子量800以下之PEG與樹狀聚合物結合、且親水性連接子為PEG之情形時，就使細胞內化促進劑與靶細胞效率良好地相互作用、提高寡核酸共軛物向細胞內之遞送效率之觀點而言，親水性連接子之數量平均分子量可為2000以上、3400以上、5000以上、6000以上、8000以上、或10000以上。又，於親水性連接子為pMeOx或pSar之情形時，親水性連接子之數量平均分子量可為4000以上、7000以上、10000以上、15000以上、或20000以上。又，於親水性連接子為EK肽之情形時，EK肽可為包含5對以上、7對以上、10對以上、15對以上或20對以上之交替排列之麩胺酸與離胺酸之EK肽。本說明書中，數量平均分子量係藉由利用核磁共振(NMR)之端基定量法、或尺寸排除層析法(SEC)求出之值。
親水性連接子之數量可根據細胞內化促進劑之種類及數量來決定。親水性連接子之數量可少於、多於或等於細胞內化促進劑之數量。於親水性連接子經由共價鍵與樹狀聚合物結合之情形時，親水性連接子之數量例如可為1個以上、2個以上、或樹狀聚合物所具有之反應性官能基之1%以上，較佳為樹狀聚合物所具有之反應性官能基之2%以上，更佳為3%以上或5%以上。
本說明書中，細胞內化促進劑係藉由與靶細胞特異性或非特異性地相互作用而誘導該細胞內化促進劑上結合之物質向靶細胞之內化之分子種類。本態樣之寡核酸共軛物中，藉由使細胞內化促進劑經由親水性連接子與樹狀聚合物結合，相較於不含該細胞內化促進劑之情形(例如單獨使用寡核酸之情形)，能夠高效率地將寡核酸遞送至靶細胞內。作為細胞內化促進劑，可列舉：與細胞表面受體相互作用之物質、與膜轉運體相互作用之物質、與細胞黏著因子相互作用之物質、或與細胞膜表面相互作用之其他物質，但不限於該等。細胞內化促進劑例如可為與存在於細胞膜表面之作為細胞黏著因子之整合素相互作用之物質、與上皮細胞黏著分子相互作用之物質、與核仁素相互作用之物質、與作為細胞骨架分子之波形蛋白相互作用之物質、與前列腺特異性膜抗原相互作用之物質、與表皮生長因子受體、生長抑素受體、甘露糖受體、去唾液酸糖蛋白受體、葉酸受體等細胞表面受體相互作用之物質、或者與葡萄糖轉運體、非選擇性單胺轉運體等轉運體相互作用之物質。
作為細胞內化促進劑，例如可列舉：疏水性分子、聚陽離子、低分子配體、多肽、適體、抗體或其片段、糖或糖鏈、或脂質，但細胞內化促進劑並不限於該等。寡核酸共軛物可包含1種或2種以上之細胞內化促進劑。細胞內化促進劑較佳為選自由低分子配體、多肽、適體、及糖或糖鏈所組成之群中之1種或2種以上。細胞內化促進劑更佳為多肽、低分子配體、或適體。
多肽之分子量可為例如50kDa以下、15kDa以下、6kDa以下、2kDa以下、或1kDa以下，但不限於該等。多肽之分子量可藉由例如質譜法求出。
本說明書中，抗體或其片段係指具有與特定因子特異性結合之功能之支架蛋白(scaffold protein)，包括IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等免疫球蛋白，F(ab)'2、Fab'、Fab、scFv等片段化抗體，鯊魚VNAR、駱駝VHH等單域抗體，及親和抗體(Affibody)、毒藜素(Aphylline)、單抗體(Monobody)、α抗體(α-Body)等擬抗體(antibody mimetic)，但不限於該等。
作為細胞內化促進劑之具體例，可列舉以下之式(I)～(IV)表示之多肽。式(I)表示之多肽係作為包含精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)序列之環狀肽配體(cRGD)之一種的cRGDfK(分子量：603.7Da，Pharmaceutics, 2018, 10, 2)。cRGDfK與整合素α Vβ 3相互作用。cRGDfK以外之cRGD亦可用作細胞內化促進劑。式(II)表示之多肽係與整合素α Vβ 6相互作用之c(avb6)(分子量：1046.2，ACS Omega, 2018, 3, 2428-2436)。式(III)表示之多肽係與表皮生長因子受體相互作用之GE11(分子量：1539.7Da)。式(IV)表示之多肽係與生長抑素受體相互作用之奧曲肽衍生物(OCT；分子量：1577.8Da)。作為cRGD，可使用市售品。式(II)～(IV)表示之肽可藉由周知之合成方法容易地獲得。
[化1]
Figure 02_image001
[化2]
Figure 02_image003
作為其他細胞內化促進劑之具體例，可列舉以下之式(V)～(VII)表示之低分子。式(V)表示之低分子係與葉酸受體相互作用之葉酸。式(VI)表示之低分子係與前列腺特異性膜抗原相互作用之DUPA。式(VII)表示之低分子係與非選擇性單胺轉運體相互作用之茚達曲林(IND)。
[化3]
Figure 02_image005
作為其他細胞內化促進劑之具體例，可列舉以下之式(VIII)～(XII)表示之糖。式(VIII)表示之糖係與葡萄糖轉運體相互作用之葡萄糖(Glu)。式(IX)表示之糖係與甘露糖受體相互作用之甘露糖(Man)。式(X)及式(XI)表示之糖係與去唾液酸糖蛋白受體相互作用之N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)及半乳糖(Gal)。式(XII)表示之糖係與作為細胞骨架分子之波形蛋白相互作用之N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)。
[化4]
Figure 02_image007
作為其他細胞內化促進劑，例如可列舉具有下表所示之序列編號1～6表示之鹼基序列之適體。作為與核仁素相互作用之DNA適體，可列舉：序列編號1表示之AS1411(Oncotarget, 2015, 6(26), 22270-22281)、及序列編號2表示之FAN-1524dI(Scientific Reports, 2016, 6, 1-12)。作為與上皮細胞黏著分子相互作用之適體，可列舉：序列編號3表示之EpCAM適體(Molecular Cancer Therapeutics, 2015, 14(10), 2279-2291)、及序列編號4表示之EpCAM適體(Theranostics, 2015, 5(10), 1083-1097)。作為與運鐵蛋白受體相互作用之適體，可列舉：序列編號5表示之FB4(Proc Natl Acad Sci USA., 2008, 105(41), 15908-15913)、及序列編號6表示之GS24(Mol Ther Nucleic Acids, 2014, 3(1), e144)。
[表1]
序列 編號 序列(5'至3')
1 ggtggtggtggttgtggtggtggtgg
2 ggtggtggtggttgiggtggtggigg
3 GC(F)GAC(F)U(F)GGU(F)U(F)AC(F)C(F)C(F)GGU(F)C(F)GU(F)U(F)U(F)
4 cgcgcgccgcAC(F)GU(F)AU(F)C(F)C(F)C(F)U(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GU(F)Acggcgcgcg
5 GGGCGAAUUCCGCGUGUGCUGAGGGCGGAAGAACUAAUUUGGGACGGAUUGCGGCCGUUGUCUGUGGCGUCCGUUCGGG
6 gcgtgtgcacacggtcacttagtatcgctacgttctttggttccgttcgg
表中，小寫字母＝DNA、大寫字母＝RNA、(F)＝2'-F置換
就使細胞內化促進劑與靶細胞效率良好地相互作用、提高寡核酸共軛物向細胞內之遞送效率之觀點而言，寡核酸共軛物中之細胞內化促進劑之數量例如可為1個以上、2個以上、6個以上、12個以上、18個以上、25個以上或26個以上，且可為400個以下、200個以下或100個以下。寡核酸共軛物中之細胞內化促進劑之數量例如可藉由如下方式求出：測定包含寡核酸共軛物之溶液中之樹狀聚合物之濃度及細胞內化促進劑之濃度，由該等值計算細胞內化促進劑相對於樹狀聚合物之比率。樹狀聚合物之濃度及細胞內化促進劑之濃度例如可藉由HPLC或使用紫外可見分光光度計測定。
如上所述，於樹狀聚合物、更具體而言樹狀聚合物之反應性官能基(該等為末端官能基)之至少一部分結合有寡核酸或親水性連接子。一實施方式中，對於未與寡核酸及親水性連接子結合即未反應之反應性官能基之至少一部分或全部，可利用封端劑進行封端。所謂反應性官能基之封端，換言之係指藉由結合而降低反應性官能基之反應性。封端劑藉由與樹狀聚合物之反應性官能基結合，而保護樹狀聚合物以免其參與各種相互作用或化學反應。例如，封端劑保護樹狀聚合物以免其參與靜電相互作用、分解反應、縮合反應、加成反應等。
又，封端劑可藉由與樹狀聚合物結合，而對樹狀聚合物附加樹狀聚合物原本不具備之功能或活性。作為此種封端劑，例如可列舉：提高隱身性(stealth)之分子、與脂質雙層膜相互作用之分子、具有質子緩衝能力之分子等，但封端劑並不限於該等。
封端劑例如可為選自由a)親水性分子及b)疏水性分子所組成之群中之1種或2種分子。
上述a)親水性分子可為a-1)電中性親水性分子、a-2)酸性條件下質子化之極性分子、a-3)陰離子性分子、或a-4)陽離子性分子。a)親水性分子可為與親水性連接子同種之分子，亦可為與親水性連接子不同種之分子。本說明書中，所謂「電中性」係指如下情況：陽離子與陰離子之數量相等；或者以多的一方之帶電基之數量為基準計，陽離子與陰離子之數量相差10%以內。
作為上述a-1)電中性親水性分子，例如可列舉：含有羥基、烷氧基、肟基、酯基、醯胺基、醯亞胺基、烷氧基醯胺基、羰基、磺醯基、硝基、吡咯啶酮基等親水性基之分子、甜菜鹼等雙性離子、PEG、或甲氧基聚乙二醇等烷氧基聚乙二醇，但親水性分子並不限於該等。
上述a-2)酸性條件下質子化之極性分子係指於內體中等酸性環境下保有之電荷與於血液中、細胞間質液中等生理條件下保有之電荷不同的分子。酸性條件下質子化之極性分子係指具有7.4以下、較佳為5.0～7.4之酸解離常數(pK a)之分子。作為酸性條件下質子化之極性分子，例如可列舉：含有三級胺基、二乙基三胺(DET)基(-NH-CH 2-CH 2-NH-CH 2-CH 2-NH 2)、嗎啉基、硫代嗎啉基、咪唑基、吡啶基、羧基等極性基之分子，但酸性條件下質子化之極性分子並不限於該等。
上述a-3)陰離子性分子係指於生理條件下呈負離子價之分子。例如可列舉：含有羧基、磺基、磷酸基、磷酸酯基等官能基之分子，但陰離子性分子並不限於該等。
上述a-4)陽離子性分子係指於生理條件下呈正離子價之分子。例如可列舉：含有一級胺基、二級胺基、三級胺基、胍基等官能基之分子，但陽離子性分子並不限於該等。
上述所謂b)疏水性分子，意指與水之間不易形成氫鍵、對水之親和性較低之分子。疏水性分子可為非極性分子或分配係數為2.0以上之分子。作為疏水性分子，例如可列舉：脂肪族化合物、含有三烷基胺芳香族基等疏水性基之分子、膽固醇或類固醇，但疏水性分子並不限於該等。
本說明書中，「結合」係指直接或間接之不可逆結合。所謂不可逆結合係指反應不會逆向進行之結合，即，一旦形成後不會經逆反應解離之結合、或者逆反應解離為可忽視程度之結合。樹狀聚合物與寡核酸之結合或與結合寡核酸之連接子之結合、寡核酸與連接子之結合、樹狀聚合物與親水性連接子之結合、及細胞內化促進劑與親水性連接子之結合例如可為藉由官能基間之親核加成反應、親核取代反應、親電子取代反應等化學反應生成之共價結合、氨與鉑之間的結合之類的金屬配位結合、或生物素與抗生物素蛋白之間的結合之類的賓主相互作用。就達成較高之結構穩定性之觀點、及控制寡核酸共軛物之尺寸之觀點而言，結合較佳為共價結合。
作為共價鍵，例如可列舉：單鍵、雙鍵、三鍵、醯胺鍵、糖苷鍵、酯鍵、醚鍵、胺基甲酸酯鍵、縮醛鍵、磷酸酯鍵、硫醚鍵、硫酯鍵、雙硫鍵、三唑鍵、腙鍵、醯肼鍵、亞胺或肟鍵、脲或硫脲鍵、脒鍵、磺醯胺鍵、或者藉由反向電子需求型狄爾斯-阿爾德(Diels-Alder)反應形成之鍵，但共價鍵並不限於該等。
醯胺鍵係形成於羧基與胺基之間。醯胺鍵例如採用適當保護之胺基與活化羧酸(被N-羥基丁二醯亞胺活化之酯等)之間發生的先前之醯胺鍵形成反應形成。
雙硫鍵(-S-S-)例如藉由含有硫醇(thiol，亦稱為mercaptan)基(-SH)之成分與其他成分之活化硫醇基進行硫醇交換而形成。
硫醚鍵(-S-)例如採用硫醇基與順丁烯二醯亞胺基之間發生的先前之硫醚鍵形成反應形成。
三唑鍵係形成於疊氮基與碳碳三鍵之間。三唑鍵例如藉由使用金屬觸媒之Huisgen環化、不使用金屬觸媒之應變促進型疊氮-炔環加成反應(Strain-promoted alkyne-azide cycloaddition)等所謂點擊(click)反應形成。
金屬配位係藉由金屬離子與配位基形成錯合物而結合之結合方式。作為金屬離子，可列舉：鉑族元素、錳、鈷、銅、釓等金屬元素之離子，但不限於該等。又，作為配位基，可列舉：氨、吡啶、聯吡啶、乙二胺、乙二胺四乙酸、乙醯丙酮酸鹽、或該等之衍生物等，但不限於該等。
賓主相互作用係作為提供可選擇性地識別特定分子之空腔之分子的主體分子與作為可嵌入其中之分子的客體分子之間的相互作用。作為主體分子，可列舉：環糊精、分子監獄(carcerand)、腔穴化合物(cavitand)、冠醚、穴狀配位子(cryptand)、葫蘆脲(cucurbituril)、杯芳烴、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素等，但不限於該等。又，作為客體分子，可列舉：金剛烷、雙金剛烷、膽固醇、萘、生物素等，但不限於該等。
其次，參照圖1說明寡核酸共軛物之結構。圖1之(A)係表示寡核酸共軛物之一態樣之模式圖。寡核酸共軛物100包含樹狀聚合物之中心10與配置於中心10之周圍之複數個寡核酸1、細胞內化促進劑2、及親水性連接子3。寡核酸1經由連接子5結合於中心10。親水性連接子3結合於中心10，細胞內化促進劑2結合於親水性連接子3。又，於中心10亦結合有封端劑4。如此，寡核酸共軛物100之樹狀聚合物以外之構成要素全部結合於樹狀聚合物，因此，樹狀聚合物構成「中心」10即寡核酸共軛物100之中心部。又，於水溶液中，寡核酸1及親水性連接子3自中心10呈大致放射狀地擴展，藉此使寡核酸共軛物100成為近似球狀之奈米粒子之形狀。因此，寡核酸共軛物100表現出奈米粒子之行為。本領域中，有關奈米粒子於生物體內行為之見解豐富。再者，於圖1中，寡核酸1經由連接子5結合於中心10，但如上所述，寡核酸1亦可直接結合於中心10。
寡核酸共軛物100之平均粒徑較佳為10～100 nm，更佳為15～45 nm，進而較佳為15～35 nm。本說明書中，寡核酸共軛物之平均粒徑意指藉由動態光散射法獲得之粒度分佈中之平均粒徑。寡核酸共軛物100由於含有樹狀聚合物作為中心10，故而易於控制尺寸，能夠進行精密設計。
為了將寡核酸共軛物100遞送至細胞內，需使細胞內化促進劑2與細胞相互作用。就提高寡核酸共軛物向細胞內之遞送效率之觀點而言，較佳為細胞內化促進劑2之密度較高。作為寡核酸共軛物100，由於高度分支之樹狀聚合物之中心10上結合有細胞內化促進劑2，故而實現細胞內化促進劑2之高密度分佈，因此能夠使細胞內化促進劑2與靶細胞效率良好地相互作用。
又，為了使細胞內化促進劑2與細胞相互作用，細胞內化促進劑2較佳為存在於寡核酸共軛物100之奈米粒子中之外側部分。一實施方式中，如圖1之(A)所示，細胞內化促進劑2更佳為存在於模擬寡核酸共軛物100之結構的真球之最外側之部分即寡核酸共軛物100之奈米粒子之表面。另一實施方式中，細胞內化促進劑2未存在於模擬寡核酸共軛物100之結構的真球之最外側之部分，於該情形時，亦較佳為親水性連接子3之空間範圍(旋轉半徑)未被核酸1之空間範圍完全包圍在內，親水性連接子3實質上露出至外側。本發明之本態樣之寡核酸共軛物100中，由於用以連接樹狀聚合物與細胞內化促進劑之連接子為親水性，故而抑制非特異性相互作用，易使細胞內化促進劑2存在於寡核酸共軛物100之奈米粒子中之外側部分。寡核酸共軛物100之奈米粒子中之細胞內化促進劑2之位置可藉由親水性連接子3之種類及長度來調整。就使細胞內化促進劑2與靶細胞效率良好地相互作用、提高寡核酸共軛物向細胞內之遞送效率之觀點而言，各親水性連接子3之末端間直線距離之平均值可為寡核酸1之長度之五分之一以上、四分之一以上、三分之一以上、五分之二以上、或一半以上。此處，所謂各親水性連接子3之末端間直線距離係指各親水性連接子3之結合中心10之末端與結合細胞內化促進劑2之末端之間的直線距離。更嚴密而言，各親水性連接子3之末端間直線距離之平均值可較佳為自中心10之表面至寡核酸1之自由末端的直線距離之平均值之五分之一以上、四分之一以上、三分之一以上、五分之二以上、或一半以上。此處，所謂自中心10之表面至寡核酸1之自由末端的直線距離係指連接子5之結合中心10之末端(其中，於寡核酸1與中心10直接結合之情形時，寡核酸1之結合中心10之末端)與寡核酸1之未結合連接子5或中心10之末端之間的直線距離。例如，於寡核酸1為5 nm之核酸、且寡核酸1與中心10直接結合之情形時，各親水性連接子3之末端間直線距離之平均值可為1 nm以上、1.25 nm以上、1.67 nm、2 nm以上或2.5 nm以上。
有時可藉由測定由於親水性連接子3之存在而形成之水合層之厚度來求解各親水性連接子3之末端間直線距離之平均值。此處，參照圖1之(B)對上述水合層進行說明。由於親水性連接子3為親水性，故而於水溶液中，水分子固定於親水性連接子3彼此之間(即寡核酸共軛物100被水合)，藉此於親水性連接子3之周圍形成水分子之層即水合層20。根據親水性連接子之種類，有時某親水性連接子3之周圍形成之水合層20之厚度h與該親水性連接子3之末端間直線距離相等或大致相等。因此，於此種情形(例如親水性連接子3為PEG之情形)時，可將各親水性連接子3之末端間直線距離之平均值定義為水合層20之厚度h之平均值。水合層20之厚度h之平均值例如可藉由多角度動態光散射法求出。更具體而言，首先，準備分別包含樹狀聚合物之中心10與結合於中心10之複數個親水性連接子3之複數個奈米粒子化合物，且各奈米粒子化合物之親水性連接子3之分子量不同於另一奈米粒子化合物之親水性連接子3之分子量。其次，藉由多角度動態光散射法測定各奈米粒子化合物之平均粒徑，根據平均粒徑之差及親水性連接子3之分子量之差，求出親水性連接子3之分子量與水合層之厚度之相關函數。進而，可基於該相關函數，由寡核酸共軛物100中之親水性連接子3之分子量來計算寡核酸共軛物100中之水合層20之厚度h。
寡核酸共軛物可為游離體，亦可為藥學上容許之鹽。寡核酸共軛物可為溶劑合物(例如水合物、乙醇溶劑合物、丙二醇溶劑合物)或非溶劑合物之任意者。藥學上容許之鹽可為酸加成鹽或鹼加成鹽。作為酸加成鹽，例如可列舉：甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸(TFA)、丙酸鹽、琥珀酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、己二酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、順丁烯二酸鹽、對甲苯磺酸鹽、抗壞血酸鹽等與有機酸之鹽；鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等與無機酸之鹽等。作為鹼加成鹽，例如可列舉：鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等鹼土金屬鹽；銨鹽；三甲胺鹽；三乙胺鹽；二環己基胺鹽、乙醇胺鹽、二乙醇胺鹽、三乙醇胺鹽、普魯卡因鹽等脂肪族胺鹽；N,N-二苄基乙二胺等芳烷基胺鹽；吡啶鹽、甲基吡啶鹽、喹啉鹽、異喹啉鹽等雜環芳香族胺鹽；四甲基銨鹽、四乙基銨鹽、苄基三甲基銨鹽、苄基三乙基銨鹽、苄基三丁基銨鹽、甲基三辛基銨鹽、四丁基銨鹽等四級銨鹽；精胺酸鹽、離胺酸鹽等鹼性胺基酸鹽等。
本發明亦提供製造上述態樣之寡核酸共軛物之方法。即，本發明之一態樣係一種製造寡核酸共軛物之方法，其包括如下步驟：使複數個寡核酸及一個或複數個親水性連接子與樹狀聚合物結合；以及使細胞內化促進劑與各親水性連接子結合。寡核酸可直接或經由連接子結合於樹狀聚合物。一實施方式中，製造寡核酸共軛物之方法可進而包括使封端劑與樹狀聚合物結合之步驟。藉此，能夠製造樹狀聚合物之反應性官能基之至少一部分被封端劑封端之寡核酸共軛物。
上述各步驟均可採用公知方法進行。作為公知方法，例如可列舉：利用活化基使胺基與羧基反應形成醯胺鍵之方法；利用活化基使硫醇基彼此反應形成雙硫鍵之方法；使硫醇基與順丁烯二醯亞胺基反應形成硫醚鍵之方法；利用使用觸媒或活化基之點擊化學，由疊氮基與炔基形成三唑鍵之方法；利用反向電子需求型狄爾斯-阿爾德反應，由四𠯤、三𠯤等電子極其不足之雜環與降𦯉烯、反式環辛烯、環辛炔等具有應變之碳多重鍵之化合物形成鍵之方法等。
上述態樣之寡核酸共軛物亦可藉由上述態樣之方法以外之公知方法製造。
本發明之一態樣係一種含有上述態樣之寡核酸共軛物作為有效成分之醫藥組合物。醫藥組合物包含藥學上容許之添加劑。本說明書中，所謂「藥學上容許之」係指就藥理學或毒性學之觀點而言允許用於哺乳動物。即，所謂「藥學上容許之」物質係指生理學上允許使用、且對哺乳動物投予之情形時一般不會引起過敏性反應或者其他有害反應或毒性反應之物質。「藥學上容許之」物質意指經公知之監督官署批准、或於公知之藥典中列舉之用於哺乳動物更具體而言人類之物質。「藥學上容許之添加劑」意指與寡核酸共軛物一起使用來製作醫藥組合物製劑之藥理學上之惰性材料。
添加劑可為液體或固體。考慮到以獲得所需之用量、軟硬度等之醫藥組合物之方式設計之投予方法來選擇添加劑。添加劑並無特別限定，例如可列舉：水、生理鹽水、其他水性溶劑、水性或油性基材等各種載體、賦形劑、結合劑、pH調整劑、崩解劑、吸收促進劑、潤滑劑、著色劑、矯味劑、香料等。添加劑之調配比率可基於醫藥品領域中之常用範圍而適當設定。
醫藥組合物例如可為用於注射之無菌組合物。用於注射之無菌組合物可按照通常之製劑生產方法(例如使有效成分溶解或懸浮於注射用水、天然植物油等溶劑等)進行製備。作為注射用之水性液，例如使用包含生理鹽水、葡萄糖、或其他輔助液(例如D-山梨糖醇、D-甘露醇、乳糖、蔗糖、氯化鈉等)之等張液等。注射用之水性液可進而包含例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇或聚乙二醇)、非離子性界面活性劑(例如聚山梨醇酯80TM或HCO-50)等適宜之溶解輔助劑。又，注射用之水性液亦可包含緩衝劑(例如磷酸鹽緩衝液或乙酸鈉緩衝液)、鎮痛劑(例如氯化苄烷銨、鹽酸普魯卡因等)、穩定劑(例如人血清白蛋白或聚乙二醇)、保存劑(例如苄醇、苯酚等)、抗菌劑、分散劑、抗氧化劑等該技術領域中公知之各種材料。注射劑亦可為例如冷凍乾燥製劑。
本發明之上述態樣之寡核酸共軛物或醫藥組合物可用於治療及/或預防特定之基因產物相關之疾病。作為特定之基因產物相關之疾病，例如可列舉：先天性代謝異常症、先天性內分泌疾病、單基因疾病、神經退化性疾病、神經疾病、肌肉疾病、腦膜炎、腦炎、腦病、溶酶體貯積病、惡性贅生物、纖維化症、炎症性疾病、免疫缺乏疾病、自體免疫疾病、或感染症，但疾病並不限於該等。因此，本發明之一態樣係一種含有寡核酸共軛物作為有效成分之針對上述疾病之治療劑或預防劑。
本發明之另一態樣係一種包括對人類或人類以外之動物投予治療上有效量之寡核酸共軛物的用於治療及/或預防上述疾病之方法。人類可為需要治療之人類即患者。人類以外之動物意指包括靈長類等溫血哺乳動物，鳥類，貓、狗、綿羊、山羊、牛、馬、豬等家庭寵物或家畜，小鼠、大鼠、豚鼠等實驗動物，魚類，蟲類，動物園之動物及野生動物等在內之動物。投予方法可為經口、舌下、靜脈內、動脈內、皮下、皮內、腹腔內、肌肉內、脊椎內、腦室內、鼻腔內、經黏膜、直腸、滴眼、眼內、經肺、經皮、關節內、局部(皮膚)、毛囊內、陰道內、子宮內、腫瘤內、或淋巴內投予、或該等之組合，但不限於該等。
本發明之另一態樣係一種用於治療及/或預防上述疾病之寡核酸共軛物。本發明之另一態樣係一種用於製造針對上述疾病之治療劑及/或預防劑的寡核酸共軛物之用途。
本發明之上述態樣之寡核酸共軛物或醫藥組合物亦可與1種以上之其他藥劑併用。其他藥劑可為針對上述特定之基因產物相關之疾病的1種以上之治療劑及/或預防劑。例如，於對象之疾病為惡性贅生物之情形時，作為其他藥劑之例，可列舉化學療法中可使用之醫藥品。即，本發明之一態樣係一種用於與針對上述疾病之1種以上之治療劑及/或預防劑併用而治療疾病之寡核酸共軛物。本發明之另一態樣係一種包含寡核酸共軛物或醫藥組合物與針對上述疾病之1種以上之治療劑及/或預防劑的組合之醫藥。然而，本發明係能夠高效率地向細胞內遞送寡核酸之平台(platform)技術，可用於宜將寡核酸作為治療劑或預防劑之任何疾病，因此，其他藥劑不限於特定藥劑。
寡核酸共軛物或醫藥組合物及與其組合使用之上述其他藥劑之投予時間並無限定，可將該等同時或適當分開地對人類或人類以外之動物進行投予。或可於上述態樣之醫藥組合物中調配上述其他藥劑而製備合劑。上述其他藥劑之投予量及調配量可基於臨床上採用之用量而適當決定。又，寡核酸共軛物或醫藥組合物與上述其他藥劑之調配比可根據投予對象、投予路徑、對象疾病、症狀、其他藥劑之組合等適當決定。 [實施例]
以下，列舉實施例及試驗例來詳細地說明本發明，但本發明並不限定於該等實施例。再者，只要無特別規定，下文中之「%」均指重量%。
＜寡核酸之合成＞ 準備表2所示之siRNA及反義核酸。於siRNA之正義股RNA之3'末端及反義核酸之5'末端經由spacer18(六乙二醇)結合有硫醇基。該等核酸由JEEN DESIGN股份有限公司製造。 [表2]
Atp5b-siRNA 正義股 (序列編號7) 5'-U(F)^G(M)^U(F)C(M)A(F)U(M)U(F)G(F)G(F)A(M)G(F)A(M)A(F)C(M)C(F)U(M)A(F)U(M)U(F)tt-3'_8_SH
Atp5b-siRNA 反義股 (序列編號8) 5'-p_A(M)^A(F)^U(M)A(F)G(M)G(F)U(M)U(F)C(M)U(F)C(M)C(M)A(M)A(F)U(M)G(F)A(M)C(F)A(M)^t^t-3'
加擾siRNA 正義股 (序列編號9) 5'-G(F)^C(M)^U(F)A(M)G(F)A(M)C(F)U(F)G(F)U(M)U(F)U(M)A(F)A(M)C(F)U(M)G(F)A(M)U(F)tt-3'_18_SH
加擾siRNA 反義股 (序列編號10) 5'-p_A(M)^U(F)^C(M)A(F)G(M)U(F)U(M)A(F)A(M)A(F)C(M)A(M)G(M)U(F)C(M)U(F)A(M)G(F)C(M)^t^t-3'
Malat1-ASO (序列編號11) SH_18_5'-mC(L)^T(L)^A(L)^g^t^t^c^a^c^t^g^a^a^T(L)^G(L)^mC(L)-3'
表中，大寫字母＝RNA、小寫字母＝DNA、mC＝5-甲基胞苷、(M)＝2'-O-CH 3取代、(F)＝2'-F取代、(L)＝鎖核酸、^＝硫代磷酸酯連接、p＝PO 4、18＝spacer18
使siRNA與乙二胺四乙酸三鈉鹽(EDTA 3Na)溶解於pH值7.4之10 mM磷酸緩衝生理鹽水(PBS)，進而添加二硫蘇糖醇(DTT)(終濃度：EDTA 0.5 mM、DTT 40 mM)。將該溶液於25℃下加熱6小時後，使用PBS藉由超過濾(區分分子量10kDa)實施6次純化。對於所獲得之溶液，使用紫外可見分光光度計(TECAN公司製造，Infinite M200 PRO)，根據260 nm下之吸光度之測定值求出核酸濃度。
＜實施例1.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF5標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ (A)疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G4之合成 作為樹狀聚合物，使用COLCOM公司製造之表面具有胺基之第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物(DGL G4)。於DGL G4之50 mg/mL二甲基亞碸(DMSO)溶液10 μL中添加PEG12-SPDP(Thermo Fisher Scientific公司製造)之300 mM DMSO溶液1.53 μL、三乙胺(TEA)之50 v/v%二甲基甲醯胺(DMF)溶液1.17 μL、及Alexa Fluor(註冊商標)546 NHS酯(Thermo Fisher Scientific公司製造)之30 mM DMSO溶液1.28 μL，於室溫下攪拌4.5小時。繼而，於該反應液中添加疊氮-PEG5k-NHS(Nanocs公司製造，PEG之數量平均分子量：5000)之20 mM DMSO溶液68.9 μL，進而於室溫下攪拌18小時。繼而，添加甲基-PEG12-NHS(Thermo Fisher Scientific公司製造)之200 mM DMSO溶液15.3 μL，進而於室溫下攪拌6小時。以如上方式使DGL G4之胺基與疊氮-PEG5k-NHS、PEG12-SPDP、作為陰離子性螢光色素之Alexa Fluor 546 NHS酯及甲基-PEG12-NHS之N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G4。於反應液中添加純水400 μL並混合後，使用純水藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量10kDa)實施6次純化。於回收之水溶液中添加純水，將液體體積調整成100 μL。
(B)疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G4之合成 於(A)所示之疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G4之水溶液20 μL中添加3M之氯化鈉水溶液12 μL與siRNA之5.1 mM PBS溶液72.1 μL，於25℃下攪拌15小時，藉此使疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G4所含有之吡啶基二硫基與siRNA所含有之SH基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR(GE Healthcare公司製造)，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：PBS)。回收包含結合有siRNA之DGL G4之區分部分(fraction)，藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)進行濃縮，將液體體積調整成170 μL。
(C)cRGD-DBCO之合成 於Cyclo(-RGDfK)(Chemscene公司製造)之100 mM DMSO溶液33.1 μL中添加DBCO-NHCO-PEG4-NHS(BroadPharm公司製造)之300 mM DMSO溶液33.1 μL與TEA 1.39 μL，於25℃下攪拌16小時，藉此使Cyclo(-RGDfK)所含有之胺基與DBCO-NHCO-PEG4-NHS所含有之NHS酯進行反應。將反應液一面於45℃下加熱一面減壓去除溶劑使之濃縮，藉由逆相HPLC(管柱：Waters公司製造之Xbridge Peptide BEH C18，300 Å，4.6×100 mm；溶離液A：0.1 v/v%TFA、溶離液B：0.1 v/v%TFA/乙腈(v/v：10/90))進行純化。將回收之溶液一面於45℃下加熱一面減壓去除溶劑後，添加DMSO將濃度調整成50 mM。
(D)cRGD-PEG5k siRNA AF5 DGL G4之合成 於(B)所獲得之疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G4水溶液30 μL中添加(C)所獲得之cRGD-DBCO之DMSO溶液4.1 μL，於25℃下攪拌20小時，藉此使疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G4所含有之疊氮基與cRGD-DBCO所含有之DBCO基(二苯并環辛炔基)進行反應。繼而，添加PBS 65 μL後，利用NAP-5柱(GE Healthcare公司製造)進行純化。藉由超過濾(區分分子量30kDa)濃縮所回收之溶液，將液體體積調整成95 μL，獲得寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA AF5 DGL G4之溶液。
＜實施例2.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF5標記GE11結合型寡核酸共軛物之製造＞ 於實施例1之(B)所獲得之疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G4水溶液30 μL中添加GE11-DBCO(JEEN DESIGN股份有限公司製造)之50 mM DMSO溶液4.1 μL及DMSO 32.8 μL，於25℃下攪拌20小時，藉此使疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G4所含有之疊氮基與GE11-DBCO所含有之DBCO基進行反應。繼而，添加PBS 130 μL而獲得沈澱，因此對其進行離心沈降，去除上清液。使獲得之沈澱溶解於100 μL之DMSO後，添加400 μL之2-丙醇而獲得沈澱，因此再次對其進行離心沈降，去除上清液。使獲得之沈澱溶解於500 μL之PBS後，利用NAP-5柱(GE Healthcare公司製造)進行純化。藉由超過濾(區分分子量30kDa)濃縮所回收之溶液，將液體體積調整成95 μL，獲得寡核酸共軛物GE11-PEG5k siRNA AF5 DGL G4之溶液。
＜實施例3.中心採用PAMAM G5之TF7標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ (A)疊氮-PEG5k SPDP TF7 PAMAM G5之合成 作為樹狀聚合物，使用Sigma-Aldrich公司製造之表面具有胺基之第五代PAMAM樹枝狀聚合物(PAMAM G5)。於PAMAM G5之5 wt%甲醇溶液3.0 μL中添加PEG12-SPDP之100 mM DMSO溶液1.24 μL、Tide Fluor(商標)7WS琥珀醯亞胺酯(AAT Bioquest公司製造)之10 mM DMSO溶液1.66 μL、及TEA之10 v/v%DMF溶液1.48 μL，於室溫下攪拌5小時。繼而，於該反應液中添加疊氮-PEG5k-NHS之30 mM DMSO溶液12.4 μL、NHS(FUJIFILM Wako Pure Chemical股份有限公司製造)之400 mM DMSO溶液1.03 μL、及1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDC-HCl，Nacalai Tesque股份有限公司製造)之400 mM DMSO溶液1.03 μL，進而於室溫下攪拌18.5小時。繼而，添加甲基-PEG12-NHS之200 mM DMSO溶液2.65 μL，進而於室溫下攪拌6小時。以如上方式使PAMAM G5之胺基與疊氮-PEG5k-NHS、PEG12-SPDP、Tide Fluor 7WS琥珀醯亞胺酯及甲基-PEG12-NHS之NHS基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物疊氮-PEG5k SPDP TF7 PAMAM G5。於反應液中添加純水400 μL並混合後，使用純水藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量10kDa)實施6次純化。於回收之水溶液中添加純水，將液體體積調整成80 μL。
(B)疊氮-PEG5k siRNA TF7 PAMAM G5之合成 於(A)所示之疊氮-PEG5k SPDP TF7 PAMAM G5之水溶液10.0 μL中添加3M之氯化鈉水溶液3.2 μL與siRNA之5.0 mM PBS溶液12.4 μL，於25℃下攪拌15小時，藉此使疊氮-PEG5k SPDP TF7 PAMAM G5所含有之吡啶基二硫基與siRNA所含有之SH基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：PBS)。回收包含結合有siRNA之PAMAM G5之區分部分，藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)進行濃縮，將液體體積調整成100 μL。
(C)cRGD-PEG5k siRNA TF7 PAMAM G5之合成 於(B)所獲得之疊氮-PEG5k siRNA TF7 PAMAM G5水溶液500 μL中添加實施例1之(C)所獲得之cRGD-DBCO之DMSO溶液3.70 μL，於25℃下攪拌16小時，藉此使疊氮-PEG5k siRNA TF7 PAMAM G5所含有之疊氮基與cRGD-DBCO所含有之DBCO基進行反應。繼而，添加PBS將液量調整成100 μL後，利用NAP-5柱進行純化。藉由超過濾(區分分子量30kDa)濃縮所回收之溶液，將液體體積調整成110 μL，獲得寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA TF7 PAMAM G5之溶液。
＜實施例4.中心採用PAMAM G6之TF7標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ (A)疊氮-PEG5k SPDP TF7 PAMAM G6之合成 作為樹狀聚合物，使用Sigma-Aldrich公司製造之表面具有胺基之第六代PAMAM樹枝狀聚合物(PAMAM G6)。於PAMAM G6之5 wt%甲醇溶液5.0 μL中添加PEG12-SPDP之100 mM DMSO溶液1.39 μL、Tide Fluor 7WS琥珀醯亞胺酯之10 mM DMSO溶液2.78 μL、及TEA之10 v/v%DMF溶液2.48 μL，於室溫下攪拌5小時。繼而，於該反應液中添加疊氮-PEG5k-NHS之30 mM DMSO溶液12.4 μL、NHS之400 mM DMSO溶液1.72 μL、及EDC-HCl之400 mM DMSO溶液1.72 μL，進而於室溫下攪拌18.5小時。繼而，添加甲基-PEG12-NHS之200 mM DMSO溶液4.44 μL，進而於室溫下攪拌6小時。以如上方式使PAMAM G6之胺基與疊氮-PEG5k-NHS、PEG12-SPDP、Tide Fluor 7WS琥珀醯亞胺酯及甲基-PEG12-NHS之NHS基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物疊氮-PEG5k SPDP TF7 PAMAM G6。於反應液中添加純水400 μL並混合後，使用純水藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量10kDa)實施6次純化。於回收之水溶液中添加純水，將液體體積調整成80 μL。
(B)疊氮-PEG5k siRNA TF7 PAMAM G6之合成 於(A)所示之疊氮-PEG5k SPDP TF7 PAMAM G6之水溶液9.0 μL中添加3M之氯化鈉水溶液3.1 μL與siRNA之5.0 mM PBS溶液12.5 μL，於25℃下攪拌15小時，藉此使疊氮-PEG5k SPDP TF7 PAMAM G6所含有之吡啶基二硫基與siRNA所含有之SH基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：PBS)。回收包含結合有siRNA之PAMAM G6之區分部分，藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)進行濃縮，將液體體積調整成100 μL。
(C)cRGD-PEG5k siRNA TF7 PAMAM G6之合成 於(B)所獲得之疊氮-PEG5k siRNA TF7 PAMAM G6水溶液500 μL中添加實施例1之(C)所獲得之cRGD-DBCO之DMSO溶液4.51 μL，於25℃下攪拌16小時，藉此使疊氮-PEG5k siRNA TF7 PAMAM G6所含有之疊氮基與cRGD-DBCO所含有之DBCO基進行反應。繼而，添加PBS將液量調整成100 μL後，利用NAP-5柱進行純化。藉由超過濾(區分分子量30kDa)濃縮所回收之溶液，將液體體積調整成110 μL，獲得寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA TF7 PAMAM G6之溶液。
＜實施例5.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之TF7標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ 依據實施例1之cRGD-PEG5k siRNA AF5 DGL G4之合成，合成寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA TF7 DGL G4。其中，使用Tide Fluor 7WS琥珀醯亞胺酯代替Alexa Fluor 546 NHS酯。
＜實施例6.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF5標記cRGD肽結合型寡核酸共軛物2之製造＞ (A)疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G4之合成 依據實施例1之(A)，合成疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G4。
(B)疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G4之合成 於(A)所獲得之疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G4之水溶液20 μL中添加3M之氯化鈉水溶液12 μL與siRNA之6.0 mM PBS溶液76.7 μL，於25℃下攪拌18小時，藉此使疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G4所含有之吡啶基二硫基與siRNA所含有之SH基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR(GE Healthcare公司製造)，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：PBS)。回收包含結合有siRNA之DGL G4之區分部分，藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)進行濃縮，將液體體積調整成200 μL。
(C)cRGD-PEG5k siRNA AF5 DGL G4之合成 於(B)所獲得之疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G4水溶液30 μL中添加實施例1之(C)所獲得之cRGD-DBCO之5 mM DMSO溶液5.8 μL，於25℃下攪拌20小時，藉此使疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G4所含有之疊氮基與cRGD-DBCO所含有之DBCO基進行反應。繼而，添加PBS 65 μL後，利用NAP-5柱(GE Healthcare公司製造)進行純化。藉由超過濾(區分分子量30kDa)濃縮所回收之溶液，將液體體積調整成95 μL，獲得寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA AF5 DGL G4之溶液。
＜實施例7.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF5標記cRGD肽結合型寡核酸共軛物3之製造＞ 依據實施例6之合成，合成與實施例6相同之寡核酸共軛物。其中，添加cRGD-DBCO之5 mM DMSO溶液1.4 μL與DMSO 4.3 μL代替添加cRGD-DBCO之5 mM DMSO溶液5.8 μL。
＜實施例8.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF5標記cRGD肽結合型寡核酸共軛物4之製造＞ 依據實施例6之合成，合成與實施例6相同之寡核酸共軛物。其中，添加cRGD-DBCO之5 mM DMSO溶液1.2 μL與DMSO 4.6 μL代替添加cRGD-DBCO之5 mM DMSO溶液5.8 μL。
＜實施例9.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF5標記cRGD肽結合型寡核酸共軛物5之製造＞ 依據實施例6之合成，合成與實施例6相同之寡核酸共軛物。其中，添加cRGD-DBCO之5 mM DMSO溶液0.9 μL與DMSO 4.9 μL代替添加cRGD-DBCO之5 mM DMSO溶液5.8 μL。
＜實施例10.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF5標記cRGD肽結合型寡核酸共軛物6之製造＞ 依據實施例6之合成，合成與實施例6相同之寡核酸共軛物。其中，添加cRGD-DBCO之5 mM DMSO溶液0.6 μL與DMSO 5.2 μL代替添加cRGD-DBCO之5 mM DMSO溶液5.8 μL。
＜實施例11.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF5標記c(avb6)肽結合型寡核酸共軛物之製造＞ 依據實施例1之合成，合成寡核酸共軛物c(avb6)-PEG5k siRNA AF5 DGL G4。其中，使用由c(avb6)之離胺酸側鏈之胺基與DBCO-NHCO-PEG4-NHS所含有之NHS酯反應獲得之c(avb6)-DBCO(JEEN DESIGN股份有限公司製造)代替cRGD-DBCO。
＜實施例12.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF5標記葉酸結合型寡核酸共軛物之製造＞ 依據實施例1之合成，合成寡核酸共軛物FA-PEG5k siRNA AF5 DGL G4。其中，使用葉酸-PEG2 DBCO(Nanocs公司製造)代替cRGD-DBCO。
＜實施例13.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF6標記茚達曲林結合型寡核酸共軛物之製造＞ (A)疊氮-PEG5k SPDP AF6 DGL G4之合成 於DGL G4之50 mg/mL DMSO溶液18 μL中添加PEG12-SPDP之60 mM DMSO溶液13.8 μL、作為陰離子性螢光色素之Alexa Fluor(註冊商標)647 NHS酯(Thermo Fisher Scientific公司製造)之8 mM DMSO溶液8.9 μL、及TEA之10 v/v%DMSO溶液14.0 μL，於室溫下攪拌11小時。繼而，於該反應液中添加N3-PEG-NHS(Biochempeg公司製造，PEG之數量平均分子量：5000)之1.8 mM DMSO溶液1417.6 μL、EDC-HCl之200 mM DMSO溶液24.8 μL、及NHS之200 mM DMSO溶液24.8 μL，進而於室溫下攪拌13小時。繼而，添加甲基-PEG12-NHS之200 mM DMSO溶液37.8 μL，進而於室溫下攪拌6小時。以如上方式使DGL G4之胺基與N3-PEG-NHS、PEG12-SPDP、Alexa Fluor 647 NHS酯及甲基-PEG12-NHS之NHS基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物疊氮-PEG5k SPDP AF6 DGL G4。於反應液中添加純水700 μL並混合後，使用純水藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)實施6次純化。於回收之水溶液中添加純水，將液體體積調整成420 μL。
(B)疊氮-PEG5k siRNA AF6 DGL G4之合成 於(A)所獲得之疊氮-PEG5k SPDP AF6 DGL G4之水溶液410.0 μL中添加3M之氯化鈉水溶液127.1 μL、siRNA之5.0 mM PBS溶液465.0 μL、及DMSO 111.3 μL，於25℃下攪拌13小時，藉此使疊氮-PEG5k SPDP AF6 DGL G4所含有之吡啶基二硫基與siRNA所含有之SH基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：PBS)。回收包含結合有siRNA之DGL G4之區分部分，藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)進行濃縮，將液體體積調整成700 μL。
(C)IND-DBCO之合成 於鹽酸茚達曲林(Sigma-Aldrich公司製造)之800 mM DMSO溶液15.5 μL中添加DBCO-NHCO-PEG4-NHS之300 mM DMSO溶液16.5 μL、TEA 3.62 μL、及乙腈20 μL，於25℃下攪拌18小時，藉此使茚達曲林所含有之胺基與DBCO-NHCO-PEG4-NHS所含有之NHS酯進行反應。使用Sephadex(註冊商標)LH-20(Cytiva公司製造)，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：乙醇/乙腈(v/v：50/50))。回收包含作為目標物之IND-DBCO之區分部分，一面於45℃下加熱一面減壓去除溶劑後，添加DMSO將濃度調整成20 mM。
(D)IND-PEG5k siRNA AF6 DGL G4之合成 將(B)所獲得之疊氮-PEG5k siRNA AF6 DGL G4之PBS溶液370 μL、(C)所獲得之IND-DBCO之20 mM DMSO溶液42.7 μL、及DMSO 49.8 μL進行混合，於25℃下攪拌22小時，藉此使疊氮-PEG5k siRNA AF6 DGL G4所含有之疊氮基與IND-DBCO所含有之DBCO基進行反應。繼而，利用NAP-10 Columns(GE Healthcare公司製造)對反應液進行純化。藉由超過濾(區分分子量10kDa)濃縮所回收之溶液，將液體體積調整成95 μL，獲得寡核酸共軛物IND-PEG5k siRNA AF6 DGL G4之溶液。
＜實施例14.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF6標記適體結合型寡核酸共軛物1之製造＞ (A)疊氮-PEG5k SPDP AF6 DGL G4之合成 於DGL G4之50 mg/mL DMSO溶液8 μL中添加PEG12-SPDP之60 mM DMSO溶液6.1 μL、Alexa Fluor 647 NHS酯之8 mM DMSO溶液3.8 μL、及TEA之10 v/v%DMSO溶液6.5 μL，於室溫下攪拌7小時。繼而，於該反應液中添加N3-PEG-NHS(Biochempeg公司製造，PEG之數量平均分子量：5000)之1.8 mM DMSO溶液700.1 μL、EDC-HCl之200 mM DMSO溶液12.3 μL、及NHS之200 mM DMSO溶液12.3 μL，進而於室溫下攪拌16小時。繼而，添加甲基-PEG12-NHS之200 mM DMSO溶液16.8 μL，進而於室溫下攪拌6小時。以如上方式使DGL G4之胺基與N3-PEG-NHS、PEG12-SPDP、Alexa Fluor 647 NHS酯及甲基-PEG12-NHS之NHS基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物疊氮-PEG5k SPDP AF6 DGL G4。於反應液中添加純水700 μL並混合後，使用純水藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)實施6次純化。於回收之水溶液中添加純水，將液體體積調整成190 μL。
(B)疊氮-PEG5k siRNA AF6 DGL G4之合成 於(A)所獲得之疊氮-PEG5k SPDP AF6 DGL G4之水溶液120 μL中添加3M之氯化鈉水溶液33.9 μL、siRNA之6.0 mM PBS溶液108.3 μL、及DMSO 29.4 μL，於25℃下攪拌14小時，藉此使疊氮-PEG5k SPDP AF6 DGL G4所含有之吡啶基二硫基與siRNA所含有之SH基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：PBS)。回收包含結合有siRNA之DGL G4之區分部分，藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)進行濃縮，將液體體積調整成800 μL。
(C)NU1-PEG5k siRNA AF6 DGL G4之合成 使DBCO-NHCO-PEG4-NHS經由胺基-C6連接子與包含序列編號1表示之鹼基序列之適體AS1411之3'末端反應，而獲得NU1-DBCO(JEEN DESIGN股份有限公司製造)。將NU1-DBCO之2.3 mM PBS溶液22.7 μL、(B)所獲得之疊氮-PEG5k siRNA AF6 DGL G4之PBS溶液95 μL、及DMSO 14.1 μL進行混合，於25℃下攪拌15小時，藉此使疊氮-PEG5k siRNA AF6 DGL G4所含有之疊氮基與NU1-DBCO所含有之DBCO基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：PBS)。回收包含目標物之區分部分，藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)進行濃縮。進而，使用2根串聯之Superose 6 Increase(Cytiva公司製造，溶離液：PBS)，藉由凝膠過濾進行純化。回收包含目標物之區分部分，藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)進行濃縮。將液體體積調整成194 μL，獲得寡核酸共軛物NU1-PEG5k siRNA AF6 DGL G4之溶液。
＜實施例15.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF6標記適體結合型寡核酸共軛物2之製造＞ 依據實施例14之合成，合成NU2-PEG5k siRNA AF6 DGL G4。其中，使用使DBCO-NHCO-PEG4-NHS經由胺基-C6連接子與包含序列編號2表示之鹼基序列之適體FAN-1524dI之3'末端反應獲得之NU2-DBCO(JEEN DESIGN股份有限公司製造)代替NU1-DBCO。
＜實施例16.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF6標記適體結合型寡核酸共軛物3之製造＞ 依據實施例14之合成，合成EP1-PEG5k siRNA AF6 DGL G4。其中，使用使DBCO-NHCO-PEG4-NHS經由胺基-C6連接子與包含序列編號3表示之鹼基序列之適體之3'末端反應獲得之EP1-DBCO(JEEN DESIGN股份有限公司製造)代替NU1-DBCO。
＜實施例17.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF6標記適體結合型寡核酸共軛物4之製造＞ 依據實施例14之合成，合成EP2-PEG5k siRNA AF6 DGL G4。其中，使用使DBCO-NHCO-PEG4-NHS經由胺基-C6連接子與包含序列編號4表示之鹼基序列之適體之5'末端反應獲得之EP2-DBCO(JEEN DESIGN股份有限公司製造)代替NU1-DBCO。
＜實施例18.中心採用第三代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF5標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ (A)疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G3之合成 作為樹狀聚合物，使用COLCOM公司製造之表面具有胺基之第三代聚離胺酸樹枝狀接枝物(DGL G3)。於DGL G3之50 mg/mL DMSO溶液10 μL中添加PEG12-SPDP之300 mM DMSO溶液1.5 μL、Alexa Fluor 546 NHS酯之10 mM DMSO溶液3.8 μL、及TEA之20 v/v%DMF溶液1.0 μL，於室溫下攪拌7小時。繼而，於該反應液中添加疊氮-PEG5k-NHS(Nanocs公司製造，PEG之數量平均分子量：5000)之30 mM DMSO溶液45.9 μL、EDC-HCl之400 mM DMSO溶液6.9 μL、及NHS之400 mM DMSO溶液6.9 μL，進而於室溫下攪拌16小時。繼而，添加甲基-PEG12-NHS之200 mM DMSO溶液4.7 μL，進而於室溫下攪拌8小時。以如上方式使DGL G3之胺基與疊氮-PEG5k-NHS、PEG12-SPDP、Alexa Fluor 546 NHS酯及甲基-PEG12-NHS之NHS基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G3。於反應液中添加純水700 μL並混合後，使用純水藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量10kDa)實施6次純化。於回收之水溶液中添加純水，將液體體積調整成100 μL。
(B)疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G3之合成 於(A)所獲得之疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G3之水溶液4.0 μL中添加3M之氯化鈉水溶液2.4 μL與siRNA之5.0 mM PBS溶液14.8 μL，於25℃下攪拌18小時，藉此使疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G3所含有之吡啶基二硫基與siRNA所含有之SH基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：PBS)。回收包含結合有siRNA之DGL G3之區分部分，藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)進行濃縮，將液體體積調整成100 μL。
(C)cRGD-PEG5k siRNA AF5 DGL G3之合成 於(B)所獲得之疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G3之PBS溶液40 μL中添加實施例1之(C)所獲得之cRGD-DBCO之5 mM DMSO溶液3.1 μL，於25℃下攪拌18小時，藉此使疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G3所含有之疊氮基與cRGD-DBCO所含有之DBCO基進行反應。繼而，添加PBS將液量調整成100 μL後，利用NAP-5柱進行純化。藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)濃縮所回收之溶液，將液體體積調整成110 μL，獲得寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA AF5 DGL G3之溶液。
＜實施例19.中心採用第五代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF5標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ (A)疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G5之合成 作為樹狀聚合物，使用COLCOM公司製造之表面具有胺基之第五代聚離胺酸樹枝狀接枝物(DGL G5)。於DGL G5之50 mg/mL DMSO溶液3.0 μL中添加PEG12-SPDP之300 mM DMSO溶液0.46 μL、Alexa Fluor 546 NHS酯之10 mM DMSO溶液1.1 μL、及TEA之20 v/v%DMF溶液2.3 μL，於室溫下攪拌7小時。繼而，於該反應液中添加疊氮-PEG5k-NHS(Nanocs公司製造，PEG之數量平均分子量：5000)之30 mM DMSO溶液13.8 μL、EDC-HCl之400 mM DMSO溶液2.1 μL、及NHS之400 mM DMSO溶液2.1 μL，進而於室溫下攪拌16小時。繼而，添加甲基-PEG12-NHS之200 mM DMSO溶液11.1 μL，進而於室溫下攪拌8小時。以如上方式使DGL G5之胺基與疊氮-PEG5k-NHS、PEG12-SPDP、Alexa Fluor 546 NHS酯及甲基-PEG12-NHS之NHS基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G5。於反應液中添加純水700 μL並混合後，使用純水藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量10kDa)實施6次純化。於回收之水溶液中添加純水，將液體體積調整成100 μL。
(B)疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G5之合成 於(A)所獲得之疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G5之水溶液13.0 μL中添加3M之氯化鈉水溶液4.0 μL與siRNA之5.0 mM PBS溶液14.8 μL，於25℃下攪拌18小時，藉此使疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G5所含有之吡啶基二硫基與siRNA所含有之SH基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：PBS)。回收包含結合有siRNA之DGL G5之區分部分，藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)進行濃縮，將液體體積調整成100 μL。
(C)cRGD-PEG5k siRNA AF5 DGL G5之合成 於(B)所獲得之疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G5之PBS溶液40 μL中添加實施例1之(C)所獲得之cRGD-DBCO之5 mM DMSO溶液3.0 μL，於25℃下攪拌18小時，藉此使疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G5所含有之疊氮基與cRGD-DBCO所含有之DBCO基進行反應。繼而，添加PBS將液量調整成100 μL後，利用NAP-5柱進行純化。藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)濃縮所回收之溶液，將液體體積調整成110 μL，獲得寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA AF5 DGL G5之溶液。
＜實施例20.中心採用第六代Bis-MPA樹枝狀聚合物之AF6標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ (A)PFD-G6-TMP-NH2之合成 使PFD-G6-TMP-NHBoc(Polymer Factory公司製造)5.25 mg溶解於200 μL之TFA，於室溫下攪拌3小時。繼而，於該反應液中添加二乙醚，使析出之固體離心沈降。去除上清液，使用二乙醚將固體清洗3次。去除上清液後，添加DMSO 300 μL使固體溶解。
(B)疊氮-PEG5k SPDP AF6 MPA G6之合成 於(A)所獲得之PFD-G6-TMP-NH2之DMSO溶液20 μL中添加PEG12-SPDP之60 mM DMSO溶液6.4 μL、Alexa Fluor 647 NHS酯之8 mM DMSO溶液3.4 μL、N3-PEG-NHS(Biochempeg公司製造，PEG之數量平均分子量：5000)之2.5 mM DMSO溶液384.0 μL、EDC-HCl之200 mM DMSO溶液9.6 μL、NHS之200 mM DMSO溶液9.6 μL、甲基-PEG12-NHS之200 mM DMSO溶液6.1 μL、及TEA之10 v/v%DMSO溶液6.1 μL，於室溫下攪拌12小時。以如上方式使PFD-G6-TMP-NH2之胺基與N3-PEG-NHS、PEG12-SPDP、Alexa Fluor 647 NHS酯及甲基-PEG12-NHS之NHS基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物疊氮-PEG5k SPDP AF6 MPA G6。於反應液中添加純水700 μL並混合後，使用純水藉由超過濾(Sartorius公司製造，Vivaspin，區分分子量50kDa)實施6次純化。於回收之水溶液中添加純水，將液體體積調整成310 μL。
(C)疊氮-PEG5k siRNA AF6 MPA G6之合成 於(B)所獲得之疊氮-PEG5k SPDP AF6 MPA G6之水溶液6.0 μL中添加3M之氯化鈉水溶液1.9 μL、siRNA之6.0 mM PBS溶液7.4 μL、及DMSO 3.8 μL，於25℃下攪拌16小時，藉此使疊氮-PEG5k SPDP AF6 MPA G6所含有之吡啶基二硫基與siRNA所含有之SH基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：PBS)。回收包含結合有siRNA之MPA G6之區分部分，藉由超過濾(Sartorius公司製造，Vivaspin，區分分子量50kDa)進行濃縮，將液體體積調整成80 μL。
(D)cRGD-PEG5k siRNA AF6 MPA G6之合成 於(C)所獲得之疊氮-PEG5k siRNA AF6 MPA G6之PBS溶液50 μL中添加實施例1之(C)所獲得之cRGD-DBCO之10 mM DMSO溶液1.5 μL、及DMSO 4.1 μL，於25℃下攪拌16小時，藉此使疊氮-PEG5k siRNA AF6 MPA G6所含有之疊氮基與cRGD-DBCO所含有之DBCO基進行反應。利用Zeba(註冊商標)脫鹽離心柱(Thermo Fisher Scientific公司製造，區分分子量：40kDa)對反應液進行純化。繼而，使用PBS藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量50kDa)實施3次純化，將液體體積調整成70 μL，獲得寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA AF6 MPA G6之溶液。
＜實施例21.寡核酸修飾數較少、中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF6標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ (A)疊氮-PEG5k SPDP-C3 AF6 DGL G4之合成 依據實施例14之(A)，合成疊氮-PEG5k SPDP-C3 AF6 DGL G4。其中，使用3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(東京化成工業公司製造)代替SPDP-PEG12。
(B)疊氮-PEG5k siRNA-C3 AF6 DGL G4之合成 於(A)所獲得之疊氮-PEG5k SPDP-C3 AF6 DGL G4水溶液10.0 μL中添加siRNA之6.5 mM PBS溶液0.79 μL、3M NaCl水溶液1.9 μL、及DMSO 1.4 μL，於室溫下攪拌13小時，藉此使疊氮-PEG5k SPDP-C3 AF6 DGL G4所含有之吡啶基二硫基與siRNA所含有之SH基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：PBS)。回收包含結合有siRNA之DGL G4之區分部分，藉由超過濾(Sartorius公司製造，Vivaspin，區分分子量30kDa)進行濃縮，將液體體積調整成95 μL。
(C)cRGD-PEG5k siRNA-C3 AF6 DGL G4之合成 於(B)所獲得之疊氮-PEG5k siRNA-C3 AF6 DGL G4之PBS溶液60 μL中添加實施例1之(C)所獲得之cRGD-DBCO之5 mM DMSO溶液4.1 μL、及DMSO 2.6 μL，於25℃下攪拌14小時，藉此使疊氮-PEG5k siRNA-C3 AF6 DGL G4所含有之疊氮基與cRGD-DBCO所含有之DBCO基進行反應。利用Zeba(註冊商標)脫鹽離心柱對反應液進行純化。繼而，使用PBS藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量50kDa)實施3次純化，將液體體積調整成70 μL，獲得寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA-C3 AF6 DGL G4之溶液。
＜實施例22.使用反義核酸、中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之AF6標記c(avb6)結合型寡核酸共軛物之製造＞ (A)疊氮-PEG5k ASO AF6 DGL G4之合成 依據實施例14之(B)，合成疊氮-PEG5k ASO AF6 DGL G4。其中，使用表2表示之Malat1-ASO代替siRNA。
(B)c(avb6)-PEG5k ASO AF6 DGL G4之合成 於(A)所獲得之疊氮-PEG5k ASO AF6 DGL G4之PBS溶液60 μL中添加c(avb6)-DBCO之1 mM DMSO溶液1.6 μL、及DMSO 5.1 μL，於25℃下攪拌15小時，藉此使疊氮-PEG5k ASO AF6 DGL G4所含有之疊氮基與c(avb6)-DBCO所含有之DBCO基進行反應。利用Zeba(註冊商標)脫鹽離心柱對反應液進行純化。繼而，使用PBS藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量50kDa)實施3次純化，將液體體積調整成100 μL，獲得寡核酸共軛物c(avb6)-PEG5k ASO AF6 DGL G4之溶液。
＜實施例23.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物、修飾有PEG2k之AF5標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ (A)疊氮-PEG2k SPDP AF5 DGL G4之合成 於DGL G4之50 mg/mL DMSO溶液2.0 μL中添加PEG12-SPDP之100 mM DMSO溶液0.9 μL、Alexa Fluor 546 NHS酯之5 mM DMSO溶液1.5 μL、及TEA之10 v/v%DMF溶液2.5 μL，於室溫下攪拌6小時。繼而，於該反應液中添加疊氮-PEG2k-NHS(Nanocs公司製造，PEG之數量平均分子量：2000)之100 mM DMSO溶液6.1 μL、EDC-HCl之400 mM DMSO溶液3.1 μL、及NHS之400 mM DMSO溶液3.1 μL，進而於室溫下攪拌14小時。繼而，添加甲基-PEG12-NHS之200 mM DMSO溶液2.8 μL，進而於室溫下攪拌6小時。以如上方式使DGL G4之胺基與疊氮-PEG2k-NHS、PEG12-SPDP、Alexa Fluor 546 NHS酯及甲基-PEG12-NHS之NHS基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物疊氮-PEG2k SPDP AF5 DGL G4。於反應液中添加純水700 μL並混合後，使用純水藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)實施6次純化。於回收之水溶液中添加純水，將液體體積調整成230 μL。
(B)疊氮-PEG2k siRNA AF5 DGL G4之合成 於(A)所獲得之疊氮-PEG2k SPDP AF5 DGL G4之水溶液50 μL中添加3M之氯化鈉水溶液7.3 μL與siRNA之5.0 mM PBS溶液12.0 μL，於25℃下攪拌18小時，藉此使疊氮-PEG2k SPDP AF5 DGL G4所含有之吡啶基二硫基與siRNA所含有之SH基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：PBS)。回收包含結合有siRNA之DGL G4之區分部分，藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)進行濃縮，將液體體積調整成185 μL。
(C)cRGD-PEG2k siRNA AF5 DGL G4之合成 於(B)所獲得之疊氮-PEG2k siRNA AF5 DGL G4之PBS溶液90 μL中添加實施例1之(C)所獲得之cRGD-DBCO之5.0 mM DMSO溶液4.0 μL、及DMSO 6.0 μL，於25℃下攪拌18小時，藉此使疊氮-PEG2k siRNA AF5 DGL G4所含有之疊氮基與cRGD-DBCO所含有之DBCO基進行反應。繼而，利用NAP-5柱對反應液進行純化。藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)濃縮所回收之溶液，將液體體積調整成110 μL，獲得寡核酸共軛物cRGD-PEG2k siRNA AF5 DGL G4之溶液。
＜實施例24.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物、修飾有PEG3.4k之AF5標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ 依據實施例23之合成，合成寡核酸共軛物cRGD-PEG3.4k siRNA AF5 DGL G4。其中，使用疊氮-PEG3.4k-NHS(Nanocs公司製造，PEG之數量平均分子量：3400)代替疊氮-PEG2k-NHS。
＜實施例25.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物、修飾有PEG5k之AF5標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ (A)疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G4之合成 於DGL G4之50 mg/mL DMSO溶液2 μL中添加PEG12-SPDP之30 mM DMSO溶液3.1 μL、Alexa Fluor 546 NHS酯之4mM DMSO溶液1.5 μL、及TEA之10 v/v%DMSO溶液1.6 μL，於室溫下攪拌8小時。繼而，於該反應液中添加N3-PEG-NHS(Biochempeg公司製造，PEG之數量平均分子量：5000)之1.0 mM DMSO溶液306.3 μL、EDC-HCl之200 mM DMSO溶液3.1 μL、及NHS之200 mM DMSO溶液3.1 μL，進而於室溫下攪拌15小時。繼而，添加甲基-PEG12-NHS之200 mM DMSO溶液4.2 μL，進而於室溫下攪拌8小時。以如上方式使DGL G4之胺基與N3-PEG-NHS、PEG12-SPDP、Alexa Fluor 546 NHS酯及甲基-PEG12-NHS之NHS基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G4。於反應液中添加純水700 μL並混合後，使用純水藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)實施6次純化。於回收之水溶液中添加純水，將液體體積調整成50 μL。
(B)疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G4之合成 於(A)所獲得之疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G4之水溶液18.0 μL中添加3M之氯化鈉水溶液4.1 μL與siRNA之6.0 mM PBS溶液7.9 μL，於25℃下攪拌14小時，藉此使疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G4所含有之吡啶基二硫基與siRNA所含有之SH基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：PBS)。回收包含結合有siRNA之DGL G4之區分部分，藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)進行濃縮，將液體體積調整成100 μL。
(C)cRGD-PEG5k siRNA AF5 DGL G4之合成 於(B)所獲得之疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G4之PBS溶液70 μL中添加實施例1之(C)所獲得之cRGD-DBCO之2.0 mM DMSO溶液6.9 μL、及DMSO 0.9 μL，於25℃下攪拌14小時，藉此使疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G4所含有之疊氮基與cRGD-DBCO所含有之DBCO基進行反應。繼而，利用NAP-5柱對反應液進行純化。藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)濃縮所回收之溶液。將液體體積調整成70 μL，利用過濾器進行過濾(Merck公司製造之Ultrafree-MC或-GV，0.22 μm)，藉此獲得寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA AF5 DGL G4之溶液。
＜實施例26.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物、修飾有PEG10k之AF5標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ 依據實施例25之合成，合成寡核酸共軛物cRGD-PEG10k siRNA AF5 DGL G4。其中，添加N3-PEG-NHS(Biochempeg公司製造，PEG之數量平均分子量：10000)之0.2mM DMSO溶液1531 μL代替添加N3-PEG-NHS(Biochempeg公司製造，PEG之數量平均分子量：5000)之1.0 mM DMSO溶液306.3 μL。
＜實施例27.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物、修飾有pMeOx10k之TF7標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ (A)疊氮-pMeOx10k SPDP TF7 DGL G4之合成 於DGL G4之50 mg/mL DMSO溶液4.0 μL中添加PEG12-SPDP之150 mM DMSO溶液1.2 μL、Tide Fluor7WS琥珀醯亞胺酯之10 mM DMSO溶液1.5 μL、及TEA之25 v/v%DMF溶液1.3 μL，於室溫下攪拌4小時。繼而，於該反應液中添加藉由將聚(2-甲基-2-㗁唑啉)(羧基引發、疊氮終止)(Ultroxa公司製造，pMeOx之數量平均分子量：10000)之8 mM DMSO溶液76.6 μL、EDC-HCl之500 mM DMSO溶液4.9 μL及NHS之500 mM DMSO溶液4.9 μL於室溫下攪拌0.5小時獲得之混合液，進而攪拌18小時。繼而，添加甲基-PEG12-NHS之200 mM DMSO溶液5.6 μL，進而於室溫下攪拌6小時。以如上方式使DGL G4之胺基與聚(2-甲基-2-㗁唑啉)(羧基引發、疊氮終止)之COOH基、以及PEG12-SPDP、Tide Fluor7WS及甲基-PEG12-NHS之NHS基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物疊氮-pMeOx10k SPDP TF7 DGL G4。於反應液中添加純水700 μL並混合後，使用純水藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)實施6次純化。於回收之水溶液中添加純水，將液體體積調整成230 μL。
(B)疊氮-pMeOx10k siRNA TF7 DGL G4之合成 於(A)所獲得之疊氮-pMeOx10k SPDP TF7 DGL G4之水溶液8.0 μL中添加3M之氯化鈉水溶液2.9 μL與siRNA之5.0 mM PBS溶液13.1 μL，於25℃下攪拌14小時，藉此使疊氮-pMeOx10k SPDP TF7 DGL G4所含有之吡啶基二硫基與siRNA所含有之SH基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：PBS)。回收包含結合有siRNA之DGL G4之區分部分，藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)進行濃縮，將液體體積調整成100 μL。
(C)cRGD-pMeOx10k siRNA TF7 DGL G4之合成 於(B)所獲得之疊氮-pMeOx10k siRNA TF7 DGL G4之PBS溶液40 μL中添加實施例1之(C)所獲得之cRGD-DBCO之10.0 mM DMSO溶液1.6 μL，於25℃下攪拌19小時，藉此使疊氮-pMeOx10k siRNA TF7 DGL G4所含有之疊氮基與cRGD-DBCO所含有之DBCO基進行反應。繼而，利用NAP-5柱對反應液進行純化。藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)濃縮所回收之溶液，將液體體積調整成110 μL，獲得寡核酸共軛物cRGD-pMeOx10k siRNA TF7 DGL G4之溶液。
＜實施例28.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物、修飾有pSar10k之AF5標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ (A)疊氮-pSar10k SPDP AF5 DGL G4之合成 於DGL G4之50 mg/mL DMSO溶液4.0 μL中添加PEG12-SPDP之150 mM DMSO溶液1.2 μL、Alexa Fluor 546 NHS酯之15 mM DMSO溶液1.0 μL、及TEA之20 v/v%DMF溶液1.6 μL，於室溫下攪拌8小時。繼而，於該反應液中添加藉由將N3-pSar(150)-COOH(Iris Biotech公司製造，pSar之數量平均分子量：11400)之10 mM DMSO溶液61.3 μL、EDC-HCl之500 mM DMSO溶液2.5 μL及NHS之500 mM DMSO溶液2.5 μL於室溫下攪拌0.5小時獲得之混合液，進而攪拌19小時。繼而，添加甲基-PEG12-NHS之200 mM DMSO溶液5.6 μL，進而於室溫下攪拌9小時。以如上方式使DGL G4之胺基與N3-pSar(150)-COOH之COOH基、以及PEG12-SPDP、Alexa Fluor 546 NHS酯及甲基-PEG12-NHS之NHS基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物疊氮-pSar10k SPDP AF5 DGL G4。於反應液中添加純水700 μL並混合後，使用純水藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)實施6次純化。於回收之水溶液中添加純水，將液體體積調整成90 μL。
(B)疊氮-pSar10k siRNA AF5 DGL G4之合成 於(A)所獲得之疊氮-pSar10k SPDP AF5 DGL G4之水溶液12.0 μL中添加3M之氯化鈉水溶液4.4 μL與siRNA之5.0 mM PBS溶液19.7 μL，於25℃下攪拌18小時，藉此使疊氮-pSar10k SPDP AF5 DGL G4所含有之吡啶基二硫基與siRNA所含有之SH基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：PBS)。回收包含結合有siRNA之DGL G4之區分部分，藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)進行濃縮，將液體體積調整成100 μL。
(C)cRGD-pSar10k siRNA AF5 DGL G4之合成 於(B)所獲得之疊氮-pSar10k siRNA AF5 DGL G4之PBS溶液40 μL中添加實施例1之(C)所獲得之cRGD-DBCO之10.0 mM DMSO溶液1.6 μL，於25℃下攪拌19小時，藉此使疊氮-pSar10k siRNA AF5 DGL G4所含有之疊氮基與cRGD-DBCO所含有之DBCO基進行反應。繼而，利用NAP-5柱對反應液進行純化。藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)濃縮所回收之溶液，將液體體積調整成110 μL，獲得寡核酸共軛物cRGD-pSar10k siRNA AF5 DGL G4之溶液。
＜實施例29.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物、經由雙硫鍵修飾有PEG5k之AF5標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ (A)SPDP AF5 DGL G4之合成 於DGL G4之50 mg/mL DMSO溶液3 μL中添加PEG12-SPDP之100 mM DMSO溶液2.8 μL、Alexa Fluor 546 NHS酯之5 mM DMSO溶液2.3 μL、及TEA之10 v/v%DMF溶液1.8 μL，於室溫下攪拌19小時。繼而，添加甲基-PEG12-NHS之200 mM DMSO溶液4.2 μL，進而於室溫下攪拌6小時。以如上方式使DGL G4之胺基與PEG12-SPDP、Alexa Fluor 546 NHS酯及甲基-PEG12-NHS之NHS基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物SPDP AF5 DGL G4。於反應液中添加純水700 μL並混合後，使用純水藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)實施6次純化。於回收之水溶液中添加乙醇，調整成100 μL之40v/v%乙醇/水溶液。
(B)疊氮-PEG5k-SS siRNA AF5 DGL G4之合成 於(A)所獲得之SPDP AF5 DGL G4之溶液8.0 μL中添加siRNA之5.0 mM PBS溶液10.6 μL與3M之氯化鈉水溶液8.7 μL，於25℃下攪拌8小時。繼而，於該反應液中添加疊氮-PEG5k-硫醇(Nanocs公司製造，PEG之數量平均分子量：5000)之25 mM 30 v/v%DMSO/水溶液79.4 μL，進而攪拌15小時。以如上方式使SPDP AF5 DGL G4所含有之吡啶基二硫基與siRNA及疊氮-PEG5k-硫醇所含之SH基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：PBS)。回收包含結合有siRNA之DGL G4之區分部分，藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)進行濃縮。使用TSKgel(註冊商標)G2000swxl(Tosoh公司製造)，藉由凝膠過濾對獲得之溶液進行純化。藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)濃縮所回收之溶液，將液體體積調整成120 μL。
(C)cRGD-PEG5k-SS siRNA AF5 DGL G4之合成 於(B)所獲得之疊氮-PEG5k-SS siRNA AF5 DGL G4之PBS溶液80 μL中混合實施例1之(C)所獲得之cRGD-DBCO之5 mM DMSO溶液7.4 μL、及DMSO 1.5 μL，於25℃下攪拌19小時，藉此使疊氮-PEG5k-SS siRNA AF5 DGL G4所含有之疊氮基與cRGD-DBCO所含有之DBCO基進行反應。繼而，添加PBS將液量調整成100 μL後，利用NAP-5柱進行純化。藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)濃縮所回收之溶液，將液體體積調整成110 μL，獲得寡核酸共軛物cRGD-PEG5k-SS siRNA AF5 DGL G4之溶液。
＜實施例30.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物、修飾有EK肽之AF6標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ (A)疊氮-PEG500 SPDP AF6 DGL G4之合成 於DGL G4之50 mg/mL DMSO溶液5 μL中添加PEG12-SPDP之150 mM DMSO溶液1.5 μL、Alexa Fluor 647 NHS酯之10 mM DMSO溶液1.5 μL、疊氮-PEG12-NHS之100 mM DMSO溶液3.8 μL、及TEA之10 v/v%DMF溶液2.3 μL，於室溫下攪拌9小時。繼而，添加甲基-PEG12-NHS之200 mM DMSO溶液4.2 μL，進而於室溫下攪拌15小時。以如上方式使DGL G4之胺基與PEG12-SPDP、Alexa Fluor 647 NHS酯、疊氮-PEG12-NHS及甲基-PEG12-NHS之NHS基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物疊氮-PEG500 SPDP AF6 DGL G4。於反應液中添加純水700 μL並混合後，使用純水藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)實施6次純化。於回收之水溶液中添加純水，調整成100 μL之40v/v%乙醇/水溶液。
(B)疊氮-PEG500 siRNA AF6 DGL G4之合成 於(A)所獲得之疊氮-PEG500 SPDP AF6 DGL G4之溶液7.0 μL中添加siRNA之5.0 mM PBS溶液16.1 μL、3M之氯化鈉水溶液2.7 μL、及DMSO 5.2 μL，於25℃下攪拌17小時。以如上方式使疊氮-PEG500 SPDP AF6 DGL G4所含有之吡啶基二硫基與siRNA所含有之SH基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR，藉由凝膠過濾對該反應液進行純化(溶離液：PBS)。回收包含結合有siRNA之DGL G4之區分部分，藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)進行濃縮，將液體體積調整成80 μL。
(C)cRGD-EK-順丁烯二醯亞胺之合成 於下式(XIII)表示之肽cRGD-EK-SH(JEEN DESIGN股份有限公司製造)之20 mM PBS溶液50.0 μL中添加DBCO-順丁烯二醯亞胺(東京化成工業公司製造)之300 mM 50v/v%DMSO/DMF溶液6.7 μL、及DMF 20.0 μL，於4℃下攪拌15小時，藉此使cRGD-EK-SH所含有之SH基與DBCO-順丁烯二醯亞胺所含有之順丁烯二醯亞胺基進行反應。將該反應液一面於45℃下加熱一面減壓去除溶劑。添加DMF 10 μL使試樣溶解，進而添加純水400 μL，利用過濾器進行過濾(Merck公司製造之Ultrafree-MC或-GV，0.22 μm)，一面於45℃下加熱一面減壓去除溶劑。利用30 μL之DMSO溶解所獲得之固體。 [化5]
Figure 02_image009
(D)cRGD-EK siRNA AF6 DGL G4之合成 於(B)所獲得之疊氮-PEG500 siRNA AF6 DGL G4之PBS溶液20 μL中混合(C)所獲得之cRGD-EK-DBCO之DMSO溶液4.8 μL、及1M氯化鎂水溶液(NIPPON GENE公司製造)20 μL，於25℃下攪拌18小時，藉此使疊氮-PEG500 siRNA AF6 DGL G4所含有之疊氮基與cRGD-EK-DBCO所含有之DBCO基進行反應。使析出之固體離心沈降後，去除上清液，添加PBS 100 μL，利用NAP-5柱進行純化。藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)濃縮所回收之溶液，將液體體積調整成110 μL，獲得寡核酸共軛物cRGD-EK siRNA AF6 DGL G4之溶液。
＜實施例31.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物、修飾有mPEG4之AF5標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ 依據實施例1之合成，合成寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA AF5 mPEG4 DGL G4。其中，使用m-dPEG(註冊商標)4-NHS酯(Quanta Biodesig公司製造)代替甲基-PEG12-NHS。
＜實施例32.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物、修飾有乙醇酸之AF5標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ 依據實施例1之合成，合成寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA AF5 GA DGL G4。其中，使用乙醇酸(Sigma-Aldrich公司製造)代替甲基-PEG12-NHS，且於添加乙醇酸之同時，添加EDC-HCl之400 mM DMSO溶液9.3 μL及NHS之400 mM DMSO溶液9.3 μL。
＜實施例33.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物、修飾有磺基甜菜鹼之AF5標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ 依據實施例1之合成，合成寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA AF5 sbeta DGL G4。其中，添加3-[[2-(甲基丙烯醯氧基)乙基]二甲基銨]丙烷-1-磺酸鹽(Sigma-Aldrich公司製造)於60℃下攪拌代替添加甲基-PEG12-NHS於25℃下攪拌。
＜實施例34.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物、導入有二甲胺之AF5標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ 依據實施例32之合成，合成寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA AF5 tN DGL G4。其中，使用二甲胺基丙酸鹽酸鹽(東京化成工業公司製造)代替乙醇酸。
＜實施例35.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物、導入有丁基之AF5標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ 依據實施例32之合成，合成寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA AF5 nBu DGL G4。其中，使用正戊酸(關東化學公司製造)代替乙醇酸。
＜實施例36.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物、導入有異丁基之AF5標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ 依據實施例32之合成，合成寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA AF5 iBu DGL G4。其中，使用異戊酸(東京化成工業公司製造)代替乙醇酸。
＜實施例37.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物、導入有嗎啉基之AF5標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ 依據實施例32之合成，合成寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA AF5 MP DGL G4。其中，使用3-嗎啉-4-基-丙酸(Santa Cruz Biotechnology公司製造)代替乙醇酸。
＜實施例38.中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物、導入有硫代嗎啉基之AF5標記cRGD結合型寡核酸共軛物之製造＞ 依據實施例32之合成，合成寡核酸共軛物cRGD-PEG5k siRNA AF5 TP DGL G4。其中，使用4-硫代嗎啉基乙酸鹽酸鹽(Fluorochem公司製造)代替乙醇酸。
＜比較例1.非細胞識別型寡核酸共軛物之製造＞ (A)mPEG5k SPDP AF5 DGL G4之合成 於DGL G4之50 mg/mL DMSO溶液10 μL中添加PEG12-SPDP之300 mM DMSO溶液1.53 μL、TEA之50 v/v%DMF溶液1.17 μL、Alexa Fluor 546 NHS酯之30 mM DMSO溶液1.28 μL，於室溫下攪拌4.5小時。繼而，於該反應液中添加mPEG5k-NHS(Iris Biotech公司製造，PEG之數量平均分子量：5000，批號：1217558)之20 mM DMSO溶液68.9 μL，進而於室溫下攪拌18小時。繼而，添加甲基-PEG12-NHS酯之200 mM DMSO溶液15.3 μL，進而於室溫下攪拌6小時。以如上方式使DGL G4之胺基與mPEG5k-NHS、PEG12-SPDP、Alexa Fluor 546 NHS酯及甲基-PEG12-NHS之NHS基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物mPEG5k SPDP AF5 DGL G4。於反應液中添加純水400 μL並混合後，使用純水藉由超過濾(區分分子量10kDa)實施6次純化。於回收之水溶液中添加純水，將液體體積調整成100 μL。
(B)mPEG5k siRNA AF5 DGL G4之合成 於(A)所示之mPEG5k SPDP AF5 DGL G4之水溶液10 μL中添加3M之氯化鈉水溶液6.0 μL與siRNA之5.1 mM PBS溶液36.0 μL，於25℃下攪拌15小時，藉此使mPEG5k SPDP AF5 DGL G4所含有之吡啶基二硫基與siRNA所含有之SH基進行反應。使用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR，藉由凝膠過濾對反應液進行純化(溶離液：PBS)，回收包含結合有siRNA之DGL G4之區分部分。藉由超過濾(區分分子量30kDa)濃縮所回收之溶液，將液體體積調整成95 μL，獲得寡核酸共軛物mPEG5k siRNA AF5 DGL G4之溶液。
＜參考例1.修飾有PEG2000之第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之製造＞ (A)疊氮-PEG2k AF5 DGL G4之合成 於DGL G4之50 mg/mL DMSO溶液3.5 μL中添加Alexa Fluor 546 NHS酯之5 mM DMSO溶液2.68 μL、及TEA之10 v/v%DMF溶液2.05 μL，於室溫下攪拌6.5小時。繼而，於該反應液中添加疊氮-PEG2k-NHS(Nanocs公司製造，PEG之數量平均分子量：2000，批號：190220)之75 mM DMSO溶液12.9 μL、NHS之400 mM DMSO溶液4.82 μL、及EDC-HCl之400 mM DMSO溶液4.82 μL，進而於室溫下攪拌17.5小時。繼而，添加甲基-PEG12-NHS之200 mM DMSO溶液4.9 μL，進而於室溫下攪拌6小時。以如上方式使DGL G4之胺基與疊氮-PEG2k-NHS、Alexa Fluor 546 NHS酯及甲基-PEG12-NHS之NHS基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物疊氮-PEG2k AF5 DGL G4。於反應液中添加純水3 mL並混合後，使用純水藉由超過濾(區分分子量30kDa)實施6次純化。藉由逆相HPLC(管柱：Waters公司製造之XBridge peptide BEH C18，4.6×180 mm；溶離液A：0.1%TFA水溶液/乙腈(v/v：90/10)、溶離液B：0.1%TFA水溶液/乙腈(v/v：10/90))對回收之水溶液進行純化，分取目標區分部分。藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量10kDa)將分取之區分部分之溶劑置換成PBS，將液體體積調整成110 μL。
(B)Cy7-PEG2k AF5 DGL G4之合成 於(A)所獲得之疊氮-PEG2k AF5 DGL G4 40 μL中添加Cy7-DBCO(click Chemistry Tools製造)之20 mM水溶液8.8 μL、及DMSO 5.4 μL，於40℃下攪拌13.5小時，藉此使疊氮-PEG2k AF5 DGL G4所含有之疊氮基與Cy7-DBCO所含有之DBCO基進行反應。繼而，添加PBS 47 μL後，利用NAP-5柱進行純化。藉由超過濾(區分分子量10kDa)濃縮所回收之溶液，將液體體積調整成110 μL，獲得奈米粒子化合物Cy7-PEG2k AF5 DGL G4之溶液。對於獲得之溶液，使用紫外可見分光光度計分別測定554 nm及754 nm下之吸光度，由各測定值求出Alexa Fluor 546之濃度及Cy7之濃度。又，藉由採用下述AQC(6-Aminoquinolyl-N-hydroxysccinimidyl carbamate，6-胺基喹啉基-N-羥基琥珀醯亞胺基胺基甲酸酯)法之胺基酸定量分析，求出DGL G4之濃度。根據該等之濃度，計算一個DGL G4上結合之Cy7之數量。根據Cy7之數量求出之PEG2k之數量為21。因此，(A)所合成之疊氮-PEG2k AF5 DGL G4中之PEG2k之數亦可謂21。
＜參考例2.修飾有PEG5000之第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之製造＞ (A)疊氮-PEG5k AF5 DGL G4之合成 於DGL G4之25 mg/mL DMSO溶液7.0 μL中添加Alexa Fluor 546 NHS酯之10 mM DMSO溶液1.34 μL、及TEA之20 v/v%DMF溶液1.03 μL，於室溫下攪拌7小時。繼而，於該反應液中添加疊氮-PEG5k-NHS(Nanocs公司製造，PEG之數量平均分子量：5000，批號：2005EC)之30 mM DMSO溶液16.1 μL、NHS之400 mM DMSO溶液2.41 μL、及EDC-HCl之400 mM DMSO溶液2.41 μL，進而於室溫下攪拌16小時。繼而，添加甲基-PEG12-NHS之200 mM DMSO溶液4.9 μL，進而於室溫下攪拌6小時。以如上方式使DGL G4之胺基與疊氮-PEG5k-NHS、Alexa Fluor 546 NHS酯及甲基-PEG12-NHS之NHS基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物疊氮-PEG5k AF5 DGL G4。於反應液中添加純水3 mL並混合後，使用純水藉由超過濾(區分分子量30kDa)實施6次純化。藉由逆相HPLC(管柱：Waters公司製造之XBridge peptide BEH C18，4.6×180 mm；溶離液A：0.1%TFA水溶液/乙腈(v/v：90/10)、溶離液B：0.1%TFA水溶液/乙腈(v/v：10/90))對回收之水溶液進行純化，分取目標區分部分。藉由超過濾(區分分子量10kDa)將分取之區分部分之溶劑置換成PBS，將液體體積調整成200 μL。
(B)AF405-PEG5k AF5 DGL G4之合成 於(A)所獲得之疊氮-PEG5k AF5 DGL G4 100 μL中添加AFDye(註冊商標)405 DBCO(click Chemistry Tools製造)之1 mM DMSO溶液5.12 μL，於室溫下攪拌30小時，藉此使疊氮-PEG5k AF5 DGL G4所含有之疊氮基與AFDye 405 DBCO所含有之DBCO基進行反應。繼而，利用NAP-5柱對反應液進行純化。藉由超過濾(區分分子量30kDa)濃縮所回收之溶液，將液體體積調整成110 μL，獲得奈米粒子化合物AF405-PEG5k AF5 DGL G4之溶液。對於獲得之溶液，使用紫外可見分光光度計分別測定405 nm及554 nm下之吸光度，由各測定值求出AFDye 405之濃度及Alexa Fluor 546之濃度。又，藉由採用下述AQC法之胺基酸定量分析，求出DGL G4之濃度。根據該等之濃度，計算一個DGL G4上結合之AFDye 405之數量。根據AFDye 405之數量求出之PEG5k之數量為26。因此，(A)所合成之疊氮-PEG5k AF5 DGL G4中之PEG5k之數量亦可謂26。
＜參考例3.導入有嗎啉基之第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之製造＞ 於DGL G4之50 mg/mL DMSO溶液50 μL中添加PEG12-SPDP之300 mM DMSO溶液2.6 μL、及TEA之50 v/v%DMF溶液0.26 μL，於室溫下攪拌2小時。添加mPEG2k-NHS(Iris Biotech公司製造，PEG之數量平均分子量：2000)之20 mM DMSO溶液38.3 μL、及TEA之10 v/v%DMF溶液1.3 μL，於室溫下攪拌2小時。繼而，混合3-嗎啉-4-基-丙酸之100 mM DMSO溶液187.2 μL、EDC-HCl之400 mM DMSO溶液93.6 μL、及NHS之400 mM DMSO溶液93.6 μL，並添加TEA之10 v/v%DMF溶液31.3 μL，於室溫下徹夜攪拌。以如上方式使DGL G4之胺基與3-嗎啉-4-基-丙酸之COOH基、以及PEG12-SPDP及mPEG2k-NHS之NHS基進行反應，藉此獲得奈米粒子化合物mPEG2k SPDP MP DGL G4。於反應液中添加純水700 μL並混合後，使用純水藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量10kDa)實施6次純化。於回收之水溶液中添加純水，將液體體積調整成100 μL。
＜參考例4.導入有硫代嗎啉基之第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之製造＞ 依據參考例3之合成，合成奈米粒子化合物mPEG2k SPDP TP DGL G4。其中，使用4-硫代嗎啉基乙酸鹽酸鹽代替3-嗎啉-4-基-丙酸。
＜參考例5.導入有mPEG12之第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之製造＞ 依據參考例3之合成，合成奈米粒子化合物mPEG2k SPDP mPEG12 DGL G4。其中，使用甲基-PEG12-NHS代替3-嗎啉-4-基-丙酸。
＜參考例6.用以對實施例13之寡核酸共軛物進行評價之奈米粒子化合物之製造＞ 依據實施例13之合成，合成奈米粒子化合物AF4-PEG5k siRNA AF6 DGL G4。其中，使用AFDye405 DBCO(click Chemistry Tools公司製造)代替IND-DBCO。獲得之奈米粒子化合物中之螢光分子AFDye405之數量可謂等於實施例13中所獲得之寡核酸共軛物中之茚達曲林之數量。
＜參考例7.用以對實施例14～17之寡核酸共軛物進行評價之奈米粒子化合物之製造＞ 依據實施例14之合成，合成奈米粒子化合物AF4-PEG5k siRNA AF6 DGL G4。其中，使用AFDye405 DBCO(Broadpharm公司製造)代替NU1-DBCO。獲得之奈米粒子化合物中之螢光分子AFDye405之數量可謂等於實施例14之(B)中所獲得之奈米粒子化合物疊氮-PEG5k siRNA AF6 DGL G4中之親水性連接子(即疊氮基)之數量。
＜參考例8.用以對實施例14之寡核酸共軛物進行評價之寡核酸共軛物之製造＞ 於實施例14所獲得之寡核酸共軛物之PBS溶液30 μL中添加AFDye405 DBCO之PBS溶液1.6 μL、及DMSO 3.5 μL，於25℃下攪拌14小時。利用Zeba(註冊商標)脫鹽離心柱(Thermo Fisher Scientific公司製造，分子量區分：40kDa)對反應液進行純化。繼而，使用PBS藉由超過濾(Merck公司製造之Amicon Ultra，區分分子量30kDa)實施3次純化，將液體體積調整成70 μL，獲得寡核酸共軛物AF4-NU1-PEG5k siRNA AF6 DGL G4之溶液。獲得之寡核酸共軛物中之螢光分子AFDye405之數量可謂等於實施例14中所獲得之寡核酸共軛物中之未反應之親水性連接子(即未反應之疊氮基)之數量。因此，自參考例7獲得之奈米粒子化合物AF4-PEG5k siRNA AF6 DGL G4中之螢光分子AFDye405之數量減去寡核酸共軛物AF4-NU1-PEG5k siRNA AF6 DGL G4中之螢光分子AFDye405之數量，藉此可求出所獲得之寡核酸共軛物AF4-NU1-PEG5k siRNA AF6 DGL G4中之適體AS1411之數量，該值可謂等於實施例14中所獲得之寡核酸共軛物中之適體AS1411之數量。
＜參考例9.用以對實施例15之寡核酸共軛物進行評價之寡核酸共軛物之製造＞ 依據參考例8之合成，獲得寡核酸共軛物AF4-NU2-PEG5k siRNA AF6 DGL G4之溶液。其中，使用實施例15中所獲得之寡核酸共軛物代替實施例14中所獲得之寡核酸共軛物。
＜參考例10.用以對實施例16之寡核酸共軛物進行評價之寡核酸共軛物之製造＞ 依據參考例8之合成，獲得寡核酸共軛物AF4-EP1-PEG5k siRNA AF6 DGL G4之溶液。其中，使用實施例16中所獲得之寡核酸共軛物代替實施例14中所獲得之寡核酸共軛物。
＜參考例11.用以對實施例17之寡核酸共軛物進行評價之寡核酸共軛物之製造＞ 依據參考例8之合成，獲得寡核酸共軛物AF4-EP2-PEG5k siRNA AF6 DGL G4之溶液。其中，使用實施例17中所獲得之寡核酸共軛物代替實施例14中所獲得之寡核酸共軛物。
＜試驗例1.寡核酸共軛物之評價＞ 藉由如下方式評價實施例及比較例之寡核酸共軛物。
(A)寡核酸、細胞內化促進劑及螢光分子之數量之評價 藉由如下方求出實施例及比較例之寡核酸共軛物試樣中之寡核酸、細胞內化促進劑及螢光分子之濃度。寡核酸、葉酸及螢光分子之濃度係根據使用紫外可見分光光度計測定之如下波長下之吸光度之值求出：寡核酸(siRNA及反義核酸)為260 nm、葉酸為300 nm、AFDye405為402 nm、Alexa Fluor 546為554 nm、Alexa Fluor 647為651 nm、及Tide Fluor 7WS為749 nm。又，藉由以下所示之胺基酸定量分析(PTC(phenylthiocarbamoyl，苯胺硫甲醯)法或AQC法)定量試樣中之樹狀聚合物與多肽系細胞內化促進劑之濃度。對於實施例1及比較例1之試樣採用PTC法，對於其以外之實施例之試樣採用AQC法。
關於實施例13之寡核酸共軛物試樣中之茚達曲林之數量，合成實施例13之寡核酸共軛物中之茚達曲林被螢光分子AFDye405取代之奈米粒子化合物(參考例6)，求出該奈米粒子化合物中之AFDye405之數量，將其視作實施例13之寡核酸共軛物中之茚達曲林之數量。
關於含有適體作為細胞內化促進劑之實施例14～17之寡核酸共軛物試樣，試樣中之寡核酸之數量係藉由求出適體反應前之合成中間物(奈米粒子化合物)中之寡核酸之數量而確定。又，試樣中之適體之數量係藉由如下方式求出。首先，合成實施例14～17之寡核酸共軛物中之適體被螢光分子AFDye405取代之奈米粒子化合物(參考例7)，求出該奈米粒子化合物中之螢光分子之數量(等於適體反應前之合成中間物中之親水性連接子之數量)。另外準備使實施例14～17之寡核酸共軛物進而與螢光分子AFDye405反應獲得之寡核酸共軛物(參考例8～11)，求出該寡核酸共軛物中之AFDye405之數量(等於適體反應後剩餘之未反應之親水性連接子之數量)。繼而，求出該等AFDye405之數量之差值，將其視作實施例14～17之寡核酸共軛物中之適體之數量。
根據該等之濃度，計算一個樹狀聚合物上結合之寡核酸、細胞內化促進劑及螢光分子之數量。計算結果示於以下之各試驗例或表3。
[表3]
試樣 IND-PEG5k siRNA AF6 DGL G4 EP1-PEG5k siRNA AF6 DGL G4 EP2-PEG5k siRNA AF6 DGL G4 cRGD-PEG5k siRNA AF6 MPA G6
對應實施例 13 16 17 20
樹狀聚合物 DGL G4 DGL G4 DGL G4 Bis-MPA G6
寡核酸 Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA
寡核酸之數量 20.3 15.8 15.8 5
親水性連接子 PEG5k PEG5k PEG5k PEG5k
細胞內化 促進劑 茚達曲林 序列編號3表示之 EpCAM適體 序列編號4表示之 EpCAM適體 cRGDfK
細胞內化 促進劑之數量 28.1 18.8 15 11.9
螢光分子 AlexaFluor 647 AlexaFluor 647 AlexaFluor 647 AlexaFluor 647
螢光分子之數量 4 1.9 2.3 2.8
封端劑 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12
試樣 cRGD-PEG5k siRNA-C3 AF6 DGL G4 c(avb6)-PEG5k ASO AF6 DGL G4 cRGD-PEG5k-SS siRNA AF5 DGL G4 cRGD-EK siRNA AF6 DGL G4
對應實施例 21 22 29 30
樹狀聚合物 DGL G4 DGL G4 DGL G4 DGL G4
寡核酸 加擾siRNA Malat1-ASO 加擾siRNA Atp5b-siRNA
寡核酸之數量 2.6 28.4 32.7 28.4
親水性連接子 PEG5k PEG5k PEG5k EK肽
細胞內化 促進劑 cRGDfK c(avb6) cRGDfK cRGDfK
細胞內化 促進劑之數量 26 25.7 10.2 20.6
螢光分子 AlexaFluor 647 AlexaFluor 647 AlexaFluor 546 AlexaFluor 647
螢光分子之數量 2.9 3.6 4.4 3.1
封端劑 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12
(A-1)胺基酸定量分析(PTC法) 於能夠密封之玻璃瓶中添加寡核酸共軛物試樣之水溶液30 μL與定沸點鹽酸300 μL，加以密封，於105℃下加熱24小時進行水解。將反應液一面於45℃下加熱一面減壓去除溶劑後，添加乙腈/吡啶/TEA/純水之混合液(v/v/v/v：10/5/2/3)150 μL，進而一面於45℃下加熱一面減壓去除溶劑。添加乙腈/吡啶/TEA/純水/PITC之混合液(v/v/v/v/v：10/5/2/3/1)150 μL，於25℃下攪拌30分鐘後，一面於45℃下加熱一面減壓去除溶劑。所使用之PITC由FUJIFILM Wako Pure Chemical股份有限公司製造。藉由逆相HPLC(管柱：FUJIFILM Wako Pure Chemical股份有限公司製造之Wakopak Wakosil-PTC，4.0×250 mm；溶離液A：PTC-胺基酸流動相A、溶離液B：PTC-胺基酸流動相B)對獲得之固體進行分析，根據離胺酸殘基之波峰積分值定量DGL G4之濃度，又，根據苯丙胺酸殘基之波峰積分值定量cRGDfK之濃度。
(A-2)胺基酸定量分析(AQC法) 於能夠密封之玻璃瓶中添加寡核酸共軛物試樣之水溶液30 μL與定沸點鹽酸300 μL，加以密封，於110℃下加熱24小時進行水解。水解後，將反應液一面於45℃下加熱一面減壓去除溶劑。使AQC(Adipogen Life Sciences公司製造)溶解於60℃之乙腈(超脫水)，調整成3 mg/mL。於裝有乾燥之寡核酸共軛物試樣之玻璃瓶中添加20 mM鹽酸30 μL、0.2 M硼酸緩衝液(pH值8.8)90 μL、及3 mg/mL AQC 乙腈溶液30 μL並攪拌，於60℃下靜置。靜置10分鐘後，一面於45℃下加熱一面減壓去除溶劑。使獲得之固體溶解於溶離液A 150 μL後，利用過濾器進行過濾(Merck公司製造之Ultrafree-MC或-GV，0.22 μm)。藉由逆相HPLC(管柱：AccQ-Tag Column，60 Å，4 μm，3.9×150 mm；溶離液A：AccQ-Tag Eluent A/純水(v/v：1/9)、溶離液B：水/乙腈(v/v：1/1))對獲得之濾液進行分析，根據離胺酸殘基之波峰積分值定量DGL G3、DGL G4及DGL G5之濃度，又，分別根據固有之波峰積分值定量PAMAM G5、PAMAM G6、Bis-MPA樹枝狀聚合物、cRGDfK、c(avb6)及GE11之濃度。AccQ-Tag Column及AccQ-Tag Eluent A購自Waters Corporation公司。
(B)寡核酸共軛物之粒度分佈評價 使用粒徑分析裝置(Malvern Panalytical製造之Zetasizer Nano ZS)，對於比較例1獲得之mPEG5k siRNA AF5 DGL G4之平均粒徑進行評價。使用Malvern Panalytical製造之樣品池ZEN0040，藉由動態光散射法測定。測定結果示於表4。
[表4]
試樣 平均粒徑 (散射強度基準)
mPEG siRNA AF5 DGL G4 36.2 nm
(C)寡核酸共軛物之水合層之厚度h之評價 如上所述，求解樹狀聚合物上結合之親水性連接子之末端間直線距離之平均值時可採用利用結合有長度各異之親水性連接子之複數種樹狀聚合物之方法。具體而言，測定該等之粒徑，製作親水性連接子之分子量與親水性連接子之末端間距離的校準曲線，藉此可推測未於實驗中使用之分子量之親水性連接子之末端間距離。作為一例，以下揭示使用PEG作為親水性連接子、由兩種試樣製作校準曲線之情形。
藉由如下方式求出實施例之寡核酸共軛物之水合層之厚度h(即PEG5k之末端間直線距離之平均值)。首先，使用粒徑分析裝置(Malvern Panalytical製造之Zetasizer Ultra)，藉由多角度動態光散射法測定參考例1中之奈米粒子化合物疊氮-PEG2k AF5 DGL G4及參考例2中之奈米粒子化合物疊氮-PEG5k AF5 DGL G4之平均粒徑。作為樣品池，使用Sarstedt K.K.公司製造之Cuvette(產品編號：67.754)。結果示於表5。其次，根據疊氮-PEG5k AF5 DGL G4之平均粒徑與疊氮-PEG2k AF5 DGL G4之平均粒徑的差，計算每單位分子量之PEG對應之水合層之厚度。具體而言，算出每1000分子量之PEG對應之水合層之厚度為(32.9－21.5)/[2×(5000－2000)]×1000＝1.9 nm。根據該結果，算出含有分子量5000之PEG作為親水性連接子之實施例之寡核酸共軛物之水合層之厚度h為5000/1000×1.9＝9.5 nm。即，親水性連接子PEG5k之末端間直線距離之平均值可謂9.5 nm。另一方面，實施例中，由於siRNA(分子長約5 nm)經由PEG12(分子量約500之PEG)及spacer18(分子量約250之PEG)結合於樹狀聚合物，故而算出自中心表面至siRNA之游離末端之直線距離之平均值為5＋(500＋250)/1000×1.9＝6.4 nm。因此，實施例之寡核酸共軛物中，親水性連接子PEG5k之末端間直線距離之平均值可謂比siRNA之長度長、且比自中心表面至siRNA之游離末端之直線距離之平均值長。其中，本分析結果及本考察限於使用參考例1及2之奈米粒子化合物作為試樣、且假設PEG分子量與水合層之厚度呈線形關係的情形。作為一例揭示了二點近似之例，但為了使解析更準確，較理想為採用多點近似方法。
[表5]
試樣 PEG之分子量 平均粒徑 (散射強度基準)
疊氮-PEG2k AF5 DGL G4 2000 21.5 nm
疊氮-PEG5k AF5 DGL G4 5000 32.9 nm
(D)親水性連接子之末端間直線距離之平均值與寡核酸之長度的比較 使用粒徑分析裝置(Malvern Panalytical製造之Zetasizer Ultra)，藉由多角度動態光散射法測定實施例25之(A)所獲得之奈米粒子化合物疊氮-PEG5k SPDP AF5 DGL G4、及於該奈米粒子化合物上結合有siRNA之奈米粒子化合物疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G4(實施例25之(B)中合成)之平均粒徑。作為樣品池，使用Sarstedt K.K.公司製造之Cuvette(產品編號：67.754)。同樣地，測定實施例26之合成過程中獲得之奈米粒子化合物疊氮-PEG10k SPDP AF5 DGL G4、及於該奈米粒子化合物上結合有siRNA之奈米粒子化合物疊氮-PEG10k siRNA AF5 DGL G4(實施例26之合成過程中獲得)之平均粒徑。結果示於表6。
[表6]
試樣 疊氮-PEG5k AF5 DGL G4 疊氮-PEG5k siRNA AF5 DGL G4 疊氮-PEG10k AF5 DGL G4 疊氮-PEG10k siRNA AF5 DGL G4
對應實施例 25(A)所獲得之 合成中間物 25(B)所獲得之 合成中間物 26所獲得之 合成中間物 26所獲得之 合成中間物
樹狀聚合物 DGL G4 DGL G4 DGL G4 DGL G4
寡核酸 加擾siRNA 加擾siRNA 加擾siRNA 加擾siRNA
寡核酸之數量 - 16.7 - 15.3
親水性連接子 PEG5k PEG5k PEG10k PEG10k
親水性連接子之數量 31.0 31.0 21.8 21.8
封端劑 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12
螢光分子 AlexaFluor546 AlexaFluor546 AlexaFluor546 AlexaFluor546
螢光分子之數量 1.8 1.8 4.5 4.5
平均粒徑 (散射強度基準) 23.5 nm 26.9 nm 33.9 nm 32.7 nm
於使用PEG5k(分子量5000之PEG)作為親水性連接子之情形時，藉由在中心結合加擾siRNA而使奈米粒子化合物之平均粒徑增大5.4 nm。根據該結果，可謂自中心表面至siRNA之游離末端之直線距離之平均值比親水性連接子PEG5k之末端間直線距離之平均值長2.7 nm。從而可知，與試驗例1之(C)中之結果相反，含有親水性連接子PEG5k之實施例之寡核酸共軛物中，親水性連接子PEG5k之末端間直線距離之平均值比自中心表面至siRNA之游離末端之直線距離之平均值短。
另一方面，於使用PEG10k(分子量10000之PEG)作為親水性連接子之情形時，即便於中心結合加擾siRNA，奈米粒子化合物之平均粒徑亦幾乎無變化。根據該結果，可謂親水性連接子PEG5k之末端間直線距離之平均值比自中心表面至siRNA之游離末端之直線距離之平均值長。
再者，由於自中心表面至siRNA之游離末端之直線距離之平均值比親水性連接子PEG5k之末端間直線距離之平均值長2.7 nm，故而若親水性連接子PEG5k之末端間直線距離之平均值為1.35 nm以上且未達2.7 nm，則可謂該直線距離之平均值為自中心表面至寡核酸之游離末端之長度的三分之一以上且未達一半。又，若親水性連接子PEG5k之末端間直線距離之平均值為2.7 nm以上，則可謂該直線距離之平均值為自中心表面至寡核酸之游離末端之長度的一半以上。
其中，本分析結果限於當前合成批次，使用相同分子量材料之情形時結果並非統一。於對親水性連接子之末端間直線距離之平均值與寡核酸之長度進行比較時，需針對各合成批次分別實施相同之分析。
＜試驗例2.cRGD配體結合型寡核酸共軛物之細胞評價＞ 於96孔培養盤中接種人類神經膠母細胞瘤細胞株(U-87MG)，使用含10%FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)之DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，達爾伯克改良伊格爾培養基)培養基，於37℃、5%CO 2之培養箱中進行培養。次日，交換培養基，並於各孔中添加試樣轉染細胞，於37℃、5%CO 2之培養箱中進行培養。轉染之時間點的試樣之siRNA濃度為0.1 μM或1 μM。距轉染經過48小時後，利用PBS將細胞洗淨後，測定螢光強度(激發波長540 nm、螢光波長585 nm)。進而，根據siRNA與螢光分子之數量之比(siRNA之數量/螢光分子之數量)，將siRNA濃度換算成螢光分子之濃度，基於螢光強度與螢光分子之濃度近似成正比例關係，計算螢光分子之濃度為0.1 μM或1 μM時之螢光強度。將所使用之試樣示於表7，將所得之結果示於圖2。
表7中，mPEG-siAtp5b對應於比較例1，cRGD-siAtp5b對應於實施例1。 [表7]
試樣 mPEG-siAtp5b cRGD-siAtp5b
對應實施例/比較例 比較例1 實施例1
樹狀聚合物 DGL G4 DGL G4
寡核酸 Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA
寡核酸之數量 20.8 35.5
親水性連接子 PEG5k PEG5k
細胞內化促進劑 - cRGDfK
細胞內化促進劑之數量 - 25.4
螢光分子 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546
螢光分子之數量 6.7 16.9
封端劑 甲基-PEG12 甲基-PEG12
於96孔培養盤中接種人類神經膠母細胞瘤細胞株(U-87MG)，使用含10%FBS之DMEM培養基，於37℃、5%CO 2之培養箱中進行培養。次日，交換培養基，並於各孔中添加試樣轉染細胞，於37℃、5%CO 2之培養箱中進行培養。轉染之時間點的試樣之siRNA濃度為0.1 μM或1 μM。於對照組中添加PBS代替試樣。距轉染經過48小時後，使用RNeasy小量提取套組(RNeasy Mini Kit)(Qiagen公司製造)提取mRNA，使用高容量RNA-to-cDNA套組(High Capacity RNA-to-cDNA Kit)(Applied Biosystems(註冊商標))由一定量之mRNA合成cDNA。繼而，以獲得之cDNA作為模板，使用PowerUp SYBR Green Master Mix預混液(Applied Biosystems)實施定量RT-PCR(Real-time PCR，即時聚合酶鏈鎖反應)。作為ATP5B引子，使用下表8所示之序列編號12及序列編號13之引子，作為GAPDH引子，使用下表8所示之序列編號14及序列編號15之引子。PCR條件(溫度及時間)如下所示。將95℃下1秒、60℃下30秒設計為1個循環，實施40個循環。基於定量RT-PCR之結果，計算「hATP5B之表現量/hGAPDH(內部標準基因)之表現量」之值，將對照組之相關計算結果與試樣添加組之相關計算結果進行比較。將所使用之試樣示於表7，將所得之結果示於圖3。 [表8]
ATP5B-正方向 (序列編號12) 5'-GGTCCTGAGACTTTGGGCAGAA-3'
ATP5B-反方向 (序列編號13) 5'-CCTCAGCATGAATGGGAGCA-3'
GAPDH-正方向 (序列編號14) 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGMC-3'
GAPDH-反方向 (序列編號15) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'
＜試驗例3.使用cRGD配體結合型寡核酸共軛物之siRNA序列特異性減弱活性之評價＞ 於96孔培養盤中接種人類神經膠母細胞瘤細胞株(U-87MG)，使用含10%FBS之DMEM培養基，於37℃、5%CO 2之培養箱中進行培養。次日，交換培養基，並於各孔中添加試樣轉染細胞，於37℃、5%CO 2之培養箱中進行培養。轉染之時間點的試樣之siRNA濃度為0.1 μM或1 μM。於對照組中添加PBS代替試樣。距轉染經過48小時後，使用RNeasy小量提取套組(Qiagen公司製造)提取mRNA，使用高容量RNA-to-cDNA套組(Applied Biosystems)由一定量之mRNA合成cDNA。繼而，以獲得之cDNA作為模板，使用PowerUp SYBR Green Master Mix預混液(Applied Biosystems)實施定量RT-PCR。作為ATP5B引子，使用上表8所示之序列編號12及序列編號13之引子，作為GAPDH引子，使用上表8所示之序列編號14及序列編號15之引子。PCR條件(溫度及時間)如下所示。將95℃下1秒、60℃下30秒設計為1個循環，實施40個循環。基於定量RT-PCR之結果，計算「hATP5B之表現量/hGAPDH(內部標準基因)之表現量」之值，將對照組之相關計算結果與試樣添加組之相關計算結果進行比較。將所使用之試樣示於表9，將所得之結果示於圖4。
表9中，mPEG-siAtp5b對應於比較例1，其餘試樣對應於實施例1。 [表9]
試樣 mPEG-siAtp5b cRGD-siScramble cRGD-siAtp5b
對應實施例/比較例 比較例1 實施例1 實施例1
樹狀聚合物 DGL G4 DGL G4 DGL G4
寡核酸 Atp5b-siRNA 加擾siRNA Atp5b-siRNA
寡核酸之數量 20.8 18.0 28.0
親水性連接子 PEG5k PEG5k PEG5k
細胞內化促進劑 - cRGDfK cRGDfK
細胞內化促進劑之數量 - 26.2 25.6
螢光分子 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546
螢光分子之數量 6.7 5.8 6.1
封端劑 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12
＜試驗例4.GE11配體結合型寡核酸共軛物之細胞評價＞ 於96孔培養盤中接種人類鱗狀上皮細胞癌細胞株(A431)，使用含10%FBS之DMEM培養基，於37℃、5%CO 2之培養箱中進行培養。次日，交換培養基，並於各孔中添加試樣轉染細胞，於37℃、5%CO 2之培養箱中進行培養。轉染之時間點的試樣之siRNA濃度為0.1 μM或1 μM。距轉染經過48小時後，利用PBS將細胞洗淨後，測定螢光強度(激發波長540 nm、螢光波長585 nm)。進而，根據siRNA與螢光分子之數量之比(siRNA之數量/螢光分子之數量)，將siRNA濃度換算成螢光分子之濃度，基於螢光強度與螢光分子之濃度近似成正比例關係，計算螢光分子之濃度為0.1 μM或1 μM時之螢光強度。將所使用之試樣示於表10，將所得之結果示於圖5。
表10中，mPEG-siAtp5b對應於比較例1，GE11-siAtp5b對應於實施例2。 [表10]
試樣 mPEG-siAtp5b GE11-siAtp5b
對應實施例/比較例 比較例1 實施例2
樹狀聚合物 DGL G4 DGL G4
寡核酸 Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA
寡核酸之數量 20.8 21.5
親水性連接子 PEG5k PEG5k
細胞內化促進劑 - GE11
細胞內化促進劑之數量 0 19.1
螢光分子 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546
螢光分子之數量 6.7 8.2
封端劑 甲基-PEG12 甲基-PE612
於96孔培養盤中接種人類鱗狀上皮細胞癌細胞株(A431)，使用含10%FBS之DMEM培養基，於37℃、5%CO 2之培養箱中進行培養。次日，交換培養基，並於各孔中添加試樣轉染細胞，於37℃、5%CO 2之培養箱中進行培養。轉染之時間點的試樣之siRNA濃度為0.1 μM或1 μM。於對照組中添加PBS代替試樣。距轉染經過48小時後，使用RNeasy小量提取套組(Qiagen公司製造)提取mRNA，使用高容量RNA-to-cDNA套組(Applied Biosystems)由一定量之mRNA合成cDNA。繼而，以獲得之cDNA作為模板，使用PowerUp SYBR Green Master Mix預混液(Applied Biosystems)實施定量RT-PCR。作為ATP5B引子，使用上表8所示之序列編號12及序列編號13之引子，作為GAPDH引子，使用上表8所示之序列編號14及序列編號15之引子。PCR條件(溫度及時間)如下所示。將95℃下1秒、60℃下30秒設計為1個循環，實施40個循環。基於定量RT-PCR之結果，計算「hATP5B之表現量/hGAPDH(內部標準基因)之表現量」之值，將對照組之相關計算結果與試樣添加組之相關計算結果進行比較。將所使用之試樣示於表10，將所得之結果示於圖6。
＜試驗例5.中心採用PAMAM之cRGD配體結合型寡核酸共軛物之細胞評價＞ 於96孔培養盤中接種人類神經膠母細胞瘤細胞株(U-87MG)，使用含10%FBS之DMEM培養基，於37℃、5%CO 2之培養箱中進行培養。次日，交換培養基，並於各孔中添加試樣轉染細胞，於37℃、5%CO 2之培養箱中進行培養。轉染之時間點的試樣之樹枝狀聚合物濃度為2 nM或10 nM。距轉染經過48小時後，利用PBS將細胞洗淨後，測定螢光強度(激發波長740 nm、螢光波長780 nm)。進而，根據螢光分子之數量，將樹枝狀聚合物濃度換算成螢光分子之濃度，基於螢光強度與螢光分子之濃度近似成正比例關係，計算螢光分子之濃度為5 nM或25 nM時之螢光強度。將所使用之試樣示於表11，將所得之結果示於圖7。
表11中，cRGD-DGL4對應於實施例5，cRGD-PAM5對應於實施例3，cRGD-PAM6對應於實施例4。 [表11]
試樣 cRGD-DGL4 cRGD-PAM5 cRGD-PAM6
對應實施例 5 3 4
樹狀聚合物 DGL G4 PAMAM G5 PAMAM G6
寡核酸 Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA
寡核酸之數量 25.6 13.9 15.9
親水性連接子 PEG5k PEG5k PEG5k
細胞內化促進劑 cRGDfK cRGDfK cRGDfK
細胞內化促進劑之數量 19.9 10.5 20.8
螢光分子 TideFluor 7WS TideFluor 7WS TideFluor 7WS
螢光分子之數量 2.9 1.0 2.0
封端劑 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12
於96孔培養盤中接種人類神經膠母細胞瘤細胞株(U-87MG)，使用含10%FBS之DMEM培養基，於37℃、5%CO 2之培養箱中進行培養。次日，交換培養基，並於各孔中添加試樣轉染細胞，於37℃、5%CO 2之培養箱中進行培養。轉染之時間點的試樣之siRNA濃度為0.1 μM或1 μM。於對照組中添加PBS代替試樣。距轉染經過48小時後，使用RNeasy小量提取套組(Qiagen公司製造)提取mRNA，使用高容量RNA-to-cDNA套組(Applied Biosystems(註冊商標))由一定量之mRNA合成cDNA。繼而，以獲得之cDNA作為模板，使用PowerUp SYBR Green Master Mix預混液(Applied Biosystems)實施定量RT-PCR。作為ATP5B引子，使用上表8所示之序列編號12及序列編號13之引子，作為GAPDH引子，使用上表8所示之序列編號14及序列編號15之引子。PCR條件(溫度及時間)如下所示。將95℃下1秒、60℃下30秒設計為1個循環，實施40個循環。基於定量RT-PCR之結果，計算「hATP5B之表現量/hGAPDH(內部標準基因)之表現量」之值，將對照組之相關計算結果與試樣添加組之相關計算結果進行比較。將所使用之試樣示於表11，將所得之結果示於圖8。
＜試驗例6.具有各種修飾數之cRGD配體結合型寡核酸共軛物之細胞評價＞ 按照試驗例5之程序實施入胞行為評價。轉染之時間點的試樣之樹枝狀聚合物濃度為2 nM或10 nM。於激發波長540 nm、螢光波長580 nm下測定螢光強度。根據螢光分子之數量，將樹枝狀聚合物濃度換算成螢光分子之濃度，基於螢光強度與螢光分子之濃度近似成正比例關係，計算螢光分子之濃度為10 nM或50 nM時之螢光強度。將所使用之試樣示於表12，將所得之結果示於圖9。
按照試驗例5之程序實施減弱活性評價。將所使用之試樣示於表12，將所得之結果示於圖10。
[表12]
試樣 cRGD-DGL4_1 cRGD-DGL4_2 cRGD-DGL4_3 cRGD-DGL4_4 cRGD-DGL4_5 N3-DGL4
對應實施例 6 7 8 9 10 6(B)所獲得之 合成中間物
樹狀聚合物 DGL G4 DGL G4 DGL G4 DGL G4 DGL G4 DGL G4
寡核酸 Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA AtpBb-siRNA AtpBb-siRNA
寡核酸 之數量 26.7 27.2 27.3 29.0 29.9 27.5
親水性 連接子 PEG5k PEG5k PEG5k PEG5k PEG5k PEG5k
細胞內化 促進劑 cRGDfK cRGDfK cRGDfK cRGDfK cRGDfK cRGDfK
細胞內化 促進劑之數量 25.6 20.7 16.2 13.1 8.8 -
螢光分子 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546
螢光分子 之數量 7.4 7.8 7.5 8.4 8.5 6.0
封端劑 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12
＜試驗例7.靶向整合素αVβ6之肽配體結合型寡核酸共軛物之細胞評價＞ 按照試驗例6之程序實施入胞行為評價。作為細胞，使用人類肺腺癌細胞株(H2009)。於激發波長540 nm、螢光波長580 nm下測定螢光強度。根據螢光分子之數量，將樹枝狀聚合物濃度換算成螢光分子之濃度，基於螢光強度與螢光分子之濃度近似成正比例關係，計算螢光分子之濃度為5 nM或25 nM時之螢光強度。將所使用之試樣示於表13，將所得之結果示於圖11。
按照試驗例6之程序實施減弱活性評價。轉染之時間點的試樣之siRNA濃度為0.05 μM或0.5 μM。將所使用之試樣示於表13，將所得之結果示於圖12。
[表13]
試樣 N3-DGL4 c(avb6)-DGL4
對應實施例 1(B)所獲得之合成中間物 11
樹狀聚合物 DGL G4 DGL G4
寡核酸 Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA
寡核酸之數量 30.2 21.9
親水性連接子 PEG5k PEG5k
細胞內化促進劑 - c(avb6)
細胞內化促進劑之數量 - 16.5
螢光分子 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546
螢光分子之數量 2.5 4.4
封端劑 甲基-PEG12 甲基-PEG12
＜試驗例8.葉酸配體結合型寡核酸共軛物之細胞評價＞ 按照試驗例6之程序實施入胞行為評價。作為細胞，使用人類口腔表皮樣癌細胞株(KB)。轉染之時間點的試樣之螢光濃度為10 nM或100 nM。將所使用之試樣示於表14，將所得之結果示於圖13。
[表14]
試樣 N3-DGL4 FA-DGL4
對應實施例 1(B)所獲得之合成中間物 12
樹狀聚合物 DGL G4 DGL G4
寡核酸 Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA
寡核酸之數量 20.5 28.5
親水性連接子 PEG5k PEG5k
細胞內化促進劑 - 葉酸
細胞內化促進劑之數量 - 31.5
螢光分子 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546
螢光分子之數量 10.0 8.9
封端劑 甲基-PEG12 甲基-PEG12
＜試驗例9.靶向核仁素之適體配體結合型寡核酸共軛物之細胞評價＞ 按照試驗例6之程序實施入胞行為評價。作為細胞，使用人類乳癌細胞株(MCF-7)。轉染之時間點的試樣之樹枝狀聚合物濃度為3 nM、10 nM或30 nM。於激發波長650 nm、螢光波長695 nm下測定螢光強度。根據螢光分子之數量，將樹枝狀聚合物濃度換算成螢光分子之濃度，基於螢光強度與螢光分子之濃度近似成正比例關係，計算螢光分子之濃度為6 nM、20 nM或60 nM時之螢光強度。將所使用之試樣示於表15，將所得之結果示於圖14。
按照試驗例6之程序實施減弱活性評價。轉染之時間點的試樣之樹枝狀聚合物濃度為3 nM、10 nM或30 nM。將所使用之試樣示於表15，將所得之結果示於圖15。
[表15]
試樣 N3-DGL4 NU1-DGL4 NU2-DGL4
對應實施例 14(B)所獲得之 合成中間物 14 15
樹狀聚合物 DGL G4 DGL G4 DGL G4
寡核酸 Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA
寡核酸之數量 14.3 15.3 15.3
親水性連接子 PEG5k PEG5k PEG5k
細胞內化促進劑 - AS1411 FAN-1524dI
細胞內化促進劑之數量 - 16.3 16.6
螢光分子 AlexaFluor 647 AlexaFluor 647 AlexaFluor 647
螢光分子之數量 2.4 2.0 1.8
封端劑 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12
＜試驗例10.使用不同代數之聚離胺酸樹枝狀接枝物之cRGD配體結合型寡核酸共軛物之細胞評價＞ 按照試驗例6之程序實施入胞行為評價及減弱活性評價。將所使用之試樣示於表16，將所得之結果示於圖16及圖17。
[表16]
試樣 CRGD-DGL3 CRGD-DGL4 CRGD-DGL5
對應實施例 18 1 19
樹狀聚合物 DGL G3 DGL G4 DGL G5
寡核酸 Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA
寡核酸之數量 10.9 25.3 44.8
親水性連接子 PEG5k PEG5k PEG5k
細胞內化促進劑 cRGDfK cRGDfK cRGDfK
細胞內化促進劑之數量 7.2 23.6 40.5
螢光分子 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546
螢光分子之數量 1.5 6.5 14.0
封端劑 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12
＜試驗例11.經不同分子量PEG修飾之cRGD配體結合型寡核酸共軛物之細胞評價1＞ 按照試驗例6之程序實施入胞行為評價。轉染之時間點的試樣之樹枝狀聚合物濃度為2 nM或10 nM。根據螢光分子之數量，將樹枝狀聚合物濃度換算成螢光分子之濃度，基於螢光強度與螢光分子之濃度近似成正比例關係，計算螢光分子之濃度為20 nM或100 nM時之螢光強度。將所使用之試樣示於表17，將所得之結果示於圖18。
[表17]
試樣 N3-PEG2k -DGL4 cRGD-PEG2k -DGL4 N3-PEG3.4k- DGL4 cRGD-PEG3.4k- DGL4 N3-PEG5k -DGL4 cRGD-PEG5k -DGL4
對應實施例 23(B)所獲得之 合成中間物 23 24所獲得之合成中間物 24 25 25(B)所獲得之合成中間物
樹狀聚合物 DGL G4 DGL G4 DGL G4 DGL G4 DGL G4 DGL G4
寡核酸 加擾siRNA 加擾siRNA 加擾siRNA 加擾siRNA Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA
寡核酸 之數量 18.3 17.9 15.5 13.7 20.5 22.9
親水性 連接子 PEG2k PEG2k PEG3.4k PEG3.4k PEG5k PEG5k
細胞內化 促進劑 - cRGDfK - cRGDfK - cRGDfK
細胞內化 促進劑之數量 - 30.2 - 31.8 - 34.9
螢光分子 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546
螢光分子 之數量 9.5 7.4 10.4 7.8 10.0 11.0
封端劑 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12 甲基-PEG12
＜試驗例12.經不同分子量PEG修飾之cRGD配體結合型寡核酸共軛物之細胞評價2＞ 按照試驗例6之程序實施入胞行為評價。將所使用之試樣示於表18，將所得之結果示於圖19。
[表18]
試樣 cRGD-PEG5k-DGL4 cRGD-PEG10k-DGL4
對應實施例 25 26
樹狀聚合物 DGL G4 DGL G4
寡核酸 Atp5b-siRNA 加擾siRNA
寡核酸之數量 18.3 13.1
親水性連接子 PEG5k PEG10k
細胞內化促進劑 cRGDfK cRGDfK
細胞內化促進劑之數量 34.8 21.8
螢光分子 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546
螢光分子之數量 1.7 3.7
封端劑 甲基-PEG12 甲基-PEG12
＜試驗例13.使用pMeOx之cRGD配體結合型寡核酸共軛物之細胞評價＞ 按照試驗例6之程序實施入胞行為評價。轉染之時間點的試樣之樹枝狀聚合物濃度為4 nM或20 nM。於激發波長740 nm、螢光波長780 nm下測定螢光強度。根據螢光分子之數量，將樹枝狀聚合物濃度換算成螢光分子之濃度，基於螢光強度與螢光分子之濃度近似成正比例關係，計算螢光分子之濃度為10 nM或50 nM時之螢光強度。將所使用之試樣示於表19，將所得之結果示於圖20。
按照試驗例6之程序實施減弱活性評價。將所使用之試樣示於表19，將所得之結果示於圖21。
[表19]
試樣 cRGD-PEG5k-DGL4 cRGD-pMeOx10k-DGL4
對應實施例 5 27
樹狀聚合物 DGL G4 DGL G4
寡核酸 Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA
寡核酸之數量 17.7 16.8
親水性連接子 PEG5k pMeOx10k
細胞內化促進劑 cRGDfK cRGDfK
細胞內化促進劑之數量 14.0 14.7
螢光分子 TideFluor7WS TideFluor7WS
螢光分子之數量 2.1 2.5
封端劑 甲基-PEG12 甲基-PEG12
＜試驗例14.使用pSar之cRGD配體結合型寡核酸共軛物之細胞評價＞ 按照試驗例6之程序實施入胞行為評價及減弱活性評價。將所使用之試樣示於表20，將所得之結果示於圖22及圖23。
[表20]
試樣 cRGD-PEG5k-DGL4 cRGD-pSar10k-DGL4
對應實施例 1 28
樹狀聚合物 DGL G4 DGL G4
寡核酸 Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA
寡核酸之數量 27.2 21.5
親水性連接子 PEG5k pSar10k
細胞內化促進劑 cRGDfK cRGDfK
細胞內化促進劑之數量 20.7 22.9
螢光分子 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546
螢光分子之數量 7.8 3.5
封端劑 甲基-PEG12 甲基-PEG12
＜試驗例15.經各種封端劑修飾之cRGD配體結合型寡核酸共軛物之細胞評價＞ 按照試驗例6之程序實施入胞行為評價。轉染之時間點的試樣之樹枝狀聚合物濃度為2 nM或10 nM。根據螢光分子之數量，將樹枝狀聚合物濃度換算成螢光分子之濃度，基於螢光強度與螢光分子之濃度近似成正比例關係，計算螢光分子之濃度為20 nM或100 nM時之螢光強度。將所使用之試樣示於表21，將所得之結果示於圖24。
按照試驗例6之程序實施減弱活性評價。將所使用之試樣示於表21，將所得之結果示於圖25。
[表21]
試樣 cRGD-mPEG 12-DGL4 cRGD-mPEG 4-DGL4 cRGD-GA -DGL4 cRGD-tN -DGL4 cRGD-sbeta -DGL4 cRGD-nBu -DGL4 cRGD-iBu -DGL4
對應實施例 1 31 32 33 34 35 36
樹狀聚合物 DGL G4 DGL G4 DGL G4 DGL G4 DGL G4 DGL G4 DGL G4
寡核酸 Atp5b -siRNA Atp5b -siRNA Atp5b-siRNA Atp5b -siRNA Atp5b -siRNA Atp5b -siRNA Atp5b -siRNA
寡核酸 之數量 28.1 37.6 34.0 33.0 29.0 35.7 34.9
親水性 連接子 PEG5k PEG5k PEG5k PEG5k PEG5k PEG5k PEG5k
細胞內化 促進劑 cRGDfK cRGDfK cRGDfK cRGDfK cRGDfK cRGDfK cRGDfK
細胞內化 促進劑之數量 22.3 24.9 27.6 25.6 26.1 13.1 13.9
螢光分子 Alexa Fluor 546 Alexa Fluor 546 Alexa Fluor 546 Alexa Fluor 546 Alexa Fluor 546 Alexa Fluor 546 Alexa Fluor 546
螢光分子 之數量 4.3 14.4 8.2 7.6 9.3 9.1 8.4
封端劑 甲基-PEG12 甲基-PEG4 乙醇酸 二甲胺 磺基甜菜鹼 n-Bu i-Bu
＜試驗例16.經具有質子化能力之封端劑修飾之cRGD配體結合型寡核酸共軛物之細胞評價＞ 按照試驗例6之程序實施入胞行為評價。轉染之時間點的試樣之siRNA濃度為0.1 μM或1 μM，根據螢光分子之數量，將樹枝狀聚合物濃度換算成螢光分子之濃度，基於螢光強度與螢光分子之濃度近似成正比例關係，計算螢光分子之濃度為0.1 μM或1 μM時之螢光強度。將所使用之試樣示於表22，將所得之結果示於圖26。
按照試驗例6之程序實施減弱活性評價。將所使用之試樣示於表22，將所得之結果示於圖27。
[表22]
試樣 cRGD-mPEG12-DGL4 cRGD-MP-DGL4 cRGD-TP-DGL4
對應實施例 1 37 38
樹狀聚合物 DGL G4 DGL G4 DGL G4
寡核酸 Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA Atp5b-siRNA
寡核酸之數量 35.5 14.2 16.8
親水性連接子 PEG5k PEG5k PEG5k
細胞內化促進劑 cRGDfK cRGDfK cRGDfK
細胞內化促進劑之數量 25.4 28.8 28.3
螢光分子 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546 AlexaFluor 546
螢光分子之數量 16.9 10.1 11.4
封端劑 甲基-PEG12 嗎啉基 硫代嗎啉基
＜試驗例17.經具有質子化能力之封端劑修飾之樹狀聚合物之pH敏感性之評價＞ 對試樣添加純水，將各試樣之樹枝狀聚合物濃度調整成8.2 μM。又，使6-(對甲苯胺基)-2-萘磺酸鈉鹽(TNS，Sigma-Aldrich公司製造)溶解於DMSO，製備2 mg/mL之TNS溶液。於各試樣12.4 μL中添加pH值4.5、5.5、6.5或7.5之10 mM檸檬酸-20 mM磷酸緩衝生理鹽水487 μL，進而添加TNS溶液5 μL，劇烈攪拌。於96孔培養盤中添加各混合液，每種混合液各3孔，每孔150 μL，其後測定螢光強度(激發波長325 nm、螢光波長435 nm)。用各pH值下之螢光強度除以pH值7.5下之螢光強度，計算相對螢光強度。將所使用之試樣示於表23，將所得之結果示於圖28。
[表23]
試樣 mPEG12-DGL4 MP-DGL4 TP-DGL4
參考例 5 3 4
樹狀聚合物 DGL G4 DGL G4 DGL G4
親水性連接子 mPEG2k mPEG2k mPEG2k
封端劑 甲基-PEG12 嗎啉基 硫代嗎啉基
[產業上之可利用性]
本發明之一態樣之寡核酸共軛物能夠提高寡核酸向細胞質內之遞送量，因此能夠用作用以治療或預防疾病之醫藥組合物或者醫藥。
1:寡核酸 2:細胞內化促進劑 3:親水性連接子 4:封端劑 5:連接子 10:中心 20:水合層 100:寡核酸共軛物
圖1之(A)及圖1之(B)係寡核酸共軛物之一態樣之模式圖，圖1之(B)中示出形成於親水性連接子周圍之水合層。 圖2係圖示體外之中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含cRGD之寡核酸共軛物之入胞行為之圖表。 圖3係圖示體外之中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含cRGD之寡核酸共軛物之基因減弱之圖表。 圖4係圖示體外之中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含cRGD之寡核酸共軛物之核酸序列特異性基因減弱之圖表。 圖5係圖示體外之中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含GE11之寡核酸共軛物之入胞行為之圖表。 圖6係圖示體外之中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含GE11之寡核酸共軛物之基因減弱之圖表。 圖7係圖示體外之中心採用PAMAM的包含cRGD之寡核酸共軛物之入胞行為之圖表。 圖8係圖示體外之中心採用PAMAM的包含cRGD之寡核酸共軛物之基因減弱之圖表。 圖9係圖示體外之中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含cRGD之寡核酸共軛物之cRGD修飾數與入胞量之比較之圖表。 圖10係圖示體外之中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含cRGD之寡核酸共軛物之cRGD修飾數與基因減弱之比較之圖表。 圖11係圖示體外之中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含c(avb6)之寡核酸共軛物之入胞行為之圖表。 圖12係圖示體外之中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含c(avb6)之寡核酸共軛物之基因減弱之圖表。 圖13係圖示體外之中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含葉酸之寡核酸共軛物之入胞行為之圖表。 圖14係圖示體外之中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含核仁素適體(nucleolin aptamer)之寡核酸共軛物之入胞行為之圖表。 圖15係圖示體外之中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含核仁素適體之寡核酸共軛物之基因減弱之圖表。 圖16係圖示體外之中心採用不同代數聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含cRGD之寡核酸共軛物之入胞行為之比較之圖表。 圖17係圖示體外之中心採用不同代數聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含cRGD之寡核酸共軛物之基因減弱之比較之圖表。 圖18係圖示體外之作為親水性連接子之PEG之分子量為2k、3.4k或5k且中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含cRGD之寡核酸共軛物之入胞行為之比較之圖表。 圖19係圖示體外之作為親水性連接子之PEG之分子量為5k或10k且中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含cRGD之寡核酸共軛物之入胞行為之比較之圖表。 圖20係圖示體外之具有pMeOx10k作為親水性連接子且中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含cRGD之寡核酸共軛物之入胞行為之圖表。 圖21係圖示體外之具有pMeOx10k作為親水性連接子且中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含cRGD之寡核酸共軛物之基因減弱之圖表。 圖22係圖示體外之具有pSar10k作為親水性連接子且中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含cRGD之寡核酸共軛物之入胞行為之圖表。 圖23係圖示體外之具有pSar10k作為親水性連接子且中心採用第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含cRGD之寡核酸共軛物之基因減弱之圖表。 圖24係圖示體外之中心採用經不同封端劑修飾之第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含cRGD之寡核酸共軛物之入胞行為之比較之圖表。 圖25係圖示體外之中心採用經不同封端劑修飾之第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含cRGD之寡核酸共軛物之基因減弱之比較之圖表。 圖26係圖示體外之中心採用經具有質子化能力之封端劑修飾之第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含cRGD之寡核酸共軛物之入胞行為之比較之圖表。 圖27係圖示體外之中心採用經具有質子化能力之封端劑修飾之第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物的包含cRGD之寡核酸共軛物之基因減弱之比較之圖表。 圖28係圖示經具有質子化能力之封端劑修飾之第四代聚離胺酸樹枝狀接枝物之pH敏感性之比較之圖表。 

          <![CDATA[<110>  日商大日本住友製藥股份有限公司(SUMITOMO DAINIPPON PHARMA CO., LTD.)]]>
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1:寡核酸
2:細胞內化促進劑
3:親水性連接子
4:封端劑
5:連接子
10:中心
20:水合層
100:寡核酸共軛物

Claims (42)

  1. 一種寡核酸共軛物，其包含樹狀聚合物、複數個寡核酸、一個或複數個細胞內化促進劑、及一個或複數個親水性連接子， 各寡核酸直接或經由連接子結合於上述樹狀聚合物， 各細胞內化促進劑經由上述親水性連接子結合於上述樹狀聚合物。
  2. 如請求項1之寡核酸共軛物，其中上述樹狀聚合物與上述寡核酸之結合、上述樹狀聚合物與上述親水性連接子之結合、上述樹狀聚合物與上述連接子之結合、上述細胞內化促進劑與上述親水性連接子之結合、及上述連接子與上述寡核酸之結合為共價結合、金屬配位或賓主相互作用。
  3. 如請求項1之寡核酸共軛物，其中上述樹狀聚合物與上述寡核酸之結合、上述樹狀聚合物與上述親水性連接子之結合、上述樹狀聚合物與上述連接子之結合、上述細胞內化促進劑與上述親水性連接子之結合、及上述連接子與上述寡核酸之結合為共價結合或金屬配位。
  4. 如請求項1之寡核酸共軛物，其中上述樹狀聚合物與上述寡核酸之結合、上述樹狀聚合物與上述親水性連接子之結合、上述樹狀聚合物與上述連接子之結合、上述細胞內化促進劑與上述親水性連接子之結合、及上述連接子與上述寡核酸之結合為共價結合。
  5. 如請求項1至4中任一項之寡核酸共軛物，其中上述樹狀聚合物之反應性官能基之至少一部分被封端劑封端。
  6. 如請求項5之寡核酸共軛物，其中上述封端劑為選自由親水性分子及疏水性分子所組成之群中之1種以上之分子。
  7. 如請求項6之寡核酸共軛物，其中上述封端劑為親水性分子。
  8. 如請求項6之寡核酸共軛物，其中上述封端劑為選自由電中性親水性分子、酸性條件下質子化之極性分子、陰離子性分子及陽離子性分子所組成之群中之1種以上之親水性分子。
  9. 如請求項6之寡核酸共軛物，其中上述封端劑為選自由電中性親水性分子、酸性條件下質子化之極性分子、及陰離子性分子所組成之群中之1種以上之親水性分子。
  10. 如請求項6之寡核酸共軛物，其中上述封端劑為疏水性分子。
  11. 如請求項6之寡核酸共軛物，其中上述封端劑為選自由脂肪族化合物、芳香族化合物、三烷基胺及類固醇所組成之群中之1種以上之分子。
  12. 如請求項6之寡核酸共軛物，其中上述封端劑為脂肪族化合物。
  13. 如請求項1至12中任一項之寡核酸共軛物，其中上述樹狀聚合物為樹枝狀接枝物或樹枝狀聚合物。
  14. 如請求項1至12中任一項之寡核酸共軛物，其中上述樹狀聚合物中之單體彼此經由醯胺鍵、酯鍵或糖苷鍵結合。
  15. 如請求項1至12中任一項之寡核酸共軛物，其中上述樹狀聚合物中之單體彼此經由醯胺鍵或酯鍵結合。
  16. 如請求項1至12中任一項之寡核酸共軛物，其中上述樹狀聚合物為聚-L-離胺酸樹枝狀接枝物、聚醯胺胺樹枝狀聚合物、或2,2-雙(羥基甲基)丙酸樹枝狀聚合物。
  17. 如請求項1至16中任一項之寡核酸共軛物，其中上述寡核酸為基因表現控制劑。
  18. 如請求項17之寡核酸共軛物，其中上述基因表現控制劑為抑制mRNA之表現之分子。
  19. 如請求項17之寡核酸共軛物，其中上述基因表現控制劑為RNA干擾誘導核酸或反義核酸。
  20. 如請求項1至19中任一項之寡核酸共軛物，其中各親水性連接子之末端間直線距離之平均值為上述寡核酸之長度的五分之一以上。
  21. 如請求項1至19中任一項之寡核酸共軛物，其中各親水性連接子之末端間直線距離之平均值為上述寡核酸之長度的四分之一以上。
  22. 如請求項1至19中任一項之寡核酸共軛物，其中各親水性連接子之末端間直線距離之平均值為上述寡核酸之長度的三分之一以上。
  23. 如請求項1至19中任一項之寡核酸共軛物，其中各親水性連接子之末端間直線距離之平均值為上述寡核酸之長度的五分之二以上。
  24. 如請求項1至19中任一項之寡核酸共軛物，其中各親水性連接子之末端間直線距離之平均值為上述寡核酸之長度的一半以上。
  25. 如請求項1至24中任一項之寡核酸共軛物，其中上述親水性連接子為選自由聚乙二醇、聚(2-烷基-2-㗁唑啉)、多肽及聚類肽所組成之群中之1種以上之親水性連接子。
  26. 如請求項1至24中任一項之寡核酸共軛物，其中上述親水性連接子為選自由聚乙二醇、聚(2-甲基-2-㗁唑啉)、EK肽及聚肌胺酸所組成之群中之1種以上之親水性連接子。
  27. 如請求項1至26中任一項之寡核酸共軛物，其中上述細胞內化促進劑為選自由低分子配體、多肽、適體、抗體或其片段、糖鏈及脂質所組成之群中之1種以上之細胞內化促進劑。
  28. 如請求項1至26中任一項之寡核酸共軛物，其中上述細胞內化促進劑為低分子配體。
  29. 如請求項1至26中任一項之寡核酸共軛物，其中上述細胞內化促進劑為多肽。
  30. 如請求項1至26中任一項之寡核酸共軛物，其中上述細胞內化促進劑為適體。
  31. 如請求項1至26中任一項之寡核酸共軛物，其中上述細胞內化促進劑為抗體或其片段。
  32. 如請求項1至26中任一項之寡核酸共軛物，其中上述細胞內化促進劑為糖鏈。
  33. 如請求項1至26中任一項之寡核酸共軛物，其中上述細胞內化促進劑為脂質。
  34. 一種醫藥組合物，其含有如請求項1至33中任一項之寡核酸共軛物作為有效成分。
  35. 一種針對選自由先天性代謝異常症、先天性內分泌疾病、單基因疾病、神經退化性疾病、神經疾病、肌肉疾病、腦膜炎、腦炎、腦病、溶酶體貯積病、惡性贅生物、纖維化症、炎症性疾病、免疫缺乏疾病、自體免疫疾病及感染症所組成之群中之疾病之治療劑或預防劑，其含有如請求項1至33中任一項之寡核酸共軛物作為有效成分。
  36. 一種用於治療及/或預防選自由先天性代謝異常症、先天性內分泌疾病、單基因疾病、神經退化性疾病、神經疾病、肌肉疾病、腦膜炎、腦炎、腦病、溶酶體貯積病、惡性贅生物、纖維化症、炎症性疾病、免疫缺乏疾病、自體免疫疾病及感染症所組成之群中之疾病之方法，其包括投予治療上有效量之如請求項1至33中任一項之寡核酸共軛物。
  37. 一種如請求項1至33中任一項之寡核酸共軛物之用途，其用於製造針對選自由先天性代謝異常症、先天性內分泌疾病、單基因疾病、神經退化性疾病、神經疾病、肌肉疾病、腦膜炎、腦炎、腦病、溶酶體貯積病、惡性贅生物、纖維化症、炎症性疾病、免疫缺乏疾病、自體免疫疾病及感染症所組成之群中之疾病之治療劑及/或預防劑。
  38. 如請求項1至33中任一項之寡核酸共軛物，其用於治療及/或預防選自由先天性代謝異常症、先天性內分泌疾病、單基因疾病、神經退化性疾病、神經疾病、肌肉疾病、腦膜炎、腦炎、腦病、溶酶體貯積病、惡性贅生物、纖維化症、炎症性疾病、免疫缺乏疾病、自體免疫疾病及感染症所組成之群中之疾病。
  39. 一種醫藥，其包含如請求項1至33中任一項之寡核酸共軛物、與 針對疾病之1種以上之治療劑及/或1種以上之預防劑的組合， 上述疾病選自由先天性代謝異常症、先天性內分泌疾病、單基因疾病、神經退化性疾病、神經疾病、肌肉疾病、腦膜炎、腦炎、腦病、溶酶體貯積病、惡性贅生物、纖維化症、炎症性疾病、免疫缺乏疾病、自體免疫疾病及感染症所組成之群。
  40. 一種寡核酸共軛物，其係如請求項1至33中任一項之寡核酸共軛物，用於與針對疾病之1種以上之治療劑及/或1種以上之預防劑併用而治療疾病， 上述疾病選自由先天性代謝異常症、先天性內分泌疾病、單基因疾病、神經退化性疾病、神經疾病、肌肉疾病、腦膜炎、腦炎、腦病、溶酶體貯積病、惡性贅生物、纖維化症、炎症性疾病、免疫缺乏疾病、自體免疫疾病及感染症所組成之群。
  41. 一種如請求項1至33中任一項之寡核酸共軛物之製造方法，其包括如下步驟：使複數個寡核酸及一個或複數個親水性連接子與樹狀聚合物結合；以及 使細胞內化促進劑與各親水性連接子結合。
  42. 如請求項41之寡核酸共軛物之製造方法，其進而包括如下步驟：使封端劑與上述樹狀聚合物結合。
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