JP2010501039A - デンドリマー並びにその製造及び使用方法 - Google Patents

Abstract

多面体シルセスキオキサンに由来するデンドリマー及びその製造／使用方法が本明細書に記載される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００６年８月１７日に出願された米国仮出願第６０／８２２６７１号の優先権を主張する。この出願は、その教示内容全部に関して全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

謝辞
本発明につながる研究は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、助成第Ｒ０１ ＣＡ０９７４６５号によって一部資金供給された。米国政府は、本発明における一定の権利を有し得る。

しばらく前から、ケイ素は、材料の熱的及び機械的特性を強化するために材料に組み込まれた。その化学的不活性及び生体適合性のため、シリカをベースとする材料は、生物医学装置に広く使用されている。特に、多面体オリゴマーシルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）ケージは、人気が高いケイ素添加剤である。かつて副産物と考えられたが、ＰＯＳＳケージは、今やセラミックス並びに高度に多孔質の材料の作製に使用される。ＰＯＳＳケージの用途は、表面触媒、外科用器具のコーティング及び血管ステントを含むように拡大した。

多面体オリゴマーシルセスキオキサンコアから成長したデンドリマーは、二次元コアを有する従来のデンドリマーに対して幾つもの利点を有する。立方ＰＯＳＳの場合に、ＰＯＳＳコアは、２つの求核アミンを有する二次元コア、例えばエチレンジアミンと対照的に、デンドリマー分岐が分岐して成長し、三次元的に成長することを可能にする、８つの官能部位を有する。立方ＰＯＳＳコアから成長したデンドリマーは、低世代で球状形態を示し、それは表面基の過密状態を取り除き、かつ追加の世代の共役効率を改善する。反対に立体的に込み合った表面のために、欠陥の数は、二次元デンドリマーに関して高世代で増加する。

多面体オリゴマーシルセスキオキサンコアに由来する新規なデンドリマーが、本明細書に記載される。デンドリマーは、剛性のために高い共役効率を示し、かつ小型の離散した球状形態をなおも維持しながら、膨大な数の官能性と更に共役する。

多面体シルセスキオキサンに由来するデンドリマー及びその製造／使用方法が本明細書に記載される。本発明の利点は、部分的に以下に続く説明に示され、かつ部分的に説明から見て明白であるか、又は下記の態様の実施によって習得できる。下記の利点は、添付の請求項に特に指摘された要素及び組み合わせによって実現及び達成される。前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方とも専ら代表的かつ説明用であり、かつ限定的でないことが理解されるべきである。

本明細書に組み込まれ、かつその一部を構成する添付図面は、下記の幾つかの態様を示す。

立方オクタ（３−アミノプロピル）シルセスキオキサンケージの構造を示す。 ポリ−Ｌ−リシンオクタ（３−アミノプロピル）シルセスキオキサンデンドリマーの世代４のナノ骨格を示す。 ポリ−Ｌ−リシンオクタ（３−アミノプロピル）シルセスキオキサンデンドリマー調製のための合成スキームを示す。 室温でのＤ_２Ｏ中のＧ_１からＧ_４デンドリマーの４００ＭＨｚでの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。 室温でのＤ_２Ｏ中のＧ_１からＧ_４の４００ＭＨｚでの^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。 Ｇ_１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。 Ｇ_２のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。 Ｇ_３のＥＳＩ質量スペクトルを示す。 Ｇ_４のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。 （Ａ）Ｇ_４デンドリマー及びプラスミドＤＮＡのゲル電気泳動アッセイ（Ｎ／Ｐ比は、各ウェルの上に標識を付す）と、（Ｂ）Ｇ_４デンドリマー及びプラスミドＤＮＡによって形成されたナノ粒子のＴＥＭ画像（スケールバーは、５０ｎｍを示す）を示す。 Ｎ／Ｐ比４０でＧ３−［ＦＩＴＣ］_２−［ＮＨ_２］_６２／ＤＮＡポリプレックスによるインキュベーション後４時間で獲得されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の通常光画像（左）及び蛍光（右）画像を示す。 ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＳＦ）をＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞中の対照とする、異なるＮ／Ｐ比での球状デンドリマーのインビトロトランスフェクション効率を示す。 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞中のＦＩＴＣ標識Ｇ３リシン球状デンドリマー及びＣｙ３標識ｓｉＲＮＡの錯体の細胞取り込みを示す共焦点顕微鏡画像を示す。 ＭＲＩ造影剤としてのＧｄ−ＤＯ３Ａ Ｌ−リシン ＯＡＳデンドリマーコンジュゲートの概略合成手順を示す。 世代３ナノ小球（ｎａｎｏｇｌｏｂｕｌｅ）ＭＲＩ造影剤の構造を示す。 世代１〜３ナノ小球ＭＲＩ造影剤；ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムのサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）スペクトルを示す。 体重１ｋｇ当り０．０３ｍｍｏｌのＧｄの用量で世代（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）１〜３ナノ小球ＭＲＩ造影剤の静脈注射後、２分（２−ｍｉｎ）、５分（５−ｍｉｎ）、１０分（１０−ｍｉｎ）、１５分（１５−ｍｉｎ）、３０分（３０−ｍｉｎ）、６０分（６０−ｍｉｎ）、１２０分（１２０−ｍｉｎ）のマウスの３Ｄ ＭＩＰ ＭＲ画像を示す。Ｐｒｅ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、注射前。 体重１ｋｇ当り０．０１ｍｍｏｌのＧｄの用量で世代３ナノ小球ＭＲＩ造影剤の静脈注射後、２分（２−ｍｉｎ）、５分（５−ｍｉｎ）、１０分（１０−ｍｉｎ）、１５分（１５−ｍｉｎ）、３０分（３０−ｍｉｎ）、６０分（６０−ｍｉｎ）、１２０分（１２０−ｍｉｎ）のＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片を持つマウスの３Ｄ ＭＩＰ ＭＲ画像（上部）及び２Ｄ軸方向腫瘍画像（下部）を示す。Ｐｒｅ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、注射前。 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（Ｎ＝３）中のＧ_１〜Ｇ_４のナノ小球、並びにＯＡＳコア及びポリ−Ｌ−リシン（１０ｋＤａ）のＭＴＴ細胞毒性アッセイを示す。

現在の化合物、組成物及び／又は方法が開示及び記載される前に、後述の態様は、それが当然に変化し得るので、具体的な化合物、合成方法又は用途に限定されないことが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語が、特定の態様のみを記載するためのものであり、限定することが意図されないことも理解されるべきである。

本明細書及び以下に続く請求項において、多数の用語が参照されるが、それらは以下の意味を有するように定義されるものとする。

明細書及び添付の請求項で使用されるような、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明瞭に別段の指図をしない限り、複数の指示対象を含むことに注目すべきである。従って、例えば「薬剤担体」の参照は、２種以上のかかる担体の混合物を含む、等である。

「任意の」又は「任意に」は、その後に記載される事象又は状況が、起こり得るか、起こり得ないこと、及び記載が、事象又は状況が起こる場合、及びそれが起こらない場合を含むことを意味する。例えば、語句「任意に置換された低級アルキル」は、低級アルキル基が置換され得る、又は置換され得ないこと、及び記載が、非置換低級アルキル及び置換がある低級アルキルの両方を含むことを意味する。

明細書及び結び請求項における組成物又は物品中の特定の要素又は成分の重量部の参照は、重量部が表現される組成物又は物品中の要素又は成分と、他のいずれかの要素又は成分との間の重量関係を表す。従って、２重量部の成分Ｘと、５重量部の成分Ｙとを含有する化合物中に、Ｘ及びＹは、２：５の重量比で存在し、かつ追加の成分が化合物中に含有されるか否かにかかわらず、かかる比で存在する。

成分の重量パーセントは、具体的に反対の定めがない限り、成分が含まれる製剤又は組成物の総重量に基づく。

本明細書及び結びの請求項に使用するような、化学種の残基は、特定の反応スキームにおける化学種の結果として生じる生成物、又はその後の製剤若しくは化学生成物である部分を、その部分が実際に化学種から得られたか否かにかかわらず、指す。例えば、少なくとも１つの−ＯＨ基を含有する多面体シルセスキオキサンは、式Ｚ−ＯＨ（式中、Ｚはシルセスキオキサンの残部（すなわち残基）である）で表すことができる。

本明細書で使用するような、用語「アルキレン基」は、相互に結合された２つ以上のＣＨ_２基を有する基である。アルキレン基は、式−（ＣＨ_２）_ｎ−（式中、ｎは２から２５の整数である）によって表すことができる。

本明細書で使用するような、用語「芳香族基」は、ベンゼン、ナフタレン等を含むが、それらに限定されないいずれかの炭素ベースの芳香族基である。用語「芳香族化合物」は、芳香族基の環中に組み込まれる少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香族基と定義される「ヘテロアリール基」も含む。ヘテロ原子の例には、窒素、酸素、硫黄及びリンを含むが、それらに限定されない。アリール基は、置換されても、又は非置換であっても良い。アリール基は、アルキル、アルキニル、アルケニル、アリール、ハロゲン化物、ニトロ、アミノ、エステル、ケトン、アルデヒド、ヒドロキシ、カルボン酸又はアルコキシを含むが、それらに限定されない１つ以上の基によって置換できる。

本明細書で使用するような、用語「エーテル基」は、式−［（ＣＨＵ）_ｎＯ］_ｍ−（式中、Ｕは水素又は低級アルキル基であり、ｎは１から２０の整数であり、かつｍは１から１００の整数である）を有する基である。

本明細書で使用するような、用語「チオエーテル基」は、式−［（ＣＨＵ）_ｎＳ］_ｍ−（式中、Ｕは水素又は低級アルキル基であり、ｎは１から２０の整数であり、かつｍは１から１００の整数である）を有する基である。

本明細書で使用するような、用語「イミノ基」は、式−［（ＣＨＵ）_ｎＮＵ］_ｍ−（式中、各Ｒは独立して水素又は低級アルキル基であり、ｎは１から２０の整数であり、かつｍは１から１００の整数である）を有する基である。

本明細書で使用するような、用語「ペプチド基」は、複数の天然及び／又は非天然アミノ酸間の反応によってに生成される基である。

本出願を通して使用するＲ、Ｕ、Ｘ、Ｙ、ｎ、ｍ、ｐ、ｑ及びｒのような変数は、反対の定めがない限り、以前に定義されたものと同じ変数である。

Ｉ．デンドリマー及びその製造方法
多面体シルセスキオキサンに由来するデンドリマーが、本明細書に記載される。デンドリマーは、その独特な構造及び官能基のために、広範囲に研究された。デンドリマーは、一般的にコア材料から製造される。本明細書に記載する、デンドリマーを生成するために使用されるコア材料は、「多面体シルセスキオキサン」である。多面体シルセスキオキサンは、第１世代デンドリマーを生成するために化合物と反応する。この化合物は、本明細書において「デンドリマーアーム前駆体」と呼ばれる。第１世代デンドリマーは、コアに取り付けられた１つ以上の「分岐」を有する。第２世代デンドリマーは、同じ又は異なるデンドリマーアーム前駆体を、第１世代デンドリマーの分岐と反応させることによって形成できる。第３、第４、第５世代等を生成するために、同様の反応が実行できる。

一態様において、デンドリマーは、リンカーが第１デンドリマーアーム前駆体を有する少なくとも１つの反応基を含み、第１デンドリマーアーム前駆体が３つ以上の官能基を含み、第１デンドリマーアーム前駆体上の少なくとも１つの官能基が第１世代デンドリマーを生成するためにリンカー上の反応基と反応できる、リンカー修飾多面体シルセスキオキサンを反応させることを含む方法によって製造される。

もう１つの態様において、デンドリマーアームが少なくとも２つの官能基を含む、多面体シルセスキオキサンを含むコアと、多面体シルセスキオキサンに共有結合した複数のリンカーと、リンカーに共有結合した複数のデンドリマーアームとを含むデンドリマーが本明細書に記載される。

リンカー修飾多面体シルセスキオキサンは、シルセスキオキサンに共有結合したリンカーを有する多面体シルセスキオキサンである。リンカー修飾多面体シルセスキオキサンは、三官能性有機ケイ素単量体の加水分解縮合によって容易に調製できる。参照によって組み込まれる、米国特許第５０４７４９２及び６９２７２７０号に開示された技術、並びに米国公開出願第２００６／００４０１０３号に開示されたそれは、本明細書において有用なリンカー修飾多面体シルセスキオキサンを製造するために使用できる。これらの特許及び公開出願に開示されたリンカー修飾多面体シルセスキオキサンも、本明細書で使用できる。

一実施態様において、リンカー修飾シルセスキオキサンは、式（ＲＳｉＯ_１．５）_ｐ（式中、Ｒはリンカーの残基を含み、かつｐは６、８、１０又は１２である）を含む。もう１つの実施態様において、リンカー修飾シルセスキオキサンは、Ｒ_８Ｓｉ_８Ｏ_１２（式中、Ｒはリンカーの残基を含む）である。この多面体シルセスキオキサン群は、Ｔ_８ケージとも呼ばれる。

リンカー修飾シルセスキオキサンのリンカーは、１つ以上の異なる反応基を持つ種々の異なる基であっても良い。一態様において、リンカーは、少なくとも１つの反応基を含むアルキレン基、エーテル基、芳香族基、ペプチド基、チオエーテル基又はイミノ基を含む。リンカーが、リンカー修飾多面体シルセスキオキサン中で同じ又は異なっても良いことが検討される。

リンカーは、１つ以上の反応基を持つ。反応基は、デンドリマーアーム前駆体上に存在する官能基と反応する時に共有結合を形成できる基である。反応基が、各リンカー上で同じ又は異なっても良いことが検討される。一態様において、反応基は、求電子基又は求核基であっても良い。当該技術分野において公知の技術を使用して、求電子基が求核基に変換できること及びその逆の場合が検討される。一態様において、リンカーは、１つ以上の求核基を含み、ここで求核基はヒドロキシル基、チオール基又は置換若しくは非置換アミンを含む。もう１つの態様において、リンカーは、１つ以上の求電子基を含む。求電子基の例には、ハロゲン、カルボキシル基、エステル基、ハロゲン化アシル基、スルホン酸基又はエーテル基を含むが、それらに限定されない。一態様において、リンカー修飾多面体シルセスキオキサンは、式（ＲＳｉＯ_１．５）_ｐ［式中、ｐは６、８、１０又は１２であり、Ｒは−（ＣＨ_２）_ｑＹ（式中、ｑは１から１０であり、かつＹは求電子基を含み、ここで求電子基は、ハロゲン（例えばＣｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆ）、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）、エステル基（例えばＣＯＯＭｅ、ＣＯＯＥｔ）、ハロゲン化アシル基（例えばＣＯＣｌ）、スルホン酸基（例えばｐ−トルエンスルホン酸基又はｐ−ブロモベンゼンスルホン酸基）、電子不足芳香族基（例えばＯ−Ｃ_６Ｈ_４−ＮＯ_２）又はエーテル基を含む）を含む］を有する。

一態様において、リンカー修飾シルセスキオキサンは、Ｒ_８Ｓｉ_８Ｏ_１２（式中、Ｒは−（ＣＨ_２）_ｒＸＨを含み、ｒは１から１０であり、かつＸはＯ、Ｓ又はＮＨである）である。もう１つの態様において、リンカー修飾シルセスキオキサンは、Ｒ_８Ｓｉ_８Ｏ_１２（式中、各Ｒは−（ＣＨ_２）_３ＮＨ_２を含む）である。図１を参照すると、この立方ナノ粒子は、８つのケイ素原子の各々に取り付けられたプロピルアミン官能基によって囲まれるシロキサンコアを有する。コア体積は、約６Å^３であり、直径が約１ｎｍである。これらの立方ナノ粒子は、種々の環境で安定しており、かつ高いインビボ安定性を示す。

リンカー上に存在する１つ以上の官能基は、第１世代デンドリマーを生成するために、第１デンドリマーアーム前駆体と反応できる。第１デンドリマーアーム前駆体が同じ化合物又は異なる化合物であっても良いことが検討される。本明細書で使用されるデンドリマーアーム前駆体は、少なくとも３つの官能基を含む。用語「官能基」は、リンカー上に存在する反応基と共有結合を形成できるいずれかの基として定義される。官能基の選択は、リンカー上の反応基の同一性によって異なり得る。例えば、反応基が求電子性ならば、デンドリマーアーム前駆体上に存在する官能基の１つは、求核性である。一態様において、第１デンドリマーアーム前駆体は、３つの官能基を含み、ここで官能基は、１つの求電子基及び２つ以上の求核基を含む。もう１つの態様において、第１デンドリマーアーム前駆体は、３つの官能基を含み、ここで官能基は、１つの求核基及び２つ以上の求電子基を含む。

一態様において、デンドリマーアーム前駆体は、少なくとも３つの官能基を含むアルキレン化合物、エーテル化合物、芳香族化合物又はチオエーテル化合物を含む。一態様において、第１デンドリマーアーム前駆体は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、又は以下に定義するようなアミノ酸の医薬上許容し得る塩若しくはエステルを含み、ここでアミノ酸は、３つの官能基を含む。幾つかのアミノ酸は、カルボン酸基（求電子試薬）及び２つのアミノ基（求核試薬）を含む。かかる天然アミノの例には、リシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、４−ヒドロキシプロリン（４−ｈｙｄｒｏｐｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンを含む。非天然アミノ酸も、検討される。アミノ酸誘導体は、例えばアルキル基との、アミノ基の置換を含むことができる。第１デンドリマーアーム前駆体が、アミノ酸、アミノ酸誘導体、又は以下に定義するようなアミノ酸の医薬上許容し得る塩若しくはエステルを含み、ここでアミノ酸が、２つの官能基を含むことも検討される。かかるアミノ酸の例には、グリシン及び３−アミノプロピオン酸を含む。

リンカー修飾多面体シルセスキオキサン及びデンドリマーアーム前駆体の間の反応は、当該技術分野において公知の技術を使用して行うことができる。リンカー修飾多面体シルセスキオキサンは、中性であるか、又は対応する塩として使用できる。溶剤及び反応パラメータの選択は、出発原料の選択によって異なる。デンドリマーアーム前駆体の量もまた、変化できる。ある態様において、リンカー上に存在する反応基全部がデンドリマーアーム前駆体と反応するように、過剰のデンドリマーアーム前駆体を使用することが望ましい。

一態様において、第１世代デンドリマーは、式Ｒ_８Ｓｉ_８Ｏ_１２（式中、各Ｒは−（ＣＨ_２）_３ＮＨ_２である）を有するリンカー修飾シルセスキオキサンを、リシンを含む第１デンドリマーアーム前駆体と反応させることによって製造できる。この態様において、デンドリマーアーム前駆体との８つのアミンの共役は、比較的良好な収率で８つの等価基を有する骨格をもたらし、それは追加の官能性と更に反応できる。図３を参照すると、第１世代デンドリマーは、保護形状のリシンをリンカー修飾多面体シルセスキオキサンのアンモニウム塩と反応させ、その後にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって脱保護することにより生成される。

本明細書で生成される第１世代デンドリマーが、高世代デンドリマーを生成するために、その後に追加のデンドリマーアーム前駆体と反応できることが検討される。高世代デンドリマーは、第２世代以上のデンドリマーとして本明細書で定義される。一態様において、高世代デンドリマーは、第２世代デンドリマーから世代１０デンドリマーを含む。図３は、世代２、３及び４デンドリマーが生成される、本明細書に記載された一態様を描く。第１世代デンドリマーを生成する技術を使用して、デンドリマーアーム前駆体としてリシンとのその後のカップリング／脱保護が、世代２〜４デンドリマーを生成する。世代４デンドリマーの構造を、図２に描く。

少なくとも３つの反応基を有するデンドリマーアーム前駆体を使用する利点は、図２で見ることができる。図２に示すように、複数の官能基を有する高度分岐デンドリマーを生成することが可能である。デンドリマーアーム前駆体が、２つの官能基を有するだけであるならば、線状デンドリマーアームを生成することが可能なだけであり、分岐アームを生成することは可能でない。このことは、特にデンドリマー上の多数の官能基が望ましいならば、デンドリマーの使用を著しく限定し得る。後述するように、本明細書に記載された高度に官能化されたデンドリマーは、多数の医療用途を有する。

本明細書に記載されたデンドリマーのいずれも存在できるか、又はその塩に変換できる。一態様において、塩は、医薬上許容し得る塩である。塩は、適切な量の化学又は医薬上許容し得る塩基で遊離酸を処理することによって調製できる。代表的な化学又は医薬上許容し得る塩基は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化亜鉛、水酸化銅、水酸化アルミニウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、リシン、アルギニン、ヒスチジン等である。一態様において、反応は、室温のような約０℃から約１００℃の温度で、不活性の水混和性有機溶剤と組み合わせて、又は単独で水中で行われる。化合物の使用される塩基に対するモル比は、いかなる特定の塩にも望ましい比を提供するように選択される。例えば遊離酸出発原料のアンモニウム塩を調製するために、出発原料は、塩を産生するように約１当量の塩基によって処理できる。

もう１つの態様において、本明細書に記載されたデンドリマーのいずれもそのルイス塩基によって存在できるか、又は塩に変換できる。デンドリマーは、適切な量のルイス塩基によって処理できる。代表的なルイス塩基は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化亜鉛、水酸化銅、水酸化アルミニウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、リシン、アルギニン、ヒスチジン、ＴＨＦ、エーテル、チオール試薬、アルコール類、チオールエーテル、カルボン酸塩、フェノラート、アルコキシド、水等である。一態様において、反応は、室温のような約０℃から約１００℃の温度で、不活性の水混和性有機溶剤と組み合わせて、又は単独で水中で行われる。デンドリマーの使用される塩基に対するモル比は、いかなる特定の錯体にも望ましい比を提供するように選択される。例えば遊離酸出発原料のアンモニウム塩を調製するために、出発原料は、錯体を産生するように約１当量の化学又は医薬上許容し得るルイス塩基によって処理できる。

デンドリマーがカルボン酸基を持つならば、これらの基は、当該技術分野において公知の技術を使用して医薬上許容し得るエステルに変換できる。あるいは、エステルがデンドリマー上に存在するならば、エステルは、エステル交換技術を使用して、医薬上許容し得るエステルに変換できる。

ＩＩ．使用方法
本明細書に記載されたデンドリマーは、多数の医療用途を有する。一態様において、本明細書に記載されたデンドリマーは、医薬品を被検者に送達するために使用できる。もう１つの態様において、本明細書に記載されたデンドリマーは、細胞及び組織に遺伝物質を送達するために遺伝子治療で使用できる。更なる態様において、デンドリマーは、化学療法剤を、かかる治療を必要とする被検者に送達するために使用できる。上記デンドリマー（世代１以上）のいずれも、生物活性剤の送達装置として使用できる。一態様において、生物活性剤は、デンドリマーに錯化できる。例えば、デンドリマーアーム上に存在する官能基は、デンドリマーが生物活性剤によって被検者に投与できるように、生物活性剤と相互作用できる。本明細書で定義するような用語「錯化した」は、デンドリマー及び生物活性剤の間の、いずれかのタイプの化学又は物理的相互作用を含む。例えば、相互作用は、共有又は非共有結合（例えば静電、水素結合、双極子間、イオン等）の形成を伴うことができる。生物活性剤を被検者に送達する方法は、一般的に本明細書に記載されたデンドリマーと細胞を接触させることを伴い、ここで生物活性剤は、デンドリマーに錯化される。接触ステップは、当該技術分野において公知の技術を使用して、インビトロ、インビボ又はエキソビボで実行できる。

一態様において、生理活性剤は、天然又は合成オリゴヌクレオチド、天然又は修飾／遮断ヌクレオチド／ヌクレオシド、核酸、天然又は修飾／遮断アミノ酸を含むペプチド、その抗体又は断片、ハプテン、生物学的リガンド、ウイルス、膜タンパク質、脂質膜又は小型医薬分子を含む。

一態様において、生理活性剤は、タンパク質であっても良い。例えばタンパク質は、ペプチド、タンパク質又はペプチドの断片、膜結合タンパク質又は核タンパク質を含むことができる。タンパク質は、いかなる長さであっても良く、かつ１つ以上のアミノ酸又はその変異体を含むことができる。タンパク質は、例えば分析前のプロテアーゼ消化によって断片化できる。分析するタンパク質試料は、試料の複雑さを減少させるために、分画又は分離を受けさせることもできる。断片化及び分画は、同じアッセイにおいて一緒に使用することもできる。かかる断片化及び分画は、タンパク質分析を簡略化し、かつ拡張できる。

一態様において、生物活性剤は、ウイルスである。ウイルスの例には、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、水疱瘡ウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７、ヒトヘルペスウイルス８、痘瘡ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、はしかウイルス、ポリオーマウイルス、ヒト渓谷熱ウイルス、西ナイルウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ、シンドビスウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型、ハンタウイルス、風疹ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型、ワクシニアウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ヒト免疫不全ウイルス２型、レンチウイルス、バキュロウイルス、アデノ随伴ウイルス、又はいずれかの菌株、又はその変異体を含むが、それらに限定されない。

一態様において、生物活性剤は、核酸を含む。核酸は、オリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）又はペプチド核酸（ＰＮＡ）であっても良い。本方法によって導入される関心対象の核酸は、それが自然に発生する細胞から得られた核酸、組み換え生成された核酸、又は化学合成された核酸のような、いかなる出所からの核酸であっても良い。例えば核酸は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ又は自然発生ＤＮＡのヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を有するように合成されたＤＮＡであっても良い。核酸は、核酸の変異又は変化形状（例えば少なくとも１つの核酸残基の変化、欠失、置換又は添加によって自然発生ＤＮＡと異なるＤＮＡ）又は自然に発生しない核酸であっても良い。

一態様において、核酸は、発現ベクター（例えばプラスミド又はウイルス由来ベクター）のようなベクター中に存在しても良い。もう１つの態様において、選択された核酸は、ゲノムＤＮＡに組み込まれ、かつ発現されるか、又は染色体外に留まる（すなわちエピソームとして発現される）ように細胞に導入できる。もう１つの態様において、ベクターは、染色体に組み込まれたベクターである。本明細書で有用な核酸は、線状又は円形であっても良く、かついかなる大きさであっても良い。一態様において、核酸は、一本又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであっても良い。

一態様において、核酸は、機能性核酸であっても良い。機能性核酸は、標的分子を結合する、又は特異反応に触媒作用を及ぼすような、具体的な機能を有する核酸分子である。機能性核酸分子は、以下のカテゴリーに分けることができるが、限定的であることは意図されない。例えば機能性核酸は、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成性分子、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ及び外部ガイド配列を含む。機能性核酸分子は、標的分子が持つ比活性の影響因子、阻害因子、修飾因子及び刺激因子の役割を果たすことができるか、又は機能性核酸分子は、他のいかなる分子からも独立しているデノボ活性を持つことができる。機能性核酸は、優性作用の合成遺伝要素（ＳＧＥ）を符号化する小型遺伝子断片、例えばそれらが由来する遺伝子の機能に干渉する分子（アンタゴニスト）又はかかる遺伝子の優性な構成的活性断片である分子（アゴニスト）であっても良い。ＳＧＥには、ポリペプチド、阻害アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、核酸おとり、及び小型ペプチドを含むが、それらに限定されない。参照により組み込まれる、米国特許公開第２００３／０２２８６０１号に開示された小型遺伝子断片及びＳＧＥライブラリが、本明細書で使用できる。

本方法の機能性核酸は、例えばアンチセンス若しくはおとり機構によって、又はタンパク質レベルでの干渉機構を通して阻害性であるポリペプチド、例えば天然タンパク質の優性阻害断片を符号化することによって、核酸レベルで内因性遺伝子の機能を阻害するように機能できる。あるいは、ある種の機能性核酸は、対応する内因性遺伝子の生物活性の少なくとも一部を保持し、かつ特定の場合に構成的に活性であっても良い、ポリペプチドを符号化することによって内因性遺伝子の機能を強化する（模倣することを含む）ように機能できる。

機能性核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又は炭水化物鎖のようないかなる巨大分子とも相互作用できる。多くの場合、機能性核酸は、標的分子及び機能性核酸分子間の配列相同性に基づき、他の核酸と相互作用するように設計される。他の状況において、機能性核酸分子及び標的分子間の特異的認識は、機能性核酸分子及び標的分子間に配列相同性に基づかず、むしろ特異的認識が起こることを可能にする三次構造の形成に基づく。

もう１つの態様において、標的薬剤は、少なくとも１つのデンドリマーアームに共有結合される。標的薬剤の例には、タンパク質、抗体又はペプチドを含むが、それらに限定されない。標的薬剤は、生物活性剤又は造影剤の細胞への送達を容易にできる。一態様において、標的薬剤は、化学療法剤又は核酸を細胞に送達するために使用できる。

もう１つの態様において、造影剤は、デンドリマー（例えばデンドリマーアームの１つ）に錯化できる。用語「造影剤」は、本明細書において、造影剤なしで細胞又は組織を視覚化することと比較した時、当該技術分野において公知の技術を使用して撮像又は見られる細胞又は組織の能力を増加又は強化するいずれかの作用剤又は化合物と定義される。造影剤は、デンドリマーに共有又は非共有結合できる。

一態様において、少なくとも１種のキレート剤は、デンドリマーアームに共有結合される。キレート剤は、造影剤と非共有結合（例えば錯体形成、静電、イオン、双極子間、ルイス酸／塩基相互作用）を形成できるいずれか作用剤である。キレート剤は、共有結合を形成するために、デンドリマーアーム上の１つ以上の官能基と反応できる基を持つことができる。例えば、デンドリマーアームがアミノ基を有するならば、アミノ基は、アミド結合を生成するためにキレート剤上のカルボキシル基と反応できる。

当該技術分野において公知の多数の異なるキレート剤が、本明細書で使用できる。一態様において、キレート剤は、造影剤と協調できる孤立電子対を有する少なくとも１つのヘテロ原子（例えば酸素、窒素、硫黄、リン）を含む非環状又は環状化合物を含む。非環状キレート剤の例には、エチレンジアミンを含む。環状キレート剤の例には、ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）又はその誘導体、１，４，７，１０−テトラアザドデカンテトラアセテート（ＤＯＴＡ）及びその誘導体、１，４，７，１０−テトラアザドデカン−１，４，７−トリアセテート（ＤＯ３Ａ）及びその誘導体、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）及びその誘導体、１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン四酢酸（ＴＲＩＴＡ）及びその誘導体、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）及びその誘導体、１，４，７，１０−テトラアザドデカンテトラメチルアセテート（ＤＯＴＭＡ）及びその誘導体、１，４，７，１０−テトラアザドデカン−１，４，７−トリメチルアセテート（ＤＯ３ＭＡ）及びその誘導体、Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラホスホネートメチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ＤＯＴＰ）及びその誘導体、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（メチレンメチルホスホン酸）（ＤＯＴＭＰ）及びその誘導体、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（メチレンフェニルホスホン酸）（ＤＯＴＰＰ）及びその誘導体を含む。用語「誘導体」は、本明細書においてキレート剤の対応する塩及びそのエステルと定義される。

当該技術分野において公知の造影剤が、本明細書で使用できる。一態様において、造影剤は、デノプティカル染料（ｄｅｎｏｐｔｉｃａｌ ｄｙｅ）、ＭＲＩ造影剤、ＰＥＴプローブ、ＳＰＥＣＴプローブ、ＣＴ造影剤又は超音波造影剤を含む。一態様において、磁気共鳴映像法で有用な造影剤には、Ｇｄ^＋３、Ｅｕ^＋３、Ｔｍ^＋３、Ｄｙ^＋３、Ｙｂ^＋３、Ｍｎ^＋２又はＦｅ^＋３イオン又は錯体を含む。もう１つの態様において、ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴ撮像で有用な造影剤には、^５５Ｃｏ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^４７Ｓｃ、^６６Ｇａ、^６８Ｇａ、^９０Ｙ、^９７Ｒｕ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^１０９Ｐｄ、^１５３Ｓｍ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅを含む。１種以上のキレート剤を有するデンドリマーへの造影剤の錯化は、定型的な技術を使用して実行できる。例えば、造影剤の塩は、溶剤中で溶解でき、かつデンドリマーと混合できる。

生物活性剤又は造影剤と錯化されるデンドリマーは、当該技術分野において公知の技術を使用して被検者に投与できる。例えば、医薬組成物が、生物活性／造影剤と錯化されて又は単独でデンドリマーによって調製できる。規定の場合での実際の好ましい量のデンドリマーが、利用される具体的な化合物、処方される特定の組成物、適用様式、並びに治療される特定の位置及び被検者に応じて異なることが認められるであろう。所与の宿主の用量は、例えば適切な従来の薬理学的手順によって、例えば対象化合物及び公知の作用剤の特異的活性の慣習的な比較によって、従来の考慮すべき事項を使用して決定できる。医薬化合物の用量を決定する技術分野において熟練した医師及び配合者なら、標準的な勧奨（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｂａｒｎｈａｒｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９９）に従って用量を決定することに問題はない。

本明細書に記載された医薬組成物は、生物系又は実体が許容できるいかなる賦形剤中にも処方できる。かかる賦形剤の例には、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液及び他の生理的平衡塩水溶液を含むが、それらに限定されない。非水性ビヒクル、例えば固定油、オリーブ油及びゴマ油のような植物油、トリグリセリド、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及びオレイン酸エチルのような注入可能な有機エステルも使用できる。他の有用な剤形には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランのような増粘剤を含む懸濁液を含む。賦形剤は、少量の添加剤、例えば等張性及び化学安定性を強化する物質も含むことができる。緩衝液の例には、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液及びトリス緩衝液を含み、他方で防腐剤の例にはチメロゾル（ｔｈｉｍｅｒｏｓｏｌ）、クレゾール、ホルマリン及びベンジルアルコールを含む。

薬剤担体は、当業者に公知である。それらは、最も典型的には滅菌水、食塩水及び生理的ｐＨでの緩衝化溶液のような溶液を含む、ヒトに投与するための標準的担体である。

薬剤送達を対象とする分子は、医薬組成物中に処方できる。医薬組成物には、選択の分子に加えて、担体、増粘剤、希釈液、緩衝液、防腐剤、界面活性剤等を含むことができる。医薬組成物は、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤等のような１種以上の活性成分も含むことができる。

医薬組成物は、局所的又は全身的治療が望ましいか、及び治療する領域に応じて多数の方法で投与できる。投与は、（眼科的、経膣的、直腸、鼻腔内を含む）局所的であっても良い。細胞を、本明細書に記載されたデンドリマーと接触させる場合に、細胞をインビボ又はエキソビボで接触させることが可能である。

投与用の製剤には、滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液及びエマルジョンを含む。非水溶担体の例には、食塩水及び緩衝化培地を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョン又は懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、開示された組成物及び方法の不随的使用のために必要ならば、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー、又は固定油を含む。静脈内ビヒクルは、開示された組成物及び方法の不随的使用のために必要ならば、流体及び栄養補液、（リンガーデキストロースをベースとするような）電解質補液等を含む。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガス等のような防腐剤及び他の添加剤は、同様に存在し得る。

局所投与用剤形には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐薬、スプレー、液体及び粉末を含むことができる。従来の薬剤担体、水性、粉末、又は油性基剤、増粘剤等が、必要又は望ましいことがある。

投薬は、治療する状態の重症度及び反応性によって決まるが、通常１日当たり１服以上であり、治療コースは、数日から数ヶ月，又は当業者が送達を停止すべきであると決定するまで続く。通常の技能を有する者は、最適投与量、投薬方法及び繰返し率を容易に決定できる。

本明細書に記載したデンドリマーは、細胞に生理活性剤を送達する際に効果的であり、それは多数の異なる疾患を治療又は予防するために最終的に使用できる。本明細書で使用される用語「治療する」は、疾患の症状を減少させる、又は疾患の症状が次第に悪化しないように症状を維持することと定義される。用語「治療する」は、特定の疾患と関連するいかなる症状の予防とも定義される。本明細書で使用されるような用語「有効量」は、被検者への投与後に被検者において疾患を治療するために十分なデンドリマー及び生物活性剤の量である。一態様において、本明細書に記載されたデンドリマーは、被検者において癌を治療又は予防するために、生理活性剤を送達するための担体として使用できる。異なるタイプの癌の例には、乳癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌、精巣癌、グリア芽腫、肉腫、骨肉腫、頭頚部癌及び皮膚癌を含むが、それらに限定されない。

他の態様において、本明細書に記載されたデンドリマーは、被検者中の細胞又は組織を撮像するために使用できる。一態様において、方法は、（１）本明細書に記載されたデンドリマーに共役した造影剤を被検者に投与すること、及び（２）造影剤を検出することを含む。方法は、正常細胞及び腫瘍細胞を撮像するために使用できる。肝臓、脾臓、心臓、腎臓、肺、食道、骨髄、リンパ節、リンパ管、神経系、脳、脊髄、毛細血管、胃、卵巣、膵臓、小腸及び大腸を含むが、それらに限定されない種々の異なる組織及び器官が、本明細書に記載された方法を使用して撮像できる。一旦細胞又は組織に組み込まれた造影剤を検出するための当該技術分野において公知の技術は、当該技術分野において公知である。例えば、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）は、造影剤を検出するために使用できる。その上、記載されたデンドリマーは、血管撮影法、プレチスモグラフィ、リンパ管撮影法、マンモグラフィ、癌診断並びに機能及び動的ＭＲＩを含むが、それらに限定されない種々の他の医療処置において不可欠なツールであり得る。

他の態様において、医薬品及び造影剤を有するデンドリマーは、被検者に同時に又は連続的に投与できる。例えば、錯化される医薬化合物を有する第１デンドリマーは、錯化される造影剤を有する第２デンドリマーと混合できる。第１及び第２デンドリマーは、同じ又は異なっていても良い。同じ又は異なる生物活性剤又は造影剤を有する２つ以上のデンドリマーの混合物が被検者に投与できることも検討される。

開示された組成物及び方法の与えられたいかなる特定の態様も、実施例で論じられる非多糖ベースの試薬を含む、本明細書に開示された具体的な実施例及び実施態様と容易に比較できることが理解される。かかる比較を実行することによって、各特定の実施態様の相対的効力が、容易に決定できる。特に好ましい組成物及び方法が、本明細書の実施例に開示され、かつこれらの組成物及び方法は、必ずしも限定的でないが、本明細書に開示された組成物及び方法のいずれによっても実行できることが理解される。

以下の実施例は、本明細書に記載され、かつ特許請求される化合物、組成物及び方法が、いかにして製造及び評価されるかという完全な開示及び記載を当業者に提供するように出され、かつ純粋に代表的であることが意図され、かつ発明者がその発明とみなすものの範囲を限定することが意図されない。数（例えば量、温度等）に関して正確さを確保にするために、努力がなされたが、若干の誤差及び偏向が、計上されるはずである。別段の指示のない限り、部は重量部であり、温度は℃又は周囲温度であり、かつ圧力は大気圧かその近くである。記載されたプロセスから得られる生成物純度及び収率を最適化するために使用できる、反応条件、例えば成分濃度、所望の溶剤、溶剤混合物、温度、圧力、並びに他の反応範囲及び条件の多数の変形及び組合せがある。かかるプロセス条件を最適化するために、妥当な、かつ定型的な実験のみが必要とされる。

材料及び方法。 デンドリマー調製のための全ての試薬及び溶剤は、更なる精製なしで使用された。Ｄ_２Ｏは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｎｃｌｏｖｅｒ， ＭＡ）から購入した。オクタ（３−アミノプロピル）シルセスキオキサンＨＣｌ（ＯＡＳ）−ＨＣｌは、Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｌａｓｔｉｃｓ（Ｈａｔｔｉｅｓｂｕｒｇ，ＭＳ）から購入し、２−（ｌＨ−ベンゾトリアゾール−１イル）−１，１，３，３−ヘキサフルオロリン酸テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）及びＮ_α，Ｎ_ε−ジ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−リシンジシクロヘキシルアンモニウム塩（（ジ−ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌｙｓ−ＯＨ・ＤＣＨＡ）は、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入された。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド無水物（ＤＭＦ）は、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡ）から購入された。クエン酸は、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）から購入された。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、ＡＣＲＯＳ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）から購入された。

^１Ｈ及び^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ ＩＮＯＶＡ ４００で、４００ＭＨｚ、２５℃で得られた。エレクトロスプレイイオン化質量スペクトルは、Ｑｕａｔｔｒｏ−ＩＩ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｉｎｃ．）で得られた。マトリクス支援レーザー脱離飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量スペクトルは、線形モードで、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸をマトリクスとしてＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＳＴＲ分光計（ＰｅｒＳｐｅｐｔｉｖｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）で得られた。試料精製は、ＺＯＲＢＡＸ ３００ＳＢ−Ｃ１８ ＰｒｅｐＨＴカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００で高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を使用して実行された。移動相は、Ｈ_２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）及びアセトニトリル（０．０５％ＴＦＡ）の混合物であった。

世代１の調製。 図３を参照して、世代１（Ｇ_１）は、０．７０グラムのＯＡＳ−ＨＣｌ（０．５９７ｍｍｏｌ、ＯＡＳ、図１）、７．６０グラムの２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１イル）−１，１，３，３−ヘキサフルオロリン酸テトラメチルウロニウム（２０．０ｍｍｏｌ、ＨＢＴＵ）、２．７０グラムの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２０．０ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔ）及びＮ_α，Ｎ_ε−ジ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−リシンジシクロヘキシルアンモニウム塩（２０．０ｍｍｏｌ、（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌｙｓ−ＯＨ・ＤＣＨＡ）を３０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解することによって最初に調製された。反応フラスコは、室温で約２０分間、撹拌された。１０ｍｌのジイソプロピルエチルアミン（６３．１ｍｍｏｌ、ＤＩＰＥＡ）は、反応溶液に添加され、かつ約２０分間の撹拌後、Ｎ_２フラッシュは、中止され、かつ溶液は、室温で２日間撹拌したままにされた。反応は、０．５Ｍの氷冷したクエン酸中で溶液を沈殿させることによって停止された。白い粘着性の沈殿物が、水溶液中に存在し、かつビーカーの側面に付着した。水溶液は、僅かに黄色がかったようになった。水は移され、かつ白い沈殿物は、メタノール中で溶解することによって収集され、次に真空下で透明な油に濃縮された。透明な油は、アセトニトリル中に溶解され、その後濁った白い沈殿物が得られた。濁った白い沈殿物は、真空濾過によって収集され、固体の白い沈殿物として１．２９グラム（６１．６％の収率）の［（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌ−リシン］_８−ＰＯＳＳをもたらした。

ｔ−ＢＯＣ保護は、室温で約１時間撹拌する間に、１．２９グラムの［（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌ−リシン］_８−ＯＡＳを５ｍｌの氷冷したトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で溶解することによって除去された。溶液は、真空下で黄色の粘性油に濃縮された。白い粗生成物は、氷冷した無水ジエチルエーテルの添加によって沈殿し、エーテルで再度洗浄され、脱イオン化Ｈ_２Ｏ（ＤＩ−Ｈ_２Ｏ）中で溶解され、かつ凍結乾燥された。１．０４グラム（４７．１％の収率）のＧ_１は、透明なＴＦＡ塩として存在した。^１Ｈ及び^１３Ｃ−ＮＭＲ、並びにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルは、ＺＯＲＢＡＸ ３００ＳＢ−Ｃ１８ ＰｒｅｐＨＴカラムを使用してＨＰＬＣ精製後に得られた（両方とも０．５％のＴＦＡを含むＨ_２Ｏ及びアセトニトリル）。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ，δ）：３．８２（ｔ，８Ｈ，−ＣＨ），３．４０−２．９８（ｄｍ，１６Ｈ，−Ｓｉ（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２），２．８４（ｔ，１６Ｈ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２），１．７４（ｍ，１６Ｈ，−ＣＨＣＨ_２），１．５８（ｍ，１６Ｈ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２），１．４７（ｍ，１６Ｈ，−ＳｉＣＨ_２ＣＨ_２），１．３１（ｍ，１６Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２），０．５４（ｔ，１６Ｈ，−ＳｉＣＨ_２）；^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ，δ）：１６９．４（８Ｃ，ＣＯ），５３．２（８Ｃ，−ＣＨ），４２．０（８Ｃ，−Ｓｉ（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２），３９．１（８Ｃ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２），３０．６（８Ｃ，−（ＣＨＣＨ_２），２６．５（８Ｃ，−ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２），２１．８（８Ｃ，−ＳｉＣＨ_２ＣＨ_２），２１．５（ｍ，１６Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２），８．３９（ｔ，１６Ｈ，−ＳｉＣＨ_２）；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ Ｃ_７２Ｈ_１６０Ｎ_２４Ｏ_２０Ｓｉ_８に関する計算値、１９０７．８８；実測値、１９０７．０４。

世代２の調製。 図３を参照して、世代２（Ｇ_２）は、Ｇ_１と同じように調製された。０．４９７グラム（０．１３３ｍｍｏｌ）のＧ_１、６．７６グラム（１７．８ｍｍｏｌ）のＨＢＴＵ、２．４０グラム（１７．８ｍｍｏｌ）のＨＯＢｔ、及び９．４０グラム（１７．８ｍｍｏｌ）の（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌｙｓ−ＯＨ・ＤＣＨＡ）を２０．０ｍｌのＤＭＦ中に。反応フラスコは、室温で約２０分間、撹拌された。１０ｍｌの（５７．４ｍｍｏｌ）ＤＩＰＥＡは、反応溶液に添加され、かつ約２０分間の撹拌後、Ｎ_２フラッシュは、中止され、かつ溶液は、室温で撹拌したままにされた。精製手順は、上記と同様であったが、しかしながらアセトニトリル中の［（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌ−リシン］_１６−ＯＡＳの溶解度増加のために、粗生成物は、サイズ排除クロマトグラフィ（ＬＨ−２０、メタノールによって溶出）によって精製され、白い沈殿物０．７９４グラム（８３．１％の収率）を産出した。

ｔ−ＢＯＣ保護は、０．７９４グラムの［（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌ−リシン］_３２−ＰＯＳＳを３ｍｌの氷冷したＴＦＡ中で溶解することによって除去された。０．８２１グラム（８０．１％の収率）のＧ_２は、透明な塩として存在した。^１Ｈ及び^１３Ｃ−ＮＭＲ、並びにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルは、ＨＰＬＣ精製後に得られた。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ，δ）：４．１２（ｔ，８Ｈ，−ＣＨ），３．９１＆３．８０（ｔ，１６Ｈ，−ＣＨ），３．２０−２．９１（ｂｒ １６Ｈ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２，−Ｓｉ（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ １６Ｈ，），２．９０（ｂｒ ｔ，３２Ｈ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２ＮＨ_２），１．８４−１．６８（ｂｒ ｍ，１６Ｈ，−ＣＨＣＨ_２＆３２Ｈ，−ＣＨＣＨ_２），１．６６−１．４８（ｂｒ ｍ，１６Ｈ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２＆３２Ｈ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２），１．４８−１．１８（ｂｒ ｍ，１６Ｈ，−ＳｉＣＨ_２ＣＨ_２，１６Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２＆３２Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２），０．５１（ｂｒ ｔ，１６Ｈ，−ＳｉＣＨ_２）；^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ，δ）：１７３．２（８Ｃ，ＣＯ），１６９．６−１６９．４（１６Ｃ，ＣＯ），５４．３（８Ｃ，−ＣＨ），５３．２−５２．９（１６Ｃ，−ＣＨ），４２．０（８Ｃ，−Ｓｉ（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２），３９．５（８Ｃ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２），３９．１（１６Ｃ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２），３１．１（８Ｃ，−（ＣＨＣＨ_２），３０．５（１６Ｃ，−（ＣＨＣＨ_２），２８．１（８Ｃ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２），２６．５−２６．４（１６Ｃ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２），２２．８（８Ｃ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２），２１．９（８Ｃ，−ＳｉＣＨ_２ＣＨ_２），２１．５−２１．４（１６Ｃ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２），８．３９（８Ｃ，−ＳｉＣＨ_２）；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ Ｃ_１６８Ｈ_３５２Ｎ_５６Ｏ_３６Ｓｉ_８に関する計算値、３９５８．６４；実測値、３９５８．４９。

世代３の調製。 図３を参照して、世代３（Ｇ_３）は、Ｇ_２と同じように調製された。０．３６３グラム（０．０４７６ｍｍｏｌ）のＧ_２、４．４５グラム（１１．７ｍｍｏｌ）のＨＢＴＵ、１．５８グラム（１１．７ｍｍｏｌ）のＨＯＢｔ、及び６．１７グラム（１１．７ｍｍｏｌ）の（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌｙｓ−ＯＨ・ＤＣＨＡ）を１２．０ｍｌのＤＭＦ中に。反応フラスコは、室温で約２０分間、撹拌された。４．０ｍｌの（２３．０ｍｍｏｌ）ＤＩＰＥＡは、反応溶液に添加され、かつ約２０分間の撹拌後、Ｎ_２フラッシュは、中止され、かつ溶液は、室温で３日間、撹拌したままにされた。精製手順は、上記と同様であった。粗生成物は、サイズ排除クロマトグラフィ（ＬＨ−２０、メタノールによって溶出）によって精製され、白い沈殿物０．４８３グラム（７０．０％の収率）を産出した。

ｔ−ＢＯＣ保護は、０．４８３グラムの［（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌ−リシン］_３２−ＯＡＳを４ｍｌの氷冷したＴＦＡ中で溶解することによって除去された。０．４５０グラム（６１．３％の収率）の（Ｌ−リシン）_３２−ＰＯＳＳは、透明な塩として存在した。^１Ｈ及び^１３Ｃ−ＮＭＲ、並びにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルは、ＨＰＬＣ精製後に得られた。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ，δ）：４．２５−４．０８（ｂｒ，８Ｈ，−ＣＨ＆１６Ｈ，−ＣＨ），３．８８＆３．７６（ｂｒ ｍ，３２Ｈ，−ＣＨ），３．２０−２．７９（ｂｒ，３２Ｈ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２，１６Ｈ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２，１６Ｈ，−Ｓｉ（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２，＆６４Ｈ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２ＮＨ_２），１．９５−１．１０（ｂｒ，１６Ｈ，−ＣＨＣＨ_２，３２Ｈ，−ＣＨＣＨ_２，６４Ｈ，−ＣＨＣＨ_２，１６Ｈ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２，３２Ｈ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２，６４Ｈ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２，１６Ｈ，−ＳｉＣＨ_２ＣＨ_２，１６Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２，３２Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２＆６４Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２），０．４３（ｔ，１６Ｈ，−ＳｉＣＨ_２）；^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ，δ）：１７４．０−１７３．３（８Ｃ，ＣＯ＆１６，ＣＯ），１６９．７−１６９．４（３２Ｃ，ＣＯ），５４．５−５３．９（８Ｃ，−ＣＨ＆１６Ｃ，−ＣＨ），５３．３−５２．８（３２Ｃ，−ＣＨ）４２．７（８Ｃ，−Ｓｉ（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２），４１．８（８Ｃ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２），３９．４−３９．１（１６Ｃ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２＆３２Ｃ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２）３１．０−３０．１（８Ｃ，−ＣＨＣＨ_２，１６Ｃ，−ＣＨＣＨ_２＆３２Ｃ，−ＣＨＣＨ_２），２８．１−２７．９（８Ｃ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２＆１６Ｃ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２），２６．５（３２Ｃ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２），２３．１−２２．２（８Ｃ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２，１６Ｃ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２＆８Ｃ，−ＳｉＣＨ_２ＣＨ_２），２１．５−２１．３（３２Ｃ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２），８．３９（８Ｃ，−ＳｉＣＨ_２）；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：［Ｍ−Ｈ］^＋ Ｃ_３６０Ｈ_７３６Ｎ_１２０Ｏ_６８Ｓｉ_８に関する計算値、８０５７．９７、実測値、８０５７．８０。

世代４の調製。 図２及び３を参照して、世代４（Ｇ_４）は、Ｇ_３と同じように調製された。０．１７６グラム（０．０１１４ｍｍｏｌ）のＧ_３、２．１２グラム（５．５０ｍｍｏｌ）のＨＢＴＵ、０．７０８グラム（５．６０ｍｍｏｌ）のＨＯＢｔ、及び２．９５グラム（５．６０ｍｍｏｌ）の（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌｙｓ−ＯＨ・ＤＣＨＡ）を１０．０ｍｌのＤＭＦ中に。反応フラスコは、室温で約２０分間、撹拌された。４．０ｍｌの（２３．０ｍｍｏｌ）ＤＩＰＥＡは、反応溶液に添加され、かつ約２０分間の撹拌後、Ｎ_２フラッシュは、中止され、かつ溶液は、室温で３日間、撹拌したままにされた。精製手順は、上記と同様であった。粗生成物は、サイズ排除クロマトグラフィ（ＬＨ−２０、メタノールによって溶出）によって精製され、白い沈殿物０．２５０グラム（７５．０％の収率）を産出した。

ｔ−ＢＯＣ保護は、０．２５０グラムの［（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌ−リシン］_６４−ＯＡＳを４ｍｌの氷冷したＴＦＡ中で溶解することによって除去された。０．２４９グラム（７０．２％の収率）のＧ_４は、透明な塩として存在した。^１Ｈ及び^１３Ｃ−ＮＭＲ、並びにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルは、ＨＰＬＣ精製後に得られた。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ，δ）：４．２１−４．０２（ｂｒ，８Ｈ，−ＣＨ，１６Ｈ，−ＣＨ＆３２Ｈ，−ＣＨ），３．９０＆３．７８（ｂｒ ６４Ｈ，−ＣＨ），３．１５−２．７６（ｂｒ，６４Ｈ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２，３２Ｈ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２，１６Ｈ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２，１６Ｈ，−Ｓｉ（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２，＆１２８Ｈ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２ＮＨ_２），１．８３−１．００（ｂｒ，１６Ｈ，−ＣＨＣＨ_２，３２Ｈ，−ＣＨＣＨ_２，６４Ｈ，−ＣＨＣＨ_２，１２８Ｈ，−ＣＨＣＨ_２，１６Ｈ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２，３２Ｈ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２，６４Ｈ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２，１２８Ｈ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２，１６Ｈ，−ＳｉＣＨ_２ＣＨ_２，１６Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２，３２Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２，６４Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２＆１２８Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２），０．４３（ｂｒ，１６Ｈ，−ＳｉＣＨ_２）；^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ，δ）：１７４．０−１７３．３（８Ｃ，ＣＯ，１６Ｃ，ＣＯ＆３２Ｃ，ＣＯ），１７０．０−１６９．４（６４Ｃ，ＣＯ），５４．５−５２．９（８Ｃ，−ＣＨ，１６Ｃ，−ＣＨ，３２Ｃ，−ＣＨ＆６４Ｃ，−ＣＨ），４０．１−３８．５（８Ｃ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２，１６Ｃ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２，３２Ｃ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２＆６４Ｃ，−（ＣＨ_２）_３ＣＨ_２），３１．０−２９．６（８Ｃ，−ＣＨＣＨ_２，１６Ｃ，−ＣＨＣＨ_２，３２Ｃ，−ＣＨＣＨ_２＆６４Ｃ，−ＣＨＣＨ_２），２９．３（１６Ｃ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２），２８．０（３２Ｃ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２＆６４Ｃ，−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２ＣＨ_２），２３．６−２２．２（８Ｃ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２，１６Ｃ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２，８Ｃ，−ＳｉＣＨ_２ＣＨ_２，３２Ｃ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２），２１．５（６４Ｃ，−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：［Ｍ］^＋ Ｃ_７４４Ｈ_１５０４Ｎ_２４８Ｏ_１５２Ｓｉ_８に関する計算値、１６２６２．１８、実測値、１６３１４．９６。

透過電子顕微鏡法。 １０ｍＭのＮａＣｌ溶液中のＧ_４（５ｍｇ／ｍｌ）は、炭素メッシュに添加され、かつ一晩乾燥させられた。炭素メッシュは、約３０秒間、タングステン酸ウラニルによって更に処理された。Ｇ_４の従来のＴＥＭ顕微鏡写真は、５９５０００×以下の倍率で作動するＰｈｉｌｉｐｓ Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅによって１２０ｋＶで得られた。

デンドリマー調製。 ＯＡＳは、Ｌ−リシンに共役され、世代１から４の４種の新規なポリ−Ｌ−リシンスターバーストデンドリマーをもたらす。合成スキームは、図３に示す。これらのスターバーストデンドリマーは、過剰のＮ_α，Ｎ_ε−ジ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−リシン、ＨＢＴＵ及びＨＯＢＴをＤＭＦ中に添加して、活性エステルＮ_α，Ｎ_ε−ジ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−リシン−ＯＢｔを形成し、それを次にＯＡＳ−ＨＣｌの８つのコーナーアミンと反応させることによって最初に調製される。ジイソプロピルエチレンアミン（ＤＩＰＥＡ）は、Ｇ_１の調製中にＯＡＳの塩酸塩を中和するために溶液に添加され、かつ後に高世代の調製中に、Ｇ_１、Ｇ_２及びＧ_３の表面上のα−及びε−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）アミン塩を中和するために添加された。ｔ−ＢＯＣ保護デンドリマーの疎水性は、無水ジエチルエーテル中の溶解度増加から明らかなように、高世代で増加した。

［（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌ−リシン］_８−ＯＡＳ及び［（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌ−リシン］_１６−ＯＡＳは、無水ジエチルエーテル中の沈殿によって分離され、生成物は、低温で保存すると最終的に沈下した濁った白い沈殿物として出て来た。無水ジエチルエーテル中の［（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌ−リシン］_３２−ＯＡＳ及び［（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌ−リシン］_６４−ＯＡＳの沈殿は、［（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌ−リシン］_８−ＯＡＳ及び［（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌ−リシン］_１６−ＯＡＳよりも遙かに低い収率（約１０％）をもたらした。このことは、ｔ−ＢＯＣ保護Ｇ_３及びＧ_４の疎水性増加に起因する可能性があり、多数のｔ−ＢＯＣ保護基による有機溶剤中の溶解度増加をもたらす。従って、ｔ−ＢＯＣ保護Ｇ_３及びＧ_４は、メタノールによって溶出されるＬＨ−２０サイズ排除クロマトグラフィを使用して精製された。収集されたフラクションは、ＨＰＬＣ精製の純度に匹敵する純度を有する、著しく高い収率（約７０％）をもたらした。ｔ−ＢＯＣ保護は、過剰のＴＦＡ中に溶解することによって除去された。生成物は、無水ジエチルエーテル中に透明な粘性油を滴下することによって沈殿し、次に水中に溶解され、かつ透明な塩に凍結乾燥された。

Ｇ_３及びＧ_４は、Ｇ_１及びＧ_２よりも遙かに高い収率で調製されたが、このことは、おそらくサイズ排除クロマトグラフィによる不純物からの粗生成物の分離に起因した。［（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌ−リシン］_３２−ＯＡＳ及び［（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌ−リシン］_６４−ＯＡＳは、不純物よりも速い速度でカラムを通って溶出するために十分大きい。Ｇ_１及びＧ_２の低い収率は、精製ステップの間に無水ジエチルエーテル中に僅かに可溶性であるｔ−ＢＯＣ保護Ｇ_１及びＧ_２の結果であった。Ｇ_１及びＧ_２の収率を増加させるために、［（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌ−リシン］_８−ＯＡＳ及び［（ｔ−ＢＯＣ）_２−Ｌ−リシン］_１６−ＯＡＳは、メタノールによって溶出されるＬＨ−２０サイズ排除カラムを通されるが、しかしながらそれらの収率は、不純物とのごく僅かな大きさの違いためにＧ_３及びＧ_４ほど高くなかった。

デンドリマーのカチオン及び吸湿特性は、表面アミンの数が１６（Ｇ_１）から１２８（Ｇ_４）に増加するにつれ、増加した。各世代は、^１Ｈ及び^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル並びに質量分析によって明らかなように、ＨＰＬＣによる優れた純度により、比較的良好な収率で調製された。

デンドリマー特徴付け。 各世代は、ＨＰＬＣ精製後、Ｄ_２Ｏ中の^１Ｈ及び^１３Ｃ−ＮＭＲ、並びにＥＳＩ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって完全に特徴付けられた。デンドリマー世代が１から４に増加するにつれて、^１Ｈ−ＮＭＲによって幾つかの興味深い傾向が観察された、図４。約０．５４ｐｐｍでのピークは、ＯＡＳコアのケイ素原子に隣接したメチレン陽子の特性である。このピークは、各精製ステップ中に生成物を識別するために使用された。非常に過剰なＮ_α，Ｎ_ε−ジ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−リシンが各共役反応中に添加されたので、Ｎ_α，Ｎ_ε−ジ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−リシンからの生成物の分離は、類似する^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのために困難であった。このピークの位置は、世代数が増加するにつれ^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルに関して僅かに高磁場に（ｕｐｆｉｅｌｄ）移動し、かつ広くなる。ケイ素原子に隣接したメチレン陽子の数が、反復した共役で一定のままであり、かつデンドリマーコア内に埋設され、それが低い信号対雑音比をもたらすので、このことは、予期された。Ｌ−リシン側鎖のメチレン陽子は、約１．３１、１．５８及び１．７７ｐｐｍで、３つの多重線によって表される。これらのピークは、高い世代で遙かに広くなる。約１．４７ｐｐｍのピークは、ＯＡＳコアのメチレン陽子の化学シフト値であるが、高いデンドリマー世代のリシン側鎖のメチレン陽子増加によって隠されるようになる。Ｇ_１に関する約２．８８ｐｐｍでの三重線は、リシン側鎖のε−アミンに隣接したメチレン陽子を表す。このピークは、高いデンドリマー世代で遙かに広く、かつ大きくなる。

興味深い観察結果は、Ｇ_１に関する３．００及び３．１３ｐｐｍでの２つの多重線の存在であった。積分は、各ピークに関して約８の値をもたらした。これらのピークは、ＯＡＳコアの窒素原子に隣接した２つのメチレン陽子のものとされた。単一のピークが、これら２つの陽子に関して予期されたが、電子共鳴がペプチド結合の酸素−炭素及び窒素−炭素の間に存在するので、窒素軌道は、平面形状を示し、それ故にメチレン陽子は、異なる化学シフトをもたらす空間内に部分的に固定されるようになり得る。第２世代のＬ−リシンの更なる添加で、ＯＡＳコアの窒素原子に隣接したメチレン陽子は、３．００ｐｐｍまで高磁場にシフトし、他方で第１世代Ｌ−リシンの新規に形成されたε−アミド結合に隣接したメチレン陽子は、ＯＡＳコアのメチレン陽子と同じように分割される。この現象は、全てのその後の世代に関して観察された。換言すれば、前のペプチド結合に隣接したメチレン陽子は、もはや分割ピークとして観察されず、高磁場にシフトされ、他方で新規に形成されたペプチド結合に隣接したメチレン陽子は、２つのピークによって表される。二次元^１Ｈ−ＮＭＲ及びパルス磁場勾配異核多重量子的相関（ｇＨＭＱＣ）ＮＭＲは、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを明確にすることに役立った。

新規に形成されたペプチド結合に隣接したメチレン陽子のこれら２つのピークの存在は、剛性デンドリマー表面を示す。低いＬ−リシン世代のこれらのメチレン陽子は、２つの化学シフトによってもはや表されないが、内部分岐の剛性が、リシンの更なる共役後に変化しないこと、しかしながらこれらのメチレン陽子がデンドリマーコア内に一旦埋設されると、ＮＭＲ機器が、これらのメチレン陽子を識別できないことが提案される。高い磁気強度を有する^１Ｈ−ＮＭＲは、デンドリマー内のメチレン陽子を識別できることがある。

Ｇ_１の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル中の３．８３ｐｐｍでのピークは、ペプチド結合に隣接したα−炭素陽子のものとされた。このピークは、第２世代のリシンがデンドリマー表面に共役されるにつれ、約４．１５ｐｐｍまで低磁場に（ｄｏｗｎｆｉｅｌｄ）移動する。第２世代のＬ−リシンのα−炭素陽子は、２つのピーク３．８０及び３．９１ｐｐｍによって表される。ここでもまた、これら２つのピークは、Ｌ−リシンの第３共役で約４．１４及び４．０９ｐｐｍまで低磁場にシフトされ、他方で新規に共役されたＬ−リシンのα−炭素陽子は、３．８０及び３．９１ｐｐｍの分割化学シフト値を有する。この傾向は、第４世代のＬ−リシンが外面に共役された後にも観察され、第４リシン世代のα−炭素陽子は、３．８０及び３．９０ｐｐｍの２つのピークによって表され、他方で第３世代α−炭素陽子は、約４．１０ｐｐｍまで低磁場にシフトされる。

^１３Ｃ−ＮＭＲは、Ｇ_１からＧ_４を特徴付けるために同様に使用された。図５は、Ｇ_１からＧ_４の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。約８．３９ｐｐｍでのピークは、Ｇ_１からＧ_２の同じ化学シフトを保持する、ケイ素原子に隣接したメチレン炭素を表す。しかしながら、このピークはＧ_３スペクトル中でかすかに示され、かつＧ_４スペクトル中では観察されない。この観察結果は、低い炭素信号対雑音比、並びにデンドリマー内に埋設されるようになるメチレン炭素原子の結果である。このことは、ケイ素原子に隣接したメチレン陽子からのピークが、遙かに小さくかつ広くなる、（上述の）Ｇ_４の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと類似する。３９．０、３０．６、２６．４及び２１．５ｐｐｍに位置し、かつＧ_１からＧ_４の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと同様の、Ｌ−リシン側鎖のメチレン炭素は、化学シフトを変えないが、高世代で互いに近くに位置する複数のピークによって表される。ＯＡＳコアの内部メチレン炭素は、２６．４ｐｐｍの化学シフト値を有するが、低い信号対雑音比のためにＧ_３及びＧ_４のスペクトルで観察されない。第１Ｌ−リシン世代のα−炭素は、５３．２ｐｐｍの化学シフト値によって表され、それは次に第２Ｌ−リシン世代が表面に共役された後に、約５４．２ｐｐｍまで低磁場にシフトされる。Ｇ_２の新規に共役されたＬ−リシン上のα−炭素は、２つのピーク、５３．２及び５２．８ｐｐｍによって表される。この傾向は、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル中のα−炭素陽子と同様であり、第１世代のα−炭素陽子の化学シフト値は、低磁場に移動し、他方で新規に共役されたリシンのα−炭素陽子は、２つのピークによって表される。Ｇ_３の表面Ｌ−リシン分岐のα−炭素は、約５３．３及び５２．８ｐｐｍでの２つのピークとして示され、他方でＧ_１及びＧ_２のα−炭素は、それぞれ５４．４及び５３．９ｐｐｍまで低磁場にシフトする。ここでもまた、Ｇ_３のリシン分岐のα−炭素は、約５４．０ｐｐｍまで低磁場にシフトし、他方でＧ_４のリシン分岐のα−炭素は、約５３．２及び５２．９ｐｐｍで２つのピークとして現れる。Ｇ_１の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて、１６９ｐｐｍでのピークは、最も反遮蔽の炭素である、ペプチド結合のカルボニル炭素のものとされた。リシンの第１世代のカルボニル炭素は、約１６９ｐｐｍでの化学シフトによって表されるＬ−リシンの更なる共役で、約１７３ｐｐｍまで低磁場に移動する。この傾向は、Ｇ_４を通して反復される。

Ｇ_１からＧ_４の^１Ｈ及び^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、同様の傾向を示した。Ｌ−リシンを更に添加すると、以前のＬ−リシン世代の化学シフトは、低磁場に移動し、他方で、表面リシン分岐は、前の世代の化学シフト値を有した。リシンの世代番号が増加するにつれ、早い世代のピーク高さは減少するか、又は消失する。上述のもう１つの興味深い観察結果は、ＯＡＳコアの窒素に隣接したメチレン陽子によって表される２つのピークの存在であった。これらの陽子が、アミド結合の平面性のために空間内に部分的に固定されることが提案された。この仮説は、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルによって裏付けられる。これらのスペクトルは、この具体的な炭素に関して単一のピークのみを示し、他方で^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、２つのピークを示す。換言すると、メチレン炭素は、化学的に等価であるが、メチレン陽子は、そうでない。このことは、デンドリマーが剛性構造を保持するという仮説も裏付け、それは、表面の追加の部分を共役させる時に有益であると分かることがある。

ＯＡＳコアは、加水分解を受けやすい。コアの加水分解は、非球形デンドリマー形態をもたらす。酸素−ケイ素結合の切断を識別するために、^２９Ｓｉ−ＮＭＲが使用された。Ｇ_１からＧ_４の^２９Ｓｉアイソトープ信号を検出する以前の試みは、失敗であったが、しかしながら^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、ＯＡＳコアの構造的完全性を確認するために有益であると分かった。上述のように、ＯＡＳコアのケイ素原子に隣接したメチレン炭素は、約８．３９ｐｐｍの独特な化学シフト値によって表された。酸素−ケイ素結合の加水分解は、隣接するメチレン炭素を異なる化学環境に置き、かつそれ故に異なる化学シフト値として^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル中で観察される。Ｇ_１からＧ_３の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルに示すように、ケイ素原子に隣接したメチレン炭素の全ては、１つの化学シフト値、８．３９ｐｐｍによって表される。それ故に、ＯＡＳコアがデンドリマー調製中に加水分解されないことを、我々は確信している。このピークは、低い信号対雑音比のためにＧ_４の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル中に存在しないが、第４世代の調製及び精製は、前の世代と同様であった。

Ｇ_１からＧ_４は、エレクトロスプレイイオン化（ＥＳＩ）又はマトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析によって更に特徴付けされた。データは、表１に要約される。図６は、Ｇ_１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。このスペクトルは、１９０７．０５ｍ／ｚで単一のピークを有し、かつ［Ｍ＋Ｈ］^＋分子イオンに対応する（計算値、１９０７．８８ｍ／ｚ）。Ｇ_２は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって同様に特徴付けされ、図７、かつ３つの主要なピークを示した。３９５８．４９ｍ／ｚでの質量は、［Ｍ＋Ｈ］^＋分子イオンに対応する（計算値、３９５８．６３ｍ／ｚ）。３９７９．３４及び３９９６．３１ｍ／ｚでの質量は、［Ｍ＋Ｎａ−Ｈ］^＋（計算値、３９７９．６０ｍ／ｚ）及び［Ｍ＋Ｋ］^＋（計算値、３９９６．７２ｍ／ｚ）分子イオンにそれぞれ対応する。ＥＳＩ質量分析は、Ｇ_３を特徴付けるために使用された、図８。８０５７．８ｍ／ｚでのピークは、［Ｍ−Ｈ］^＋（計算値、８０５７．９７）分子イオンに対応し、かつ以前の質量スペクトルのように、完全に置換された単分散Ｇ_３が調製されたことを示す。図９は、Ｇ_４のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。主要なピークは、約１６３２３．２４ｍ／ｚであり（計算値、［Ｍ＋Ｈ］^＋１６２６２．１７）、かつ早い世代の以前の質量スペクトルよりも広い。このことは、溶液相で高世代の完全に単分散のデンドリマーを調製する際の困難さ、並びにマトリクスからの高分子量デンドリマーのイオン化の起こり得る困難さのために、予期される。主要なピークは、計算［Ｍ］^＋分子イオンよりも大きいが、追加のＬ−リシン残基の質量よりも小さく、それ故にＧ_４が比較的良好な単分散により、かつ優れた純度で調製されることを、我々は信じている。

ＮＭＲ及び質量分析スペクトルから、球形ポリ−Ｌ−リシンデンドリマーが優れた純度で合成され、かつ均一の分子量分布を有することが明白であり、Ｇ_４の実測分子量は、計算分子量よりも５２．７９Ｄａ高いだけであった。その上、これらの新規なナノ小球の調製は、Ｌーリシン又は場合により他の表面部分の更なる添加に適した純度を達成するために共通の共役化学的性質及び機器類を必要とした。デンドリマー表面の剛性は、おそらく高い共役効率に寄与した。これらの新規なポリ−Ｌ−リシンデンドリマーは、例えば常磁性キレート剤、すなわちＤＯＴＡ、標的部分、すなわちＲＧＤ又は治療薬剤、すなわちドキソルビシンのような表面部分の更なる添加のために優れた骨格を作る。その上、剛性表面は、周囲環境とのデンドリマー表面部分の相互作用を改善する。線状重合体は、折り曲げられやすく、そのことは、疎水性部分を埋設することがある。全てのコンジュゲートが外側に完全に露出される、剛性デンドリマー表面は、周囲環境との高い相互作用をもたらす。

リシン−ＯＡＳデンドリマーによるプラスミドＤＮＡ錯体形成及びトランスフェクション。 リシン−ＯＡＳデンドリマーのＤＮＡ錯体形成及びインビトロトランスフェクションは、ルシフェラーゼを符号化するプラスミドＤＮＡによって調査された。世代２から４のナノ小球は、プラスミドＤＮＡを遅延させる同じような能力を有した。これらの分子は、ゲル電気泳動アッセイにおいて約０．５のＮ／Ｐ比で部分的プラスミド遅延を、かつ０．７５以上のＮ／Ｐ比で完全遅延をもたらした。図１０（Ａ）は、Ｇ_４ナノ小球によるプラスミドＤＮＡのＤＮＡ遅延を示す。Ｇ_１デンドリマーは、１．５のＮ／Ｐ比で完全なＤＮＡ遅延を示し、他方でＯＡＳコアは、１．５のＮ／Ｐ比でＤＮＡを遅延させることが不可能であった。その上、１．０以上のＮ／Ｐ比で、世代２から４のナノ小球は、ＤＮＡを完全に錯化することが可能であり、そのことは、臭化エチジウムの排除、及び蛍光バンドの完全喪失を引き起こす。図１０（Ｂ）は、プラスミドＤＮＡによって３０分間、ＰＢＳ中でインキュベートされた後にＧ_４デンドリマー及びプラスミドＤＮＡによって５のＮ／Ｐ比で形成された錯体の透過電子顕微鏡像を示す。錯体の粒径は、直径６０から８０ｎｍの範囲にあった。

ＦＩＴＣ標識Ｇ_３球状デンドリマーとのＤＮＡ錯体の細胞取り込みは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞によって予め研究された。図１１は、Ｎ／Ｐ比４０でＧ３−［ＦＩＴＣ］_２−［ＮＨ_２］_６２／ＤＮＡポリプレックスによるインキュベーション後４時間で獲得されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の通常光及び蛍光画像を示す。緑色蛍光が細胞内で観察され、そのことは、ＦＩＴＣ標識デンドリマー／ＤＮＡ錯体の細胞取り込みを示す。標識デンドリマー錯体は、早期エンドソーム又はリソソーム区画（小型の集中的な円形スポット）及び細胞質中に存在した。結果は、小型球状デンドリマーが、核酸の細胞取り込みを容易にするために効率的であることを証明した。

球状デンドリマーのインビトロトランスフェクション効率は、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを符号化するｇＷｉｚプラスミドＤＮＡ、及び対照としてＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＰＡＭＡＭデンドリマー）を使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において研究された。ＤＮＡ錯体は、細胞によって４８時間インキュベートされた。トランスフェクション効率は、標準ルシフェラーゼアッセイによって決定された。図１２は、リシン球状デンドリマーのトランスフェクション効率を示す。全ての球状デンドリマーのトランスフェクション効率は、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ｐ＜０．０５）より遙かに高い。Ｎ／Ｐ＝２及び５で、全ての球状デンドリマーは、比較できるトランスフェクション効率を有した。Ｎ／Ｐ＝１０で、Ｇ_４デンドリマーは、他のデンドリマー（ｐ＜０．０５）より遙かに高いトランスフェクション効率を示した。

リシン−ＯＡＳデンドリマーによるインビトロｓｉＲＮＡ送達。 球状リシン−ＯＡＳデンドリマーＧ_１からＧ_４のｓｉＲＮＡ送達効率は、抗ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを使用してＵ３７３細胞を発現するルシフェラーゼによって予め評価された。ｓｉＲＮＡ送達の担体として研究された、線状ポリ−Ｌ−リシン（分子量１００００）、並びにＯＡＳ及びポリリシンコアは、対照として使用された。細胞は、デンドリマー／ｓｉＲＮＡポリプレックスにより１０、２０、３０及び４０のＮ／Ｐ比で４時間インキュベートされ、その後培地は除去され、新規の培地と取り替えられ、かつ追加の４８時間インキュベートされた。図１３は、球状デンドリマー及び対照の遺伝子抑制効率を示す。ルシフェラーゼ発現効率は、ＯＡＳコアによる平均発現に対するデンドリマー又はポリリシンによる発現率として示される。デンドリマーの遺伝子抑制効率は、デンドリマーの大きさを増加させることにより増加した。Ｇ_４デンドリマーは、５０％までの抑制効率を有するデンドリマーの間で、最高の遺伝子抑制効率を示した。低い遺伝子トランスフェクション効率が、その細胞毒性のためにポリリシンに関して観察された。顕微鏡法による細胞生存度の検査は、ポリリシン／ｓｉＲＮＡ錯体によりインキュベートされた細胞が、非常に低い生存度を有することを示した。その生存度は、ＰＬＬ／ｓｉＲＮＡ錯体のＮ／Ｐ比の増加により減少した。全てのＮ／Ｐ比で、コア及びデンドリマーによってインキュベートされた細胞に関して細胞生存度の変化は、観察されなかった。デンドリマー／ｓｉＲＮＡ錯体によって媒介されたルシフェラーゼ抑制効率は、試験を受けた範囲でそのＮ／Ｐ比によって大きく影響されなかった。

ｓｉＲＮＡによるリシン球状デンドリマーの粒子形成は、動的光散乱法を使用して調査された。粒子形成を研究するために、１０のＮ／Ｐが選択された。ＯＡＳコア、ポリリシン（１０ｋＤａ）、ＰＡＭＡＭ−Ｇ_５（１２８の表面アミノ基、２８８８２６Ｄａ）及びＰＡＭＡＭ−Ｇ_６（２５６の表面アミノ基、５８０４８Ｄａ）デンドリマーが、対照として使用された。リシンデンドリマーＧ_１〜Ｇ_４及び対照は、１．０ｎＭの正電荷で、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ２ｘ濾過された水中に溶解された。ｓｉＲＮＡ（０．５μｇ）は、リボヌクレアーゼを含まない水中に添加され、かつ次にＮ／Ｐ比１０で３０分間、室温でリシンデンドリマーＧ_１〜Ｇ_４及び対照と錯化された。ポリプレックス溶液は、容量０．５ｍｌの２ｘ濾過されたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水に希釈された。ｓｉＲＮＡ錯体の大きさは、動的光散乱法によって２分間測定された。ＯＡＳ、球状リシンデンドリマー及びＰＡＭＡＭデンドリマーとのｓｉＲＮＡ錯体の大きさは、表２に一覧にされる。表２に示すように球状リシンデンドリマーＧ_２〜Ｇ_４は、ＯＡＳコア、球状リシンデンドリマーＧ_１並びにＰＡＭＡＭ Ｇ_５及びＧ_６デンドリマーよりも小さいナノ粒子（〜５０ｎｍ）を形成した。結果は、ＰＡＭＡＭデンドリマーが、球状リシンデンドリマーＧ_２〜Ｇ_４よりも大きな分子量及び多くのカチオン電荷を有するとしても、後者は、ＰＡＭＡＭデンドリマーよりもｓｉＲＮＡとの安定した濃縮錯体を形成するためにはより効果的であることを示唆している。錯体の大きさは、溶液中で２４時間以内に変化しなかった。

球状デンドリマーとのｓｉＲＮＡ錯体の細胞取り込みは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞中の共焦点顕微鏡法によって評価された。ＦＩＴＣ標識リシン球状デンドリマー（Ｎ／Ｐ＝１０）とのＣｙ３標識ｓｉＲＮＡの錯体は、細胞によって２時間インキュベートされた。細胞は、ＰＢＳ中の２％のパラアルデヒドによって３７℃で５０分間固定された。細胞取り込みは、二重チャネルＦＶ１０００ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１共焦点顕微鏡で観察された。正確な細胞スライスを達成し、かつ観察された錯体が、細胞中に位置し、かつ細胞表面に付着しないことを確実にするために、Ｚ−シリーズ画像獲得が実行された。図１３は、担体及びｓｉＲＮＡの両方がエンドソーム−リソソーム区画に蓄積されたことを示す、Ｇ_３デンドリマーとのｓｉＲＮＡ錯体の細胞取り込みの代表的な共焦点像を示す。結果は、Ｇ_３球状リシンデンドリマーがｓｉＲＮＡとの安定した錯体を形成し、かつ無傷錯体が細胞によって取られることを示唆した。球状デンドリマーは、ｓｉＲＮＡの酵素分解を防ぎ、かつｓｉＲＮＡを標的細胞に効果的に送達することができる。

ＭＲＩ造影剤としての［Ｇｄ−ＤＯ３Ａ］−ポリ−Ｌ−リシンＯＡＳデンドリマーの合成及び特徴付け。 世代１〜３［Ｇｄ−ＤＯ３Ａ］−ポリ−Ｌ−リシンＯＡＳ ＭＲＩ造影剤は、標準的な液相ペプチド合成を使用して合成された。合成手順は、図１４に示され、かつ以下のように記載される：（Ｌ−リシン）_８−ＯＡＳ（Ｇ_１）トリフルオロアセテート（０．０１８５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１．５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１．５ｍｍｏｌ）、及び１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス−ｔｅｒｔ−ブチルアセテート−１０−酢酸（ＤＯＴＡ−ｔｒｉｓ（ｔ−ｂｕ））（０．５２ｍｍｏｌ；大環状）は、ＤＭＦ中に溶解され、かつ室温で２０分間撹拌された。ジイソプロピルエチルアミン（４．０ｍｍｏｌ）は、溶液に添加され、かつ室温で２日間撹拌された。反応溶液は、真空下で濃縮され、メタノール中に溶解され、次に無水ジエチルエーテル中に沈殿した。保護ｔ−ブチル基は、１８時間室温で純トリフルオロ酢酸中に粗生成物を溶解することによって除去された。溶液は、次に真空下で粘性油に濃縮された。残基は、氷冷したジエチルエーテルによって処理され、無色の固体生成物を与えた。粗［ＤＯ３Ａ］−ポリ−Ｌ−リシンＯＡＳ世代１デンドリマーは、ＨＰＬＣによって更に精製された。純粋な［ＤＯ３Ａ］−ポリ−Ｌ−リシンＯＡＳ世代１デンドリマーの収率は、３５．０％であった。［ＤＯ３Ａ］−ポリ−Ｌ−リシンＯＡＳ世代１コンジュゲートへのＧｄ^３＋の錯体形成は、［ＤＯ３Ａ］−ナノ小球コンジュゲート（０．００６５ｍｍｏｌ）及びＧｄ（ＯＡｃ）_３（０．３０ｍｍｏｌ）の両方を水中に溶解し、かつ２日間室温で撹拌することによって達成された。遊離Ｇｄ^３＋イオンは、ＥＤＴＡの添加、並びに反応溶液をＰＤ−１０脱塩カラムに通すこと、及び凍結乾燥によって除去された。純粋な［Ｇｄ−ＤＯ３Ａ］−ポリ−Ｌ−リシンＯＡＳ ＭＲＩ造影剤は、ＨＰＬＣ精製後に得られた、収率１５．１％。世代２（１５．５％の収率）及び世代３（１８．８％）［Ｇｄ−ＤＯ３Ａ］−ポリ−Ｌ−リシンＯＡＳ ＭＲＩ造影剤は、同様の手順に従って合成された（図１５）。

Ｇｄ^３＋含有量は、誘導結合プラズマ発光分光法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）によって測定され、かつこれらのデータからナノ小球表面に共役した［Ｇｄ−ＤＯ３Ａ］キレートの数、並びに分子量が、概算された。コンジュゲートのＴ_１緩和能（ｒ_１）は、３Ｔで決定された。ナノ小球ＭＲＩ造影剤の見掛けの分子量は、ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって測定され、２−ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）によって較正され、かつ粒径は、水中で動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定された。物理化学的特性は、表３に要約される。

作用剤は、ポリ−Ｌ−リシンデンドリマー表面への［Ｇｄ−ＤＯ３Ａ］の約６０〜７６％の共役効率で調製された。Ｔ１緩和能及び粒径は、世代の大きさによって増加した。その上、図１６のＳＥＣスペクトルは、作用剤が、優れた純度によって調製され、かつナノ小球ＭＲＩ造影剤の流体力学的容量が、デンドリマー世代によって増加することを示す。

インビボＭＲ撮像。 インビボＭＲ撮像は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌異種移植片を持つ雌ｎｕ／ｎｕ胸腺欠損マウスにおいて実行された。３匹のマウス（ｎ＝３）のグループは、各々が各コンジュゲート用に使用され、かつマウスは、２ｍｇ／ｋｇのキシラジン及び８０ｍｇ／ｋｇのケタミンの混合物の腹腔内注射によって麻酔をかけられた。世代１〜３ナノ小球ＭＲＩ造影剤は、尾静脈を介して体重１ｋｇ当たりＧｄ０．０３ｍｍｏｌの用量で投与された。マウスは、ヒト手首コイル内に置かれ、かつ脂肪抑制３Ｄ ＦＬＡＳＨシーケンス（ＴＲ＝７．８ｍｓ、ＴＥ＝２．７４ｍｓ、２５°フリップ角、０．５ｍｍスライス厚）を使用して、注射前及び注射後２、５、１０、１５、３０、６０及び１２０分でＳｉｅｍｅｎｓ Ｔｒｉｏ ３Ｔ ＭＲＩスキャナー内で走査された。図１７は、３Ｄ最大強度投影像（３Ｄ ＭＩＰ）を示す。

世代１及び２ナノ小球ＭＲＩ造影剤は、ＭＲ画像上で同様のコントラスト増大プロフィールを示した。これらの作用剤は、腎臓濾過を介して排出され、かつＭＲＩによって示すように、注射後約１０分で膀胱内に蓄積された。世代３ナノ小球ＭＲＩ造影剤は、注射後２分で、かつ注射後６０分までに著しく高い血液プール増大を示した。その上、この作用剤は、最終的に腎臓濾過を介して排出され、かつ注射後約１５分で膀胱内の蓄積を示した。全ての作用剤は、肝臓中の僅かな増大を示したが、それは高分子量のＭＲＩ造影剤に関して多くの場合観察される最小限の肝臓取り込みを示す。世代３ナノ小球ＭＲＩ造影剤は、おそらくその高い緩和能により、並びにその大きな流体力学的容量により低いナノ小球世代と比較して高いコントラスト増大を提供した。

図１８は、通常の臨床用量の１／１０である、０．０１ｍｍｏｌ−Ｇｄ／ｋｇの用量でＧ_３ナノ小球造影剤により強化された、代表的な３Ｄ ＭＩＰ及び軸方向２Ｄスピンエコー像を示す。作用剤は、かかる低用量で少なくとも６０分間、血液プール中の著しいコントラスト増大をもたらした。コントラスト増大は、血液プール中で時間の経過に伴い漸減した。同時に、膀胱中のコントラスト増大は漸増し、Ｇ３ナノ小球造影剤が腎臓濾過を介して徐々に排出され、かつ膀胱中に蓄積されることを示す。注射後２時間で、体内のコントラスト増大は、強い増大を有した膀胱を除き注射前のレベルに戻った。

細胞毒性。 デンドリマー及びオクタ（３−アミノプロピル）シルセスキオキサンコアの細胞毒性は、ポリ−Ｌ−リシン（１０ｋＤａ）を対照として、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞によるインキュベーションによってＭＴＴアッセイにより評価された。図１９は、ＯＡＳコア、ナノ小球デンドリマー及びポリ−Ｌ−リシンの濃度依存性細胞生存度を示す。デンドリマー及びコアは、ポリ−Ｌ−リシンよりも遙かに低い細胞毒性を示した。デンドリマーの細胞毒性は、その大きさによって漸増する。Ｇ_３及びＧ_４デンドリマーのＩＣ_５０値は、それぞれ１３４．８μｇ／ｍｌ及び９７．９μｇ／ｍｌであったが、それはポリ−Ｌ−リシンのそれ（１２．０μｇ／ｍｌ）よりも遙かに高い。ＯＡＳコア、Ｇ_１及びＧ_２のＩＣ_５０値は、最高検査濃度（２００μｇ／ｍｌ）が細胞成長の５０％の阻害をもたらさなかったので、計算できなかった。結果は、これらのナノ小球が生物医学的応用に関して低い毒性を有することを示す。

本出願を通して、種々の公報が参照された。これらの公報の開示は、本明細書に記載された化合物、組成物及び方法を更に十分に記載するために、参照によって本出願に全体として組み込まれる。

種々の修正及び変形が、本明細書に記載された化合物、組成物及び方法に行うことができる。本明細書に記載された化合物、組成物及び方法の他の態様は、明細書の検討及び本明細書に開示された化合物、組成物及び方法の実施から明白であろう。明細書及び実施例は、例として役立つものとみなされることが意図される。

Claims (44)

1. リンカー修飾多面体シルセスキオキサンを反応させることを含む方法によって製造されるデンドリマーであって、リンカーが、第１デンドリマーアーム前駆体を有する少なくとも１つの反応基を含み、前記第１デンドリマーアーム前駆体が３つ以上の官能基を含み、前記第１デンドリマーアーム前駆体上の少なくとも１つの官能基が第１世代デンドリマーを生成するために前記リンカー上の反応基と反応できるデンドリマー。
2. 前記リンカーが、アルキレン基、エーテル基、芳香族基、ペプチド基、チオエーテル基又はイミノ基を含む請求項１に記載のデンドリマー。
3. 前記反応基が、１つ以上の求核基を含み、ここで前記求核基はヒドロキシル基、チオール基又は置換若しくは非置換アミンを含む請求項１に記載のデンドリマー。
4. 前記反応基が、１つ以上の求電子基を含む請求項１に記載のデンドリマー。
5. 前記求電子基が、ハロゲン、カルボキシル基、エステル基、ハロゲン化アシル基、スルホン酸基又はエーテル基を含む請求項４に記載のデンドリマー。
6. 前記リンカー修飾シルセスキオキサンが、式（ＲＳｉＯ_１．５）_ｐ（式中、Ｒは、前記リンカーの残基を含み、かつｐは６、８、１０又は１２である）を含む請求項１に記載のデンドリマー。
7. 前記リンカー修飾シルセスキオキサンが、Ｒ_８Ｓｉ_８Ｏ_１２（式中、Ｒは、前記リンカーの残基を含む）である請求項１に記載のデンドリマー。
8. Ｒが、−（ＣＨ_２）_ｑＹ（式中、ｑは１から１０であり、かつＹは求電子基を含み、ここで前記求電子基は、ハロゲン、カルボキシル基、エステル基、ハロゲン化アシル基、スルホン酸基又はエーテル基を含む）を含む請求項７に記載のデンドリマー。
9. Ｒが、−（ＣＨ_２）_ｒＸＨ（式中、ｒは１から１０であり、かつＸはＯ、Ｓ又はＮＨである）を含む請求項７に記載のデンドリマー。
10. 前記リンカー修飾シルセスキオキサンが、Ｒ_８Ｓｉ_８Ｏ_１２（式中、各Ｒは−（ＣＨ_２）_３ＮＨ_２である）である請求項１に記載のデンドリマー。
11. 前記第１デンドリマーアーム前駆体は、３つの官能基を含み、ここで前記官能基は、１つの求電子基及び２つ以上の求核基を含む請求項１に記載のデンドリマー。
12. 前記第１デンドリマーアーム前駆体は、３つの官能基を含み、ここで前記官能基は、１つの求核基及び２つ以上の求電子基を含む請求項１に記載のデンドリマー。
13. 前記第１デンドリマーアーム前駆体が、アミノ酸、アミノ酸誘導体、又はアミノ酸の医薬上許容し得る塩若しくはエステルを含み、ここで前記アミノ酸が、３つの官能基を含む請求項１に記載のデンドリマー。
14. 前記アミノ酸が、グリシン、３−アミノプロピオン酸、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、４−ヒドロキシプロリン（４−ｈｙｄｒｏｐｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンを含む請求項１３に記載のデンドリマー。
15. 前記第１デンドリマーアーム前駆体が、リシン、リシン誘導体、又はリシンの医薬上許容し得る塩若しくはエステルを含む請求項１に記載のデンドリマー。
16. 前記第１デンドリマーアーム前駆体の量が、各リンカー上の全反応基と反応するために十分である請求項１に記載のデンドリマー。
17. 前記リンカー修飾シルセスキオキサンが、Ｒ_８Ｓｉ_８Ｏ_１２（式中、各Ｒは−（ＣＨ_２）_３ＮＨ_２である）であり、かつ前記第１デンドリマーアーム前駆体が、リシンを含む請求項１に記載のデンドリマー。
18. 前記第１世代デンドリマーが、高世代デンドリマーを生成するために、その後に追加のデンドリマーアーム前駆体と反応する前記請求項１に記載のデンドリマー。
19. 前記高世代デンドリマーが、第２世代デンドリマーから世代１０デンドリマーを含む請求項１８に記載のデンドリマー。
20. 前記デンドリマーに生物活性剤を錯化することを更に含む請求項１に記載のデンドリマー。
21. 前記生理活性剤が、天然又は合成オリゴヌクレオチド、天然又は修飾／遮断ヌクレオチド／ヌクレオシド、核酸、天然又は修飾／遮断アミノ酸を含むペプチド、その抗体又は断片、ウイルス、ハプテン、生物学的リガンド、膜タンパク質、脂質膜又は小型医薬分子を含む請求項２０に記載のデンドリマー。
22. 前記生理活性剤が、ＤＮＡ又はその断片を含む請求項２０に記載のデンドリマー。
23. 前記生理活性剤が、ＲＮＡ又はその断片を含む請求項２０に記載のデンドリマー。
24. 少なくとも１つのデンドリマーアームに共有結合される標的薬剤を更に含む請求項１に記載のデンドリマー。
25. 前記標的薬剤が、生物活性剤又は造影剤送達用のタンパク質、抗体又はペプチドを含む請求項２４に記載のデンドリマー。
26. 前記生物活性剤が、化学療法剤又は核酸を含む請求項２５に記載のデンドリマー。
27. 前記デンドリマーに造影剤を錯化することを更に含む請求項１に記載のデンドリマー。
28. 前記造影剤が、デノプティカル染料（ｄｅｎｏｐｔｉｃａｌ ｄｙｅ）、ＭＲＩ造影剤、ＰＥＴプローブ、ＳＰＥＣＴプローブ、ＣＴ造影剤又は超音波造影剤を含む請求項２７に記載のデンドリマー。
29. 多面体シルセスキオキサンを含むコアと、多面体シルセスキオキサンに共有結合した複数のリンカーと、リンカーに共有結合した複数のデンドリマーアームとを含むデンドリマーであって、前記デンドリマーアームが少なくとも２つの官能基を含むデンドリマー。
30. 生物活性剤又は造影剤は、少なくとも１つのデンドリマーアームに錯化される請求項２９に記載のデンドリマー。
31. 少なくとも１種のキレート剤が、少なくとも１つのデンドリマーアームに共有結合され、かつ前記キレート剤が、造影剤と錯化する請求項２９に記載のデンドリマー。
32. 前記キレート剤が、少なくとも１つのヘテロ原子を含む環状又は非環状化合物を含む請求項３１に記載のデンドリマー。
33. 前記キレート剤が、ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）又はその誘導体、１，４，７，１０−テトラアザドデカンテトラアセテート（ＤＯＴＡ）及びその誘導体、１，４，７，１０−テトラアザドデカン−１，４，７−トリアセテート（ＤＯ３Ａ）及びその誘導体、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）及びその誘導体、１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン四酢酸（ＴＲＩＴＡ）及びその誘導体、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）及びその誘導体、１，４，７，１０−テトラアザドデカンテトラメチルアセテート（ＤＯＴＭＡ）及びその誘導体、１，４，７，１０−テトラアザドデカン−１，４，７−トリメチルアセテート（ＤＯ３ＭＡ）及びその誘導体、Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラホスホネートメチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ＤＯＴＰ）及びその誘導体、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（メチレンメチルホスホン酸）（ＤＯＴＭＰ）及びその誘導体、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（メチレンフェニルホスホン酸）（ＤＯＴＰＰ）及びその誘導体を含む請求項３１に記載のデンドリマー。
34. 前記造影剤が、デノプティカル染料、ＭＲＩ造影剤、ＰＥＴプローブ、ＳＰＥＣＴプローブ、ＣＴ造影剤又は超音波造影剤を含む請求項３１に記載のデンドリマー。
35. 前記ＭＲＩ造影剤が、Ｇｄ^＋３、Ｅｕ^＋３、Ｔｍ^＋３、Ｄｙ^＋３、Ｙｂ^＋３、Ｍｎ^＋２又はＦｅ^＋３イオン又は錯体を含む請求項３１に記載のデンドリマー。
36. 前記ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴプローブが、^５５Ｃｏ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^４７Ｓｃ、^６６Ｇａ、^６８Ｇａ、^９０Ｙ、^９７Ｒｕ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^１０９Ｐｄ、^１５３Ｓｍ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ又は^１８８Ｒｅを含む請求項３１に記載のデンドリマー。
37. 医薬上許容し得る担体と、請求項１から３６のデンドリマーとを含む医薬組成物。
38. 細胞に生物活性剤を送達する方法であって、請求項１から３６のデンドリマーに錯化又は共役された前記生物活性剤と前記細胞を接触させることを含む方法。
39. 前記接触ステップが、インビトロ、インビボ又はエキソビボである請求項３８に記載の方法。
40. 癌を有する患者を治療する方法であって、請求項１から３６のデンドリマーに錯化又は共役された有効量の生物活性剤を前記被検者に投与することを含む方法。
41. 前記癌が、乳癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌、精巣癌、グリア芽腫、肉腫、骨肉腫、頭頚部癌及び皮膚癌を含む請求項４０に記載の方法。
42. 前記生物活性剤が、核酸又は医薬分子を含む請求項４０に記載の方法。
43. 被検者中の細胞又は組織を撮像する方法であって、（１）請求項１から３６のデンドリマーに錯化された造影剤を前記被検者に投与することと、（２）前記造影剤を検出することとを含む方法。
44. 被検者中の細胞又は組織を撮像する方法であって、（１）請求項１から３６のデンドリマーに錯化された造影剤と前記細胞又は組織を接触させることと、（２）前記造影剤を検出することとを含む方法。