CN118119411A - 肽类树枝状大分子及其使用方法 - Google Patents

肽类树枝状大分子及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本说明书涉及包含一个或多个源自具有式(I)的经修饰赖氨酸的残基的肽类树枝状大分子、包含这些肽类树枝状大分子的药物递送系统、含有这些肽类树枝状大分子的药物组合物，以及这些肽类树枝状大分子、药物递送系统和药物组合物在疗法中的用途。

Description

肽类树枝状大分子及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年10月8日提交的美国临时申请号63/262,269的优先权权益，该临时申请出于所有目的通过援引以其全文并入本文。
技术领域
本说明书涉及包含一个或多个源自经修饰赖氨酸的残基的肽类树枝状大分子，以及这些肽类树枝状大分子用于将药物活性剂、特别是遗传物质递送到细胞中的用途。本说明书进一步涉及这些肽类树枝状大分子在疗法中的用途。
背景技术
基因疗法属于聚焦于将(外来)遗传物质(例如DNA和RNA)以治疗为目的递送到患者细胞中以治疗疾病的医学领域。迄今为止，包括(RPE65突变诱导的目盲)和(嵌合抗原受体T细胞疗法)在内的几种基因疗法已经获得了针对多种不同医学病症的监管批准。
基因递送是用于将遗传物质引入细胞的过程。为了成功，遗传物质必须在运输过程中保持稳定并最终内化到靶细胞中。当遗传物质是DNA时，必须将其内化到靶细胞中并递送到细胞核中。基因递送需要载体，合适的载体一般分为两类：病毒载体和非病毒载体。
病毒介导的基因递送利用病毒将其DNA注入宿主细胞的能力。为了形成病毒载体，可将遗传物质包装成复制缺陷型病毒颗粒。病毒方法虽然高效，但可能诱发免疫应答。此外，这些方法只能将非常小块的遗传物质递送入细胞，生产病毒载体需要消耗大量劳力，并且存在随机插入位点、细胞病变效应和诱变的风险。
在结构通用性和可规模化方面，合成载体在基因递送应用中与病毒载体相比具有多个优势；且合成载体可单独且特定设计以实现某一所希望的目的。可以设计这些物质以将遗传物质包装成纳米颗粒或囊泡，这些纳米颗粒或囊泡被工程化来克服与细胞摄取、运输到细胞溶质以及(如果需要)递送到细胞核相关的生物屏障。常见的方法是用材料(例如聚合物、肽或脂质，它们包含与阴离子核酸缔合的正电荷)将遗传物质包装成多分子组件。正负电荷之间的静电相互作用促使自组装成纳米颗粒结构或微粒结构，这些颗粒的大小和形状可以由材料类型和冷凝条件控制(Park等人，Adv Drug Del Rev[先进药物递送评论],2006,58(4):467-86)。
例如，将DNA配制成合适的载体(如纳米颗粒)显著提高细胞对DNA的摄取(与对未配制的DNA的摄取相比)。DNA太大且带负电荷，无法通过被动过程(例如穿过细胞膜的扩散)自行内化到细胞(其也具有净负电荷)中。未配制的DNA也易引发导致其降解的免疫应答。将DNA配制成合适载体可以中和其负电荷，并且保护其免于在细胞外空间降解。
为了使载体被有效内化，必须使其经由称为内吞作用的过程运输到细胞中。在这个过程期间，载体被细胞膜的区域包围，然后其在细胞内出芽形成内体。必须设计载体以允许该过程发生，但随后要降低被溶酶体截留(即隔离到酸性膜结合的溶酶体室中)的可能性。实现这一点的一种方法是确保在溶酶体运输发生前内体破裂。这可以通过载体缓冲内体pH(细胞摄取后内体变得愈发呈酸性)来实现，直到产生的渗透梯度导致内体破裂并将遗传物质释放到可以将其用于进行转录/翻译的细胞质中。在内体缓冲范围(pH 7.4-pH 5.0)内具有有效的缓冲能力的合适的载体材料可以通过接受质子来减缓对内体的酸化，其导致更多的质子和反荷离子从细胞溶质中流入。
目前的合成基因递送系统在体内受到遗传物质的低稳定性、高毒性和低效的细胞质进入的限制。将适用于基因递送的多功能材料工程化(在保持高递送效率的同时，实现配制品特性(大小、电荷等)、稳定性、缓冲能力和毒性之间的最佳平衡)已被证明是困难且复杂的，但这样将显著简化最终配制品。
肽类树枝状大分子(PD)是包含氨基酸残基的3维结构，其中残基之一的侧链，例如赖氨酸的ε-胺用于形成分支或代，从而将分子构建成三维(3-D)高分子。肽类树枝状大分子通常是使用固相肽合成产生的，允许在明确的结构内精确控制氨基酸残基序列和几何形状。最终产品是单分散的，具有高度可定制的特性(即疏水性、电荷密度和分子量)，可实现多功能优化和灵活应用。
已对肽类树枝状大分子进行了广泛探索，但生产成本和低蛋白水解稳定性阻碍了临床成功。Kwok等人(ACS Nano[美国化学会纳米期刊],2013年5月28日；7(5):4668-82,doi:10.1021/nn400343z和ChemBioChem[化学生物化学杂志],2016,17(23),2223-2229)探索了肽类树枝状高分子/脂质杂合系统作为DNA和RNA转染试剂，但由于合成限制、限制性材料功能和体内功效而仅限于二肽分支。
本申请描述了包含一个或多个源自经修饰赖氨酸的残基的某些肽类树枝状大分子。这些肽类树枝状大分子i)具有增强的缓冲特性，可对这些特性加以调整以在细胞内化和溶酶体运输过程中发生的pH转换期间实现质子化，ii)由于通过静电和非静电(例如π-π堆积)相互作用增加的核酸结合而更加稳定，iii)当使用天然存在的且不太可能具有毒性或免疫原性的基于代谢物的核心单元时，具有增加的生物相容性，且/或iv)通过特定的细胞内酶降解(组织蛋白酶-B)实现响应性核酸释放。这些肽类树枝状大分子与包括质粒DNA、mRNA、siRNA和反义寡核苷酸(ASO)在内的多种核酸形式形成纳米颗粒(约25-100nm，球体、棒体和超环状体)，并在向小鼠静脉注射后血清稳定性升高且血液循环延长，无相关毒性。它们已表现出一定能力，能够成功递送和/或共同递送多种多样核酸形式(包括DNA、mRNA、siRNA和ASO)，并能够保护包封的遗传物质在进入细胞之前不会轻易解离。此外，RNA/DNA在同一纳米颗粒中的共同递送允许控制蛋白质表达动力学(即协同治疗剂的表达)，并将纳米颗粒的应用扩展到需要多种组分的领域，例如CRISPR。
发明内容
本说明书部分地描述了肽类树枝状大分子，其包含一个或多个源自具有式(I)的经修饰赖氨酸的残基：
其中：
A是键、C1-6亚烷基、碳环基或杂环基；其中所述碳环基或杂环基可任选地在碳上被一个或多个R2取代；并且其中如果所述杂环基含有-NH-部分，则氮可任选地被选自RA的基团取代；
Q是键、碳环基或杂环基；其中所述碳环基或杂环基可任选地在碳上被一个或多个R3取代；并且其中如果所述杂环基含有-NH-部分，则氮可任选地被选自RB的基团取代；
环B是吗啉基或硫代吗啉基；其中如果所述吗啉基或硫代吗啉基含有-NH-部分，则氮可任选地被选自RC的基团取代；
R1、R2和R3各自独立地选自卤代、硝基、氰基、羟基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、羧基、氨甲酰基、巯基、氨磺酰基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、乙酰基、乙酰氧基、甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、N-甲基-N-乙基氨基、乙酰基氨基、N-甲基氨甲酰基、N-乙基氨甲酰基、N,N-二甲基氨甲酰基、N,N-二乙基氨甲酰基、N-甲基-N-乙基氨甲酰基、甲基硫代、乙基硫代、甲基亚磺酰基、乙基亚磺酰基、甲磺酰基、乙基磺酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺酰基、N-乙基氨磺酰基、N,N-二甲基氨磺酰基、N,N-二乙基氨磺酰基以及N-甲基-N-乙基氨磺酰基；
n是0-4；
RA、RB和RC独立地选自甲基、乙基、丙基、异丙基、乙酰基、甲磺酰基、乙基磺酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基、氨甲酰基、N-甲基氨甲酰基、N-乙基氨甲酰基、N,N-二甲基氨甲酰基、N,N-二乙基氨甲酰基和N-甲基-N-乙基氨甲酰基。
本说明书还部分地描述了如本文所述的肽类树枝状大分子，其用于将药物活性剂递送到细胞中。
本说明书还部分地描述了药物组合物，其包含如本文所述的一种或多种肽类树枝状大分子和药物活性剂。
本说明书还部分地描述了基因疗法方法，该方法包括向所述动物施用有效量的如本文所述的药物组合物。
具体实施方式
许多实施例在整个说明书中详细描述并且对于本领域技术读者将是显而易见的。本披露不被解释为受限于任何所阐述的实施例。
“一个/种(a)”意指“至少一个/种”。在任何实施例中，在使用“一个/种(a)”表示给定材料或元素时，“一个/种(a)”可以意指一个/种。
“包含”意指给定材料或元素可含有其他材料或元素。在任何实施例中，在提及“包含”时，给定材料或元素可由该材料或元素的至少1％w/w、至少5％w/w、至少10％w/w、至少20％w/w、至少30％w/w、或至少40％w/w组成。“包含”还可以意指“由给定材料或元素组成”(“consisting of”或“consists of”)或“基本上由给定材料或元素组成”(“consistingessentially of”或“consists essentially of”)。
“由……组成(“consisting of”或“consists of”)”意指给定材料或元素完全由该材料或元素组成。在任何实施例中，在提及“由……组成(“consisting of”或“consistsof”)”时，给定材料或元素可以由该材料或元素的100％w/w组成。
“基本上由……组成(“consisting essentially of”或“consists essentiallyof”)”意指给定材料或元素几乎完全由该材料或元素组成。在任何实施例中，在提及“基本上由……组成(“consisting essentially of”或“consists essentially of”)”时，给定材料或元素可以由该材料或元素的至少50％w/w、至少60％w/w、至少70％w/w、至少80％w/w、至少90％w/w、至少95％w/w或至少99％w/w组成。
在任何实施例中，在用“是”或“可为”来定义材料或元素时，“是”或“可为”可以意指该材料或元素“由该材料或元素组成”或“基本上由该材料或元素组成”。
在本说明书的任何实施例中，在提及“约”时，“约”可以意指所引用数字的+/-0％(即无差异)、+/-0.01％、+/-0.05％、+/-0.1％、+/-0.5％、+/-1％、+/-2％、+/-5％、+/-10％或+/-20％。当一个数字被引用时，在另一实施例中这进一步是指大约为所引用的数字。
权利要求是实施例。
本文披露了肽类树枝状大分子，其包含一个或多个源自具有式(I)的经修饰赖氨酸的残基：
其中A、Q、B、R1和n如本文所述。
在一个实施例中，A是键。
在一个实施例中，A是C1-6亚烷基。
在一个实施例中，A是亚甲基。
在一个实施例中，A是碳环基；其中所述碳环基可任选地在碳上被一个或多个R2取代。
在一个实施例中，A是杂环基；其中所述杂环基可任选地在碳上被一个或多个R2取代；并且其中如果所述杂环基含有-NH-部分，则氮可任选地被选自RA的基团取代。
在一个实施例中，A是杂环基。
在一个实施例中，A是吡啶基。
在一个实施例中，A是键、C1-6亚烷基或杂环基。
在一个实施例中，A是键、亚甲基或吡啶基。
在一个实施例中，Q是键。
在一个实施例中，Q是碳环基；其中所述碳环基可任选地在碳上被一个或多个R3取代。
在一个实施例中，Q是杂环基；其中所述杂环基可任选地在碳上被一个或多个R3取代；并且其中如果所述杂环基含有-NH-部分，则氮可任选地被选自RB的基团取代。
在一个实施例中，环B是吗啉基。
在一个实施例中，环B是吗啉基；其中如果所述吗啉基含有-NH-部分，则氮可任选地被选自RC的基团取代。
在一个实施例中，环B是硫代吗啉基。
在一个实施例中，环B是硫代吗啉基；其中如果所述硫代吗啉基含有-NH-部分，则氮可任选地被选自RC的基团取代。
在一个实施例中，R1是卤代。
在一个实施例中，n是0。
在一个实施例中，n是1。
在一个实施例中，n是2。
在一个实施例中，n是3。
在一个实施例中，n是4。
在一个实施例中，提供了肽类树枝状大分子，其包含一个或多个源自具有式(I)的经修饰赖氨酸的残基，其中：
A是键、C1-6亚烷基或杂环基；
Q是键；
环B是吗啉基或硫代吗啉基；并且
n是0。
在一个实施例中，提供了肽类树枝状大分子，其包含一个或多个源自具有式(I)的经修饰赖氨酸的残基，其中：
A是键、亚甲基或吡啶基；
Q是键；
环B是吗啉基或硫代吗啉基；以及
n是0。
在一个实施例中，具有式(I)的经修饰赖氨酸是具有式(IA)的经修饰赖氨酸：
其中A、Q、B、R1和n如本文所述。具有式(IA)的经修饰赖氨酸也可称为经修饰D-赖氨酸。
在一个实施例中，具有式(I)的经修饰赖氨酸是具有式(IB)的经修饰赖氨酸：
其中A、Q、B、R1和n如本文所述。具有式(IB)的经修饰赖氨酸也可称为经修饰L-赖氨酸。
在一个实施例中，具有式(I)的经修饰赖氨酸选自：
2-氨基-6-{[6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羰基]氨基}己酸；
2-氨基-6-[(硫代吗啉-3-羰基)氨基]己酸；以及
2-氨基-6-[2-(吗啉-4-基)乙酰胺基]己酸。
在一个实施例中，具有式(I)的经修饰赖氨酸选自：
(R)-2-氨基-6-{[6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羰基]氨基}己酸；
(R)-2-氨基-6-[(硫代吗啉-3-羰基)氨基]己酸；以及
(R)-2-氨基-6-[2-(吗啉-4-基)乙酰胺基]己酸。
在一个实施例中，具有式(I)的经修饰赖氨酸选自：
(S)-2-氨基-6-{[6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羰基]氨基}己酸；
(S)-2-氨基-6-[(硫代吗啉-3-羰基)氨基]己酸；以及
(S)-2-氨基-6-[2-(吗啉-4-基)乙酰胺基]己酸。
如本文所用，术语“取代的”当指化学基团时，意指该化学基团具有一个或多个氢原子，该一个或多个氢原子被去除并被取代基替代。如本文所用，术语“取代基”具有本领域已知的普通含义，并且是指共价附接到亲本基团的化学部分。如本文所用，术语“任选地取代的”意指化学基团可不具有取代基(即未取代的)或可具有一个或多个取代基(即取代的)。应理解的是，给定原子处的取代受化合价限制。在任选的取代基选自基团的列表的情况下，应理解的是，该定义包括选自指定基团之一的所有取代基或选自两个或更多个指定基团的取代基。在可能存在不止一个相同取代基的情况下，例如R2，应理解的是，该定义还包括选自指定基团之一的所有此类取代基或选自两个或更多个指定基团的取代基。
如本文所用，术语“Ci-j”表示碳原子数的范围，其中i和j是整数，并且碳原子数的范围包括端点(即i和j)和介于两者之间的每个整数点，并且其中j大于i。例如，C1-6表示一到六个碳原子的范围，包括一个碳原子、两个碳原子、三个碳原子、四个碳原子、五个碳原子和六个碳原子。在一些实施例中，术语“C1-6”表示1到6、1到5、1到4、1到3或1到2个碳原子。
如本文所用，术语“烷基”(无论是作为另一个术语的一部分还是独立地使用)是指饱和烃链。上述烃链可以是直链或支链。术语“Ci-j烷基”是指具有i到j个碳原子的烷基。C1-6烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基；更高级的同系物，例如2-甲基-1-丁基、正戊基、3-戊基、正己基、1,2,2-三甲基丙基等。对“丁基”等基团的提及(未作进一步限制)是指所有形式的丁基，例如正丁基和叔丁基等。
如本文所用，术语“亚烷基”(无论是作为另一个术语的一部分还是独立地使用)是指饱和烃链。上述烃链可以是直链或支链。术语“Ci-j亚烷基”是指具有i到j个碳原子的烷基。C1-6亚烷基的实例包括但不限于亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2-CH2-)、亚丙基(-CH2-CH2-CH2-)和亚丁基(-CH2-CH2-CH2-CH2-和-CH2-CH(CH3)-CH2-等)等。
如本文所用，术语“卤代”是指氟、氯、溴和碘。
“杂环基”是含有4-12个原子的饱和的、部分饱和的或不饱和的单环或双环，该4-12个原子中的至少一个原子选自氮、硫或氧，除非另有规定，否则该杂环基可以是碳或氮连接的，其中，-CH2-基团可任选地被-C(O)-替代，并且环硫原子可任选地氧化形成S-氧化物。术语“杂环基”的实例和合适的值是吗啉代、哌啶基、吡啶基、吡喃基、吡咯基、吡唑基、异噻唑基、吲哚基、喹啉基、噻吩基、1,3-苯并二氧杂环戊烯基、噻二唑基、哌嗪基、噻唑烷基、吡咯烷基、硫代吗啉代、吡咯啉基、高哌嗪基、3,5-二氧杂哌啶基、四氢吡喃基、咪唑基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、异噁唑基、N-甲基吡咯基、4-吡啶酮、1-异喹啉酮、2-吡咯烷酮和4-噻唑烷酮。术语“杂环基”的具体实例是吡啶基。在一个实施例中，“杂环基”是含有5或6个原子的饱和的、部分饱和的或不饱和的单环，该5或6个原子中的至少一个原子选自氮、硫或氧，除非另有规定，否则该杂环基可以是碳或氮连接的，-CH2-基团可任选地被-C(O)-替代，并且环硫原子可任选地氧化形成S-氧化物。
“碳环基”是含有3-12个原子的饱和的、部分饱和的或不饱和的单环或双环碳环；其中-CH2-基团可任选地被-C(O)-替代。在一个实施例中，“碳环基”是含有5或6个原子的单环或含有9或10个原子的双环。“碳环基”的合适的值包括环丙基、环丁基、1-氧代环戊基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、苯基、萘基、萘满基、茚满基或1-氧代茚满基。“碳环基”的具体实例是苯基。
本披露的“化合物”涵盖化合物中的原子的所有同位素。原子的同位素包括原子数相同但质量数不同的原子。例如，除非另有规定，本披露“化合物”中的氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴或碘还旨在包括其同位素，例如但不限于：1H、2H、3H、11C、12C、13C、14C、14N、15N、16O、17O、18O、31P、32P、32S、33S、34S、36S、17F、19F、35Cl、37Cl、79Br、81Br、127I和131I。在一些实施例中，氢包括氕、氘和氚。在一些实施例中，氢是指氕。在一些实施例中，氢是指氘。在一些实施例中，氢是指氚。在一些实施例中，术语“被氘取代”或“氘取代的”是用氘替代化学基团中的氢的其他同种型(例如氕)。在一些实施例中，碳包括12C和13C。
残基
本文所述的肽类树枝状大分子中的氨基酸经由α-氨基基团和羧基基团之间的肽键连接在一起形成链。一旦在链中连接，单独的氨基酸被称为“残基”。“残基”源自氨基酸。“残基”也可用于描述仅经由α-氨基基团或羧基基团连接的末端氨基酸；任选地其中末端氨基基团是经修饰的氨基基团或末端羧基基团是经修饰的羧基基团(如下文所述)。本文对特定氨基酸(例如“赖氨酸”)的提及可能是指氨基酸本身或残基，这取决于上下文。
经修饰赖氨酸
在任何实施例中，在提及经修饰赖氨酸或源自经修饰赖氨酸的残基时，这些是指根据式(I)修饰的赖氨酸及其实施例。
在任何实施例中，在提及经修饰赖氨酸或源自经修饰赖氨酸的残基时，这可以指经修饰D-赖氨酸。
在任何实施例中，在提及经修饰赖氨酸或源自经修饰赖氨酸的残基时，这可以指经修饰L-赖氨酸。
盐形式
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指盐形式的肽类树枝状大分子。
如本文所用，“盐形式”是指本文所述的肽类树枝状大分子的衍生物，其中通过将一个或多个现有的酸性部分(例如羧基等)和/或碱性部分(例如胺、碱等)转化为其盐形式来修饰母体化合物。在许多情况下，由于氨基和/或羧基基团或与其类似的基团的存在，本披露的化合物能够形成酸盐和/或碱盐。特定的盐形式是药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”是安全且有效地用于在哺乳动物，特别是人类中使用的盐。
本文所述的肽类树枝状大分子的合适的盐形式包括例如酸加成盐，该酸加成盐可源自例如无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)或有机酸(例如，甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、均苯三甲酸、柠檬酸、乳酸、苯乙酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、萘二磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、三氟乙酸、水杨酸、磺基水杨酸等)。特定的酸加成盐是盐酸盐。
本文所述的肽类树枝状大分子的合适的盐形式包括例如碱加成盐，该碱加成盐可源自例如无机碱(例如，钠、钾、铵盐和来自周期表第I至XII列的金属(例如钙、镁、铁、银、锌、铜等)的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐)或有机碱(例如伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环胺、碱性离子交换树脂等)。某些有机胺包括但不限于异丙基胺、苄星青霉素(benzathine)、胆碱盐(cholinate)、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨丁三醇。另外的合适盐的列表可以例如见于以下中：“Remington'sPharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]”，第20版，Mack Publishing Company[麦克出版公司],Easton,Pa.[宾夕法尼亚州伊斯顿],(1985)；也见于Stahl和Wermuth的“Handbook of PharmaceuticalSalts:Properties,Selection and Use[药用盐手册：特性、选择和使用]”(约翰威立国际出版公司(Wiley-VCH)，德国魏因海姆(Weinheim,Germany),2002)。
本文使用的肽类树枝状大分子术语
本申请描述了一种肽类树枝状大分子，其包含一个或多个源生自如本文所述的具有式(I)的经修饰赖氨酸的残基。在本文中提及肽类树枝状大分子时，这是指包含氨基酸残基的3维结构，其中残基之一的侧链，例如赖氨酸的ε-胺形成分支点，从而产生后续代，将分子构建成三维高分子。肽类树枝状大分子包含至少一个分支点，形成具有至少一代(G1)的非线性分子。
本文使用了以下术语：
·第0代：肽类树枝状大分子内第一分支点之前的氨基酸残基序列。
·分支点：侧链因开始新一代的氨基酸残基的新增而被修饰的氨基酸残基。
·代：分支点之间的氨基酸残基，其中每个后续系列代被编号(G1、G2、G3…)。
·靶向基团：对特定细胞类型或器官具有亲和力的部分，例如基于糖、小分子、肽和/或抗体的部分。
按照惯例，先绘制肽的N末端氨基酸，最后绘制C末端氨基酸(从左到右书写)。
除非另有说明，赖氨酸(LYS)是指未经修饰的赖氨酸。
在氨基酸可以是手性的任何实施例中，这可以指D-氨基酸。
在氨基酸可以是手性的任何实施例中，这可以指L-氨基酸。
在氨基酸可以是手性的任何实施例中，氨基酸可以是L-氨基酸和D-氨基酸的混合物。
肽类树枝状大分子
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指经由允许精确控制其组合物和纯度的技术合成的肽类树枝状大分子。合适的技术包括固相肽合成。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指其中分支点、第0代和后续代一起包含少于120个氨基酸残基的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指其中分支点、第0代和后续代一起包含少于100个氨基酸残基的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指其中分支点、第0代和后续代一起包含少于80个氨基酸残基的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指其中分支点、第0代和后续代一起包含少于60个氨基酸残基的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指其中分支点、第0代和后续代一起包含约52个氨基酸残基的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指其中分支点、第0代和后续代一起包含52个氨基酸残基的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，肽类树枝状大分子可呈盐形式。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，肽类树枝状大分子包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、以及一个或多个亮氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，肽类树枝状大分子包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、以及一个或多个精氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，肽类树枝状大分子包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、以及一个或多个赖氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，肽类树枝状大分子包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、一个或多个精氨酸残基、以及一个或多个赖氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，肽类树枝状大分子包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、一个或多个亮氨酸残基、以及一个或多个赖氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，肽类树枝状大分子包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、一个或多个精氨酸残基、以及一个或多个亮氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，至少一代包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、以及一个或多个亮氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，至少一代包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、以及一个或多个精氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，至少一代包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、以及一个或多个赖氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，至少一代包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、一个或多个精氨酸残基、以及一个或多个赖氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，至少一代包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、一个或多个亮氨酸残基、以及一个或多个赖氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，至少一代包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、一个或多个精氨酸残基、以及一个或多个亮氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，一代或多代包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、以及一个或多个亮氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，一代或多代包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、以及一个或多个精氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，一代或多代包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、以及一个或多个赖氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，一代或多代包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、一个或多个精氨酸残基、以及一个或多个赖氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，一代或多代包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、一个或多个亮氨酸残基、以及一个或多个赖氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，一代或多代包含一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、一个或多个精氨酸残基、以及一个或多个亮氨酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，侧链pKa>7.4的氨基酸％为25％-50％。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，侧链pKa>7.4的氨基酸％为25％-30％。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，侧链pKa>7.4的氨基酸％为30％-35％。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，侧链pKa>7.4的氨基酸％为35％-40％。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，侧链pKa>7.4的氨基酸％为40％-45％。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，侧链pKa>7.4的氨基酸％为45％-50％。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，侧链pKa＝4.0-6.5的氨基酸％为25％-50％。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，侧链pKa＝4.0-6.5的氨基酸％为25％-30％。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，侧链pKa＝4.0-6.5的氨基酸％为30％-35％。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，侧链pKa＝4.0-6.5的氨基酸％为35％-40％。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，侧链pKa＝4.0-6.5的氨基酸％为40％-45％。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，侧链pKa＝4.0-6.5的氨基酸％为45％-50％。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，在后续代的氨基酸残基中，侧链pKa>7.4的％为25％-50％，且侧链pKa＝4.0-6.5的％为25％-50％。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，肽类树枝状大分子包含具有式(II)的肽类树枝状大分子：
({X3}{X2}{X1})8({BP}{X3}{X2}{X1})4({BP}{X3}{X2}{X1})2{BP},
其中：
X1、X2、或X3之一是碱性氨基酸残基；
X1、X2、或X3中的另一个是疏水性氨基酸残基；
X1、X2、或X3中的剩余者是源自如本文定义的经修饰赖氨酸的
残基；并且
BP是分支点氨基酸残基。
在式(II)中，一个X1基团附接到BP氨基酸的α-胺，另一个附接到侧链上的反应基团上，例如氨基基团，例如附接到赖氨酸的ε-胺。具有式(II)的肽类树枝状大分子具有以下结构：
在具有式(II)的肽类树枝状大分子中，同一代内的X1氨基酸残基可能相同或不同，且/或不同代间的X1氨基酸残基可能相同或不同。同样分别适用于X2和X3。
在一个实施例中，X1是碱性氨基酸残基。
在一个实施例中，X1是疏水性氨基酸残基。
在一个实施例中，X1是源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基。
在一个实施例中，X2是碱性氨基酸残基。
在一个实施例中，X2是疏水性氨基酸残基。
在一个实施例中，X2是源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基。
在一个实施例中，X3是碱性氨基酸残基。
在一个实施例中，X3是疏水性氨基酸残基。
在一个实施例中，X3是源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基。
在一个实施例中：
X1是碱性氨基酸残基；
X2是疏水性氨基酸残基；并且
X3是源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基。
在一个实施例中：
X3是碱性氨基酸残基；
X2是疏水性氨基酸残基；并且
X1是源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基。
X1、X2、或X3之一是碱性氨基酸残基。碱性氨基酸残基是具有能够携带正电荷的侧链的氨基酸残基。
在一个实施例中，碱性氨基酸残基选自精氨酸、鸟氨酸和赖氨酸。
在一个实施例中，碱性氨基酸残基是精氨酸。
在一个实施例中，碱性氨基酸残基是鸟氨酸。
在一个实施例中，碱性氨基酸残基是赖氨酸。
在一个实施例中，X1选自精氨酸、鸟氨酸和赖氨酸。
在一个实施例中，X1是精氨酸。
在一个实施例中，X1是鸟氨酸。
在一个实施例中，X1是赖氨酸。
在一个实施例中，X2选自精氨酸、鸟氨酸和赖氨酸。
在一个实施例中，X2是精氨酸。
在一个实施例中，X2是鸟氨酸。
在一个实施例中，X2是赖氨酸。
在一个实施例中，X3选自精氨酸、鸟氨酸和赖氨酸。
在一个实施例中，X3是精氨酸。
在一个实施例中，X3是鸟氨酸。
在一个实施例中，X3是赖氨酸。
X1、X2、或X3之一是疏水性氨基酸残基。疏水性氨基酸残基是侧链主要由碳和氢构成的氨基酸残基，具有排斥水的倾向。
在一个实施例中，疏水性氨基酸残基选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸。
在一个实施例中，疏水性氨基酸残基是丙氨酸。
在一个实施例中，疏水性氨基酸残基是异亮氨酸。
在一个实施例中，疏水性氨基酸残基是亮氨酸。
在一个实施例中，疏水性氨基酸残基是苯丙氨酸。
在一个实施例中，疏水性氨基酸残基是色氨酸。
在一个实施例中，疏水性氨基酸残基是酪氨酸。
在一个实施例中，疏水性氨基酸残基是甲硫氨酸。
在一个实施例中，疏水性氨基酸残基是缬氨酸。
在一个实施例中，X1选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸。
在一个实施例中，X1是丙氨酸。
在一个实施例中，X1是异亮氨酸。
在一个实施例中，X1是亮氨酸。
在一个实施例中，X1是苯丙氨酸。
在一个实施例中，X1是色氨酸。
在一个实施例中，X1是酪氨酸。
在一个实施例中，X1是甲硫氨酸。
在一个实施例中，X1是缬氨酸。
在一个实施例中，X2选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸。
在一个实施例中，X2是丙氨酸。
在一个实施例中，X2是异亮氨酸。
在一个实施例中，X2是亮氨酸。
在一个实施例中，X2是苯丙氨酸。
在一个实施例中，X2是色氨酸。
在一个实施例中，X2是酪氨酸。
在一个实施例中，X2是甲硫氨酸。
在一个实施例中，X2是缬氨酸。
在一个实施例中，X3选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸。
在一个实施例中，X3是丙氨酸。
在一个实施例中，X3是异亮氨酸。
在一个实施例中，X3是亮氨酸。
在一个实施例中，X3是苯丙氨酸。
在一个实施例中，X3是色氨酸。
在一个实施例中，X3是酪氨酸。
在一个实施例中，X3是甲硫氨酸。
在一个实施例中，X3是缬氨酸。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，肽类树枝状大分子包含如本文定义的具有式(II)的肽类树枝状大分子，其中：
X1是精氨酸；
X2是亮氨酸；
X3是源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基；并且
BP是赖氨酸。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，肽类树枝状大分子包含如本文定义的具有式(II)的肽类树枝状大分子，其中：
X1是源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基；
X2是亮氨酸；
X3是精氨酸；并且
BP是赖氨酸。
第0代
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，肽类树枝状大分子包含与肽类树枝状大分子中的第一分支点氨基酸附接的称为“第0代”的氨基酸残基序列。第0代氨基酸残基序列可以在C末端、或N末端，特别是C末端。例如，具有第0代氨基酸残基序列的肽类树枝状大分子可以说明如下：
其中第一分支点是赖氨酸，上图中的第0代序列可以如下附接：
其中“..”代表分子的其余部分。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，肽类树枝状大分子在第一代之前的分支点氨基酸的C末端包含第0代氨基酸序列。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，肽类树枝状大分子在第一代之前的分支点氨基酸的N末端包含第0代氨基酸序列。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列包含一个或多个甘氨酸残基。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列包含一个甘氨酸残基。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列包含两个甘氨酸残基。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列包含三个甘氨酸残基。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列包含一个或多个缬氨酸残基。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列包含缬氨酸残基。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列包含一个或多个瓜氨酸残基。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列包含瓜氨酸残基。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列包含一个或多个丝氨酸残基。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列包含丝氨酸残基。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列包含一个或多个半胱氨酸残基。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列包含半胱氨酸残基。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列可以终止于半胱氨酸残基。末端半胱氨酸允许通过硫醇化学进行额外的功能化。在另一个实施例中，第0代序列可以终止于赖氨酸、丝氨酸、酪氨酸和/或氨基酸的反应性衍生物例如叠氮苯基丙氨酸。氨基酸的其他反应性衍生物包括含有叠氮化物、炔烃、环戊二烯和四嗪基团的那些。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列终止于半胱氨酸残基，其中末端羧基基团已被酰胺化形成C(O)NH2基团。酰胺化使COOH基团呈惰性并降低肽的总电荷并更好地模拟天然肽。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列包含甘氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、丙氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或半胱氨酸残基。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列包含甘氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、丝氨酸和/或半胱氨酸残基。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列包含甘氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、丝氨酸和半胱氨酸残基。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列由GLY-VAL-CIT-GLY-GLY-SER-CYS(SEQ ID NO 5)组成。
在任何实施例中，在提及第0代氨基酸序列时，第0代序列包含序列VAL-CIT、VAL-ALA、LYS-PHE、GLY-GLY-PHE-GLY(SEQ ID NO 1)或GLY-PHE-LEU-GLY(SEQ ID NO 2)。
分支点
分支点是侧链因开始新一代的氨基酸残基的新增而被修饰的氨基酸残基。分支点在下图中标记为BP：
当分支点是赖氨酸时，赖氨酸可以形成上图中的分支点，如下所示：
其中“..”代表分子的其余部分。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，肽类树枝状大分子内的分支点可以是相同或不同的氨基酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，肽类树枝状大分子内的分支点可以是相同的氨基酸残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指其中赖氨酸形成一个或多个分支点的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指其中赖氨酸形成所有分支点的肽类树枝状大分子。
代
肽类树枝状大分子包含多代。代可以说明如下：
其中G1代表第1代，G2代表第2代，G3代表第3代，它们统称为代。可以通过向G3代中的末端X3基团添加另一个分支点(BP)氨基酸然后添加G4代氨基酸残基序列(例如另外的X3-X2-X1基团)，以此类推来添加另一代。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由5个氨基酸残基组成的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由4个氨基酸残基组成的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由3个氨基酸残基组成的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由2个氨基酸残基组成的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由4个或更多个氨基酸残基组成的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由3个或更多个氨基酸残基组成的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由2个或更多个氨基酸残基组成的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由多达5个氨基酸残基组成的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由多达4个氨基酸残基组成的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由多达3个氨基酸残基组成的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由相同肽链组成的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由每代中相同肽链组成的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由不同肽链组成的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由每代中不同肽链组成的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含含有碱性氨基酸残基的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含含有疏水性氨基酸残基的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含含有碱性氨基酸残基和疏水性氨基酸残基的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含含有碱性氨基酸残基、疏水性氨基酸残基和源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含含有一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、以及一个或多个亮氨酸残基的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含含有一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、以及一个或多个精氨酸残基的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含含有一个或多个源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基、一个或多个精氨酸残基以及一个或多个亮氨酸残基的多代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含含有ARG-LEU-LYS(经修饰)的一代或多代的肽类树枝状大分子，其中LYS(经修饰)是源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由ARG-LEU-LYS(经修饰)组成的一代或多代的肽类树枝状大分子，其中LYS(经修饰)是源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含含有ARG-LEU-LYS(经修饰)的所有代的肽类树枝状大分子，其中LYS(经修饰)是源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由ARG-LEU-LYS(经修饰)组成的所有代的肽类树枝状大分子，其中LYS(经修饰)是源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含含有LYS(经修饰)-LEU-ARG的一代或多代的肽类树枝状大分子，其中LYS(经修饰)是源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由LYS(经修饰)-LEU-ARG组成的一代或多代的肽类树枝状大分子，其中LYS(经修饰)是源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含含有LYS(经修饰)-LEU-ARG的所有代的肽类树枝状大分子，其中LYS(经修饰)是源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含由LYS(经修饰)-LEU-ARG组成的所有代的肽类树枝状大分子，其中LYS(经修饰)是源自如本文定义的经修饰赖氨酸的残基。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含一代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含两代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含三代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含四代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含五代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指一代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指两代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指三代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指四代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指五代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含多于一代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含多于两代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含多于三代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含多于四代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含少于六代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含少于五代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含少于四代的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及肽类树枝状大分子时，这可以指包含少于三代的肽类树枝状大分子。
聚乙二醇肽类树枝状大分子
在另一实施例中，本文所述的肽类树枝状大分子可进一步包含生物相容的亲水聚合物，例如聚乙二醇或聚肌氨酸基团。
聚乙二醇(PEG)是由-(OCH2CH2)n-重复亚基组成的聚合物，其中通常n>3且<250。通常使用环氧乙烷的开环聚合进行合成。PEG聚合物可以是线性的或支链的。支链PEG通常具有三到三十个从中心核心基团发出的PEG链。
在一个实施例中，本文所述的肽类树枝状大分子可包含聚乙二醇基团，在本文称为“聚乙二醇肽类树枝状大分子”或“PEG肽类树枝状大分子”。PEG基团可以帮助稳定纳米颗粒并形成“隐形层”，通过空间屏蔽减少非特异性蛋白质相互作用。
PEG基团可以如下任选地通过连接基团附接到肽类树枝状大分子的第0代氨基酸序列中的末端氨基酸残基：
PEG基团可以通过末端-O-基团或通过PEG的末端-CH2-基团附接到肽类树枝状大分子；并且可以任选地通过连接基团附接到第0代氨基酸序列中末端氨基酸残基的胺或羧基。PEG基团还可以任选地通过连接基团附接到末端氨基酸残基侧链上的反应基团，例如末端半胱氨酸侧链上的-SH基团，特别地其中末端半胱氨酸的末端羧基基团也被酰胺化。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇肽类树枝状大分子时，在未附接到肽类树枝状大分子的PEG基团的末端可以有修饰，或者该末端可以是氢。聚乙二醇基团末端合适的修饰是例如C1-4烷基，例如甲基；或C1-4烷氧基，例如甲氧基。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇肽类树枝状大分子时，在未附接到肽类树枝状大分子的PEG基团的末端可以有反应基团，或者该末端可以是氢。合适的反应基团包括马来酰亚胺、叠氮化物、炔烃(例如C2-6炔烃)和环戊二烯。在PEG缀合到肽类树枝状大分子之前或之后，该反应基团可用于附接放射性标记、染料和靶向细胞的配体等种类。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇肽类树枝状大分子时，在聚乙二醇基团和肽类树枝状大分子之间可存在连接基团。合适的连接基团为C1-4烷基氨基，例如-CH2-CH2-NH-(形成例如PEG-CH2-CH2-NH-PD或PEG-NH-CH2-CH2-PD)；或C1-4亚烷基，例如-CH2-CH2-(形成例如PEG-CH2-CH2-PD)；其中PD是肽类树枝状大分子。
当聚乙二醇基团附接到末端氨基酸残基侧链上的反应基团，例如末端半胱氨酸侧链上的-SH基团时，可以采用各种方法来附接聚乙二醇基团。通常这使得聚乙二醇基团通过接头基团附接到肽类树枝状大分子。例如，用通过酰胺键连接到聚乙二醇的3-马来酰亚胺基丙酸官能团官能化的聚乙二醇是硫醇反应性试剂。聚乙二醇分子的另一端可以是以甲基终止的。使用这种性质的官能化聚乙二醇基团在PEG基团和肽类树枝状大分子之间产生接头基团的反应可以说明如下：
其中“PD-SH”中的“SH”是指半胱氨酸侧链上的硫醇，PD是肽类树枝状大分子，“n”是-(OCH2CH2)n-重复亚基的数量。
包含支链PEG基团的进一步官能化PEG基团的实例包括：
这种包含支链PEG基团的肽类树枝状大分子的实例是：
其中n是-CH2CH2O-重复亚基的数量，并且其中∑n(所有n个基团组合起来的总和)为4-250。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指分子量范围在0.5-30kDa之间的聚合物。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指分子量范围在2-20kDa之间的聚合物。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指分子量范围在4-11kDa之间的聚合物。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指分子量范围在1-6kDa之间的聚合物。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指分子量范围为约2kDa的聚合物。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指分子量范围为约5kDa的聚合物。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指分子量范围为约10kDa的聚合物。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n>3。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n>10。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n>20。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n>30。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n>50。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n>100。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n>150。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n>200。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n>250。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n<300。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n<250。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n<200。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n<150。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n<100。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n<50。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n<40。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n<30。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n<20。
在任何实施例中，在提及聚乙二醇时，这可以指包含-(OCH2CH2)n-重复亚基的聚合物，其中n<10。
靶向基团
在另一实施例中，本文所述的肽类树枝状大分子可进一步包含靶向基团。靶向基团是指与细胞结合和/或促进细胞内化的靶向部分。靶向基团可以如下任选地通过连接基团附接至肽类树枝状大分子的PEG基团：
在任何实施例中，在提及靶向基团时，靶向基团可以选自肽、抗体、糖或小分子。
可任选地通过连接基团附接到PEG基团的合适靶向肽包括：
·转移受体靶向肽，例如Ac-KGGGAWSIIDCSMNYCLYIEG(SEQ ID NO 3)(其中粗体“C”表示半胱氨酸通过二硫键交联)(例如https://doi.org/10.21954/ou.ro.0000d744)；
·环状RGD肽，例如靶向肿瘤和发炎脉管系统中的a3b5整合素的那些，例如Cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys)(SEQ ID NO 4)：
以及
·肌肉靶向肽，例如ASSLNIA(SEQ ID NO 6)(T I Samoylova1,B F Smith.MuscleNerve[肌肉与神经].1999年4月；22(4):460-6；doi:10.1002/(sici)1097-4598(199904)22:4<460::aid-mus6>3.0.co；2-l)。
合适的靶向抗体包括：
·T细胞靶向抗体，例如抗CD3 Fab(Van Wauwe等人J Immunol[免疫学杂志],1980,124(6):2708-2713)；以及
·小窝靶向抗体，例如Meca32单体FC(例如以下中所述的抗体：GabrielaM.Marchetti,等人Commun Biol.[通讯-生物]2019；2:92；于2019年3月7日线上发表.doi:10.1038/s42003-019-0337-2及类似文献)
合适的靶向糖包括那些靶向肝脏中无唾液酸糖蛋白受体的糖，例如含有例如如下分子的GalNac和Tri-GalNac：
合适的小分子靶向剂包括叶酸。
对于一些靶向基团，可以使用靶向基团上的-SH基团来附接到PEG基团，使用的方法为与上述PEG基团的附接所述类似的方法。通常这使得靶向基团通过接头基团附接到聚乙二醇基团。有利的试剂是可以通过硫醇化学与肽类树枝状大分子和靶向基团缀合的双功能PEG试剂。一种这样的试剂是PEG试剂，其中分子的两端都被马来酰亚胺基丙酸酯基团官能化。使用这种性质的双官能化聚乙二醇基团在PEG基团和肽类树枝状大分子之间以及在PEG基团和靶向基团之间产生接头基团的反应的简化版本可以说明如下：
其中“PD-SH”中的“SH”是指半胱氨酸侧链上的硫醇，“TG-SH”中的“SH”是指靶向基团中的反应性硫醇，PD是肽类树枝状大分子，TG是靶向基团，“n”是-(OCH2CH2)n-重复亚基的数量。
肽靶向基团或具有反应性胺(例如胺官能化糖)的另一个靶向基团可以使用可替代的活化PEG试剂附接到PEG基团。通常这也使得靶向基团通过接头基团附接到聚乙二醇基团。有利的试剂是双功能PEG试剂，其可以通过硫醇化学与肽类树枝状大分子缀合，通过酰胺键与肽靶向基团缀合。一种这样的试剂是PEG试剂，其中分子的一端用马来酰亚胺基丙酸酯基团官能化，而另一端用四氟苯基(TFP)酯官能化。使用这种性质的双官能化聚乙二醇基团的反应的简化版本可以说明如下：
末端氨基基团可任选地为经修饰的氨基基团
在一个实施例中，肽类树枝状大分子的末端氨基基团可为未经修饰的。未经修饰的末端氨基基团意指该基团是-NH2基团。
在一个实施例中，肽类树枝状大分子的末端氨基基团可为经修饰的氨基基团。
修饰通常是化学修饰，其包括但不限于添加化学基团、产生新键和去除化学基团。经修饰的氨基基团为本领域技术人员所熟知，并且包括但不限于乙酰化、脱氨基、N-低级烷基、N-二低级烷基、受限烷基(例如支链、环状、稠合、金刚烷基)和N-酰基修饰。经修饰的氨基基团还可包括但不限于内部酰胺键，该内部酰胺键涉及N-末端(例如焦谷氨酸(pyroGlu))保护的氨基基团或者附接放射性标记、荧光标签或亲和标签(例如生物素)。经修饰的氨基基团还可以包括但不限于缓冲基团(2-氨基-6-{[6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羰基]氨基}己酸；2-氨基-6-[(硫代吗啉-3-羰基)氨基]己酸；和2-氨基-6-[2-(吗啉-4-基)乙酰胺基]己酸，以及交联基团(即环戊二烯)。
氨基基团的合适保护基团是，例如酰基基团，例如烷酰基基团，例如乙酰基；烷氧基羰基基团，例如甲氧基羰基、乙氧基羰基或叔丁氧基羰基基团；芳基甲氧基羰基基团，例如苯甲氧基羰基；或芳酰基基团，例如苯甲酰基。特定的经修饰氨基基团是酰氨基。特定的经修饰氨基基团是乙酰氨基。
低级烷基为C1-4烷基，包括叔丁基、丁基、丙基、异丙基、乙基和甲基。
末端羧基基团可任选地为经修饰的羧基基团
在一个实施例中，肽类树枝状大分子的末端羧基基团为未经修饰的。未经修饰的末端羧基基团意指该基团是-C(O)OH基团。
在一个实施例中，肽类树枝状大分子的末端羧基基团为经修饰的羧基基团。
修饰通常是化学修饰，其包括但不限于添加化学基团、产生新键和去除化学基团。改性羧基基团为本领域技术人员所熟知，并且包括但不限于酰胺、低级烷基酰胺、受限烷基(例如支链、环状、稠合、金刚烷基)、二烷基酰胺和低级烷基酯改性。改性羧基基团还可包括但不限于受保护的羧基基团或者附接放射性标记、荧光标签或亲和标签(例如生物素)或靶向细胞的配体。羧基基团的合适保护基团是，例如酯化基团，例如甲基乙基基团、叔丁基基团或苄基基团。特定的改性羧基基团是-CO2NH2。特定的改性羧基基团是C-末端酰胺化。特定的改性羧基基团是甲酰胺基团。特定的改性羧基基团是N-(C1-4烷基)氨甲酰基基团。
药物活性剂
本文所述的组合物和方法适用于递送药物活性剂。药物活性剂是能够对人体或动物体发挥药理作用，从而导致治疗结果的任何物质。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自遗传物质、经化学修饰的核酸、寡核苷酸、治疗性肽、化疗剂、蛋白质、蛋白质缀合物、显像剂、与CRISPR技术相关的蛋白质核酸、以及天然病毒组分，如衣壳或酶。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自遗传物质。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自核酸。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自遗传物质(例如DNA或RNA)。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自遗传物质(例如DNA和RNA)。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自遗传物质(例如DNA和/或RNA)。
在任何实施例中，在提及DNA时，这可以是质粒、线性DNA、短单链或双链DNA、微环和微串等最小化载体、折叠DNA(包括发夹结构和十字形DNA)、以及病毒衍生DNA。
在任何实施例中，在提及RNA时，这可以是mRNA或siRNA。
在任何实施例中，在提及RNA时，这可以是mRNA、gRNA和/或siRNA。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自DNA。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自RNA。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自DNA和mRNA。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自mRNA和gRNA。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自DNA和gRNA。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自DNA、mRNA和gRNA。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自寡核苷酸。
在任何实施例中，在提及寡核苷酸时，这可以是反义寡核苷酸(ASO)、RNA干扰(RNAi)和适体RNA。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自化学改性核酸。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自治疗性肽。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自化疗剂。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自蛋白质。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自蛋白质缀合物。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自显像剂。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自与CRISPR技术相关的蛋白质核酸。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自与CRISPR技术相关的DNA、gRNA和/或mRNA。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自天然病毒组分，如衣壳或酶。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自编码治疗性蛋白质(例如单克隆抗体)的核酸(即质粒和mRNA)，例如，阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿法塞特(alefacept)、阿仑单抗(alemtuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)、卡那单抗(canakinumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗(cetuximab)、达克珠单抗(daclizumab)、地诺单抗(denosumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、戈利木单抗(golimumab)、英夫利昔单抗(inflectra)、伊匹单抗(ipilimumab)、依奇珠单抗(ixekizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托珠单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、苏金单抗(secukinumab)、以及优特克单抗(ustekinumab)；酶，例如，阿加糖酶β(agalsidase beta)、伊米苷酶(imiglucerase)、维拉苷酶α(velaglucerase alfa)、他利苷酶(taliglucerase)、阿葡糖苷酶α(alglucosidasealfa)、阿葡糖苷酶α、拉罗尼酶(laronidase)、静脉注射艾杜硫酶(idursulfaseintravenous)、以及加硫酶(galsulfase)；生长因子；和细胞因子，例如IL-2和IFN-α。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自编码治疗性蛋白质(例如单克隆抗体)的核酸(即质粒和mRNA)；酶；生长因子；和细胞因子。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自编码治疗性蛋白质(例如单克隆抗体)的核酸(即质粒和mRNA)；酶；生长因子；转录因子；和细胞因子。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自编码单克隆抗体的核酸(即质粒和mRNA)。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自编码MEDI8852和STK11的核酸(即质粒和mRNA)。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自编码单克隆抗体的核酸(即质粒和mRNA)，该单克隆抗体可选自阿昔单抗、阿达木单抗、阿法塞特、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝洛托舒单抗、卡那单抗、赛妥珠单抗、西妥昔单抗、达克珠单抗、地诺单抗、依法利珠单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗、伊匹单抗、依奇珠单抗、那他珠单抗、纳武单抗、奥拉单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、派姆单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、曲妥珠单抗、苏金单抗、以及优特克单抗。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自编码酶的核酸(即质粒和mRNA)。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自编码酶的核酸(即质粒和mRNA)，该酶可选自阿加糖酶β、伊米苷酶、维拉苷酶α、他利苷酶、阿葡糖苷酶α、阿葡糖苷酶α、拉罗尼酶、静脉注射艾杜硫酶、以及加硫酶。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自编码生长因子的核酸(即质粒和mRNA)。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自编码转录因子的核酸(即质粒和mRNA)。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自编码转录因子HNF-4α的核酸(即质粒和mRNA)。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自编码细胞因子的核酸(即质粒和mRNA)。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自编码选自IL-2和IFN-α的细胞因子的核酸(即质粒和mRNA)。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自siRNA。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自mRNA。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自gRNA。
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，药物活性剂可选自siRNA，该siRNA用于降低包括调节致癌基因、生长因子和细胞因子表达的应用中的蛋白质表达。
在任何实施例中，在药物活性剂选自核酸时，肽类树枝状大分子碱性氨基酸残基:核酸磷酸盐(N:P)的比率为约2:1。
在任何实施例中，在药物活性剂选自核酸时，肽类树枝状大分子碱性氨基酸残基:核酸磷酸盐(N:P)的比率为约4:1。
在任何实施例中，在药物活性剂选自核酸时，肽类树枝状大分子碱性氨基酸残基:核酸磷酸盐(N:P)的比率为约6:1。
在任何实施例中，在药物活性剂选自DNA时，肽类树枝状大分子碱性氨基酸残基:DNA磷酸盐(N:P)的比率为约2:1。
在任何实施例中，在药物活性剂选自DNA时，肽类树枝状大分子碱性氨基酸残基:DNA磷酸盐(N:P)的比率为约4:1。
在任何实施例中，在药物活性剂选自DNA时，肽类树枝状大分子碱性氨基酸残基:DNA磷酸盐(N:P)的比率为约6:1。
在任何实施例中，在药物活性剂选自RNA时，肽类树枝状大分子碱性氨基酸残基:RNA磷酸盐(N:P)的比率为约2:1。
在任何实施例中，在药物活性剂选自RNA时，肽类树枝状大分子碱性氨基酸残基:RNA磷酸盐(N:P)的比率为约4:1。
在任何实施例中，在药物活性剂选自RNA时，肽类树枝状大分子碱性氨基酸残基:RNA磷酸盐(N:P)的比率为约6:1。
在任何实施例中，在药物活性剂选自RNA时，肽类树枝状大分子碱性氨基酸残基:DNA和RNA磷酸盐(N:P)的比率为约2:1。
在任何实施例中，在药物活性剂选自RNA时，肽类树枝状大分子碱性氨基酸残基:DNA和RNA磷酸盐(N:P)的比率为约4:1。
在任何实施例中，在药物活性剂选自RNA时，肽类树枝状大分子碱性氨基酸残基:DNA和RNA磷酸盐(N:P)的比率为约6:1。
药物递送系统
在一个实施例中，提供了药物递送系统，其包含含有一个或多个源自如本文所述的经修饰赖氨酸的残基的肽类树枝状大分子。药物递送系统是可用于将药物活性剂递送到人体或动物体内例如细胞内的递送系统。
在一个实施例中，提供了肽类树枝状大分子在药物递送系统中的用途，该肽类树枝状大分子包含一个或多个源自如本文所述的经修饰赖氨酸的残基。
在一个实施例中，提供了用作药物递送系统的肽类树枝状大分子，该肽类树枝状大分子包含一个或多个源自如本文所述的经修饰赖氨酸的残基。
在一个实施例中，提供了用于药物活性剂的递送系统，该递送系统包含含有一个或多个源自如本文所述的经修饰赖氨酸的残基的肽类树枝状大分子。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可以包含一种或多种不同的肽类树枝状大分子，例如两种不同的肽类树枝状大分子。可以使用肽类树枝状大分子的混合物来掺入靶向部分、稳定纳米颗粒和/或协同地组合不同的特性。
在一个实施例中，提供了药物递送系统，其包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及“一种或多种肽类树枝状大分子”时，这可以指一种肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及“一种或多种肽类树枝状大分子”时，这可以指两种不同肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在提及“一种或多种肽类树枝状大分子”时，这可以指多于一种不同的肽类树枝状大分子。
在一个实施例中，提供了用于药物活性剂的递送系统，该递送系统包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含含有聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子，以及含有聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含约1:50的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含高于1:50的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含低于1:50的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含约1:20的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含高于1:20的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含低于1:20的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含约1:15的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含高于1:15的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含低于1:15的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含约1:10的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含高于1:10的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含低于1:10的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含约1:5的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含高于1:5的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含低于1:5的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含约2:4的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含高于2:4的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含低于2:4的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含约1:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含约4:2的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含高于4:2的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含低于4:2的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含约5:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含高于5:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含低于5:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含约10:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含高于10:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含低于10:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含约15:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含高于15:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含低于15:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含约20:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含高于20:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含低于20:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含约50:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含高于50:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统可包含低于50:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
如本文所述的肽类树枝状大分子与药物活性剂可以组合，同时在生理等渗缓冲液(例如5％海藻糖或蔗糖、20mM HEPES或磷酸盐缓冲盐水(PBS))中轻轻混合以形成纳米颗粒。这些配制品可立即递送、储存在4℃或冻干用于长期储存。
如本文所述的肽类树枝状大分子可以如下形式制备：适用于口服施用的形式，例如，作为片剂或胶囊；适用于肠胃外注射(包括静脉内、皮下、皮内、肌肉内、血管内注射或输注)的形式；适用于局部施用的形式，如软膏或乳膏；或适用于直肠施用的形式，如栓剂。特别地，如本文所述的肽类树枝状大分子可以以适用于注射(例如，通过静脉内、皮下、皮内或肌肉内注射)的形式制备。
另外的赋形剂
在一个实施例中，可以将另外的赋形剂添加到包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子和药物活性剂的配制品和组合物中。这些可以增强纳米颗粒的稳定性并增强核酸包装，从而改善细胞递送和转染。
在一个实施例中，提供了配制品，其包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子和脂质。
在一个实施例中，提供了配制品，其包含选自1:1(w/w)的N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子和脂质。
在一个实施例中，提供了配制品，其包含选自N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-庚卅烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰甘油(DMG)、和十七烷酯-9-基8-((2-羟乙基)(6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基)氨基)辛酸酯(SM-102)或胆固醇的混合物的一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子和脂质。
用途
如本文所述的肽类树枝状大分子可以用于递送适合治疗广泛疾病的药物活性剂，这些疾病包括代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、吸收不良障碍。治疗性应用可包括：蛋白质(即用于病毒治疗的抗体)的系统表达或靶向递送(即转移性肿瘤，体内CAR-T)。
在一个实施例中，提供了用于疗法的药物递送系统，其包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子。
在一个实施例中，提供了用于疗法的用于药物活性剂的递送系统，该递送系统包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子。
在一个实施例中，提供了肽类树枝状大分子，其用于将药物活性剂递送到细胞。
在一个实施例中，提供了包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子的药物递送系统，该系统用于在治疗代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、或吸收不良障碍中使用。
在一个实施例中，提供了包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子的用于药物活性剂的递送系统，该系统用于在治疗代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、或吸收不良障碍中使用。
在一个实施例中，提供了用于基因疗法的用于药物活性剂的递送系统，该递送系统包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子。
如本文所用，如本文所述的术语“治疗(treatment和treat)”是指逆转、缓解、延迟疾病或障碍或其一种或多种症状的发作或抑制疾病或障碍或其一种或多种症状的进展。在一些实施例中，可以在一个或多个症状已经出现之后进行治疗。在其他实施例中，可以在没有症状的情况下进行治疗。例如，可在症状发作之前(例如，以症状的病史为根据和/或以遗传或其他易感因素为根据)对易感个体进行治疗。症状消退后也可继续治疗，例如以防止或延迟它们复发。
药物组合物
在一个实施例中，提供了药物组合物，其包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在药物组合物包含一种或多种肽类树枝状大分子时，药物组合物可以包含一种肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在药物组合物包含“一种或多种肽类树枝状大分子”时，药物组合物可以包含多于一种不同的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在药物组合物包含“一种或多种肽类树枝状大分子”时，药物组合物可以包含两种不同的肽类树枝状大分子。
在任何实施例中，在药物组合物包含“一种或多种肽类树枝状大分子”时，药物组合物可以包含至少两种不同的肽类树枝状大分子。
在一个实施例中，提供了药物组合物，其包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子和药物活性剂。
在一个实施例中，提供了药物组合物，其包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子。
在一个实施例中，提供了药物组合物，其包含两个或更多个不同的肽类树枝状大分子。
在一个实施例中，提供了组合物，其包含药物活性剂和一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含含有聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子，以及含有聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含约1:50的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含高于1:50的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含低于1:50的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含约1:20的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含高于1:20的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含低于1:20的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含约1:15的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含高于1:15的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含低于1:15的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含约1:10的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含高于1:10的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含低于1:10的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含约1:5的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含高于1:5的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含低于1:5的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含约2:4的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含高于2:4的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含低于2:4的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含约1:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含约4:2的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含高于4:2的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含低于4:2的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含约5:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含高于5:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含低于5:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含约10:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含高于10:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含低于10:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含约15:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含高于15:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含低于15:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含约20:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含高于20:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含低于20:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含约50:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含高于50:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，如本文所述的药物组合物可包含低于50:1的包含聚乙二醇基团的肽类树枝状大分子：包含聚乙二醇基团和靶向基团两者的肽类树枝状大分子的比率。
在一个实施例中，提供了用于疗法的药物组合物，其包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子。
在一个实施例中，提供了用于疗法的药物组合物，其包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子、和药物活性剂。
在一个实施例中，提供了包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子的药物组合物，该药物组合物用于在治疗代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、或吸收不良障碍中使用。
在一个实施例中，提供了包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子和药物活性剂的药物组合物，该药物组合物用于在治疗代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、或吸收不良障碍中使用。
在一个实施例中，提供了用于基因疗法的药物组合物，其包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子、和药物活性剂。
在一个实施例中，提供了用于基因疗法的药物组合物，其包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子。
治疗方法
在一个实施例中，提供了治疗代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、或吸收不良障碍的方法，该方法包括向所述动物施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子。
在一个实施例中，提供了治疗代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、或吸收不良障碍的方法，该方法包括向所述动物施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子和药物活性剂。
在一个实施例中，提供了基因疗法方法，该方法包括施用一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子。
在一个实施例中，提供了基因疗法方法，该方法包括施用一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子和药物活性剂。
药物组合物的用途
在一个实施例中，提供了包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子的药物组合物在制造用于治疗代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、或吸收不良障碍的药物中的用途。
在一个实施例中，提供了包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子和药物活性剂的药物组合物在制造用于治疗代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、或吸收不良障碍的药物中的用途。
在一个实施例中，提供了包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子的药物组合物用于基因疗法的用途。
在一个实施例中，提供了包含一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子和药物活性剂的药物组合物用于基因疗法的用途。
试剂盒
在一个实施例中，提供了试剂盒，该试剂盒包括：
a)第一单元中的一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子；
b)第二单位中的药物活性剂；以及
c)含有所述第一和第二单元的容器装置。
在一个实施例中，提供了试剂盒，该试剂盒包括：
a)第一单元中的一种或多种如本文所述的肽类树枝状大分子；
b)第二单位中的药物活性剂；以及
c)含有所述第一和第二单元的容器装置。
d)使用说明书。
附图说明
图1：如实例2中所述的肽类树枝状大分子(PD)合成的代表性示意图。
图2A和图2B：如实例7中所述，肽纳米颗粒(PNP)抗阴离子解离的稳定性(A)和组织蛋白酶B降解性(B)的结果。纳米颗粒的稳定性对于将完整的核酸有效递送到靶细胞中至关重要；然而，核酸必须在细胞摄取后释放才能发挥其功能。为此，PD被设计为在细胞摄取后酶促降解。确定了具有刺激响应性释放的物质具有增强的功效和较低的毒性。结果表明，与使用在硫酸葡聚糖浓度超过50μg/mL时容易释放DNA的PD1、未经修饰的(NM)PD和PD3(His)配制的纳米颗粒相比，PD3(MN)和PD3(TM)纳米颗粒对阴离子解离的抗性明显更强。此外，相对于未经修饰的PD3和所有PD2配制品，PD3(M)、PD3(MN)、和PD3(TM)响应于组织蛋白酶B活性容易释放DNA。
图3A、图3B和图3C：如实例8中所述从体外转染筛选获得的结果。不同细胞系的评估如图3A)人非小肺癌细胞系H1299和图3B)小鼠肌管细胞系C2C12所示。一式四份收集发光并表示为平均值+/-标准偏差。在图3C中，在各种细胞系(H1299、C2C12、HEK393、和HEPG2)中筛选了两种不同的NP配制品PD3(MN)和PD3(TM)，以确定不同应用的最佳表现者。这些结果表明，MN修饰在肺细胞(H1299，源自淋巴的人非小细胞肺癌细胞系)和肌肉细胞(C2C12，小鼠成肌细胞)中具有优势。可替代地，TM修饰在源自包括肾脏(HEK393，人胚胎肾细胞)和肝脏(HEPG2，人肝细胞瘤细胞系)在内的过滤器官的细胞系中表现最好。
图4：从实例9中所述的萤光素酶mRNA小鼠表达实验获得的结果。DNA NP翻译的体内翻译在小鼠肌肉内表达研究中进行了测试。表达了报告蛋白萤光素酶以允许实时跟踪表达。观察到表达并确定表达在1个月的监测期内是一致的。每周使用IVIS评估表达，并一式四份收集发光并表示为平均值+/-标准偏差。结果表明，MeO-PEG-PD(MN)通过IM注射在体内有效地递送DNA，从而稳定表达一个月。
图5A和图5B.从实例10中所述的治疗性表达实验获得的结果。图5A显示了抗流感mAb MEDI8852的结果，且图5B显示了肿瘤抑制因子丝氨酸/苏氨酸激酶11(STK11)的结果。MEDI8852通过间接ELISA进行量化，并一式三份收集表达水平，并表示为平均值+/-标准偏差。质谱被用作表达的额外确认。使用蛋白质印迹对STK11进行量化。NP的目标是使用宿主细胞表达治疗性蛋白质。这些结果表明，NP能够针对治疗剂的作用模式在目的细胞系中体内表达多种治疗剂，包括mAb(即MEDI8852(抗流感mAb))和酶(即肿瘤抑制剂丝氨酸/苏氨酸激酶11(STK11))。
图6A、图6B和图6C。如实例11中所述，从体外靶向DNANP转染获得的结果。靶向PD纳米颗粒在各种细胞系中进行了测试，并确定其促进转染。在H1299中，相对于商业转染对照聚乙烯亚胺(PEI)，TfR(图6A)和cRGD(图6B)增强了总体表达水平(递送GFP，荧光)和动力学(递送Gwiz萤光素酶；发光)。相对于非靶向NP，在C2C12和CT26中观察到类似的转染改善(图6C)。靶向DNA递送可用于提高转染效率和/或实现细胞特异性表达。PD平台经过精心设计，具有灵活的靶向策略，允许结合一系列基于肽和抗体的靶向配体(如实例3和5所示)，从而显著促进转染。此外，通过聚乙二醇化和靶向，实现了高度特异性表达。这些结果表明靶向可用于增强多种非常不同的细胞系中的表达。
图7：从实例12中所述的靶向肺的NP体内实验获得的结果。将靶向PV1的纳米颗粒IV施用于BALB/C小鼠，并通过IVIS对萤光素酶的表达进行8天监测。第3天和第8天的离体成像表明，具有优化配体密度的纳米颗粒仅在靶向的肺内具有显著表达。细胞特异性递送极大地拓宽了基于核酸的疗法的潜在应用。这些结果表明，基于抗体的靶向部分可用于生成靶向PD NP，且PV1靶向可用于靶向肺。在该实例中，靶向PV1的NP被证明可以在小鼠肺内实现为期至少8天的高度特异性表达。
图8：如实例13中所述，从用pDNA与mRNA PD3(MN)纳米颗粒转染H1299细胞获得的结果。用mRNA或pDNA制备的纳米颗粒处理H1299细胞。使用Incucyte对细胞进行荧光成像以实时监测转染动力学，并使用仪器软件量化总红色荧光强度作为转染的量度。mRNA不需要复杂的核定位即可成功表达转基因，并且已被证明比递送DNA时促进更快的表达动力学。我们的NP被证明可以成功地包装和递送mRNA，并有望实现比递送DNA时更快的表达动力学。这些结果表明mRNA表达明显更快，但是到48小时时，表达水平与递送pDNA时相似。
图9：从实例14中所述的萤光素酶mRNA小鼠表达实验获得的结果。用与MeO PEG-PD3(MN)复合的pDNA或mRNA对CD小鼠进行肌肉内治疗。使用IVIS评估表达。一式四份收集发光并表示为平均值+/-标准偏差。这些结果表明，mRNA和pDNA都可以使用PD平台在体内肌肉内递送，其中mRNANP具有更快的表达动力学。
图10：如实例15中所述，从小鼠实验中的抗流感mAb MEDI8852表达获得的结果。通过IV注射用mRNANP处理BALB/c小鼠，并通过ELISA量化MEDI8852的表达。这些结果表明在8天内检测到显著水平的mAb，并证实了PD在体内表达治疗性蛋白质的能力。
图11：如实例16中所述，用具有不同抗CD3靶向fab展示的mCherry mRNA/PD3(MN)NP转染未活化的原代T细胞获得的结果。这些结果表明非靶向NP具有转染T细胞的能力；然而，当靶向fab以低(25％)到中等(50％)水平显示时，CD3靶向显著增强了递送。
图12：如实例17中所述，通过报告基因测定和蛋白质印迹监测CTNNB1沉默而获得的结果。在靶向癌基因CTNNB1的结肠癌细胞系SW480中证明了NP递送siRNA的能力。通过蛋白质印迹，证明1％(w/w)DOPE:DOTMA＝1:1的PD3(MN)和PD3(TM)可在至少5天内有效地沉默CTNNB1。这些结果表明PD NP可以有效地将siRNA递送至靶细胞。
图13A、图13B和图13C：如实例18中所述，用具有不同靶向肽cRGD展示的PD3(MN)NP沉默连环蛋白-B获得的结果。CTNNB1报告基因活性SW480 TopFlash(图13A)、CTNNB1蛋白质水平SW480(图13B)和Colo205增殖(图13C)。对于许多应用，需要定位递送。为了确定是否可以使用NP平台实现“开/关”递送，制备了具有不同量的cRGD展示的聚乙二醇化NP，并用于转染结肠癌细胞系SW480和Colo205。确定聚乙二醇化可停止或减少沉默，而在NP上安装cRGD恢复了NP活性。这些结果表明聚乙二醇化可用于减少非特异性细胞摄取，而靶向可用于恢复NP活性。
图14：如实例18中所述，从小鼠转移性结肠癌模型中的肿瘤体积获得的结果。在第8、9、15和16天(用黑色箭头表示)，向具有已建立结肠癌细胞系Colo205肿瘤的小鼠静脉内施用具有不同程度cRGD靶向的NP。组包括未处理组(A)、施用非靶向NP小鼠组(B)和施用具有中等(C)至高cRGD(D)展示的靶向纳米颗粒的小鼠组，其中每个数据集代表一只小鼠。还确定了随时间变化的平均值(E)和研究的最后一天(F)。在小鼠模型中评估了靶向siRNA NP的体内翻译。与非靶向NP相比，确定高水平的cRGD展示显著减缓肿瘤生长。这些结果表明靶向cRGD的NP可以实现增强的siRNA递送，并突出了靶向配体密度的重要性。
图15：如实例19中所述，用荧光标记的DNA(Cy5)和mRNA(Cy5)配制的NP的荧光谱。带有Cy5标记的DNA(图1)的NP不会被蓝色LED激发，因此在其发射波长(650-700nm)处未检测到荧光。带有Cy3标记的mRNA(图2)的NP在其发射峰约550-600被激发并发出荧光。同样，用Cy5标记的DNA制备的NP与带有Cy3标记的mRNA的NP组合(图3)在Cy3发射峰发出荧光。重要的是，用Cy5标记的DNA和Cy3标记的mRNA的1:1混合物制备的NP(图4)显示在约560-700nm的Cy5发射处的发射增加，而在约550-600nm的Cy3发射峰处的荧光强度相应降低。这表明样品4中的DNA和mRNA非常接近(<5nm)，从而使mRNA上的Cy3荧光团的荧光共振能量转移(FRET)能够激发标记DNA上的Cy5荧光团。这是mRNA和DNA共包封于肽类树枝状大分子NP中的证据。
图16：mRNA/DNA杂合PDID NP在H1299细胞中的表达动力学如实例19中所述。DNA表达用GFP荧光面积测量，mRNA表达用mCherry荧光面积测量。GFP表达在100小时内增加，而mRNA表达在60小时左右达到峰值。通过重叠荧光信号量化的DNA/mRNA共表达量与mRNA表达具有相似的动力学，在65小时左右达到峰值。这些结果表明DNA和mRNA成功地共同递送至细胞。
图17：mRNA/DNA杂合PDID NP在已分化C2C12细胞中的表达动力学如实例19中所述。已分化C2C12肌肉细胞融合到肌管中并且不分裂，使这些细胞难以转染。DNA表达用GFP荧光面积测量，mRNA表达用mCherry表达面积测量。GFP表达在75小时内增加，随后是平台信号。mRNA表达在60小时左右达到峰值，然后缓慢下降。通过重叠荧光信号量化的DNA/mRNA共表达量与mRNA表达具有相似的动力学，在60小时左右达到峰值。这些结果表明DNA和mRNA成功地共同递送至无分裂细胞。
实例
本文所使用的缩写
·NP：纳米颗粒；
·PD：肽类树枝状大分子；
·PDID：肽类树枝状大分子细胞内递送
·氨基酸“CIT”：瓜氨酸
·本文用以下缩写来表示经修饰的赖氨酸：/>
以下聚合物和配体掺入肽类树枝状大分子中：
表1掺入PD中的靶向部分的汇总。
实例1
经修饰赖氨酸的制备
方法1：1-{[(吗啉-4-基)乙酰基]氧基}吡咯烷-2,5-二酮的合成
将(吗啉-4-基)乙酸(1g，6.89mmol)溶解于二氯甲烷(DCM)(25mL)中，且添加N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(872mg，7.58mmol)和N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)(1.60g，8.35mmol)。将该反应在室温下搅拌1h，然后通过2”x 3”硅胶垫过滤。用DCM(3x 25mL)洗涤该垫，并合并滤液和洗涤液并浓缩以给出呈白色固体的1-{[(吗啉-4-基)乙酰基]氧基}吡咯烷-2,5-二酮(1.3g，78％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)d 3.75(d,J＝3.6Hz,4H),3.57(s,2H),2.85(s,4H),2.67(d,J＝4.2Hz,4H)；MS(ESI)计算值：242.09，实测值：243.3(M+1)。
方法2：1-{[6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羰基]氧基}吡咯烷-2,5-二酮的合成
将6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羧酸(350mg，1.68mmol)在室温下伴随搅拌溶解于DCM(25mL)中。添加NHS(213mg，1.85mmol)，随后添加EDC·HCl(418mg，2.18mmol)。将该反应混合物在室温下搅拌1h，并且然后通过2”x 3”硅胶垫过滤。用DCM(3x 25mL)和乙酸乙酯(25mL)洗涤该垫。合并滤液和洗涤液并浓缩以给出呈白色固体的1-{[6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羰基]氧基}吡咯烷-2,5-二酮(325mg，63％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)d 8.89(s,1H),8.07(dd,J＝9.3Hz,1.5Hz,1H),6.60(d,J＝9.3Hz,1H),3.80(d,J＝4.2Hz,4H)3.72(d,J＝4.2Hz,4H),2.89(s,4H)。MS(ESI)计算值：305.1，实测值：306.3(M+1)。
方法3：叔丁基3-{[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}硫代吗啉-4-甲酸酯的合成
将4-(叔丁氧基羰基)硫代吗啉-3-羧酸(1g，4.04mmol)在室温下伴随搅拌溶解于DCM(25mL)中。添加NHS(511mg，4.44mmol)，随后添加EDC·HCl(1.01g，5.25mmol)。将该反应混合物在室温下搅拌1h，并且然后通过2”x 3”硅胶垫过滤。用DCM(3x 25mL)洗涤该垫，并合并滤液和洗涤液并浓缩以给出呈白色固体的叔丁基3-{[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}硫代吗啉-4-甲酸酯(1.3g，93.4％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)d 5.38(br s,1H),4.43-4.22(m,1H),3.46-3.21(m,1H),3.19-3.10(m,1H),3.06-2.97(m,1H),2.85(s,4H),2.81-2.62(m,1H),2.61-2.42(m,1H),1.47(s,9H)。MS(ESI)计算值：345.4(M+1)。
方法4：N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N6-(6-吗啉代烟酰基)-L-赖氨酸的合成
将芴甲氧羰基氯L-赖氨酸(Fmoc-Lys-OH)(15.3g，41.53mmol，1.2当量)在室温下在机械搅拌下溶解于THF-水(1:1，800mL)中。一次性添加上述制备的酯(方法2)在DCM中的溶液，随后添加DIPEA(10.73g，82.99mmol，2.4当量)。将反应在室温下进一步搅拌直至起始材料(TLC，2h)耗尽，然后添加乙酸乙酯(EtOAc)(250mL)。将混合物用HCl(1M，200mL)酸化，倒入分液漏斗，并分离各层。用EtOAc(2x 250mL)萃取水层。将有机层合并，用盐水(200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。获得呈浅棕色油状残余物的粗产物，将其溶解于THF中，吸附在硅胶上，并经硅胶柱(7”x 3”)通过快速色谱法纯化。将柱用在己烷中的50％乙酸乙酯和100％乙酸乙酯洗涤，以在真空抽吸下洗脱产物。将含有所需产物的级分合并并在真空下浓缩以提供呈灰白色固体的N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N6-(6-吗啉代烟酰基)-L-赖氨酸(12.6g，65％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ9.26(br s,1H),8.62(d,J＝1.5Hz,1H),7.93(dd,J＝2.5,9Hz,1H),7.71(d,J＝7.5Hz,2H),7.53(dd,J＝4.5,7.5Hz,2H),7.35(t,J＝7.5Hz,2H),7.23(q,J＝6.5Hz,2H),6.59(t,J＝5Hz,1H),6.48(d,J＝9Hz,1H),5.99(d,J＝8Hz,1H),4.41(dd,J＝7.5,12.5Hz,1H),4.31(dd,J＝12,18Hz,2H),4.15(d,J＝7Hz,1H),3.71(t,＝4.5Hz,4H),3.56-3.32(m,6H),1.98-1.87(m,1H),1.86-1.75(m,1H),1.71-1.57(m,2H),1.56-1.39(m,2H)ppm；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ175.2,166.6,159.9,156.6,146.9,144.1,143.9,141.4,137.7,127.9,127.3,125.3,120.1,119.5,106.3,67.2,66.6,53.8,47.3,45.3,39.5,32.0,28.9,22.4ppm；C31H34N4O6[M+H]+的MS(ESI)准确质量计算值：559.26，实测值：559.35。
方法5：(2S)-2-氨基-6-{[6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羰基]氨基}己酸(N6-(6-吗啉代烟酰基)-L-赖氨酸)的合成(LYS(MN))
程序1
N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N6-(6-吗啉代烟酰基)-L-赖氨酸(方法4)的Fmoc保护基团可例如使用DMF中20％的哌啶通过本领域已知的标准程序去除。
程序2
/>
将经修饰赖氨酸溶解在700μL的NMP(15mg，26.87μmol)中。随后伴随搅拌将300μL哌啶添加到溶液(哌啶:NMP＝7:3；1mL)中。将反应在室温下搅拌30分钟。随后使用离心(4000g，10分钟，4℃)使经修饰赖氨酸沉淀并在冷二乙醚(10mL)中洗涤3次。使用1H NMR(500MHz,CDCl3)确认Fmoc去除1H NMR(500MHz,CDl3)δ11.89(s,1H),8.85(dd,1H),7.89(dd,1H),7.34(dd,1H),3.52-3.71(m,8H),3.35(t,1H),2.72-2.61(t,2H),2.01-1.57(m,6H)ppm。MS(ESI)准确质量计算值[M+H2O]+：352.55，实测值：352.04。
方法6：N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N6-(4-(叔丁氧基羰基)硫代吗啉-3-羰基)-L-赖氨酸的合成
将Fmoc-L-Lys-OH(8.94g，24.26mmol，1.2当量)在室温下在机械搅拌下溶解于THF-水(1:1，800mL)中。一次性添加上述制备的活化酯(方法3)在DCM中的溶液，随后添加DIPEA(6.27g，48.53mmol，2.4当量)。将反应在室温下进一步搅拌直至起始材料(TLC，2h)消耗，然后添加EtOAc(250mL)。将混合物用HCl(1M，200mL)酸化，倒入分液漏斗，并分离各层。用EtOAc(2x 250mL)萃取水层。将有机层合并，用盐水(200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。获得呈淡黄色油状残余物的粗产物，将其溶解于DCM中，吸附在硅胶上，并经硅胶柱(7”x 3”)通过快速色谱法纯化。将柱用在己烷中的50％-70％乙酸乙酯洗涤，以在真空抽吸下洗脱产物。将含有所需产物的级分合并并在真空下浓缩以提供呈灰白色固体的N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N6-(4-(叔丁氧基羰基)硫代吗啉-3-羰基)-L-赖氨酸(9.1g，75％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.75(d,J＝7.5Hz,2H),7.63-7.51(m,2H),7.38(t,J＝7.5Hz,2H),7.29(t,J＝7.5Hz,2H),5.71(dd,J＝7.5,23Hz,1H),4.97(br s,1H),4.57-4.23(m,4H),4.20(t,J＝7Hz,1H),3.51-3.18(m,3H),3.17-2.96(br s,1H),2.77(d,J＝12.5Hz,1H),2.70-2.58(m,1H),2.38(d,J＝12.5Hz,1H),1.98-1.86(m,1H),1.85-1.73(m,1H),1.66-1.53(m,2H),1.46(br s,12H)ppm；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ175.0,156.4,155.8,143.9,141.4,127.9,127.3,125.3,120.1,67.3,60.6,53.8,47.3,39.2,31.5,29.1,28.5,26.7,22.3ppm；C31H39N3O7S[M+Na]+的MS(ESI)准确质量计算值：620.24，实测值：620.35。
方法7：(2S)-2-氨基-6-[(硫代吗啉-3-羰基)氨基]己酸(N6-(硫代吗啉-3-羧基)-L-赖氨酸)的合成(LYS(TM))
程序1
N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N6-(4-(叔丁氧基羰基)硫代吗啉-3-羰基)-L-赖氨酸(方法6)的Fmoc保护基团可例如使用DMF中20％哌啶通过本领域已知的标准程序去除。类似地，Boc保护基团可例如使用在DCM中的30％TFA通过本领域已知的标准程序去除。
程序2
将经修饰赖氨酸溶解在700μL的NMP(15mg，25.12μmol)中。随后伴随搅拌将300μL哌啶添加到溶液(哌啶:NMP＝7:3；1mL)中。将反应在室温下搅拌30分钟以去除Fmoc保护基团。随后使用离心(4000g，10分钟，4℃)使经修饰赖氨酸沉淀并在冷二乙醚(10mL)中洗涤3次。在过夜风干后，将产物溶解在50％TFA:DCM(1mL)中并在室温下搅拌15分钟。使用旋转蒸发仪去除TFA:DCM溶液，并沉淀并在冷乙醚中洗涤2次。使用1H NMR确认Fmoc去除：δ11.56-12.04(1H,br),7.34(s,1H),3.65-3.76(dd,2H),3.42(t,J＝7.3Hz,1H),3.01-3.15(m,2H),2.70-2.89(m,2H),2.55-2.61(t,J＝5.6Hz,2H),2.06-2.18(m,2H),1.74-1.85(m,2H),1.58-1.64(q,2H)1.05(1H,s)ppm，和MS(ESI)准确质量计算值[M+H2O]+：279.22，实测值：279.62。
方法8：N2(1-{[(吗啉-4-基)乙酰基]氧基}吡咯烷-2,5-二酮)-L-赖氨酸的合成
可采用以下程序来产生N2(1-{[(吗啉-4-基)乙酰基]氧基}吡咯烷-2,5-二酮)-L-赖氨酸，可在室温下在机械搅拌下将Fmoc-L-Lys-OH(1.2当量)溶解于THF-水(1:1，800mL)中。可以一次性添加上述制备的活化酯在DCM中的溶液，随后添加DIPEA(2.4当量)。可将反应在室温下进一步搅拌直至起始材料(TLC，2h)消耗，然后可添加EtOAc(250mL)。可将混合物用HCl(1M，200mL)酸化，倒入分液漏斗，并分离各层。可将水层用EtOAc(2x 250mL)萃取。可将有机层合并，用盐水(200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。可将粗产物溶解于DCM中，吸附在硅胶上，并经硅胶柱(7”x 3”)通过快速色谱法纯化。可将柱用在己烷中的50％-70％乙酸乙酯洗涤，以在真空抽吸下洗脱产物。可将含有所需产物的级分合并并在真空下浓缩以提供N2-(N2(1-{[(吗啉-4-基)乙酰基]氧基}吡咯烷-2,5-二酮)-L-赖氨酸。
方法9：(2S)-2-氨基-6-[2-(吗啉-4-基)乙酰氨基]己酸(N6-(2-吗啉代乙酰基)-L-赖氨酸)的合成(LYS(M))
程序1
N2(1-{[(吗啉-4-基)乙酰基]氧基}吡咯烷-2,5-二酮)-L-赖氨酸(方法8)的Fmoc保护基团可例如使用DMF中的20％哌啶通过本领域已知的标准程序去除。
程序2
将经修饰赖氨酸溶解在700μL的NMP(15mg，25.02μmol)中。随后伴随搅拌将300μL哌啶添加到溶液(哌啶:NMP＝7:3；1mL)中。将反应在室温下搅拌30分钟。随后使用离心(4000g，10分钟，4℃)使经修饰赖氨酸沉淀并在冷二乙醚(10mL)中洗涤3次。使用H-NMR确认Fmoc去除：1H NMR(500MHz,CDl3)δ12.01(br s,1H),3.62-3.74(m,4H),3.40(t,1H),3.29(s,2H),3.10(t,1H),2.59-2.70(m,4H),1.88-2.01(m,2H),1.58-1.65(m,2H),and 1.46-1.56(q,2H)和MS(ESI)准确质量计算值[M+H2O]+：273.17，实测值：273.33。
实例2
含经修饰的赖氨酸的肽类树枝状大分子的合成
合成了一系列肽类树枝状大分子(表2)。经修饰的赖氨酸在肽合成过程中使用上述方法5、7和9中合成的经修饰赖氨酸(在表中标记为“*”)直接掺入，或者它们随后在树脂裂解后的溶液中利用N-羟基丁二酰亚胺化学和上述方法1-3中合成的化合物通过赖氨酸侧链的修饰(ε-胺)掺入。合成PD1-PD3和PD3(His)用于比较，并含有未经修饰的赖氨酸(PD 1-3)或代替赖氨酸的组氨酸(PD3(His))。
/>
表2.粗体、斜体{LYS}是分支点的肽类树枝状大分子汇总。*表示肽是用经修饰的赖氨酸直接合成的。
程序a)通过直接掺入经修饰的赖氨酸或组氨酸的肽类树枝状大分子合成
使用标准固相肽合成法通过在Rink Amide树脂上的片段缩合来合成肽类树枝状大分子。每个片段都是在2-氯三苯甲基树脂(高度酸不稳定树脂)上用Fmoc化学合成的，并用三氟乙醇从树脂中去除，以保持侧链和N末端上的所有保护基团。然后使用片段和Nα,Nε-二-Fmoc-L-赖氨酸作为分支点构建肽类树枝状大分子，随后用三氟乙酸(TFA)从树脂上切割，导致C末端酰胺化。组装在图1中示意性地显示，其中肽类树枝状大分子具有PD3碱基序列，例如PD3(M)、PD3(MN)、和PD3(TM)。在切割步骤中去除所有保护基团。粗肽通过高压液相色谱法(HPLC)用水:乙腈梯度纯化。纯度和质量通过HPLC和电子喷雾电离(ESI)质谱确认。使用去卷积工具来解释ESI质谱，其中包含呈不同电荷状态形式的相同种类。多电荷种类被计算为其单电荷形式，并根据m/z值和峰宽分组在一起，并以原子质量单位(amu)表示。PD1：MW 4540.1[4540.2amu].PD2：MW 7097.1[7097.5amu].PD3：MW 7097.1[7097.5amu].PD3(His)：MW 7223.1[7223.1amu].PD3(MN)*：MW 9760.0[9759.9amu].PD3(TM)*：MW 8905.5[8905.5amu].
程序b)在从树脂上切割树枝状大分子中间体后，通过修饰肽赖氨酸ε-胺的肽类树枝状大分子合成
将2μmol肽类树枝状大分子(PD1、PD2或PD3)悬浮在新制备的0.1M碳酸氢钠(pH8.0)中。将混合物超声处理10分钟。在DMAC中制备40mM的NHS功能化中间体(方法1-3)，并在搅拌下逐滴添加到肽溶液(0.5mM)中。将NHS功能化中间体以1.5摩尔过量添加到每个肽的赖氨酸中，以确保100％的赖氨酸ε-酰胺转化。将反应液在室温下搅拌0.5小时，随后通过超速离心(MWCO 3.0kDa)去除未反应的中间体。电喷雾电离质谱用于确认修饰。使用去卷积工具来解释ESI质谱，其中包含呈不同电荷状态形式的相同种类。多电荷种类被计算为其单电荷形式，并根据m/z值和峰宽分组在一起，并以原子质量单位(amu)表示。PD2(M):MW 9904.9[9904.9amu].PD2(MN)：MW 9759.9[9808.1amu(MW+甲酸)].PD2(TM)：MW 8905.5[8905.5amu].PD3(M)：MW 9904.8[9905.0amu].PD3(MN)：MW 9759.9[9808.1amu(MW+甲酸)].PD3(TM)：MW 8905.5[8905.6amu].
实例3
将靶向部分或聚乙二醇(PEG)结合到肽类树枝状大分子上
a)甲氧基-PEG和Mal-PEG肽类树枝状大分子的制备
用马来酰亚胺功能化的甲氧基-PEG(n＝36)(-MAL；量子生物设计公司，俄亥俄州普莱恩城)和双马来酰亚胺PEG(n＝19)(Bis-Mal-PEG19(BroadPharm公司，加利福尼亚州圣地亚哥))(来自表1的化合物#1和#2)分别制备为在pH 5.5的20mM柠檬酸钠缓冲液中的1.25和5mM溶液。将相同缓冲液中的等体积肽类树枝状大分子溶液(按照实例2制备，1mM)与PEG溶液分别以1.25倍和5倍摩尔过量混合。将反应在室温搅拌2小时并通过质谱确认。对于Mal-PEG-PD缀合物，通过在PBS和水中或在20mM柠檬酸钠(pH5.5)中透析去除过量PEG。电喷雾电离质谱用于确认修饰。MeO-PEG(36)-PD2(MN)MW 11528.2(11528.2amu)、MeO-PEG(36)-PD3(TM):MW 10673.9(10674.1amu)、MeO-PEG(36)-PD2(MN):MW 11528.2(11529.2amu)、MeO-PEG(36)-PD3(TM):MW 10674.2(10673.9amu).Mal-PEG(19)-PD1:MW8296.4(8297.2amu)、Mal-PEG(19)-PD2(MN):MW 10959.3(10960.3amu)、Mal-PEG(19)-PD3(MN):MW 10959.3(10960.3amu)、和Mal-PEG(19)-PD2(MN):MW 10959.3(10960.3amu).
b)靶向PEG-肽类树枝状大分子缀合物的制备
靶向肽(表1中的化合物#3-#6)是使用Fmoc化学的标准固相肽合成制备的。在从树脂上切割之前，用DMF中的10％乙酸酐进行N末端乙酰化。将TFP-PEG(n＝36)-马来酰亚胺(量子生物设计公司，俄亥俄州普莱恩城)(5mM)和酰化肽(7.5mM)溶解在新制备的0.1M碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)中，并将肽溶液添加到1.25摩尔过量的PEG溶液。将反应在室温下搅拌30分钟，然后将pH降低至5.5，并使用质谱确认缀合。使用Vivaspin柱MWCO 3.5kDa(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))将缓冲液更换为20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5)。随后将纯化的产物以2倍过量的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5)在室温下添加到肽类树枝状大分子(如实例2中制备)中2h。电喷雾电离质谱用于确认修饰。使用去卷积工具来解释ESI质谱，其中包含呈不同电荷状态形式的相同种类。多电荷种类被计算为其单电荷形式，并根据m/z值和峰宽分组在一起，并以原子质量单位(amu)表示。TfR-PEG-PD3(MN)*: 13855.0 MW (13856.7 amu).cRGD-PEG-PD3(MN)*: 12188.5 MW(12188.2amu).TfR-PEG-PD3(TM)*:MW 13855.0MW(13856.7amu).cRGD-PEG-PD3(TM)*:12188.5MW(12188.6amu).
c)糖-PEG-Mal缀合物的制备
在室温下，将N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(0.0860mmol)添加到胺官能化单或三乙酰半乳糖胺(GalNAc)(表1中的化合物#7和8；萨塞克斯研究公司，加拿大安大略省)(0.01620mmol)和-TFP酯(量子生物设计公司，俄亥俄州普莱恩城)(0.020261mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(6mmol)中的溶液中。将反应液在室温下搅拌1h并通过HPLC-MS确认缀合。随后使用反相HPLC纯化产物。随后将纯化的产物以2倍过量的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5)在室温下添加到肽类树枝状大分子(如实例2中制备)中2h。电喷雾电离质谱用于确认修饰。使用去卷积工具(安捷伦Mass Hunter定量分析(Agilent MassHunter Quantitative Analysis))来解释ESI质谱，其中包含呈不同电荷状态形式的相同种类。多电荷种类被计算为其单电荷形式，并根据m/z值和峰宽分组在一起，并以原子质量单位(amu)表示。GalNAc-PD3(TM)*MW 11708.6(片段化：11506.6)[11506.6amu].TriGalNAc-PD3(TM)*:MW 12679.1(片段化：12071.2)[11507.0amu].
实例4
肽类树枝状大分子/DNA纳米颗粒(NP)自组装成单分散纳米颗粒
阳离子肽类树枝状大分子(PD)与阴离子核酸自组装成纳米颗粒。使用包括透射电子显微术和动态光散射在内的标准纳米颗粒技术确定NP介于球形之间，直径为50-75nm。
a)NP制备
在20mM HEPES(pH 7.0)中制备等体积DNA(40μg/mL；Gwiz萤光素酶质粒(6732bp)(Genlantis公司，加利福尼亚州圣地亚哥))和肽类树枝状大分子(如实例2制备)溶液。以对应于肽类树枝状大分子精氨酸:DNA磷酸盐(N:P)为2:1的浓度制备肽溶液。将DNA溶液逐滴添加到肽溶液中，同时轻轻旋转以确保颗粒均匀。使DNA/肽纳米颗粒(NP)在室温下复合30分钟。NP溶液中DNA的最终浓度为20μg/mL。
b)动态光散射
使用Zetasizer ZS(马尔文公司(Malvern))、Green Laser和ZEN2112石英比色皿收集动态光散射数据。通过累积拟合分析推导流体动力学直径和多分散指数(PDI)。所有数据点代表如表3中所示的三个或更多个单独制备的样品的平均值。
c)透射电子显微术(TEM)
将样品施加到辉光放电的400目formva涂层铜网格上，用1％乙酸铀酰负染色，风干并在透射电子显微镜(Tecnai T12，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))中在80kV的工作电压下进行检查。使用AMT底部安装CCD相机和AMT600软件采集数字图像。
形态学测定如表3所示。
配制品 直径(nm) 形态学
PD1NP 61.2+/-5.4 球体
PD2NP 69.2+/-7.1 球体
PD2(M)NP 91.0+/-4.3 球体
PD2(MN)NP 65.3+/-6.9 球体
PD2(TM)NP 78.7+/-8.2 球体
PD3NP 65.8+/-8.9 球体
PD3(M)NP 90.1+/-6.5 球体
PD3(MN)NP 62.0+/-5.4 球体
PD3(TM)NP 61.4+/-7.4 球体
PD3(His)NP 75.1+/-5.9 球体
表3.肽类树枝状高分子DNA纳米颗粒(NP)的表征。所有测量值均来自使用累积拟合分析的强度相关函数。一式三份收集测量值并表示为平均值+/-标准偏差。
实例5
肽类树枝状大分子/RNA纳米颗粒(NP)自组装成单分散纳米颗粒
阳离子肽类树枝状大分子(PD)与阴离子核酸自组装成纳米颗粒。使用包括动态光散射在内的标准纳米颗粒技术确定NP直径为约50nm。
a)NP制备
在20mM HEPES(pH 7.0)中制备等体积RNA(40μg/mL)和肽溶液(如实例2制备)。具体而言，制备了编码mcherry的cleancap mRNA(Trilink公司，加利福尼亚州圣地亚哥)和靶向CTNNB1的siRNA(Dharmacon公司/Horizon Discovery公司，科罗拉多州拉斐特(Lafayette,CO))。以对应于肽类树枝状大分子精氨酸:mRNA磷酸盐(N:P)比率为4:1的浓度制备肽溶液。将RNA溶液逐滴添加到肽溶液中，同时轻轻旋转以确保颗粒均匀。使RNA/肽纳米颗粒或NP在室温下复合30分钟。NP溶液中RNA的最终浓度为20μg/mL。作为任选步骤，将(DOTMA:DOPE(％w/w)＝1)(赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)添加到配制品中。/>在20mM HPES(pH 7.0)中稀释，对应于与RNA的介于1和4之间的w/w％。如前所述，在添加RNA溶液之前立即将/>溶液添加到肽类树枝状大分子溶液中。含有/>的纳米颗粒被标记为“脂质”。
b)动态光散射
使用Zetasizer ZS(马尔文公司(Malvern))、Green Laser和ZEN2112石英比色皿收集动态光散射数据。通过累积拟合分析推导流体动力学直径和多分散指数(PDI)。所有数据点代表三个或更多个单独制备的样品的平均值。结果如表4所示。
表4.用含和不含脂质的PD3(MN)制备的RNA NP的流体动力学直径。所有测量值均来自使用累积拟合分析的强度相关函数。一式三份收集测量值并表示为平均值+/-标准偏差。
实例6
靶向NP纳米颗粒的产生
a)包含甲氧基-PEG肽类树枝状大分子和靶向PEG-肽类树枝状大分子缀合物和DNA或RNA的混合物的纳米颗粒的制备
在20mM HEPES(pH 7.0)中，用不同比率的肽类树枝状大分子(如实例2制备)或甲氧基-PEG树枝状大分子(如实例3a制备)和靶向PEG肽缀合物(如实例3b制备)制备肽溶液。将相同缓冲液中的DNA(gwiz萤光素酶)(Genlantis公司，加利福尼亚州圣地亚哥)或RNA(clean cap mcherry)(Trilink公司，加利福尼亚州圣地亚哥)溶液(40μg/mL)逐滴添加到PD混合物中，同时涡旋，使肽类树枝状大分子精氨酸:核酸磷酸盐(N:P)的最终比率为4:1(DNA)和6:1(RNA)。使核酸/肽纳米颗粒在室温下复合30分钟。纳米颗粒溶液中核酸的最终浓度为20μg/mL。作为任选步骤，将(DOTMA:DOPE(％w/w)＝1)(赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)添加到配制品中。/>在20mM HPES(pH 7.0)中稀释，对应于与RNA的介于1和4之间的w/w％。如前所述，在添加RNA溶液之前立即将/>溶液添加到肽类树枝状大分子溶液中。
b)包含甲氧基-PEG肽类树枝状大分子和靶向PEG-抗体缀合物和DNA或RNA的混合物的纳米颗粒的制备
对于基于抗体的靶向配体，制备mal-PEG PD纳米颗粒，然后缀合至抗体(表1的化合物#5和#6，按下文修改)。在20mM HEPES(pH 7.0)中，用不同比率的甲氧基-PEG树枝状大分子(实例3a)和mal-PEG树枝状大分子(实例3a)制备肽溶液。将相同缓冲液中的DNA(gwiz萤光素酶)(Genlantis公司，加利福尼亚州圣地亚哥)或RNA(clean cap mcherry)(Trilink公司，加利福尼亚州圣地亚哥)溶液(40μg/mL)逐滴添加到PD混合物中，同时涡旋，使肽类树枝状大分子精氨酸:核酸磷酸盐(N:P)的比率为4:1(DNA)和6:1(RNA)。使核酸/肽纳米颗粒在室温下复合30分钟。纳米颗粒溶液中核酸的最终浓度为20μg/mL。
Fab和/或半聚体(一条轻链和一条重链)在重链内经非天然氨基酸取代工程化：
非天然氨基酸在其侧链中含有环戊二烯(Nnaa CP1)，可作为狄尔斯－阿尔德反应(Diels-Alder reaction)的反应手柄。使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞将Nnaa CP1基因编码到抗体序列中，该CHO细胞表达马氏甲烷八叠球菌吡咯赖氨酸tRNA合成酶/tRNA(PylRS)/tRNA(Pyl)对，该对响应于琥珀终止(TAG)密码子递送Nnaa CP1。(Amant等人Angew Chem[应用化学],2019,58(25):8489-93)。
在室温下将工程化的基于抗体的靶向部分以相对于马来酰亚胺1.25摩尔过量的方式添加到核酸/肽纳米颗粒溶液中2h，如实例6中所述。随后通过添加N-乙酰半胱氨酸(10倍摩尔过量)来淬灭混合物。使用超速离心(MWCO 100kDa)去除过量抗体，并使用A260/A280比率和动态光散射确认反应。
c)动态光散射
使用Zetasizer ZS(马尔文公司(Malvern))、Green Laser和ZEN2112石英比色皿收集动态光散射数据。通过累积拟合分析推导流体动力学直径和多分散指数(PDI)。所有数据点代表三个或更多个单独制备的样品的平均值。
表5.靶向DNA NP的动态光散射。所有测量值均来自使用累积拟合分析的强度相关函数。一式三份收集测量值并表示为平均值+/-标准偏差。
表6.靶向siRNA NP的动态光散射直径。所有数据一式三份收集并表示为具有标准偏差的平均值。使用累积拟合分析的强度相关函数
实例7
NP产生具有刺激反应DNA释放的稳定纳米颗粒
a)阴离子稳定性测定
在20mM HEPES中制备硫酸葡聚糖(DS)溶液并添加到NP溶液(如实例4制备)中，因此最终DS浓度在100mg/mL与1000mg/mL之间，并且DNA浓度为10μg/mL。在15分钟的去复合期后，将15μL的每种配制品添加到含溴化乙锭的2％E-凝胶中并运行10分钟。使用ImageJ(NIH，马里兰州贝塞斯达(Bethesda,Maryland))计算pDNA释放，结果如图2A所示，其中完整纳米颗粒的百分比被绘制为DS浓度的函数。
b)酶促DNA释放
如实例4制备NP，但在8mM L-半胱氨酸HCl缓冲液(pH 6)中，最终DNA浓度为0.1μg/μl。随后添加组织蛋白酶-B储备溶液(60单位/mL)。Cat-B NP溶液在37℃下孵育长达4小时。在适当的时间点取出等分试样并通过琼脂糖凝胶电泳分析以观察释放的DNA。以不同浓度制备DNA稀释液作为对照，并同样添加到相同的琼脂糖凝胶中，以便随后使用伯乐公司(bio-rad)强度软件分析进行量化，结果如图2B所示。
表7.pDNA的程序化酶促释放。该表总结了使用不同NP配制品进行组织蛋白酶-B处理1h后pDNA释放％。
实例8
NP在体外转染中显示出细胞特异性
a)体外转染
将H1299、C2C12、HEK393、和HEPG2细胞系接种在96孔板中，在24小时内靶向80％汇合。随后将C2C12在杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)中孵育7天，培养基中补充2％马血清以从成肌细胞分化成肌管。在24小时恢复期后，在OPTI-MEM(1:10稀释)中以0.2μg/孔向细胞中添加NP(如实例2制备)。16小时时间段后，去除补充NP的培养基，并添加新鲜的培养基。使用Incucyte(埃森生物科学公司(EssenBio))对GFP成像，并使用ONE-GloTM+ToxLuciferase Reporter(普洛麦格公司(Promega))的标准方案对萤光素酶/活力进行量化。结果如图3A、3B、和3C所示。
实例9
肌肉内DNANP体内转染
a)肌肉内递送
BALB/C小鼠每肢用5μg pDNA(Gwiz萤光素酶)(Genlantis公司，加利福尼亚州圣地亚哥)与MeO-PEG-PD(MN)(如实例5制备)复合处理。每周使用IVIS(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))评估表达。一式四份收集发光并表示为平均值+/-标准偏差。结果如图4所示。
实例10
DNANP治疗性表达
a)编码MEDI8852和STK11的PD纳米颗粒的制备
如实例4中所述用PD3(MN)和编码治疗剂MEDI8852和STK11的质粒制备纳米颗粒。对于MED8852表达，还使用TfR-PEG-PD3(MN)和MeO-PD3(MN)(肽类树枝状大分子精氨酸:核酸磷酸盐N:P 4:1)制备NP，其中25％的肽是TfR-PEG-PD3(MN)。等体积DNA(40μg/mL；MEDI8852质粒(以与来自密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司的Minimal CMV表达质粒类似的方式制备)或STK11(Origene公司，马里兰州罗克维尔市(RockvilleMD))质粒)和肽类树枝状大分子溶液在20mM HEPES(pH 7.0)中制备。以对应于肽类树枝状大分子精氨酸:核酸磷酸盐(N:P)为4:1的浓度制备肽类树枝状大分子溶液。将DNA溶液逐滴添加到肽溶液中，同时轻轻旋转以确保颗粒均匀。使DNA/肽纳米颗粒在室温下复合30分钟。NP溶液中DNA的最终浓度为20μg/mL。作为对照，MEDI8852质粒也使用制造商的方案用lipofectamine-2000(赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)制备。
b)治疗性编码纳米颗粒的体外转染研究
将H1299(6,600个细胞/孔)、HEPG2(50,000个细胞/孔)和C2C12(12,000个细胞/孔细胞)接种在96孔板中的RPMI培养基或DMEM(分别补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素(P/S))中。在24小时恢复期后，用100μL的PBS洗涤细胞两次，用培养基洗涤一次。然后在培养基中以每孔0.2μg(H1299)或0.5μg(HEPG2和C2C12)将纳米颗粒添加到细胞中。16小时时间段后，去除补充纳米颗粒的培养基，并添加新鲜的培养基。MEDI8852表达使用如下(c)所述的ELISA进行量化，STK11表达通过如下(d)所述的蛋白质印迹检测。结果分别如图5A和5B所示。
c)MEDI8852 ELISA
向NUNCTM MaxiSorpTM 96孔微孔板涂覆100μL/孔的在碳酸氢盐缓冲液中的1μg/mL抗MEDI8852抗体(Ali,S等人Antimicrob Agents Chemother.[抗微生物剂与化学疗法]2018年11月；62(11):e00694-18.)。将板在4℃下孵育过夜，然后在第二天早上用300μLPBS-T(磷酸盐缓冲盐水(PBS)+0.1％Tween 20)洗涤三次。所有标准品、质量控制样品和测试样品均在0.5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS+0.1％Tween 20中按1:250稀释。将100μL稀释样品装入每个孔中并孵育2小时。孵育后，用300μL PBS-T洗涤板三次。将二级抗体生物素化抗MEDI8852(Ali,S等人Antimicrob Agents Chemother.[抗微生物剂与化学疗法]2018年11月；62(11):e00694-18.)在PBS-T中稀释至2μg/mL，并在每个孔中添加100uL，并在37℃孵育1小时。然后用PBS-T将板洗涤四次，并添加100μL的1:40稀释的链霉亲和素-HRP复合物(杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)，代码016-030-084)。用PBS-T将板洗涤四次，并将100μL室温平衡的SureBlue TMB底物(赛默飞世尔科技公司)添加到所有孔中。在黑暗中15分钟后，使用100μL的TMB停止溶液(赛默飞世尔科技公司)来淬灭反应。使用BMG Labtech PHERAstar FSX微读板器在450nm处读取每个孔的光密度(OD)。结果如图5A所示。
e)STK11蛋白质印迹
转染后使用补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(皮尔斯公司(Pierce)#78442)的RIPA裂解缓冲液(泰克诺瓦公司(Teknova)，目录号R3792)裂解细胞，并在12,000xg下离心5min。收集上清液并使用BCA测定法(Thermo prod#23227)进行定量。然后使用SDS-聚丙烯酰胺电泳以200mA电流分解每个样品的10μg的提取的蛋白质，持续90min，然后通过iBlot系统转移到PVDF膜上。随后用补充有5％BSA的TBS-T(20mM Tris-HCl，pH 7.6)封闭膜。将兔抗STK11(细胞信号传导公司目录号D60C5)和抗GAPDH(细胞信号传导公司目录号14C10)一级抗体以1:10,000稀释度杂合过夜。将膜洗涤30min，然后与HRP缀合的山羊抗兔IgG杂合30min。孵育后，洗涤膜以消除任何非特异性结合，并与皮尔斯公司SuperSignal West Pico化学发光试剂(皮尔斯公司目录号34579)一起孵育。使用Image Quant LAS 4000检测条带。结果如图5B所示。
实例11
体外靶向DNANP转染
a)体外转染
将H1299(6,600个细胞/孔)、CT26(10,000个细胞/孔)和C2C12(12,000个细胞/孔细胞)接种在96孔板中的RPMI培养基或DMEM(分别补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素(P/S))中。在转染前，允许H1299和CT26细胞有24h的恢复期，而通过将C2C12成肌细胞在补充有2％的马血清的DMEM中孵育至少7天分化成肌管。随后将细胞用100μL PBS洗涤两次，并用培养基洗涤一次。如实例6所述，用Gwiz萤光素酶质粒(Genlantis公司，加利福尼亚州圣地亚哥)制备靶向和非靶向纳米颗粒。用MeO-PEG-PD(MN):TfR-PEG-PD(MN)或cRGD-PEG-PD(MN)的混合物(在实例3a)和b)中制备的材料)制备TfR-和cRGD靶向NP，其中使用0、10％和50％TfR-PEG-PD(MN)和0、5％、10％、20％和30％cRGD-PEG-PD(MN)。在培养基中以每孔0.2μg(1:10稀释)将NP添加到细胞中。16小时时间段后，去除补充纳米颗粒的培养基，并添加新鲜的培养基。GFP的表达用Incucyte(埃森生物科学公司(Essen BioScience)，安娜堡，密歇根州)成像，并且萤光素酶/活力用ONE-GloTM+Tox Luciferase Reporter(普洛麦格公司，麦迪逊，威斯康辛州)和PHERAstarFSX仪器(BMG实验室技术公司(BMG Lab Tech)，凯里，北卡罗来纳州)的标准方案进行量化。结果如图6A-C中所示。
实例12
a)纳米颗粒制备
如实例6所述，靶向PV1的MECA32被工程化并表达为在重链内具有非天然氨基酸取代的半聚体(一条轻链和一条重链)。使用实例6中所述的方案，用PD3(MN)PEG缀合物(如实例6制备)和Gwiz萤光素酶质粒(Genlantis公司，加利福尼亚州圣地亚哥)在5％海藻糖缓冲液中制备NP，其中肽类树枝状大分子精氨酸:核酸磷酸盐(N:P)比率为4:1(75％MeO-PEG-PD3(MN):25％Mal-PEG-PD3(MN))。基于马来酰亚胺的摩尔数，以1.25倍摩尔过量添加CP1-MECA32(Gabriela M.Marchetti,等人Commun Biol.[通讯-生物]2019；2:92；于2019年3月7日线上发表doi:10.1038/s42003-019-0337-2)，并在室温下孵育过夜。通过添加N-乙酰半胱氨酸(10倍摩尔过量)淬灭反应，并使用超速离心(MWCO 100kDa)去除过量抗体。
b)小鼠的肺靶向递送
BALB/C小鼠用20μg的与PD(MN)复合的Gwiz萤光素酶pDNA进行静脉内治疗。10％的pDNA用Cy-5标记(12个标记/质粒)。在第1、3和8天使用IVIS(珀金埃尔默公司)评估表达和生物分布。一式四份进行每个处理，且定量数据表示为平均值+/-标准偏差。结果如图7所示。
实例13
体外mRNANP转染
a)DNA和mRNANP制备
在20mM HEPES(pH 7.0)中制备肽类树枝状大分子溶液PD3(MN)(如实例4和5所述制备)。将编码mCherry的DNA(Origene公司，马里兰州罗克维尔市)或mRNA(Trilink公司，加利福尼亚州圣地亚哥)在相同的缓冲液(40μg/mL)中稀释，并在涡旋的同时逐滴添加到PD混合物中，使得肽类树枝状大分子精氨酸:核酸磷酸盐(N:P)的最终比率为2:1(DNA)或4:1(mRNA)。使核酸/肽纳米颗粒在室温下复合15分钟。纳米颗粒溶液中核酸的最终浓度为20μg/mL。如实例4(DNA)和5(mRNA)中所述，使用DLS表征NP。
b)体外转染
将H1299接种在96孔板中，在24小时内靶向80％汇合。在24小时恢复期后，在培养基(1:10稀释)中以0.2μg/孔向细胞中添加NP。4小时时间段后，去除补充NP的培养基，并添加新鲜的培养基。使用Incucyte(埃森生物科学公司)对mCherry成像。结果如图8所示。
实例14
体内pDNA和mRNA转染
肌肉内递送
如实例4和5所述，用MeO PEG-PD3(MN)制备NP。BALB/C小鼠每肢用5μg编码萤光素酶的复合cleancap mRNA(Trilink公司，加利福尼亚州圣地亚哥)或Gwiz DNA(Genlantis公司，加利福尼亚州圣地亚哥)处理。每周使用IVIS(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))评估表达。一式四份收集发光并表示为平均值+/-标准偏差。结果如图9所示。
实例15
体内mRNA治疗性表达
静脉内递送
如实例5所述，用MeO-PD3(MN)和编码MEDI8852的mRNA制备NP。向BALB/C小鼠通过尾静脉注射(每只小鼠20μg)静脉内施用NP。每周使用IVIS(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))评估表达。一式四份收集发光并表示为平均值+/-标准偏差。结果如图10所示。
实例16
原代T细胞的mRNA靶向转染
T细胞靶向NP制备和表征
体外转染
将新鲜的原代T细胞(类似于可从马萨诸塞州洛厄尔(Lowell,MA)的Cellero公司获得的那些，但新鲜的未冷冻)接种在24孔板(3e6/孔)中的RPMI1640培养基(西格玛公司)中。在24小时的恢复期后，然后在OPTI-MEM中以每孔100μM将NP添加到细胞中。如实例6所述用编码mcherry的cleancap mRNA(Trilink公司，加利福尼亚州圣地亚哥)以及PD3(MN)和Mal-PEG-PD3(MN)的混合物制备NP。用0、25％、50％、和100％Mal-PEG-PD3(MN)制备NP，然后如实例6所述与抗CD3 fab缀合。4小时时间段后，去除补充NP的培养基，并添加新鲜的培养基。RFP使用Incucyte(埃森生物科学公司)成像，并使用流式细胞术进行量化。结果如图11所示，其中A)表示平均mcherry强度，B)为转染细胞的百分比且C)为CD3的表面表达。
实例17
siRNA转染体外研究
a)细胞培养
Colo205和SW480细胞系获自ATTC(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,Virginia))。在37℃和5％CO2下，将培养物维持在补充有10％胎牛血清(FBS)的洛斯维帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)生长培养基(吉博科公司(Gibco))中。Colo205和SW480 CTNNB1 shRNA细胞系是通过多西环素诱导型人CTNNB1 shRNA(Dharmacon公司/Horizon Discovery公司，科罗拉多州拉斐特)的慢病毒转导产生的。
b)TopFlash CTNNB1报告基因测定和蛋白质印迹
SW480肿瘤细胞(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯)用TCF1 TopFlash萤光素酶报告基因(EMD密理博公司(EMD Millipore)，马萨诸塞州柏林顿(Burlington,MA))稳定转导。SW480TopFlash细胞以每孔2.0x 105个细胞的密度接种在6孔培养皿中，并如上所述用胆固醇缀合的siRNA(Accell siRNA)或siRNANP处理48-72小时。如实例5所述，使用具有0、33％、66％或100％cRGD靶向的PD3(MN)或MeO-PEG-PD(MN)和cRGD-PEG-PD(MN)的混合物制备纳米颗粒。使用BrightGlo试剂(普洛麦格公司，威斯康辛州麦迪逊(Madison WI))裂解和处理细胞，转移至96孔板，并使用Envision X(珀金埃尔默公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)测量萤光素酶报告基因活性。PD3(MN)的TopFlash结果：cRGD-PEG-PD3(MN)如图12所示。MeO-PEG-PD3(MN)的TopFlash结果：cRGD-PEG-PD3(MN)如图13A所示。如图13B所示，还使用标准蛋白质印迹方案在5天后评估细胞裂解物的CTNNB1表达。
c)CTNNB1蛋白质印迹和细胞增殖测定
将Colo205细胞以每孔2.0x 105个细胞的密度铺板在6孔板中。作为对照，胆固醇缀合的siRNA用于处理细胞。具体而言，在每孔购自Dharmacon公司/Horizon Discovery公司(科罗拉多州拉斐特)的Accell转染培养基中，向细胞添加1ml的500nM的Accell对照非靶向siRNA和Accell CTNNB1 siRNA。胆固醇缀合可促进高浓度siRNA的递送。转染48小时后，每孔添加2ml的RPMI+10％FBS。对于用包封NP的CTNNB1 siRNA处理Colo205细胞的实验，将细胞以每孔2.0x 105个细胞的密度接种在6孔板中。如实例5所述，使用MeO-PEG-PD(MN)和cRGD-PEG-PD(MN)与0或66％cRGD-PD和1％(w/w siRNA)脂质体的混合物制备纳米颗粒。将生长培养基更换为900μl的最佳最低必需培养基(OPTIMEM)，且每孔添加100μl的NP配制品(每孔100μM的mRNA)。转染16小时后，每孔添加2ml的RPMI+10％FBS。对于细胞增殖测定，在转染后72至96小时收获细胞并使用ViCell XR细胞计数器计数，如图13C所示。
实例18
靶向siRNA转染体内研究
a)体内肿瘤生长抑制测定
七周龄的雌性裸鼠皮下注射200μl的PBS中的5.0x 106个Colo205细胞。当平均肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分为治疗组并连续三天接受静脉注射NP(0、33％和66％cRGD PD(MN):PEG-PD(MN)，如实例6中制备的)，接着一周后连续注射两天。在实验期间，每周记录两次或三次肿瘤测量值和小鼠体重。当肿瘤达到2000mm3大小或表现出溃疡覆盖超过50％的肿瘤表面时，对小鼠实施安乐死。结果如图14所示。
实例19
杂合RNA/DNA肽类树枝状大分子纳米颗粒(NP)自组装
a)NP制备
编码mCherry的Cleancap mRNA(Trilink公司，加利福尼亚州圣地亚哥)和编码GFP的gWizTMDNA(Aldevron公司，北达科他州法戈(Fargo,ND))在20mM HEPES(pH 7.0)中以1:1质量比制备，最终浓度为40μg/mL。在20mM HEPES(pH 7.0)中制备PD3(MN)溶液(如实例2制备)，浓度对应于最终肽类树枝状大分子精氨酸:核酸磷酸盐(N:P)比率4:1。将核酸溶液以1:1的体积比添加到PD3(MN)溶液中，并通过吸移彻底混合。使NP在室温下复合30分钟。NP溶液中核酸的最终浓度为20μg/mL(10μg/mL mRNA和μg/mL DNA)。对照NP仅用DNA和mRNA制备，最终核酸浓度为20μg/mL。
b)动态光散射
使用Zetasizer ZS(马尔文公司(Malvern))、Green Laser和ZEN2112石英比色皿收集动态光散射(DLS)数据。通过累积拟合分析推导流体动力学直径和多分散指数(PDI)。所有数据点代表三个或更多个单独制备的样品的平均值。结果如表8所示。
遗传物质 流体动力学直径(nm) 多分散指数
DNA NP 56±2 0.177±0.005
mRNA NP 33±2 0.190±0.008
DNA mRNA NP 49±2 0.187±0.003
表8.如实例19所述，用PD3(MN)和DNA、mRNA或1:1比率的DNA和mRNA制备的NP的流体动力学直径。一式三份收集所有测量值并表示为平均值+/-标准偏差。
c)通过荧光共振能量转移(FRET)评估共包封
使用Label核酸标记试剂盒(Mirus Bio公司，威斯康辛州麦迪逊)，将编码GFP的gWizTMDNA(Aldevron公司，北达科他州法戈)用Cy5标记，编码mCherry的Cleancap mRNA(Trilink公司，加利福尼亚州圣地亚哥)用Cy3标记。以下纳米颗粒用如上所述PD3(MN)配制，最终核酸浓度为20μg/mL：
1.Cy5 DNA+无标记DNA(1:1)共包封的NP
2.Cy3 mRNA+无标记mRNA(1:1)共包封的NP
3.Cy5 DNA NP+Cy3 mRNANP(1:1)，分开包封的。
4.Cy5 DNA+Cy3 mRNA(1:1)共包封的NP
在荧光分析之前，使NP复合10分钟。上面列出的3中的NP分别配制，使其复合10分钟，然后在荧光分析之前以1:1的比率混合。使用NanoDropTM3300荧光光谱仪(赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行荧光分析。将2μL的NP样品加载到基座上，并使用蓝色LED激发样品。在450和750nm波长之间测量荧光发射(相对荧光单位，RFU)。这些NP样品的荧光谱如图15所示。
d)H1299细胞中mRNA和DNA的表达
如a)所述，用1:1重量比的PD3(MN)与GFP DNA和mCherry mRNA配制NP，最终核酸浓度为20μg/mL。在处理前24h，H1299细胞以10,000个细胞/孔铺板在组织培养处理的96孔板中。在处理之前，立即去除生长培养基并更换100μL Opti-MEMTMI减少的血清培养基(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)，马萨诸塞州沃尔瑟姆)。向每个孔中添加10μL纳米颗粒溶液(200ng/孔核酸剂量)。将纳米颗粒与细胞一起孵育4小时，然后去除Opti-MEM和纳米颗粒并更换为生长培养基。使用Incucyte实时细胞分析系统(赛多利斯公司，德国哥廷根(Germany))监测GFP和mCherry蛋白的表达，该分析系统每4小时捕获一次细胞的荧光图像。使用Incucyte软件分析图像以确定绿色(GFP)和红色(mCherry)通道中的荧光面积以及红色和绿色信号重叠的面积。将信号归一化为峰值信号面积以监测表达动力学。结果如图16所示。
e)C2C12细胞中mRNA和DNA的表达
C2C12细胞以20,000个细胞/孔铺板在组织培养处理的96孔板中。将生长培养基更换为低血清分化培养基(DMEM+2％马血清)并培养7天，直到形成融合的细长肌管。如a)所述，用1:1重量比的PD3(MN)与GFP DNA和mCherry mRNA配制纳米颗粒，最终核酸浓度为50μg/mL。将(DOTMA:DOPE(％w/w)＝1)(赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)添加到配制品中。/>在20mM HPES(pH 7.0)中稀释，对应于与核酸的1％w/w。如前所述，在添加RNA溶液之前立即将/>溶液添加到PD3(MN)溶液中。在处理之前，立即去除培养基并更换100μLOpti-MEMTMI减少的血清培养基(赛默飞世尔公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)。向每个孔中添加10μL纳米颗粒溶液(200ng/孔核酸剂量)。将纳米颗粒与细胞一起孵育4小时，然后去除Opti-MEM和纳米颗粒并更换为生长培养基。如所述，使用Incucyte实时细胞分析监测GFP和mCherry蛋白的表达。结果如图17所示。/>

Claims (27)

1.一种肽类树枝状大分子，其包含一个或多个源自具有式(I)的经修饰赖氨酸的残基：
其中：
A是键、C1-6亚烷基、碳环基或杂环基；其中所述碳环基或杂环基可任选地在碳上被一个或多个R2取代；并且其中如果所述杂环基含有-NH-部分，则氮可任选地被选自RA的基团取代；
Q是键、碳环基或杂环基；其中所述碳环基或杂环基可任选地在碳上被一个或多个R3取代；并且其中如果所述杂环基含有-NH-部分，则氮可任选地被选自RB的基团取代；
环B是吗啉基或硫代吗啉基；其中如果所述吗啉基或硫代吗啉基含有-NH-部分，则氮可任选地被选自RC的基团取代；
R1、R2和R3各自独立地选自卤代、硝基、氰基、羟基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、羧基、氨甲酰基、巯基、氨磺酰基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、乙酰基、乙酰氧基、甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、N-甲基-N-乙基氨基、乙酰基氨基、N-甲基氨甲酰基、N-乙基氨甲酰基、N,N-二甲基氨甲酰基、N,N-二乙基氨甲酰基、N-甲基-N-乙基氨甲酰基、甲基硫代、乙基硫代、甲基亚磺酰基、乙基亚磺酰基、甲磺酰基、乙基磺酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺酰基、N-乙基氨磺酰基、N,N-二甲基氨磺酰基、N,N-二乙基氨磺酰基以及N-甲基-N-乙基氨磺酰基；
n是0-4；
RA、RB和RC独立地选自甲基、乙基、丙基、异丙基、乙酰基、甲磺酰基、乙基磺酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基、氨甲酰基、N-甲基氨甲酰基、N-乙基氨甲酰基、N,N-二甲基氨甲酰基、N,N-二乙基氨甲酰基和N-甲基-N-乙基氨甲酰基。
2.如权利要求1所述的肽类树枝状大分子，其中A是键、C1-6亚烷基或杂环基。
3.如权利要求1或权利要求2所述的肽类树枝状大分子，其中Q是键。
4.如权利要求1-3中任一项所述的肽类树枝状大分子，其中n是0。
5.如权利要求1-4中任一项所述的肽类树枝状大分子，其中环B是吗啉基。
6.如权利要求1-4中任一项所述的肽类树枝状大分子，其中环B是硫代吗啉基。
7.如权利要求1-4中任一项所述的肽类树枝状大分子，其中：
A是键、亚甲基或吡啶基；
Q是键；
环B是吗啉基或硫代吗啉基；并且
n是0。
8.如权利要求1-7中任一项所述的肽类树枝状大分子，其中该源自经修饰赖氨酸的残基具有式(IB)：
9.如权利要求1-4、7或8中任一项所述的肽类树枝状大分子，其中该源自经修饰赖氨酸的残基是：
(S)-2-氨基-6-{[6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羰基]氨基}己酸；
(S)-2-氨基-6-[(硫代吗啉-3-羰基)氨基]己酸；以及
(S)-2-氨基-6-[2-(吗啉-4-基)乙酰胺基]己酸。
10.如前述权利要求中任一项所述的肽类树枝状大分子，其中该树枝状大分子包含少于六代。
11.如前述权利要求中任一项所述的肽类树枝状大分子，其中该肽类树枝状大分子包含分支点、第0代和后续代，并且其中这些分支点、第0代和后续代一起包含少于100个氨基酸残基。
12.如前述权利要求中任一项所述的肽类树枝状大分子，其中该肽类树枝状大分子包含具有式(II)的肽类树枝状大分子：
({X3}{X2}{X1})8({BP}{X3}{X2}{X1})4({BP}{X3}{X2}{X1})2{BP}
(II)
其中：
X1、X2、或X3之一是碱性氨基酸残基；
X1、X2、或X3中的另一个是疏水性氨基酸残基；
X1、X2、或X3中的剩余者是源自如权利要求1-9中任一项所定义的经修饰赖氨酸的残基；并且
BP是分支点氨基酸残基。
13.如权利要求12所述的肽类树枝状大分子，其中该碱性氨基酸残基选自精氨酸。
14.如权利要求12或权利要求13所述的肽类树枝状大分子，其中该疏水性氨基酸残基选自亮氨酸。
15.如权利要求12-14中任一项所述的肽类树枝状大分子，其中BP是赖氨酸。
16.如前述权利要求中任一项所述的肽类树枝状大分子，其进一步包含与该肽类树枝状大分子的第一分支点氨基酸附接的第0代氨基酸残基序列。
17.如权利要求16所述的肽类树枝状大分子，其中该第0代序列由GLY-VAL-CIT-GLY-GLY-SER-CYS(SEQ ID NO 5)组成，其中末端CYS羧基基团被酰胺化形成C(O)NH2基团。
18.如前述权利要求中任一项所述的肽类树枝状大分子，其进一步包含由-(OCH2CH2)n-重复亚基组成的聚乙二醇基团，其中n>3。
19.如前述权利要求中任一项所述的肽类树枝状大分子，其进一步包含选自肽、抗体、糖或小分子靶向基团的靶向基团。
20.如前述权利要求中任一项所述的肽类树枝状大分子用于将药物活性剂递送到细胞中的用途。
21.一种药物组合物，其包含一种或多种如前述权利要求中任一项所述的肽类树枝状大分子、和药物活性剂。
22.如权利要求20或权利要求21所述的用途或药物组合物，其中该药物活性剂是遗传物质。
23.如权利要求22所述的用途或药物组合物，其中该遗传物质是DNA。
24.如权利要求22所述的用途或药物组合物，其中该遗传物质是RNA。
25.如权利要求22所述的用途或药物组合物，其中该遗传物质是DNA和RNA。
26.如权利要求20-25中任一项所述的用途或药物组合物，其进一步包含脂质。
27.一种基因疗法方法，该方法包括向所述动物施用有效量的如权利要求21-26中任一项所述的药物组合物。
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