KR20240035722A - 세포 내 형질주입을 위한 신규한 폴리펩타이드 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포 내 형질주입을 위한 신규한 펩타이드 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 세포 내 형질주입을 위한 신규한 펩타이드 조성물은 목적 물질에 대한 형질주입의 효능을 크게 향상시켰으며 세포독성도 현저하게 낮은 장점을 가진다. 이를 통해 다양한 물질들을 세포 내로 수송할 수 있다는 점에서 다양한 활용 가치를 지닌다.
본 발명에 따른 세포 내 형질주입을 위한 신규한 펩타이드 조성물은 목적 물질에 대한 형질주입의 효능을 크게 향상시켰으며 세포독성도 현저하게 낮은 장점을 가진다. 이를 통해 다양한 물질들을 세포 내로 수송할 수 있다는 점에서 다양한 활용 가치를 지닌다.
Description
본 발명은 세포 내 형질주입을 위한 신규한 폴리펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
세포 내로 핵산 물질을 전달하기 위한 핵산 전달체는 크게 바이러스성 벡터와 비바이러스성 벡터로 구분할 수 있다.
비바이러스성 벡터로서는 리포좀, 양이온성 고분자를 비롯하여, 미셀, 에멀젼, 나노입자 등의 다양한 제형이 사용될 수 있다. 이들 제형에서 양이온성 지질은 음이온성 핵산 물질과 정전기적으로 결합하는 힘을 제공하므로 핵산 전달체 설계의 핵심 물질이다(리포펙션(lipofection)). 양이온성 지질은 음이온성 핵산 물질과 안정한 이온결합에 의한 복합체 입자를 형성하며, 이렇게 형성된 복합체는 세포막 융합이나 세포 내 이입(endocytosis)에 의하여 세포 내로 수송되게 된다.
종래에 개발된 양이온성 지질들은 중성의 지방산 사슬에 1차 아민(primary amine), 2차 아민(secondary amine), 3차 아민(tertiary amine), 또는 4차 암모늄염(quarternary ammonium salt) 등의 아민 보유 화합물을 결합시켜 양이온성을 부여하는 방법을 사용하였다.
위의 지질들은 유전자 전달효과는 비교적 높으나 세포 독성을 지니고 있다는 보고가 있다. 이러한 세포 독성을 극복하기 위해 비-아미노산 링커(linker) 대신 아미노산 링커(linker)를 사용한 지질들이 합성되어 왔다.
최근의 보고에 의하면 지방산 아민과 아미노산의 카르복실기를 결합시켜 제작한 양이온성 지질들은 예상과는 달리 세포독성을 가지고 있는 것이 많았으며, 특히 제작된 양이온성 지질들의 대부분이 세포 내로의 올리고 핵산 등의 전달대상 물질의 전달효율이 매우 떨어져 실용적 가치가 없는 것으로 보고되고 있다. 이는 단순히 아미노산과 지방산 아민의 결합만으로 지질 전달체를 구성하는 것만으로는 세포 내 전달 효율을 얻기 어렵고, 그 구체적인 구조에 따라 전달 효율이 결정되므로 매우 세심한 사전 설계와 실험결과들이 뒷받침되어야 실용적으로 전달시스템으로 사용될 수 있음을 시사한다.
또한, 바이러스성 벡터는 유전자 전달 효율 높으나 병원성이 있는 바이러스이므로 안전성의 문제 및 벡터 내 삽입 가능한 유전자 크기에도 제한적이라는 문제점이 있다. 또한, 최근에는 이의 면역원성과 관련된 문제들이 다수 나타나고 있기 때문에, 핵산 전달을 위한 바이러스성 벡터의 활용에 대해서 매우 제한적인 부분이 있다.
이러한 배경하에 본 발명자들은 신규의 핵산 전달용 시스템을 제조하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 세포 내 형질주입을 위한 신규 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포 내 형질주입을 위한 폴리펩타이드의 신규 용도를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석해서는 아니된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서 “포함하다” 또는 “가지다” 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 하기에서는 중복되는 내용의 혼잡을 방지하기 위하여, 중복되는 내용의 기재를 생략하고자 하였다. 즉, 하기의 내용만으로 발명의 내용이 한정되는 것은 아니고, 전체적인 발명의 내용에 따라 발명의 내용이 해석되어야 할 것이다.
폴리펩타이드
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신; 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
보다 구체적으로, 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신; 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드로 필수적으로 이루어진 폴리펩타이드를 제공한다.
보다 구체적으로, 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신; 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명에서 용어 “펩타이드”란 아미드 결합 (또는 펩타이드 결합)에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 분자를 의미한다. 상기 펩타이드는 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 합성된 것일 수 있고, 바람직하게는 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관 내에서 합성된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "폴리펩타이드"란 아미드 결합(또는 펩타이드 결합)에 의해 선형으로 연결된 단량체들(아미노산들)로 구성된 분자를 의미한다. 상기 폴리펩타이드에는 2개 이상의 아미노산들로 구성된 쇄를 지칭하기 위해 사용되는 펩타이드, 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 올리고펩타이드 등이 포함된다.
본 발명에서 용어 "아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 및 변형된 아미노산을 의미한다. 달리 언급되지 않는 한, 아미노산에 대한 모든 언급은, 일반적으로 또는 명칭에 따라 특이적으로, D 및 L 입체 이성질체(구조가 이같은 입체 이성질체 형태를 허용하는 경우) 양쪽 모두에 대한 언급을 포함한다. 천연 아미노산에는 알라닌(Ala), 아르기닌(Arg), 아스파라긴(Asn), 아스파르트산(Asp), 시스테인(Cys), 글루타민(Gln), 글루탐산(Glu), 글리신(Gly), 히스티딘(His), 이소류신(Ile), 류신(Leu), 라이신(Lys), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 프롤린(Pro), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 트립토판(Trp), 타이로신(Tyr) 및 발린(Val)이 포함된다. 비천연 아미노산에는 N-말단 아미노기 또는 측쇄 작용기 상에서 화학적으로 변형된, 또는 가역적 또는 비가역적으로 화학적으로 차단된 변형 아미노산 잔기, 예를 들어, N-메틸화 D 및 L 아미노산 또는 측쇄 작용기가 또다른 작용기로 화학적으로 변형된 잔기가 포함된다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 융합된 구성요소를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬로서, 융합된 구성요소들은 직접적 또는 간접적으로 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 필요에 따라 이의 유도체를 포함하는 의미로 상기 펩타이드의 아미노산 단편 또는 일부가 치환 또는 결실되거나, 아미노산 서열의 일부가 생체 내에서 안정성을 증가시킬 수 있는 구조로 변형되거나, 친수성을 높이기 위해 아미노산 서열의 일부가 변형되거나, 아미노산의 일부 또는 전부가 L- 또는 D-아미노산으로 치환되거나 또는 아미노산의 일부가 변형된 단편들일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 펩타이드는 펩타이드의 안정성 및 생체활성 증가를 위하여 폴리펩타이드의 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산이 변형(modification)된 형태일 수 있다. 예컨대 N 말단 아세틸화(N' acetylation) 또는 C 말단 아미드화(C' amidation)에 의하여 변형된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 “이에 연결된”이란 표현은 N-말단 또는 C-말단으로의 펩타이드 서열의 연결 및/또는 결합을 의미한다. 여기서 연결은 직접 결합되어 연결된 것이나 링커 또는 스페이서 펩타이드를 통해 연결되는 것을 모두 포함한다. 바람직하게 “이에 연결된”은 9개 내지 11개의 연속된 류신의 C 말단에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 언급하는 것일 수 있다.
즉, 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신; 및 이의 C 말단에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명에서 서열번호 1은 NLS(nuclear localization sequence)로 알려진 서열이며, PKKKRKV의 아미노산으로 구성된 서열을 의미한다. 이러한 펩타이드는 단순 NLS의 작용 목적이 아닌, 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신에 연결되어 복합적으로 세포 내 목적 물질을 전달하기 위한 목적 작용 효과를 도달하게 한다.
필요에 따라 상기 서열은 상기 펩타이드 간의 연결은 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커 또는 스페이서 펩타이드를 두고 연결될 수도 있다.
용어 "링커" 또는 "스페이서"는 폴리펩타이드 구성시 기능이 다른 두 펩타이드를 분리하는데 사용되는 짧은 아미노산 서열을 지칭하는 것이다. 단백질 내의 두 개 또는 그 이상의 개별 도메인 사이에 링커가 부재하면 입체 장애로 인하여 단백질 도메인의 감소된 또는 부적절한 기능, 예를 들어 수용체/리간드에 대한 촉매 활성 또는 결합 친화력의 감소를 초래할 수 있다. 인공적인 링커를 사용하여 키메라 단백질에서 단백질 도메인을 연결하면 도메인 사이의 공간을 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 링커 또는 스페이서 펩타이드는 류신과 서열번호 1의 펩타이드의 결합체 혹은 반복되는 서열번호 1의 펩타이드 결합 사이에서 이의 활성을 향상시키는 효과를 나타내게 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 상기 영역들을 결합시키거나 또는 이들 간의 일부 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 보존하는 것 이외에 특정한 생물 활성을 갖지 않을 것이나, 구성 아미노산들은 상기 분자의 일부 성질, 예를 들어 폴딩, 순 전하, 또는 소수성에 영향을 미치도록 선택될 수 있다.
보다 구체적으로, 폴리펩타이드는 서열번호 2 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
이러한 임의의 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
| L 9 | L 10 | L 11 | |
| 1xNLS | N'-LLLLLLLLLPKKKRKV-C' (서열번호 2) | N'-LLLLLLLLLLPKKKRKV-C' (서열번호 6) | N'-LLLLLLLLLLLPKKKRKV-C' (서열번호 10) |
| 2xNLS | N'-LLLLLLLLLPKKKRKVPKKKRKV-C' (서열번호 3) | N'-LLLLLLLLLLPKKKRKVPKKKRKV-C' (서열번호 7) | N'-LLLLLLLLLLLPKKKRKVPKKKRKV-C' (서열번호 11) |
| 3xNLS | N'-LLLLLLLLLPKKKRKVPKKKRKVPKKKRKV-C' (서열번호 4) | N'-LLLLLLLLLLPKKKRKVPKKKRKVPKKKRKV-C' (서열번호 8) | N'-LLLLLLLLLLLPKKKRKVPKKKRKVPKKKRKV-C' (서열번호 12) |
| 4xNLS | N'-LLLLLLLLLPKKKRKVPKKKRKVPKKKRKVPKKKRKV-C' (서열번호 5) | N'-LLLLLLLLLLPKKKRKVPKKKRKVPKKKRKV PKKKRKV-C' (서열번호 9) |
N'-LLLLLLLLLLLPKKKRKVPKKKRKVPKKKRKV PKKKRKV-C' (서열번호 13) |
필요에 따라, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 서열은 상기 언급된 서열번호 2 내지 13으로 이루어진 것일 수 있다. 이때, 상기 서열번호 2 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나와 적어도 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 펩타이드도 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
9개, 10개, 또는 11개의 연속된 류신은 각각 서열번호 14, 15 및 16에 나타내었다.
9개의 연속된 류신 : LLLLLLLLL (서열번호 14)
10개의 연속된 류신 : LLLLLLLLLL (서열번호 15)
11개의 연속된 류신 : LLLLLLLLLLL (서열번호 16)
상기 서열 상동성 측면에서, 본 발명에 따른 서열번호 2 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나와 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 펩타이드의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가한 펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 세포 내로 목적 물질을 전달하는 능력을 가진 전달체 용도의 폴리펩타이드이다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 구성요소들 간의 직접적인 상호작용을 통하여 융합되고 융합된 입자에 공통의 내부 공간을 형성한다. 이러한 공통의 내부 공간에 목적 물질을 담지하여 세포 내로 목적 물질을 전달하게 한다. 즉, 상기 폴리펩타이드는 "막"을 형성하여 외층을 구성할 수 있으며, 여기에 내부 구획을 가짐으로써 목적 물질을 담지할 수 있다. 구체적으로, 막을 형성하여 외층을 구성하여 내부 구획을 가짐으로써 목적 물질을 담지하는 것일 수 있다.
특히, 물리화학적 물성들, 가변 융합유도성, 높은 봉입 효율을 보유하고, 안전성이 높고 면역원성이 낮아 세포 뿐만 아니라 인체 내 적용에도 활용 가능성이 높다.
또한, 본 발명에 따른 목적 물질을 전달하는 능력을 가지는 폴리펩타이드는 매우 작은 펩타이드이므로, 혹시 발생할 수 있는 활성물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다.
이에 따라, 본 발명에서는 폴리펩타이드를 이용하여 목적 물질을 세포 내로 전달할 수 있다.
본 발명에서 “목적 물질”이란 폴리펩타이드에 담지되어 세포 내로 전달되어 세포 내 활성을 조절하는 활성을 나타낼 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특별히 제한되지 않으나, 일 예시로서, 화합물, 단백질, 핵산 등이 될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 화합물은 저분자 화합물, 전하를 띤 고분자 화합물, 형광화합물일 수 있다.
보다 구체적으로, 단백질은 항체, 수용체와 결합할 수 있는 리간드 펩타이드, 단백질 약물, 세포 독성 폴리펩타이드, 세포독성 단백질 및 형광 단백질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
보다 구체적으로 상기 핵산은 예를 들어, DNA, 재조합 DNA, 플라스미드 DNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앱타머, RNA, siRNA, shRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 이용 가능한 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 폴리펩타이드는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 절차, 즉 공지된 폴리펩타이드 합성 방법(ex. 유전공학적 방법, 화학적 합성)을 이용하여 합성될 수 있다.
예컨대 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 유전공학적 방법에 따른 재조합 기법에 의해 제조될 수 있다. 유전공학적 방법에 의한 펩타이드의 제작은, 예를 들어, 우선 통상적인 방법에 따라 상기 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산(폴리뉴클레오타이드)을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하여 준비할 수 있다. 또는 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence; 예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시켜 재조합 발현 벡터를 제작하고 숙주세포에 형질전환시킨 후, 상기 세포를 목적하는 폴리펩타이드가 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산으로부터 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩타이드를 회수하게 된다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 예를 들면 추출법, 재결정법, 다양한 크로마토크래피(겔 여과법, 이온 교환, 침전, 흡착, 역전상), 전기영동, 역류 분배법 등 당업계에 공지된 방법으로 분리 및 정제할 수 있다.
상기에서 “실질적으로 순수한 폴리펩타이드(substantially pure polypeptide)”는 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
상기에서 "벡터(vector)"는 어떤 핵산을 그것이 연관된 곳으로 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 또한, "발현 벡터(expression vector)"는 벡터에 의해 운반된 각각의 재조합 유전자에 의해 암호화된 융합체 단백질을 합성할 수 있는 플라스미드, 코스미드(cosmid) 또는 파지(phage)를 포함한다.
또한, 예컨대 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다.
예컨대 본 발명의 폴리펩타이드는 고체상 펩타이드 합성(SPPS) 방법을 이용한 직접적 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 고체상 펩타이드 합성(SPPS) 방법은 작은 다공성의 비드(beads)에 링커(linkers)라 불리는 기능성 유닛(functional units)을 부착하여 펩타이드 사슬을 이어 나갈 수 있도록 유도함으로써 합성을 개시할 수 있다. 액체상 방법과 달리 펩타이드는 비드와 공유 결합하여 TFA(trifluoroacetic acid)와 같은 특정 반응물에 의해 절단되기 전까지 여과(filtration) 과정에 의해 떨어져 나가는 것을 방지한다. 고체상에 부착된 펩타이드의 N-말단 아민과 N-보호 아미노산 유닛(N-protected amino acid unit)이 결합하는 보호(protection) 과정, 탈보호(deprotection) 과정, 다시 드러난 아민 그룹(amine group)과 새로운 아미노산이 결합하는 커플링(coupling) 과정의 사이클(cycle, deprotection-wash-coupling-wash)이 반복되면서 합성이 이루어지게 된다. 상기 SPPS 방법은 마이크로파(microwave) 기술을 함께 이용하여 수행할 수 있으며, 마이크로파 기술은 펩타이드 합성 과정에서 열을 가해줌으로써 각 사이클의 커플링과 탈보호에 요구되는 시간을 단축시킬 수 있다. 상기 열 에너지는 확장되는 펩타이드 사슬이 접히거나(folding) 집합체를 형성하는 것(aggregation)을 방지하고 화학적 결합을 촉진시킬 수 있다.
본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
목적 물질 전달 용도
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는, 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드; 및 목적 물질을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는, 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드; 및 목적 물질을 포함하는 세포 내 형질주입용 조성물을 제공한다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는, 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드; 및 목적 물질을 포함하는 핵 내 목적 물질 전달용 조성물을 제공한다.
이하 위 개별 용도에 대해 구체적으로 설명한다.
본 발명은 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드; 및 목적 물질을 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 세포 내 형질주입 용도로 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 목적 물질을 형질주입(transfection)하여 세포 내로 전달하고, 세포 내에서 상기 목적 물질의 발현을 조절함으로써 다양한 작용 효과를 나타낼 수 있다. '주입'시키는 것에 대하여 '운반', '침투', '수송', '전달', '투과' 또는 '통과'한다는 표현들과 상호 혼용한다.
본 발명에서 용어 "형질주입(transfection)"이란, 세포, 바람직하게는 진핵 세포에 핵산 분자 또는 단백질을 주입하는 과정을 의미한다. 상기 핵산 분자는 완전한 단백질 또는 이의 기능적 부분을 코딩하는 유전자 서열일 수 있다. 상기 진핵 세포는 동물 세포, 포유동물 세포, 또는 인간 세포일 수 있으며, 예를 들어, 줄기 세포(예를 들어, 배아 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 말초 혈액 줄기 세포), 일차 세포(예를 들어, 근아세포, 섬유아세포), 면역 세포(예를 들어, NK 세포, T 세포, 수지상 세포, 항원 제시 세포), 암세포, 상피 세포, 피부 세포, 위장 세포, 점막 세포, 또는 폐 세포일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 표적 세포에 대한 형질주입 효율을 증가시키는 것으로 표적 세포 내로의 목적 물질의 전달을 용이하게 할 수 있다. 필요에 따라 핵 내료 목적 물질의 전달 또한 가능하다.
치료, 영상화 및 진단적 적용이 본 발명에 따른 조성물의 관심사이다. 이에 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 이용하면 다양한 목적 물질이 시험관 내, 생체 내 바람직하게 인체 내에서 목적 물질을 내부로 용이하게 봉입될 수 있으며 맞춤식으로 목적 물질을 세포 내 형질주입할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 이들 간에 상호작용을 통해 구(sphere) 형태의 모양을 형성하고 이들 내부에 목적 물질을 담지할 수 있다. 이러한 구 형태는 직경으로 대략 30nm 내지 200nm 범위이며, 보다 바람직하게, 50nm 내지 150nm 범위, 보다 더 바람직하게 60 내지 130 nm 범위이다. 이들 내부에 목적 물질을 함유할 수 있다.
특히, 입도분석기(particle size analyzer)를 이용하여 제조된 폴리펩타이드 담체의 유체역학적 반경과 제타 전위를 측정한 결과, 유체역학적 반경은 30nm 내지 50nm, 제타 전위는 +2mV 내지 +6mV 정도로 확인되었다. 이는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 목적 물질을 이용하여 나노 사이즈의 복합체를 만들 수 있음을 보여주며, 상기 목적 물질 탑재 여부와 관련 없이 목적하는 일정한 크기를 유지하는 것을 보여 주었다. 또한, 혼성화에 대한 영향 없이 목적 물질을 목적하는 수준 이상으로 담지하여 전달 효능을 나타내는 것을 확인하였다.
예컨대, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 당업계에 알려진 일반적인 방법을 통해 세포 내로 목적 물질을 도입할 수 있다. 이러한 도입 방법은 일반적으로 알려진 세포 배양 조건의 수준 내에서 이루어질 수 있다.
예를 들어, in vitro 하에서 목적 물질과 혼합하여 세포 내로 형질 주입할 수 있다. 상기 혼합은 32~40℃, 바람직하게 약 37℃ 조건 하에 10, 20, 30, 40, 50 또는 60분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간 또는 그 이상 동안 이루어질 수 있다. 또한, 상기 혼합을 위한 버퍼는 임의의 알려진 배지 등이 활용될 수 있다. 이에 한정되지 않으나, 예를 들어, Opti-MEM, DPBS, 및/또는 RPMI-1640 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 ex vivo, in vivo 조건 하에서 목적 물질과 혼합하여 목적 물질은 표적 세포 내로 도달하게 할 수 있다. 본 발명에서 상기 목적 물질의 형질주입은 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 시간 동안 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물(폴리펩타이드 및 목적 물질)은 표적 세포에 접촉시키기 전에, 혼합물을 형성하기 위하여 폴리펩타이드 및 목적 물질을 예비-배양할 수도 있다.
상기 방법은 세포에 조성물을 다중 처리하는 것을 또한 포함할 수 있다 (예를 들어, 1일당 1, 2, 3, 4회 또는 그 이상, 및/또는 미리 결정된 스케줄). 이 경우, 더 낮은 농도의 조성물이 (예를 들어, 감소된 독성에 대해) 권장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 현탁 세포 또는 부착세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 당업자는 원하는 생존력을 갖는 특정 세포에 목적 물질을 전달하는 특정 요구에 적합하도록 운반, 도메인, 용도 및 방법의 상이한 조합들을 사용하여 본 설명의 교시를 적합화할 수 있을 것이다.
예를 들어, 상기 목적 물질은 화합물, 단백질, 핵산 등이 될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 화합물은 저분자 화합물, 전하를 띤 고분자 화합물, 형광화합물일 수 있다.
보다 구체적으로, 단백질은 항체, 수용체와 결합할 수 있는 리간드 펩타이드, 단백질 약물, 세포 독성 폴리펩타이드, 세포독성 단백질 및 형광 단백질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
보다 구체적으로 상기 핵산은 예를 들어, DNA, 재조합 DNA, 플라스미드 DNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앱타머, RNA, siRNA, shRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 목적 물질은 치료 또는 예방의 목적, 연구 개발을 위한 실험 목적 등에 따라 목적하는 물질을 변경하면서 세포 내 또는 인체 내로 전달 가능하다. 이러한 물질은 내인성리간드, 신경전달물질, 호르몬, 오타코이드(autacoid), 사이토카인(cytokine), 항바이러스제, 항암제, 항생제, 산소-강화제, 산소-함유제, 항전간제 및 항염증 약물 등 다양한 활성 검토를 위한 임의의 물질들이 고려될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물을 이용한 목적 물질의 형질주입은 일반적인 형질주입과 비교하여 세포 내로의 전달 효능을 크게 높일 수 있다. 이를 통해 본 발명에 따른 조성물은 세포 내로 목적 물질을 전달하여 질병 또는 장애에 대한 치료 효능을 나타낼 수 있다. 본 발명의 일실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 목적 물질을 세포 내로 다량 전달할 수 있다.
본 발명은 상기 조성물을 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내로 목적 물질 전달 방법을 제공한다.
상기 세포는 동물 세포, 포유동물 세포, 또는 인간 세포일 수 있으며, 예를 들어, 줄기세포(예를 들어, 배아 줄기세포, 만능 줄기세포, 유도 만능 줄기세포, 신경 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 말초 혈액 줄기세포), 일차세포(예를 들어, 근아세포, 섬유아세포), 면역세포(예를 들어, NK 세포, T 세포, 수지상 세포, 항원 제시 세포), 암세포, 상피세포, 피부세포, 위장세포, 점막세포, 또는 폐 세포일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
치료 용도
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는, 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드; 및 목적 물질을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는, 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드; 및 목적 물질을 포함하는 약물 보조용 조성물을 제공한다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는, 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드; 및 약물을 포함하는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는, 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드; 및 목적 물질을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 약물 전달용은 약물을 표적 세포 내로 전달하기 위한 전달 물질로 용도를 의미한다.
본 발명에서 약물 보조용은 종래 약물의 효과를 극대화시키기 위해 약물과 병용하는 보조제로서의 용도를 의미한다.
상기 약물 전달용 또는 약물 보조용은 단독으로 투여할 때에는 의약적 효과가 상대적으로 낮지만, 본 발명에 따른 폴리펩타이드와 함께 투여될 경우 약물의 효능을 현저히 개선하는 용도를 의미한다.
본 발명에서 조성물은 목적 물질을 생체 조직 또는 혈중으로 전달시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 조성물은 생체 조직을 구성하는 세포 또는 세포 간 연접을 통하여 전달될 수 있으나 전달 방식에는 제한이 없다.
상기 생체 조직은 하나 이상의 상피조직, 근육조직, 신경조직, 결합조직을 의미하며 각 장기는 하나 이상의 조직으로 이루어질 수 있으므로, 점막, 피부, 뇌, 폐, 간, 신장, 비장, 폐장, 심장, 위장, 대장, 소화관, 방광, 요관, 요도, 난소, 정소, 생식기, 근육, 혈액, 혈관, 림프관, 림프절, 흉선, 췌장, 부신, 갑상선, 부갑상선, 후두, 편도, 기관지, 폐포의 다양한 생체 장기가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
특히, 종래 목적 물질, 예컨대 생물학적 활성 물질을 세포 내로 전달하여 직접 작용할 수 있게 할 뿐만 아니라, 세포 중에서도 대식세포, B 림프구, T 림프구, 비만세포, 단핵구, 수지상 세포, 호산구, 자연살해세포, 호염기구, 및 호중구로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 면역세포를 타겟으로 하여 생물학적 활성 물질을 면역세포 내에 작용할 수 있도록 전달할 수 있다. 또한, 바이러스성 벡터를 통해서만 면역세포에 유전자를 전달할 수 있었던 종래의 기술들과는 달리, 본 발명에 따른 조성물은 비바이러스성 벡터를 통해서도 면역세포에 유전자를 전달할 수 있다는 점에서 약물 전달체계(drug delivery system)의 발전에 획기적인 계기가 될 수 있다.
본 발명에서 목적 물질은 앞서 언급한 바와 같이, 상기 폴리펩타이드에 담지되어 세포 내로 전달됨으로써 생체 내의 모든 생리 현상을 조절하는 생물학적 활성을 갖는 기능조절 물질로서, 세포 내로 전달하고자 하는 모든 물질을 의미한다.
상기 약물은 화합물 약물, 바이오 약물, 핵산 약물, 펩타이드 약물, 단백질 약물, 호르몬(hormone), 조영제(contrast agent) 및 항체(antibody)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게, 핵산 약물은 DNA, 재조합 DNA, 플라스미드 DNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앱타머, RNA, siRNA, shRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약물은 핵산 약물 또는 항체일 수 있다.
구체적으로 일반적인 경로를 통해서는 세포 내로 이동이 용이하지 않거나, 세포 내 이동이 용이하더라도 특이적 전달 효율이 낮은 물질일 수 있다. 보다 구체적으로 대부분의 세포에서 전달이 용이하지 않은 항체이거나, 면역세포, 줄기세포 또는 신경세포에서 전달이 어려운 플라스미드, mRNA, siRNA 등의 유전 물질일 수 있다.
생체 내에서 세포에 목적 물질(바람직하게 약물)을 세포내 전달하는 방법에 적용될 수 있다. 이러한 방법은 비경구 투여 또는 조직, 기관, 또는 시스템으로의 직접 주입에 의해 달성될 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 조성물은 포유류, 바람직하게는 인간에게 사용될 수 있으며 예컨대 정맥내 (intravein), 복막내 (intraperitoneal), 근육내 (intramuscular), 피하내 (subcutaneous), 피내 (intradermal), 비내 (nasal), 점막내 (mucosal), 흡입 (inhalation) 및 경구 (oral) 등의 경로로 투여하여 세포 내에 목적 물질을 전달할 수 있다.
본 발명에서 용어, "치료"는 질병 또는 질환의 억제, 경감을 의미한다. 따라서, 본 발명에서 용어 "치료학적 유효량"은 상기 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 조성물은 적절한 형태로 제제화되어 제공될 수 있다. 상기 제제는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연고제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
또한, 상기 제제는 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 제제는 상기 조성물(유효성분)에 추가하여 이를 제형화하기 위한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 결합제, 활탁제, 현탁용제, 가용화제, 완충제, 보존제, 윤활제, 등장제, 부형제, 안정화제, 분산제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있다.
상기 조성물은 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행(standard phamaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 담체와 혼합되어 투여될 수 있다.
예를 들면, 상기 제제를 비경구용으로 제공하는 경우, 일 예로 액제, 겔(gel)제, 세정 조성물, 삽입용 정제, 좌제 형태, 크림, 연고, 드레싱 용액, 분무제, 기타 도포제등의 국소 투여제, 용액형, 현탁형, 유제형 등의 액상제형일 수 있으며, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 크림, 연고, 젤리, 거품, 세척제 또는 삽입물, 바람직하게는 액제, 겔(gel)제, 세정 조성물, 삽입용 정제 등의 피부 외용제가 포함될 수 있다. 상기 제형은 일 예로 멸균수에 용해보조제, 유화제, pH 조절을 위한 완충제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 상기 비수성용제 또는 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 제제를 경구용으로 제공하는 경우, 일 예로 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강 내 또는 혀 밑 투여될 수 있다.
상기 제제의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 0.001 내지 10000 ㎎/kg, 0.01 내지 10000 ㎎/kg, 0.1 내지 10000 ㎎/kg, 0.5 내지 10000 ㎎/kg, 0.001 내지 1000 ㎎/kg, 0.01 내지 1000 ㎎/kg, 0.1 내지 1000 ㎎/kg, 0.5 내지 1000 ㎎/kg, 0.001 내지 500 ㎎/kg, 0.01 내지 500 ㎎/kg, 0.1 내지 500 ㎎/kg, 0.5 내지 500 ㎎/kg, 0.001 내지 300 ㎎/kg, 0.01 내지 300 ㎎/kg, 0.1 내지 300 ㎎/kg, 또는 0.5 내지 300 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다.
상기 조성물의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 발생할 수 있으므로, 상기 범위로 하는 것이 좋다.
상기 조성물의 투여 대상은 인간 등의 포유류, 포유류로부터 분리된 세포, 조직, 체액, 또는 이들의 배양물일 수 있다.
본 발명은 또한 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드; 및 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 분자, 또는 핵산 분자를 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 제조하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
보다 구체적으로, 본원에 기술된 키메라 항원 수용체(CAR)는, 바람직하게는 이것이 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산된다고 해도, 당해 분야에 공지된 어떠한 수단에 의해서도 생산될 수 있다. 키메라 수용체의 수개의 영역을 암호화하는 핵산을 제조하고 편리하게는, 당해 분야에 공지된 분자 클로닝의 표준 기술(게놈 라이브러리 스크리닝, PCR, 프라이머-보조된 연결, 부위-지시된 돌연변이 유발 등)에 의해 완전한 암호화 서열 내로 조립할 수 있다. 수득되는 암호화 영역은 바람직하게는 발현 벡터 내로 삽입되고 적합한 발현 숙주 세포주, 면역세포주, 바람직하게는 T 림프구 세포주, 및 가장 바람직하게는 자가 T 림프구 세포주를 형질전환하는 데 사용된다.
상기 핵산 작제물은 상기 기술된 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
상기 핵산 분자는 변형되지 않거나, 변형된, RNA 또는 DNA일 수 있는, 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 핵산 분자는 단일- 및/또는 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥 또는, 보다 전형적으로 이중-가닥 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함할 수 있다. 또한, 핵산 분자는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는 삼중-가닥 영역을 포함할 수 있다. 핵산 분자는 또한 하나 이상의 변형된 염기 또는 안정성 또는 다른 이류로 변형된 DNA 또는 RNA 골격을 포함할 수 있다. 다양한 변형이 DNA 및 RNA에 대해 이루어질 수 있으므로; 용어 "핵산 분자"는 화학적으로, 효소적으로, 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다.
핵산 작제물은 다음 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있음이 이해되어야 한다: 하나 이상의 숙주에 대한 복제 오리진; 하나 이상의 숙주 내에서 활성인 선택가능한 마커 유전자; 및/또는 하나 이상의 전사 제어 서열, 여기서 핵산 분자의 발현은 전사 제어 서열의 제어 하에 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "선택가능한 마커 유전자"는 이것이 발현되는 세포에 표현형을 부여함으로써, 작제물로 형질감염 또는 형질주입되는, 세포의 확인 및/또는 선택을 용이하게 하는 임의의 유전자를 포함한다. "선택가능한 마커 유전자"는 작제물로 형질주입된 세포의 의해 발현된 경우, 이러한 형질주입된 세포의 확인 및 /또는 선택을 용이하게 하는 세포에 표현형을 부여하는 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 적합한 선택가능한 마커를 암호화하는 광범위한 뉴클레오타이드 서열이 당해 분야에 공지되어 있다. 선택가능한 마커를 암호화하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 다음을 포함한다: 형광성-활성화된 세포 분류(Fluorescence-Activated Cell Sorting; FACS)와 같은 기술을 사용하여 세포의 최적 선택을 허용하는 다른 것들 중에서 아데노신 데아미나제(ADA) 유전자; 사이토신 데아미나제(CDA) 유전자; 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자; 히스티딘올데하이드로게나제(hisD) 유전자; 푸로마이신-N-아세틸 트랜스퍼라제(PAC) 유전자; 티미딘 키나제(TK) 유전자; 크산틴-구아닌 포스포리보 실트랜스퍼라제(XGPRT) 유전자 또는 항생제 내성 유전자, 예를 들면, 암피실린-내성 유전자, 푸로마이신-내성 유전자, 블레오마이신-내성 유전자, 하이드로마이신-내성 유전자, 가나마이신-내성 유전자 및 암피실린-내성 유전자; 형광성 리포터 유전자, 예를 들면, 녹색, 적색, 황색 또는 청색 형광성 단백질-암호화 유전자; 및 발광성-기반 리포터 유전자, 예를 들면, 루시퍼라제 유전자.
상기 제시된 바와 같이, 핵산 작제물은 또한 하나 이상의 전사 제어 서열을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "전사 제어 서열"은 작동가능하게 연결된 핵산의 전사에 영향을 미치는 임의의 핵산 서열을 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 상기 전사 제어 서열은 예를 들면, 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로모터, 인핸서 또는 상부 활성화 서열, 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
전형적으로, 전사 제어 서열은 적어도 프로모터를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 세포 내에서 핵산의 발현을 부여하거나, 활성화시키거나 향상시키는 임의의 핵산을 기술한다. 전사 제어 서열은 전사 제어 서열이 핵산 분자의 전사를 촉진, 억제 또는 달리 조 정할 수 있는 경우 주어진 핵산 분자에 "작동가능하게 연결된" 것으로 고려된다.
핵산 분자는 전사 제어 서열, 예를 들면, 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 프로모터는 작동가능하게 연결된 핵산 분자의 발현을 구성적으로, 또는 발현이 일어나는 세포, 조직, 또는 기관 과 관련하여, 차등적으로 조절할 수 있다. 따라서, 프로모터는 예를 들면, 구성적 프로모터, 또는 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. "구성적 프로모터"는 대부분의 환경적 및 생리학적 상태 하에 활성인 프로모터이다. "유도성 프로모터"는 특정의 환경 또는 생리 조건 하에서 활성인 프로모터이다. 본 발명은 목적한 세포 내에서 활성인 임의의 프로모터의 사용을 고려한다. 따라서, 프로모터의 광범위한 배열이 당업자에 의해 용이하게 추정될 수 있다. 포유동물 구성적 프로모터는 시미안 바이러스(Simian virus) 40(SV40), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus; CMV), P-앤틴, 유비퀴틴 C(UBC), 신장 인자(elongation factor)-1 알파(E3A), 포스포글리세 레이트 키나제(PGK) 및 CMV 얼리 인핸서/닭 β액틴(chicken βactin; CAGG)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 유도성 제어 서열은 또한 터미네이터를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "터미네이터"는 전사의 종결을 신호하는 전사 단위의 끝의 DNA 서열을 지칭한다. 터미네이터는 폴리아데닐화 신호를 일반적으로 함유하는 3'- 비-해독된 DNA 서열이고, 이는 1차 전사체의 3'-말단에 폴리아데닐레이트 서열의 첨가를 촉진시킨다. 프로모터 서열을 사용하므로, 터미네이터는 이것이 사용되도록 의도된 세포, 조직 또는 기관 내에서 작동가능한 임의의 터미네이터 서열일 수 있다. 적합한 터미네이터는 당업자에게 공지될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 작제물은 추가의 서열, 예를 들면, 향상된 발현, 세포질성 또는 막 수송(transportation), 및 위치 신호(location signal)를 허용하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 필수적으로 본원에 기술된 바와 같은 모든 유전 작제물로 연장된다. 이러한 작제물은 진핵 세포 내에서 유전 작제물의 유지 및/또는 복제 및/또는 유전 작제물 또는 이의 부분의 진핵 세포 게놈 내로의 통합을 위해 의도된 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 핵산 작제물은 임의의 적합한 형태, 예를 들면, 플라스미드, 파아지, 트랜스포손(transposon), 코스미드(cosmid), 염색체, 벡터 등일 수 있고, 이는 적절한 제어 성분과 연합되는 경우 복제될 수 있고 세포 사이에서, 작제물 내에 함유된 유전자 서열을 전달할 수 있다.
적어도 일부 실시양태에서, 본 발명은 유전적으로 변형된 세포를 제조하는데 사용하기 위한, 상기 기술된 CAR을 암호화하는, 핵산 분자, 또는 핵산 작제물을 제공한다.
또한, 적어도 일부 실시양태에서, 본 발명은 세포의 형질전환, 형질감염 또는 형질주입을 위한 벡터의 제조시 핵산 분자의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 세포는 CD3, CD4 또는 CD8 중 하나 이상을 발현하는 T 세포이다. 유전적 변형에 적합한 세포는 이종 또는 자가일 수 있다.
상기 언급된 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 분자, 또는 핵산 분자를 포함하는 핵산 작제물은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 통해 세포 내로 주입될 수 있다. 이러한 세포 내 도입은 알려진 세포 내 형질주입 방법과 대비하여 더 높은 효율로 세포 내 형질주입을 달성할 수 있다는 점에서 우수한 치료 효능을 나타내는 CAR로 형질전환된 세포를 제공할 수 있다.
이에 본 발명은, 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드; 및 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 분자, 또는 핵산 분자를 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
보다 구체적으로, 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드; 및 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 분자, 또는 핵산 분자를 포함하는 핵산 작제물로 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
즉, 암을 방지 또는 치료하기 위한 상기 기술된 바와 같은 유전적으로 변형된 세포의 용도를 제공한다. 따라서, 본 발명은 암을 가진 환자를 방지 또는 치료하는 방법을 제공하고, 이러한 방법은 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 환자에게 노출시키는 단계를 포함한다.
여기서 세포는 바람직하게 T 세포, 또는 NK 세포일 수 있다. 보다 바람직하게 세포는 CD3, CD4 또는 CD8 중 하나 이상을 발현하는 T 세포이다.
상기 암은 방광 암(bladder cancer), 뇌 암(brain cancer), 유방 암, 자궁경부 암(cervical cancer), 결장 암, 자궁내막 암(endometrial cancer), 상피 암(epithelial cancer), 식도 암(oesophageal cancer), 폐 암, 구강 암(mouth cancer), 난소 암(ovarian cancer), 신장 암 (kidney cancer), 간 암(liver cancer), 백혈병(leukaemia), 림프종, 골수종(myeloma), 췌장 암, 전립선 암 (prostate cancer), 직장 암(rectal cancer), 피부 암(skin cancer), 위장 암(stomach cancer), 고환 암 (testicular cancer), 갑상선 암(thyroid cancer) 및 혀 암(tongue cancer)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상 일 수 있다.
상기 치료용 조성물은 주당 약 1회 내지 약 5회 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2회 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 3회 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 4회 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 5 x 108 개의 세포를 포함한다.
본 발명의 일시양태에 따르면, 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 CAR DNA 플라스미드를 담지하여 CAR-T세포를 제조하고 이의 암에 대한 치료 효능을 확인하였다. 이러한 CAR-T의 경우 일반적으로 형질전환 효율이 좋지 못하다. 그러나, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 전달 시스템으로 사용하는 경우 플라스미드 DNA에 대한 높은 전달 효능을 나타냄으로써 우수한 치료 효능을 가지는 CAR-T를 대량 생산할 수 있다.
본 발명은 상기 조성물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 질병 또는 장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 조성물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포 내로의 목적 물질 전달 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폴리펩타이드를 대상체에 처리하는 단계를 포함하는 세포 내로의 목적 물질 전달 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 조성물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포 내로의 목적 물질의 선택적 전달 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 조성물을 대상체에 처리하는 단계를 포함하는 세포 내로의 목적 물질의 선택적 전달 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 질병 또는 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 목적 물질을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 세포 내로 목적 물질을 전달하기 위한 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 세포 내로 목적 물질을 전달하기 위한 제제의 제조에 있어 폴리펩타이드의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 언급된 조성물들의 용도 및 활용 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 세포 내 형질주입을 위한 신규한 펩타이드 조성물은 목적 물질에 대한 형질주입의 효능을 크게 향상시켰으며 세포독성도 현저하게 낮은 장점을 가진다. 이를 통해 다양한 물질들을 세포 내로 수송할 수 있다는 점에서 다양한 활용 가치를 지닌다.
도 1은 다양한 종류의 소수성 아미노산을 포함하는 펩타이드(Peptide 1 내지 10)에 대하여 Jurkat T 세포로의 플라스미드 DNA 전달 효율을 확인한 도이다.
도 2는 서로 다른 길이의 Leucine의 길이로 10개, 또는 11개의 류신을 가지는 펩타이드(Peptide 1 및 11)에 대하여 Jurkat T 세포로의 플라스미드 DNA 전달 효율을 확인한 도이다.
도 3은 NLS의 copy수를 2개, 3개 혹은 4개로 다르게 하여 제조한 펩타이드(Peptide 1, 12 및 13)에 대하여 Jurkat T 세포로의 플라스미드 DNA 전달 효율을 확인한 도이다.
도 4는 NLS의 위치를 C 말단 또는 N 말단으로 설정한 펩타이드(Peptide 1 및 14)에 대하여 Jurkat T 세포로의 플라스미드 DNA 전달 효율을 확인한 도이다.
도 5는 L10-2xNLS 농도에 따른 GFP의 발현 변화를 면역블로팅(immunoblotting)을 통해 확인한 도이다.
도 6은 pEGFP-N3의 농도에 따른 GFP의 발현 변화를 면역블로팅(immunoblotting)을 통해 확인한 도이다.
도 7은 L10-2xNLS 및 pEGFP-N3를 혼합하는 온도에 따른 GFP의 발현 변화를 면역블로팅(immunoblotting)을 통해 확인한 도이다.
도 8은 L10-2xNLS 및 pEGFP-N3를 혼합하는 시간에 따른 GFP의 발현 변화를 면역블로팅(immunoblotting)을 통해 확인한 도이다.
도 9는 L10-2xNLS 및 pEGFP-N3를 혼합하는 버퍼 종류에 따른 GFP의 발현 변화를 면역블로팅(immunoblotting)을 통해 확인한 도이다.
도 10은 형질주입 시간(incubation time of transfection)에 따른 GFP의 발현 변화를 면역블로팅(immunoblotting)을 통해 확인한 도이다.
도 11은 L10-2xNLS 및 플라스미드 DNA 복합체의 크기를 확인한 도이다.
도 12는 L10-2xNLS 및 플라스미드 DNA 복합체의 제타 전위를 확인한 도이다.
도 13은 L10-2xNLS 및 플라스미드 DNA 복합체의 모양을 투과전자현미경(TEM)을 통해 확인한 도이다.
도 14는 L10-2xNLS를 이용하여 플라스미드 DNA를 형질주입한 후 나타나는 Jurkat T 세포의 모양 변화를 확인한 도이다.
도 15는 L10-2xNLS를 이용하여 플라스미드 DNA를 형질주입한 후 나타나는 Jurkat T 세포의 생존율 변화를 확인한 도이다.
도 16은 L10-2xNLS를 이용한 Jurkat T 세포 내로의 플라스미드 DNA 전달 효율을 확인한 도이다.
도 17은 L10-2xNLS를 이용하여 전달된 플라스미드 DNA의 Jurkat T 세포 내 위치를 확인한 도이다.
도 18은 L10-2xNLS를 이용하여 전달된 플라스미드 DNA의 Jurkat T 세포 내 위치를 정량화하여 나타낸 도이다.
도 19는 L10-2xNLS를 이용한 human primary T 세포로의 유전자 전달 효과를 확인한 도이다.
도 20은 L10-2xNLS를 이용하여 제조된 CAR-T의 활성 효능을 확인한 도이다.
도 21은 L10-2xNLS를 이용하여 Jurkat T 세포로의 항체 전달 효과를 확인한 도이다.
도 22는 L10-2xNLS를 이용하여 Jurkat T 세포 내 항체 존재 여부를 확인한 도이다.
도 2는 서로 다른 길이의 Leucine의 길이로 10개, 또는 11개의 류신을 가지는 펩타이드(Peptide 1 및 11)에 대하여 Jurkat T 세포로의 플라스미드 DNA 전달 효율을 확인한 도이다.
도 3은 NLS의 copy수를 2개, 3개 혹은 4개로 다르게 하여 제조한 펩타이드(Peptide 1, 12 및 13)에 대하여 Jurkat T 세포로의 플라스미드 DNA 전달 효율을 확인한 도이다.
도 4는 NLS의 위치를 C 말단 또는 N 말단으로 설정한 펩타이드(Peptide 1 및 14)에 대하여 Jurkat T 세포로의 플라스미드 DNA 전달 효율을 확인한 도이다.
도 5는 L10-2xNLS 농도에 따른 GFP의 발현 변화를 면역블로팅(immunoblotting)을 통해 확인한 도이다.
도 6은 pEGFP-N3의 농도에 따른 GFP의 발현 변화를 면역블로팅(immunoblotting)을 통해 확인한 도이다.
도 7은 L10-2xNLS 및 pEGFP-N3를 혼합하는 온도에 따른 GFP의 발현 변화를 면역블로팅(immunoblotting)을 통해 확인한 도이다.
도 8은 L10-2xNLS 및 pEGFP-N3를 혼합하는 시간에 따른 GFP의 발현 변화를 면역블로팅(immunoblotting)을 통해 확인한 도이다.
도 9는 L10-2xNLS 및 pEGFP-N3를 혼합하는 버퍼 종류에 따른 GFP의 발현 변화를 면역블로팅(immunoblotting)을 통해 확인한 도이다.
도 10은 형질주입 시간(incubation time of transfection)에 따른 GFP의 발현 변화를 면역블로팅(immunoblotting)을 통해 확인한 도이다.
도 11은 L10-2xNLS 및 플라스미드 DNA 복합체의 크기를 확인한 도이다.
도 12는 L10-2xNLS 및 플라스미드 DNA 복합체의 제타 전위를 확인한 도이다.
도 13은 L10-2xNLS 및 플라스미드 DNA 복합체의 모양을 투과전자현미경(TEM)을 통해 확인한 도이다.
도 14는 L10-2xNLS를 이용하여 플라스미드 DNA를 형질주입한 후 나타나는 Jurkat T 세포의 모양 변화를 확인한 도이다.
도 15는 L10-2xNLS를 이용하여 플라스미드 DNA를 형질주입한 후 나타나는 Jurkat T 세포의 생존율 변화를 확인한 도이다.
도 16은 L10-2xNLS를 이용한 Jurkat T 세포 내로의 플라스미드 DNA 전달 효율을 확인한 도이다.
도 17은 L10-2xNLS를 이용하여 전달된 플라스미드 DNA의 Jurkat T 세포 내 위치를 확인한 도이다.
도 18은 L10-2xNLS를 이용하여 전달된 플라스미드 DNA의 Jurkat T 세포 내 위치를 정량화하여 나타낸 도이다.
도 19는 L10-2xNLS를 이용한 human primary T 세포로의 유전자 전달 효과를 확인한 도이다.
도 20은 L10-2xNLS를 이용하여 제조된 CAR-T의 활성 효능을 확인한 도이다.
도 21은 L10-2xNLS를 이용하여 Jurkat T 세포로의 항체 전달 효과를 확인한 도이다.
도 22는 L10-2xNLS를 이용하여 Jurkat T 세포 내 항체 존재 여부를 확인한 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 플라스미드 DNA 전달에 최적화된 펩타이드의 아미노산 서열
1-1. 소수성 아미노산 종류에 따른 플라스미드 DNA 전달 효과
Leucine(L), Phenylalanine(F), Methionine(M), Valine(V), Glycine(G), Proline(P), Alanine(A), Tyrosine(Y), Isoleucine(I) 및/또는 Tryptophan(W)으로 연결된 서열에 대하여 nucleus localization sequence(NLS, PKKKRKV)의 2 copy 서열(2xNLS)로 구성된 펩타이드를 접합하여 제조하였다.
이들의 구체적인 서열을 하기의 표 2에 나타내었다(Peptide 1 내지 10). 상기 각 펩타이드를 4μM의 농도로 pEGFP-N3 플라스미드 2μg과 30분동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 혼합하였다. 상기 플라스미드를 Jurkat T 세포에 30분간 형질주입(transfection)한 후 24시간이 경과하였을 때 면역블로팅(immunoblotting) 기법을 이용하여 GFP의 발현을 분석하였다(도 1).
그 결과, Leucine으로 구성된 L10-2xNLS 펩타이드가 GFP 발현이 가장 높은 것으로 확인되었다. 특히, 이러한 형질주입은 일반적으로 형질주입에 사용되는 lipofectamine®과 대비하여 월등히 높은 수준으로 나타났다.
1-2. Leucine 아미노산 길이에 따른 플라스미드 DNA 전달 효과
10 또는 11개의 Leucine 아미노산 및 2xNLS가 연결된 펩타이드를 제조하고 (Peptide 1, 11) 이를 기반으로 투과 수준에 Leucine 아미노산의 개수가 미치는 영향을 추가적으로 확인하였다. 상기 각 펩타이드에 대하여 실시예 1-1과 동일하게 실험을 시행한 후 면역블로팅(immunoblotting) 기법을 통해 GFP의 발현을 분석하였다(도 2).
그 결과, Leucine의 길이가 10개일 때 가장 높은 효율이 나타남을 확인하였고, 11개에서도 일정 수준 이상 높은 효율이 유지되는 것을 확인하였다.
1-3. NLS의 copy수 및 N 말단/C 말단 위치에 따른 플라스미드 DNA 전달 효과
10개의 Leucine 아미노산 서열 뒤에 위치한 NLS의 copy수를 2, 3 또는 4로 다르게 하여 펩타이드를 제조하고, 이들의 구체적인 서열을 하기의 표 2에 나타내었다(Peptide 1, 12 및 13). 각 펩타이드에 대하여 면역블로팅(immunoblotting) 기법을 통해 NLS의 copy수에 따른 GFP의 발현 변화를 확인하였다(도 3).
그 결과, L10-2xNLS를 이용하여 pEGFP-N3를 Jurkat T 세포에 형질주입하였을 때 GFP가 가장 높게 발현되었다. 또한, NLS 서열이 3개 및 4개로 늘어나도 일정 수준 이상 발현 수준이 유지되는 것을 확인하였다.
이에, NLS의 copy수를 2로 설정하고 상기 NLS 아미노산 서열을 Leucine의 뒤쪽인 C 말단에 위치시킨 펩타이드(L10-2xNLS), 및 Leucine의 앞쪽인 N 말단에 위치시킨 펩타이드(2xNLS-L10)를 제조하였다. 상기 각 펩타이드(Peptide 1 및 14)를 pEGFP-N3와 혼합하여 Jurkat T 세포에 형질주입하고 GFP의 발현 변화를 비교하였다. 이의 형질전환 효율을 확인한 결과, NLS 아미노산 서열을 Leucine의 뒤쪽인 C 말단에 위치시킨 펩타이드(L10-2xNLS) 경우에 높은 효율을 나타내는 것을 확인하였다(도 4).
즉, Jurkat T 세포로의 플라스미드 DNA 전달에 최적화된 펩타이드는 10개 내외의 Leucine 아미노산 서열을 포함하고, NLS의 2~4 copy 수준에서 일정 수준 이상의 형질주입 효능을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 상기 Leucine의 C 말단에 위치한 L10-2xNLS이 Jurkat T 세포로의 플라스미드 DNA 전달에 최적화된 펩타이드의 아미노산 서열을 포함하고 있음을 확인하였다.
실시예 1에 사용된 Peptide 1 내지 14의 구체적인 서열은 하기의 표 2에 정리하였으며, 각 펩타이드는 펩타이드의 안정성 및 생체활성 증가를 위하여 N 말단 아세틸화(N' acetylation) 또는 C 말단 아미드화(C' amidation)에 의하여 변형된 것을 사용하였다.
| Peptide | Name | Sequence | Modifications |
| 1 | L 10 -2xNLS | N’-LLLLLLLLLLPKKKRKVPKKKRKV-C’(서열번호 7) | N’ acetylation /C’ amidation |
| 2 | F 10 -2xNLS | N’-FFFFFFFFFFPKKKRKVPKKKRKV-C’(서열번호 17) | N’ acetylation /C’ amidation |
| 3 | M 10 -2xNLS | N’-MMMMMMMMMMPKKKRKVPKKKRKV-C’(서열번호 18) | N’ acetylation /C’ amidation |
| 4 | V 10 -2xNLS | N’-VVVVVVVVVVPKKKRKVPKKKRKV-C’(서열번호 19) | N’ acetylation /C’ amidation |
| 5 | G 10 -2xNLS | N’-GGGGGGGGGGPKKKRKVPKKKRKV-C’(서열번호 20) | N’ acetylation /C’ amidation |
| 6 | P 10 -2xNLS | N’-PPPPPPPPPPPKKKRKVPKKKRKV-C’(서열번호 21) | N’ acetylation /C’ amidation |
| 7 | A 10 -2xNLS | N’-AAAAAAAAAAPKKKRKVPKKKRKV-C’(서열번호 22) | N’ acetylation /C’ amidation |
| 8 | Y 10 -2xNLS | N’-YYYYYYYYYYPKKKRKVPKKKRKV-C’(서열번호 23) | N’ acetylation /C’ amidation |
| 9 | I 8 L 2 -2xNLS | N’-IIIILIIIILPKKKRKVPKKKRKV-C’(서열번호 24) | N’ acetylation /C’ amidation |
| 10 | W 8 L 2 -2xNLS | N’-WWWWLWWWWLPKKKRKVPKKKRKV-C’(서열번호 25) | N’ acetylation /C’ amidation |
| 11 | L 11 -2xNLS | N’-LLLLLLLLLLLPKKKRKVPKKKRKV-C’(서열번호 11) | N’ acetylation /C’ amidation |
| 12 | L 10 -3xNLS | N’-LLLLLLLLLLPKKKRKVPKKKRKVPKKKRKV-C’(서열번호 8) | N’ acetylation /C’ amidation |
| 13 | L 10 -4xNLS | N’-LLLLLLLLLLPKKKRKVPKKKRKVPKKKRKV PKKKRKV-C’(서열번호 9) |
N’ acetylation /C’ amidation |
| 14 | 2xNLS-L 10 | N’-PKKKRKVPKKKRKVLLLLLLLLLL-C’(서열번호 26) | N’ acetylation /C’ amidation |
실시예 2. 플라스미드 DNA을 세포 내 형질주입하는 방법의 최적화된 조건
2-1. L
10
-2xNLS 및 pEGFP-N3의 농도에 따른 플라스미드 DNA 전달 효과
L10-2xNLS을 각기 다른 농도(2, 3, 4, 5 또는 6μM)로 하여 2μg의 pEGFP-N3와 혼합하고 Jurkat T 세포에 형질주입하였다. 이후 GFP의 발현을 면역블로팅(immunoblotting) 기법을 이용하여 확인하였다(도 5).
그 결과, L10-2xNLS의 농도가 4μM일 때 GFP가 가장 높은 발현 효율을 나타냄을 알 수 있었다.
다음으로, pEGFP-N3를 각기 다른 농도(0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 5 또는 6μg)로 하여 4μM의 L10-2xNLS와 혼합하고 Jurkat T 세포에 형질주입하였다. 이후 GFP의 발현을 면역블로팅(immunoblotting) 기법을 이용하여 확인하였다(도 6).
그 결과, pEGFP-N3가 2μg일 때 GFP의 발현 효율이 가장 높게 나타났다.
위 목적하는 형질전환 주입의 농도 범위를 고려하여 이하 실험을 수행하였다.
2-2. L
10
-2xNLS 및 pEGFP-N3의 혼합 조건에 따른 플라스미드 DNA 전달 효과
플라스미드 DNA 전달에 가장 효과적인 혼합 조건을 알아내기 위하여, 4μM의 L10-2xNLS 및 2μg의 pEGFP-N3를 혼합하는 온도, 시간 및 혼합에 사용하는 버퍼를 다르게 설정하여 각 조건에서의 유전자 전달 효과를 비교하였다.
우선, 4, 16, 25, 37 또는 42℃에서 4μM의 L10-2xNLS 및 2μg의 pEGFP-N3을 30분간 혼합하고 Jurkat T 세포에 30분 동안 형질주입하였다. 24시간이 지난 후 면역블로팅(immunoblotting) 기법을 이용하여 GFP의 발현 변화를 분석한 결과, 혼합 시의 온도가 37℃일 때 GFP가 가장 높게 발현하였다(도 7). 이는 통상적인 세포 배양 조건이나 인체 적용을 위한 적합한 온도 조건에서 본 발명의 시스템이 잘 작동하는 것에 대한 결과를 나타낸다.
이에, 온도를 37℃로 설정하고 4μM의 L10-2xNLS 및 2μg의 pEGFP-N3을 각기 다른 시간(10, 20, 30, 40, 50 또는 60분) 동안 혼합하였다. 이후 상기와 동일한 방법으로 GFP의 발현 변화를 분석한 결과, 혼합하는 시간이 30분일 때의 GFP가 가장 높은 발현 수준을 보였다(도 8). 이는 목적하는 형질주입이 빠른 시간 내에 진행될 수 있음에 대한 장점을 보여준다.
마지막으로, 혼합에 사용하는 버퍼를 각각 Opti-MEM, DPBS, 또는 Serum free RPMI-1640(SF) 로 하여 4μM의 L10-2xNLS와 2μg의 pEGFP-N3을 혼합하였다. 이후 상기와 동일한 방법으로 GFP의 발현 변화를 분석한 결과, 다양한 배지 조건 하에서 형질주입 수준이 유지되는 결과를 확인하였다. 이를 통해 다양한 배지 조건 하에 본 발명의 시스템을 적용하여 사용할 수 있음을 확인하였다(도 9).
위 최적화된 온도, 시간 및 배지 조건 등을 고려하여 이하 후속 실험을 수행하였다.
2-3. 형질주입 시간에 따른 플라스미드 DNA 전달 효과
상기 최적화된 조건에 따라 4μM의 L10-2xNLS 및 2μg의 pEGFP-N3을 혼합한 후, Jurkat T 세포에 0.5, 1, 2, 3, 4 또는 5시간 동안 형질주입하여 각 시간에 따른 GFP 발현 변화를 비교하였다(도 10).
그 결과, 0.5 또는 1시간 동안 형질주입하여도 플라스미드 DNA를 전달하는 데 충분함을 확인하였다.
실시예 3. L
10
-2xNLS 및 플라스미드 DNA 복합체의 물리화학적 특징
입자 크기를 측정하는 입도분석기 Zetasizer(Malvern Panalytical)를 이용하여 L10-2xNLS만 섞은 혼합물(L10-2xNLS only)과 L10-2xNLS 및 pEGFP-N3을 섞은 혼합물(L10-2xNLS + pEGFP 2μg)의 크기 및 제타 전위를 분석하였다(도 11 및 12).
그 결과, L10-2xNLS 및 플라스미드 DNA 복합체의 크기는 대략 100nm 정도였으며, 제타 전위는 L10-2xNLS의 농도에 따라 +2~+6 mV의 양전하를 띄고 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM)을 이용하여 L10-2xNLS 및 플라스미드 DNA 복합체의 모양을 분석하였다(도 13). 그 결과, 상기 복합체는 도 13에 나타낸 바와 같이 60~100nm 크기의 타원형 형태로 확인되었다.
이를 통해 L10-2xNLS 및 플라스미드 DNA가 나노 사이즈의 복합체를 형성할 수 있음을 확인하였다. 또한 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 구체를 형성하여 구체 내 핵산을 담지시켜 전달 물질로 작용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. L
10
-2xNLS를 이용한 형질주입이 세포에 미치는 영향
4.1. Jurkat T 세포의 손상 및 사멸 여부
4μM의 L10-2xNLS 및 2μg의 pEGFP-N3을 혼합하여 Jurkat T 세포에 형질주입하고 24시간이 지난 후 세포 모양의 변화를 확인하였다(도 14). 또한, MTT assay를 이용하여 형질주입 이후의 세포 생존율을 분석하였다(도 15).
그 결과, L10-2xNLS를 이용하여 Jurkat T 세포에 형질주입을 하였을 때 세포가 손상되거나 사멸하지 않음을 확인하였다.
4.2. Jurkat T 세포로의 전달 효율 및 위치 분석
형광 물질(fluorescein)이 표지된 플라스미드 DNA(Takara) 2μg을 L10-2xNLS 4μM과 혼합하여 0.5, 1, 2, 3, 4 또는 5시간 동안 Jurkat T 세포에 형질주입하였다. 이후 Novocyte FACS(Agilent)를 이용하여 상기 플라스미드 DNA의 Jurkat T 세포 내로의 전달 효율을 분석하였다(도 16).
그 결과, lipofectamine의 경우에는 5시간이 지나도 15% 정도의 효율밖에 보이지 못한 반면, L10-2xNLS는 0.5시간이 경과하였을 때도 약 90%의 효율로 대부분의 세포에 플라스미드 DNA를 전달하였다.
다음으로, 형광 물질(fluorescein)이 표지된 플라스미드 DNA 및 L10-2xNLS을 혼합하여 Jurkat T 세포에 형질주입하고, 핵을 염색하는 시약인 Hoechst 33342(ThermoFisher)을 처리하였다. 이후 형광 현미경(Leica)을 이용하여 상기 플라스미드 DNA의 Jurkat T 세포 내의 위치를 확인하였으며(도 17), 이를 정량화하여 그래프로 분석하였다(도 18). 그 결과, L10-2xNLS를 이용하여 형질주입 한 후 1시간이 경과하였을 때 대부분의 세포 내로 플라스미드 DNA가 전달되었으며, 4시간이 경과하였을 때 세포 내 핵에 플라스미드 DNA가 약 40%의 효율로 존재함을 확인하였다.
이를 통해 본 발명에 따른 형질주입 시스템을 이용하는 경우 기존에 일반적인 형질주입과 대비하여 세포 내로의 전달 효능을 크게 높일 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. L
10
-2xNLS를 이용한 플라스미드 DNA의 세포 내 전달 및 이의 효능
5-1. CAR-T의 혈액암 세포 사멸 효능
L10-2xNLS 4μM 및 FLAG가 태그된 CAR 플라스미드 DNA 2μg을 혼합하여 human primary T 세포에 형질주입하였다. 24시간이 지난 후 FLAG 항체를 이용하여 면역블로팅(immunoblotting)으로 상기 human primary CD8+ T 세포에서 CAR이 발현됨을 확인하였다(도 19).
상기와 같은 방법에 따라 제조된 CAR-T가 혈액암 세포를 사멸시킬 수 있는지 확인하기 위하여, CAR-T 세포 및 루시퍼라아제(luciferase)를 발현하는 혈액암 세포(Nalm6 세포)를 10:1의 비율로 하여 함께 배양하였다. 6시간 경과 후에 루시퍼라아제(luciferase)의 활성을 측정한 결과, CAR-T 세포가 혈액암 세포 사멸 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 20).
위 결과를 통해 본 발명에 따른 형질주입 시스템을 이용하는 경우 기존에 일반적인 형질주입과 대비하여 표적 특이적으로 치료 물질을 전달하여 세포 사멸 효능을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. L
10
-2xNLS를 이용한 항체 전달 효능 확인
전달을 목적하는 물질로써 핵산 뿐만 아니라 다른 항체 의약품의 전달 가능성을 확인하고자 L10-2xNLS과 혼합하여 항체를 처리하여 형질주입 수준의 변화를 확인하였다.
6-1. Jurkat T 세포로의 항체 전달 효율
형광 물질(FITC)이 표지된 IgG(Thermofisher) 1μg을 각기 다른 농도(0.5, 1, 2, 4 또는 6μM)의 L10-2xNLS와 혼합하였다. 각 혼합물을 Jurkat T 세포에 2시간 동안 처리한 후 Novocyte FACS(Agilent)를 이용하여 세포로의 항체 전달 효율을 확인하고(도 21), 형광 현미경(Leica)을 통해 해당 항체의 세포 내 존재 여부를 관찰하였다(도 22).
그 결과, L10-2xNLS의 농도가 4μM 농도 이상인 경우에 약 90%의 효율로 항체가 Jurkat T 세포 내로 전달되었다.
정리하자면, L10-2xNLS을 이용하여 세포 내로 플라스미드 DNA 또는 항체를 효과적으로 전달 가능함을 확인하였다.
이를 통해 다양한 세포들에 표적 특이적으로 목적하는 폴리뉴클레오티드, 항체 등을 전달할 수 있음을 확인하였고, 특히 CAR-T 세포와 같은 면역세포 치료제의 개발에 응용할 수 있음을 확인하였다.
Claims (21)
- 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신(Leucine); 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 서열번호 1의 펩타이드는 류신(Leucine)의 C 말단에 연결된 것인, 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 10개 또는 11개의 연속된 류신(Leucine); 및 이에 연결된 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 폴리펩타이드.
- 제4항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 7, 8, 11 또는 12인, 폴리펩타이드.
- 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신(Leucine) 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드; 및 목적 물질을 포함하는 세포 내 형질주입용 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 목적 물질은 화합물, 단백질, 또는 핵산인, 세포 내 형질주입용 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 단백질은 항체, 수용체와 결합할 수 있는 리간드 펩타이드, 단백질 약물, 세포 독성 폴리펩타이드, 세포독성 단백질 및 형광 단백질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 세포 내 형질주입용 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 핵산은 DNA, 재조합 DNA, 플라스미드 DNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앱타머, RNA, siRNA, shRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 세포 내 형질주입용 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 세포 내 형질주입용 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 막을 형성하여 외층을 구성하여 내부 구획을 가짐으로써 목적 물질을 담지하는 것인, 세포 내 형질주입용 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포, 일차 세포, 면역 세포, 암세포, 상피 세포, 피부 세포, 위장 세포, 점막 세포, 및 폐 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 세포 내 형질주입용 조성물.
- 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신(Leucine) 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드; 및 목적 물질을 포함하는 약물 전달용 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 약물은 화합물 약물, 바이오 약물, 핵산 약물, 펩타이드 약물, 단백질 약물, 호르몬(hormone), 조영제(contrast agent) 및 항체(antibody)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약물 전달용 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약물 전달용 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 막을 형성하여 외층을 구성하여 내부 구획을 가짐으로써 목적 물질을 담지하는 것인, 약물 전달용 조성물.
- 9개, 10개 또는 11개의 연속된 류신(Leucine) 및 이에 연결된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복된 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드; 및 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 분자, 또는 핵산 분자를 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 제조하는데 사용하기 위한 조성물.
- 제17항에 있어, 상기 세포는 면역 세포인, 조성물.
- 제17항 또는 제18항에 따라 유전적으로 변형된 세포.
- 제19항에 따른 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물.
- 제20항에 있어서, 상기 암은 방광 암(bladder cancer), 뇌 암(brain cancer), 유방 암, 자궁경부 암(cervical cancer), 결장 암, 자궁내막 암(endometrial cancer), 상피 암(epithelial cancer), 식도 암(oesophageal cancer), 폐 암, 구강 암(mouth cancer), 난소 암(ovarian cancer), 신장 암 (kidney cancer), 간 암(liver cancer), 백혈병(leukaemia), 림프종, 골수종(myeloma), 췌장 암, 전립선 암 (prostate cancer), 직장 암(rectal cancer), 피부 암(skin cancer), 위장 암(stomach cancer), 고환 암 (testicular cancer), 갑상선 암(thyroid cancer) 및 혀 암(tongue cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 암 예방 또는 치료용 조성물.
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