CN114081965B - 一种外泌体递送载体及其制备方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种外泌体递送载体及其制备方法、应用，涉及医疗领域。通过HSSP多肽修饰使得外泌体能靶向血红素加氧酶1(HMOX1)，而HMOX1蛋白高表达于多种肿瘤细胞和神经退行性疾病，尤其是耐药性胶质瘤，基于此，修饰有HSSP的外泌体能够特异性靶向肿瘤和神经退行性疾病，因此，本发明的外泌体递送载体也可应用于靶向治疗或预防肿瘤和/或神经退行性疾病，为胶质瘤药物TMZ耐药问题提供了新的解决方案。而外泌体本身又具有极低的免疫原性，提升了递送载体本身的安全性；同时，外泌体也具有良好的血脑屏障穿透能力，从而有利于破解药物在血脑屏障穿透难的难题。

Description

一种外泌体递送载体及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及医疗领域，具体而言，涉及一种外泌体递送载体及其制备方法、应用。
背景技术
胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是成年人最常见且最致命的原发性颅内恶性肿瘤。当前临床治疗方案为手术结合放化疗，总体上疗效不佳，患者的中位生存时间仅为14个月，并且复发几乎不可避免，因此GBM也是不可治愈的肿瘤之一。其中，复发的重要原因是GBM浸润性生长，手术不可能完全切除，并且极易产生耐药性。
而当前仅有的FDA批准的GBM口服治疗药物替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）临床治疗的最大障碍是GBM容易产生耐药性，进而导致无药可治。当前一些临床实验用药物和具有潜力的小分子、核酸、多肽药物在血脑屏障穿透和GBM靶向尚存在障碍，因此开发有效的递送载体提高药物血脑屏障穿透和肿瘤靶向是极为迫切的。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种外泌体递送载体及其制备方法、应用以解决上述技术问题。
目前，在胶质瘤治疗手段开发过程中有几大瓶颈：有效的药物血脑屏障穿透；特异性靶向肿瘤聚集；载体本身的安全性和免疫原性。
基于此，特提出了一种新的外泌体递送载体，可同时突破上述的血脑屏障、特异性靶向肿瘤以及安全性的瓶颈。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种外泌体递送载体，其包括外泌体以及在外泌体表面修饰的HSSP多肽，HSSP多肽能靶向血红素加氧酶1（HMOX1）。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述HSSP多肽通过接枝材料修饰于外泌体膜上；
在一种实施方式中，接枝材料与HSSP多肽共价连接，接枝材料与外泌体膜物理结合；
在一种实施方式中，接枝材料为DSPE-PEG-Mal，DSPE-PEG-Mal通过马来酰亚胺与HSSP多肽以硫醚键共价连接。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述外泌体的来源为外周血、腹水、尿液、唾液、脑脊液或干细胞、牛奶或植物。
在一种实施方式中，外泌体的来源为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、血清、胎盘、人内皮祖细胞、牙髓干细胞、人胎肝细胞、牛奶或植物。
在一种实施方式中，外泌体的平均粒径为50-200nm。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述外泌体内负载有药物或siRNA，药物为治疗或预防：肿瘤和/或神经退行性疾病的药物；siRNA为STAT3的siRNA。
在一种实施方式中，STAT3的siRNA的序列如SEQ ID NO.1-2所示；肿瘤包括如下肿瘤中的至少一种：胶质母细胞瘤、肺癌、脑胶质瘤、淋巴瘤、胃癌、食管癌、鼻咽癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌或白血病。
神经退行性疾病包括如下疾病中的至少一种：阿尔茨海默病、帕金森症、轻度认知障碍、亨廷顿症、朊病毒引起的疾病、额颞痴呆、路易体痴呆、血管性痴呆、肌萎缩性侧索硬化症、慢性损伤性脑病、进行性核上性麻痹、多系统萎缩症、皮质基底节变性、皮克氏病和橄榄体脑桥小脑萎缩。
在一种实施方式中，药物为替莫唑胺。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述外泌体中药物的载药量为1-70%，外泌体中siRNA的载药量为1-40%。
在一种实施方式中，外泌体中药物的载药量为20-60%，外泌体中siRNA的载药量为1-30%。
在一种实施方式中，当外泌体负载药物时，外泌体的浓度为10-1000 μg/mL；当外泌体负载siRNA时，外泌体的浓度为10-1000μg/mL。
本发明还提供了一种外泌体递送载体的制备方法，其包括将HSSP多肽修饰于外泌体表面。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述修饰是指：将HSSP多肽与接枝材料混合，制得配体，然后将配体与外泌体混合培养。
在一种实施方式中，在将配体与外泌体混合培养前，还包括将药物或siRNA与外泌体进行混合培养以使得外泌体负载药物或siRNA；
在一种实施方式中，配体制备时，HSSP多肽与接枝材料的混合摩尔比例为1:1-1.2，接枝材料为DSPE-PEG-Mal，将接枝材料和HSSP多肽混合溶解在二甲基亚砜中，除氧，混匀20-28h，透析。
在一种实施方式中，选择3000-3500道尔顿的透析袋进行透析20-28h。
优选地，每1mg的外泌体添加50-500µg 的所述配体。
本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述的外泌体递送载体和药学上可接受的添加剂或辅料。
在一种实施方式中，药物组合物的剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂、喷雾或针剂。
本发明还提供了一种外泌体递送载体或药物组合物在制备治疗或预防肿瘤和/或神经退行性疾病的药物中的应用，肿瘤包括如下肿瘤中的至少一种：胶质母细胞瘤、肺癌、脑胶质瘤、淋巴瘤、胃癌、食管癌、鼻咽癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌或白血病。
神经退行性疾病包括如下疾病中的至少一种：阿尔茨海默病、帕金森症、轻度认知障碍、亨廷顿症、朊病毒引起的疾病、额颞痴呆、路易体痴呆、血管性痴呆、肌萎缩性侧索硬化症、慢性损伤性脑病、进行性核上性麻痹、多系统萎缩症、皮质基底节变性、皮克氏病和橄榄体脑桥小脑萎缩。
本发明还提供了一种外泌体递送载体或药物组合物在制备治疗或预防耐药肿瘤的药物中的应用，耐药肿瘤为替莫唑胺耐药肿瘤。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种表面修饰有HSSP多肽的外泌体递送载体，通过HSSP多肽使得外泌体能靶向血红素加氧酶1（即HMOX1蛋白），而HMOX1蛋白高表达于多种肿瘤细胞和神经退行性疾病，基于此，修饰有HSSP的外泌体能够特异性靶向肿瘤和神经退行性疾病，因此，本发明的外泌体递送载体也可应用于靶向治疗或预防肿瘤和/或神经退行性疾病。而外泌体本身又具有极低的免疫原性，提升了递送载体本身的安全性；同时，外泌体也具有良好的血脑屏障穿透能力，从而有利于破解药物在血脑屏障穿透难的难题。目前已有多种外泌体装载药物的成功实例，使得外泌体具有装载内容物的高度兼容性，可以用于装载核酸、多肽、小分子等一系列药物，借助装载的药物进一步实现肿瘤和神经退行性疾病的治疗或预防。
本发明还提供了外泌体递送载体的制备方法，该方法简单易行，具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为外泌体的表征以及装载的内容物和体外BBB穿越评估；
图2验证了HSSP修饰的外泌体具有靶向耐药细胞能力；
图3验证了负载STAT3基因沉默工具的外泌体处理可以恢复TMZ耐药的GBM的TMZ敏感性；
图4为HSSP修饰的外泌体的体内生物分布和体内TR-GBM靶向；
图5为在GBM原位肿瘤移植模型小鼠中，负载siSTAT3 / TMZ的外泌体的体内抗肿瘤作用。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
TMZ耐药是胶质瘤复发的重要原因，胶质瘤是一种不可治愈的疾病，具有极高的复发率，容易产生耐药性，目前临床唯一胶质瘤药物TMZ的耐药是治疗中的一大难点。发明人开发了一种对装载内容物高度兼容的、增强肿瘤靶向和耐药性肿瘤靶向的且低免疫原性的外泌体递送载体，该外泌体递送载体具有血脑屏障穿透能力和肿瘤特异性靶向能力，并且在神经退行性疾病中有潜在应用，为胶质瘤药物TMZ耐药问题提供了新的解决方案。
具体地，该外泌体递送载体包括外泌体以及在外泌体表面修饰的HSSP多肽，HSSP多肽能靶向血红素加氧酶1。
基于HSSP多肽能靶向血红素加氧酶1（HMOX1(hemeoxygenase 1）），修饰有HSSP多肽的外泌体能够针对高表达血红素加氧酶1的细胞靶向递送相应的药物或siRNA，从而对相应的肿瘤细胞进行杀伤。发明人发现，因HSSP靶向HMOX1，进而能够针对TMZ耐药的胶质瘤进行有效杀伤。
此外，血红素加氧酶1高表达于多种肿瘤细胞和神经退行性疾病，因此HSSP修饰的外泌体也可应用于多种其他疾病的治疗。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述HSSP多肽通过接枝材料修饰于外泌体膜上。借助接枝材料，HSSP多肽可以锚定在外泌体膜上，从而对外泌体靶向细胞提供条件。
在一种实施方式中，接枝材料与HSSP多肽共价连接，接枝材料与外泌体膜物理结合；需要说明的是，上述共价连接包括不限于：硫醚键、酰胺键、肽键、酯键等。上述物理结合可以是通过磷脂双分子层的疏水性实现物理嵌合。
在一种实施方式中，接枝材料为DSPE-PEG-Mal，DSPE-PEG-Mal通过马来酰亚胺与HSSP多肽以硫醚键共价连接。
当接枝材料为DSPE-PEG-Mal时，其中的磷脂和聚乙二醇结合使得该接枝材料本身具有良好的亲水性和疏水性。从而有利于通过修改目标表面配体实现靶向给药。该接枝采用可以用于药物输送。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述外泌体的来源为外周血、腹水、尿液、唾液、脑脊液、干细胞、牛奶或植物。
在一种实施方式中，外泌体的来源为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、血清、胎盘、人内皮祖细胞、牙髓干细胞、人胎肝细胞、牛奶或植物。
在其他实施方式中，上述外泌体的来源也可以是血浆内皮细胞、树突状细胞、纤维细胞、人髓核细胞、关节液来源等。
在一种实施方式中，外泌体的平均粒径为5-150nm。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述外泌体内负载有药物或siRNA，药物为治疗或预防：肿瘤和/或神经退行性疾病的药物；siRNA为STAT3的siRNA，STAT3的siRNA可以激活TMZ耐药细胞的药物敏感性，在其他实施方式中，其他信号传导与转录激活因子家族的蛋白也可行。
在一种实施方式中，STAT3的siRNA的序列如SEQ ID NO.1-2所示，siRNA的序列也可根据需要进行自适应调整。肿瘤包括如下肿瘤中的至少一种：胶质母细胞瘤、肺癌、脑胶质瘤、淋巴瘤、胃癌、食管癌、鼻咽癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌或白血病。
神经退行性疾病包括如下疾病中的至少一种：阿尔茨海默病、帕金森症、轻度认知障碍、亨廷顿症、朊病毒引起的疾病、额颞痴呆、路易体痴呆、血管性痴呆、肌萎缩性侧索硬化症、慢性损伤性脑病、进行性核上性麻痹、多系统萎缩症、皮质基底节变性、皮克氏病和橄榄体脑桥小脑萎缩。
在一种实施方式中，药物为替莫唑胺。在其他实施方式中，其他的抗肿瘤药物也可行，也均可用于装载。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述外泌体中药物的载药量为1-70%，外泌体中siRNA的载药量为1-40%。
在一种实施方式中，外泌体中药物的载药量为20-60%，外泌体中siRNA的载药量为1-30%。
在一种实施方式中，当外泌体负载药物时，外泌体的浓度为10-1000 μg/mL；当外泌体负载siRNA时，外泌体的浓度为10-1000μg/mL。
本发明还提供了一种外泌体递送载体的制备方法，其包括将HSSP多肽修饰于外泌体表面。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述修饰是指：将HSSP多肽与接枝材料混合，制得配体，然后将配体与外泌体混合培养。
在一种实施方式中，在将配体与外泌体混合培养前，还包括将药物或siRNA与外泌体进行混合培养以使得外泌体负载药物或siRNA；
在一种实施方式中，配体制备时，HSSP多肽与接枝材料的混合摩尔比例为1:1-1.2，接枝材料为DSPE-PEG-Mal，将接枝材料和HSSP多肽混合溶解在二甲基亚砜中，除氧，混匀20-28h，透析。
在上述HSSP多肽与接枝材料的混合摩尔比条件下，有利于将未接枝的原料透析去除，发明人发现在上述混合摩尔比下，该反应效率更高。
在一种实施方式中，选择3000-3500道尔顿的透析袋进行透析20-28h。
优选地，每1mg的外泌体添加50-500µg 的配体。
本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述的外泌体递送载体和药学上可接受的添加剂或辅料。
在一种实施方式中，药物组合物的剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂、喷雾或针剂。优选地，上述药物组合物优选为静脉注射施用。
本发明还提供了一种外泌体递送载体或药物组合物在制备治疗或预防肿瘤和/或神经退行性疾病的药物中的应用，肿瘤包括如下肿瘤中的至少一种：胶质母细胞瘤、肺癌、脑胶质瘤、淋巴瘤、胃癌、食管癌、鼻咽癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌或白血病。
在本发明应用较佳的实施方式中，神经退行性疾病包括如下疾病中的至少一种：
阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease, AD)、帕金森症(Pakinson’ disease, PD)、轻度认知障碍(MCI)、亨廷顿症(HD)、朊病毒引起的疾病、额颞痴呆(FTD)、路易体痴呆、血管性痴呆、肌萎缩性侧索硬化症(Amyotuophiclateralsclerosis, ALS)、慢性损伤性脑病(CTE)、进行性核上性麻痹(PSP)、多系统萎缩症(MSA)、皮质基底节变性(CBGD)、皮克氏病和橄榄体脑桥小脑萎缩(OPCA)。
在其他实施方式中，上述的神经退行性疾病(Neurodegenerativediseases, NDD)临床表现为患者常有记忆力下降、认知困难、痴呆、动作平衡失调、运动能力丧失等症状。
上述神经退行性疾病治疗药物的制备应用，包括不限于增强免疫力、减缓衰老和记忆力衰退。在一种实施方式中，可将上述的外泌体递送载体或药物组合物制备为神经元保护剂和神经元修护剂。
需要说明的是，上述列举的仅为发明人列举的几种可行的疾病，在其他实施方式中，只要能实现神经退行性病症的缓解、治愈等效果均在本发明的保护范围内，而并不限于上述列举的几种疾病的类型。
需要说明的是，上述肿瘤治疗药物的制备应用，包括不限于肿瘤的病灶消除、肿瘤范围变小、抗肿瘤、肿瘤耐药性治疗等效果，也不限于上述列举的几种肿瘤的类型，只要能实现肿瘤的病灶消除、肿瘤范围变小、抗肿瘤、肿瘤耐药性治疗等效果，均在本发明的包括范围内。
需要说明的是，发明人发现，采用上述外泌体递送载体对于脑瘤具有良好的疗效。
本发明还提供了一种外泌体递送载体或药物组合物在制备治疗或预防耐药肿瘤的药物中的应用，耐药肿瘤为替莫唑胺耐药肿瘤。
发明人发现使用间充质干细胞来源的外泌体通过修饰HSSP多肽靶向HMOX1蛋白（血红素加氧酶1(hemeoxygenase 1），能够增强TMZ耐药胶质瘤的靶向性，通过STAT3（信号传导与转录激活因子(Signal Transducer and Activator of Transcription 3 ,STAT3)）的siRNA和TMZ（替莫唑胺）联合给药，有效地杀伤了TMZ耐药的胶质瘤，并且在动物实验中取得了良好的治疗效果。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
下述的实施例以及实验例中使用的所有化学品均为分析级，由Sigma Aldrich提供。细胞培养基和化学品购自GE Healthcare Bio Sciences的HyClone，STEMCELLSTechnologies Inc提供BMSC分离和培养基。细胞培养瓶及相关材料来自中国江苏无锡市耐思生物技术有限公司。小鼠内皮细胞（bEnd.3）、人胚肝细胞（L02）和胶质瘤细胞（U87MG）由中国科学院细胞库提供。转染荧光素酶的TMZ耐药细胞（U251MG）来自中国上海iCell生物科技有限公司。
试剂的水为Milli-Q净水系统去离子。
由中国键凯公司JenKem Technology Co.Ltd合成了的脂质栓系聚乙二醇马来酰亚胺DSPE-PEG2000-MAL（接枝材料）。下述实施例以及实验例中使用的所有抗体均从Biolegend公司获得。
中国GenePharma公司合成了STAT3 siRNA（siSTAT3），其正义链的核苷酸序列（SEQID NO.1）为：5'- GGA CGA CUU UGA UUU CAA CTT -3'，反义链的核苷酸序列（SEQ IDNO.2）为：5'- GUU GAA AUC AAA GUC GUC CTG-3'。荧光素酶抑制的siRNA: siRNA-GL3:5'-CUU ACG CUG AGU ACU UCG AdTdT -3'（正义）；5'- UCG AAG UAC UCA GCG UAA GdTdT -3'（反义）和对照无意义序列siRNA（siScr）：5'- UUC UCCGAA CGU GUC ACG UdTdT -3'（正义）；5'- ACG UGA CAC GUU CGG AGA AdTdT -3'（反义）。
实施例1
本实施例提供了一种外泌体递送载体的制备方法。
（1）外泌体分离
分离方案是从标准方案修改而来的。骨髓间充质干细胞在75 cm2的细胞培养瓶中培养，DMEM-F12培养基中添加10%去外泌体的FBS（120000×g，4°C离心12小时，弃掉沉淀）加1%链霉素青霉素溶液，细胞长满后不换液72小时，细胞融合率为90%，此时将细胞培养基收集在50ml试管中，以2000×g离心20分钟，然后在4℃下以15000×g离心30分钟。然后收集上清液并通过0.22µm无菌过滤器过滤，以确保大颗粒和大分子过滤掉。最后，将培养基置于4℃下以120000×g离心70分钟。丢弃上清液，将外泌体团块沉淀收集在PBS中并在-20℃下储存以供进一步实验。
此外，在其他实施方式中，为了增加细胞培养上清液中的外泌体产量，基于PEG6000沉淀的商用离心试剂盒也是可行的选择（如Hieff Quick exosome isolationkit，YEASEN Biotech）有限公司，中国上海）。
（2）HMOX1靶向配体制备
HMXO1特异性短肽（HSSP）与DSPE-PEG-MAL结合制得，DSPE-PEG-MAL是商业制备的。本实施例中将等摩尔量的HSSP和DSPE-PEG-MAL（10 mg）溶解在二甲基亚砜中充氮气以除去氧，在室温下持续24小时搅拌。然后将溶液在3500道尔顿透析袋中透析24小时，每两小时换一次水。然后将溶液冻干，24小时后称重以供进一步实验。
（3）外泌体的药物和siRNA装载
分别将TMZ和siRNA装载至外泌体中，然后对载物的外泌体进行配体修饰。
具体地，将1ml外泌体（即1mg/mL con.）和1mg/mL TMZ在37℃下培养30分钟（或将1ml外泌体（即1mg/mL con.）和4000nM 的siRNA在37℃下培养30分钟）。然后在4℃下超声仪器处理（GT SONIC-P20；（长×宽×高）：53.00 × 33.00 ×31.00 cm，40kHz，400W@30%功率）6个循环（每个循环30秒，循环间休息10秒），冰休息2分钟。重复相同的程序，即六个循环和冰息。之后，再次将外泌体培养1小时以稳定外泌体膜，并通过超速离心在PBS中洗涤3次。
载物的外泌体进行配体修饰：每1mg装载货物的外泌体添加100µg 步骤（2）制备的HMOX1靶向配体，超声处理30秒并且在37℃下培养1小时。此外，在其他实施方式中，可以选择使用电转仪如Neon转染系统（Invitrogen）通过电转将siRNA装载到外泌体中，并且可以使用基于凝胶吸附的商业外泌体离心柱（4484449 Thermofisher）洗涤卸载的TMZ或siRNA以获得更高的产量。
实验例1
本实验例对实施例1制备的外泌体递送载体进行粒径检测，并在电镜下进行观察，同时对外泌体装载siRNA和TMZ的效率进行检测。
结果参照图1所示，图1中的a图为BMSC衍生的外泌体（BMSCExo）的大小分布，b图为透射电子显微镜图像，c图为BMSCExo和LO2Exo中siRNA的装载百分比（横坐标为外泌体浓度）， d图为BMSCExo和LO2Exo中TMZ的装载百分比（横坐标为外泌体浓度）。e图用于f图-g图，bEnd.3内皮细胞的体外BBB模型的Transwell测定法在体外模拟了BBB，在下腔室的GBM细胞中评估了穿透效率。 f图在transwell模型中，显示了BMSCExo和LO2Exo中载的AuNP的总穿透量（尺寸<10 nm）。g图为用BMSC Exo和LO2 Exo加载荧光素酶（luc）敲低的siRNA（萤火虫荧光素酶，siGL3）处理后，在下腔室中luc基因携带的GBM细胞中荧光素酶表达。h图为在小鼠中通过尾静脉注射装载了AuNP的外泌体通过尾静脉注射后再脑部的聚集量。（n＝3）。
实验例2
本实验例对HMOX1在耐药胶质瘤中的表达水平进行检测。结果显示，HSSP修饰的外泌体体能够靶向HMOX1高表达的耐药GBM。
结果参照图2所示。a图为HMOX1在正常人星形胶质细胞（HA），U251和TMZ耐药性U251(TR)细胞中的表达。 b图为HMOX1蛋白在细胞膜和细胞质组分中的表达，ACTB作为细胞质组分的对照。 c图和d图：与载有DiR小分子染料或FAM绿色荧光素标记的siRNA（siFAM）或DiR小分子染料的HSSP-BMSC Exo一起孵育后，对U251-TMZ耐药细胞进行流式细胞检测，可见被HSSP修饰的外泌体（HSSP-BMSC Exo）装载的siRNA和小分子，其摄取量都显著高于未经外泌体装载和无HSSP修饰组。
e-f图为共聚焦显微镜成像结果，同样显示HSSP修饰的外泌体具有更强的摄取。
实验例3
本实验评估了HSSP修饰的外泌体用于递送STAT3的siRNA，并在耐药胶质瘤中重新诱发了耐药细胞的TMZ敏感性。结果显示，HSSP修饰的外泌体装载STAT3的siRNA和TMZ能够提高耐药细胞死亡。
结果参照图3所示。a图用装载了siSTAT3的HSSP-BMSCExo，处理TR细胞可见STAT3的表达降低，并且STAT3下游的蛋白：O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶（MGMT）降低，而MGMT的降低公认会阻碍DNA损伤修复，恢复TR细胞的耐药性。
b-c图在用siSTAT3 / TMZ负载的外泌体处理的U251-TMZ抗性细胞中，STAT3的免疫荧光共聚焦照片结果，比例尺= 10 µm。显示HSSP-BMSC组STAT3表达明显降低。而DNA双链损伤标记γH2AX提高。比例尺= 10 µm。d图负载siSTAT3 / TMZ的外泌体处理后，U251-TR细胞的MTT细胞活性测定显示具有杀伤作用。
本实验例所有附图中的PBS组被认为是标准对照。使用方差分析和Tukey的多重比较检验进行统计评估。
实验例4
本实验例对在脑部移植了肿瘤的小鼠进行外泌体水平检测。实验结果参照图4所示。
a-b图通过静脉途径单剂量注射后，血浆中Cy5-siRNA或DiR浓度/时间曲线显示的体内药代动力学。c图显示了不同时间点大脑中DiR的积累。 d图显示负载Cy5或DiR的外泌体在16小时的脑内聚集，HSSP修饰的外泌体较未修饰的外泌体高。e-f图为注射后16h主要组织经匀浆后检测的siRNA和DiR组织荧光统计。 n = 3。
实验例5
对HSSP修饰的外泌体递送siSTAT3的siRNA和TMZ联合治疗杀伤耐药胶质瘤进行实验。实验结果参照图5所示。
a图为实验时间表的示意图。 自U251-TR细胞移植后第13天起，每隔一天进行外泌体静脉给药治疗,共计6次。b图显示了在治疗过程中小鼠模型的体重变化（每组起始n =9）。c图显示了各个治疗组中小鼠的存活率（每组n = 5）。d图通过TUNEL分析和剪切形式的caspase3(c-casp3)显示了原位移植的肿瘤细胞的细胞凋亡情况，结果表明在HMOX1靶向的间充质干细胞来源外泌体处理组中细胞凋亡提高。统计数据通过方差分析和Tukey的多重比较测试对数据进行分析。以上数据中统计学差异*p<0.05 **p＜0.01，***p＜0.001。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南大学
<120> 一种外泌体递送载体及其制备方法、应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggacgacuuu gauuucaact t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 2
guugaaauca aagucgucct g 21

Claims (13)

1.一种治疗或预防耐替莫唑胺的脑胶质瘤的外泌体递送载体，其特征在于，其包括外泌体以及在外泌体表面修饰的HSSP多肽，所述HSSP多肽能靶向血红素加氧酶1，所述HSSP多肽通过接枝材料修饰于外泌体膜上；
所述接枝材料与所述HSSP多肽共价连接，所述接枝材料与所述外泌体膜物理结合；
所述接枝材料为DSPE-PEG-Mal，DSPE-PEG-Mal通过马来酰亚胺与所述HSSP多肽以硫醚键共价连接；所述外泌体的平均粒径为50-200nm；所述外泌体内负载有药物和siRNA，所述siRNA为STAT3的siRNA；
所述STAT3的siRNA的序列如SEQ ID NO.1-2所示；所述药物为替莫唑胺。
2.根据权利要求1所述的治疗或预防耐替莫唑胺的脑胶质瘤的外泌体递送载体，其特征在于，所述外泌体的来源为外周血、腹水、尿液、唾液、脑脊液、干细胞、牛奶或植物。
3.根据权利要求2所述的治疗或预防耐替莫唑胺的脑胶质瘤的外泌体递送载体，其特征在于，所述外泌体的来源为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、血清、胎盘、人内皮祖细胞、牙髓干细胞、人胚胎干细胞、牛奶或植物。
4.根据权利要求1所述的治疗或预防耐替莫唑胺的脑胶质瘤的外泌体递送载体，其特征在于，所述外泌体中所述药物的载药量为1-70%，所述外泌体中所述siRNA的载药量为1-40%。
5.根据权利要求4所述的治疗或预防耐替莫唑胺的脑胶质瘤的外泌体递送载体，其特征在于，所述外泌体中所述药物的载药量为20-60%，所述外泌体中所述siRNA的载药量为1-30%。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的治疗或预防耐替莫唑胺的脑胶质瘤的外泌体递送载体的制备方法，其特征在于，其包括将所述HSSP多肽修饰于所述外泌体表面。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述修饰是指：将所述HSSP多肽与所述接枝材料混合，制得配体，然后将所述配体与所述外泌体混合培养。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述配体制备时，所述HSSP多肽与所述接枝材料的混合摩尔比例为1:1-1.2，所述接枝材料为DSPE-PEG-Mal，将所述接枝材料和所述HSSP多肽混合溶解在二甲基亚砜中，除氧，混匀20-28h，透析。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，选择3000-3500道尔顿的透析袋进行透析20-28h。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，每1mg的外泌体添加50-500µg 的所述配体。
11.一种药物组合物，其特征在于，其包括权利要求1-5任一项所述的治疗或预防耐替莫唑胺的脑胶质瘤的外泌体递送载体和药学上可接受的添加剂或辅料。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂、喷雾或针剂。
13.一种如权利要求1-5任一项所述的治疗或预防耐替莫唑胺的脑胶质瘤的外泌体递送载体或权利要求11-12任一项所述的药物组合物在制备治疗或预防耐药肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述耐药肿瘤为耐替莫唑胺的脑胶质瘤。
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