JPH10504709A

JPH10504709A - ポリヌクレオチドの細胞への標的を定めた送達を増大させるための細菌成分の利用

Info

Publication number: JPH10504709A
Application number: JP8503399A
Authority: JP
Inventors: ワイ．ウー，ジョージ; エイチ．ウー，キャサリン; ジァング，イン; エル．スピタルニー，ジョージ; カーマイケル，エレン
Original assignee: ユニバーシティオブコネティカット; ターゲテック，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-06-29
Filing date: 1995-06-27
Publication date: 1998-05-12
Also published as: AU2950295A; US5728399A; CA2192687C; EP0804603A1; WO1996000792A1; AU683400B2

Abstract

(57)【要約】特定の細胞をポリヌクレオチドの標的とするための改良された可溶性分子複合体を開示する。この分子複台体は：（ａ）ポリヌクレオチド；（ｂ）ポリヌクレオチド結合剤と細胞の表面分子に結合してエンドソームに内在化される細胞特異的結合剤とからなるキャリアー、及び（ｃ）エンドソームを溶解させてその細胞の細胞質へのポリヌクレオチドの放出を引き起こす細菌成分又はその断片を含む。この発明の好適具体例において、ポリヌクレオチド結合剤はポリリジンであり、細胞特異的結合剤はアシアロ糖蛋白質であり、細菌成分はリステリオリシンＯである。開示した可溶性分子複合体及び利用方法を治療に用いて、遺伝子及びアンチセンスポリヌクレオチドをイン・ビボで特定の細胞に送達することができる。

Description

【発明の詳細な説明】ポリヌクレオチドの細胞への標的を定めた送達を増大させるための細菌成分の利用発明の背景分子生物学における急速な発展は、正常に機能する遺伝子をヒト組織に導入することにより遺伝病を矯正する遺伝子治療の利用の可能性を示した。ここ数年間で、遺伝子送達のための多くの方法が、イン・ビトロで開発された。これらの内には、リン酸カルシウム沈澱（Gopal(1985)Mol Cell Biol．5:1188; Graham等(1 973)Virology 52:456）、エレクトロポレーション（Potter等(1984)PNAS81:7161 ）、マイクロインジェクション（Harland等(1985)Cell Biol.101:1094）、リポソーム（Fraley等(1979)PNAS 76:3348）及びレトロウイルスベクター（Guild等( 1988)Virology62:3795）がある。しかしながら、本質的制限が、これらの技術のいくつかをイン・ビボで遺伝子送達のために広く使用することを妨げてきた。例えば、レトロウイルスは、分裂細胞にのみ統合され且つこのベクターが運ぶことのできる外来遺伝子にはサイズの制限がある。リン酸カルシウム沈澱においては、原形質膜損傷が生じる。最近、肝細胞及び他の細胞に特異的にＤＮＡを送達するための可溶性ＤＮＡターゲティングシステムが開発された（Wu等J.Biol.Chem.(1987)262:4429;米国特許第５，１６６，３２０号）。肝細胞への送達のために、このシステムは、肝実質細胞に対して高度に選択的なレセプターによるアシアロ糖蛋白質のレセプター媒介のエンドサイトーシスを利用する。細胞表面レセプターに結合する実体であるアシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）及びＤＮＡに結合する実体であるポリリジンよりなる可溶性のターゲティング可能な結合体が開発された。ポリリジンは、ＤＮＡと強い、ダメージを与えない様式で結合して、そのＤＮＡをヌクレアーゼの攻撃から保護する。この結合体は、アシアロ糖蛋白質レセプターを有する細胞を特異的に標的とすることができ、外来遺伝子の細胞への取り込み及び発現を生じさせる（米国特許第５，１６６，３２０号；Wilson等J.Biol.Chem.(1992) 267:963; Wu等J.Biol.Chem.(1989)242:16985;Wu等Biochemistry(1988)27(3):887 ; Wu等J.Biol.Chem.(1991)266:14438)。送達された遺伝子の発現を増大させる幾つかのアプローチが報告されている。例えば、Curiel等は、最近、細胞に完全なアデノウイルスとトランスフェリン− ポリリジン−ＤＮＡ複合体を同時トランスフェクトすることによる増大した遺伝子発現を報告した（Curiel等(1991)PNAS 88:8850）。Wagner等は、ＤＮＡ複合体の部分としてインフルエンザウイルスヘマグルチニンのＮ末端配列から引き出したある種のフソジェニックペプチドを含み、トランスフェリン−ポリリジン媒介の遺伝子トランスファーのかなりの増大を生じた（Wagner(1992)PNAS 89:7934）。トランスフェクトした遺伝子の発現を増大させるための更なる方法は、有益であろう。発明の要約この発明は、選択的細胞内在化のための特定の細胞へのポリヌクレオチドのターゲティングのための改良された可溶性分子複合体及びその分子複合体の利用方法に関するものである。この可溶性分子複合体は、ポリヌクレオチド結合剤と、細胞の表面分子に結合してエンドソーム中に内在化される細胞特異的結合剤とからなるキャリアー成分と複合体化したポリヌクレオチドを含む。この複合体は、更に、エンドソームを溶解させることのできる細菌成分又はその部分を含み、そのポリヌクレオチドの細胞質内への放出を生じる。このポリヌクレオチド結合剤は、細胞外条件下でポリヌクレオチドと安定に複合体化し且つ細胞内条件下でそのポリヌクレオチドを機能的形態で放出するポリカチオン等の化合物である。キャリアーを調製するためには、ポリヌクレオチド結合剤を、細胞性エンドソーム中へのエンドサイトーシスによる結合リガンドの内在化を媒介する細胞表面構造典型的には細胞表面レセプターに結合する細胞特異的結合剤に結合する。この細胞特異的結合剤は、天然若しくは合成のリガンド（例えば、蛋白質、ポリペプチド、糖蛋白質、炭水化物等）であってよく、又はそれは、結合した複合体の内在化を、その後、媒介する細胞表面構造に特異的に結合する抗体若しくはそのアナログであってよい。この細胞特異的結合剤に対する好適な標的は、ガラクトース末端（アシアロ−）糖蛋白質と結合してその内在化を媒介する肝細胞のアシアロ糖蛋白質レセプターである。ポリヌクレオチドの細胞への送達を増大させるために、細胞性エンドソームを溶解させることのできる細菌成分又は活性なその断片をこの分子複合体に含有させる。この複合体の細胞のエンドソーム中への内在化の後に、この細菌成分がエンドソームを溶解させてポリヌクレオチドの細胞質への放出を生じる。好ましくは、この細菌成分は、ｐＨ依存性であり、エンドソームへの内在化に際して活性化される。或は、この細菌成分は、チオール活性化される。特に好適な細菌成分は、リステリオリシンＯ又はその活性成分である。この発明の可溶性分子複合体を用いて、治療のために、ポリヌクレオチド例えば遺伝子及びアンチセンスポリヌクレオチドを、イン・ビボ、イン・ビトロ又はエクソ・ビボで、特定の細胞に送達することができる。発明の詳細な説明この発明は、少なくとも部分的に、細胞性エンドソームの溶解を引き起こす能力を有する細菌成分を用いて、特定の細胞に対するポリヌクレオチドの送達を増大させることができるという発見に基づいている。従って、レセプター媒介のエンドサイトーシスによるポリヌクレオチドの細胞中への送達を増大させるために、エンドソームを溶解させることのできる細菌成分を可溶性分子複合体に含有させる。用語「細菌成分」は、ここで用いる場合、細胞性エンドソームを溶解させる能力を有する細菌の任意の部分又は細菌により生成される任意の物質を含み、エンドソーム溶解活性を有する蛋白質及び断片又はそれらのアナログを含む。この発明の可溶性分子複合体は、ポリヌクレオチド結合剤と細胞特異的結合剤とからなるキャリアーと非共有結合したポリヌクレオチドを含む。この分子複合体は、更に、細胞性エンドソームを溶解させる細菌成分又はその断片を含む。この細菌成分を、キャリアーの成分例えばポリヌクレオチド結合剤と結合することができる。或は、この細菌成分を、別々に第２のポリヌクレオチド結合剤と結合させ、そしてこの分子複合体の残りの成分と複合体化させることができる。この分子複合体の部分として、この細菌成分又はその断片を、同様のエンドサイトーシス経路によって、この分子複合体の残りの成分（即ち、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド結合剤及び細胞特異的結合剤）と共に細胞中に内在化させる。この同時内在化させた細菌成分又はその活性断片は、エンドソームの溶解を引き起こし、それにより、この複合体の成分を細胞の細胞質中に放出させて、機能的ポリヌクレオチドの増大した取り込み及び／又は細胞における延長された活性を生じる。送達すべきポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらのアナログであってよい。例えば、標的を定めたポリヌクレオチドは、所望の蛋白質例えば分泌蛋白質（１９９１年６月５日出願の米国特許出願第７１０，５５８号及び１９９２年６月５日出願の第８９３，７３６号を参照）例えば凝固因子及び他の血中蛋白質、細胞表面蛋白質（１９９１年５月３日出願の米国特許出願第６９５，５９８号を参照）例えば低密度リポ蛋白質、成長因子若しくはホルモンに対する細胞表面レセプター、免疫原性蛋白質（１９９１年５月１４日出願の米国特許出願第６９９，８９１号及び1９９２年５月１４日出願の第８８２，６６９号を参照）例えばウイルス蛋白質（例えば、Ｂ型肝炎抗原又はＨＩＶエンベロープ蛋白質）又は他の病原体の蛋白質をコードする遺伝子であってよい。所望の蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、標的細胞による発現に適した形態である。例えば、このポリヌクレオチドは、その生成物の細胞内目的地への通行又は細胞性分泌を与える適当なシグナル配列をコードする遺伝子であってよい。このシグナル配列は、その蛋白質の天然の配列であってもよいし、外来の配列であってもよい。この遺伝子は、標的細胞による遺伝子産物の発現のために必要な適当な遺伝子調節要素と機能的に結合する。調節配列は、適当な細胞内での所望の蛋白質の発現を指示するために、技術的に認識され、選択される。従って、用語「調節配列」は、ここで用いる場合、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素を含む。かかる調節配列は、公知であり、Goeddel、Geneexpress ion Technology: Methods in Enzymology ，p.185，Academic Press，カリフォルニア、S an Diego(1990)中で論じられている。この遺伝子は、遺伝子の発現及び遺伝子にコードされた産物の分泌に必要な遺伝子調節要素を伴う発現ベクター例えばプラスミッド又は転移性遺伝要素等に含まれ得る。或は、この標的を定めたポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチドであってよい（１９９２年９月４日出願の米国特許出願第０７／９４１，３６８号、及び１９９３年４月５日出願の第０８／０４２，９４３号、及び１９９４年１月１２日出願の第０８／１８１，５５７号を参照されたい）。別の場合には、このポリヌクレオチドは、触媒活性を有するＲＮＡ分子例えばリボザイムをコードする遺伝子であってよい（１９９４年４月４日出願の米国特許出願第０８／２２２，６１５号を参照されたい）。この分子複合体は、同じポリヌクレオチドの１つより多いコピー又は１種以上の異なるポリヌクレオチドを含むことができる。この複合体のキャリアー成分は、典型的には、細胞特異的結合剤とポリヌクレオチド結合剤との結合剤である。この細胞特異的結合剤は、特定の細胞をこの複合体の標的とし、そして細胞表面構造に特異的に結合する薬剤である（該細胞表面構造は、例えばエンドサイトーシスの過程により、その細胞性エンドソーム中への内在化を媒介する）。この結合剤のための標的の表面構造は、蛋白質、ポリペプチド、炭水化物、脂質又はこれらの組合せであってよい。典型的には、この細胞表面構造は、リガンドのエンドサイトーシスを媒介する表面レセプターである。従って、この結合剤は、レセプターに結合する天然又は合成のリガンドであってよい。このリガンドは、細胞表面構造により認識されるだけ十分に露出した官能基を有する蛋白質、ポリペプチド、糖蛋白質、糖ペプチド又は糖脂質であってよい。それは又、ウイルス又は細胞（例えば、哺乳動物、細菌、原生成物の細胞）等の生物の成分であってもよい。細胞特異的リガンドは又、抗体又は抗体のアナログ例えば一本鎖抗体（細胞表面構造に結合するもの）であってもよい。キャリアーを形成するのに有用なリガンドは、標的とすべき特定の細胞によって変化する。肝細胞を標的とするには、ガラクトース末端炭水化物例えば天然の糖蛋白質から得られる炭水化物トリー特に末端ガラクトース残基を含むか又は酵素処理されて末端ガラクトース残基を露出し得る構造を利用することができる。或は、他のリガンド例えばポリペプチドホルモンを用いることができる。更に、天然の植物性炭水化物例えばアラビノガラクタンをリガンドとして用いることができる。肝細胞ターゲティングに有用な他のリガンドには、露出した末端炭水化物基を有する糖蛋白質例えばアシアロ糖蛋白質（ガラクトース末端）が含まれる。これらのガラクトース末端リガンドは、ガラクトース末端炭水化物例えばラクトース又はアラビノガラクタンをガラクトースを有しない蛋白質に還元的ラクトサミネーションにより結合することにより形成することができる。更なるアシアロ糖蛋白質の例には、アシアロオロソムコイド、アシアロフェチュイン及び脱シアル化された水疱性口内炎ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。かかるリガンドは、末端シアル酸及び末端から２番目のガラクトース残基を有する糖蛋白質の化学的又は酵素的脱シアル化により形成することができる。他の細胞表面レセプターを標的とする可溶性分子複合体のターゲティングのためには、他の型のリガンド例えばマクロファージ用のマンノース（リンパ腫）、繊維芽細胞用のマンノース６リン酸糖蛋白質（繊維肉腫）、腸細胞用の内性因子 −ビタミンＢ１２及び胆汁酸（Kramer等(1992)J.Biol.Chem.267:18598-18604参照）、脂肪細胞用のインシュリン、及び平滑筋細胞又は他のトランスフェリンレセプターを有する細胞用のトランスフェリンを用いることができる。或は、細胞特異的結合剤は、レセプター又はレセプター様分子例えば細胞表面のリガンド（例えば、抗原）に結合する抗体であってよい。かかる抗体は、標準的手順により生成することができる。このキャリアーのポリヌクレオチド結合剤は、送達されるべきポリヌクレオチドと複合体を形成する。このポリヌクレオチドとの複合体形成は、標的細胞による内在化の前に細胞外でのポリヌクレオチドの有意の解離を阻止するだけ十分に安定なものでなければならない（イン・ビボ、エクソ・ビボ又はイン・ビトロの何れかで）。しかしながら、この複合体は、その細胞中では適当な条件下で開裂可能であり、それにより、ポリヌクレオチドはその細胞内で機能的形態で放出される。好適具体例において、ポリヌクレオチド結合剤とポリヌクレオチドとの間の結合は、十分な細胞外安定性を与えるが細胞内では遊離可能である静電引力に基づくものである。好適なポリヌクレオチド結合剤は、負に帯電したポリヌクレオチドと結合するポリカチオンである。これらの正に帯電した蛋白質は、非共有的にポリヌクレオチドと結合して、細胞外では安定であるが細胞内では遊離可能なターゲティング可能な分子複合体を形成することができる。適当なポリカチオンはポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、塩基性蛋白質例えばヒストン、アビジン、プロタミン等である。好適ポリカチオンは、ポリリジンである（例えば、３，８００〜６０，０００ダルトン）。発現可能なポリヌクレオチドを遊離可能に結合するために利用できる他の非共有結合には、単独又は組合せた水素結合、疎水結合、静電的結合が含まれる（例えば、ポリヌクレオチドに結合した抗ポリヌクレオチド抗体及びポリヌクレオチド含有のビオチン化ヌクレオチドに結合するストレプトアビジン又はアビジン）。好適なポリヌクレオチド結合剤は、ポリカチオンである。これらの正に帯電した物質は、負に帯電したポリヌクレオチドと非共有的に結合して、細胞外では安定であるが細胞内では遊離可能な可溶性のターゲティング可能な分子複合体を形成することができる。適当なポリカチオンは、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、塩基性蛋白質例えばヒストン、アビジン、プロタミン等である。好適なポリカチオンは、ポリリジン（例えば、３，８００〜６０，０００ダルトン）である。ポリヌクレオチドに遊離可能に結合するために利用できる他の非共有結合には、単独又は組合せた水素結合、疎水結合、静電的結合が含まれる（例えば、ポリヌクレオチドに結合した抗ポリヌクレオチド抗体及びポリヌクレオチド含有のビオチン化ヌクレオチドに結合するストレプトアビジン又はアビジン）。ポリヌクレオチドの細胞への送達を増大するために、細胞性エンドソームを溶解させることのできる細菌成分又はその断片をこの分子複合体に含ませる。この細菌成分又は断片は、典型的には、キャリアー成分例えばポリヌクレオチド結合剤の少なくとも１つに、好ましくはジスルフィド結合により共有結合される。或は、この細菌成分又は断片を、第２のポリヌクレオチド結合剤又は第２の細胞特異的結合剤と別々に結合し、そしてこの分子複合体の残りの成分と複合体化させる。この発明の好適具体例において、この分子複合体で用いられる細菌蛋白質又はペプチドは、細胞性エンドソームに内在化される際に活性化される。用語「活性化」は、ここで用いる場合、細菌成分又はその部分がエンドソームを溶解させることができる（例えば、コンホメーション変化を受け、エンドソームの膜に結合してそのエンドソームを溶解させることによって）ことを意味する。例えば、この細菌成分の活性は、ｐＨ依存性であってよく、即ち、この細菌成分は、エンドソーム内の酸性ｐＨにおいてはエンドソーム溶解活性を有するが、エンソソームの外（即ち、細胞質中又は細胞外）のｐＨではかかる活性を有しない。かかる細菌成分は、細胞外では不活性であり、細胞の外において又は細胞質に放出された場合に標的細胞又は宿主に無害であるが、細胞のエンドソーム内の酸性環境にさらされた後には活性になる。この発明の他の好適具体例において、細菌成分は、チオール活性化される。チオール活性化された細菌成分は、バチルス、ストレプトコッカス、クロストリジウム、ラクトバチルス及びリステリアを含む種々のグラム陽性細菌（これらに限定されない）により生成される（例えば、Smyth，C.J．及びDuncan，J.L.，Bact erial Toxins and Cell Membranes ,第５章 129頁、Academic Press(1978);Alouf ,J.E.及びGeoffrey,C.，Bacterial component Toxins，165頁、AcademicPress(1 984)を参照されたい）。チオール活性化された細菌成分は、還元された場合にはその蛋白質を活性化し、酸化された場合にはその蛋白質を不活性化する１つ以上のスルフヒドリル基を含むものである。一具体例において、チオール活性化された細菌蛋白質例えばＬＬＯ又は、全蛋白質と比較して免疫原性が減少したその蛋白質の断片を、その蛋白質の遊離のスルフヒドリル基を介してキャリアーと結合し、それにより、スルフヒドリル基の還元を防止してその蛋白質の活性化を阻止する。この構成は、細菌蛋白質又はペプチドが細胞のエンドソームへの内在化前に標的細胞に対して有害となることを阻止するという利点を与える。一度細胞性エンドソームに入れば、細菌蛋白質とキャリアーとの間のジスルフィド結合が還元されて蛋白質が活性な形態でキャリアーから遊離し、エンドソームの溶解を引き起こすと考えられる。この発明の特に好適な具体例においては、この分子複合体は、リステリアモノサイトジェネスにより生成された５６ｋＤのチオール活性化された蛋白質である細菌成分リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）を含み、或は一層好ましくさえあるが、エンドソーム溶解活性を未だ保持しているＬＬＯの断片は、後述の実施例３に記載のような減じた免疫原性を有する。ＬＬＯは、ｐＨ５．５において完全に活性であるが、ｐＨ７ではその殆どの活性を失う（例えば、Portnoy等(1992)Infecti on & Immunity 60:2710を参照されたい）。従って、この発明の分子複合体の部分として、ＬＬＯは細胞外又は細胞質中（中性のｐＨ）では不活性であり、この複合体がエンドソームの酸性環境中に内在化されると活性となると考えられる。従って、ＬＬＯは、ＬＬＯが細胞外でこの細胞に接触した場合に細胞膜に殆ど障害を与えないことを確実にする細胞溶解活性の欠如の故に、この発明の分子複合体において用いるのに特に好適である。エンドソームへ入った後に、活性なＬＬＯがエンドソームの膜に結合し、かかる結合が膜の浸透性を崩壊させてエンドソームの溶解へと導くと考えられる。他のｐＨ依存性又はチオール活性化細菌成分例えばニューモリシンも又、この発明の分子複合体に含まれ得る。この発明の分子複合体を生成するために、ポリヌクレオチド結合剤（例えば、ポリヌクレオチド）と細胞特異的結合剤（例えば、ＡＳＯＲ）との化学結合好ましくは共有的相互作用によってキャリアーを形成する。一具体例において、このキャリアーを、エンドソーム溶解可能な細菌性蛋白質又はその断片に結合する。他の具体例においては、細菌成分又は断片とポリヌクレオチド結合剤との結合体を調製する。次いで、その結合体とキャリアーとをポリヌクレオチドと複合体化する。その結果生成する分子複合体は、別々にポリヌクレオチド結合剤に結合し、この複合体の残りの成分（即ち、キャリアーとポリヌクレオチド）と非共有的に複合体化する細菌成分を含む。このキャリアーは、細胞特異的結合剤をポリヌクレオチド結合剤に化学結合させることにより形成することができえる。この化学結合は、典型的には共有結合である。好適な結合は、ペプチド結合である。これは、Jung,G．等(1981)Bioche m．Biophys．Res．Commun．101:599-606に記載されたように水溶性カルボジイミドを用いて形成することができる。別の結合は、ジスルフィド結合又はアビジン−ビオチンカップリング等の強い非共有結合である。化学結合は、キャリアーを形成するのに用いる特定の細胞特異的結合剤及びポリヌクレオチド結合剤に対して最適化することができる。反応条件をデザインして結合形成を最大化し且つキャリアー成分の凝集の形成を最小化することができえる。細胞特異的結合剤のポリヌクレオチド結合剤に対する最適比は、経験的に決定することができる。ポリカチオンを用いる場合には、成分比は、ポリカチオンのサイズ及びポリヌクレオチドのサイズによって変化する。一般に、この比（重量比）は、約１０：１〜１：１好ましくは約３：１に及ぶ。未結合の成分及び凝集物は、分子ふるい又はイオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ａｑｕａｐｏｒｅ（商標）カチオン交換、Rainin）によってキャリアーから分離することができる。一具体例において、アシアロオロソムコイド−ポリリジン結合体を、架橋剤１ −（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドを用いて形成する。透析後に、調製用酸−尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｐＨ４〜５）により、結合体を未結合成分から分離する。この結合体を、更に、カルボキシメチル官能化カラムにて精製することができる（１９９３年４月５日出願の米国特許出願第０８／０４３，００８を参照されたい。その教示を参考として本明細書中に援用する）。この分子複合体を形成するための一つの方法により、キャリアーと細菌成分を結合する。好適な結合は、ジスルフィド結合である。後述の実施例に記載のように、この結合は、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ビリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）等の化学架橋剤を用いて達成することができる。用いることのできる他の架橋剤には、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−スクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート）（ＳＩＡＢ）、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−スクシンイミジル−４−マレイミドフェニル−ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）及び水溶性カルボジイミド例えば１− エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）が含まれる（例えば、Grabarek等(1990)Anal.Biochem.185:131を参照されたい）。チオール活性化した細菌成分例えばＬＬＯを用いる場合には、例えばＳＰＤＰを用いてチオール化し、次いでＬＬＯ又はＬＬＯから導いたペプチド上に含まれる遊離のスルフヒドリル基に直接結合することができる（例えば、Cumber等(198 5)Meth Enzymol 112:207を参照されたい）。ＬＬＯ又はそのペプチドをキャリアーにそのスルフヒドリル基を介して結合することは、チオール基が参加されたままでいること及び複合体が標的細胞の外側にいる間はＬＬＯの活性が阻止されるという利点を提供することができる。キャリアーと細菌成分との結合の後に、生じた結合体（キャリアー−細菌成分結合体）を、ポリヌクレオチド結合剤を介してポリヌクレオチドと非共有的に複合体化する。これは、段階的透析手順により達成することができる。一具体例において、ポリカチオン例えばポリリジンで作成したキャリアーの利用に関して、この透析手順を、２ＭＮａＣｌダイアリゼートを用いて開始し、０．１５Ｍ溶液にて終了する。徐々に像対するＮａＣｌ濃度は、ポリヌクレオチドのキャリアー−細菌成分結合体への結合を生じる。幾つかの場合において、特に、ポリヌクレオチド及び結合体の濃度が低い場合には、透析は必要でなく；ポリヌクレオチドと結合体を単に混合して室温で約３０分間インキュベートする。この発明の可溶性分子複合体の形成のための、ポリヌクレオチドのキャリアー −細菌成分結合体に対する最適比は、用いるポリヌクレオチド及びキャリアー− 細菌成分結合体の型及びサイズによって変化し得る。例えば、オリゴヌクレオチドとＡＳＯＲ、ポリリジン及びＬＬＯで作成したキャリアー−蛋白質結合体についてのモル比は、約１０００：１〜約１０：１（オリゴヌクレオチド対キャリアー−細菌成分蛋白質結合体）で変化し得る。この比は、特定のポリヌクレオチド及びキャリアー−細菌成分結合体について、米国特許第５，１６６，３２０号（その教示を、参考として本明細書中に援用する）に記載したゲル遅延アッセイによって測定することができる。簡単に言えば、ポリアクリルアミドゲル上でランさせたＤＮＡの移動を完全に遅らせるポリヌクレオチドのキャリアー−細菌成分結合体に対する割合を、複合体形成に対する最適比として採用する。この発明の分子複合体を形成するための第２の方法によって、エンドソームを溶解させることのできる細菌成分若しくはその断片とポリヌクレオチド結合剤又は細胞特異的結合剤（例えば、抗細胞表面レセプター抗体）との結合体を形成する。説明用の例として、エンドソーム溶解活性を有する細菌成分例えばＬＬＯ又はＬＬＯの断片を、化学架橋剤例えばＳＩＡＢ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ又はＥＤＣを用いて、ポリヌクレオチド結合剤（例えば、ポリヌクレオチド）に結合することができる。或は、細菌成分又はその部分を、トランスグルタミナーゼ等の酵素の作用によって酵素的に又は例えばビオチン−ストレプトアビジンブリッジを介して生化学的に、ポリヌクレオチド結合剤と結合することができる。その結果生じた結合体を、次いで、分子ふるい又はイオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ａｑｕａｐｏｒｅ（商標）カチオン交換、Rainin）により、標準的技術を用いて、遊離の細菌成分及び遊離のポリヌクレオチド結合剤から分離することができる。特に好適な具体例においては、ポリヌクレオチド結合剤−細菌成分結合体を、ＬＬＯ、又は一層好ましくさえあるが、エンドソーム溶解活性を有するＬＬＯの断片とポリリジンとを用いて、ＬＬＯ上に含まれる遊離のスルフヒドリル基又は遊離のカルボキシル基をポリリジンに結合させることにより生成する。例えば、ポリリジンを、ＳＰＤＰを用いてチオール化し、次いで、ＬＬＯ又はＬＬＯのペプチド上の遊離のスルフヒドリル基に直接結合することができる。結合は、室温で、約１８時間インキュベートすることにより達成することができる。ポリヌクレオチド結合剤−細菌成分結合体の形成の後に、この結合体を、室温でのインキュベーションにより、分子複合体の残りの成分（即ち、ポリヌクレオチド結合剤及び細胞特異的結合剤とから上記のようにして形成したキャリアー）と非共有的に複合体化させる。最適複合体形成のためには、ポリヌクレオチドを、先ず、そのポリヌクレオチドの負電荷を部分的にのみ飽和する量のキャリアーと混合すべきである（即ち、ポリヌクレオチドの負電荷の約１／４をキャリアーのポリカチオンにより中和する）。ポリカチオン例えばポリリジンで作成したキャリアーを用いる場合には、この比は、標準的ゲル遅延アッセイにより決定することができる。キャリアーとポリヌクレオチドとの複合体形成後に、ポリヌクレオチド結合剤−細菌成分結合体を、反応混合物に加えて残りのポリヌクレオチドを中和する（例えば、Wagner等(1992)PNAS 89:6099-6103を参照されたい）。本発明の可溶性分子複合体を用いて、ポリヌクレオチドを、様々な条件下で、標的細胞に選択的に送達することができる。ポリヌクレオチドのイン・ビトロでの送達のためには、培養した細胞を、この発明の可溶性分子複合体と、細胞によるエンドサイトーシス的取込みに導く条件下でインキュベートすることができる。この分子複合体を用いて、生物から取り出し次いでその生物に戻す細胞又は組織へのポリヌクレオチドの送達をエクス・ビボで増大させることもできる。ポリヌクレオチドのイン・ビボでの送達のためには、この発明の分子複合体を製薬上許容し得るビヒクルにて生物に投与することができる。用語「製薬上許容し得るビヒクル」は、ここで用いる場合、イン・ビボ投与のために、本発明の可溶性分子複合体を安定化するための任意の生理学的に許容し得るビヒクル例えば塩溶液及び水性緩衝液を含むことを意図する。製薬上活性な物質に対してかかる媒質を使用することは、当分野では周知である。如何なる慣用の媒質でも、本発明の分子複合体と非適合性でない限り、治療用組成物におけるそれらの使用を意図する。この可溶性分子複合体は、非経口投与することができる。好ましくは、それを静脈注射する。注射用途に適した製薬組成物には、無菌水溶液が含まれる。すべての場合において、この組成物は、無菌でなければならず且つ容易に注射できる程度に流動性でなければならない。それは、製造及び貯蔵の条件下において安定でなければならず、汚染作用又は微生物例えば細菌及びカビに対して保護されなければならない。この発明を、下記の実施例によって、更に説明するが、これらの実施例は、主題発明の更なる制限と解釈すべきでない。この出願中で引用したすべての引用文献及び公表された特許出願の内容を、参考として本明細書中に援用する。実施例実施例１：可溶性分子複合体の形成ホタルPhotinus pyralisからのルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするプラスミッドＤＮＡを培養Ｈｕｈ−７細胞に送達するための可溶性分子複合体を下記のように製造した。（ａ）リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の精製ＬＬＯを、Geoffroy等(1987)Infection & Immunity 55:1641の方法に従って精製した。簡単に言えば、リステリアモノサイトジェネス１０４０３Ｓ株（ペンシルベニア大学からPortnoy博士により親切に提供された）を、鉄を含まない培地で増殖させた。培養上清を、ＰＭ膜（Amicon）を用いて、４℃で、圧力限外濾過により濃縮した。チオールプロピルセファロース４Ｂ又は６Ｂカラムを用いて、スルフヒドリル基を有しない蛋白質を除去した。最終生成物を、Toyopearl HW-5 0ゲル濾過カラムを通して精製した。各精製工程からの生成物を、Geoffroy等（前出）の方法によって溶血性について試験し、蛋白質濃度を試験して回収率のパーセンテージを測定した。各工程からの蛋白質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりチェックした。（ｂ）キャリアーの形成：アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）のポリリジン（ＰＬ）とのカップリングＡＳＯＲ−ＰＬキャリアーを、ヨウ素−１２５で標識したＡＳＯＲを、ペプチド結合を解してＰＬに化学結合させることにより形成した。この結合を、Jung， G.等(1981)Biochem.Biophys.Res.Commun.101:599-606により記載されたように、水溶性カルボジイミドを用いて形成した。このキャリアーを、分子ふるいクロマトグラフィーにより精製した。（ｃ）ＬＬＯのキャリアーへの結合ＬＬＯをＡＳＯＲ−ＰＬキャリアーに結合するために、このキャリアーを、先ず、中性ｐＨで３０分間、ＳＰＤＰ［Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート］、ＡＳＯＲ又はＰＬ上に含まれる第１アミンと反応するヘテロ二官能性の開裂可能な架橋剤（Cumber等Meth Enzymol(1985)112:207)とインキュベートすることによりチオール化した。簡単に言えば、１ｍｌのホウ酸緩衝塩溶液中の１０ｍｇのＡＳＯＲ−ＰＬに、ＤＭＳＯ中の２０ｍＭのＳＰＤＰ溶液２５μｌを加えた。未結合のＳＰＤＰは、ＰＤ−１０カラムにより除去した。次いで、等量のＳＰＤＰ−ＡＳＯＲ−ＰＬ及びＬＬＯを混合して総量を１ｍｌとし、一晩、室温で反応させた。この反応混合物を、次いで、カチオン交換ＨＰＬＣシステムに加えた。ＡＳＯＲ−ＰＬ−ＬＬＯ結合体を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．１）〜２０ｍＭ酢酸ナトリウム＋１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ５．１）の連続勾配にて４０分間にわたって溶出した。結合体は、１２分にて溶出された。全溶離液は、８ｍｌであった。導入した２−ピリジル−ジスルフィドの量を、反応生成物をジチオスレイトール（ＤＴＴ）とインキュベートすることにより測定した。遊離したピリジン−２ −チオンの濃度を、３４３ｍｍでの吸光度を測定することにより測定することができる（３４３ｎｍでのモル吸光係数＝８．０８×１０³Ｍ^-1ｃｍ^-1）。（ｄ）可溶性分子複合体の形成：ポリヌクレオチドとＡＳＯＲ−ポリリジン−ＬＬＯ結合体との非共有的複合体形成可溶性複合体を産出するＡＳＯＲ−ポリリジン−ＬＬＯ結合体のＤＮＡに対する最適な割合を測定するために、ゲル遅延アッセイを行なった。簡単に言えば、増大する量の精製ＡＳＯＲ−ポリリジン−ＬＬＯ結合体を、２４ウェル皿にて、３０分間、室温で、２．０μｇ／ウェルのプラスミッドＤＮＡ、ｐＣＭＶＬ（Ta rgeTech，Inc．）｛ＣＭＶプロモーター／エンハンサーにより駆動されるルシフェラーゼの遺伝子（De Wet等(1987)Mol.Cell Biol.7(2)725-737）を含む｝とインキュベートした。これは、ＤＮＡ複合体を静電気的様式で形成することを可能にする。各試料を、０．４５μの膜を通して濾過して使用する複合体が可溶性であることを確実にした。次いで、試料を、電気泳動のためにアガロースゲル上に載せた（例えば、Wu等 (1987)J.Biol.Chem.262:4429-32を参照されたい）。ゲル中のＤＮＡの移動を完全に遅らせた割合を、複合体形成に最適な比として選んだ。一度ＤＮＡのＡＳＯＲ−ＰＬ−ＬＬＯに対する適当な比が決定されたならば、複合体を大きいスケールで作成した。典型的には、２μｇのプラスミッドＤＮＡ（０．９％塩溶液中）と４０μｇのＡＳＯＲ−ＰＬ−ＬＬＯ結合体（０．９％塩溶液中）とを混合して総容積を２０μｌにし、室温で４０分間インキュベートして複合体を形成した。実施例２：可溶性分子複合体を用いるイン・ビトロトランスフェクションアッセイプラスミッドＤＮＡ、ｐＣＭＶＬ（TargeTech，Inc．）を含む可溶性分子複合体を、実施例１に記載の方法に従って調製した。次いで、トランスフェクションのために、複合体を、２％カルシウムを含む５００μｇの無血清ダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）に加え、０．４５μのＤｕｒａｐｏｒｅ膜（Milipore Inc .）を通して濾過し、培養Ｈｕｈ細胞（アシアロ糖蛋白質レセプター（＋））（L iang J.等(1993)J.Clin.Invest.91:1241-1246）に加えた。対照用の細胞を、ＡＳＯＲ−ＰＬ−ｐＣＭＶＬ複合体（Wu等(1988)Biopchemistry 27(3):887に従って調製した）単独で及びＡＳＯＲ−ＰＬ−ｐＣＭＶＬ複合体と遊離のリステリオリシンＯでトランスフェクトした。これらの細胞を、ＡＳＯＲ−ＰＬ−ＬＬＯ−ｐＣＭＶＬ複合体と４時間３７℃ でインキュベートし、次いで、培地を除去して１０％ウシ胎児血清を含む新鮮なＤＭＥＭで置き換えた。インキュベーションを４８時間続けた。細胞溶解物を、三連で、ルシフェラーゼ活性について、ルシフェラーゼ遺伝子発現検出用キット（Promega）を用いて光単位でアッセイした。その結果を表１に示すが、これは、ＬＬＯを含む複合体が、何らの細胞に対する毒性の形跡をも伴わずに、複合体単独又は複合体と遊離のＬＬＯよりも１００倍以上増大した遺伝子発現を生じたことを示している。細胞を複合体と遊離のＬＬＯにさらすことは、遺伝子発現の４倍増を生じただけであった。ＡＳＯＲ−ＰＬ−ＬＬＯ−ｐＣＭＶＬ複合体をＳＫＨｅｐ−１細胞（アシアロ糖蛋白質レセプター（−））にさらすことは、如何なる条件下においても、有意の発現を生じなかった（表２参照）。これは、これらの複合体が、アシアロ糖蛋白質表面レセプターに結合することにより細胞内に内在化される（これらのレセプターは、結合に次いで、エンドサイトーシスにより細胞内に内在化される）ことを示している。次いで、１００倍モル過剰の放射性標識したＡＳＯＲを用いて競争アッセイを行なって、ＡＳＯＲ−ＰＬ−ＬＬＯ−ｐＣＭＶＬ複合体の特性を測定した。これらの結果も、表１に示してある。遊離のＡＳＯＲは、効果的にＡＳＯＲ−ＰＬ− ＬＬＯ−ｐＣＭＶＬ複合体と競争して、３−ｌｏｇの活性の減少を生じた。これは、ＡＳＯＲ−ＰＬ−ＬＬＯ−ｐＣＭＶＬ複合体が非常に標的特異的である（即ち、ＡＳＯＲレセプターによってのみ取込まれる）ことを示した。実施例３：ＬＬＯのエンドソーム溶解性ペプチドこの実施例では、ｐＨ依存性の溶血活性を有するリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）のペプチドを同定した。ＬＬＯ蛋白質は、蛋白質配列に関して、ストレプトリシンＯ及びニューモリシンと相同性である。これらの３つの蛋白質において１００％保存されている１１アミノ酸のペプチド（ＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲ）（SEQ ID NO:1）は、溶解活性に必須であることが示されたユニークなシステインを含んでいる（例えば、Meng aud等(1988)Infection and Immunity 56:766-772を参照されたい）。それ故に、溶解活性を有するＬＬＯからのペプチドを得るために、この配列を含むペプチドを発現させ、下記のように試験した。リステリアモノサイトジェネスのλｇｔ１１ライブラリー（Clonetechより購入）からのＬＬＯの完全なコード領域を含むクローンを、公知のＬＬＯ配列のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて単離した。推定の活性な溶血性ドメイン（即ち、アミノ酸配列ＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲ（SEQ ID NO:1）をコードするドメイン）を含むこのクローンの２０１塩基対断片を、次いで、細菌性発現ベクター、ｐＧＥＸ−２Ｘ（Pharmacia Biotechより購入）中にサブクローン化した。その結果生成したＧＳＴ−ＬＬＯ融合蛋白質の精製を、グルタチオンを含むアガロースビーズへのＧＳＴタグの結合により達成した。トロンビンプロテアーゼ部位は、この蛋白質のＬＬＯ部分からのＧＳＴドメインの引き続く開裂を可能にした。ＬＬＯの発現したドメインを溶解活性について試験するために、ＧＳＴ−ＬＬＯ融合蛋白質を含む細菌抽出物及び精製した融合蛋白質について、下記のように溶血アッセイを行なった：血液（５ｍｌ）をパープルチューブ（３．５％クエン酸塩含有チューブ）中に吸引し、１０００ｒｐｍで５分間回転させた。次いで、血清／血漿をこの試料から除去し、赤血球（ＲＢＣ）をＰＢＳ（ｐＨ７．０）で２回洗った。２μｌのアリコートを取り、血球計で細胞を計数した。１５μｌのＲＢＣ試料についての総細胞数は、約１０⁸ＲＢＣと測定された。この１５μｌのＲＢＣ試料を、次いで、１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ６．０又は７．０）と合わせた。次いで、５μｌの細菌抽出物試料及び精製したＧＳＴ−ＬＬＯ融合蛋白質を、１５μｌのＲＢＣ試料に加えた。このＲＢＣ試料の５μｌのアリコートを負の対照として用いた。このＲＢＣ試料の１５μｌのアリコートを、１ｍｌのＨ₂Ｏを加えて、正の対照として用いた。次いで、５μｌの１ＭＤＴＴ、還元剤（ＤＴＴの終濃度＝５ｍＭ）を試験試料に加え、これらの試料を、チューブの側面を軽くたたくことにより穏やかに混合した。チューブを視覚的にチェックしてＲＢＣの混合を確実にした。試料を、３７℃の湯浴で３０〜６０分間インキュベートし、次いで、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。試料を、細胞溶解（赤い上清）について視覚的にチェックした。或は、光学密度（ＯＤ）測定を、Ａ５３０ｎｍにて行なうことができた。結果ＧＳＴ−ＬＬＯ融合蛋白質を含む細菌抽出物は、赤血球の溶解について陽性であった。精製した融合蛋白質も又、溶血活性を有し、これは、この活性が細菌抽出物中の成分によるものではないことを示した。この融合蛋白質のＧＳＴ部分のみを生成する細菌からの抽出物は、溶血活性について陰性であり、これは、この活性が融合蛋白質のＬＬＯ部分によることを示唆している。これらの結果は、溶解活性（即ち、細胞又はエンドソームを溶解させる能力）を有するＬＬＯの断片が、組換えにより製造可能であることを示している。これらのＬＬＯの断片を、次いで、実施例１に記載のように、完全長のＬＬＯ蛋白質の代わりに、この発明の分子複合体に取込ませることができる。同等物当業者は、ここに記載した特定の手順に対する多くの同等物を認識することができ、又は常例的実験を用いて確認することができるであろう。かかる同等物は、この発明の範囲内にあると考えられ、後述の請求の範囲にカバーされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者ウー，ジョージワイ. アメリカ合衆国 06001 コネティカット, エイボン，リッジバリーロード 52 (72)発明者ウー，キャサリンエイチ. アメリカ合衆国 06001 コネティカット, エイボン，リッジバリーロード 52 (72)発明者ジァング，インアメリカ合衆国 06032 コネティカット, ファーミントン，トールコットフォレストロード４，アパートメントナンバー４エフ (72)発明者スピタルニー，ジョージエル. アメリカ合衆国 06410 コネティカット, チェシア，ブルックフィールドコート６ (72)発明者カーマイケル，エレンアメリカ合衆国 06117 コネティカット, ウエストハートフォード，リッチモンドレイン 103

Claims

【特許請求の範囲】１．特定の細胞をポリヌクレオチドの標的とするための可溶性分子複合体であって、下記を含む該可溶性分子複合体：ａ）ポリヌクレオチド；ｂ）ポリヌクレオチド結合剤と、細胞の表面分子に結合してエンドソーム内に内在化される細胞特異的結合剤とからなるキャリアー；及びｃ）エンドソームを溶解させて、細胞の細胞質へのポリヌクレオチドの遊離を生じさせる細菌成分。２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載の可溶性分子複合体。３．ポリヌクレオチドが、標的細胞による遺伝子産物の発現に必要な適当な遺伝子調節要素に結合された遺伝子を含む、請求項１に記載の可溶性分子複合体。４．ポリヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の可溶性分子複合体。５．ポリヌクレオチドが、細胞中のＲＮＡに対するリボザイムである、請求項１に記載の可溶性分子複合体。６．ポリヌクレオチド結合剤がポリリジンである、請求項１に記載の可溶性分子複合体。７．細胞特異的結合剤がアシアロ糖蛋白質である、請求項１に記載の可溶性分子複合体。８．細菌成分がエンドソームへの内在化に際して活性化される、請求項１に記載の可溶性分子複合体。９．細菌成分がｐＨ依存性である、請求項１に記載の可溶性分子複合体。１０．細菌成分がチオール活性化される、請求項１に記載の可溶性分子複合体。１１．細菌成分がリステリオリシンＯである、請求項１に記載の可溶性分子複合体。１２．特定の細胞をポリヌクレオチドの標的とするための可溶性分子複合体であって、下記を含む該可溶性分子複合体：ａ）ポリヌクレオチド；ｂ）ポリリジン及びアシアロ糖蛋白質からなるキャリアー；及びｃ）リステリオリシンＯ。１３．リステリオリシンＯがジスルフィド結合によりキャリアーに結合されている、請求項１２に記載の可溶性分子複合体。１４．請求項１に記載の分子複合体及び製薬上許容し得るキャリアーを含む薬剤投与に適した組成物。１５．ポリヌクレオチドを特定の細胞に送達する方法であって、その細胞を下記よりなる可溶性分子複合体と接触させることを含む該方法：ａ）ポリヌクレオチド；ｂ）ポリヌクレオチド結合剤と、細胞の表面分子に結合してその細胞のエンドソームに内在化される細胞特異的結合剤とからなるキャリアー及びｃ）エンドソームを溶解させて、その細胞の細胞質へのポリヌクレオチドの遊離を生じる細菌成分。１６．ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１５に記載の方法。１７．ポリヌクレオチドが、標的細胞による遺伝子産物の発現に必要な適当な遺伝子調節要素と結合した遺伝子を含む、請求項１５に記載の方法。１８．ポリヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１５に記載の方法。１９．ポリヌクレオチドが細胞内のＲＮＡに対するリボザイムである、請求項１５に記載の方法。２０．ポリヌクレオチド結合剤がポリリジンである、請求項１５に記載の方法。２１．リガンドがアシアロ糖蛋白質である、請求項１５に記載の方法。２２．細菌成分がエンドソームへの内在化に際して活性化される、請求項１５に記載の方法。２３．細菌成分がｐＨ依存性である、請求項１５に記載の方法。２４．細菌成分がチオール活性化される、請求項１５に記載の方法。２５．細菌成分がリステリオリシンＯである、請求項１５に記載の方法。２６．ポリヌクレオチドを特定の細胞に送達する方法であって、その細胞を下記を含む可溶性分子複合体と接触させることを含む該方法：ａ）ポリヌクレオチド；ｂ）ポリリジン及びアシアロ糖蛋白質よりなるキャリアー；及びｃ）リステリオリシンＯ。２７．リステリオリシンＯがジスルフィド結合によりキャリアーに結合されている、請求項２６に記載の方法。２８．生物の特定の細胞へのポリヌクレオチドのイン・ビボ送達の方法であって、請求項１４に記載の組成物をその生物に投与することを含む該方法。２９．特定の細胞をポリヌクレオチドの標的とするための可溶性分子複合体であって、下記を含む該可溶性分子複合体：ａ）ポリヌクレオチド；ｂ）ポリヌクレオチドに非共有的に結合するポリカチオンと細胞特異的結合剤とからなるキャリアー；及びｃ）エンドソーム溶解活性を有する細菌成分の断片。３０．細菌成分がリステリオリシンＯである、請求項２９に記載の複合体。