JP2003530360A - 薬剤送達のためのペプチド複合体 - Google Patents

薬剤送達のためのペプチド複合体

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Abstract

(57)【要約】 細胞膜を通して移行可能なペプチドおよび治療薬物の複合体。上記ペプチドは、細胞内への移行に必要なシグナルを提供する規定のアミノ酸配列を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 ［発明の分野］ 本発明は、特に、ヒストン−治療薬物複合体の形態にある（しかし、これに限
定されない）、移行（トランスロケーション）剤としてのタンパク質調製物に関
する。
【０００２】 ［発明の背景］ 遺伝子治療は、一定の遺伝病を治癒する潜在能力を提供する。しかしながら、
主な障害として、標的部位へ所定の遺伝子またはタンパク質を効果的に送達する
ことがある。ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ戦略により、様々な細胞、組
織および器官へ、遺伝子または遺伝子産物を送達するための、様々なウイルスベ
クターおよび非ウイルスベクターが開発されてきた。ウイルス系ベクターの中で
は、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびヘルペスウ
イルスが最も広範に研究されてきた。非ウイルス系ベクターの中では、リポソー
ムおよびカチオン脂質媒介性の系が、プラスミドＤＮＡを直接的に動物に導入す
るために使用されてきた。しかしながら、遺伝子治療の主な挑戦の１つは、依然
として効果的な送達系の設計である。
【０００３】 ヒストンもまた、トランスフェクションによる遺伝子送達の媒体として使用す
ることが提案されている。ヒストンは、真核生物における染色体のヌクレオソー
ムの編成に重要な役割を果たすタンパク質である。コアヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ
、Ｈ３およびＨ４は、ヌクレオソームのコア構造を形成し、リンカーヒストンＨ
１は、ヌクレオソームのコアにある２回転のＤＮＡを固定する。
【０００４】 Zaitsev et al, Gene Therapy (1997) 4, 586-592は、ヒストンを含むある種
の核タンパク質を開示しており、それはトランスフェクションによるＤＮＡキャ
リアとして作用させるために調製され得る。開示した例は、高いトランスフェク
ション効率を得るために必要とされるカルシウムイオンを含む血清含有培地中で
調製されるヒストンＨ１である。クロロキンもまた、効率的なトランスフェクシ
ョンを得るために含まれている。しかしながら、血清、カルシウムイオンおよび
クロロキンの存在のため、この配合物は臨床用途には不適切である。
【０００５】 Haberland et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1999; 1445: 21-30は、
高いトランスフェクション効率を達成するために、ヒストンはＣａ2+を必要とす
ることを開示している。Ｃａ2+の非存在下では、クロロキンが必要とされた。
【０００６】 欧州特許第Ａ−０９０８５２１号は、細胞へ核酸を導入させるためのトランス
フェクション系を開示する。トランスフェクションは、ポリヌクレオチドに結合
した後、細胞にＤＮＡを導入するヒストンを用いて達成される。
【０００７】 Fritz et al., Human Gene Therapy, 1996; 7:1395-1404もまた、ＤＮＡをト
ランスフェクトするために、ＤＮＡ結合ヒストンを使用する。しかしながら、こ
の系はまた、トランスフェクション効率を高めるために、リポフェクチンを必要
とする。リポフェクチンは毒性があり、治療上の用途には一般的に適さない。
【０００８】 Schwartz et al., Gene Therapy, 1999; 6:282-292は、カチオン脂質に基づい
たトランスフェクション系を開示している。この系は、輸送されるべきＤＮＡが
、ヒストンペプチドを用いてまず緊密化することが必要とされる。次に、緊密化
されたＤＮＡ／ヒストン複合体を、カチオン脂質と接触させ、トランスフェクシ
ョンプロセスにて使用される。
【０００９】 国際特許公開第Ａ−８９／１０１３４号は、血液脳関門を通じて神経ペプチド
を送達するためのキメラペプチドを開示している。キメラペプチドは、トランス
サイトーシスを介して血液脳関門を通過することが可能な神経ペプチドおよびペ
プチドを含む。ヒストンは、この基準を満たすペプチドとして言及される。キメ
ラペプチドは、血液脳関門を通過する際に、結合が破壊されて神経ペプチドを放
出するように、化学的結合により生産される。神経ペプチドは、細胞外受容体上
で作用して、その治療効果を発揮し、神経細胞に侵入することはない。
【００１０】 ［発明の概要］ 本発明は、特定アミノ酸モチーフを含むヒストンタンパク質および特定アミノ
酸モチーフを含むその他のタンパク質またはペプチドを調製することができ、そ
れを細胞膜を通して治療薬剤を移行させるために用いることができるという驚く
べき知見に基づいている。
【００１１】 本発明の一態様によれば、細胞膜を通して移行可能なペプチドと治療薬物また
は診断薬物との複合体が存在し、この場合、ペプチドは配列番号１として示され
るアミノ酸配列を含む。
【００１２】 複合体は、好ましくは細胞内で作用する神経ペプチドを治療薬物として含まな
い。
【００１３】 意外にも、アミノ酸配列番号１を含むペプチドおよびタンパク質、例えばヒス
トンＨ１は、そのヒストンと共有結合した治療薬剤または診断薬剤を、移行によ
り細胞内に送達することができるように作用し得ることが判明した。これは、Ｄ
ＮＡのトランスフェクションにおけるヒストンの従来の使用（移行に依存しない
）と対照をなしており、従来の使用では、ＤＮＡはヒストンと共有的に結合せず
、ヒストンを用いて他の治療薬、例えばタンパク質または化学化合物を細胞の内
側に送達し得ることは示されてこなかった。それは、国際特許公開第Ａ−９８／
１０１３４号の開示とも対照をなしており、この開示では、受容体媒介性トラン
スサイトーシスを用いて血液−脳関門を通して神経ペプチドを送達するが、細胞
内に送達がされることは示唆されていない。さらに、慣用的転位作用物質、例え
ばｔａｔ、ＶＰ２２またはアンテナペディアと違って、本発明では、ヒト送達ペ
プチド（例えばヒトヒストンからの）を移行因子として用いることができるので
、それにより非ヒトペプチドの使用に起因し得る免疫学的副作用の危険を低減す
る。
【００１４】 本発明の第二の態様によれば、細胞内でその治療効果を発揮する治療薬剤は疾
患を治療または診断するための組成物を製造するのに用いられるが、この場合、
薬剤は、配列番号１として本明細書中で同定されているアミノ酸配列を含むペプ
チドに結合される。
【００１５】 本発明の第三の態様によれば、上記の複合体は疾患を治療または診断するため
の組成物を製造するのに用いられるが、この場合、疾患は神経的障害に関連しな
い。
【００１６】 本発明の第四の態様によれば、融合タンパク質の形態で本発明の複合体を発現
する発現ベクターが調製される。
【００１７】 ［発明の説明］ 本発明は、細胞中へ、または細胞内区画を横断して薬剤が進入するために、細
胞膜を通して治療薬剤を輸送する能力を有する複合体を提供する。
【００１８】 本発明の状況では、「移行」という用語は、細胞膜を横切る、すなわち細胞に
進入する薬剤の能力を指す。「トランスフェクション」という用語は、細胞の内
側へのポリヌクレオチド、例えばＤＮＡの送達を指し、通常は取込み機構、例え
ば細胞表面の受容体を介して実行される。
【００１９】 「複合体」という用語は、転位ペプチドと、治療薬物または診断薬物とから形
成されるキメラ分子を指す。ペプチドと薬物とは共有的に結合し、これは本発明
の複合体を、ＤＮＡと非共有結合させていた従来技術のものと区別する。共有結
合は、化学リンカー分子の形態であり得るか、または融合タンパク質の形態であ
り得る。
【００２０】 「ペプチド」という用語は、本明細書中で用いる場合、ペプチドおよびタンパ
ク質の両方を指すよう意図される。
【００２１】 本発明は、ヒストンが細胞膜を通して移行することができるという驚くべき知
見に基づく。特に、重要なアミノ酸配列は、移行がうまくいくために重要である
とここに同定された。重要な配列を以下に示す： ＬｙｓＬｙｓＸ1Ｘ2Ｌｙｓ 配列番号１ （ただし、Ｘ1は好ましくはアラニンまたはプロリンであり、 Ｘ2はリシンまたはアルギニンである）。
【００２２】 この配列の同定により、ヒストン由来のものだけでなく多数の異なるペプチド
の産生が可能になる。
【００２３】 しかしながら、ヒストン、特にヒトヒストンが好ましい。配列番号１を含むす
べてのヒストンが用いられ得るが、ヒトヒストンＨ１を用いるのが好ましい。Ｈ
１ヒストンは多数の異なるアイソフォームで存在するが、これらの間には高レベ
ルの配列相同性が存在する。適切なヒトＨ１ヒストンのアミノ酸配列は、Albig
et al., Genomics, 1991; 10(4):940-948で同定されている。配列も、ＮＣＢＩ
データベース（ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号Ｍ６０７４８）で入手可能である。
【００２４】 ヒストンは切断形態、好ましくは以下で同定される形態でもあり得る。ヒスト
ンが切断形態であると、時間のかかる高価な精製過程を経る必要なしに、容易に
合成物を産生することができる。切断形態は、組換え発現系において、すなわち
組換え体哺乳類発現系または組換え細菌発現系においてより容易に産生されるこ
とも見出された。さらに、切断形態のヒストン（または任意の小ペプチド）は低
免疫原性であり、したがって治療薬の投与に、より適している。
【００２５】 ヒストンタンパク質の機能的変異体も用いられ得る。例えば、高レベルの（７
０％超、好ましくは９０％超）配列類似性または同一性を有するタンパク質は、
本発明の範囲内である。変異体は、標準的な組換えＤＮＡ技術、例えば部位特異
的突然変異誘発を用いて産生され得る。変異体は、保存的アミノ酸置換基（重要
なアミノ酸配列中ではない）を有し得る。例えばある疎水性残基を、異なる疎水
性残基に置換し得る。これはすべて、慣用的タンパク質技術に基づいて、当業者
には明らかである。変異体は、細胞膜を通して移行する機能的能力を保持しなけ
ればならない。
【００２６】 好ましい実施形態では、ペプチド断片は５０個以下、好ましくは４０個以下、
最も好ましくは３０個以下のアミノ酸残基である。本発明に用いるのに適したペ
プチドは、配列番号２〜９として本明細書中で同定される配列を含むかまたはそ
れからなる。
【００２７】 ペプチドは、２個以上の限定配列モチーフを含み、例えば２個または３個のモ
チーフが存在し得る。
【００２８】 ペプチドは、高パーセンテージの、典型的には５％より高い、好ましくは１０
％より高いパーセンテージのリシンおよびアルギニン残基も含み得る。
【００２９】 ヒストンについて保存アミノ酸置換がされた配列、または本明細書中で同定さ
れた配列（配列番号１以外）も、本発明の範囲内である。保存アミノ酸置換は、
例えばある疎水性アミノ酸を異なる疎水性アミノ酸に置換するものである、と当
業者は理解するであろう。
【００３０】 本明細書中で同定されたペプチドのほかに、複合体は、別個の治療薬物または
診断薬物を含む。本発明の状況では、「療法」または「治療薬」に対する言及は
、予防的治療、例えばワクチン接種も含む。適切な治療薬物および診断薬物の例
としては、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、抗体、酵素、抗原、成長
因子、ホルモンおよび造影剤が挙げられる。
【００３１】 タンパク質治療薬物は、好ましくは少なくとも１００アミノ酸長である。本発
明は、より長い配列、例えば少なくとも１５０、２００、３００、４００または
１０００アミノ酸長のタンパク質治療薬物に関して特に有用である。「タンパク
質」という用語は、本明細書中で用いる場合は、必要な長さのポリペプチドも含
むことを明確にしておく。しかし「ポリペプチド」という用語は一般に、２〜１
００アミノ酸長、通常は２〜６０のアミノ酸長の配列を意味する。
【００３２】 治療薬物は、核酸、例えばレポーター遺伝子を含み得る。核酸は、ＤＮＡまた
はＲＮＡであり得る。
【００３３】 核酸は、治療薬物、例えば酵素、毒素、免疫原等をコードし得るか、あるいは
それ自体が治療薬物であり得る。例えば治療薬物としてアンチセンスＲＮＡを用
いて、遺伝子を標的とし、その発現を破壊し得る。これはすべて、当業者には明
らかである。
【００３４】 治療薬物は、化学化合物、すなわち有機または無機分子でもあり得る。任意の
適切な薬理学的作用物質は、本発明の範囲内である。好ましい化学分子としては
、細胞傷害剤および成長因子が挙げられる。
【００３５】 治療薬物は細胞の外側にその作用部位を有する神経ペプチドでないことが好ま
しい。神経薬理学的作用物質は、複合体の一部として用いられ得るが、それは細
胞内でその治療効果を発揮すべきである。したがって、細胞外で、例えば細胞表
面受容体で作用する神経ペプチドは好ましくない。本発明の複合体は移行を対象
とし、したがって治療薬物の作用部位は細胞内である、ということは明らかであ
る。
【００３６】 本発明の複合体は、当業者に既知の技術により生成され得る。ペプチドおよび
薬物は、共有結合により連結される。一実施形態では、薬物はペプチド（または
タンパク質）であり、複合体は融合タンパク質である。融合タンパク質の産生は
当業者には既知であり、枠内でペプチドおよび薬物の両方をコードする組換えポ
リペプチドの産生を含む。例えば、適切な複合体をコードする核酸は、さらなる
操作のために適切な発現ベクター中に組み入れられ得る。本明細書中で用いる場
合、ベクター（またはプラスミド）とは、核酸の発現または複製をさせるべく、
細胞中に異種ＤＮＡを導入するために用いられる別個の素子を指す。このような
ビヒクル（Ｖｅｈｉｃｌｅ）の選定および使用は、当業者に既知である。多数の
ベクターが利用可能であり、適切なベクターの選定は、ベクターを使用する意図
（例えばそれがＤＮＡ増幅のために用いられるのか、あるいはＤＮＡ発現のため
に用いられるのか）、ベクター中に挿入されるＤＮＡのサイズ、およびベクター
で形質転換される宿主細胞に依存している。各ベクターは、その機能（ＤＮＡの
増幅またはＤＮＡの発現）およびそれが適合する宿主細胞によって、種々の構成
成分を含む。ベクターの構成成分としては一般に、１つまたはそれ以上の、以下
のものがあげられるが、これらに限定されない：複製の起点、１つまたはそれ以
上の標識遺伝子、エンハンサー素子、プロモーター、転写終結配列およびシグナ
ル配列。
【００３７】 複合体は、ペプチドおよび薬物と反応可能な二官能性試薬の使用によっても産
生され得る。例えば、ペプチドおよび薬物の接合は、ジスルフィド架橋を形成す
る試薬、例えばＮ‐スクシンイミジル３−（２−ピリジル−ジチオ）プロピオネ
ート（ＳＰＤＰ）により達成される。代替的複合試薬としては、グルタルアルデ
ヒド、シスタミンおよびＥＤＡＣが挙げられる。
【００３８】 好ましくは、薬物は切断可能なリンカー領域によりペプチド領域に連結される
。好ましくは切断可能なリンカーは、プロテアーゼ−によって切断可能なリンカ
ーであるが、例えば小分子により切断可能である他のリンカーも用いられ得る。
これらの例としては、Ｍｅｔ−Ｘ部位（臭化シアンにより切断可能）、Ａｓｎ−
Ｇｌｙ（ヒドロキシルアミンにより切断可能）、Ａｓｐ−Ｐｒｏ（弱酸により切
断可能）およびＴｒｐ−Ｘ（特にＮＢＳ−スカトールにより切断可能）が挙げら
れる。プロテアーゼによる切断部位は切断に必要な条件がより穏やかであるため
に好ましく、例えば因子Ｘａ、トロンビンおよびコラゲナーゼで切断することが
できる。これらのいずれかが用いられ得る。精確な配列が当業界で利用可能であ
り、適切な切断部位を選定することは当業者には難しくない。例としては、因子
Ｘａによりターゲッティングされるプロテアーゼ切断領域は、ＩＥＧＲである。
エンテロキナーゼによりターゲッティングされるプロテアーゼ切断領域は、ＤＤ
ＤＤＫである。トロンビンによりターゲッティングされるプロテアーゼ切断領域
は、ＬＶＰＲＧである。好ましくは切断可能なリンカー領域は、細胞内のプロテ
アーゼによりターゲッティングされるものである。
【００３９】 複合体には、さらなる細胞輸送シグナルが存在し得る。例えば核局在化シグナ
ルは、構築物の付加的構成成分であり得る。これは、正しい細胞内部位へ治療構
成成分を送達することを助け得る。適切なシグナルは既知であり、従来技術にお
いて同定されている。
【００４０】 本発明の組成物および構築物を治療的に使用することを意図することは明らか
である。
【００４１】 本発明の複合体に関する用途を以下に挙げる：
【００４２】 １．抗原送達系 １．抗原は、免疫適格動物中に導入されると、抗原と結合しうる単数または複
数の特異的抗体の産生を刺激する任意の作用物質である。しかしながら、抗原は
、抗体産生を刺激することができるキャリアまたは特異的Ｔ細胞（ヘルパーまた
は細胞傷害性）と結合する必要がある。これは、本発明が、抗体産生を刺激でき
るよう、細胞膜の片側から他の側へ抗原を輸送するためのキャリアとして有用で
あり得る場合である。例としては、細胞質中へ複合体により移行した細菌抗原お
よびウイルス抗原はプロセシングされ、ＭＨＣクラス１分子と会合され得る。こ
の抗原プロセシングおよび提示経路は、特定のＣＤ８細胞傷害性リンパ球を活性
化することが既知である。
【００４３】 ２．遺伝子治療 遺伝子治療としては、以下のうちの任意の１つまたはそれ以上のものが挙げら
れる：例えば１つまたはそれ以上の標的部位（例えば標的細胞）中の１つまたは
それ以上のヌクレオチド配列の付加、置換、欠失、補充、操作等。標的部位が標
的細胞である場合には、細胞は組織または器官の一部であり得る。遺伝子治療に
関する一般的教示は、Molecular Biology, Ed Robert Meyers, Pub VCHの例えば
５５６〜５５８ページに見出され得る。
【００４４】 さらなる例としては、遺伝子治療は、下記の任意の１つまたはそれ以上を達成
する手段も提供し得る：ヌクレオチド配列、例えば遺伝子が欠陥遺伝子と置換す
るかまたは欠陥遺伝子に補充するために適用され得る；病原性ヌクレオチド配列
、例えば遺伝子またはその発現産物が排除され得る；例えばより好ましい表現型
を作成するために、ヌクレオチド配列、例えば遺伝子またはその発現産物が付加
または導入され得る；ヌクレオチド配列、例えば遺伝子またはその発現産物が、
例えば選択目的（すなわち形質転換していない細胞を上回る形質転換した細胞な
どを選択するために）で、付加または導入され得る；疾患状態、例えば癌（Schm
idt-Wolf and Schmidt-Wolf, 1994, Annals of Hematology 69:273-279）または
その他の疾患状態、例えば免疫、心臓血管、神経学的炎症または感染性障害を治
療、治癒または予防するために、分子レベルで細胞が操作され得る；免疫応答を
誘発するために抗原が操作および／または導入（例えば遺伝子ワクチン接種）さ
れ得る。特に好ましい実施形態では、組成物は、遺伝的欠損細胞型の細胞質中に
機能性タンパク質を導入するために用いられ得る。
【００４５】 ３．癌治療 組成物は、転写因子である分子を癌細胞中に輸送するために用いられ、細胞周
期制御を回復するかまたは分化を誘導することができる。例えば、多数の癌細胞
は、機能性Ｐ−５３分子がそれらの細胞質中に導入されると、アポトーシスを受
けると理解されている。本発明は、このような遺伝子産物を送達するために用い
られ得る。
【００４６】 ４．抗細菌治療および抗ウイルス治療 例えば、組成物は、感染細胞の細胞質中に、細菌またはウイルス複製にとって
きわめて重大なステップを妨害する組換え抗体または付加的ＤＮＡ結合分子を輸
送するために用いられ得る。
【００４７】 ５．発現系中での使用 例えば、正常にプロセシングされるよう、真核生物細胞中で外因性タンパク質
を発現するのが望ましい。しかしながら、多数の外因性タンパク質は、真核生物
細胞に対して毒性がある。したがって、外因性タンパク質を製造する場合は、外
因性タンパク質を一時的に発現させるのが望ましい。したがってその系は、この
ような系を含むこの用途または任意のその他の用途のために、誘導可能プロモー
ターと関連して用いられ得る。
【００４８】 ６．タンパク質分類
【００４９】 ７．ＤＮＡ合成
【００５０】 ８．対比画像処理
【００５１】 適切な造影剤は、画像処理を実行させるために複合体の一部であり得る。
【００５２】 本発明の複合体を含む組成物は、薬学的に許容なキャリア、希釈剤、賦形剤ま
たはアジュバントを任意に含み得る。製剤キャリア、賦形剤または希釈剤の選定
は、意図された投与経路および標準製剤実施型に従って選定され得る。薬学的組
成物は、任意の適切な結合剤（単数または複数）、潤滑剤（単数または複数）、
懸濁剤（単数または複数）、被覆剤（単数または複数）、可溶化剤（単数または
複数）および標的部位への進入を助けるかまたは増大し得るその他のキャリア剤
をさらに含み得る。
【００５３】 組成物は、任意の投与経路に、例えば筋内、静脈内、皮内または皮下投与に適
用され得る。組成物が血清、カルシウムおよびクロロキンを含有しない場合が好
ましい。これは、血清、カルシウムまたはクロロキンがトランスフェクションス
テップにおいて存在する従来技術とさらに相違する点である。
【００５４】 本発明による１つまたはそれ以上の治療用遺伝子または治療用タンパク質の送
達は、単独で、あるいは他の治療または治療の構成要素と併用して実施されても
よい。治療され得る疾患としては、癌、細胞内に薬物が必要とされる神経疾患、
遺伝性疾患、心臓疾患、発作、関節炎、ウイルス感染および免疫系疾患が挙げら
れるが、これらに限定されない。適切な治療用遺伝子としては、腫瘍抑制因子タ
ンパク質、酵素、プロドラッグ活性化酵素、免疫調節分子、抗体、改変免疫グロ
ブリン様分子、複合体、ホルモン、膜タンパク質、血管作動性タンパク質または
ペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗ウイルスタンパク質、アンチセンスＲ
ＮＡおよびリボザイムをコードする遺伝子が挙げられる。
【００５５】 患者に投与されるべき量は、通常の要因：患者の年齢、体重、状態の重篤性、
投与経路、治療薬の活性等に依存するであろう。このすべてが、当業者に既知の
従来法により決定され得る。
【００５６】 以下の実施例で、本発明を説明する。
【００５７】 実施例１ この実施例に用いられるヒストンタンパク質は、すべてヒトリンカーヒストン
Ｈ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号Ｍ６０７４８）に由来する。Ｈ１．４断片およ
び亜断片（配列番号２〜９として同定される）を、細菌発現ベクター中でクロー
ニングした。検出および精製のために、ヒストン遺伝子またはその亜断片のＮま
たはＣ末端部分にタグを挿入した。Ａ６ｘヒスチジンタグをヒストン配列のＮ末
端に入れ、ニッケルカラム（Quiagen）を通すアフィニティークロマトグラフィ
ーにより所望のタンパク質を精製するために用いた。第二タグは、ｃ−ｍｙｃエ
ピトープ（商業的供給元から入手可能な既知のペプチドタグ）に対応し、組換え
タンパク質を免疫蛍光検出するために用いられた。
【００５８】 各組換えタンパク質を変性条件下でニッケルカラムを通して精製し、２０ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．５ｍのＮａＣｌを含む０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０に対して透析したが、ただしＨ１．４全長ヒストンは、０．１Ｍリン酸塩緩
衝液（ｐＨ４．７）の透析緩衝液を必要とした。
【００５９】 移行手法： １０％ＦＣＳを補充した、またはＦＣＳの非存在下でのＲＰＭＩ１６４０中に
５０〜８０％集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）で、ＨｅＬａ細胞を接種した。各タ
ンパク質を細胞培地に添加し、３７℃で３時間インキュベートさせた。ｃ−Ｍｙ
ｃ抗体（Sigma）を用いた免疫検出により、タンパク質の移行を確認した。
【００６０】 配列番号１を含むペプチドは形質膜を通して移行可能であることが判明した。
【００６１】 実施例２ 別個の実験で、２つの合成ペプチドを産生し、ビオチン分子と共有的に結合さ
せた。配列を以下に示す： ビオチン−スペーサー−TPKKASSPAAAAGAKKAKSP−アミド 配列番号１０ ビオチン−スペーサー−TPKKAKKPAAAAGASSAKSP−アミド 配列番号１１
【００６２】 ビオチンタグを蛍光標識アビジンと反応させることにより、移行に関して合成
ペプチドを査定した。
【００６３】 配列番号１０を用いて、配列モチーフ中のＫＫをＳＳのに置換すると移行効率
が変わるか否かを試験した。この配列を用いた場合、移行は観察されなかった。
【００６４】 配列番号１１は、配列モチーフ、およびさらにＫ残基を置換する２つのさらな
るＳ残基も含む。移行が観察された。
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年４月５日（２００２．４．５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１４】 前記複合体は、治療または診断のために用いられる、請求
項１〜１３のいずれかに記載の複合体。
【請求項１５】 疾患を治療するための組成物の製造における、細胞内でそ
の治療効果を発揮する治療薬物の使用であって、該治療薬物は、請求項１で規定
されるアミノ酸配列を含むペプチドに接合される使用。
【請求項１６】 疾患を治療または診断するための組成物の製造における、
細胞膜を通して移行可能なペプチドと、治療薬物または診断薬物との複合体の使
用であって、該ペプチドは請求項１で規定されるアミノ酸配列を含むが、該疾患
は神経的障害でない使用。
【請求項１７】 前記複合体は、請求項２〜１３のいずれかで規定される、
請求項１５または請求項１６記載の使用。
【請求項１８】 筋内投与をするための、請求項１５〜１７のいずれかに記
載の使用。
【請求項１９】 前記組成物は、カルシウム、血清またはクロロキンを含ま
ない、請求項１５〜１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】 請求項７記載の融合タンパク質をコードする発現ベクター
。
【請求項２１】 請求項２０記載の発現ベクターを含む組換え細胞系。
【請求項２２】 細胞膜を通して送達可能な治療薬剤または診断薬剤の製造
方法であって、請求項１で規定されるペプチドに前記薬物を共有結合することを
含む方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 29/00 29/00 31/04 31/04 31/12 31/12 35/00 35/00 37/02 37/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 エッセガー，セルマ イギリス ロンドン エスダブリュ７ ２ エーゼット インペリアル カレッジ ロ ード インペリアル カレッジ オブ サ イエンス テクノロジー アンド メディ シン Ｆターム(参考） 4C076 AA95 BB15 CC01 CC07 CC11 CC27 CC32 CC35 CC42 EE41 EE59 FF34 4C084 AA02 AA03 AA13 BA44 MA66 NA13 ZA361 ZB051 ZB112 ZB261 ZB331 ZB351 4C085 HH01 KA36 KB82 4C086 AA01 AA02 EA16 MA02 MA05 MA66 NA13 ZA36 ZB05 ZB11 ZB26 ZB33 ZB35

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞膜を横切って移行可能であるペプチドと、治療薬物また
    は診断薬物との複合体であって、該ペプチドがアミノ酸配列ＫＫＸ1Ｘ2Ｋ（ただ
    し、Ｘ1＝ＡまたはＰ、かつＸ2＝ＫまたはＲである）を含む複合体。
  2. 【請求項２】 前記薬物は、治療タンパク質である、請求項１記載の複合体
    。
  3. 【請求項３】 前記薬物は、神経ペプチドでない、請求項１記載の複合体。
  4. 【請求項４】 前記薬物は、ポリヌクレオチド分子である、請求項１記載の
    複合体。
  5. 【請求項５】 前記薬物は、造影剤である、請求項１記載の複合体。
  6. 【請求項６】 前記薬物は、細胞内において治療活性が発現する、請求項１
    または請求項２記載の複合体。
  7. 【請求項７】 前記複合体は、融合タンパク質である、請求項１〜３のいず
    れかに記載の複合体。
  8. 【請求項８】 前記薬物は、化学リンカー分子を介してペプチドに接合され
    る、請求項１〜４のいずれかに記載の複合体。
  9. 【請求項９】 前記ペプチドは、少なくとも２０個のアミノ酸を含む、請求
    項１〜８のいずれかに記載の複合体。
  10. 【請求項１０】 前記ペプチドは、ヒストンまたはその断片である、請求項
    １〜９のいずれかに記載の複合体。
  11. 【請求項１１】 前記ペプチドは、ヒトヒストンＨ１またはその断片である
    、請求項１〜１０のいずれかに記載の複合体。
  12. 【請求項１２】 前記ペプチドは、配列番号２〜９として特定されるヒスト
    ン断片のいずれかを含むか、またはそれらからなる、請求項１〜１１のいずれか
    に記載の複合体。
  13. 【請求項１３】 前記複合体は、治療または診断のために用いられる、請求
    項１〜１２のいずれかに記載の複合体。
  14. 【請求項１４】 疾患を治療するための組成物の製造における、細胞内でそ
    の治療効果を発揮する治療薬物の使用であって、該治療薬物は、請求項１で規定
    されるアミノ酸配列を含むペプチドに接合される使用。
  15. 【請求項１５】 疾患を治療または診断するための組成物の製造における、
    細胞膜を通して移行可能なペプチドと、治療薬物または診断薬物との複合体の使
    用であって、該ペプチドは請求項１で規定されるアミノ酸配列を含むが、該疾患
    は神経的障害でない使用。
  16. 【請求項１６】 前記複合体は、請求項２〜１２のいずれかで規定される、
    請求項１４または請求項１５記載の使用。
  17. 【請求項１７】 筋内投与をするための、請求項１４〜１６のいずれかに記
    載の使用。
  18. 【請求項１８】 前記組成物は、カルシウム、血清またはクロロキンを含ま
    ない、請求項１４〜１７のいずれかに記載の使用。
  19. 【請求項１９】 請求項７記載の融合タンパク質をコードする発現ベクター
    。
  20. 【請求項２０】 請求項１９記載の発現ベクターを含む組換え細胞系。
  21. 【請求項２１】 細胞膜を通して送達可能な治療薬剤または診断薬剤の製造
    方法であって、請求項１で規定されるペプチドに前記薬物を共有結合することを
    含む方法。
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