JPH10505835A

JPH10505835A - 特定の細胞型への化学試薬の細胞内送達

Info

Publication number: JPH10505835A
Application number: JP8510273A
Authority: JP
Inventors: プラカシュ，ラメシュ・ケイ
Original assignee: セラテック・インコーポレーテッド
Priority date: 1994-09-13
Filing date: 1995-09-12
Publication date: 1998-06-09
Also published as: AU697469B2; CN1157570A; PL319100A1; HUT77263A; ZA957688B; AU3550795A; CZ74797A3; WO1996008263A1; MX9701860A; CA2198361A1; KR970705404A; BR9508951A; EP0781139A1

Abstract

(57)【要約】化学試薬に結合され、ＣＲ２受容体を結合しおよびエンドサイトーシスを誘導するリガンド（ＣＢＥＬ）を含む、ＣＲ２受容体を持つ細胞内への化学試薬の特異的細胞内送達のための組成物。ＣＢＥＬはＣＲ２受容体に結合し、組成物のエンドサイトーシスを惹起する。随意に、組成物はＣＢＥＬの化学試薬への結合のためにスペーサー（生分解可能であってもまたは生分解可能でなくてもよい）を含むことができる。化学試薬は細胞毒素、形質転換核酸、遺伝子調節物質、標識、抗原、薬剤などを含むことができる。組成物はさらに水溶性ポリマー、リポソームまたは粒子状物のような担体を含むことができる。インビボまたはインビトロで化学試薬送達のためにこれらの組成物を使用する方法もまた開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】特定の細胞型への化学試薬の細胞内送達技術分野本発明は細胞への化学試薬の送達に関する。特に、本発明は特定の細胞型、即ちＣＲ２受容体を発現している細胞への化学試薬の細胞内送達のための組成物および方法に関する。背景技術腫瘍細胞上の細胞表面受容体または抗原を標的とする毒素は、癌の処置においてかなりの興味が持たれている。例えば、Ｉ．Ｐａｓｔａｎ＆Ｄ．ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ，癌処置のための組換え体毒素，２５４Ｓｃｉｅｎｃｅ１１７３（１９９１）；Ａｎｄｅｒｓｏｎらによる米国特許第５，１６５，９３３号および第５，１３５，７３６号；Ｔｈｏｒｐｅらによる米国特許第５，１６５，９２３号；Ｊａｎｓｅｎらによる米国特許第４，９０６，４６９号；Ｆｒａｎｋｅｌによる米国特許第４，９６２，１８８号;Ｕｈｒらによる米国特許第４，７９２，４４７号；Ｍａｓｕｈｏらによる米国特許第４，４５０，１５４号および第４，３５０，６２６号。これらの試薬は植物または細菌毒素に連結された、増殖因子または抗原結合タンパク質のような細胞標的化残基を含んでいる。これらは通常の化学療法とは異なった機構で細胞を殺すので、通常の化学療法剤への交差耐性を潜在的に減少または除去する。膜糖タンパク質ＣＲ２（ＣＤ２１としても知られている）は成熟Ｂリンパ球（Ｂ細胞）およびヒト咽頭上皮細胞、ヒト胞状樹枝状細胞および頚部上皮細胞のようなある種の上皮細胞に生じ、エプスタインーバールウイルス（ＥＢＶ）および補体断片Ｃ３ｄ／Ｃ３ｄｇ両方の受容体である。Ｎ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｌ．Ｍ．Ｈｕｔｔ−Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，６６Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３４０９（１９９０）。この受容体は１４５ｋＤの膜糖タンパク質であり、その結合機能に加えてＢ細胞活性化経路にも含まれている。例えば、Ｇ．Ｒ．Ｎｅｍｅｒｏｗら、ヒトＢリンパ球上のエプスタインーバールウイルス受容体の同定と特性評価およびＣ３ｄ補体受容体との関係、５５Ｊ．Ｖｉｒｏｌ３４７（１９８５）。ＥＢＶによるＢ細胞の感染はＣＲ２受容体へのウイルスｇｐ３５０／２２０エンベロープ糖タンパク質の選択的結合、続いてのＣＲ２のインターナリゼーションおよび受容体結合ビリオンのエンドサイトーシスにより開始される。例えば、Ｔｅｄｄｅｒら、（１９８６）、エプスタインーバールウイルス結合はＣ３ｄ受容体のインターナリゼーションを誘導する：新規免疫毒素送達系、１３７Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８７（１９８６）。ＣＲ２受容体を含む上皮細胞もＥＢＶを結合するが、明らかにそのような細胞は受容体媒介エンドサイトーシスとは別の機構で感染される。Ｎｅｍｅｒｏｗらは、Ｂ細胞ＥＢＶ／Ｃ３ｄへのエプスタインーバールウイルス（ＥＢＶ）のウイルス糖タンパク質媒介結合におけるｇｐ３５０の同定：ｇｐ３５０およびＣ３補体断片Ｃ３ｄの配列相同性、６１Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１４１６（１９８７）、においてＣ３ｄｇ中の配列（Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ −Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ；配列ＩＤ番号：２）に対応するｇｐ３５０／２２０のＮ−末端近くのドメイン（Ｇｌｕ−Ａｓｐ −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ；配列ＩＤ番号：１）を含むＣ３ｄｇおよびｇｐ３５０／２２０間の類似したアミノ酸配列のドメインを同定した。Ｎｅｍｅｒｏｗらは、Ｂリンパ球ＥＢＶ受容体（ＣＲ２）へのウイルス結合を媒介するエプスタインーバールウイルスの主エンベロープタンパク質中のエピトープの同定、５６Ｃｅｌｌ３６９（１９８９）においてもまた配列ＩＤ番号：１と同定されたアミノ酸配列を含む合成テトラデカペプチドの精製ＣＲ２受容体およびＣＲ２発現Ｂ細胞両方への結合を記載している。この合成ペプチドはまた、Ｂ細胞上のＣＲ２受容体への組換え体ｇｐ３２０／２２０またはＣ３ｄｇの結合を阻止し、同様な合成ペプチドはインビトロでＥＢＶ感染を阻害した。端を切り取ったおよび置換したペプチド類似体の分析により、ＣＲ２結合に関与するＥＢＶエピトープはＧｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ− Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ配列（配列ＩＤ番号：１）内に含まれていることが示された。より短いペプチドで結合レベルの減少が観察されたが、Ｇｌｕ− Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列ＩＤ番号：３）ペプチドはかなりのＣＲ２結合活性を保持していた。この領域のプロリンをグリシンに変えた単一アミノ酸置換を含むペプチドもまた著しいＣＲ２結合活性の減少を示した。以上のことを考えると、ＣＲ２受容体を持つＢ細胞への化学試薬の細胞内送達のための組成物およびそれらを使用法は本分野での著しい進歩であることが認識されるであろう。本発明の目的および要約結合が受容体媒介エンドサイトーシスの引き金となる特定の細胞型、即ちＣＲ２受容体を発現している細胞への選択された化学試薬の細胞内送達のための組成物を提供するのが本発明の目的である。ＣＲ２受容体を発現している細胞への選択された化学試薬の細胞内送達のための組成物を作製する方法およびそれを使用する方法を提供するのも本発明の目的である。ＣＲ２受容体を発現している細胞への細胞毒素、形質転換核酸、遺伝子調節物質、標識、抗原、薬剤などのような選択された化学試薬の細胞内送達のための組成物および方法を提供するのも本発明の別の目的である。ＣＲ２受容体への化学試薬の結合および化学試薬のエンドサイトーシスのため、選択された化学試薬に結合できるペプチドリガンドを提供するのも本発明のさらに別の目的である。これらおよびその他の目的は、ＣＲ２受容体へ結合でき受容体媒介エンドサイトーシスを誘導できるリガンド（ＣＢＥＬ）およびリガンドヘ結合された化学試薬（ここで化学試薬はＣＲ２受容体を持った細胞内へ細胞内送達された場合選択された効果を惹起することができる）からなり、ＣＲ２受容体を持たない細胞を含む細胞集団中のＣＲ２受容体を持った細胞内への化学試薬の特異的細胞内送達のための組成物を提供することにより達成できる。成熟Ｂリンパ球はこれらの組成物により標的とされるＣＲ２受容体を持った細胞である。そのような細胞へ送達できる化学試薬には細胞毒素、形質転換核酸、遺伝子調節物質、標識、抗原および薬剤が含まれている。ＣＢＥＬおよび化学試薬は、お互いにおよび／または他の機能性残基とスペーサー（ある種のペプチドのように生分解可能であってもよいし、または生分解できなくてもよい）を通して結合できる。組成物はさらに水溶解性ポリマー、リポソームおよび粒子状物からなる群より選択される担体型系を含んでいてもよい。組成物はインビトロではＣＲ２受容体結合性およびエンドサイトーシス誘導性リガンド（ＣＢＥＬ）がＣＲ２受容体に結合し、受容体結合組成物のエンドサイトーシスを惹起する条件下で細胞集団と有効量の組成物を接触させることにより使用される。インビボ使用のためには、ＣＢＥＬが成熟Ｂリンパ球上のＣＲ２受容体に接触および結合し、続いて組成物のエンドサイトーシスを誘導するように有効量の組成物が全身に投与される。一度細胞内に入ったら、化学試薬がその選択された効果を惹起する。図の簡単な説明図１Ａおよび１Ｂは本発明に従った組成物を形成するＣＢＥＬと遊離スルフヒドリル基を持つ化学試薬の化学的立体配置を説明的に描いたものである。図２Ａ−２Ｄは本発明に従ったＣＢＥＬおよび化学試薬ペプチドを含む融合タンパク質を発現するためのプラスミドの構築工程を示している。図３は本発明に従ったＣＢＥＬ−リシンＡ融合タンパク質の種々の濃度にインビトロで細胞を暴露した場合のＣＲ２⁺Ｂ細胞（より濃い棒線）およびＣＲ２^-細胞（より薄い棒線）に対する効果の比較を示している。発明の詳細な説明本組成物および特定の細胞型への化学試薬の細胞内送達法を開示および説明する前に、本明細書に記載された実施態様、方法工程および材料は幾分変化させてもよく、そのような特定の実施態様、方法工程および材料に本発明が制限されるわけではないことを理解されたい。また、本発明は付随する請求の範囲およびそれらの均等物によってのみ制限されるので、本明細書で使用された用語は特定の実施態様を説明することのみを目的として使用されており、制限することを意図しているわけではないことを理解されたい。本明細書および付随する請求の範囲で使用されている単数形は、内容が明らかに指示していない限り複数の指示対象を含んでいることを指摘しなければならない。従って、例えば”リガンド”を含む組成物については二つまたはそれ以上のリガンドを含んでおり、”化学試薬”については一つまたはそれ以上のそのような化学試薬（それらは同一の化学試薬でも異なったものでもよい）を含んでおり、”スペーサー”については二つまたはそれ以上のスペーサーを含んでいる。本発明の説明および請求において、以下の用語が以下に示す定義に従って使用されるであろう。本明細書で使用される場合、”ペプチド”とは任意の長さのペプチドを意味し、タンパク質を含んでいる。用語”ポリペプチド”および”オリゴペプチド”は特定のサイズが述べられていない限り、本明細書では特定の意図されたサイズの制限なしに使用される。本明細書で使用される場合、”ＣＲ２受容体結合性およびエンドサイトーシス誘導性リガンド”または”ＣＢＥＬ”とはＣＲ２（ＣＤ２１）受容体に結合できおよび受容体および受容体結合ＣＢＥＬのエンドサイトーシスによるインターナリゼーションを誘導できる組成物を意味している。本発明に従うと、ＣＢＥＬのエンドサイトーシスによりそれに結合された種々の機能性分子もまたＣＲ２を持つ細胞によりインターナリゼーションを受けるようにＣＢＥＬは種々の機能性分子と結合されている。現在までの理解によれば、ＣＢＥＬはＥＢＶｇｐ３５０／２２０糖タンパク質、配列ＩＤ番号：１および隣接する配列を含む；Ｃ３ｄｇペプチド、配列ＩＤ番号：２および隣接する配列を含む；またはそれらに実質的に相同的なペプチドから誘導できる。本明細書で使用する場合”実質的に相同的”とは、隣接する配列を含んでいてもよいし、または端が切断されていてもよいが、ＣＲ２受容体結合および受容体媒介エンドサイトーシスの誘導においての機能性を保持しているペプチドを意味している（配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２の欠失変異体または置換変異体）。結合および受容体媒介エンドサイトーシス誘導のための最少必要性は配列ＩＤ番号：３と同定された配列であるようである。置換変異体とは一つまたはそれ以上のアミノ酸残基の保存的置換を含むものである。保存的置換とは、ペプチドの機能性（ここでの場合、ＣＲ２受容体結合および受容体結合組成物のエンドサイトーシスの惹起における機能性）が保持されるような一つのアミノ酸残基の別のアミノ酸による置換である。ある種の保存的置換群に属しているアミノ酸残基はしばしば同一の群の別のアミノ酸残基で置換することができる。そのような群分けの一つは以下のようである：Ｐｒｏ；Ａｌａ、Ｇｌｙ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ：Ｈｉｓ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；Ｃｙｓ；Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ；およびＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ。Ｍ．Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍｏｎｔａｎｏ＆Ｌ．Ｚａｍｏｒａ−Ｃｏｒｔｉｎａアミノ酸配列の発生の進化的モデルおよび哺乳類アルファーヘモグロビン鎖の研究についてのその応用、Ｐｒｏｃ．VIIｔｈＩｎｔ’ｌＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓＣｏｎｇｒｅｓｓ，ＭｅｘｉｃｏＣｉｔｙ（１９８１）。実質的に相同であると考えられる別の変異には、天然に存在するＬ−アミノ酸に対してのＤ−アミノ酸の置換、追加の側鎖を含むようなアミノ酸誘導体による置換、および非標準的アミノ酸、即ちタンパク質にはまれであるかまたは存在しないα−アミノ酸による置換が含まれる。ＣＢＥＬの一次構造は機能性によってのみ制限される。本明細書で使用される場合、”化学試薬”とはエンドサイトーシスによりＢリンパ球内にインターナリゼーションされた場合に選択された効果を示す物質を意味し、含んでいる。ある種の化学試薬はＢ細胞内へインターナリゼーションされた場合、Ｂ細胞に対して細胞毒性効果または遺伝子調節に対する効果のような生理学的効果を示す。細胞内へインターナリゼーションされた場合、”形質転換核酸”（ＲＮＡまたはＤＮＡ）は細胞内で複製および／または発現されるであろう。他の核酸は細胞内で調節配列または調節因子と相互作用し、選択された様式で細胞内で遺伝子発現に影響を与えるであろう。細胞内に送達された検出可能な標識は、標識を検出することにより本発明の組成物がインターナリゼーションされた細胞の同定を可能にする。細胞の内部に送達された抗原は、抗原に特異的な免疫応答を惹起することができる。薬剤または医薬として活性な化合物は病原性効果または他の型の障害を改善するのに使用できる。特に有用な化学試薬としてはポリペプチドが挙げられ、そのような化学試薬のいくつかは生物学的に活性なタンパク質の断片、または抗原性タンパク質の特異的抗原断片（例えばエピトープ）である。従って、化学試薬には細胞毒素、遺伝子調節物質、形質転換核酸、標識、抗原および薬剤などが含まれる。本明細書で使用される場合、”担体”とは水溶性ポリマー、粒子状物またはリポソームを意味している。そのような担体は一つまたはそれ以上のＣＢＥＬおよび／または化学試薬が結合できる多数の部位を含んでいる。そのような担体は組成物の分子量を増加させ、追加の選択性および／または安定性を提供する。そのような選択性は担体を含む組成物が受動拡散により細胞内へ入るには大きすぎ、従って受容体媒介エンドサイトーシスにより細胞内へ入ることだけに制限されるからである。水溶性ポリマーを含む担体はペプチドリガンド、化学試薬および他の機能性分子の連結に使用できる。標的化された薬剤送達のためにそのような担体が使用できることは確立されている。例えば、Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ，５Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ１９（１９８４）；Ｅ．Ｓｃｈａｃｈｔら、薬剤担体としてのポリサッカライド、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ＲｅｌｅａｓｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１８８（Ｐ．Ｉ．Ｌｅｅ＆Ｗ．Ｒ．Ｇｏｏｄ編、１９８７）；Ｆ．Ｈｕｄｅｃｚ、担体設計：ポリ（Ｌ−リジン）主鎖を持つ合成分岐鎖ポリペプチドの細胞毒性および免疫原性、１９Ｊ．ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ２３１（１９９２）；Ｚ．Ｂｒｉｃｈ、ドクソルブシンおよびモノクローナル抗体（ＡＢＬ３６４）の水溶性デキストラン免疫複合体の製造と特性評価、１９Ｊ．ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ２４５（１９９２）。従って、水溶性ポリマーの例としてはデキストラン、イヌリン、ポリ（Ｌ−リジン）、メタアクリルアミド含有合成ポリマーなどが挙げられる。本明細書で使用される場合、”有効量”とは選択された効果を生み出す量を意味している。例えば、化学試薬として細胞毒素を含んでいる組成物の選択された効果とは選択された時間内に成熟Ｂ細胞を選択された比率で殺すことであろう。組成物の有効量とはこの選択された結果を達成する量であろうし、そのような量は当業者により日常の業務として決定される。本発明の組成物は、ＣＲ２を持たない細胞を含む細胞集団中のＣＲ２を持つ細胞内への化学試薬の特異的細胞内送達を提供し、本組成物はＣＲ２受容体へ結合でき、受容体媒介エンドサイトーシスを誘導できるＣＢＥＬ、およびＣＲ２受容体を持つ細胞内へ細胞内送達された場合に選択された効果を惹起でき、ＣＢＥＬに結合された化学試薬を含んでいる。化学試薬は細胞毒素、遺伝子調節物質、形質転換核酸、標識、抗原および薬剤などから成る群より選択される。化学試薬へのＣＢＥＬの結合は、共有結合、静電的相互作用、疎水性相互作用および物理的カプセル化などであろうが、それらに制限されるわけではない。化学試薬へのＣＢＥＬの結合は直接であってもまたは別の機能性残基を通していてもよい。従って、本組成物はさらに、ＣＢＥＬおよび化学試薬間に結合および挿入されたスペーサーを含んでいる。そのようなスペーサーは生分解可能でも生分解性可能でなくてもよいが、ペプチドスペーサーが望ましい。本発明の組成物はさらに水溶性ポリマー、リポソームおよび粒子状物から成る群より選択される担体を含むこともできる。担体が水溶性ポリマーである場合、組成物は式：［Ｌ−Ｓ_a］_b−Ｃ−［Ｓ_e−Ａ］_f （式中、ＬはＣＲ２受容体に結合およびそのエンドサイトーシスを誘導できるリガンド（ＣＢＥＬ）であり；Ａは化学試薬であり；Ｓはスペーサーであり；Ｃはリガンド、化学試薬およびスペーサーとの共有結合の形成が矛盾なくできる官能基を持つ水溶性ポリマーであり；ａおよびｅは０または１であり；およびｂおよびｆは整数で少なくとも１である）を持っている。そのような水溶性ポリマーはデキストラン、イヌリン、ポリ（Ｌ−リジン）、メタアクリルアミド含有ポリマーなどから成る群より選択される。従って、本発明に従うと、ＣＢＥＬは成熟Ｂ細胞上のＣＲ２受容体に結合する組成物のための手段が提供され、エンドサイトーシスによる組成物のインターナリゼーションの引き金を引く。化学試薬はＢ細胞内で選択された効果を達成するための手段を提供する。従って、例えば化学試薬はＣＲ２受容体を示している細胞を選択的に殺すまたは無能力化するための細胞毒素（放射性核種を含む）；選択的免疫応答を惹起するための抗原；Ｂ細胞の遺伝子発現を遺伝的に形質転換するまたは調節する核酸；選択された治療効果を達成するための薬剤または他の医薬として活性な試薬；組成物を取り込んでいる細胞の検出を可能にするための標識（蛍光性、放射活性および磁気標識を含む）などを含んでいる。随意に、本発明の組成物はさらに多数の選択された機能性を持つＣＢＥＬおよび／または化学試薬を複合体分子中に一緒に結合できるように水溶性ポリマー担体を含んでいる。少なくとも一つの化学試薬および少なくとも一つのＣＢＥＬがそのような担体に結合されており、化学試薬に結合されたＣＢＥＬの好適な数は１から約１０００の範囲である。そのような担体は組成物の分子量を増加させ、担体なしで達成されるであろうものを超える付加的選択性および／または安定性を機能性残基に提供する。都合よくは、ＣＢＥＬおよび／または化学試薬の結合は生分解可能または生分解可能ではないスペーサーにより達成される。そのようなスペーサーはＢ細胞内部での加水分解および／または酵素的切断に対する相対的感受性または抵抗性で選択できる。この選択性は、細胞内で担体へ結合されたまま残っている化学試薬がよいかまたは細胞内酵素活性により担体から放出されるのが都合がよいかに基づいてスペーサーを選ぶ手腕を本技術の従事者に与える。担体としてのリポソームおよび粒子状物の使用は水溶性ポリマー担体の使用とは無関係である。いくつかの態様において、本組成物は化学試薬へＣＢＥＬを化学的に結合させることにより構築される。”化学的結合”とは本明細書で使用される場合直接的にまたは結合残基を通して化学試薬にＣＢＥＬを共有結合で結合させることを意味している。特定の態様では（化学試薬がペプチドである場合）、ＣＢＥＬ上の官能基および化学試薬間の結合の形成に結合残基が使用できる。例えば、ＣＢＥＬおよび化学試薬ペプチド含有組成物は、ヘテロ二官能性架橋剤を通して化学試薬上のスルフヒドリル基およびＣＢＥＬ上のアミノ基を結合させることにより形成できる。例えば、マレイミド架橋剤を通したＣＢＥＬおよびリシンＡの化学的結合形成のための反応スキームが図１Ａおよび１Ｂに示されている。スルフヒドリル基、ハロアセチル、アルキルハライド、アルキルスルフォネート、α，β− 不飽和カルボニル、またはα，β−不飽和スルホン残基を含む化学試薬へのＣＢＥＬの化学的結合形成のためにマレイミド架橋剤以外のものも架橋剤として使用できる。ＣＢＥＬおよびアミノ基を含む化学試薬の化学的結合のために、活性エステルが架橋剤として使用できる。どの官能基がＣＢＥＬ上および化学試薬上で利用可能かに依存して別の結合残基が用いられるであろう。本発明の組成物はまた、大腸菌のような遺伝子工学処理された微生物中で”融合タンパク質”として産生できる。即ち、ＣＢＬＥをコードしているヌクレオチド配列および化学試薬ペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むハイブリッド遺伝子は組換えＤＮＡ技術により構築できる。このハイブリッド遺伝子は、ハイブリッド遺伝子によりコードされている”融合タンパク質”が発現されるように微生物内へ挿入できる。融合タンパク質は続いてアフィニティークロマトグラフィーを含む常法により精製できる。本発明に従ったＣＢＥＬおよび化学試薬を含む融合タンパク質は化学合成によってもまた構築できる。本発明の組成物が融合タンパク質として産生される場合、ＣＢＥＬおよび化学試薬ペプチドは直後にお互いを隣接させることができ、即ち、ＣＢＥｌのカルボキシル末端は化学試薬のアミノ末端と直接的に結合できる（またはその逆）。もしくは、融合タンパク質はＣＢＥＬおよび化学試薬間に追加のアミノ酸残基を含むこともでき、これらの追加のアミノ酸残基はＣＢＥＬおよび化学試薬ペプチド間のスペーサーとして働くことができる。短いペプチドはより容易に取り扱うことができ、および追加のアミノ酸残基の存在（特にたくさんの数の追加のアミノ酸残基）はエンドサイトーシスによる化学試薬のインターナリゼーションを誘導するペプチドリガンドの機能を妨害するかもしれないため、短いペプチドリガンドが一般的に好適である。本発明に従った組成物はさらにまた、一度組成物が細胞内に移ったら、消化部位のタンパク質分解によりＣＢＥＬから化学試薬を分離できるように位置しているプロテアーゼ消化部位を含むこともできる。そのような消化部位は天然には配列ＩＤ番号：１セグメントに隣接するｇｐ３５０／２２０糖タンパク質中に存在し、従って本組成物のＣＢＥＬ部分は都合よくそのような部位を含むように伸長できる。そのようなプロテアーゼ感受性スペーサーは、組成物が化学的に合成されたかまたは遺伝子工学処理された微生物中の発現ペプチドに関係なく付加することができる。後者の場合、プロテアーゼ感受性スペーサーをコードしているヌクレオチドは本分野ではよく知られた技術によりＣＢＥＬコードセグメントおよび化学試薬ペプチドコードセグメントの間にハイブリッド遺伝子内へ挿入できる。本発明の別の態様はＣＲ２を発現しない細胞集団に含まれるＣＲ２発現細胞において所望の活性を特異的に達成する方法を特色とし、そのような活性を細胞内で示す化学試薬に結合されたＣＢＥＬを含む組成物と細胞集団を接触させる工程が含まれている。本発明の組成物は混合集団中のＣＲ２発現細胞に選択的に結合し、それにより細胞内への組成物のエンドサイトーシスが誘導され、ＣＲ２発現細胞内で化学試薬がその活性を達成する。本明細書ではペプチドの取扱いおよびペプチド発現のための核酸の取扱いのためには標準的な技術が用いられた（特に指示しない限り）。オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドの結合のための技術は本分野ではよく知られており、例えば、Ｔ．Ｚｈｕら、３ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．Ｄｅｖ．２６５（１９９３）；Ｔ．Ｚｈｕら、８９Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９３４（１９９２）；Ｐ．Ｒｉｇａｕｄｙら、４９ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１８３６（１９８９）に記載されている。前に指摘したように、本発明は組成物中でＣＢＥＬとして用いられるペプチドを特色としており、また化学試薬も含まれており、その化学試薬もまたペプチドであるかまたはペプチドを含んでいる。本発明に従ったペプチドは有機合成および組換えＤＮＡ法を含む種々の技術により作製される。ペプチドの化学合成のための技術は例えば、Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、２１Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５０２０−３１（１９８２）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，８２Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ５１３１−３５（１９８５）（本明細書において援用される）に記載されている。ペプチドと別の分子の化学結合のための技術は本分野では既知である。本発明に従った融合タンパク質は上記のようにＣＢＥＬをコードしているオリゴヌクレオチドおよび化学試薬ペプチドをコードしているオリゴヌクレオチドを含む核酸の適した宿主細胞での発現により作製できる。組換え融合タンパク質を産生するためのそのような技術は本分野ではよく知られており、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版、１９８９）（その関連する部分は本明細書において援用される）に一般的に記載されている。制限酵素などのようなそのような技術の応用に有用な試薬は本分野では広く知られており、いくつかの販売元から市販品として入手可能である。本発明に従ったＣＢＥＬおよび化学試薬ペプチドを含む組成物の構築はがここで記載されるが、特にＣＢＥＬが細胞毒性化学試薬ペプチド、リシンＡと結合される例に関するものである。リシンはひま植物（リシヌスコミュニス（ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ））により産生される毒性糖タンパク質である。それはＡ鎖およびＢ鎖の二つのサブユニットからなり、両方とも約３０ｋＤの分子量であり、ジスルフィド結合によりお互いに連結されている。リシンは大量に前駆体として合成され、それを加工すると成熟Ａ鎖およびＢ鎖サブユニットが得られる。Ａ鎖は２８ＳリボソームＲＮＡのグルコシド結合を切断する酵素であり、それによりタンパク質を合成するリボソームの能力を破壊する。Ａ鎖は１分で約１５００のリボソームを不活性化でき、そのことはリシンＡの１個のインターナリゼーションが細胞には致死的であることを意味している。Ｓ．Ｏｌｓｎｅｓら、毒性レクチンアブリンおよびリシンによるリボソームの不活性化、６０Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８１（１９７５）。Ｂ鎖は細胞表面上のガラクトース残基に結合する（リシンのインターナリゼーションに必須）。Ｂ鎖を除去するとＡ鎖の細胞への侵入が阻害され、Ａ鎖を不活性なものにする。リシンＡ鎖のＣＢＥＬへの結合は受容体媒介エンドサイトーシスによるＡ鎖の侵入を可能にし、活性な細胞毒素とする。第一の実施例において、組成物は化学的結合により形成され；および第二の実施例において、組成物は組換え体融合タンパク質として形成される。実施例１ＣＢＥＬおよびリシンＡの化学的結合形成実例として、アミノ酸配列Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ −Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（配列ＩＤ番号：１）を持つＣＢＥＬと細胞毒性化学試薬ペプチド、リシンＡとの化学的結合形成が図１Ａおよび１Ｂに示した２工程法で実施された。第一の工程において、ＣＢＥＬ（ＰｅｐｔｉｄｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ，ＵＳＡ）がｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（”ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ”；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）との反応により（本質的に発売元の使用説明書に記載されているように）活性化された。簡単に記すと、ＣＢＥＬはＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中、１：１０のモル比にて室温で２時間混合した。得られた活性化ペプチドは常法に従ってＳｕｐｅｒｏｓｅ１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いるＨＰＬＣにより精製された。第二の工程において、マレイミド活性化ペプチドはデグリシル化リシンＡ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）とＰＢＳ緩衝液中、１：５のモル比にて室温で1時間混合して反応させた。未反応ペプチド分子はＣＢＥＬ−リシンＡ結合体から４℃で６−８キロダルトンカットオフ値を持つ膜を通して一夜透析する事により除去された。得られた組成物は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のゲル電気泳動により約３２ｋＤの分子量を持つと推定された（Ｕ．Ｌａｅｍｍｌｉ，２２７Ｎａｔｕｒｅ６８０（１９７０）。従って、本実施例により製造された組成物はリシンＡ１モル当たり１つのＣＢＥＬを含んでいる。三次元コンピューターモデル化は、ＣＢＥＬはＮ末端のＣｙｓ残基が折り畳まれたリシンＡ分子の内部に埋もれている限りは、リシンＡ分子のＣ末端のＣｙｓ残基に結合している可能性が高いことを示した。実施例２ＣＢＥＬおよびリシンＡを含む組換え体タンパク質アミノ酸配列Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（配列ＩＤ番号：１）を持つＣＢＥＬと細胞毒性化学試薬ペプチド、リシンＡを含む融合タンパク質が組換えＤＮＡ技術により形成された。簡単に記すと、本実施例の融合タンパク質は大腸菌発現ベクター中、ＣＢＥＬをコードしている合成オリゴヌクレオチドをリシンＡをコードしているポリヌクレオチドの下流に挿入し、大腸菌宿主内で高収率で融合タンパク質を発現させ、次にアフィニティークロマトグラフィーにより細胞溶菌物から融合タンパク質を精製する。ここで図２Ａ−２Ｄを参照すると、ＣＢＥＬおよびリシンＡを含む融合タンパク質は以下のような組換えＤＮＡ技術により産生された。翻訳開始部位（ＡＴＧ）の下流の多クローニング部位（ＭＣＳ）を含む大腸菌発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）（図２Ａ）は制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌおよびＢａｍＨＩで消化され、得られた付着末端はＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端に変換され、再結合させてｐＴｒｃＢ（図２Ｂ）を発生させた。リシンＡをコードしている８６３ｂｐＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ断片をプラスミドｐＡＫＧ（ＲｏｂｅｒｔＷｅａｖｅｒ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＫａｎｓａｓ，Ｌａｗｒｅｎｃｅから得た；Ｃ．Ｈａｌｌｉｎｇら、１３ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．９０１９（１９８５）に記載されている）から単離し、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ消化ｐＴｒｃＢ内へクローン化した。得られた構築物はＢａｍＨＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで付着末端を平滑末端に変換し、再結合するとクローン化遺伝子の翻訳のための正しい読み枠が得られた（図２Ｃ）。得られた改変ｐＴｒｃＢベクター（リシンＡコード配列を含んでいる）は次にＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、続いてＣＢＥＬをコードしているヌクレオチド残基およびＫｐｎＩおよびEｃｏＲＩでのクローニングと両立できる付着末端を含む下記の合成オリゴヌクレオドを結合した。得られたベクター（図２Ｄ）はリシンＡ−プロテアーゼ部位−リガンド−Ｈｉｓ６融合タンパク質をコードするハイブリッド遺伝子であり、ここで”プロテアーゼ部位”とはプロテアーゼ消化部位または前記のようなプロテアーゼ感受性スペーサーを意味しており、”リガンド”はＣＢＥＬを意味しており、および”Ｈｉｓ６”は６つの連続的なＨｉｓ残基（この機能は後で説明する）の領域を意味している。得られたプラスミドは次に大腸菌細胞の形質転換に使用され、形質転換体はＬＢ培地で選択および増殖させた（Ｊ．Ｍｉｌｌｅｒ，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９７２））。細胞は次に溶解させ、組換え体融合タンパク質はニッケル荷電樹脂（”ＰＲＯＢＯＮＤ”，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含むカラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。融合タンパク質のＣ末端の６つのＨｉｓ残基は”ＰＲＯＢＯＮＤ”樹脂上のニッケル原子と静電的に結合する。結合された融合タンパク質を含む樹脂は次に洗浄して夾雑物を除く。次に、静電的結合を破壊し、ニッケル荷電樹脂からＨｉｓ残基を置き換えるイミダゾール含有溶出緩衝液に融合タンパク質を溶出する。この精製は製造元の手引き書に従って行われた。実施例３アミノ酸配列Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（配列ＩＤ番号：１）を持つＣＢＥＬと細胞毒性化学試薬ペプチド、リシンＡを含む融合タンパク質が実施例２のように組換えＤＮＡ技術により行われた、ただし６つの連続的なＨｉｓ残基を含む領域は除かれた。従って、改変ｐＴｒｃＢベクターのＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩによる消化後、ＣＢＥＬをコードしているヌクレオチド残基およびＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩでのクローニングと両立できる付着末端を含む下記の合成オリゴヌクレオドが結合された。得られたベクターはリシンＡ−プロテアーゼ部位−ＣＢＥＬ融合タンパク質をコードするハイブリッド遺伝子であり、ここで”プロテアーゼ部位”はプロテアーゼ消化部位または前記のようなプロテアーゼ感受性スペーサーを意味している。得られたプラスミドは次に大腸菌細胞の形質転換に使用され、形質転換体はＬＢ培地で選択および増殖させた。発現されたタンパク質は細胞を１ｍｇ／ｍｌのリリゾチームを含む２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）中で各々１分間３回超音波処理して溶菌させて単離した。融合タンパク質はこれらの条件下で不溶性であったが、ほとんどの大腸菌タンパク質は溶解性であった。溶菌物を９０００ｒｐｍで３０分遠心分離し、得られた融合タンパク質含有ペレットは再懸濁し、再び遠心分離する前に１分間超音波処理した。再懸濁、超音波処理および遠心分離の工程を３回繰り返した。融合タンパク質の比較的純粋な調製物を含む最終的なペレットは６Ｍ尿素および５Ｍジチオスレイトールを含む溶液に溶解した。この溶解された融合タンパク質は４Ｍ尿素；２Ｍ尿素；および２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．８に対して連続的に透析することにより復元した。実施例４アミノ酸配列Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（配列ＩＤ番号：１）を持つＣＢＥＬと細胞毒性化学試薬ペプチド、リシンＡを含む融合タンパク質が実施例２のように組換えＤＮＡ技術により行われた、ただし追加のシステイン残基が融合タンパク質内に導入された。リシンＡ鎖のＣ末端の遊離システイン残基は大腸菌タンパク質の代わりにこの新規システイン残基と分子内ジスルフィッド結合を形成できるので、この構築物は実施例２より高収率で回収可能な融合タンパク質を与えた。大腸菌発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）（異なった読み枠を持っていることを除いて図２ＡのｐＴｒｃＨｉｓＢと類似）は制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化された。６つの連続的なヒスチジン残基およびＮｃｏＩおよびBａｍＨＩ付着末端をコードしている合成ＤＮＡがベクターに連結された。プラスミドｐＡＫＧをＢａｍＨＩで消化し、放出された８９３ｂｐ断片はアガロースゲルでの電気泳動後電気溶出により回収された。この断片をＢａｍＨＩおよび腸アルカリ性ホスファターゼ− 消化改変ｐＴｒｃＨｉｓＡベクター内に結合させた。結合混合物は大腸菌株ＸＬ−１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換に用いた。形質転換体を選択し、ベクター中のＢａｍＨＩ断片の向きをＢｇｌIIで消化して決定した。翻訳のために正しい方向でリシンＡ遺伝子を持つ形質転換体からのＤＮＡをＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＣＢＥＬをコードしているヌクレオチド残基およびＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ部位でのクローニングと両立できる付着末端を含む下記の合成オリゴヌクレオドが結合された。結合されたＤＮＡは発現宿主大腸菌株ＢＬＲ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）（ｒｅｃＡ株でｉｏｎおよびｏｍｐＴプロテアーゼも欠けている）内へ形質転換された。組換え体タンパク質は３７℃でアンピシリン存在下で増殖する形質転換された細胞から単離された。培養液が０．６−０．８（６００ｎｍ）の光学密度達したとき、発現を誘導するために１ｍＭの最終濃度までイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）が加えられた。３時間さらに増殖させた後、細胞を採取し、１０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１００ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．０５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、および０．５ｍｇ／ｍｌリゾチームを含む緩衝液に懸濁し、氷浴上で１５分インキュベートした。得られた溶菌物は０．５ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリドの存在下で超音波処理し、４℃にて３０分９０００ｒｐｍで遠心分離した。硫酸アンモニウムを４０％飽和まで加えて可溶性タンパク質を沈澱させ、沈澱したペレットは溶解し１０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭＫＣｌに対して透析した。透析液は同一の緩衝液で平衡化されている強陰イオン交換カラム（ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にのせた。これらの条件下、ほとんどすべての細菌性タンパク質はカラムに結合され、非結合分画は本質的に精製された組換え体タンパク質を含んでいた。組換え体タンパク質はさらに４Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．８に対して透析することにより精製された。透析液はニッケル荷電”ＰＲＯＢＯＮＤ”樹脂を含むカラムを通過させ、４Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．０で５回洗浄した。組換え体タンパク質中の６つのヒスチジン残基は親和性相互作用による組換え体タンパク質の樹脂への結合を起こした。カラムはさらに２回イミダゾール濃度を３０ｍＭに増加させた同一の緩衝液で洗浄した。組換え体タンパク質は３００ｍＭのイミダゾール濃度を持つ同一の緩衝液で溶出させた。溶出されたタンパク質は最初に４Ｍの尿素に対して、次に２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．８に対して透析することにより復元された。実施例５ＣＲ２発現Ｂ細胞への化学試薬の標的化送達の実例として、本発明に従ったＣＢＥＬおよび化学試薬の組成物の使用が、特にＣＲ２発現Ｂ細胞に対する特異的細胞毒性効果のためにインビトロでＲａｊｉＢリンパ芽球様細胞ヘリシンＡおよびＣＢＥＬの組成物が送達される例を参照して説明されるであろう。予備的な証明において、１ｘ１０⁶のＣＲ２⁺ＲａｊｉＢリンパ芽球様細胞が追加の処理をしていない１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培養培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）；２０μｇの上記実施例１のリシンＡ−ＣＢＥＬ組成物を含む１ｍｌの培養培地；またはリシンＡのみを含む１ｍｌの培養培地中で３７℃にて２４時間インキュベーションされた。インキュベーション後の細胞死はトリパンブルー染色および倒立顕微鏡を用いるヘマサイトメーターによる細胞計数により決定された。トリパンブルーは吸収され、死んだ細胞の細胞内を青色に染める。細胞の一部を０．４％トリパンブルー染色液（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で２倍に希釈し計数する前に５分間インキュベートした。生きている細胞のパーセントは単位容量当たりの非染色細胞の数を染色および非染色細胞の全体の数で割り、１００を掛けて計算した。リシンＡ単独で処理した細胞および対照細胞は健康であるようにみえた。リシンＡ−ＣＢＥＬ組成物で処理した細胞の約９９％は死滅した（１％生存率）。リシンＡは細胞内へインターナリゼーションされた場合のみ細胞毒であるので、これらの結果は本発明に従ったリシンＡ−ＣＢＥＬ組成物は細胞毒性化学試薬のインターナリゼーションが起こったことを示している。実施例６以下のように実施例２に従った組換え体ＣＢＥＬ−リシンＡ融合タンパク質の効果がＣＲ２⁺ヒトリンパ芽球様（Ｒａｊｉ）細胞およびＣＲ２^-Ｔ（ＨＳＢ２）細胞で試験された。１ｘ１０⁶の細胞の懸濁液を種々の濃度の精製組換え体融合タンパク質を含む１ｍｌの培養培地と十分に混合し、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、細胞生存度を実施例５のようにトリパンブルーで細胞を染色することにより評価した。図３が示しているように、ＣＲ２⁺細胞（より濃い棒線）は結合体の処置に対して容量応答様式で応答したが、一方ＣＲ２^-細胞（より明るい棒線）は処置による影響を受けなかった。５０μｇ／ｍｌの融合タンパク質濃度では、ＣＲ２⁺ Ｂ細胞の生存率は１０％未満であり、ＣＲ２^-細胞の生存は１００％であった。両方の型の細胞をＣＢＥＬ単独でまたは組換え体リシンＡ単独で処理しても効果はなく、ＣＲ２⁺細胞に対する組換え体ＣＢＥＬ−リシンＡ融合タンパク質の毒性効果はＢ細胞上のＣＲ２受容体を経る組換え体タンパク質のインターナリゼーションにより生じるという結論を支持している。実施例７実施例７の方法に従った、ただし、生きている細胞のパーセントはテトラゾリウム化合物（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩；ＭＴＳ）および電子カップリング試薬（フェナジンメトスルフェート；ＰＭＳ）を用いた比色法により決定された。ＭＴＳは細胞によりホルマザンに生物還元され、それは組織培養培地に可溶である。４９０ｎｍでのホルマザンの吸光度は追加の処理をせずに９６ウェルから直接測定することができる。４９０ｎｍでの吸光度により測定されたホルマザン生成物の量は直接培養液中の生きている細胞の数に比例している。ＭＴＳアッセイのための試薬はＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から入手できた。この方法により得られた結果は実質的に実施例６と同一であった。実施例８実施例３に従った組換え体ＣＢＥＬ−リシンＡ融合タンパク質の効果は、実施例６の方法に従ってＣＲ２⁺ヒトリンパ芽球様（Ｒａｊｉ）細胞およびＣＲ２^-ヒトＴ（ＨＳＢ２）細胞で試験された。結果は実施例６の結果と実質的に同じであった。実施例９実施例４に従った組換え体ＣＢＥＬ−リシンＡ融合タンパク質の効果は、実施例６の方法に従ってＣＲ２⁺ヒトリンパ芽球様（Ｒａｊｉ）細胞およびＣＲ２^-ヒトＴ（ＨＳＢ２）細胞で試験された。結果は実施例６の結果と実質的に同じであった。本発明に従ったＣＢＥＬ−化学試薬組成物はＣＲ２発現細胞への化学試薬の標的特異的送達に用いられ、一般的にはＣＢＥＬがＣＲ２発現細胞内への組成物のエンドサイトーシスを誘導する条件下でＣＲ２発現細胞と組成物を接触させる。化学試薬は組成物がインターナリゼーションを受ける標的細胞上または内で作用し、活性試薬の所望の効果はＣＲ２⁺表現型を持つ細胞に制限できる。例えば、本発明に従ったＣＢＥＬ−細胞毒素試薬組成物は、選択的にＣＲ２⁺ Ｂ細胞を殺すことでインビボで有効な抗腫瘍剤として用いることができる。好適には、組成物は全身的投与、典型的には皮下、筋肉内または静脈内注射または腹腔内投与により患者に投与される。そのような使用のための注射剤は液状溶液または懸濁剤または注射に先立って液体で液剤または懸濁製剤とするのに適した固形剤かまたは乳化剤として都合のよい剤形で処方できる。適した添加物には、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどが含まれる；および必要なら、湿潤または乳化剤、緩衝液などのような少量の補助物質を加えてもよい。組成物はインビトロまたはインビボで細胞と接触させる。ＣＲ２発現細胞は細胞型の混合集団の亜集団を構成しているであろう（およびほとんどの例でそう予想される）；本発明に従ったペプチドリガンドはＣＲ２発現細胞内への結合物のＣＲ２特異的エンドサイトーシスを提供できる。化学試薬は標的細胞において任意の種々の所望の効果を持つことができる。上記のように、いくつかの特定の有用な態様において、試薬が細胞内へインターナリゼーションされた場合（または特にその場合）のみ化学試薬は細胞に有効である。実施例１０Ｂ細胞へのＣＢＥＬ−抗原性試薬の標的化された送達本発明に従ったＣＢＥＬおよび抗原を含む組成物はＣＲ２⁺細胞の免疫応答の標的化された開始のために温血動物へ投与できる。特に、ＣＢＥＬは細胞内へ抗原のＣＲ２媒介インターナリゼーションを提供し、標的化細胞での補体活性化のための抗体非依存性経路の開始を起こさせることができる。即ち、本発明に従うと、標的化細胞は、抗原（これに対して細胞は接触したことはない）に対して免疫応答を惹起するのを誘導することができる。配列ＩＤ番号：２と同定されたアミノ酸配列を持つＣＢＥＬの化学的結合形成が活性化され実施例１のようにニワトリリゾチーム（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）へ結合された。ＣＢＥＬ−リゾチーム結合体は次にマウスに全身投与された。Ｃ３ｄｇＣＢＥＬ（配列ＩＤ番号：２）はマウスＢ細胞へ特異的に結合し、結合体のＣＲ２受容体媒介エンドサイトーシスを誘導する。結合体（結合体のリゾチーム部分に特異的であるエピトープを含んでいる）上に運ばれたエピトープに対して標的とされたＢ細胞による免疫応答を結合体が惹起する。本実施例の結果はＣＢＥＬ−リゾチーム融合タンパク質の構築により実質的に再現することができる。実施例１１ヒトのＢ細胞白血病の処置法は（ａ）ＥＢＶＣＢＥＬ（配列ＩＤ番号：１）のようなＣＢＥＬまたはそれと実質的に相同であるペプチド、およびリシンＡのような細胞毒素を含む本発明に従った組成物を提供し、および（ｂ）患者に有効量の組成物を全身的に投与することから成っている。そのような組成物は例えば、上記実施例３に示したように作製できる。ＥＢＶＣＢＥＬは成熟Ｂ細胞を標的とし、リシンＡはそれが内部に送達されたらどの細胞にとっても細胞毒性である。組成物が血流に入ってＢ細胞と接触するように有効量の組成物が全身的に投与される。ＣＢＥＬはＢ細胞上のＣＲ２受容体への組成物の結合およびエンドサイトーシスによる組成物のインターナリゼーションを起こさせる。リシンＡ細胞毒素は続いてリボソームを破壊することにより細胞を殺す。この方法は患者の体内の悪性Ｂ細胞の数を減少させ、それにより疾患の処置において陽性の効果を持っている。実施例１２例えば、紅斑性狼癒または変形関節炎にような自己免疫疾患の処置法は実施例１１の方法に従う。一度Ｂ細胞内へ送達されたら細胞毒素は細胞を殺し、従って自己抗体を産生しているＢ細胞の数を減少させ、それにより本疾患の処置に陽性の効果を持っている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年９月１１日【補正内容】請求の範囲１．ＣＲ２受容体を持たない細胞を含む細胞集団中のＣＲ２受容体を持つ細胞内への化学試薬の特異的細胞内送達のための組成物であって、本質的に該ＣＲ２受容体へ結合および受容体媒介エンドサイトーシスを誘導できるリガンドおよび該リガンドヘ結合された化学試薬のみから成り、ここで該化学試薬は該ＣＲ２受容体を持つ細胞内へ送達された場合に選択された効果を惹起することができる組成物。２．該ＣＲ２受容体を持つ細胞がＢリンパ球である請求項第１項に記載の組成物。３．該リガンドが配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：９の配列のみから成る群より選択されるアミノ酸配列を持つペプチドを含む請求項第２項に記載の組成物。４．該化学試薬が細胞毒素、形質転換核酸、遺伝子調節物質、標識、抗原および薬剤から成る群より選択される請求項第３項に記載の組成物。５．さらに該リガンドおよび該化学試薬の間に共有結合で結合されおよび挿入されたスペーサーを含む請求項第４項に記載の組成物。６．該スペーサーが生分解可能である請求項第５項に記載の組成物。７．該スペーサーがペプチドを含む請求項第６項に記載の組成物。８．該リガンドが本明細書で配列ＩＤ番号：１として与えられた配列を持つペプチドでありおよび該化学試薬がリシンＡである請求項第７項に記載の組成物。９．該スペーサーが生分解可能ではない請求項第５項に記載の組成物。１０．該組成物がさらに水溶性ポリマー、リポソームおよび粒子状物のみから成る群より選択される担体を含む請求項第４項に記載の組成物。１１．該担体が水溶性ポリマーでありおよび該組成物が式：［Ｌ−Ｓ_a］_b−Ｃ−［Ｓ_e−Ａ］_f （式中、ＬはＣＲ２受容体に結合およびそのエンドサイトーシスを誘導できる該リガンドであり；Ａは化学試薬であり；Ｓはスペーサーであり；Ｃは該リガンド、化学試薬およびスペーサーとの共有結合の形成が矛盾なくできる官能基を持つ該水溶性ポリマーであり；ａおよびｅは０または１であり；およびｂおよびｆは整数で少なくとも１である）を持っている請求項第１０項に記載の組成物。１２．Ｃがデキストラン、イヌリン、ポリ（Ｌ−リジン）およびメタアクリルアミド含有ポリマーのみから成る群より選択される請求項第１１項に記載の組成物。１３．ＣＲ２受容体を持たない細胞を含む細胞集団中のＣＲ２受容体を持つ細胞の細胞内へインビトロで化学試薬を特異的に送達する方法であって、以下の工程を含んでいる：（ａ）ＣＲ２受容体を持たない細胞を含む細胞集団中のＣＲ２受容体を持つ細胞内への化学試薬の特異的細胞内送達のための組成物（本質的に該ＣＲ２受容体へ結合および受容体媒介エンドサイトーシスを誘導できるリガンドおよび該リガンドヘ結合された化学試薬のみからなり、ここで該化学試薬は該ＣＲ２受容体を持つ細胞内へ送達された場合に選択された効果を惹起することができる）を提供し、および（ｂ）該リガンドがＣＲ２受容体を持つ細胞上の該ＣＲ２受容体へ接触および結合し、および該組成物のエンドサイトーシスを惹起する条件下で有効量の該組成物を該細胞集団と接触させる。１４．該ＣＲ２受容体を持つ細胞がＢリンパ球である請求項第１３項に記載の方法。１５．該リガンドが配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：６、および配列ＩＤ番号：９のみから成る群より選択されるアミノ酸配列を持つペプチドを含む請求項第１４項に記載の方法。１６．該化学試薬が細胞毒素、形質転換核酸、遺伝子調節物質、標識、抗原および薬剤のみから成る群より選択される請求項第１５項に記載の方法。１７．さらに該リガンドおよび該化学試薬の間に共有結合で結合されおよび挿入されたスペーサーを含む請求項第１６項に記載の方法。１８．該スペーサーが生分解可能である請求項第１７項に記載の方法。１９．該スペーサーがペプチドを含む請求項第１８項に記載の組成物。２０．該リガンドが本明細書で配列ＩＤ番号：１として与えられた配列を持つペプチドでありおよび該化学試薬がリシンＡである請求項第１９項に記載の方法。２１．該スペーサーが生分解可能ではない請求項第１７項に記載の方法。２２．該組成物がさらに水溶性ポリマー、リポソームおよび粒子状物のみから成る群より選択される担体を含む請求項第１６項に記載の方法。２３．該担体が水溶性ポリマーでありおよび該組成物が式：［Ｌ−Ｓ_a］_b−Ｃ−［Ｓ_e−Ａ］_f （式中、ＬはＣＲ２受容体に結合およびそのエンドサイトーシスを誘導できる該リガンドであり；Ａは該化学試薬であり；Ｓはスペーサーであり；Ｃは該リガンド、化学試薬およびスペーサーとの共有結合の形成が矛盾なくできる官能基を持つ該水溶性ポリマーであり；ａおよびｅは０または１であり；およびｂおよびｆは整数で少なくとも１である）を持っている請求項第２２項に記載の方法。２４．Ｃがデキストラン、イヌリン、ポリ（Ｌ−リジン）およびメタアクリルアミド含有ポリマーのみから成る群より選択される請求項第２３項に記載の方法。２５．温血動物のＣＲ２受容体を持つ細胞の細胞内へ化学試薬を特異的に送達する方法であって、以下の工程を含んでいる：（ａ）ＣＲ２受容体を持たない細胞を含む細胞集団中のＣＲ２受容体を持つ細胞内への化学試薬の特異的細胞内送達のための組成物（本質的に該ＣＲ２受容体へ結合および受容体媒介エンドサイトーシスを誘導できるリガンドおよび該リガンドヘ結合された化学試薬のみからなり、ここで該化学試薬は該ＣＲ２受容体を持つ細胞内へ送達された場合に選択された効果を惹起することができる）を提供し、および（ｂ）該リガンドがＣＲ２受容体を持つ細胞上の該ＣＲ２受容体へ接触および結合し、および該組成物のエンドサイトーシスを惹起する条件下で有効量の該組成物を該温血動物に全身的に投与する。２６．該ＣＲ２受容体を持つ細胞がＢリンパ球である請求項第２５項に記載の方法。２７．該リガンドが配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：６、および配列ＩＤ番号：９のみから成る群より選択されるアミノ酸配列を持つペプチドを含む請求項第２６項に記載の方法。２８．該化学試薬が細胞毒素、形質転換核酸、遺伝子調節物質、標識、抗原および薬剤のみから成る群より選択される請求項第２７項に記載の方法。２９．さらに該リガンドおよび該化学試薬の間に共有結合で結合されおよび挿入されたスペーサーを含む請求項第２８項に記載の組成物。３０．該スペーサーが生分解可能である請求項第２９項に記載の組成物。３１．該スペーサーがペプチドを含む請求項第３０項に記載の組成物。３２．該リガンドが本明細書で配列ＩＤ番号：１として与えられた配列を持つペプチドでありおよび該化学試薬がリシンＡである請求項第３１項に記載の組成物。３３．該スペーサーが生分解可能ではない請求項第２９項に記載の組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 17/08 17/08 19/00 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:69） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ＣＲ２受容体を持たない細胞を含む細胞集団中のＣＲ２受容体を持つ細胞内への化学試薬の特異的細胞内送達のための組成物であって、該ＣＲ２受容体へ結合および受容体媒介エンドサイトーシスを誘導できるリガンドおよび該リガンドへ結合された化学試薬を含み、ここで該化学試薬は該ＣＲ２受容体を持つ細胞内へ送達された場合に選択された効果を惹起することができる。２．該ＣＲ２受容体を持つ細胞がＢリンパ球である請求項第１項に記載の組成物。３．該リガンドが配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：９およびそれらと実質的に相同である配列のみから成る群より選択されるアミノ酸配列を持つペプチドを含む請求項第２項に記載の組成物。４．該化学試薬が細胞毒素、形質転換核酸、遺伝子調節物質、標識、抗原および薬剤のみから成る群より選択される請求項第３項に記載の組成物。５．さらに該リガンドおよび該化学試薬の間に共有結合で結合されおよび挿入されたスペーサーを含む請求項第４項に記載の組成物。６．該スペーサーが生分解可能である請求項第５項に記載の組成物。７．該スペーサーがペプチドを含む請求項第６項に記載の組成物。８．該リガンドが本明細書で配列ＩＤ番号：１として与えられた配列を持つペプチドでありおよび該化学試薬がリシンＡである請求項第７項に記載の組成物。９．該スペーサーが生分解可能ではない請求項第５項に記載の組成物。１０．該組成物がさらに水溶性ポリマー、リポソームおよび粒子状物のみから成る群より選択される担体を含む請求項第４項に記載の組成物。１１．該担体が水溶性ポリマーでありおよび該組成物が式：［Ｌ−Ｓ_a］_b−Ｃ−［Ｓ_e−Ａ］_f （式中、ＬはＣＲ２受容体に結合およびそのエンドサイトーシスを誘導できる該リガンドであり；Ａは該化学試薬であり；Ｓはスペーサーであり；Ｃは該リガンド、化学試薬およびスペーサーとの共有結合の形成が矛盾なくできる官能基を持つ該水溶性ポリマーであり；ａおよびｅは０または１であり；およびｂおよびｆは整数で少なくとも１である）を持っている請求項第１０項に記載の組成物。１２．Ｃがデキストラン、イヌリン、ポリ（Ｌ−リジン）およびメタアクリルアミド含有ポリマーのみから成る群より選択される請求項第１１項に記載の組成物。１３．ＣＲ２受容体を持たない細胞を含む細胞集団中のＣＲ２受容体を持つ細胞の細胞内へインビトロで化学試薬を特異的に送達する方法であって、以下の工程を含んでいる：（ａ）ＣＲ２受容体を持たない細胞を含む細胞集団中のＣＲ２受容体を持つ細胞内への化学試薬の特異的細胞内送達のための組成物（該ＣＲ２受容体へ結合および受容体媒介エンドサイトーシスを誘導できるリガンドおよび該リガンドヘ結合された化学試薬を含み、ここで該化学試薬は該ＣＲ２受容体を持つ細胞内へ送達された場合に選択された効果を惹起することができる）を提供し、および（ｂ）該リガンドがＣＲ２受容体を持つ細胞上の該ＣＲ２受容体へ接触および結合し、および該組成物のエンドサイトーシスを惹起する条件下で有効量の該組成物を該細胞集団と接触させる。１４．該ＣＲ２受容体を持つ細胞がＢリンパ球である請求項第１３項に記載の方法。１５．該リガンドが配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：９およびそれらと実質的に相同である配列のみから成る群より選択されるアミノ酸配列を持つペプチドを含む請求項第１４項に記載の方法。１６．該化学試薬が細胞毒素、形質転換核酸、遺伝子調節物質、標識、抗原および薬剤のみから成る群より選択される請求項第１５項に記載の方法。１７．さらに該リガンドおよび該化学試薬の間に共有結合で結合されおよび挿入されたスペーサーを含む請求項第１６項に記載の方法。１８．該スペーサーが生分解可能である請求項第１７項に記載の方法。１９．該スペーサーがペプチドを含む請求項第１８項に記載の組成物。２０．該リガンドが本明細書で配列ＩＤ番号：１として与えられた配列を持つペプチドでありおよび該化学試薬がリシンＡである請求項第１９項に記載の方法。２１．該スペーサーが生分解可能ではない請求項第１７項に記載の方法。２２．該組成物がさらに水溶性ポリマー、リポソームおよび粒子状物のみから成る群より選択される担体を含む請求項第１６項に記載の方法。２３．該担体が水溶性ポリマーでありおよび該組成物が式：［Ｌ−Ｓ_a］_b−Ｃ−［Ｓ_e−Ａ］_f （式中、ＬはＣＲ２受容体に結合およびそのエンドサイトーシスを誘導できる該リガンドであり；Ａは該化学試薬であり；Ｓはスペーサーであり；Ｃは該リガンド、化学試薬およびスペーサーとの共有結合の形成が矛盾なくできる官能基を持つ該水溶性ポリマーであり；ａおよびｅは０または１であり；およびｂおよびｆは整数で少なくとも１である）を持っている請求項第２２項に記載の方法。２４．Ｃがデキストラン、イヌリン、ポリ（Ｌ−リジン）およびメタアクリルアミド含有ポリマーのみから成る群より選択される請求項第２３項に記載の方法。２５．温血動物のＣＲ２受容体を持つ細胞の細胞内へ化学試薬を特異的に送達する方法であって、以下の工程を含んでいる：（ａ）ＣＲ２受容体を持たない細胞を含む細胞集団中のＣＲ２受容体を持つ細胞内への化学試薬の特異的細胞内送達のための組成物（該ＣＲ２受容体へ結合および受容体媒介エンドサイトーシスを誘導できるリガンドおよび該リガンドヘ結合された化学試薬を含み、ここで該化学試薬は該ＣＲ２受容体を持つ細胞内へ送達された場合に選択された効果を惹起することができる）を提供し、および（ｂ）該リガンドがＣＲ２受容体を持つ細胞上の該ＣＲ２受容体へ接触および結合し、および該組成物のエンドサイトーシスを惹起する条件下で有効量の該組成物を該温血動物に全身的に投与する。２６．該ＣＲ２受容体を持つ細胞がＢリンパ球である請求項第２５項に記載の方法。２７．該リガンドが配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：９およびそれらと実質的に相同である配列のみから成る群より選択されるアミノ酸配列を持つペプチドを含む請求項第２６項に記載の方法。２８．該化学試薬が細胞毒素、形質転換核酸、遺伝子調節物質、標識、抗原および薬剤のみから成る群より選択される請求項第２７項に記載の方法。２９．さらに該リガンドおよび該化学試薬の間に共有結合で結合されおよび挿入されたスペーサーを含む請求項第２８項に記載の組成物。３０．該スペーサーが生分解可能である請求項第２９項に記載の組成物。３１．該スペーサーがペプチドを含む請求項第３０項に記載の組成物。３２．該リガンドが本明細書で配列ＩＤ番号：１として与えられた配列を持つペプチドでありおよび該化学試薬がリシンＡである請求項第３１項に記載の組成物。３３．該スペーサーが生分解可能ではない請求項第２９項に記載の組成物。３４．該組成物がさらに水溶性ポリマー、リポソームおよび粒子状物のみから成る群より選択される担体を含む請求項第２８項に記載の方法。３５．該担体が水溶性ポリマーでありおよび該組成物が式：［Ｌ−Ｓ_a］_b−Ｃ−［Ｓ_e−Ａ］_f （式中、ＬはＣＲ２受容体に結合およびそのエンドサイトーシスを誘導できる該リガンドであり；Ａは該化学試薬であり；Ｓはスペーサーであり；Ｃは該リガンド、化学試薬およびスペーサーとの共有結合の形成が矛盾なくできる官能基を持つ該水溶性ポリマーであり；ａおよびｅは０または１であり；およびｂおよびｆは整数で少なくとも１である）を持っている請求項第３４項に記載の方法。３６．Ｃがデキストラン、イヌリン、ポリ（Ｌ−リジン）およびメタアクリルアミド含有ポリマーのみから成る群より選択される請求項第３５項に記載の方法。３７．宿主の形質転換のために適応させた組換え体ベクターであって、該ベクターはＣＲ２受容体結合およびエンドサイトーシス誘導リガンドおよび化学試薬を含む融合タンパク質をコードしているＤＮＡセグメントを含んでいるベクター。３８．該ベクターがプラスミドを含んでいる請求項第３７項に記載の組換え体ベクター。３９．該リガンドが配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：９およびそれらと実質的に相同である配列のみから成る群より選択されるアミノ酸配列を持つペプチドを含む請求項第３８項に記載の組換え体ベクター。４０．該リガンドが本明細書で配列ＩＤ番号：１として同定されたアミノ酸配列を持つ請求項第３９項に記載の組換え体ベクター。４１．該化学試薬が細胞毒素を含む請求項第４０項に記載の組換え体ベクター。４２．該細胞毒素がリシンＡを含む請求項第４１項に記載の組換え体ベクター。４３．該化学試薬が抗原を含む請求項第４０項に記載の組換え体ベクター。４４．該化学試薬が遺伝子調節物質、標識および薬剤のみから成る群より選択される請求項第４０項に記載の組換え体ベクター。４５．ＣＲ２受容体結合およびエンドサイトーシス誘導リガンドおよび化学試薬を含む融合タンパク質をコードしているＤＮＡセグメント。４６．該リガンドが配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：９およびそれらと実質的に相同である配列のみから成る群より選択されるアミノ酸配列を持つペプチドを含む請求項第４５項に記載のＤＮＡセグメント。４７．該リガンドが本明細書で配列ＩＤ番号：１として同定されたアミノ酸配列を持つ請求項第４６項に記載のＤＮＡセグメント。４８．該化学試薬が細胞毒素を含む請求項第４７項に記載のＤＮＡセグメント。４９．該細胞毒素がリシンＡを含む請求項第４８項に記載のＤＮＡセグメント。５０．該化学試薬が抗原を含む請求項第４７項に記載のＤＮＡセグメント。５１．該化学試薬が遺伝子調節剤、標識および薬物のみからなる群から選択される請求項第４７項に記載のＤＮＡセグメント。