KR0169729B1 - 하이브리드 단백질, 이의 생산방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물 - Google Patents

하이브리드 단백질, 이의 생산방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

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Description

하이브리드 단백질, 이의 생산방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물
통상적인 암화학요법은 암환자의 종양 세포를 살해하는 약물의 능력에 의존한다. 유감스럽게도, 이러한 약물은 종양 세포 뿐만 아니라 정상 세포도 빈번하게 살해한다. 항암제가 정상 세포보다는 종양세포를 살해하는 정도가 종양세포에 대한 화합물의 선택성의 지표이다. 항암제의 종양세포 선택성을 증가시키는 방법중 하나는 약물을 정상 세포집단은 피하면서 종양 세포에 우선적으로 수송하는 것이다. 특정 세포 집단에 화학요법제를 선택적으로 수송하는 것을 다른 용어로는 표적화(targeting)라 한다. 종양 세포에 대한 약물 표적화는 몇가지 방법으로 달성할 수 있다. 이러한 방법중 하나는 종양 세포 표면에서 발견되는 특이적 수용체 분자의 존재에 달려있다. 표적화제(targeting agent)로 언급되는 기타 분자는 이들 세포 표면 수용체를 인지하여 이 수용체에 결합할 수 있다. 이러한 표적화제에는 예를 들면, 항체, 생장 인자 또는 호르몬이 포함된다. 특이적 세포 표면 수용체를 인지하고 이에 결합하는 표적화제는 이들 수용체를 갖고 있는 세포를 표적화 한다고 말한다. 예를 들면, 다수의 종양 세포는 자체의 표면에 표피 생장 인자 수용체라 불리는 단백질을 지닌다. 표피 생장 인자(EGF) 및 형질전환 생장 인자-α(TGF-α)를 포함한 몇몇 생장 인자는 종양 세포의 EGF 수용체를 인지하여 이에 결합한다. 따라서 EFG 및 TGF-α는 이들 종양 세포에 대한 표적화제이다.
표적화제는 그 자체로는 종양 세포를 살해하지 않는다. 세포독 또는 독소를 포함한 기타 분자들은 종양 세포 표적화 영역 및 세포 독소 영역 모두를 함유하는 하이브리드 분자를 생성시키기 위하여 표적화제에 연결시킬 수 있다. 이들 하이브리드 분자는 종양 세포를 표적화한 후 자체의 독소 성분을 통하여 종양 세포를 살해하는 그들의 능력에 의해 종양 세포 선택적인 독으로서 작용한다. 이러한 하이브리드 분자의 작제에 사용된 가장 강한 세포 독중 일부는 포유동물 세포에서 단백질 합성을 억제시키는 세균 독소이다. 슈도모나스 외독소 A는 이러한 세균 독소중의 하나이며, 하이브리드 표적화-독소분자를 작제하는데 사용되어 왔다(미합중국 특허 제4,545,985호).
슈도모나스 외독소 A는 먼저 포유동물의 세포 표면에 결합한 후 세포의 세포질내로 들어가서 단백질 합성에 요구되는 세포 단백질인 신장 인자 2를 불활성화 시킴으로써 포유동물 세포를 중독시킨다. 슈도모나스 외독소 A는 모노클로날 항체와 단백질 호르몬을 사용하여 항암성 하이브리드 분자를 작제하는데 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 하이브리드 분자와 관련하여 제기되는 한가지 문제점은 이들이 정상 세포에 대해서도 독성을 나타낸다는 점이다. 슈도모나스 외독소 A를 함유하는 하이브리드 분자와 관련한 독성중 적어도 일부는 그 자체에 의해 여러 유형의 포유동물 세포에 결합하여 세포내로 들어가는 슈도모나스 외독소 A의 능력에 기인한다. 그러므로, 슈도모나스 외독소 A와 특이적인 표적화제간에 형성된 하이브리드 분자는 표적화제에 의해 인지된 세포뿐만 아니라 다수의 정상 세포와도 결합할 수 있다. 이러한 문제를 다루기 위한 한가지 방법은 정상 세포에 더 이상 결합할 수 없도록 슈도모나스 외독소 A를 변형시키는 것이다. 이러한 과정은 세포결합 활성에 관여하는 슈도모나스 외독소 A분자의 일부분을 제거시킴으로써 달성할 수 있다. 신장 인자 2를 불활성화시키는 능력은 보유하지만 포유동물 세포에 더 이상 결합할 수 없는 절단된 형태의 슈도모나스 외독소 A 분자는 제조되어져 있다. 이렇게 변형된 슈도모나스 외독소 A분자를 슈도모나스 외독소-40 또는 PE40[참조 문헌: Hwang et al., Cell 48:129-136 1987]이라 한다.
PE40은 TGF-α를 포함한 몇몇 표적화 분자에 연결된다[참조 문헌: Chaudhary et al., PNAS USA 84:4583-4542 1987]. TGF-α의 경우, PE40및 TGF-α 영역을 함유하는 하이브리드 분자는 EGF 수용체를 지니는 종양 세포에 특이적으로 결합할 수 있고 단백질 합성을 억제시킴으로써 이들 세포를 중독시킬 수 있다. 이러한 하이브리드 분자가 EGF 수용체에 효율적으로 결합하기 위해서는 적절한 구조를 가져야 한다. 효과적인 수용체 결합은 또한 결합하기 쉽도록 적절히 노출된 표적화 영역의 함유 여부에 좌우된다. TGF-α와 PE40하이브리드 분자가 재조합 DNA 기술을 사용하여 세균내에서의 융합 단백질로서 생성될 때 이들 대부분의 하이브리드 분자들은 불량한 EGF 수용체 결합 활성을 나타낸다.
[참조 문헌]
1. 미합중국 특허 제4,545,985호에는 슈도모나스 외독소 A가 항체 또는 표피 생장 인자에 결합할 수 있다고 교시되어 있다. 당해 특허에는 또한 이러한 결합체를 이용하여 사람 종양 세포를 살해할 수 있다고 교시되어 있다.
2. 미합중국 특허 제4,664,911호에는 항체를 식물로부터 수득한 독소인 리신의 A쇄 또는 B쇄에 결합시킬 수 있다고 교시되어 있다. 당해 특허는 또한 이러한 결합체를 사용하여 사람 종양 세포를 살해할 수 있다고 교시되어 있다.
3. 미합중국 특허 제4,675,382호에는 흑혈구 자극 호르몬(MSH)과 같은 호르몬이 펩타이드 결합을 통해 디프테리아 독소 단백질의 부분에 연결될 수 있다고 교시되어 있다. 당해 특허에는 또한 재조합 DNA 기술을 사용하여 이러한 단백질을 암호화하는 유전자를 함께 연결시켜서 하이브리드 융합 단백질의 합성을 유도할 수 있다고 교시되어 있다. 당해 융합 단백질은 MSH 수용체를 지니는 세포에 결합하는 능력을 갖는다.
4. 문헌 [참조:Murphy et al., PNAS USA 83:8258-8262 1986, 디프테리아 독소가 관련된 α-흑혈구-자극 호르몬 융합 단백질의 유전자 구조, 발현 및 흑색종-선택적인 세포 독성]에는 재조합 DNA 기술을 사용하여 세균내에서 생성되고 α-흑혈구-자극 호르몬에 연결된 디프테리아 독소 단백질의 일부분으로 이루어진 하이브리드 융합 단백질이 사람 흑색종 세포에 결합하여 이를 살해한다고 교시되어 있다.
5. 문헌[참조: Kelly et al., PNAS USA 85:3980-3984 1988, 생체내에서 세포-중재된 면역성을 제거할 수 있는 인터루킨 2-디프테리아 독소 융합 단백질]에는 재조합 DNA 기술을 사용하여 세균내에서 생성되고 인터루킨 2 기능기에 연결된 디프테리아 독소 단백질 일부분으로 이루어진 하이브리드 융합 단백질이 누드 마우스내에서 세포 중재된 면역성을 억제한다고 교시되어 있다.
6. 문헌[참조: Allured et al., PNAS USA 83:1320-1324 1986, 3.0Å에서 슈도모나스 에루기노사의 외독소 A의 구조]에는 슈도모나스 외독소 A 단백질의 3차원적 구조가 교시되어 있다.
7. 문헌[참조: Hwang et al., Cell 48:129-136 1987, 이. 콜라이내에서 발현된 유전자의 결실 분석으로 확인된 슈도모나스 외독소의 작용성 영역]에는 슈도모나스 외독소 A 단백질이 다음과 같은 3가지의 명백한 작용 영역으로 나누어질 수 있다고 교시되어 있다: 포유동물 세포에 대한 결합에 관여하는 영역, 라이소좀 막을 통과하는 독소 단백질의 전위에 관여하는 영역, 및 포유동물 세포내부의 신장 인자 2의 ADP 리보실화에 관여하는 영역. 이 문헌에는 이들 작용영역이 슈도모나스 외독소 A 단백질의 명백한 영역에 상응한다고 교시되어 있다.
8. 1988년 3월 30일자로 공개된 유럽 특허원 제0 261 671호에는 슈도모나스 외독소 A 단백질의 일부분이, 전반적인 슈도모나스 외독소 A 단백질의 세포 결합 기능을 상실하고 있으나 전체 슈도모나스 외독소 A 단백질의 전위 및 ADP 리보실화 기능을 지니는 슈도모나스 외독소 A 단백질이 생성될 수 있다고 교시하고 있다. 전체 슈도모나스 외독소 A 단백질의 전위 및 ADP 리보실화 기능을 보유하는 슈도모나스 외독소 A 단백질 일부분을 슈도모나스 외독소 -40 또는 PE-40이라 부른다. PE-40은 문헌[참조: Gray et al., PNAS USA 81:2645-2649, 1984]에 정의된 바와 같이 전체 슈도모나스 외독소 A 단백질의 252번 내지 613번 아미노산 잔기로 이루어진다. 상기 특허원에는 또한 PE-40을 형질전환 생장 인자-α에 결합시켜 재조합 DNA 기술을 사용하여 하이브리드 융합 단백질을 생성시킬 수 있다고 교시하고 있다.
9. 문헌[참조: Chaudhary et al., PNAS USA 84:4538-4542 1987, 형질전환 생장인자 α 유형과 슈도모나스 독소 사이의 재조합 융합 단백질의 활성]에는 PE-40과 형질전환 생장인자-α사이에 형성되며 재조합 DNA 기술을 사용하여 세균내에서 생성된 하이브리드 융합 단백질이 표피 생장 인자 수용체를 지니는 사람 종양 세포에 결합하여 이를 살해할 것이라는 사실이 교시되어 있다.
10. 문헌[참조: Bailon, Biotechnology, pp. 1326-1329 Nov. 1988, 인터루킨 2-슈도모나스 외독소 융합 단백질의 정제 및 부분적 특성화]에는 PE-40과 인터루킨 2사이에 형성되며 재조합 DNA 기술을 사용하여 세균내에서 생성되는 하이브리드 융합 단백질이 인터루킨 2 수용체를 지니는 사람 세포주에 결합하여 이를 살해할 것이라는 사실이 교시되어 있다.
본 발명의 한 목적은 표적화제와 변형된 PE40분자 사이에 형성된 하이브리드 분자가, 표적화제를 인지하는 세포 수용체에 효과적으로 결합되도록 PE40을 변형시키는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 세균내에서 표적화제와 변형된 PE40사이에서 융합 단백질로서, 형성된 하이브리드 단백질을 회수하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 세포 수용체 결합영역(또는 부분)과 PE40영역(또는 부분)을 갖는 하이브리드(또는 융합) 단백질을 제공하는 것이며, 여기에서 PE40영역은 표피 생장 인자 수용체 또는 변형된 PE40에 연결된 표적화제에 의해 결합된 수용체에 결합하는 하이브리드 단백질의 결합을 향상시키도록 변형된다. 또 다른 목적은 보다 용이하게 정제되는 하이브리드 단백질을 제공하는 것이다. 본 발명의 이들 목적 및 기타의 목적은 하기 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 단백질 표적화 영역에 결합된 변형된 PE40영역을 포함하는 하이브리드 분자를 제공하는 것이다. 변형된 PE40영역은 이러한 하이브리드 분자의 수용체 결합 활성을 향상시킨다. 예를 들면, PE40중의 시스테인 잔기가 알라닌으로 치환되는 것과 같이 기타 아미노산의 치환, 또는 시스테인 잔기의 결실에 의해, 표적화 영역에 의해 인지된 수용체에 대한 하이브리드 분자의 결합을 향상시킨다. 본 발명의 하이브리드 분자는 변형되지 않은 PE40을 갖는 하이브리드 분자보다 효과적으로, 사람 종양세포에서 표적화된 수용체에 결합한다.
TGF-α와 PE40사이에 형성된 하이브리드 분자는 3회의 주요 검정 시스템으로 특성화된다. 이들 검정으로는: 포유동물 세포 단백질 합성을 억제하는 TGF-α PE40의 효소활성을 측정하는 신장인자 2의 ADP 리보실화; TGF-α-PE40의 EGF 수용체 결합 활성을 측정하는, A431 세포로부터의 막 소포상의 EGF 수용체에 결합하는 방사선 표지된 EGF 결합의 억제; 및 TGF-α-PE40에 노출된 후 종양 세포의 생존율을 측정하기 위하여 이용되는, 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)에서 포르마잔으로의 전환에 의해 검정되는 바와 같은 세포 증식을 포함한다. 이들 검정은 이미 기술된 바와 같이 수행한다[참조: Dominic et al., Infection and Immunity 16: 832-841 1977, Cohen et al., J. Biol. Chem. 257:1523-1531 1982, Riemen et al., Peptides 8:877-885 1987, Mosmann J. Immunol. Methods 65:55-63 1983].
우수한 수용체 결합 특성을 가진 신규의 TGF-α-PE40하이브리드 분자를 생성시키기 위해, 본 발명자들은 우선 TGF-α-PE40또는 TGF-α-PE40의 특이적으로 변형된 변형체를 암호화 하는 일련의 재조합 DNA 분자를 제조하였다. 원래의 또는 모든 TGF-α-PE40유전자는 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같은 클로닝된 DNA의 명백한 단편을 사용하여 세균 TAC 발현 플라스미드 벡터(pTAC TGF57-PE40)내에서 분자적으로 클로닝시킨다. TGF-α-PE40DNA의 특이적으로 변형된 변형체를 작제하기 위해 pTAC TGF57-PE40 DNA클론을 출발물질로 사용한다. pTAC TGF57-PE40 DNA의 특이적 변형은, pTAC TGF57-PE40 DNA의 PE40영역내 2개 또는 4개의 시스테인 코돈을 다른 아미노산 코돈으로 교체시키는데 필요한 DNA 암호화 서열내의 부위 특이적 돌연변이를 포함한다. 달리는, 부위 특이적 돌연부위를 유발시켜 pTAC TGF57-PE40의 PE40영역내 2개 또는 4개의 시스테인 코돈을 결실시킨다. 문헌[Winter et al., Nature 299:756-758 1982]의 방법을 사용하여 pTAC TGF57-PE40 DNA의 부위 특이적 돌연변이를 작제한다. 돌연변이된 pTAC TGF57-PE40 DNA의 특이적 예가 실시예 3에 예시된다. pTAC TFG57-PE40 DNA에 의해 암호화된 하이브리드 단백질의 아미노산 서열은 표 3에 예시된다. 모 TGF-α-PE40 하이브리드 단백질의 PE40 영역내 4개의 시스테인 잔기는 Cys265, Cys287, Cys372및 Cys379의 잔기로 지정된다(표 3). 아미노산 잔기들은 문헌[Gray et al., PNAS USA 81:2645-2649 (1984)]에 정의된 바와 같이 번호가 매겨진 것이다. 특이적으로 돌연변이된 pTAC TGF57-PE40 DNA로부터 생성된 변형된 TGF-α-PE40하이브리드 단백질은 [Cys265및 Cys287] 또는 [Cys372및 Cys379] 또는 [Cys265, Cys287, Cys372및 Cys379] 잔기의 치환 또는 결실을 포함한다. 이들 돌연변이된 pTAC TGF57-PE40 DNA에서 생성된 변형된 하이브리드 단백질을 기술하기 위한 명명법은 단순화하기 위해 본 발명자들은 265 및 287번 위치의 아미노산 잔기를 A 좌위 및 372 및 379번 위치의 잔기를 B 자위라고 지정한다. 모 TGF-α-PE40하이브리드 분자에서와 같이 아미노산 잔기 265 및 287번에 시스테인이 존재하는 경우, 이 좌위를 대문자로 표시한다(예 A). 시스테인이 예를 들어 알라닌, 페닐알라닌, 발린, 루이신 또는 이소루이신과 같은 다른 아미노산으로 치환되거나, 잔기 265 및 287번에서 결실되면 이 자위는 소문자 a로 표시한다. 유사하게 372 및 379번 위치의 아미노산 잔기가 시스테인이면 이 좌위는 대문자 B로 표시하며, 372 및 379번 위치의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되거나 결실되면 이 좌위는 소문자 b로 표시한다. 따라서 TGF-α-PE40의 PE40영역내 4개의 모든 시스테인 잔기가 알라닌으로 치환되면 이러한 변형된 하이브리드 단백질은 TGF-α-PE40ab로 지정된다. 유사한 양상으로, 아미노산 잔기 265, 287, 372 및 379번 위치에 시스테인이 있는 모 TGF-α-PE40하이브리드 단백질은 TGF-α-PE40AB로 지정한다.
TGF-α-PE40AB 하이브리드 단백질 및 변형된 TGF-α-PE40하이브리드 단백질은 모두 문헌[참조: Linemeyer et al., Bio-Technology 5:960-965 1987]에 기술된 TAC 발현 벡터 시스템을 사용하여 이. 콜라이 내에서 생성시킨다. 이들 세균 중에서 생성된 재조합 하이브리드 단백질을 수거하고 구아니딘 하이드로클로라이드 중에서 세균을 용해시킨 다음 아황산나트륨 및 나트륨 테트라티오네이트를 가해 정제시킨다. 계속하여 이 반응 혼합물을 투석하고 우레아를 가하여 용액으로부터 침전된 단백질을 가용화시킨다. 그런 다음 혼합물을 원심분리하여 불용성 단백질을 제거하고 재조합 하이브리드 TGF-α-PE40단백질을 이온교환 크로마토그래피에 이어 크기 배출 크로마토그래피, 그리고 다시 이온교환 크로마토그래피를 사용하여 분리한다. 그런 다음 정제된 TGF-α-PE40하이브리드 단백질을 β-머캅토에탄올과 같은 환원제에 노출시켜 하이브리드 단백질 내의 시스테인 잔기의 쌍 사이에 디설파이드 결합이 형성되게 한다. 마지막으로, 재폴딩된 하이브리드 단백질을 크기 배출 및 이온 교환 크로마토그래피시켜 아주 순수한 TGF-α-PE40단백질을 분리한다. 이 정제방법은 실시예 2에 아주 상세히 기술되어 있다. 일단 정제되고 재폴딩된 다음에는 이들 하이브리드 단백질의 생물학적 활성을 상기한 ADP 리보실화, EGF 수용체결합, 및 세포증식 검정을 통해 특성화할 수 있다.
TGF-α-PE40의 중요한 용도는 EGF 수용체를 지닌 세포에 결합하여 이를 살해하는 능력에 있다. 많은 사람 종양 세포는 EGF 수용체를 갖기 때문에 TGF-α-PE40의 세포-살해 효과에 민감하다. 케라티노사이트를 포함한 사람의 기타 비-종양 세포도 EGF 수용체를 지니므로 또한 TGF-α-PE40의 세포-살해 활성에 민감하다. 건선 및 우췌를 포함한 여러 가지 사람 질환에서는 케라티노사이트의 증가된 증식이 특징이다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이나, 본 발명이 이에 한정되지는 않는다. 분자적 생물 조작에 요구되는 모든 효소 반응은 달리 명시하지 않는한, 문헌[참조: Maniatis et al. (1982) In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press]에 기술된 대로 수행한다.
[실시예 1]
[재조합 TGF-α-PE40융합 단백질의 생산 및 분리]
[융합 단백질의 생산]
형질전환된 이.콜라이 JM-109세포를 37℃에서 1ℓ짜리 진탕 플라스크 내 앰피실린 100㎍/ml의 존재하에 LB-브로스(Broth) 500ml중에서 배양시킨다. A600 분광광도계적 흡광치가 0.6에 달한 후에, 이소프로필 B-D-티오-갈락토피라노사이드를 가하여 최종 농도가 1mM이 되게 한다. 2시간 후에 세포를 원심분리에 의해 수거한다.
[융합 단백질의 S-설폰화]
세포를 실온에서 2시간 동안 교반시키면서 8M 구아니딘 하이드로클로라이드, 50mM 트리스(pH8.0), 1mM EDTA중에 용해시킨다. 용해 혼합물에 고체 시약을 가하여 0.4M 아황산나트륨 및 0.1M 나트륨 테트라티오네이트와 혼합하고 1M NaOH로 pH가 9.0이 되게 한다. 반응을 실온에서 16시간동안 진행시킨다.
[크로마토그래피용 제제]
단백질 용액을 4℃에서 10,000배 과량의 1mM EDTA에 대해 투석한다. 그런 다음 혼합물을 6M 우레아, 50mM트리스(pH 8.0), 50mM NaCl과 혼합하여 2시간 동안 교반한다. 32,000xg로 30분 동안 원심분리시켜 용해되지 않는 물질을 제거한다.
[DEAE F.F. 세파로스 크로마토그래피]
전 단계로부터의 맑은 상등액을 1ml/분의 유속으로 6M 우레아, 50mM 트리스(pH 8.0), 50mM NaCl로 평형화시킨 26×40cm의 DEAE 급속 유동 칼럼(Pharmacia LKB Biotechnology Inc.)에 적용시킨다. 칼럼을 평형 완충액으로 세척하여 비흡착 물질을 모두 제거하여 칼럼 내에 존재하는 평형 완충액에서 UV280 분광광도계적 흡광치가 0.1 이하가 되는 것을 확인한다. 흡착된 융합 단백질을 50 내지 350mM NaCl 1000ml 구배를 사용하여 칼럼으로부터 용출시킨 다음 YM-30 막이 갖춰진 교반된 세포 아미콘 농축기 내에서 농축시킨다.
[세파크릴 S-300]
농축된 융합 단백질(8ml)을 0.25ml/분의 유속으로 6M 우레아, 50mM 트리스(pH 8.0), 50mM NaCl로 평형화시킨 2.6×100cm 세파크릴 S-300 칼럼(Pharmacia LKB Biotechnology Inc.)에 적용시킨다. 칼럼을 추가의 평형 완충액으로 용출시켜 분획 3ml을 수집한다. TGF-α-PE40활성을 갖는 분획을 수거한다.
[Q-세파로즈 크로마토그래피]
S-300 칼럼으로부터 수거한 분획을 0.7ml/분의 유속으로 6M 우레아, 50mM트리스(pH 8.0), 50mM NaCl로 평형화시킨 1.6×40cm Q-세파로즈 칼럼에 적용시킨다. 칼럼을 평형 완충액으로 세척한 다음 50 내지 450mM NaCl 600ml구배로 용출시킨다. TGF-α-PE40활성을 갖는 분획을 수거한 다음 50mM 글리신(pH 9.0)에 대해 투석하여 -20℃에서 저장한다.
[재폴딩]
단백질 샘플을 해동시키고 50mM 글리신(pH 10.5)중에서 UV의 분광광도계적 흡수가 A280 = 0.1이 되게 희석시킨다. β-머캅토 에탄올을 가하여 단백질 샘플중에 존재하는 S-설포네이트 그룹의 이론치에 대해 몰비가 4:1이 되게 한다. 반응을 4℃에서 16시간 동안 진행시킨 다음 용액을 10,000배 과량의 생리학적 완충 식염수에 대해 투석한 다음 -20℃에서 저장한다.
[실시예 2]
[TGF-α-PE40DNA를 함유하는 재조합 DNA 클론의 작제]
TGF-α DNA 단편은 문헌[참조: Defeo-Jones et al., Molecular and Cellular Biology 8: 2999-3007, 1988]에 기술된 바와 같이 3세트의 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 작제한다. 상기의 합성 TGF-α 유전자를 pCU-19 내로 클로닝한다. 재조합 사람 TGF-α를 함유하는 pUC-19 클론으로부터 생성된 DNA를 SphI 및 EcoRI로 분해한다. 상기 분해로 pUC-19 및 TGF-α의 5' 부분을 모두 함유하는 2.8kb의 DNA 단편이 생성된다. 2.8kb 단편을 정제하여 겔 전기영동으로 분리한다. EcoRI 내지 SphI 올리고뉴클레오타이드 카세트가 합성된다. 상기의 합성 카세트는 하기 제시된 서열을 갖는다:
Figure kpo00001
편의상, 상기의 올리고뉴클레오타이드 카세트를 57로 칭한다. 카세트 57를 어닐링시켜 환형 플라스미드를 형성하는 TGF-α 함유 2.8kb 단편에 결합시킨다. 카세트를 함유하는 클론은 방사능 표지된 카세트 57 DNA로 하이브리드화시켜 확인한다. 사람 TGF-α의 존재는 DNA 서열 분석으로 확인한다. 서열 분석으로 TGF-α서열의 3' 말단에 새로이 도입된 FspI 부위의 존재를 또한 확인한다. TGF-α-57/pUC-19로 명명되는 상기 플라스미드를 HinDIII 및 FspI로 분해시켜 TGF-α 유전자를 함유하는 168bp 단편(TGF-α-57)를 생성한다. pUC-19의 개별적 제조물을 HinDIII 및 EcoRI으로 분해시켜 2.68kb pUC-19 벡터 DNA를 생성한다. PE40DNA를 플라스미드 pVC8로부터 분리한다[참조: Chaudhary et al., PNAS USA 84:4538-4542 1987]. pVC8을 NdeI를 사용하여 분해한다. 이어서 플러쉬(flush) 말단을 클레노우 반응의 표준조건을 이용하여 이 DNA에 생성시킨다[참조: Maniatis, et al., 상기 참조, p. 113]. 플러쉬-말단 DNA를 EcoRI으로 두 번째 분해시켜 PE40을 함유한 1.3kb EcoRI 내지 NdeI(플러쉬 말단)단편을 생성한다. TGF-α-57 HinDIII 내지 Fspi 단편(168bp)을 2.68kb pUC-19 벡터에 연결시킨다. 밤새 항온처리한 후, 1.3kb EcoRI 내지 NdeI(플러쉬 말단)PE40DNA 단편을 연결혼합물에 가한다. 이 두 번째 연결은 밤새 수행한다. 이어서 연결 반응 생성물을 JM109 세포를 형질전환시키는데 사용한다. pUC-19에서 TGF-α-57 PE40함유 클론을 방사선 표지된 TGF-α-57 PE40DNA에 하이브리드화시켜 확인하고 이 클론으로부터 DNA를 분리시킨다. TGF-α-57 PE40을 pUC-19 벡터로부터 제거하고, 문헌[참조: Linemeyer et al., Bio-Technology 5:960-965 1987]에 기술된 TAC 벡터 시스템에 옮긴다. pUC-19내 TGF-α-57PE40을 HindIII 및 EcoRI으로 분해시켜 TGF-α-57 PE40함유 1.5kb 단편을 생성한다. 플러쉬 말단을 표준 클레노우 반응조건[참조: Maniatis et al., 하기 참조]을 이용하여 이 DNA 단편에 생성시킨다. TAC벡터를 HinDIII 및 EcoRI으로 분해시킨다. 플러쉬 말단을 표준 클레노우 반응조건[참조: Maniatis et al., 하기 참조]을 이용하여 분해된 TAC 벡터의 DNA에 생성시킨다.
겔 전기영동을 사용하여 2.7kb 플러쉬 말단 벡터를 분리한다. 플러쉬 말단화된 TGF-α-57 PE40단편을 플러쉬 말단화된 TAC벡터에 연결시킨다. 이러한 연결에 의해 생성된 플라스미드를 사용하여 JM109세포를 형질전환시킨다. TGF-α-57 PE40을 함유하는 샘플 클론을 상기에서 지시한 바와 같이 하이브리드화시키고 서열 분석함으로써 확인한다. 목적하는 구조를 함유하는 클론을 pTAC TGF 57-PE40으로 명명한다. 이러한 조작에 의해 생성된 플라스미드가 표 1에 도시되어 있다. pTAC TGF-57-PE40DNA내에서 암호화된 TGF-α-PE40융합 단백질의 아미노산 코돈의 뉴클 레오타이드 서열이 표 2에 기술되어 있다. TGF-57-PE40유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열이 표 3에 나타나 있다.
[실시예 3]
[DNA 클론을 함유하는 재조합 TGF-α-PE40의 변형체 작제]
[시스테인에서 알라닌으로의 치환]
[TGF-α-PE40aB]
클론 pTAC TGF 57-PE40을 SphI 및 BamHI로 분해시키고(TGF-α의 C-말단 5개 아미노산 및 PE40의 N-말단 243개 아미노산으로 특정화되는) 750bp SphI-BamHI 단편을 분리시킨다. M13 mp19 벡터 DNA를 SphI 및 BamHI로 절단하고 벡터 DNA를 분리한다. 750bp SphI-BamHI TGF-α-PE40단편을 15℃에서 밤새 M13 벡터 DNA 내로 연결시킨다. 이 연결 혼합물을 사용하여 세균 숙주 세포를 형질전환시키고, 샘플 클론을 분리하여 이의 플라스미드 DNA를 서열 분석함으로써 이들 클론의 적합한 재조합 DNA를 함유하는 지를 확인한다. 돌연변이 유발을 위해 일본쇄 DNA를 제조한다.
올리고뉴클레오타이드(올리고 #132)를 합성하여, HpaI 부위가 PE40의 272번 아미노산 위치에서 TGF-α-PE40DNA에 도입하는 부위 지시된 돌연변이 유발시 사용한다:
Figure kpo00002
이러한 부위 지시된 돌연변이 유발의 한 결과는, PE40의 272번 잔기가 페닐알라닌에서 류신으로 전환된 것이다. 이러한 돌연변이 유발은 윈터 등[참조: Winter et al., Nature, 299: 756-758 1982]이 기술한 바와 같이 수행한다.
새로 만들어진 HpaI 부위를 함유한 샘플 클론을 분리하고, 돌연변이된 유전자 서열이 있는지 확인하기 위해 서열 분석한다. 이 클론은 SphI과 SalI으로 절단한다. TGF-α의 C-말단 5개 아미노산과 PE40의 N-말단 70개 아미노산으로 규정되고 새로이 도입된 HpaI 자리를 함유한 210bp 단편을 분리하여, SphI-SalI부위에서 모 pTAC TGF 57-PE40플라스미드로 다시 아클로닝한다. 세균 숙주세포를 형질전환하고, 샘플 클론을 분리하며, 이 플라스미드 DNA를 서열분석하여 이 클론이 적절한 재조합 DNA를 함유하고 있는지 확인한다. 편의상, 이 클론을 pTAC TGF 57-PE40-132로 명명한다. pTAC TGF 57-PE40-132를 SphI과 HpaI으로 분해하여3.96kb의 DNA 단편을 분리한다. TGF-α의 C-말단 5개 아미노산과 PE40의 N-말단 32개 아미노산의 범위에 걸쳐 있고, SphI과 HpaI 혼용성 말단을 지니고 있는 합성 올리고뉴클레오타이드 카세트(올리고 #153)를 합성하고, 분해된 pTAC TGF 57-PE40-132에 연결한다:
Figure kpo00003
이러한 올리고뉴클레오타이드 카세트는 265번 잔기의 시스테인 암호화 코돈이 알라닌을 암호화하는 코돈으로 바뀌도록 TGF-α-PE40DNA내 변화를 포함한다. 편의상, 이 플라스미드 DNA를 pTAC TGF 57-PE40-132, 153이라 명명한다. 세균 숙주 세포를 pTAC TGF 57-PE40-132, 153 DNA로 형질전환시킨다. 샘플 클론들을 하이브리드화시켜 확인하고 분리한 후, 이들의 플라스미드 DNA가 적절한 재조합 DNA를 함유하는지 확인하기 위해 서열 분석한다.
pTAC TGF 57-PE40-132, 153 DNA를 HpaI 및 SalI로 분해하고 3.95kb 벡터 DNA를 분리한다. PE40의 272 내지 309번 아미노산 잔기에 연장되어 있고 HpaI 및 SalI 혼용성 말단을 지니는 합성 올리고뉴클레오타이드 카세트(올리고 #142)를 합성한 후 3.95kb pTAC TGF/PE40 132, 153 DNA에 연결한다.
Figure kpo00004
이러한 올리고뉴클레오타이드 카세트는 287 잔기에서 시스테인 코돈을 알라닌 코돈으로 변화시킨다. 편의상 이 돌연변이된 플라스미드 DNA를 pTAC TGF 57-PE40-132, 153, 142로 칭한다. 세균 숙주세포를 이 플라스미드로 형질전환시키고 샘플 클론을 하이브리드화하여 확인한다. 이 클론을 분리하고 이들의 플라스미드 DNA를 서열분석하여 이것이 적합한 재조합 DNA를 함유하는지를 확인한다. pTAC TGF 57-PE40-132, 153, 142 플라스미드는 A 좌위에서 시스테인 모두가 알라닌으로 대체된 TGF-α-PE40변이체를 암호화한다. 그러므로, 상기 명명법에 따라 이 TGF-α-PE40의 변형체를 TGF-α-PE40aB라 칭한다. TGF-α-PE40aB 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열이 표 4에 나타나 있다.
[TGF-α-PE40AB]
클론 pTAC TGF 57-PE40을 SphI 및 BamHI으로 분해시켜 750bp SphI-BamHI단편(TGF-α의 말단 5개 아미노산 및 PE40의 N-말단 252개 아미노산으로 구체화됨)을 분리한다. M13 mp19 벡터 DNA를 SphI 및 BamHI으로 절단하여 벡터 DNA를 분리한다. 750bp SphI-BamHI TGF-α-PE40단편을 15℃에서 밤새 M13 벡터 DNA내로 연결시킨다. 세균 숙주세포를 이 연결 혼합물로 형질전환시켜 샘플 클론을 분리하고 플라스미드 DNA를 서열분석하여 이 클론이 적합한 재조합 DNA를 함유하는지를 확인한다. 일본쇄 DNA를 돌연변이 유발을 위해 제조한다.
올리고뉴클레오타이드(올리고 #133)를 합성하고 부위-지시된 돌연변이 유발에 사용하여 Bste II 부위를 PE40의 369번 아미노산 위치에서 TGF-α-PE40DNA 내로 도입시킨다:
Figure kpo00005
이 돌연변이 유발에 의한 결과중 하나는 PE40의 369번 위치에서의 세린 잔기가 트레오닌으로 전환되는 것이다.
새롭게 생성된 Bste II 부위를 함유하는 DNA 클론을 확인하여 분리하고 서열분석하여 적합한 재조합 DNA 존재를 확인한다. 이 클론을 ApaI 및 SalI 제한효소로 분해시킨다. 새롭게 생성된 Bste Ⅱ 부위를 함유하는 120bp 삽입 DNA 단편을 분리하고, 또한 ApaI 및 SalI으로 분해된 pTAC TGF 57-PE 40 내로 연결시킨다. 세균 숙주 세포를 형질전환시키고 샘플 클론을 분리하여 서열분석함으로써 적합한 재조합 DNA가 존재함을 확인한다. 이러한 새롭게 생성된 플라스미드 DNA를 pTAC TGF 57-PE 40-133으로 칭한다. 이를 BstelI 및 Apa I으로 분해시켜 2.65kb 벡터 DNA단편을 분리한다.
Bste II 대 Apa I 올리고뉴클레오타이드 카세트(올리고 #155)를 합성시키는데 이는 Bste II 및 Apa I 제한효소로 분해된 pTAC TGF 57-PE 40-133 클론으로부터 결실된 TGF-α-PE40부분에 걸쳐 있다. 이 카세트는 또한 Bste II 및 Apa I 혼용성 말단에 대한 뉴클레오타이드 서열로 특정화된다.
Figure kpo00006
상기 올리고뉴클레오타이드 카세트는 PE40의 372 및 379 번 잔기에서의 시스테인에 대한 코돈이 알라닌을 지시하는 코돈으로 변화되어 있다. 올리고뉴클레오타이드 카세트 #155를 2.65kb 벡터 DNA 단편에 연결시킨다. 세균 숙주 세포를 형질전환시키고 샘플 클론을 분리시켜 서열 분석함으로써 적합한 재조합 DNA가 존재하는지를 확인한다. 상기와 같이 새롭게 생성된 DNA클론을 pTAC TGF 57-PE 40-133, 155로 칭한다. 이는 부위 B에서의 시스테인 모두가 알라닌으로 대체된 TGF-α-PE40변형체를 암호화 한다. 그러므로, 상슬한 명명법에 따라서 상기 변형된 TGF-α-PE40변형체를 TGF-α-PE40Ab로 명명한다. TGF-α-PE40Ab유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열을 표 5에 나타낸다.
[TGF-α-PE40ab]
TGF-α-PE40aB를 암호화하는 pTAC-TGF 57-PE 40-132, 153, 142 플리스미드를 SalI 및 ApaI로 분해시키고 생성된 3.8kb 벡터 DNA 단편을 분리시킨다. 또한 TGF-α-PE40Ab를 암호화하는 pTAC TGF 57- PE 40-133, 155 플라스미드를 SalI 및 ApaI로 분해시켜 PE40의 372 및 379번 아미노산 잔기에서 시스테인이 알라닌으로 변화된, 상기 생성된 140bp DNA 단편을 분리시킨다. 이들 2개의 DNA를 함께 연결시켜 세균 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용한다. 샘플 클론을 pTAC TGF 57-PE40-133, 155로부터 방사성 표지된 140bp DNA로 하이브리드화시켜 확인한다. 샘플 클론으로부터 플라스미드 DNA를 분리시키고 서열 분석하여 적합한 재조합 DNA가 존재하는지 확인한다. 상기 새롭게 생성된 DNA 클론을 pTAC TGF 57-PE 40-132, 153, 142, 133, 155로 명명한다. 이 플라스미드는 부위 A 및 B 좌위에서 4개의 시스테인 모두가 알라닌으로 대체된 TGF-α-PE40변이체를 암호화한다. 따라서, 상술된 명명법에 따라 이러한 TGF-α-PE40의 변형체를 TGF-α-PE40ab라 칭한다. TGF-α-PE40ab 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열은 표 6에 기재되어 있다.
[실시예 4]
[DNA 클론을 함유하는 재조합 TGF-α-PE40의 변형체의 작제]
[시스테인 잔기의 선택]
TGF-α-PE40aB, TGF-α-PE40Ab, 및 TGF-α-PE40ab는 또한 A 좌위 및/또는 B 좌위에서 시스테인 잔기를 제거함으로써 작제될 수 있다. TGF-α-PE40변형체의 작제는, TGF-α-PE40aB의 경우에는 265번 위치에 대한 알라닌 코돈이 결실되도록 올리고뉴클레오타이드 카세트 153을 변화시키고 287번 위치에 대한 알라닌 코돈이 결실되도록 올리고뉴클레오타이드 카세트 142를 변화시키는 것을 제외하고는 실시예 3에서 기술된 바와 동일하게 수행된다. TGF-α-PE40Ab의 경우에는 372 및 379번 잔기에 대한 알라닌 코돈이 결실되도록 올리고뉴클레오타이드 카세트 155를 변화시킨다. TGF-α-PE40ab의 경우에는, 이 재조합 유전자를 작제하기 위해 사용된 DNA 단편을 본 실시예에서 기술된 TGF-α-PE40aB 및 TGF-α-PE40Ab 유전자로부터 수득한다.
[실시예 5]
[TGF-α-PE40AB, TGF-α-PE40Ab, TGF-α-PE40aB 및 TGF-αPE40 ab 단백질의 생물학적 활성]
하이브리드 융합 단백질 TGF-α-PE40AB, TGF-α-PE40Ab, TGF-α-PE40aB, TGF-α-PE40ab를 실시예 1에서 기술한 바와 같이, 세균 숙주에서 발현시키고 분리한다. 이어서, 각 단백질을 A431 세포막 소포의 표피 생장 인자 수용체에 대한 방사선 표지된 표피 생장 인자의 결합을 억제하는 능력 및 언급된 바 있는 MTT세포증식 검정을 통해 측정한 것처럼 A431 세포를 살해하는 이의 능력에 따라 특징지운다. 하기 표는 이들 단백질의 생물학적 활성을 요약한 것이다.
Figure kpo00007
[실시예 6]
[TGF-α-PEab의 TGF-α 영역에 대한 표피 생장 인자 수용체에 결합하는 기타 표적화제의 치환]
TGF-α-PE의 유용성은 표피 생장 인자 수용체를 지니는 세포에 결합하여 이를 살해하는 능력에 있다. 다른 표적화제를 EGF 수용체에 결합될 본 발명의 변형된 PE을 갖는 하이브리드 분자의 생성에 사용할 수 있다. 예를 들어, 표피 생장 인자 또는 유로가스트론 또는 쇼프 피브로마(Shope fibroma)바이러스 생장 인자에 대한 유전자, 또는 우두 바이러스 생장 인자에 대한 유전자를 PE유전자에 결합시킬 수 있으며 표피 생장 인자-PE, 또는 유로가스트론-PE, 또는 쇼프피브로마 바이러스 생장 인자-PE, 또는 우두 바이러스 생장 인자-PE하이브리드 융합 단백질의 합성을 지시하는데 이용할 수 있다. 그러나 각각의 경우에 있어서, 상기에서 언급된 PE으로의 1회 이상의 변형은 표피 생장 인자 수용체를 지니는 세포에 대한 이들 다른 하이브리드 융합 단백질의 결합을 증진시킨다.
[실시예 7]
[TGF-α-PE의 TGF-α 영역에 대한 포유동물 세포의 다른 수용체에 결합하는 다른 표적화제의 치환]
본 발명은 포유동물 세포의 특정 수용체를 인지하는 다른 표적화제 및 PE사이의 하이브리드 융합 단백질의 PE영역의 변형에 관한 것으로 인지될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 일반식 단백질 X-PE(여기에서, 단백질 X는 인터루킨-2, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 혈소판 기원 성장인자 또는 특정 포유동물의 세포 수용체를 인지하여 이에 결합된 모든 기타 단백질이다)으로 표현되는 단백질과 변형된 PE사이에 형성된 융합 단백질은 이들 각 세포 수용체에 대한 증가된 결합 특성을 갖는다.
[실시예 8]
[사람 케라티노사이트에 대한 TGF-α-PEab의 생물학적 활성]
문헌[참고: Mossmann, J. Immunol, Methods 65: 55-63 (1983)]의 세포증식 검정을 이용하여 TGF-α-PEab이 검정중에 사용된 사람 케라티노사이트를 쉽게 살해한다. 50%의 케라티노사이트를 사멸시키는데 요구되는 TGF-α-PE의 농도(ED)는 11nM이다.
Figure kpo00008
Figure kpo00009
Figure kpo00010
Figure kpo00011
Figure kpo00012
Figure kpo00013
Figure kpo00014
Figure kpo00015
Figure kpo00016
Figure kpo00017

Claims (15)

  1. 디설파이드 결합을 형성하지 않는 동일하거나 상이할 수 있는 2개의 아미노산에 의해 2개 이상의 시스테인 잔기가 치환되거나 결실됨으로써 변형된, 형질전환 생장 인자 α(TGF-α) 표적화제에 의해 인지되는 종양 세포 또는 사람 케라티노사이트의 표피 생장 인자(EGF) 수용체에 결합하는 단백질 TGF-α-영역과 결합된 PE40영역을 포함하는 하이브리드 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 2개 이상의 시스테인 잔기가 치환된 하이브리드 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 4개의 시스테인 잔기가 치환된 하이브리드 단백질.
  4. 제2항에 있어서, 1개 이상의 시스테인 잔기가 알라닌으로 치환된 하이브리드 단백질.
  5. 제2항에 있어서, 2개 이상의 시스테인 잔기가 알라닌으로 치환된 하이브리드 단백질.
  6. 제3항에 있어서, 4개의 시스테인 잔기가 알라닌으로 치환된 하이브리드 단백질.
  7. 제2항에 있어서, 1개 이상의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 형성하지 않는 알라닌 이외의 아미노산으로 치환된 하이브리드 단백질.
  8. 제2항에 있어서, 2개 이상의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 형성하지 않는 알라닌 이외의 아미노산으로 치환된 하이브리드 단백질.
  9. 제3항에 있어서, 4개의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 형성하지 않는 알라닌 이외의 아미노산으로 치환된 하이브리드 단백질.
  10. 제1항에 있어서, 2개 이상의 시스테인 잔기가 결실된 하이브리드 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 4개의 시스테인 잔기가 결실된 하이브리드 단백질.
  12. 제1항에 있어서, 2개의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 형성하지 않는 아미노산에 의해 치환되고 2개의 시스테인 잔기가 결실된 하이브리드 단백질.
  13. 제1항에 따른 하이브리드 단백질을 암호화하는 DNA가 함유된 플라스미드를 적합한 원핵 또는 진핵 숙주세포내로 삽입시킨 다음, 이러한 숙주세포를 하이브리드 단백질의 생산 조건하에서 성장시킴을 포함하는 제1항에 따른 하이브리드 단백질의 생산방법.
  14. 세포독성 유효량의 제1항에 따른 하이브리드 단백질 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 선택적 세포 독성 활성을 유발시키는데 유용한 약제학적 조성물.
  15. 케라티노사이트의 증식을 억제하는데 유효한 양의 제1항에 따른 하이브리드 단백질 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 케라티노사이트의 증식을 치료하는데 유용한 약제학적 조성물.
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