FI102383B - Menetelmä ja plasmidi modifioidun PE40-domeenia sisältävän hybridiprot eiinin valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä ja plasmidi modifioidun PE40-domeenia sisältävän hybridiprot eiinin valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI102383B
FI102383B FI900783A FI900783A FI102383B FI 102383 B FI102383 B FI 102383B FI 900783 A FI900783 A FI 900783A FI 900783 A FI900783 A FI 900783A FI 102383 B FI102383 B FI 102383B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
ala
gly
alpha
tgf
leu
Prior art date
Application number
FI900783A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI102383B1 (fi
FI900783A0 (fi
Inventor
Allen Oliff
Gwynneth M Edwards
Deborah D Jones
Original Assignee
Merck & Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck & Co Inc filed Critical Merck & Co Inc
Publication of FI900783A0 publication Critical patent/FI900783A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI102383B1 publication Critical patent/FI102383B1/fi
Publication of FI102383B publication Critical patent/FI102383B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

102383
Menetelmä ja plasmidi modifioidun PE40-domeenia sisältävän hybridiproteiinin valmistamiseksi
Keksintö koskee menetelmää sellaisen hybridiprote-5 iinin valmistamiseksi, joka sisältää modifioidun PE40-do-meenin, joka käsittää taulukossa 3 esitetyn Pseudomonas-eksotoksiinin aminohapposekvenssin 252 - 613, jossa vähintään kaksi asemissa 265, 287, 372 ja 379 olevista kyste-iiniryhmistä on poistettu tai korvattu aminohapoilla, jot-10 ka eivät muodosta disulfidisiltoja, ja joka on liitetty kohdistusaineen tunnistavaan reseptoriin sitoutuvaan proteiinin kohdistusdomeeniin, jolloin hybridiproteiinin sy-totoksisuus on heikentynyt ja/tai kyky sitoutua reseptoriin on tehostunut.
15 Keksintö koskee myös plasmidia, joka sisältää edel lä määriteltyä hybridiproteiinia koodaavaa DNA:ta.
Perinteinen syövän kemoterapia perustuu lääkkeiden kykyyn tappaa syöpäpotilaiden kasvainsoluja. Valitettavasti nämä samat lääkkeet tappavat usein sekä normaalisoluja 20 että kasvainsoluja. Se, missä määrin syöpälääke tappaa mieluummin kasvainsoluja kuin normaalisoluja, osoittaa yhdisteen selektiivisyysastetta kasvainsolujen suhteen. Eräs menetelmä syöpälääkkeiden kasvainsoluselektiivisyyden lisäämiseksi on saattaa lääkkeet ensisijaisesti kasvain-25 soluihin välttäen normaalisolupopulaatioita. Toinen termi kemoterapeuttisten aineiden selektiiviselle saattamiselle tiettyihin solupopulaatioihin on "kohdistaminen". Lääkkeen kohdistaminen kasvainsoluihin voidaan toteuttaa usealla tavalla. Eräs menetelmä perustuu kasvainsolujen pinnalta 30 löytyneisiin spesifisiin reseptorimolekyyleihin. Toiset molekyylit, joita kutsutaan "kohdistusaineiksi", voivat tunnistaa ja sitoutua näihin solun pintareseptoreihin. Näitä kohdistusaineita ovat esimerkiksi vasta-aineet, kasvutekijät tai hormonit. Kohdistusaineiden, jotka tunnis-35 tavat ja sitoutuvat spesifisiin solun pintareseptoreihin, 2 102383 sanotaan hyökkäävän niiden solujen kimppuun, joilla on näitä reseptoreita. Esimerkiksi monilla kasvainsoluilla on pinnallaan epidermaaliseksi kasvutekijäreseptoriksi kutsuttu proteiini. Useat kasvutekijät, mm. epidermaalinen 5 kasvutekijä (EGF) ja muuntokasvutekijä-alfa (TGF-alfa), tunnistavat ja sitoutuvat kasvainsolujen EGF-reseptoriin. Sen vuoksi EGF ja TGF-alfa ovat näiden kasvainsolujen koh-distusaineita.
Itse kohdistusaineet eivät tapa kasvainsoluja. Mui-10 ta molekyylejä, mm. solumyrkkyjä tai toksiineja, voidaan liittää kohdistusaineisiin hybridimolekyylien muodostamiseksi, joilla on sekä kasvainsolun kohdistus- ja solutok-siinialueita eli domeeneja. Nämä hybridimolekyylit toimivat kasvainsoluselektiivisinä myrkkyinä, koska ne pystyvät 15 hyökkäämään kasvainsolujen kimppuun, ja tappavat sitten nuo solut toksisella komponentillaan. Muutamat tehokkaimmat solumyrkyt, joita on käytetty näitä hybridimolekyylejä muodostettaessa, ovat bakteeritoksiineja, jotka estävät nisäkässolujen proteiinisynteesiä. Pseudomonas-eksotoksii-20 ni A on yksi näistä bakteeritoksiineista ja sitä on käytetty "kohdistus - toksiini" -hybridimolekyylien muodostamiseksi (US-patentti 4 545 985).
Pseudomonas-eksotoksiini A myrkyttää nisäkässolut ensin sitoutumalla solun pintaan, sen jälkeen siirtymällä : 25 solun sytoplasmaan ja inaktivoimalla pidennystekijän 2, joka on proteiinisynteesiin tarvittava sellulaarinen proteiini. Pseudomonas-eksotoksiini A:ta on käytetty muodostettaessa syövänvastaisia hybridimolekyylejä monoklonaali-sten vasta-aineiden ja proteiinihormonien kanssa. Eräs 30 näiden hybridimolekyylien ongelma on kuitenkin se, että ne ovat toksisia normaaleille soluille. Ainakin osa pseudomonas-eksotoksiini A:ta sisältäviin hybridimolekyyleihin liittyvästä toksisuudesta johtuu pseudomonas-eksotoksiini A:n kyvystä sitoutua ja siirtyä itsestään monentyyppisiin 35 nisäkässoluihin. Siksi hybridimolekyyli, joka on muodos- 3 102383 tunut pseudomonas-eksotoksiini A:sta ja spesifisistä koh-distusaineista, voi sitoutua kohdistusaineen tunnistamien solujen lisäksi moniin normaalisoluihin. Eräs menetelmä tämän ongelman käsittelemiseksi on modifioida pseudomonas-5 eksotoksiini A niin, ettei se enää kykene sitoutumaan normaalisoluihin. Tämä voidaan saada aikaan siten, että poistetaan se osa pseudomonas-eksotoksiini A -molekyylistä, joka on vastuussa sen solunsitomisaktiivisuudesta. Pseudomonas-eksotoksiini A -molekyylin katkaistu muoto, joka 10 on säilyttänyt kyvyn inaktivoida pidennystekijän 2, mutta joka ei enää kykene sitoutumaan nisäkässoluihin, on valmistettu. Tätä muunneltua pseudomonas-eksotoksiini A-mole-kyyliä kutsutaan nimellä pseudomonas-eksotoksiini-40 tai PE40 [Hwang et ai., Cell 48 (1987) 129 - 136].
15 PE40 on liitetty useisiin kohdistusmolekyyleihin, mm. TGF-alfaan [Chaudhary et ai., PNAS USA 84 (1987) 4583 - 4542). TGF-alfan tapauksessa hybridimolekyylit, jotka sisältävät PE40- ja TGF-alfa-alueet, kykenevät spesifisesti sitoutumaan EGF-reseptoreita sisältäviin kas-20 vainsoluihin ja myrkyttämään nämä solut inhiboimalla proteiinisynteesiä. Jotta tämä hybridimolekyyli sitoutuisi tehokkaasti EGF-reseptoriin, täytyy sen omaksua sopiva konformaatio. Tehokas sitoutuminen reseptoriin riippuu myös siitä, että kohdistusalue on oikein esillä niin, että ; 25 se on pystyy sitoutumaan. Kun TGF-alfa- ja PE40-hybridimo lekyylit tuotetaan fuusioproteiineina bakteereissa käyttäen rekombinantti-DNA-tekniikoita, suurimmalla osalla hyb-ridimolekyylejä on matala EGF-reseptoriin sitoutumisak-tiivisuus.
30 US-patentissa 4 545 985 esitetään, että pseudomo- *. nas-eksotoksiini A voidaan konjugoida vasta-aineisiin tai epidermaaliseen kasvutekijään. Edelleen US-patentissa 4 545 985 esitetään, että näitä konjugaatteja voidaan käyttää tappamaan ihmisen kasvainsoluja.
35 US-patentissa 4 664 911 esitetään, että vasta-ai neita voidaan liittää kasveista saatavan toksiinin, ri- 4 102383 siinin, A- tai B-ketjuun. Edelleen US-patentissa 4 664 911 esitetään, että näitä konjugaatteja voidaan käyttää tappamaan ihmisen kasvainsoluja.
US-patentissa 4 675 382 esitetään, että hormoneja, 5 kuten melanosyyttejä stimuloivaa hormonia (MSH), voidaan liittää peptidisidoksin osaan kurkkumätätoksiiniproteii-nia. Lisäksi US-patentissa 4 675 382 esitetään, että geenit, jotka koodaavat näitä proteiineja, voidaan liittää yhteen ohjaamaan hybridifuusioproteiinin synteesiä rekom-10 binantti-DNA-tekniikoita käyttäen. Tämä fuusioproteiini kykenee sitoutumaan soluihin, joissa on MSH-reseptoreita.
Artikkelissa Murphy et ai., Genetic construction, expression, and melanoma-selective cytotoxicity of a diphtheria toxin-related alpha-melanocyte-stimulating 15 hormone fusion protein, PNAS USA 83 (1986) 8258 - 8262, esitetään, että hybridiproteiini, joka oli tuotettu bakteereissa rekombinantti-DNA-tekniikoita käyttäen ja joka muodostui difteriatoksiiniproteiinin osasta liitettynä alfa-melanosyyttejä stimuloiviin hormoneihin, sitoutuu ja 20 tappaa ihmisen melanoomasoluja.
Artikkelissa Kelley et ai., Interleukin 2-diphtheria toxin fusion protein can abolish cell-mediated immunity in vivo, PNAS USA 85 (1988) 3980 - 3984, esitetään, että bakteereissa rekombinantti-DNA-tekniikoita : 25 käyttäen tuotettu hybridifuusioproteiini, joka koostuu kurkkumätätoksiiniproteiinin osasta liitettynä karvattomien hiirien interleukiini-2-ryhmiin, suppressoi soluvälitteistä immuniteettiä.
Artikkelissa Allured et ai., Structure of exotoxin 30 A of Pseudomonas aeruginosa at 3,0 Angstrom, PNAS USA 83 (1986) 1320 - 1324, esitetään pseudomonas-eksotoksiini A- proteiinin kolmiulotteinen rakenne.
Artikkelissa Hwang et al., Functional Domains of Pseudomonas Exotoxin Identified by Deletion Analysis of 35 the Gene Expressed in E. Coli, Cell 48 (1987) 129 -136, 5 102383 esitetään, että pseudomonas eksotoksiini A -proteiini voidaan jakaa kolmeen erilliseen funktionaaliseen alueeseen, jotka ovat vastuussa sitoutumisesta nisäkässoluun, tok-siiniproteiinin translokaatiosta lysosomaalisten membraa-5 nien läpi ja pidennystekijä 2:n ADP-ribosylaatiosta nisä-kässoluissa. Lisäksi artikkelissa esitetään, että nämä funktionaaliset alueet vastaavat pseudomonas-eksotoksiini A -proteiinin erillisia alueita.
EP-patenttihakemuksessa 0 261 671, joka on jul- 10 kaistu 30.3.1988, selitetään, että voidaan tuottaa pseudomonas-eksotoksiini A -proteiinin osa, josta puuttuu koko pseudomonas-eksotoksiini A -proteiinin sellulaarinen si-toutumisfunktio, mutta jolla on koko pseudomonas-eksotoksiini A -proteiinin translokaatio- ja ADP-ribosylaatio-15 funktiot. Pseudomonas-eksotoksiini A -proteiinin osaa, joka sisältää koko pseudomonas-eksotoksiini A -proteiinin translokaatio- ja ADP-ribosylaatiofunktiot, kutsutaan nimellä pseudomonas-eksotoksiini-40 tai PE-40. PE-40 sisältää koko pseudomonas-eksotoksiini A -proteiinin aminohap-20 poryhmät 252 - 613, kuten Gray et ai., PNAS USA 81 (1984) 2645 -2649, ovat määritelleet. Edelleen EP-patenttihakemuksessa esitetään, että PE-40 voidaan liittää muuntokas-vutekijä-alfaan, jolloin muodostuu hybridifuusioproteiini, joka on valmistettu bakteerissa rekombinantti DNA-teknii-25 koiden avulla.
Artikkelissa Chaudhary et ai., Activity of a recombinant fusion protein between transforming growth factor type alpha and Pseudomonas toxin, PNAS USA 84 (1987) 4538 - 4542, esitetään, että PE-40:stä ja muuntokasvute-30 kijä-alfasta muodostettu ja rekombinantti-DNA-tekniikoiden v avulla bakteereissa valmistettu hybridifuusioproteiini sitoutuu ja tappaa ihmisen kasvainsoluja, joissa on epi-dermaalisia kasvutekijäreseptoreita.
Artikkelissa Bailon, Purification and Partial 35 Characterization of an Interleukin 2-Pseudomonas Exotoxin 6 102383
Fusion Protein, Biotechnology, Marraskuu (1988) 1326 - 1329, esitetään, että PE-40:stä ja interleukiini 2:sta muodostettu ja rekombinantti-DNA-tekniikoiden avulla bakteereissa valmistettu hybridifuusioproteiini sitoutuu ja 5 tappaa ihmisen solulinjoja, joissa on interleukiini 2-re-septoreita.
Esillä olevan keksinnön tavoitteena on antaa käyttöön PE40:n modifikaatioita, jotka sallivat kohdistusainei-den ja modifioitujen PE40-molekyylien muodostamien hybridi-10 molekyylien tehokkaan sitoutumisen solureseptoreihin, jotka tunnistavat kohdistusaineita. Toinen esillä olevan keksinnön tavoite on antaa käyttöön menetelmä sellaisen hybridi- (tai fuusio-) proteiinin valmistamiseksi, jolla on solureseptoria sitova alue ja PE40-alue, jolloin PE40-alue 15 on modifioitu, jotta hybridiproteiinin sitoutuminen epi- dermaaliseen kasvutekijäreseptoriin tai modifioituun PE40:een liitetyn kohdistusaineen sitomaan reseptoriin parantuisi. Menetelmällä saatu hybridiproteiini on helpompi puhdistaa. Nämä ja muut esillä olevan keksinnön tavoitteet 20 ilmenevät seuraavasta kuvauksesta.
Keksintö koskee menetelmää sellaisen hybridiproteiinin valmistamiseksi, joka sisältää modifioidun PE40-do-meenin, joka käsittää taulukossa 3 esitetyn Pseudomonas-eksotoksiinin aminohapposekvenssin 252 - 613, jossa vähin-25 tään kaksi asemissa 265, 287, 372 ja 379 olevista kyste-iiniryhmistä on poistettu tai korvattu aminohapoilla, jotka eivät muodosta disulfidisiltoja, ja joka on liitetty kohdistusaineen tunnistavaan reseptoriin sitoutuvaan proteiinin kohdistusdomeeniin, jolloin hybridiproteiinin sy-30 totoksisuus on heikentynyt ja/tai kyky sitoutua resepto-riin on tehostunut. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että plasmidi, joka sisältää mainittua hyb-ridiproteiinia koodaavan DNA-sekvenssin toiminnallisesti liitettynä ekspression helpottaviin säätelyelementteihin, 35 transformoidaan sopivaan prokaryoottiseen tai eukaryootti- 7 102383 seen isäntään ja isäntää kasvatetaan olosuhteissa, joissa hybridiproteiinia tuotetaan.
Keksintö koskee myös plasmidia, joka sisältää edellä määriteltyä hybridiproteiinia koodaavaa DNA:ta ja joka 5 pystyy ekspressoimaan hybridiproteiinia sopivassa prokary- ootti- tai eukaryootti-isännässä.
Esillä oleva keksintö siis antaa käyttöön hybridi -molekyylin, joka sisältää modifioidun PE40-alueen, joka on sidottu proteiiniin kohdistusalueeseen. Modifioitu PE40-10 alue parantaa tämän hybridimolekyylin reseptoriin sitou- tumisaktiivisuutta. Muiden aminohappojen substituutio, kuten esim. PE40:n kysteiiniryhmien korvaus alaniinilla, tai kysteiiniryhmien deleetio parantaa hybridimolekyylin sitoutumista reseptoreihin, joita kohdistusalueet tunnis-15 tavat. Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetut hyb- ridimolekyylit sitoutuvat tehokkaammin ihmisen kasvainso-lujen hyökkäyksen kohtena oleviin reseptoreihin kuin hyb-ridimolekyylit, joissa on modifioimaton PE40.
TGF-alfan ja PE40:n muodostamat hybridimolekyylit 20 karakterisoidaan kolmella ensisijaisella kokeella. Nämä kokeet ovat 1) pidennystekijä 2:n ADP-ribosylaatio, joka mittaa nisäkässolun proteiinisynteesiä inhiboivan TGF-al-fa-PE40:n entsymaattista aktiivisuutta, 2) radioaktii-visesti leimatun EGF:n sitoutumisen A431-solujen membraa-25 nirakkuloiden EGF-reseptoreihin inhibitio, mikä mittaa TGF-alfa-PE40 :n sitoutumisaktiivisuutta EGF-reseptori in, ja 3) solujen proliferaatio määritettynä 3-[4,5-dimetyyliti-atsol-2-yyli]-2,5-difenyylitetratsoliumbromidin (MTT) muuttumisena formatsaaniksi, mitä on käytetty mittaamaan 30 kasvainsolujen hengissäpysymistä TGF-alfa-PE40-altistuksen jälkeen. Nämä kokeet suoritetaan kuten aikaisemmin on kuvattu [Dominic et ai., Infection and Immunity 16 (1977) 832 - 841, Cohen et ai., J. Biol. Chem. 275 (1982) 1523 -1531, Riemen et ai., Peptides 8 (1987) 877 - 885, Mosmann, 35 J. Immunol. Methods 65 (1983) 55 - 63).
8 102383
Uusien TGF-alfa-PE40-hybridimolekyylien muodostamiseksi, joilla olisi ylivoimaiset reseptoriin sitoutumis-ominaisuudet, valmistettiin aluksi sarja rekombinantti-DNA-molekyylejä, jotka koodasivat joko TGF-alfa-PE40:tä tai 5 erityisesti modifioituja TGF-alfa-PE40-molekyylejä. Alkuperäinen tai kanta-TGF-alfa-PE40-geeni kloonattiin molekylaa-risesti bakteeriperäiseen TAC-ekspressioplasmidivektoriin (pTAC TGF57-PE40), jolloin käytettiin kloonatun DNA:n erillisia segmenttejä, kuten esimerkissä 2 on esitetty. 10 pTAC TGF57-PE40:n DNA-kloonia käytettiin aloitusreagenssi-na erityisesti modifioitujen TGF-alfa-PE40-DNA-molekyylien muodostamiseksi. pTAC TGF57-PE40 -DNA:n spesifiset modifikaatiot käsittävät paikkaspesifisiä mutaatioita DNA:n koo-daussekvenssissä, mitä tarvitaan korvaamaan pTAC TGF57-15 PE40 -DNA:n PE40-alueen kaksi tai neljä kysteiinikodonia muiden aminohappojen kodoneilla. Vaihtoehtoisesti paikka-spesifiset mutaatiot voidaan tehdä poistamalla kaksi tai neljä pTAC TGF57-PE40:n PE40-alueen kysteiinikodonia. pTAC TGF57-PE40 - DNA: n paikkaspesifiset mutaatiot tehtiin käyt-20 täen Winter et al.'in, Nature 299 (1982) 756 - 758, kuvaamia menetelmiä. Spesifiset esimerkit mutatoiduista pTAC TGF57-PE40 -NA:ista on esitetty esimerkissä 3. pTAC TGF57-PE40 -DNA:n koodaaman hybridiproteiinin aminohap posekvenssi on esitetty kuviossa 3. Kanta-TGF-alfa-PE40 : 25 hybridiproteiinin PE40-alueen neljä kysteiiniryhmää on ni mitetty Cys265-, Cys287-, Cys372- ja Cys379-ryhmiksi (kuvio 3) . Aminohapporyhmät on numeroitu, kuten Gray et ai., PNAS USA 81 (1984) 2645 - 2649, ovat määritelleet. Spesifisesti mutatoiduista pTAC TGF57-PE40 -DNA:ista muodostetut modi-3 0 fioidut TGF-alfa-PE40 -hybridiproteiinit sisältävät [Cys265 ja Cys287]-, [Cys372 ja Cys379]- tai [Cys265, Cys287 , Cys372 ja
Cys379] -ryhmien substituutioita tai deleetioita. Jotta yksinkertaistaisimme näistä mutatoiduista pTAC TGF57-PE40 DNArista tuotettujen modifioitujen hybridiproteiinien ku-35 vausten termistöä, olemme kutsuneet asemien 265 ja 287 9 102383 aminohapporyhmiä "A"-lokukseksi ja asemien 372 ja 378 ryhmiä "B"-lokukseksi. Kun aminohapporyhmät 265 ja 287 ovat kysteiineja, kuten kanta-TGF-alfa-PE40 -hybridimolekyyleis-sä, lokus on kirjoitettu isolla kirjaimella (so. A) . Kun 5 kysteiinit ovat korvautuneet toisilla aminohapoilla, kuten esim. alaniinilla, fenyylialaniinilla, valiinilla, leu-siinilla tai isoleusiinilla, tai ryhmät 265 ja 287 on poistettu, lokus on esitetty pienellä kirjaimella "a". Vastaavasti, jos asemien 372 ja 379 aminohapporyhmät ovat 10 kysteiinejä, lokus on esitetty isolla kirjaimella "B", kun taas pieni kirjain "b" esittää tätä lokusta, kun asemien 372 ja 379 aminohapporyhmät on korvattu toisilla aminohapoilla tai poistettu. Sen vuoksi, kun kaikki TGF-alfa-PE40:n PE40-alueen neljä kysteiiniryhmää on korvattu ala-15 niinillä, modifioitua hybridiproteiinia nimitetään TGF-alfa-PE40 abrksi. Samalla tavalla kanta-TGF-alfa-PE40 -hybridiproteiinia, jossa aminohappoasemissa 265, 287, 372 ja 379 on kysteiineja, voidaan nimittää TGF-alfa-PE40-AB:ksi.
Sekä TGF-alfa-PE40-AB -hybridiproteiini että modi-20 fioidut TGF-alfa-PE40 -hybridiproteiinit on valmistettu E. colissa käyttäen TAC-ekspressiovektorisysteemiä, jota Li-nemeyer et ai., Bio-Technology 5 (1987) 960 - 965, ovat kuvanneet. Rekombinanttihybridiproteiinit, jotka on tuotettu näissä bakteereissa, otetaan talteen ja puhdistetaan : 25 hajottamalla bakteerit guanidiinivetykloridissa, jonka jälkeen lisätään natriumsulfiittia ja natriumtetrationaat-tia. Tämän jälkeen reaktioseos dialysoidaan ja ureaa lisätään liuottamaan proteiineja, jotka ovat saostuneet liuoksesta. Seuraavaksi seos sentrifugoidaan, jotta liuke-30 nemattomat proteiinit saadaan poistettua, ja rekombinant-ti-TGF-alfa-PE40 -hybridiproteiinit erotetaan käyttäen ioninvaihtokromatografiaa, jota seuraa geelisuodatus ja uudelleen ioninvaihtokromatografia. Sen jälkeen puhdistetut TGF-alfa-PE40 -hybridiproteiinit altistetaan pelkistä-35 välle aineelle, kuten beeta-merkaptoetanolille, jotta di- 10 102383 sulfidisidoksia muodostuisi hybridiproteiinin kysteiini-ryhmäparien välille. Lopuksi uudelleenlaskostuneet hybri-diproteiinit käsitellään geelisuodattamalla ja ionin-vaihtokromatografiällä, jotta saadaan eristettyä hyvin 5 puhdasta TGF-al£a-PE40-proteiinia. Tämän puhdistussysteemin tarkat yksityiskohdat kuvataan esimerkissä 2. Kun hybri-diproteiinit on puhdistettu ja uudelleenlaskostettu, niiden biologinen aktiivisuus voidaan karakterisoida käyttäen yllä kuvattuja ADP-ribosylaatiota, EGF-reseptorin sitomis-10 ta ja soluproliferäätiomäärityksiä.
TGF-alfa-PE40:n tärkeä käyttökelpoisuus perustuu sen kykyyn sitoutua ja tappaa soluja, joilla on EGF-resepto-reita. Monissa ihmisen kasvainsoluissa on EGF-reseptoreita ja siksi ne ovat herkkiä TGF-alfa-PE40 :n soluja tappaville 15 vaikutuksille. Myös ihmisen ei-syöpäsoluilla, mukaan lukien keratinosyytit, on EGF-reseptoreita, ja ne ovat myös herkkiä TGF-alfa-PE40:n soluja tappaville vaikutuksille. Useille ihmisten sairauksille, esim. psoriasikselle ja syylille, on ominaista kerätinosyyttien lisääntyminen.
20 Seuraavat esimerkit valaisevat esillä olevaa kek sintöä rajoittamatta sitä kuitenkaan millään tavalla. Kaikki entsymaattiset reaktiot, joita on tarvittu molekyylibiologisiin manipulaatioihin, toteutettiin Maniatis et ai'in kuvaamalla tavalla, Molecular Cloning: A Labora-25 tory Manual, Cold Spring Harvor Press, 1982, ellei toisin ole mainittu.
ESIMERKKI 1
Rekombinantti-TGF-alfa-PE,„-fuusioproteiinin tuottaminen ia eristys 30 Fuusiooroteiinin tuottaminen
Transformoituja E. coli JM-109 -soluja kasvatettiin 1 1 ravistelupulloissa 500 ml:ssa LB-kasvatusliuosta, jossa oli 100 μg/ml ampisilliinia, 37 °C lämpötilassa. Sen jälkeen kun spektrofotometrin absorbanssi Agoo saavutti ar-35 von 0,6, isopropyyli-B-D-tiogalaktopyranosidia lisättiin 11 102383 loppukonsentraatioon 1 mM. Kahden tunnin kuluttua solut otettiin talteen sentrifugoimalla.
Fuusiooroteiinin S-sulfonointi
Solut hajotettiin puskurissa, pH 8,0, joka sisälsi 5 8 M guanidiinivetykloridia, 50 mM Tris:iä ja 1 mM EDTA:ta sekoittaen kaksi tuntia huoneenlämpötilassa. Hajotusseos tehtiin 0,4-molaariseksi natriumsulfiitin ja 0,1-molaari-seksi natriumtetrationaatin suhteen lisäämällä kiinteät reagenssit, ja pH säädettiin arvoon 9,0 1 M NaOH:lla.
10 Reaktion annettiin jatkua huoneenlämpötilassa 16 tuntia.
Kromatoarafiapreparaatti
Proteiiniliuos dialysoitiin 10 000-kertaista tilavuutta 1 mM EDTA:ta vastaan 4 °C:een lämpötilassa. Sitten seos tehtiin 6-molaariseksi urean, 50-millimolaariseksi 15 Tris:in, pH 8,0, ja 50-millimolaariseksi NaCl:in suhteen huoneenlämpötilassa ja seosta sekoitettiin kaksi tuntia. Liukenematon materiaali poistettiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 32 000 x g 30 minuutin ajan.
DEAE FF Sepharose -kromatoarafia 20 Edellisen vaiheen kirkastettu supernatantti vietiin 26 x 4 0 cm:n DEAE Fast Flow -pylvääseen (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.), joka oli tasapainotettu puskurilla, pH 8,0, joka sisälsi 6 M ureaa, 50 mM Tris:iä ja 50 mM NaCl:a virtausnopeudella 1 ml minuutissa. Pylvästä pestiin *, 25 tasapainotuspuskurilla, kunnes kaikki adsorboitumattomat materiaalit oli poistettu, mitä osoitti spektrofotometrin UV-absorbanssin arvo alle 0,1 aallonpituudella 280 nm ta-sapainotuspuskurissa, kun se eluoitui pylväästä. Adsorboitunut fuusioproteiini eluoitiin pylväästä 1000 ml :11a 30 50 -> 350 mM NaCl-gradienttia, minkä jälkeen se konsent- * roitiin Amicon-konsentraattorissa, jossa oli YM-30-memb- raani.
Sephacrvl S-300
Konsentroitu fuusioproteiini (8 ml) vietiin 2,6 x 35 100 cm:n Sephacryl S-300 -pylvääseen (Pharmacia LKB
12 102383
Biotechnology Inc.), joka oli tasapainotettu puskurilla, pH 8,0, joka sisälsi 6 M ureaa, 50 mM Trisriä ja 50 mM NaCl:a, virtausnopeudella 0,25 ml minuutissa. Pylvästä eluoitiin vielä tasapainotuspuskurilla ja kerättiin 3 ml:n 5 fraktioita. Fraktiot, jotka sisälsivät TGF-alfa-PE40-aktiivisuutta, yhdistettiin.
O-sepharose-kromatoqrafia S-300-pylväästä saadut yhdistetyt fraktiot vietiin
1,6 x 40 cm:n Q-sepharose-pylvääseen (Pharmacia LKB Bio-10 technology Inc.), joka oli tasapainotettu puskurilla, pH
8,0, joka sisälsi 6 M ureaa, 50 mM Tris:iä ja 50 mM NaCl:a virtausnopeudella 0,7 ml minuutissa. Pylväs pestiin tasapainotuspuskurilla ja eluoitiin sitten 600 ml :11a 50 -> 450 mM NaCl-gradienttia. Fraktiot, jotka sisälsivät TGF-15 alfa-PE40 -aktiivisuutta, yhdistettiin, ja dialysoitiin sitten 50 mM glysiiniä, pH 9,0, vastaan ja varastoitiin -20 °C:ssa.
Uudelleenlaskostus
Proteiininäyte sulatettiin ja laimennettiin spekt-20 rofotometrin UV-absorbanssin A^,, arvoon 0,1 50 mM glysii-nillä, pH 10,5. Beeta-merkaptoetanoiia lisättiin niin, että saatiin molaarinen suhde 4:1 proteiininäytteessä olevien S-sulfonaattiryhmien teoreettiseen määrään nähden. Reaktion annettiin jatkua 16 tuntia 4 °C:ssa, jonka jäl-25 keen liuos dialysoitiin 10 000-kertaista määrää puskuroitua fysiologista suolaliuosta vastaan ja varastoitiin -20 °C-.ssa.
ESIMERKKI 2 TGF-alfa-PE.λ-DNA:ta sisältävien rekombinantti-DNA-30 kloonien muodostaminen TGF-alfa-DNA-segmentti valmistettiin käyttäen kolmea kombinaatiota synteettisiä oligonukleotideja, kuten Defeo-Jones et ai., Molecular and Cellular Biology 8 (1988) 2999 - 3007, kuvaavat. Tämä synteettinen TGF-alfa-35 geeni kloonattiin pUC-19:ään. pUC-19-kloonin DNA, joka 13 102383 sisältää ihmisen rekombinantti TGF-alfan, pilkottiin Sph I:llä ja Eco RI:llä. Pilkkominen sai aikaan 2,8 ke:n DNA-fragmentin, joka sisälsi koko pUC-19:n ja TGF-alfan 5'-osan. 2,8 ke: n fragmentti puhdistettiin ja eristettiin 5 geelielektroforeesilla. Syntetisoitiin Eco Rl - Sph I -oligonukleotidikasetti. Tällä synteettisellä kasetilla oli alla oleva sekvenssi: 5'-CGGACCTCCTGGCTGCGCATCTAGG-3' 3'-GTACGCCTGGAGGACCGACGCGTAGATCCTTAA-5' 10 Mukavuussyistä tätä oligonukleotidikasettia kut suttiin nimellä 57. Kasetti 57 hybridisoitiin ja liitettiin 2,8 ke:n fragmentin sisältävään TGF-alfaan, jolloin muodostui rengasplasmidi. Kloonit, jotka sisälsivät kasetin, identifioitiin hybridisoimalla ne radioaktiivisesti 15 leimatun kasetti 57:n DNA:han. Ihmisen TGF-alfan läsnäolo varmistettiin DNA-sekvensoinnilla. Sekvensointi varmisti myös aikaansaadun TGF-alfa-sekvenssin 3'-päässä olevan Fsp I -paikan läsnäolon. Tämä plasmidi, jota kutsuttiin nimellä TGF-alfa-57/pUC-19, pilkottiin HinD III:11a ja Tsp 20 I:llä, mikä sai aikaan 168 ke:n fragmentin, joka sisältää TGF-alfa-geenin (TGF-alfa-57). pUC-19:n erillinen preparaatti pilkottiin HinD III:11a ja Eco RI:llä, mikä sai aikaan 2,68 ke:n pUC-19-vektori-DNA:n. PE40-DNA eristettiin plasmidista pVC 8 [Chaudhary et ai., PNAS USA 84 (1987) ·. 25 4538 -4542]. pVC 8 pilkottiin käyttäen Nde I:tä. DNA teh tiin tasapäiseksi käyttäen Klenow-reaktion standar-diolosuhteita (Maniatis, et ai., yllä, s. 113). Tämän jälkeen tasapäinen DNA pilkottiin toisen kerran Eco Rl:-llä, jolloin saatiin PE40:n sisältävä 1,3 ke:n Eco Rl -Nde 30 I -fragmentti (tasapäinen). TGF-alfa-57 - HinD III - Fsp I ‘ -fragmentti (168 ke) liitettiin 2,68 ke:n pUC-19-vekto- riin. Yön yli inkuboinnin jälkeen 1,3 ke:n Eco Rl - Nde I -PE40-DNA-fragmentti (tasapäinen) lisättiin ligaatioseok-seen. Tämän toisen ligaation annettiin jatkua yön yli. 35 Ligaatioreaktiotuotetta käytettiin sitten transformoimaan 14 102383 JM 109 -soluja. Kloonit, jotka sisälsivät TGF-alfa-57-PE40:n pUC-19:ssä identifioitiin hybridisoimalla radioak-tiivisesti leimattuun TGF-alfa-57-PE40-DNA:han ja kloonin DNA eristettiin. TGF-alfa-57-PE40 poistettiin pUC-19-vek-5 torista ja siirrettiin TAC-vektorisysteemiin, kuten Line-meyer et ai., Bio-Technology 5 (1987) 960 - 965, kuvaavat. TGF-alfa-57 -PE40 pUC-19:Ssä pilkottiin HinD III:llä ja Eco Ritilä 1,5 ke-.n TGF-alfa-57-PE40:n sisältävän fragmentin muodostamiseksi. Tämän DNA-fragmentin tasainen pää saatiin 10 aikaan käyttäen normaaleja Klenow-reaktion olosuhteita (Maniatis et ai., yllä). TAC-vektori pilkottiin HINd III:-11a ja Eco RI:llä. Tasainen pää saatiin aikaan pilkotun TAC-vektorin DNA:hän normaaleissa Klenow-reaktion olosuhteissa (Maniatis et ai., yllä). 2.7 ke:n tasapäinen vekto-15 ri eristettiin geelielektroforeesilla. Sen jälkeen tasapäinen TGF-ALFA-57-PE40-fragmentti liitettiin tasapäiseen TAC-vektoriin. Tällä ligaatiolla saatua plasmidia käytettiin transformoimaan JM 109 -soluja. Ehdolla olevat kloonit, jotka sisälsivät TGF-alfa-57-PE40:tä, identifioitiin 20 hybridisoimalla, kuten aiemmin on mainittu, ja sekvensoi-tiin. Halutun rakenteen sisältänyttä kloonia kutsuttiin nimellä pTAC TGF57-PE40. Näin saatu plasmidi on kuvattu taulukossa 1. pTAC TGF-57-PE40-DNA:n koodaaman TGF-alfa-PE40 -fuusioproteiinin aminohappokodonien nukleotidisekvens-25 si on kuvattu taulukossa 2. Aminohapposekvenssi, jota koo-daa TGF-57-PE40-geeni, on esitetty taulukossa 3.
ESIMERKKI 3
Rekombinantti-TGF-alfa-PE^:n sisältävien DNA-kloo-30 nien modifioitujen molekyylien muodostaminen * Kvsteiinien korvaaminen alaniineilla
TGF-alfa-PE^-aB
Klooni pTAC TGF57-PE40 pilkottiin Sph I:llä ja Bam HI: llä ja 750 epm Sph I - Bam HI -fragmentti (joka spesi-35 fioi TGF-alfan C-pään 5 aminohappoa ja PE40:n N-pään 243 15 102383 aminohappoa) eristettiin. M13 mpl9 -vektori-DNA katkaistiin Sph I:llä ja Bam Hl-.llä ja vektori-DNA eristettiin. 750 ep:n Sph I - Bam HI -TGF-alfa-PE40-fragmentit liitettiin M13-vektorin DNA:hän yön yli 15 °C:ssa. Isäntäbaktee-5 risolut transformoitiin tällä ligaatioseoksella, ehdolla olevat kloonit eristettiin ja niiden plasmidi-DNA sekven-soitiin, jotta voitiin varmistaa, että kloonit sisälsivät oikeat rekombinantti-DNA:t. Yksisäikeinen DNA valmistettiin mutageneesiä varten.
10 Oligonukleotidi (oligo #132) syntetisoitiin ja käy tettiin paikkaohjatussa mutageneesissä Hpa I -kohdan viemiseksi TGF-alfa-PE40-DNA:han PE40:n aminohappoaseman 272 kohdalla: 5' CTGGAGACGTTAACCCGTC 3' (oligo #132) 15 Eräs tämän paikkaohjatun mutageneesin seuraus oli, että PE40:n ryhmä nro 272 muuttui fenyylialaniinista leu-siiniksi. Mutageneesi suoritettiin Winter et ai.'in, Nature 299 (1982) 756 - 758, kuvaamalla tavalla.
Ehdolla oleva klooni, joka sisälsi äskettäin luodun 20 Hpa I- paikan, eristettiin ja sekvensoitiin, jotta muta-toidun geneettisen sekvenssin esiintyminen voitiin vahvistaa. Sen jälkeen tämä klooni katkaistiin Sphl:llä ja Sa-ll:llä. 210 ep:n fragmentti, joka spesifioi TGF-alfan C-pään 5 aminohappoa ja PE40:n N-pään 70 aminohappoa ja joka *. 25 sisälsi äskettäin lisätyn Hpal-paikan, eristettiin ja ala- kloonattiin takaisin pTAC TGF57-PE40 -kantaplasmidiin Sphl Sali-paikkoihin. Isäntäbakteerisolut transformoitiin, ehdolla oleva klooni eristettiin ja sen plasmidi-DNA sekvensoitiin, jotta voitiin varmistua siitä, että klooni sisäl-30 si oikean rekombinantti-DNA:n. Mukavuussyistä kloonille ‘ annettiin nimi pTAC TGF57-PE40-132. pTAC TGF57-PE40-132 pilkottiin Sphl:llä ja Hpal:llä ja 3,96 ke:n DNA-fragmentti eristettiin. Synteettinen oligonukleotidikasetti (oligo #153), joka kattaa TGF-alfan C-pään 5 aminohappoa ja PE40:n 35 N-pään 32 aminohappoa ja joka sisältää yhteensopivat Sphl- 16 102383 ja Hpal -päät, syntetisoitiin ja liitettiin pilkottuun pTAC TGF57-PE40-132 reen:
5' CGGACCTCCTGGCCATGGCCGAAGAGGGCGGCAGCCTGGCCGCGCTGACCGC 5 3' GTACGCCTGGAGGACCGGTACCGGCTTCTCCCGCCGTCGGACCGGCGCGACT
GCACCAGGCTGCACACCTGCCGCTGGAGACGTT 3’ GGCCGTGGTCCGACGTGTGGACGGCGACCTCTGCAA 5' (oligo #153) Tämä oligonukleotidikasetti aiheutti muutoksen TGF-10 alfa-PE40-DNA:ssa niin, että kodoni, joka spesifioi kyste-
iinin asemassa 265, spesifoi nyt alaniinia. Mukavuussyistä plasmidi-DNA:ta kutsuttiin nimellä pTAC TGF57-PE40-132,153. Isäntäbakteerisolut transformoitiin pTAC TGF57-PE40-132.153-DNA:11a. Ehdolla olevat kloonit identifioi-15 tiin hybridisoimalla, eristettiin ja niiden plasmidi-DNA
sekvensoitiin, jotta varmistuttiin, että se sisälsi oikean rekombinantti-DNA:n.
pTAC TGF57-PE40-132.153-DNA pilkottiin Hpal:llä ja Sällillä ja 3.95 ke:n vektori-DNA eristettiin. Synteetti-20 nen oligonukleotidikasetti (oligo #142), joka käsitti PE40-alueen aminohappotähteet 272 - 309 ja joka sisälsi yhteensopivat Hpal- ja Sall-päät, syntetisoitiin ja liitettiin 3,95 ke:n pTAC TGF-PE40 132,153-DNA:hän: 5' AACCCGTCATCGCCAGCCGCGCGGCTGGGAACAACTGGAGCAGGCTGGCT-25 3' TTGGGCAGTAGCGGTCGGCGCGCCGACCCTTGTTGACCTCGTCCGACCGA- ATCCGGTGCAGCGGCTGGTCGCCCTCTACCTGGCGGCGCGGCTGTCGTGGAACCA-TAGGCCACGTCGCCGACCAGCGGGAGATGGACCGCCGCGCCGACAGCACCTTGGT-GG 3 ' CCAGCT 5' (oligo #142) 30 Tämä oligonukleotidikasetti vaihtaa kodonin, joka *· spesifioi kystiiniä, asemassa 287 niin, että nyt tämä ko doni spesifioi alaniinia. Mukavuussyistä mutatoitua plasmidi-DNA: ta kutsuttiin nimellä pTAC TGF57-PE40-132,153,142. Isäntäbakteerisolut transformoitiin plasmi-35 dilla ja ehdolla olevat kloonit identifioitiin hybridisoi- 17 102383 maila. Nämä kloonit eristettiin ja niiden plasmidi-DNA sekvensoitiin, jotta varmistuttiin, että se sisälsi oikean rekombinantti-DNA:n. pTAC TGF57-PE40-132,153,142-plasmidi koodaa TGF-alfa-PE40 -varianttia, jossa molemmat lokuksen 5 "A" kysteiinit ovat korvautuneet alaniineilla. Sen vuoksi edellä mainittua termistöä noudattaen tätä modifioiduitua TGF-alf a-PE40-molekyyliä kutsutaan nimellä TGF-alfa-PE40-aB. Aminohapposekvenssi, jota koodaa TGF-alfa-PE40-aB-geeni, on esitetty taulukossa 4.
10 TGF-alf a-PE,,·,-Ab
Klooni pTAC TGF57-PE40 pilkottiin Sphl:llä ja BamHI:llä ja 750 ep:n SphI-BanHI-fragmentti (joka spesifioi TGF-alfan C-pään 5 aminohappoa ja PE40:n N-pään 252 aminohappoa) eristettiin. M13 mpl9 -vektori-DNA katkais-15 tiin Sphl:llä ja BamHI:llä ja vektori-DNA eristettiin. 750 ep-.n SphI-BamHI -TGF-alfa-PE40-fragmentit liitettiin M13-vektori-DNA:han yön yli 15 °C:ssa. Isäntäbakteerisolut transformoitiin tällä ligaatioseoksella, ehdolla olevat kloonit eristettiin ja niiden plasmidi-DNA sekvensoitiin, 20 jotta varmistuttiin, että kloonit sisälsivät oikeat rekom-binantti-DNA: t. Yksisäikeinen DNA valmistettiin mutagenee-siä varten.
Oligonukleotidi (oligo #133) syntetisoitiin ja sitä käytettiin paikkaohjatussa mutageneesissä viemään Bstell-25 paikka TGF-alf a-PE40-DNA:han PE40:n aminohappoaseman 369 kohdalla: 5' GACGTGGTGACCCTGAC 3' (oligo #133)
Eräs tämän mutageneesin seuraus oli PE40:n aseman 369 seriiniryhmän muuttuminen treoniiniksi.
30 DNA-klooni, joka sisälsi äskettäin luodun Bstell- ·' paikan, identifioitiin, eristettiin ja sekvensoitiin, jot ta oikean rekombinantti-DNA:n esiintyminen saatiin varmistettua. Seuraavaksi tämä klooni pilkottiin Apal- ja Sall-restriktioentsyymeillä. 120 ke:n insertti-DNA-fragmentti, 35 joka sisälsi äskettäin luodun Bstell-paikan, eristettiin 18 102383 ja liitettiin pTAC TGF57-PE40:een, joka oli myös pilkottu Apal- ja Sali-entsyymillä. Isäntäbakteerisolut transformoitiin ja ehdolla olevat kloonit eristettiin ja sekven-soitiin sen varmistamiseksi, että oikea rekombinantti-DNA 5 oli läsnä. Tätä äskettäin luotua plasmidi-DNA:ta kutsuttiin nimellä pTAC TGF57- PE40-133. Se pilkottiin Bste-II:11a ja Apal:llä ja 2,65 ke:n vektori-DNA-fragmentti eristettiin.
Syntetisoitiin Bstell- Atal-oligonukleotidikasetti 10 (oligo #155), joka kattoi Bstell- ja Apal-restriktioent-syymeillä pTAC TGF57-PE40-133-kloonista pilkotun ja siitä poistetun TGF-alfa-PE40-alueen. Tämä kasetti spesifioi myös yhteensopivien Bstell- ja Apal- päiden nukleotidisekvens-siä.
15 5' GTGACCCTGACCGCGCCGGTCGCCGCCGGTGAAGCTGCGGGCC 3' 3' GGACTGGCGCGGCCAGCGGCGGCCACTTCGACGC 5' (oligo #155) Tämä oligonukleotidikasetti vaihtoi kysteiinien ko-20 donit PE40:n asemissa 372 ja 379 kodoneihin, jotka spesifi-oivat alaniineja. Oligonukleotidikasetti #155 liitettiin 2,65 ke:n vektori-DNA-rfagmenttiin. Isäntäbakteerisolut transformoitiin ja ehdolla olevat kloonit eristettiin ja sekvensoitiin sen varmistamiseksi, että oikea rekombinant-: 25 ti-DNA oli läsnä. Tätä äskettäin luotua DNA-kloonia kut suttiin nimellä pTAC TGF57-PE40-133,155. Se koodaa TGF-alf a-PE40-varianttia, jossa molemmat kysteiinit lokuksessa "B" ovat korvautuneet alaniinilla. Sen vuoksi edellä kuvattua termistöä käyttäen tätä modifioitua TGF-alfa-PE40-30 molekyyliä kutsuttiin nimellä TGF-alfa-PE40 Ab. Aminohappo-sekvenssi, jota koodaan TGF-alfa-PE40-geeni, on esitetty taulukossa 5.
TGF-alfa-PE.^-ab pTAC TGF57-PE40-132,153,142-plasmidi, joka koodaa 35 TGF-alfa-PE40-aB:tä, pilkottiin Sall:llä ja Apal:llä ja 19 102383
tuloksena oleva 3,8 kp:n vektori-DNA-fragmentti eristettiin. pTAC TGF57-PE40-133,155-plasmidi, joka koodaa TGF-alfa-PE40-Ab:tä, hajotettiin myös Sällillä ja Apal-.llä ja saatu 140 ep:n DNA-fragmentti, joka sisälsi kysteiinien 5 vaihdon alaniineiksi PE40:n aminohappoasemissa 372 ja 379, eristettiin. Nämä kaksi DNA:ta liitettiin yhteen ja niitä käytettiin transformoimaan isäntäbakteerisoluja. Ehdolla olevat kloonit identifioitiin hybridisoimalla käyttäen ra-dioaktiivisesti leimattua 140 ep:n pTAC TGF57-PE40-10 133,155-DNA:ta. Ehdolla olevien kloonien plasmidi-DNA
eristettiin ja sekvensoitiin sen varmistamiseksi, että oikea rekombinantti-DNA on läsnä. Äskettäin luotua DNA-kloo-nia kutsuttiin nimellä pTAC TGF57-PE40-132,153,-142,133,155. Plasmidi koodaa TGF-alfa-PE40-varianttia, jol-15 la kaikki lokuksien "A" ja "B" neljä kysteiiniä on korvattu alaniineilla. Tämän vuoksi edellä kuvattua termistöä käyttäen modifioitua TGF-alfa-PE40-molekyyliä kutsuttiin nimellä TGF-alfa-PE40-ab. Aminohapposekvenssi, jota koodaa TGF-alfa-PE40-geeni, on esitetty taulukossa 6.
20 ESIMERKKI 4
Rekombinantti-TGF-alfa-PEin,-n sisältävien DNA-kloo-nien modifioitujen molekyylien muodostaminen Kysteiinirvhmien valinta TGF-alfa-PE40-aB, TGF-alfa-PE40-Ab ja TGF-alfa-PE40-ab 25 voidaan konstruoida myös poistamalla kysteiiniryhmät lo-kuksesta "A" ja/tai "B". Näiden TGF-alfa-PE40-molekyylien muodostaminen toteutetaan identtisesti esimerkissä 3 kuvatulla tavalla, paitsi että: TGF-alfa-PE40-aB -oligonukleo-tidikasetti 153 muutetaan siten, että alaniinikodoni, joka 30 on tarkoitettu asemaan 265, poistetaan, ja oligonukleoti-*. dikasetti 142 muutetaan siten, että alaniinikodoni, joka on tarkoitettu asemaan 287, poistetaan. TGF-alfa-PE40-Ab-oligonukleotidikasetti 155 muutetaan siten, että alaniini-kodonit, jotka on tarkoitettu asemiin 372 ja 379, poiste-35 taan. TGF-alfa-PE40-ab:n DNA-fragmentit, joita käytetään 20 102383 muodostamaan rekombinanttigeeni, otetaan TGF-alf a-PE40-aB-ja TGF-alfa-PE40-Ab-geeneistä, kuten tässä esimerkissä on kuvattu.
ESIMERKKI 5 5 TGF-alf a-PE.n-AB- . TGF-alfa-PE.^-Ab- . TGF-alfa-PE^- aB- ia TGF-alfa-PE.n-ab-proteiinien biologiset aktiivisuudet
Hybridifuusioproteiinit TGF-alfa-PE40-AB, TGF-alfa-PE40-Ab, TGF-alfa-PE40-aB ja TGF-alfa-PE40-ab ekspressoitiin 10 bakteeri-isännissä ja eristettiin, kuten esimerkissä 1 on kuvattu. Sen jälkeen kukin proteiini karakterisoitiin kykynsä suhteen inhiboida radioaktiivisesti leimatun epider-maalisen kasvutekijän sitoutumista A432-solumembraanirak-kuloiden epidermaaliseen kasvutekijäreseptoriin ja kykynsä 15 suhteen tappaa A431-soluja mitattuna MTT-soluproliferaa-tiomäärityksillä, jotka on aikaisemmin kuvattu. Alla olevassa taulukossa esitetään yhteenveto proteiinien biologisista aktiivisuuksista:
EPIDERMAALISEN KASVUTEKIJÄN A431-SOLUN 20 RESEPTORIIN SITOUTUMINEN TAPPO
IC50 nM EC50 pM
TGF-alf a-PE40-AB 346 47 TGF-alf a-PE40-Ab 588 25 TGF-alf a-PE40-aB 27 151 25 TGF-alfa-PE40-ab 60 392 ESIMERKKI 6
Muiden epidermaalisen kasvuteki~iän reseptoriin sitoutuvien kohdistusaineiden korvaaminen TGF-alfa-30 PEin-ab:n TGF-alfa-alueella TGF-alfa-PE40:n käyttö perustuu sen kykyyn sitoutua ja tappaa soluja, joissa on epidermaalisia kasvutekijä-reseptoreita. Muita kohdistusaineita voidaan käyttää luomaan EGF-reseptoreihin sitoutuvia hybridimolekyylejä esil-35 lä olevan keksinnön mukaisesti modifioidun PE40:n kanssa.
21 102383
Esimerkiksi epidermaalisen kasvutekijän, urogastronin, Shopen fibroomaviruksen kasvutekijän tai vacciniaviruk-sen kasvutekijän geenit voidaan liittää PE40:n geeniin ja käyttää ohjaamaan epidermaalinen kasvutekijä - PE40-, 5 urogastroni - PE40-, Shopen fibroomaviruksen kasvutekijä -PE40- tai vacciniaviruksen kasvutekijä - PE40-hybridi-fuusioproteiinien synteesiä. Jokaisessa tapauksessa yksi tai useampi tässä kuvatuista PE40:n modifikaatioista parantaa kuitenkin näiden muiden hybridifuusioproteiinien si-10 toutumista soluihin, joissa on epidermaalisia kas-vutekij äreseptoreita.
ESIMERKKI 7
Muihin nisäkässoluien reseptoreihin sitoutuvien kohdistusaineiden korvaaminen TGF-alfa-ΡΕ,η:n 15 TGF-alfa-alueella
On ymmärrettävä, että tämä keksintö kohdistuu PE40:n ja nisäkässolujen spesifisiä reseptoreja tunnistavien kohdistusaineiden muodostamien hybridifuusioproteiinien PE40-alueen modifiointiin. Esimerkiksi fuusioproteiineilla, 20 jotka muodostuvat proteiineista ja esillä olevan keksinnön mukaisesta modifioidusta PE40:stä ja joilla on yleinen kaava: proteiini X - PE4Q, jossa proteiini X on interleukiini-2, interleukiini-3, interleukiini-4, interleukiini-6, ve-rihiutaleperäinen kasvutekijä tai mikä tahansa proteiini, ' 25 joka tunnistaa ja sitoutuu spesifiseen nisäkässoluresepto- riin, on parantuneet sitoutumisominaisuudet vastaaviin solureseptoreihinsa.
ESIMERKKI 8 TGF-alfa-PE,n-ab:n biologinen aktiivisuus ihmisen 30 kerätinosvvtteiä vastaan Käytettäessä Mossmannin, J. Immunol. Methods 65 (1983) 55 - 63, soluproliferäätiomääritystä TGF-alfa-PE40-ab tappoi helposti määrityksessä käytetyt keratinosyytit. TGF-alfa-PE40:n konsentraatio, joka vaadittiin tappamaan 35 50 % keratinosyyteistä (ED50) , oli 11 nM.
TAULUKKO 1 22 102383 fECORl) VHIndW PE40 (NDEI /FSPl) ♦ ♦ » · · I· **» ·**^^^ g »/V v
'ζ'/β' APA1 SALI /'HindllA
£//* ^AECORlJ
Μ 'm, m PST' \p f β$ί pTAC TGF57-PE40 (bam hi) 23 102383 TAULUKKO 2
ATGGCTGCAGCAGTGGTGTCCCATTTTAATGACTGCCCAGATTCCCACACTCAGTTCTGCTTCCATGGAACATGCAGG
tttttggtgcaggaggacaagccggcatgtgtctgccattctgggtacgttggtgcgcgctgtgagcatgcggacctc
CTGGCTGCTATGGCCGAAGAGGGCGGCAGCCTGGCCGCGCTGACCGCGCACCAGGCTTGCCACCT6CCGCTGGAGACT
TTCACCCGTCATCGCCAGCCGCGCGGCTGGGAACAACTGGAGCAGTGCGGCTATCCGGTGCAGCGGCTGGTCGCCCTC
TACCTGGCGGCGCGGCTGTCGTGGAACCAGGTCGACCAGGTGATCCGCAACGCCCTGGCCAGCCCCGGCAGCGGCGGC
GACCTGGGCGAAGCGATCCGCGAGCAGCCGGAGCAGGCCCTGGCCCTGACCCTGGCCGCCGCCGAGAGCGAGCGCTTC
GTCCGGCAGGGCACCGGCAACGACGAGGCCGGCGCGGCCAACGCCGACGTGGTGAGCCTGACCTGCCCGGTCGCCGCC
ggtgaatgcgcgggcccggcggacagcggcgacgccctgctggagcgcaactatcccactggcgcggagttcctcggc gacggcggcgacgtcagcttcagcacccgcggcacgcagaactggacggtggagcggctgctccaggcgcaccgccaa
CTGGAGGA6CGCGGCTATGTGTTC6TCGGCTACCACGGCACCTTCCTCGAAGCGGCGCAAAGCATCGTCTTCGGCGGG
GTGCGCGCGCGCAGCCAGGACCTCGACGCGATCTGGCGCGGTTTCTATATCGCCGGCGATCCGGCGCTGGCCTACGGC
tacgcccaggaccaggaacccgacgcacgcggccggatccgcaacggtgccctgctgcgggtctatgtgccgcgctcg agcctgccgggcttctaccgcaccagcctgaccctggccgcgccggaggcggcgggcgaggtcgaacggctgatcggc
CATCCGCTGCCGCTGCGCCTGGACGCrMCACCGGCCCCGAGGAGGAAGGCGGGCGCCTGGAGACCATTCTCGGCTGG
ccgctggccgagcgcaccgtggtgattccctcggcgatccccaccgacccgcgcaacgtcggcggcgacctcgacccg
TCCAGCATCCCCGACAAGGAACAGGCGATCAGCGCCCTGCCGGACTACGCCAGCCAGCCCGGCAAACCGCCGCGCGAG
GACCTGAAGTAA
TGF-alfa-PE^Q:n aminohappo- sekvenssi 24 102383 TAULUKKO 3 -4 -3 -2 -1'TGFa1 6 16
Het Ala Ala Ala'Vai Vai Ser His Phe Asn Asp Cys Pro Asp Ser His Thr Gin Phe Cys 26 36
Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Vai Gin Glu Asp Lys Pro Ala Cys Vai Cys His Ser 46 TGFa501 ' PE252
Gly Tyr Vai Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu Leu Ala* Ala Het Ala Glu'Glu Gly 263 273
Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gin Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr 283 293
Arg His Arg Gin Pro Arg Gly Trp Glu Gin Leu Glu Gin Cys Gly Tyr Pro Vai Gin Arg 303 313
Leu Vai Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gin Vai Asp Gin Vai Ile Arg 323 333
Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gla Pro 343 353
Glu Gin Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Vai Arg Gin 363 373 ·. Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Vai Vai Ser Leu Thr Cys Pro 383 393
Vai Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn 403 413
Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly A*P Gly Gly Asp Vai Ser Phe Ser Thr Arg Gly 423 . 433
Thr Gin Asn Trp Thr Vai Glu Arg Leu Leu Gin Ala His Arg Gin Leu Glu Glu Arg Gly 443 453
Tyr Vai Phe Vai Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gin Ser Ile Vai Phe Gly 463 473
Gly Vai Arg Ala Arg Ser Gin Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly 483 493 TAULUKKO 3 (jatkuu) 25 102383 TGF-alfa-PE^Q:n aminohapposekvenssi
Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile 503 513
Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Vai Tyr Vai Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg 523 533
Tlir Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Vai Glu Arg Leu Ile Gly His 543 553
Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu 563 573
Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Vai Vai Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr 583 593
Asp Pro Arg Asn Vai Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gin Ala 603 613
Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys TGF-alfa- aB:n aminohapposekvenssi TAULUKKO 4 26 102383 -4 -3 _2 -1‘TGFa1 6 16
Met Ala Ala Ala'Vai Vai Ser Hl* Ph· Asn Asp Cys Pro Asp Ser Hls Thr Gin Ph· Cys 26 36
Phe Hi s Gly Thr Cys Arg Ph· Leu Vai Gin Glu Asp Lys Pro Ala Cys Vai Cys his 5*r 46 TGFa501 'PE252
Gly Tyr Vai Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu Leu Ala'Ala Met Ala Glu'Glu Gly 263 273
Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gin Ala Ala His Leu Pro Leu Glu Thr Leu Thr 283 293
Arg His Arg Gin Pro Arg Gly Trp Glu Gin Leu Glu Gin Ala Gly Tyr Pro Vai Gin Arg 303 313
Leu Vai Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gin Vai Asp Gin Vai Ile Arg 323 333
Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala II# Arg Glu Gin Pro 343 353
Glu Gin Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Vai Arg Gin 363 373
Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Vai Vai Ser Leu Thr Cys Pro * 383 393
Vai Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn 403 413
Tyr Pro Thr Glu Ala Glu Phe Leu Gly Aip Gly Gly Asp Vai Ser Phe Ser Thr Arg Gly 423 433 ·, Thr Gin Asn Trp Thr Vai Glu Arg Leu Leu Gin Ala His Arg Gin Leu Glu Glu Arg Gly 443 453
Tyr Vai Phe Vai Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gin Ser Ile Vai Phe Gly 463 473
Gly Vai Arg Ala Arg Ser Gin Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly 483 493 TAULUKKO 4 (jatkuu) 27 102383 TGF-alfa-aB:n aminohapposekvenssi
Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ilo 503 513
Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Vai Tyr Vai Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg 523 533
Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Vai Glu Arg Leu Ile Gly His 543 553
Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu 563 573
Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Vai Vai Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr 583 593
Asp Pro Arg Asn Vai Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gin Ala 603 613
Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys « TGF-alfa-PE^Q-Ab:n aminohapposekvenssi TAULUKKO 5 28 102383 «4 -3 -2 -1'TGFa1 6 16
Het Ala Ala Ala'Vai Vai Ser Hi s Phc Asn Asp Cys Pro Asp Ser His Thr Gin Ph· Cys 26 36
Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Ltu Vai Gin Glu Asp Lys Pro Ala Cys Vai Cys His Ser 46 TGFa50' ' PE252
Gly Tyr Vai Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu Leu Ala'Ala Het Ala Glu'Glu Gly 263 273
Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gin Ala Cys His Leu Pro Lcu Glu Thr Phe Thr 2B3 293
Arg His Arg Gin Pro Arg Gly Trp Glu Gin Lcu Glu Gin Cys Gly Tyr Pro Vai Gin Arg 303 313
Lcu Vai Ala Lcu Tyr Lcu Ala Ala Arg Lcu Ser Trp Asn Gin Vai Asp Gin Vai Ile Arg 323 333
Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser 61y Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gin Pro 343 353 f
Glu Gin Ala Arg Lcu Ala Leu Thr Lcu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Vai Arg Gin 363 373
Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Vai Vai Thr Lcu Thr Ala Pro 303 393
Vai Ala Ala Gly Glu Ala Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Lcu Lcu Glu Arg Asn 403 413
Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Lcu Gly Asp Gly Gly Asp Vai Ser Phe Ser Thr Arg Gly 423 433
Thr Gin Asn Trp Thr Vai Glu Arg Lcu Lcu Gin Ala His Arg Gin Leu Glu Glu Arg Gly 443 453 c
Tyr Vai Phe Vai Gly Tyr His Gly Thr Phc Leu Glu Ala Ala Gin Ser Ile Vai Phe Gly 463 473
Gly Vai Arg Ala Arg Ser Gin Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly 483 493 TAULUKKO 5 (jatkuu) 29 102383 TGF-alfa-PE^Q-Ab:n aminohapposekvenssi
Asp Pro AI· L1u Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile 503 513
Arg Asn Gly Ala Leu Leo Arg Vai Tyr Vai Pro Arg Ser Ser leu Pro Gly Phe Tyr Arg 523 533
Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Vai Glu Arg Leu Ile Gly Hts 543 553
Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu 563 573
Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Vai Vai Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr 583 593
Asp Pro Arg Asn Vai Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gin Ala 603 613
Ile Ser Ala Leu Pro Asp Ty: Ala Ser Gin Pro Gly Ly^ Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys · TGF-alfa-PE^g-ab:n aminohapposekvenssi TAULUKKO 6 30 102383 -4 -3 -2 -1'TGFa1 6 >6
Met Ala Ala AI a'Vai Vai Ser Hii Phe Asn Asp Cys Pro Asp Sar Hi s Thr Gin Ph# Cys 26 36
Phe Hi s Gly Thr Cys Arg Phc Lau Vai Gin Glu Asp Lys Pro Ala Cys Vai Cys Hi s Sar 50. . 252
46 TGfa ' ' PE
Gly Tyr Vai Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Lau Lau Ala* Ala Het Ala Glu'Glu Gly 263 273
Gly Ser Lau Ala Ala Lau Thr Ala His Gin Ala Ala His Lau Pro Lau Glu Thr Lau Thr 2Θ3 293
Arg His Arg Gin Pro Arg Gly Trp Glu Gin Lau Glu Gin Ala Gly Tyr Pro Vai Gin Arg 303 313
Leu Vai Ala Leu Tyr Lau Ala Ala Arg Lau Ser Trp Asn Gin Vai Asp Gin Vai Ile Arg 323 333
Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gin Pro 343 ' 353
Glu Gin Ala Arg Leu Ala Lau Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Vai Arg Gin 363 373 . Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Vai Vai Thr Leu Thr Ala Pro 383 393
Vai Ala Ala Gly Glu Ala Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn 403 413
Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Ajp Gly Gly Asp Vai Ser Phe Ser Thr Arg Gly 423 433
Thr Gin Asn Trp Thr Vai Glu Arg Leu Leu Gin Ala His Arg Gin Leu Glu Glu Arg Gly 443 453
Tyr Vai Phe Vai Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gin Ser Ile Vai Phe Gly 463 473
Gly Vai Arg Ala Arg Ser Gin Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly 4Θ3 493 TAULUKKO 6 (jatkuu) TGF-alfa-PE^Q-ab:n aminohapposekvenssi 31 102383
Asp Pro Ala Lty Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg II· 503 513
Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Vai Tyr Vai Pro Arg S«r Ser Leu Pro Gly Ph· Tyr Arg 523 533
Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Vai Glu Arg Leu Ile Gly His 543 553
Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu 563 573
Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Vai Vai Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr 583 593
Asp Pro Arg Asn Vai Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gin Ala 603 613
Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys

Claims (14)

102383
1. Menetelmä sellaisen hybridiproteiinin valmistamiseksi, joka sisältää modifioidun PE40-domeenin, joka kä- 5 sittää taulukossa 3 esitetyn Pseudomonas-eksotoksiinin aminohapposekvenssin 252 - 613, jossa vähintään kaksi asemissa 265, 287, 372 ja 379 olevista kysteiiniryhmistä on poistettu tai korvattu aminohapoilla, jotka eivät muodosta disulfidisiltoja, ja joka on liitetty kohdistusaineen tun-10 nistavaan reseptoriin sitoutuvaan proteiinin kohdistusdo-meeniin, jolloin hybridiproteiinin sytotoksisuus on heikentynyt ja/tai kyky sitoutua reseptoriin on tehostunut, tunnettu siitä, että plasmidi, joka sisältää mainittua hybridiproteiinia koodaavan DNA-sekvenssin toimin-15 nallisesti liitettynä ekspression helpottaviin säätelyele-mentteihin, transformoidaan sopivaan prokaryoottiseen tai eukaryoottiseen isäntään ja isäntää kasvatetaan olosuhteissa, joissa hybridiproteiinia tuotetaan.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että kohdistusaine on kasvutekijä, hormoni tai vasta-aine.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vähintään kaksi kysteiinitäh-dettä korvataan.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että neljä kysteiinitähdettä korvataan.
5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vähintään yksi kysteiinitähde .. 30 korvataan alaniinilla. * 6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vähintään kaksi kysteiinitähdettä korvataan alaniinilla.
7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että neljä kysteiinitähdettä korvataan alaniinilla. 102383
8. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vähintään yksi kysteiinitähde korvataan muulla aminohapolla kuin alaniinilla, joka aminohappo ei muodosta disulfidisidosta.
9. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vähintään kaksi kysteiinitäh-dettä korvataan muulla aminohapolla kuin alaniinilla, joka aminohappo ei muodosta disulfidisidosta.
10. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että neljä kysteiinitähdettä korvataan muulla aminohapolla kuin alaniinilla, joka aminohappo ei muodosta disulfidisidosta.
11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vähintään kaksi kysteiinitäh- 15 dettä poistetaan.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että neljä kysteiinitähdettä poistetaan .
13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että kaksi kysteiinitähdettä kor vataan aminohapolla, joka ei muodosta disulfidisidosta, ja että kaksi kysteiinitähdettä poistetaan.
14. Plasmidi, joka sisältää patenttivaatimuksessa 1 määriteltyä hybridiproteiinia koodaavaa DNA:ta ja joka 25 pystyy ekspressoimaan hybridiproteiinia sopivassa prokary- ootti- tai eukaryootti-isännässä. 102383
FI900783A 1989-02-17 1990-02-16 Menetelmä ja plasmidi modifioidun PE40-domeenia sisältävän hybridiprot eiinin valmistamiseksi FI102383B (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31254089A 1989-02-17 1989-02-17
US31254089 1989-02-17
US38909289A 1989-08-03 1989-08-03
US38909289 1989-08-03
US44918789A 1989-12-21 1989-12-21
US44918789 1989-12-21

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI900783A0 FI900783A0 (fi) 1990-02-16
FI102383B1 FI102383B1 (fi) 1998-11-30
FI102383B true FI102383B (fi) 1998-11-30

Family

ID=27405603

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI900783A FI102383B (fi) 1989-02-17 1990-02-16 Menetelmä ja plasmidi modifioidun PE40-domeenia sisältävän hybridiprot eiinin valmistamiseksi

Country Status (18)

Country Link
EP (1) EP0383599B1 (fi)
JP (2) JPH07106159B2 (fi)
KR (1) KR0169729B1 (fi)
AT (1) ATE133993T1 (fi)
AU (1) AU617039B2 (fi)
CA (1) CA2010256C (fi)
CY (1) CY1987A (fi)
DE (1) DE69025211T2 (fi)
DK (1) DK0383599T3 (fi)
ES (1) ES2085329T3 (fi)
FI (1) FI102383B (fi)
GR (1) GR3019836T3 (fi)
HK (1) HK15597A (fi)
IE (1) IE71934B1 (fi)
IL (1) IL93425A (fi)
NO (1) NO300595B1 (fi)
NZ (1) NZ232564A (fi)
PT (1) PT93178B (fi)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU631200B2 (en) * 1989-02-17 1992-11-19 Merck & Co., Inc. Production of modified pe40
ATE138688T1 (de) * 1989-04-21 1996-06-15 Us Health Rekombinantes antikörper-toxin-fusion-protein
IL98528A0 (en) * 1990-06-21 1992-07-15 Merck & Co Inc Pharmaceutical compositions containing hybrid for killing bladder cancer cells
GB2246779B (en) * 1990-08-03 1994-08-17 Delta Biotechnology Ltd Tumour-associated protease inhibitors targeted to tumour cells
AUPM959894A0 (en) * 1994-11-22 1994-12-15 Crc For Biopharmaceutical Research Pty Ltd Fusion proteins with cytotoxic activity against cells overexpressing erbb2-4
US6500646B1 (en) * 1996-12-27 2002-12-31 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Cell membrane-directed drugs
NZ500656A (en) * 1997-05-12 2001-11-30 Tno Vector containing a nucleic acid insertion expressing a hybrid polypeptide with a protease inhibitor domain and a receptor binding domain
GB0008802D0 (en) * 2000-04-10 2000-05-31 Univ London Molecule
AU2005257064B2 (en) * 2004-06-28 2012-05-10 Yeda Research And Development Co. Ltd. Chimeric proteins and uses thereof
JPWO2015076121A1 (ja) 2013-11-20 2017-03-16 株式会社村田製作所 多層配線基板およびこれを備えるプローブカード
WO2017061449A1 (ja) * 2015-10-05 2017-04-13 国立研究開発法人産業技術総合研究所 がん細胞の検出方法、がん細胞内に物質を導入するための試薬、及びがん治療用組成物

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL90047A (en) * 1982-10-19 1992-12-01 Cetus Oncology Corp Cysteine-depleted biologically active muteins other than interferon - '
FI82266C (fi) * 1982-10-19 1991-02-11 Cetus Corp Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein.
US4545985A (en) * 1984-01-26 1985-10-08 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins
US4892827A (en) * 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
ATE138688T1 (de) * 1989-04-21 1996-06-15 Us Health Rekombinantes antikörper-toxin-fusion-protein

Also Published As

Publication number Publication date
AU617039B2 (en) 1991-11-14
IE71934B1 (en) 1997-03-12
DE69025211T2 (de) 1996-09-19
FI102383B1 (fi) 1998-11-30
DE69025211D1 (de) 1996-03-21
KR0169729B1 (ko) 1999-01-15
CY1987A (en) 1997-09-05
JPH07106159B2 (ja) 1995-11-15
IL93425A (en) 1999-08-17
FI900783A0 (fi) 1990-02-16
EP0383599A2 (en) 1990-08-22
CA2010256A1 (en) 1990-08-17
PT93178B (pt) 1996-04-30
HK15597A (en) 1997-02-14
JP2510846B2 (ja) 1996-06-26
JPH02276590A (ja) 1990-11-13
GR3019836T3 (en) 1996-08-31
CA2010256C (en) 2000-07-25
JPH07278200A (ja) 1995-10-24
AU4994690A (en) 1990-08-23
NO900758L (no) 1990-08-20
EP0383599B1 (en) 1996-02-07
ES2085329T3 (es) 1996-06-01
DK0383599T3 (da) 1996-08-05
NZ232564A (en) 1992-08-26
KR900012626A (ko) 1990-09-01
IL93425A0 (en) 1990-11-29
EP0383599A3 (en) 1991-03-27
PT93178A (pt) 1990-08-31
IE900587L (en) 1990-08-17
ATE133993T1 (de) 1996-02-15
NO300595B1 (no) 1997-06-23
NO900758D0 (no) 1990-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0467536B1 (en) Method of treating bladder cancer cells
FI102383B (fi) Menetelmä ja plasmidi modifioidun PE40-domeenia sisältävän hybridiprot eiinin valmistamiseksi
CA2260288A1 (en) Conjugates of soluble peptidic compounds with membrane-binding agents
Edwards et al. Epidermal growth factor receptor binding is affected by structural determinants in the toxin domain of transforming growth factor-alpha-Pseudomonas exotoxin fusion proteins
Frankel et al. High-level expression and purification of the recombinant diphtheria fusion toxin DTGM for PHASE I clinical trials
Kreitman et al. Site-specific conjugation to interleukin 4 containing mutated cysteine residues produces interleukin 4-toxin conjugates with improved binding and activity
CA2071946A1 (en) Toxin for construction of immunotoxins
US5621078A (en) Modified pseudomonas exotoxin PE40
US6207798B1 (en) Modified PE40 toxin fusion proteins
US6833437B2 (en) Complement receptor type 1 (CR1)-like sequences
CA2012732C (en) Production of modified pe40
NZ238583A (en) Targetted cytotoxic anticancer conjugates and
AU631200B2 (en) Production of modified pe40
Riemen et al. Modified pseudomonas exotoxin PE 40
AU653365C (en) Protein structure of the plant toxin gelonin
Struckmeier et al. Pseudomonas aeruginosa cytotoxin: the Asp 197-Gly-Asp-Tyr-His-Tyr-His-Tyr 202 containing loop is critical for plasma membrane binding
AU8624091A (en) Protein structure of the plant toxin gelonin

Legal Events

Date Code Title Description
MM Patent lapsed

Owner name: MERCK & CO., INC.