NO300595B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som omfatter et PE40-domene, samt plasmid for anvendelse ved ekspresjon av hybridproteinet - Google Patents

Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som omfatter et PE40-domene, samt plasmid for anvendelse ved ekspresjon av hybridproteinet Download PDF

Info

Publication number
NO300595B1
NO300595B1 NO900758A NO900758A NO300595B1 NO 300595 B1 NO300595 B1 NO 300595B1 NO 900758 A NO900758 A NO 900758A NO 900758 A NO900758 A NO 900758A NO 300595 B1 NO300595 B1 NO 300595B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
tgf
alpha
hybrid protein
dna
protein
Prior art date
Application number
NO900758A
Other languages
English (en)
Other versions
NO900758D0 (no
NO900758L (no
Inventor
Allen I Oliff
Gwynneth M Edwards
Deborah D Jones
Original Assignee
Merck & Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck & Co Inc filed Critical Merck & Co Inc
Publication of NO900758D0 publication Critical patent/NO900758D0/no
Publication of NO900758L publication Critical patent/NO900758L/no
Publication of NO300595B1 publication Critical patent/NO300595B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som omfatter et PE40-domene, samt plasmid for anvendelse ved ekspresjon av hybridproteinet.
Oppfinnelsens bakgrunn
Tradisjonell cancerkjemoterapi er basert på medi-siners egenskaper når det gjelder å drepe svulstceller hos kreftpasienter. Uheldigvis dreper de samme legemidler ofte normale celler så vel som svulstcellene. Omfanget som et kreftlegemiddel dreper svulstceller heller enn normale celler i, er en indikasjon på forbindelsens grad av selektivitet overfor svulstceller. En metode for å øke svulstcelleselek-tiviteten til kreftlegemidler er å gi legemidlene fortrinnsvis til tumorcellene mens man unngår normale cellepopulasjoner. En annen betegnelse for den selektive tilførsel av kjemoterapeut-iske midler til spesifikke cellepopulasjoner er "målsøking"
( "targeting"). Legemiddelmålsøking for tumorceller kan bli utført på forskjellige måter. En metode er basert på nærværet av spesifikke reseptormolekyler funnet på overflaten til tumorceller. Andre molekyler, referert til som "målsøkende forbindelser", kan gjenkjenne og binde til disse overflate-reseptorer. Disse "målsøkende forbindelser" inkluderer f.eks. antistoffer, vekstfaktorer eller hormoner. "Målsøkende forbindelser" som gjenkjenner og binder til spesifikke celleover-flatereseptorer, er sagt å målsøke cellene som besitter disse reseptorer. For eksempel har mange tumorceller et protein på overflaten kalt epidermal vekstfaktorreseptor. Forskjellige vekstfaktorer inkludert epidermal vekstfaktor (EGF) og transformerende vekstfaktor-alfa (TGF-alfa) gjenkjenner og binder til EGF-reseptoren på tumorceller. EGF og TGF-alfa er derfor "målsøkende forbindelser" for disse tumorceller.
"Målsøkende forbindelser" dreper ikke tumorceller selv. Andre molekyler inkludert cellegift eller toksiner kan bli bundet til "målsøkende forbindelser" for å lage hybridmolekyler som besitter både tumorcellemålsøkende og celle-toksindomener. Disse hybridmolekylene fungerer som tumorcelle-selektive gifter ved hjelp av deres egenskaper når det gjelder å søke tumorceller og så drepe disse cellene via deres toksin-
komponent. Noen av de mest potente cellulære gifter brukt i konstruksjon av disse hybridmolekyler, er bakterielle toksiner som hemmer proteinsyntese i pattedyrceller. Pseudomonas exotoxin A er en av disse bakterielle toksiner og er blitt brukt for å konstruere hybride "målsøkende toksin"-molekyler (US patent 4,545,985).
Pseudomonas exotoxin A forgifter pattedyrceller ved først å binde til cellens overflate, så går det inn i celle-cytoplasmaet og inaktiverer elongeringsfaktor 2 som er et cellulært protein nødvendig for proteinsyntese. Pseudomonas exotoxin A er blitt benyttet for å konstruere anticancer-hybridmolekyler ved bruk av monoklonale antistoffer og proteinhormoner. Et problem med disse hybride molekyler er imidlertid at de oppviser toksisitet mot normale celler. I det minste en del av toksisiteten forbundet med hybridmolekyler som inneholder Pseudomonas exotoxin A, skyldes egenskapen til Pseudomonas exotoxin A ved selv å binde til og gå inn i mange typer av pattedyrceller. Derfor kan hybridmolekyler dannet mellom Pseudomonas exotoxin A og spesifikke "målsøkende forbindelser", binde de mange normale celler i tillegg til cellene gjenkjent av den "målsøkende forbindelse". En fremgangsmåte når det gjelder å løse dette problem, er å modifi-sere Pseudomonas exotoxin A slik at det ikke lenger er i stand til å binde til normale celler. Dette kan bli utført ved å fjerne den del av Pseudomonas exotoxin A-molekylet som er ansvarlig for den cellulære bindingsaktivitet. En avkortet form av Pseudomonas exotoxin A-molekylet er blitt laget som beholder egenskapen å inaktivere elongeringsfaktor 2, men som ikke lenger er i stand til binding til pattedyrceller. Dette modifiserte Pseudomonas exotoxin A-molekyl blir kalt Pseudomonas exotoxin-40 eller PE40 (Hwang et al., Cell 48:129-136, 1987).
PE40 er blitt bundet til flere målsøkende molekyler inkludert TGF-alfa (Chaudhary et al., PNAS, USA 84:4538-4542, 1987). I tilfellet med TGF-alfa er hybridmolekylet som inneholder PE40- og TGF-alfadomener i stand til spesifikk binding til tumorceller som besitter EGF-reseptorer og forgifte disse celler via hemming av proteinsyntesen. For at dette hybridmolekyl skal binde effektivt til EGF-reseptoren, må det anta den rette konformasjon. Effektiv reseptorbinding er også av-hengig av å ha "det målsøkende domene" eksponert riktig, slik at det er i stand til å binde. Når TGF-alfa og PE40-hybridmolekyler blir produsert som fusjonsproteiner i bakterier ved bruk av rekombinant DNA-teknikker, viser hoveddelen av hybridmolekylene dårlig EGF-reseptorbindingsaktivitet.
Teknikkens stand
1. US patent 4,545,985 lærer at Pseudomonas exotoxin A kan bli konjugert til antistoffer eller til epidermal vekstfaktor. Patent 4,545,985 lærer videre at disse konjugater kan bli benyttet for å drepe humane tumorceller. 2. US patent 4,664,911 lærer at antistoffer kan bli konjugert til A-kjeden eller B-kjeden av ricin som er et toksin oppnådd fra planter. Patent 4,664,911 lærer videre at disse konjugater kan bli benyttet for å drepe humane tumorceller. 3. US patent 4,675,382 lærer at hormoner, slik som melanocyttstimulerende hormon (MSH), kan bli bundet til en del av difteritoksinproteinet via peptidbindinger. Patent 4,675,383 lærer videre at genene som koder for disse proteinene, kan bli bundet sammen for å dirigere syntesen av et hybridfusjonsprotein ved bruk av rekombinant DNA-teknikker. Dette fusjonsprotein har evne til å binde til celler som besitter MSH-reseptorer. 4. Murphy et al., PNAS, USA 83:8258-8262, 1986, "Genetisk konstruksjon, ekspresjon og melanom-selektiv cyto-toksisitet til et difteritoksin-relatert alfa-melanocyttstimulerende hormonfusjonsprotein". Denne artikkel lærer at et hybridfusjonsprotein produsert i bakterier ved bruk av rekombinant DNA-teknologi, og bestående av en del av difteritoksinproteinet bundet til alfa-melanocyttstimulerende hormon, vil binde til og drepe humane melanomceller. 5. Kelley et al., PNAS, USA 85:3980-3984, 1988, "Interleukin-2-difteritoksinfusjonsprotein kan oppheve cellemediert immunitet in vivo". Denne artikkel lærer at et hybridfusjonsprotein produsert i bakterier ved bruk av rekombinant DNA-teknologi, og bestående av en del av difteritoksinproteinet bundet til interleukin-2, fungerer i nakne mus til å
undertrykke cellemediert immunitet.
6. Allured et al., PNAS, USA 83:1320-1324, 1986, "Struktur av eksotoksin A fra Pseudomonas aeruginosa på
3,0 Ångstrøm-nivå". Denne artikkel beskriver den tredimensjo-nale struktur til Pseudomonas exotoxin A-protein. 7. Hwang et al., Cell 48:129-136, 1987, "Funksjonelle domener i Pseudomonas exotoxin identifisert ved dele-sjonsanalyse av genet uttrykt i E. coli". Denne artikkel beskriver at Pseudomonas exotoxin A-protein kan bli delt inn i tre forskjellige funksjonelle domener ansvarlig for: binding til pattedyrceller, translokering av toksinproteinet over lysosomale membraner og ADP-ribosylering av elongeringsfaktor 2 inne i pattedyrceller. Denne artikkel beskriver videre at disse funksjonelle domener korresponderer til distinkte regioner av Pseudomonas exotoxin A-protein.
8. Europeisk patentsøknad 0 261 671, publisert
30. mars 1988, beskriver at en del av Pseudomonas exotoxin A-proteinet som mangler den cellulære bindingsfunksjon til det hele Pseudomonas exotoxin A-protein, men har de translokerende og ADP-ribosylerende funksjoner til det hele Pseudomonas exotoxin A-protein, kan fremstilles. Delen av Pseudomonas exotoxin A-proteinet som beholder de translokerende ADP-ribo-syleringsfunksjoner til det hele Pseudomonas exotoxin A-proteinet, er kalt Pseudomonas exotoxin-40 eller PE-40. PE-40 består av aminosyrerester 252-613 til det hele Pseudomonas exotoxin A-proteinet som beskrevet i Gray et al., PNAS, USA 81:2645-2649, 1984. Denne patentsøknaden beskriver videre at PE-40 kan bli bundet til transformerende vekstfaktor-alfa for å danne et hybridfusjonsprotein produsert i bakterie ved bruk av rekombinant DNA-teknikker. 9. Chaudhary et al., PNAS, USA 84:4538-4542, 1987, "Aktivitet av et rekombinant fusjonsprotein mellom transformerende vekstfaktor type alfa og Pseudomonas toxin". Denne artikkel beskriver at hybridfusjonsproteiner dannet mellom PE-40 og transformerende vekstfaktor-alfa produsert i bakterie ved bruk av rekombinant DNA-teknikker, vil binde til og drepe humane tumorceller som besitter epidermale vekstfaktorreseptorer. 10. Bailon, Biotechnology, pp 1326-1329, nov. 1988,
"Rensing og delvis karakterisering av et interleukin-2-Pseudomonas exotoxin-fusjonsprotein". Denne artikkel beskriver at hybridfusjonsproteiner dannet mellom PE-40 og interleukin-2, og produsert i bakterie ved bruk av rekombinant DNA-teknikker, vil binde til og drepe humane cellelinjer som besitter interleukin-2-reseptorer.
Formål med oppfinnelsen
Det er et formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe modifikasjoner av PE40 som tillater effektiv binding av hybridmolekylet dannet mellom "målsøkende forbindelser" og modifiserte PE40-molekyler til cellulære reseptorer som gjenkjenner den "målsøkende forbindelse". Det er en annen hensikt med denne oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av hybridproteinene som blir produsert mellom "målsøkende forbindelser" og modifisert PE40 som fusjonsproteiner i bakterier. En annen hensikt med den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe et hybrid- (eller fusjons)-protein som har et cellereseptorbindingsdomene (eller region) og et PE40-domene (eller region), der PE40-domenet er blitt modifisert til å øke binding av hybridproteinet til den epidermale vekstfaktorreseptor eller til reseptoren bundet ved den målsøkende forbindelse koblet til det modifiserte PE40. En annen hensikt er å tilveiebringe et hybridprotein som er lettere å rense. Disse og andre formål med den foreliggende oppfinnelse vil fremgå av den etterfølgende beskrivelse.
Oppsummering av oppfinnelsen
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som omfatter et PE40-domene som omfatter sekvensen angitt i tabell 3, modifisert ved alaninerstatning eller delesjon av minst én cysteinrest i 265-, 287-, 372- og 379-stillingene, koblet til et TGF-a-domene som binder til reseptoren gjenkjent av en vekstfaktor, et hormon eller et antistoff som et målsøkende middel, som er kjennetegnet ved å dyrke en transformert vertscelle som inneholder et plasmid inneholdende en DNA-sekvens som koder for det angitte hybridprotein, operativt bundet til transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som dirigerer ekspresjon av hybridproteinet, samt en seleksjonsmarkør, hvoretter proteinet isoleres og renses. Det modifiserte PE40-domene forbedrer reseptorbindingsaktiviteten til dette hybridmolekyl. Hybridmolekylene fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse binder mer effektivt til målreseptorer på humane tumorceller enn hybridmolekyler som har ikke-modifisert PE40.
Videre tilveiebringer oppfinnelsen et plasmid for anvendelse ved ekspresjon av hybridproteinet fremstilt ifølge krav 1 som omfatter et PE40-domene som omfatter sekvensen angitt i tabell 3, modifisert ved alaninerstatning eller delesjon av minst én cysteinrest i 265-, 287-, 372- og 379-stillingene, koblet til et TGF-a-domene som binder til reseptoren gjenkjent av en vekstfaktor, et hormon eller et antistoff som et målsøkende middel, kjennetegnet ved at det inneholder en DNA-sekvens som koder for det angitte hybridprotein, operativt bundet til transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som dirigerer ekspresjonen av DNA-sekvensen i en egnet vertscelle.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Hybridmolekyler dannet mellom TGF-alfa og PE40 karak-teriseres i tre primære analysesystemer. Disse analyser inkluderer: 1 - ADP-ribosylering av elongeringsfaktor 2 som måler den enzymatiske aktiviteten til TGF-alfa-PE40 som hemmer patte-dyrcelleproteinsyntese, 2 - hemming av radiomerket EGF-binding til EGF-reseptoren på membranvesikler fra A431-celler som måler EGF-reseptorbindingsaktiviteten til TGF-alfa-PE40, og 3 - celleproliferasjon som målt ved overføring av 3-[4,5-dimetyl-tiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) til formazan som blir benyttet for å måle overlevelse av tumorceller etter eksponering til TGF-alfa-PE40. Disse analyser blir utført som tidligere beskrevet (Dominic et al., Infection and Immunity 16:832-841, 1977; Cohen et al., J. Biol. Chem. 257:1523-1531, 1982; Riemen et al., Peptides 8:877-885, 1987; Mosmann, J., Immunol. Methods 65:55-63, 1983).
For å lage nye TGF-alfa-PE40-hybridmolekyler med overlegne reseptorbindingskarakteristika, produserte vi først en serie av rekombinant DNA-molekyler som kodet for enten TGF-alf a-PE40 eller spesifikke modifiserte versjoner av TGF-alfa-PE40. Det originale eller parentale TGF-alfa-PE40-gen ble mole-kylært klonet inn i en bakteriell TAC-ekspresjonsplasmidvektor (pTAC TGF57-PE40) ved bruk av distinkte segmenter av klonet DNA, som beskrevet i eksempel 2. pTAC TGF57-PE40-klonen ble benyttet som startmateriale for å konstruere spesifikke modifiserte versjoner av TGF-alfa-PE40-DNA. De spesifikke modifika-sjonene av pTAC TGF57-PE40-DNA består av setespesifikke mutasjoner i den kodende DNA-sekvens som kreves for å erstatte to eller fire av cysteinkodonene innen PE40-domenet til pTAC TGF57-PE40-DNA med kodoner for andre aminosyrer. Alternativt kan setespesifikke mutasjoner bli utført for å deletere to eller fire av cysteinkodonene innen PE40-domenet til pTAC TGF57-PE40. De setespesifikke mutasjonene i pTAC TGF57-PE40-DNA ble konstruert ved bruk av metodene til Winter et al., Nature 299:756-758, 1982. Spesifikke eksempler på det muterte pTAC TGF57-PE40-DNA er vist i eksempel 3. Aminosyresekvensen til hybridproteinet kodet for av pTAC TGF57-PE40-DNA er presentert i tabell 3. De fire cysteinrester i PE40-domenet til det parentale TGF-alfa-PE40-h<y>bridproteinet blir betegnet rester Cys<265>, Cys28<7>, Cys<372>, og Cys<379> (tabell 3). Aminosyrerestene er nummerert som definert i Gray et al., PNAS, USA 81:2645-2649
(1984). De modifiserte TGF-alfa-PE40-hybridproteinene dannet fra det spesifikt muterte pTAC TGF57-PE40-DNA, inneholder substitusjoner eller deles joner på restene [Cys265 og Cys<287>] eller [Cys37<2> og Cys<37>9], eller [Cys265, Cys287, Cys372, og Cys379]. For å forenkle nomenklaturen for å beskrive de modifiserte hybridproteiner produsert fra disse muterte pTAC TGF57-PE40-DNA, har vi betegnet aminosyrerestene i posisjonene 265 og 287 som "A"-sted og restene i posisjonene 372 og 379 som "B"-sted. Når cysteinene er til stede i aminosyrerestene 265 og 287 som i parentalt TGF-alfa-PE40-hybridmolekyl, blir stedet betegnet med stor bokstav (dvs. "A"). Når cysteinene blir byttet ut med andre aminosyrer, som f.eks. alanin, fenylalanin, valin, leucin eller isoleucin, eller deletert fra restene 265 og 287 blir stedet representert med en liten "a". Hvis aminosyre-resten i posisjonene 372 og 379 er cysteiner, angis stedet på samme måte ved hjelp av en stor "B", mens en liten "b" angir dette stedet når aminosyrerestene i posisjonene 372 og 379 er byttet ut med andre aminosyrer eller deletert. Således når alle fire cysteinrestene i PE40-domenet av TGF-alfa-PE40 er byttet ut med alaniner, er det modifiserte hybridprotein betegnet TGF-alfa-PE40 ab. På en lignende måte kan det parentale TGF-alfa-PE40-hybridprotein med cysteiner i aminosyrerestposi-sjonene 265, 287, 372 og 379 bli betegnet TGF-alfa-PE40 AB.
Både TGF-alfa-PE40 AB-hybridproteinet og de modifiserte TGF-alfa-PE40-hybridproteinene blir produsert i E. coli ved bruk av TAC-ekspresjonsvektorsystemet beskrevet av Linemeyer et al., Bio-Technology 5:960-965, 1987. De rekombinante hybridproteinene produsert i disse bakteriene, blir høstet og renset ved å lysere bakteriene i guanidin-hydroklorid, etterfulgt av tilsetning av natriumsulfitt og natriumtetrationat. Reaksjonsblandingen blir deretter dialysert, og urea blir tilsatt for å solubilisere proteinene som har presipitert ut av løsningen. Blandingen blir så sentrifugert for å fjerne uløse-lige proteiner, og de rekombinante hybrid-TGF-alfa-PE40-proteiner blir separert ved bruk av ionebytterkromatografi etterfulgt av størrelseseksklusjonskromatografi, fulgt igjen av ionebytterkromatograf i. De rensede TGF-alf a-PE40-hybridproteinene blir deretter eksponert mot reduserende midler slik som beta-merkaptoetanol for å muliggjøre dannelse av disulfid-bindinger inne i hybridproteinet mellom par av cysteinrester. Endelig blir de igjen foldede hybridproteiner gjenstand for størrelseseksklusjon og ionebytterkromatografi for å isolere høyrenset TGF-alfa-PE40-protein. De nøyaktige detaljene i dette renseskjerna er beskrevet i eksempel 2. Når det er renset og igjen foldet kan den biologiske aktiviteten til disse hybridproteinene bli karakterisert ved bruk av ADP-ribosylering, EGF-reseptorbinding og celleproliferasjonsmetoder som beskrevet ovenfor.
Et viktig bruksområde for TGF-alfa-PE40 ligger i dets evne til å binde og drepe celler som har EGF-reseptorer. Mange humane tumorceller besitter EGF-reseptorer og er derfor føl-somme overfor celledrapseffektene til TGF-alfa-PE40. Andre ikke-cancerøse humane celler inkludert keratinocytter besitter EGF-reseptorer og er også følsomme overfor celledrapsaktivi-teten til TGF-alfa-PE40. En rekke humane sykdommer er karakterisert ved øket proliferasjon av keratinocytter inkludert psoriasis og vorter. Utbytting med andre " målsøkende midler" som binder til den epidermale vekstfaktorreseptor, for TGF- alfa- domenet i TGF-alf a- PE49 ab
Brukbarheten til TGF-alfa-PE40 ligger i dets evne til å binde og drepe celler som besitter epidermal vekstfaktorreseptor. Andre "målsøkende midler" kan bli benyttet for å lage hybridmolekyler med det modifiserte PE40 som vil binde til EGF-reseptorer. For eksempel kan genene for epidermal vekstfaktor eller urogastron, eller Shope-fibrom-virusvekstfaktoren, eller vaccinia-virusvekstfaktoren bli bundet til genet for PE40 og benyttet til å dirigere syntesen av epidermal vekstfaktor-PE40, eller urogastron-PE40, eller Shope-fibrom-virusvekstfaktor-PE40, eller vaccinia-virusvekstfaktor-PE40 hybridfusjonsproteiner. I hvert tilfelle vil imidlertid én eller flere av de modifikasjoner av PE40 beskrevet heri, for-bedre bindingen av de andre hybridfusjonsproteinene til celler som besitter epidermale vekstfaktorreseptorer.
Utbytting med andre " målsøkende midler" som binder til andre reseptorer på pattedyrceller, for TGF- alfa- domenet i TGF- alfa-PE,.
Man kan også tenke seg modifikasjon av PE40-domenet i hybridfusjonsproteinene mellom PE40 og andre "målsøkende midler" som gjenkjenner spesifikke reseptorer på pattedyrceller. For eksempel har fusjonsproteiner dannet mellom proteiner og modifisert PE40, og med den generelle formel: protein X-PE40, der protein X er interleukin-2, eller interleukin-3, eller interleukin-4, eller interleukin-6, eller blodplatederivert vekstfaktor, eller ethvert annet protein som gjenkjenner og binder til en spesifikk pattedyrcellereseptor, forbedrede bindingsegenskaper til deres respektive cellulære reseptorer.
De følgende eksemplene illustrerer den foreliggende oppfinnelse nærmere. Alle de enzymatiske reaksjoner som er krevet for molekylære biologimanipulasjoner, med mindre spesi-fisert på annen måte, ble utført som beskrevet i Maniatis et al. (1982) i: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press.
Eksempel 1
Fremstilling og isolering av rekombinant TGF- alfa- PE10- fus jons-proteiner
Fremstilling av fusjonsprotein
Transformerte E. coli JM-109-celler ble dyrket ill risteflasker i 500 ml LB-medium i nærvær av 100 ug/ml ampi-cillin ved 37 °C. Etter at A600-spektrofotometerabsorpsjons-verdien nådde 0,6, ble isopropyl-B-D-tio-galaktopyranosid tilsatt til en endelig konsentrasjon av 1 mM. Etter 2 timer ble cellene høstet ved sentrifugering.
S- sulfonering av fusjonsprotein
Cellene ble lysert i 8 M guanidin-hydroklorid, 50 mM tris pH 8,0, 1 mM EDTA ved å røre i romtemperatur i 2 timer. Lysisblandingen ble justert til 0,4 M natriumsulfitt og 0,1 M natriumtetrationat ved å sette til faste reagenser og pH justert til 9,0 med 1 M NaOH. Reaksjonen fikk forløpe ved romtemperatur i 16 timer.
Forberedelse til kromatografi
Proteinløsningen ble dialysert mot et 10.000 ganger, overskuddsvolum av 1 mM EDTA ved 4 °C. Blandingen ble så justert til 6 M urea, 50 mM tris, pH 8,0, og 50 mM NaCl ved romtemperatur og omrørt i 2 timer. Alt ikke-oppløst materiale ble fjernet ved sentrifugering ved 32.000 x g i 30 minutter.
DEAE F. F. " Sepharose"- kromatografi
Den klare supernatanten fra det tidligere trinn ble applisert på en 26 x 40 cm DEAE "Fast Flow"-kolonne ekvilibrert med 6 M urea, 50 mM tris, pH 8,0, og 50 mM NaCl med en strømmehastighet på 1 ml/minutt. Kolonnen ble vasket med ekvilibreringsbufferen til alt ikke-adsorbert materiale var fjernet som målt med en UV 280-spektrofotometrisk absorbans under 0,1 i ekvilibreringsbufferen fra kolonnen. Det adsor-berte fusjonsprotein ble eluert fra kolonnen med en 1000 ml 50-350 mM NaCl-gradient og så konsentrert i en omrørt celle-Amicon-konsentrator utstyrt med en YM-30-membran.
" Sephacrvl S- 300"
Det konsentrerte fusjonsprotein (8 ml) ble applisert til en 2,6 x 100 cm "Sephacryl S-300"-kolonne ekvilibrert med 6 M urea, 50 mM tris, pH 8,0, og 50 mM NaCl med en strømme-hastighet på 0,25 ml/minutt. Kolonnen ble eluert med ytter-ligere ekvilibreringsbuffer og 3 ml fraksjoner samlet. Fraksjonene som inneholdt TGF-alfa-PE40-aktivitet ble samlet.
" Q- Sepharose"- kromatografi
De samlede fraksjoner fra S-300-kolonnen ble applisert på en 1,6 x 40 cm "Q-Sepharose"-kolonne ekvilibrert med 6 M urea, 50 mM tris, pH 8,0, og 50 mM NaCl med en strømme-hastighet på 0,7 ml/minutt. Kolonnen ble vasket med ekvili-breringsbuf feren og så eluert med 600 ml 50-450 mM NaCl-gradient. Fraksjonene som inneholdt TGF-alf a-PE40-aktivi teten ble samlet og så dialysert mot 50 mM glysin, pH 9,0, og lagret ved -20 °C.
Tilbakefolding
En prøve på proteinet ble tint og fortynnet til en
spektrofotometrisk adsorbans med UV A280 = 0,1 i 50 mM glysin, pH 10,5. Beta-merkaptoetanol ble tilsatt for å gi en 4:1 molar ratio over det teoretiske antall S-sulfonatgrupper til stede i proteinprøven. Reaksjonen fikk forløpe i 16 timer ved 4 °C,
deretter ble løsningen dialysert mot et 10.000 ganger over-skudd av fysiologisk bufret saltvann og lagret ved -20 °C.
Eksempel 2
Konstruksjon av rekombinant DNA- kloner som inneholder TGF-alf a- PE4,,- DNA
TGF-alfa-DNA-segmentet ble konstruert ved bruk av tre typer syntetiske oligonukleotider som beskrevet av Defeo-Jones et al., Molecular and Cellular Biology 8:2999-3007, 1988. Dette syntetiske TGF-alfa-gen ble klonet i pUC-19. DNA fra pUC-19-klonen, som inneholdt rekombinant human-TGF-alfa, ble fordøyd med SphI og EcoRI. Kløyvingen gav et 2,8 kb DNA-fragment som inneholdt alt pUC-19 og 5'-delen av TGF-alfa. Dette 2,8 kb fragment ble renset og isolert ved gelelektroforese. En EcoRI til SphI oligonukleotidkassett ble syntetisert. Denne syntetiske kassett hadde sekvensen indikert under:
For letthets skyld ble denne oligonukleotidkassett betegnet 57. Kassett 57 ble annelert og ligert til det TGF-alf a- inneholdende 2,8 kb fragment og gav et sirkelformet plasmid. Kloner som inneholdt kassetten ble identifisert ved hybridisering til radiomerket kassett 57-DNA. Nærværet av human-TGF-alfa ble bekreftet ved DNA-sekvensering. Sekvensering bekreftet også nærværet av et nylig introdusert Fspl-sete ved 3'-enden av TGF-alfa-sekvensen. Dette plasmid, betegnet TGF-alfa-57/pUC-19, ble fordøyd med HinDIII og Fspl som gav et 168 bp fragment som inneholdt TGF-alfa-genet (TGF-alfa-57). En separat preparering av pUC-19 ble fordøyd med HinDIII og EcoRI som gav et 2,68 kb pUC-19-vektor-DNA. PE40-DNA ble isolert fra plasmid pVC 8 (Chaudhary et al., PNAS, USA 84:4538-4542, 1987). pVC 8 ble fordøyd ved bruk av Ndel. Like lange ender ble så dannet på dette DNA ved bruk av standard-betingelsene til Klenow-reaksjonen (Maniatis et al., supra,
p. 113). Det likeendede DNA ble så underkastet en annen for-døyelse med EcoRI for å gi et 1,3 kb EcoRI til Ndel (likeendet) fragment som inneholdt PE40. TGF-alfa-57 HinDIII til Fspl-fragmentet (168 bp) ble ligert til 2,68 kb pUC-19-vektoren. Etter inkubasjon over natten ble 1,3 kb EcoRI til Ndel (likeendet) PE40-DNA-fragmentet tilsatt ligerings-blandingen. Den annen ligering fikk forløpe over natten. Ligeringsreaksjonsproduktet ble så benyttet for å transformere JM 109-cellene. Klonene som inneholdt TGF-alfa-57-PE40 i pUC-19 ble identifisert ved hybridisering til radiomerket TGF-alfa-57-PE40-DNA, og DNA fra denne klon ble isolert. TGF-alfa-57-PE40 ble fjernet fra pUC-19-vektoren og overført til et TAC-vektor-system, beskrevet av Linemeyer et al., Bio-Technology 5_:960-965, 1987. TGF-alfa-57-PE40 i pUC-19 ble fordøyd med HinDIII og EcoRI, hvorved det ble generert et 1,5 kb fragment som inneholdt TGF-alfa-57-PE40. Like ender ble dannet på dette DNA-fragment ved bruk av standard Klenow-reaksjonsbetingelser
(Maniatis et al., loe. eit.). TAC-vektoren ble fordøyd, med HinDIII og EcoRI. Like ender ble dannet på det fordøyde TAC-vektor-DNA ved bruk av standard Klenow reaksjonsbetingelser
(Maniatis et al., loe. elt.). Den 2,7 kb likeendede vektor ble isolert ved bruk av gelelektroforese. Det likeendede TGF-alfa-57-PE40-fragment ble så ligert til den likeendede TAC-vektoren. Plasmidet dannet ved denne ligering ble brukt for å transformere JM 109-celler. Kandidatkloner som inneholdt TGF-alfa-57-PE40 ble identifisert ved hybridisering som indikert ovenfor og sekvensert. Klonen som inneholdt den ønskede konstruksjon ble betegnet pTAC TGF57-PE40. Plasmidet dannet ved disse mani-puleringer er avbildet i tabell 1. Nukleotidsekvensen til aminosyrekodonene til TGF-alfa-PE40-fusjonsproteinet kodet for i pTAC TGF57-PE40-DNA, er vist i tabell 2. Aminosyresekvensen kodet for i TGF57-PE40-genet er vist i tabell 3.
Eksempel 3
Konstruksjon av modifiserte versioner av rekombinant TGF- alfa-PE 40- inneholdende DNA- kloner: Utbytting av cysteiner med alaniner
TGF-alfa-PE40 aB:
Klonen pTAC TGF57-PE40 ble fordøyd med SphI og BamHI, og det 750 bp SphI-BamHI-fragment (omfattende de C-terminale 5 aminosyrer av TGF-alfa og de N-terminale 243 aminosyrer av PE40) ble isolert. M13 mpl9-vektor-DNA ble kuttet med SpHI, og BamHI og vektor-DNA ble isolert. Det 750 bp Sphl-BamHi TGF-alf a-PE40-fragmentet ble ligert inn i Ml3-vektor-DNA over natten ved 15 °C. Bakterielle vertsceller ble transformert med denne ligeringsblanding, kandidatkloner ble isolert og deres plasmid-DNA sekvensert for å bringe på det rene at disse kloner inneholdt de riktige rekombinante DNA. Enkelttrådet DNA ble laget for mutagenese.
Et oligonukleotid (oligo nr. 132) ble syntetisert og benyttet for setedirigert mutagenese for å introdusere et Hpal-sete i TGF-alfa-PE40-DNA ved aminosyreposisjon 272 i PE40:
En konsekvens av denne setedirigerte mutagenese var omdannelse av restnummer 272 i PE40 fra fenylalanin til leucin. Mutagenesen ble utført som beskrevet av Winter et al., Nature 299:756-758, 1982.
En kandidatklon som inneholdt det nydannede Hpal-sete, ble isolert og sekvensert for å verifisere nærværet av den muterte gensekvensen. Denne klon ble så kuttet med SphI og Sali. Et 210 bp fragment som omfattet de C-terminale 5 aminosyrer av TGF-alfa og de N-terminale 70 aminosyrer av PE40, og som inneholdt det nylig introduserte Hpal-sete, ble isolert og subklonet tilbake inn i foreldre-pTAC-TGF57-PE40-plasmidet i SphI-SalI-setene. Bakterielle vertsceller ble transformert, en kandidatklon isolert og dens plasmid-DNA sekvensert for å forsikre seg om at den klonen inneholdt det riktige rekombinante DNA. For letthets skyld ble den klonen betegnet pTAC-TGF57-PE40-132. pTAC-TGF57-PE40-132 ble fordøyd med SpHI og Hpal og et 3,96 kb DNA-fragment isolert. En syntetisk oligonukleotidkassett (oligo nr. 153), omfattende de C-terminale 5 aminosyrer av TGF-alfa og de N-terminale 32 aminosyrer av PE40 og inneholdende SphI- og Hpal-kompatible ender, ble syntetisert og ligert til det fordøyde pTAC-TGF57-PE40-132:
Denne oligonukleotidkassett introduserte en forand-ring i TGF-alfa-PE40-DNA, slik at kodonet som spesifiserte cystein ved rest 265 nå spesifiserte alanin. For letthets skyld ble dette plasmid-DNA kalt pTAC-TGF57-PE40-132,153. Bakterielle vertsceller ble transformert med pTAC-TGF57-PE40-132,153-DNA. Kandidatkloner ble identifisert ved hybridisering, isolert og deres plasmid-DNA sekvensert for å forsikre seg om at det inneholdt det riktige rekombinante DNA.
pTAC-TGF57-PE40-132,153-DNA ble fordøyd med Hpal og Sali, og et 3,95 kb vektor-DNA ble isolert. En syntetisk oligonukleotidkassett (oligo nr. 142), omfattende aminosyre-
restene 272 til 309 av PE40 og som inneholdt Hpal- og Sall-kompatible ender, ble syntetisert og ligert til det 3,95 kb pTAC-TGF/PE40-132,153-DNA.
Denne oligonukleotidkassett forandrer kodonet som spesifiserer cystein ved rest 287, slik at dette kodon nå spesifiserer alanin. For letthets skyld ble dette muterte plasmid-DNA kalt pTAC-TGF57-PE40-132,153,142. Bakterielle vertsceller ble transformert med dette plasmid, og kandidatkloner ble identifisert ved hybridisering. Disse klonene ble isolert og deres plasmid-DNA sekvensert for å forsikre seg om at det inneholdt det rette rekombinante DNA. pTAC-TGF57-PE40-132,153,142-plasmid koder for TGF-alfa-PE40-varianten med begge cysteiner i sted "A" erstattet av alaniner. Ved å følge nomenklaturen beskrevet tidligere, blir derfor denne modifiserte versjon av TGF-alfa-PE40 kalt TGF-alfa-PE40 aB. Aminosyresekvensen kodet for av PE40 aB-gen er vist i tabell 4.
TGF-alfa-PE40 Ab:
Klonen pTAC TGF57-PE40 ble fordøyd med SphI og BamHI, og det 750 bp SphI-BamHI-fragment (som spesifiserer de C-terminale 5 aminosyrer av TGF-alfa og de N-terminale
252 aminosyrer av PE40) ble isolert. M13 mpl9-vektor-DNA ble
i kuttet med SpHI og BamHI, og vektor-DNA ble isolert. Det
750 bp Sphl-BamHi TGF-alfa-PE40-fragmentet ble ligert inn i M13-vektor-DNA over natten ved 15 °C. Bakterielle vertsceller ble transformert med denne ligeringsblanding, kandidatkloner
ble isolert og deres plasmid-DNA sekvensert for å forsikre seg
> om at disse kloner inneholdt de riktige rekombinante DNA.
Enkelttrådet DNA ble laget for mutagenese.
Et oligonukleotid (oligo nr. 133) ble syntetisert og benyttet i setedirigert mutagenese for å introdusere et Bstell-sete i TGF-alfa-PE40-DNA ved aminosyreposisjon 369 av
PE 40:
En konsekvens av denne mutagenese var omdannelsen av serinresten ved posisjon 369 av PE40 til en threonin.
En DNA-klon som inneholdt det nydannede Bstell-sete ble identifisert, isolert og sekvensert for å forsikre seg om nærværet av det riktige rekombinante DNA. Denne klon ble deretter fordøyd med Apal- og Sall-restriksjonsenzymer. Et 120 bp innsatt DNA-fragment som inneholdt det nydannede Bstell-sete ble isolert og ligert inn i pTAC-TGF57-PE40, som også var blitt fordøyd med Apal og Sali. Bakterielle vertsceller ble transformert og en kandidatklon isolert og sekvensert for å forsikre seg om at det riktige rekombinante DNA var til stede. Dette nydannede plasmid-DNA ble kalt pTAC-TGF57-PE40-133. Det ble fordøyd med Bstell og Apal, og et 2,65 kb vektor-DNA-fragment ble isolert.
En Bstell til Apal-oligonukleotidkassett (oligo
nr. 155) ble syntetisert som omfattet regionen av TGF-alfa-PE40 deletert fra pTAC-TGF57-PE40-133-klon fordøyd med Bstell- og Apal-restriksjonsenzymer. Denne kassett spesifiserte også nukleotidsekvensen for Bstell- og Apal-kompatible ender.
Denne oligonukleotidkassett forandret kodonet for cysteinene i restene 372 og 379 i PE40 til kodonene som spesifiserer alaniner. Oligonukleotidkassett nr. 155 ble ligert til det 2,65 kb vektor-DNA-fragmentet. Bakterielle vertsceller ble transformert, og kandidatklonen ble isolert og sekvensert for å forsikre seg om at det riktige rekombinante DNA var til stede. Den nydannede DNA-klon ble kalt pTAC-TGF57-PE40-133,155. Den koder for TGF-alfa-PE40-varianten med begge cysteiner i sted "B" erstattet av alaniner. Ved å følge den tidligere be-skrevne nomenklatur, blir derfor denne modifiserte versjon av TGF-alfa-PE40 kalt TGF-alfa-PE40 Ab. Aminosyresekvensen kodet for av TGF-alfa-PE40 Ab-genet, er vist i tabell 5.
TGF-alfa-PE40 ab:
pTAC-TGF57-PE40-132,153,142-plasmid som koder for TGF-alfa-PE40 aB ble fordøyd med Sali og Apal, og det resulterende 3,8 kb vektor-DNA-fragmentet ble isolert. pTAC-TGF57-PE40-133,155-plasmidet som koder for TGF-alfa-PE40 aB ble også fordøyd med Sali og Apal, og det resulterende 140 bp DNA-fragmentet, som inneholdt cystein- til alaninforandringene ved aminosyrerester 372 og 379 i PE40, ble isolert. Disse to DNA ble ligert sammen og brukt til å transformere bakterielle vertsceller. Kandidatklonen ble verifisert ved hybridisering med en radiomerket 140 bp DNA fra pTAC-TGF57-PE40-133,155. Plasmid-DNA fra kandidatklonene ble isolert og sekvensert for å forsikre seg om nærværet av det riktige rekombinante DNA. Den nydannede DNA-klon ble kalt pTAC-TGF57-PE40-132,153,142,133,155. Dette plasmid koder for TGF-alfa-PE40-varianten med alle fire cysteinene i stedene "A" og "B" erstattet med alaniner. Ved å følge den nomenklatur som er beskrevet tidligere, blir derfor denne modifiserte versjon av TGF-alfa-PE40 kalt TGF-alfa-PE40 ab. Aminosyresekvensen kodet for av TGF-alfa-PE40 ab-genet, er vist i tabell 6.
Eksempel 4
Konstruksjon av modifiserte versioner av rekombinant TGF- alfa-PEi 0 som inneholder DNA- kloner: Seleksjon av cvsteinrester
TGF-alfa-PE40 aB, TGF-alfa-PE40 Ab og TGF-alfa-PE40 ab kan også bli konstruert ved å fjerne cysteinrestene i sted "A" og/eller sted "B". Konstruksjon av disse versjoner av TGF-alf a-PE40 blir utført på samme måte som beskrevet i eksempel 3 bortsett fra at: for TGF-alfa-PE40 aB forandres oligonukleotidkassett 153, slik at alaninkodon ment for posisjon 265 blir deletert, og oligonukleotidkassett 142 forandres, slik at alaninkodon ment for posisjon 287 blir deletert. For TGF-alfa-PE40 Ab forandres oligonukleotidkassett 155, slik at alanin-kodonene ment for restene 372 og 379 blir fjernet. For TGF-alf a-PE40 ab blir DNA-fragmentene benyttet for å konstruere dette rekombinante gen, tatt fra TGF-alfa-PE40 aB- og TGF-alfa-PE40 Ab-gen beskrevet i dette eksempel.
Eksempel 5
Biologiske aktiviteter til TGF- alf a - PEi0 AB-, TGF- alfa- PE^ Ab-, TGF- alfa- PE10 aB-, og TGF- alfa- PE1? ab- proteiner
Hybridfusjonsproteinene TGF-alfa-PE40 AB, TGF-alfa-PE40 Ab, TGF-alfa-PE40 aB, TGF-alfa-PE40 ab ble uttrykt i bakterielle verter og isolert som beskrevet i eksempel 1. Hvert protein ble så karakterisert for dets evne til å hemme bindingen av radiomerket epidermal vekstfaktor til den epidermale vekstfaktoren på A431-cellemembranvesikler, og for dets evne til å drepe A431-celler som målt i MTT-celleproli-ferasjonsanalyser beskrevet tidligere. Den følgende tabell oppsummerer de biologiske aktivitetene til disse proteinene:
Eksempel 6
Biologisk aktivitet til TGF- alf a - PEi0 ab mot humane keratino-c<y>tter
Ved bruk av celleproliferasjonsanalysen til Mossmann, J., Immunol. Methods 65:55-63 (1983), drepte TGF-alfa-PE40 ab lett de humane keratinocytter benyttet i metoden. Konsentra-sjonen av TGF-alfa-PE40 som var nødvendig for å drepe 50 % av keratinocyttene (ED50), var 11 nM.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som omfatter et PE40-domene som omfatter sekvensen angitt i tabell 3, modifisert ved alaninerstatning eller delesjon av minst én cysteinrest i 265-, 287-, 372- og 379-stillingene, koblet til et TGF-a-domene som binder til reseptoren gjenkjent av en vekstfaktor, et hormon eller et antistoff som et mål-søkende middel, karakterisert ved å dyrke en transformert vertscelle som inneholder et plasmid inneholdende en DNA-sekvens som koder for det angitte hybridprotein, operativt bundet til transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som dirigerer ekspresjon av hybridproteinet, samt en seleksjonsmarkør, hvoretter proteinet isoleres og renses.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at DNA-sekvensen som benyttes, koder for et hybridprotein der minst én cysteinrest er erstattet av alanin.
3. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-2, karakterisert ved at DNA-sekvensen som benyttes, koder for et hybridprotein der minst to cysteinrester er erstattet av alanin.
4. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-3, karakterisert ved at DNA-sekvensen som benyttes, koder for et hybridprotein der fire cysteinrester er erstattet av alanin.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at DNA-sekvensen som benyttes, koder for et hybridprotein der minst to cysteinrester er fjernet.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at DNA-sekvensen som benyttes, koder for et hybridprotein der fire cysteinrester er fjernet.
7. Plasmid for anvendelse ved ekspresjon av hybridproteinet fremstilt ifølge krav 1 som omfatter et PE40-domene som omfatter sekvensen angitt i tabell 3, modifisert ved alaninerstatning eller delesjon av minst én cysteinrest i 265-, 287-, 372- og 379-stillingene, koblet til et TGF-a-domene som binder til reseptoren gjenkjent av en vekstfaktor, et hormon eller et antistoff som et målsøkende middel, karakterisert ved at det inneholder en DNA-sekvens som koder for det angitte hybridprotein, operativt bundet til transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som dirigerer ekspresjonen av DNA-sekvensen i en egnet vertscelle.
NO900758A 1989-02-17 1990-02-16 Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som omfatter et PE40-domene, samt plasmid for anvendelse ved ekspresjon av hybridproteinet NO300595B1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31254089A 1989-02-17 1989-02-17
US38909289A 1989-08-03 1989-08-03
US44918789A 1989-12-21 1989-12-21

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO900758D0 NO900758D0 (no) 1990-02-16
NO900758L NO900758L (no) 1990-08-20
NO300595B1 true NO300595B1 (no) 1997-06-23

Family

ID=27405603

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO900758A NO300595B1 (no) 1989-02-17 1990-02-16 Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som omfatter et PE40-domene, samt plasmid for anvendelse ved ekspresjon av hybridproteinet

Country Status (18)

Country Link
EP (1) EP0383599B1 (no)
JP (2) JPH07106159B2 (no)
KR (1) KR0169729B1 (no)
AT (1) ATE133993T1 (no)
AU (1) AU617039B2 (no)
CA (1) CA2010256C (no)
CY (1) CY1987A (no)
DE (1) DE69025211T2 (no)
DK (1) DK0383599T3 (no)
ES (1) ES2085329T3 (no)
FI (1) FI102383B1 (no)
GR (1) GR3019836T3 (no)
HK (1) HK15597A (no)
IE (1) IE71934B1 (no)
IL (1) IL93425A (no)
NO (1) NO300595B1 (no)
NZ (1) NZ232564A (no)
PT (1) PT93178B (no)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU631200B2 (en) * 1989-02-17 1992-11-19 Merck & Co., Inc. Production of modified pe40
JPH0829101B2 (ja) * 1989-04-21 1996-03-27 アメリカ合衆国 組換え抗体―毒素融合タンパク質
IL98528A0 (en) * 1990-06-21 1992-07-15 Merck & Co Inc Pharmaceutical compositions containing hybrid for killing bladder cancer cells
GB2246779B (en) * 1990-08-03 1994-08-17 Delta Biotechnology Ltd Tumour-associated protease inhibitors targeted to tumour cells
AUPM959894A0 (en) * 1994-11-22 1994-12-15 Crc For Biopharmaceutical Research Pty Ltd Fusion proteins with cytotoxic activity against cells overexpressing erbb2-4
WO1998029453A1 (fr) * 1996-12-27 1998-07-09 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Medicaments diriges vers la membrane cellulaire
AU7553698A (en) * 1997-05-12 1998-12-08 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast- Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Method and construct for inhibition of cell migration
GB0008802D0 (en) * 2000-04-10 2000-05-31 Univ London Molecule
CA2571781C (en) * 2004-06-28 2015-05-12 Yeda Research And Development Co. Ltd Chimeric proteins and uses thereof
CN105766069B (zh) 2013-11-20 2019-04-16 株式会社村田制作所 多层布线基板及具备该多层布线基板的探针卡
WO2017061449A1 (ja) * 2015-10-05 2017-04-13 国立研究開発法人産業技術総合研究所 がん細胞の検出方法、がん細胞内に物質を導入するための試薬、及びがん治療用組成物

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL90047A (en) * 1982-10-19 1992-12-01 Cetus Oncology Corp Cysteine-depleted biologically active muteins other than interferon - '
IE56026B1 (en) * 1982-10-19 1991-03-27 Cetus Corp Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
US4545985A (en) * 1984-01-26 1985-10-08 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins
US4892827A (en) * 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
JPH0829101B2 (ja) * 1989-04-21 1996-03-27 アメリカ合衆国 組換え抗体―毒素融合タンパク質

Also Published As

Publication number Publication date
EP0383599B1 (en) 1996-02-07
DE69025211T2 (de) 1996-09-19
CY1987A (en) 1997-09-05
IL93425A0 (en) 1990-11-29
GR3019836T3 (en) 1996-08-31
CA2010256A1 (en) 1990-08-17
CA2010256C (en) 2000-07-25
HK15597A (en) 1997-02-14
EP0383599A2 (en) 1990-08-22
NO900758D0 (no) 1990-02-16
PT93178B (pt) 1996-04-30
AU617039B2 (en) 1991-11-14
NO900758L (no) 1990-08-20
PT93178A (pt) 1990-08-31
IE71934B1 (en) 1997-03-12
KR900012626A (ko) 1990-09-01
FI102383B (fi) 1998-11-30
EP0383599A3 (en) 1991-03-27
ES2085329T3 (es) 1996-06-01
AU4994690A (en) 1990-08-23
KR0169729B1 (ko) 1999-01-15
ATE133993T1 (de) 1996-02-15
JPH07106159B2 (ja) 1995-11-15
NZ232564A (en) 1992-08-26
JPH07278200A (ja) 1995-10-24
JP2510846B2 (ja) 1996-06-26
DE69025211D1 (de) 1996-03-21
DK0383599T3 (da) 1996-08-05
IL93425A (en) 1999-08-17
FI900783A0 (fi) 1990-02-16
IE900587L (en) 1990-08-17
FI102383B1 (fi) 1998-11-30
JPH02276590A (ja) 1990-11-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0467536B1 (en) Method of treating bladder cancer cells
Edwards et al. Epidermal growth factor receptor binding is affected by structural determinants in the toxin domain of transforming growth factor-alpha-Pseudomonas exotoxin fusion proteins
NO300595B1 (no) Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som omfatter et PE40-domene, samt plasmid for anvendelse ved ekspresjon av hybridproteinet
AU632995B2 (en) Cell specific cytotoxic agents
US20160222362A1 (en) Target-Specific Double-Mutant Fusion Protein and Preparation Process Therefor
Siegall et al. Cytotoxic activity of chimeric proteins composed of acidic fibroblast growth factor and Pseudomonas exotoxin on a variety of cell types
US5621078A (en) Modified pseudomonas exotoxin PE40
US6207798B1 (en) Modified PE40 toxin fusion proteins
US20220153781A1 (en) Tumor Targeting Polypeptide and Method of Use Thereof
CA2012732C (en) Production of modified pe40
JPH02502287A (ja) 改良されたリシン分子およびリシン毒素コンジュゲート
AU631200B2 (en) Production of modified pe40
FitzGerald et al. Generation of chimeric toxins
NZ238583A (en) Targetted cytotoxic anticancer conjugates and
Riemen et al. Modified pseudomonas exotoxin PE 40
Cizeau et al. Engineering and characterization of anti-PSMA humabody-deBouganin fusion proteins
Cui et al. Construction and expression of novel immunotoxin cpIL-4 (13D)-PE38KDEL with increased activity

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees