JPH0829101B2 - 組換え抗体―毒素融合タンパク質 - Google Patents
組換え抗体―毒素融合タンパク質Info
- Publication number
- JPH0829101B2 JPH0829101B2 JP2507079A JP50707990A JPH0829101B2 JP H0829101 B2 JPH0829101 B2 JP H0829101B2 JP 2507079 A JP2507079 A JP 2507079A JP 50707990 A JP50707990 A JP 50707990A JP H0829101 B2 JPH0829101 B2 JP H0829101B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fusion protein
- tac
- cells
- construct
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 239000003053 toxin Substances 0.000 title abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 48
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 14
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims description 12
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 abstract description 8
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 abstract description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 3
- -1 anti-Tac(Fv)-PE40 Proteins 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 229940051173 recombinant immunotoxin Drugs 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 2
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710122462 65 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 102100033350 ATP-dependent translocase ABCB1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 239000012741 Laemmli sample buffer Substances 0.000 description 1
- 108010047230 Member 1 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000157426 Pernis Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 241000220010 Rhode Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000712908 Tacaribe mammarenavirus Species 0.000 description 1
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- UZEDIBTVIIJELN-UHFFFAOYSA-N chromium(2+) Chemical compound [Cr+2] UZEDIBTVIIJELN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 101150062015 hyg gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 101150074154 pe gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6817—Toxins
- A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
Description
【発明の詳細な説明】 本願は、参考のため本願に組み込まれる1986年9月24
日付で出願された係属出願第06/911,227号の一部継続で
ある。新出願(第06/911,227号)明細書は、特異的レセ
プターが細胞上に存在している認識タンパク質をコード
するDNA配列と融合された、修飾シュードモナス(Pseud
omonas)外毒素(PE)遺伝子からの組換えタンパク質の
産生について教示する。PE遺伝子は、PE分子の様々なド
メインの特定セグメント又は配列を変えるために修正さ
れた。これは新出願においてIL-2-PE融合遺伝子の組立
て及び発現で例示された。本出願はPEを利用した改良毒
素の産生、更に詳しくは適切な抗原又はレセプターを有
した細胞を有効かつ選択的に死滅させることができる組
換え抗体‐毒素融合タンパク質の合成に関する。ここで
記載された研究の米国政府により一部援助された。
日付で出願された係属出願第06/911,227号の一部継続で
ある。新出願(第06/911,227号)明細書は、特異的レセ
プターが細胞上に存在している認識タンパク質をコード
するDNA配列と融合された、修飾シュードモナス(Pseud
omonas)外毒素(PE)遺伝子からの組換えタンパク質の
産生について教示する。PE遺伝子は、PE分子の様々なド
メインの特定セグメント又は配列を変えるために修正さ
れた。これは新出願においてIL-2-PE融合遺伝子の組立
て及び発現で例示された。本出願はPEを利用した改良毒
素の産生、更に詳しくは適切な抗原又はレセプターを有
した細胞を有効かつ選択的に死滅させることができる組
換え抗体‐毒素融合タンパク質の合成に関する。ここで
記載された研究の米国政府により一部援助された。
図面の簡単な説明 本発明の様々な目的、特徴及び多数の付随的利点は添
付された図面に関連させて以下の詳細な記載を読むこと
でより良く理解されるであろう: 第1図(a)は発現プラスミドpVC70108の概略的な構
築を示す。プラスミドpVC70108は、単一ポリペプチド鎖
として、抗Tacの様々なドメイン:H鎖のVH可変ドメイン
(成熟H鎖の最初の116アミノ酸)、15アミノ酸リンカ
ー[(gly-gly-gly-gly-Ser)3]、L鎖のVL可変ドメイン
(成熟L鎖の最初の106アミノ酸)と転位及びADPリボシ
ル化活性を有するPEのアミノ酸253-613とをコードする
融合遺伝子を含んでいる。コードされたタンパク質は抗
体‐毒素融合タンパク質、又は更に具体的には抗Tac(F
v)‐PE40と呼ばれる。融合遺伝子はシャイン・ダルガ
ノ領域及び開始コドン(PT7)に結合されたT7プロモー
ターのコントロール下にある。pVC70108を有する大腸菌
株BL21(λDE3)はIPTG誘導でハイブリッドタンパク質
を発現させるために用いられた。Ampr、β‐ラクタマー
ゼ遺伝子;B,BamHI、A,Aval。PCRに用いられるオリゴヌ
クレオチドは水平矢印として示された。プラスミドpVC7
01において、4つの余分な塩基は斜線枠内に示された。
付された図面に関連させて以下の詳細な記載を読むこと
でより良く理解されるであろう: 第1図(a)は発現プラスミドpVC70108の概略的な構
築を示す。プラスミドpVC70108は、単一ポリペプチド鎖
として、抗Tacの様々なドメイン:H鎖のVH可変ドメイン
(成熟H鎖の最初の116アミノ酸)、15アミノ酸リンカ
ー[(gly-gly-gly-gly-Ser)3]、L鎖のVL可変ドメイン
(成熟L鎖の最初の106アミノ酸)と転位及びADPリボシ
ル化活性を有するPEのアミノ酸253-613とをコードする
融合遺伝子を含んでいる。コードされたタンパク質は抗
体‐毒素融合タンパク質、又は更に具体的には抗Tac(F
v)‐PE40と呼ばれる。融合遺伝子はシャイン・ダルガ
ノ領域及び開始コドン(PT7)に結合されたT7プロモー
ターのコントロール下にある。pVC70108を有する大腸菌
株BL21(λDE3)はIPTG誘導でハイブリッドタンパク質
を発現させるために用いられた。Ampr、β‐ラクタマー
ゼ遺伝子;B,BamHI、A,Aval。PCRに用いられるオリゴヌ
クレオチドは水平矢印として示された。プラスミドpVC7
01において、4つの余分な塩基は斜線枠内に示された。
第1図(b)は、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)に用い
られるオリゴヌクレオチドを示し、VK074、VK075及びVK
076は各々2列で示されている。VK073及びVK075の一部
はH及びL鎖cDNAの非コード鎖に相補的であり、一方VK
074及びVK076の一部はH及びL鎖cDNAのコード鎖に各々
相補的である。VK073及びVK074は抗TacH鎖cDNAを用いて
VHセグメントを増幅するために用いられ、一方VK075及
びVK076は第1図aで示されるように抗TacL鎖cDNAを用
いてVLセグメントを生成するために用いられた。すべて
のオリゴヌクレオチドは5′→3′方向に記載された。
VL又はVHcDNAのコード鎖又は非コード鎖に相補的な配列
は枠内に示されている。VH及びVL間のペプチドリンカー
をコードする配列は破線で下線が引かれている。
られるオリゴヌクレオチドを示し、VK074、VK075及びVK
076は各々2列で示されている。VK073及びVK075の一部
はH及びL鎖cDNAの非コード鎖に相補的であり、一方VK
074及びVK076の一部はH及びL鎖cDNAのコード鎖に各々
相補的である。VK073及びVK074は抗TacH鎖cDNAを用いて
VHセグメントを増幅するために用いられ、一方VK075及
びVK076は第1図aで示されるように抗TacL鎖cDNAを用
いてVLセグメントを生成するために用いられた。すべて
のオリゴヌクレオチドは5′→3′方向に記載された。
VL又はVHcDNAのコード鎖又は非コード鎖に相補的な配列
は枠内に示されている。VH及びVL間のペプチドリンカー
をコードする配列は破線で下線が引かれている。
第2図(a)は、モノQカラムクロマトグラフィーに
よる復元可溶性抗Tac(Fv)‐PE40の精製結果を示す。
復元物質はモノQカラムに適用され、タンパク質がNaCl
勾配(0〜0.5M)で溶出され、4ml分画が集められた。
活性モノマー抗Tac(Fv)‐PE40の位置は垂直矢印で示
されている。
よる復元可溶性抗Tac(Fv)‐PE40の精製結果を示す。
復元物質はモノQカラムに適用され、タンパク質がNaCl
勾配(0〜0.5M)で溶出され、4ml分画が集められた。
活性モノマー抗Tac(Fv)‐PE40の位置は垂直矢印で示
されている。
第2図(b)は様々な精製段階におけるサンプルのSD
S-PAGEの結果を示す。ゲルはクマシーブルーで染色され
た。1列目,全細胞ペレット;2列目,スフェロプラス
ト;3列目,超音波処理スフェロプラストの100,000×g
ペレット;4列目,モノQカラムによる分画(32〜33)の
プール;5列目,TSK-250カラムによるピーク分画のプー
ル;6列目,天然PE,Mr66kDa。分子量マーカーはkDaとし
てMrに関し付記されている。
S-PAGEの結果を示す。ゲルはクマシーブルーで染色され
た。1列目,全細胞ペレット;2列目,スフェロプラス
ト;3列目,超音波処理スフェロプラストの100,000×g
ペレット;4列目,モノQカラムによる分画(32〜33)の
プール;5列目,TSK-250カラムによるピーク分画のプー
ル;6列目,天然PE,Mr66kDa。分子量マーカーはkDaとし
てMrに関し付記されている。
第3図は、IL2レセプターを発現するHUT-102細胞での
抗Tac(Fv)‐PE40の細胞毒性の検討結果を示す。HUT-1
02細胞における抗Tac(Fv)‐PE40の細胞毒性は(●)
抗Tac(Fv)‐PE40;(○)抗Tac(Fv)‐PE40+10μg
抗Tac;(△)抗Tac(Fv)‐PE40+10μgOVB3でタンパク
質合成を測定することにより決定された。
抗Tac(Fv)‐PE40の細胞毒性の検討結果を示す。HUT-1
02細胞における抗Tac(Fv)‐PE40の細胞毒性は(●)
抗Tac(Fv)‐PE40;(○)抗Tac(Fv)‐PE40+10μg
抗Tac;(△)抗Tac(Fv)‐PE40+10μgOVB3でタンパク
質合成を測定することにより決定された。
第4図は、抗Tac(Fv)‐PE40の競合結合分析につい
て示す。HUT-102細胞においてTac抗原と結合するI-125
標識トレーサー抗Tac抗体による抗Tac(Fv)‐PE40
(□)及び天然マウス抗Tac抗体(●)の競合データが
示されている。実線は結合競合をモデル化したコンピュ
ーター作成の理想曲線である。Roは競合物質の不存在下
におけるトレーサーの結合/遊離比であり、Ro/2はトレ
ーサー結合に関する50%阻害点であって、それから抗Ta
c(Fv)‐PE40に関して3.5×109M-1の結合アフィニティ
が、天然抗Tacに関する9.7×109M-1と比較して、計算さ
れた。
て示す。HUT-102細胞においてTac抗原と結合するI-125
標識トレーサー抗Tac抗体による抗Tac(Fv)‐PE40
(□)及び天然マウス抗Tac抗体(●)の競合データが
示されている。実線は結合競合をモデル化したコンピュ
ーター作成の理想曲線である。Roは競合物質の不存在下
におけるトレーサーの結合/遊離比であり、Ro/2はトレ
ーサー結合に関する50%阻害点であって、それから抗Ta
c(Fv)‐PE40に関して3.5×109M-1の結合アフィニティ
が、天然抗Tacに関する9.7×109M-1と比較して、計算さ
れた。
発明の詳細な説明 本発明による組換え免疫毒素は抗体‐PE40組換え融合
タンパク質からなる。組換え融合タンパク質は、この融
合タンパク質の合成を指示するDNAセグメントを含んだ
発現ベクター又はプラスミドにより産生される。組成物
は、抗体が結合するレセプター又は抗原を有した細胞の
殺す上で有効な量の抗体‐PE40組換え融合タンパク質及
び薬学上許容されるキャリアを含む。標的細胞毒性を発
揮する方法は、死滅される標的細胞を細胞毒性量の抗体
‐PE40組換え融合タンパク質の組成物と接触させ、上記
標的細胞は上記抗体が結合するレセプター又は抗原を有
した細胞であるが、但しその組成物は上記抗体の結合の
ためのレセプター又は抗原を欠いた細胞に有意の細胞毒
性を与えない(表2)。
タンパク質からなる。組換え融合タンパク質は、この融
合タンパク質の合成を指示するDNAセグメントを含んだ
発現ベクター又はプラスミドにより産生される。組成物
は、抗体が結合するレセプター又は抗原を有した細胞の
殺す上で有効な量の抗体‐PE40組換え融合タンパク質及
び薬学上許容されるキャリアを含む。標的細胞毒性を発
揮する方法は、死滅される標的細胞を細胞毒性量の抗体
‐PE40組換え融合タンパク質の組成物と接触させ、上記
標的細胞は上記抗体が結合するレセプター又は抗原を有
した細胞であるが、但しその組成物は上記抗体の結合の
ためのレセプター又は抗原を欠いた細胞に有意の細胞毒
性を与えない(表2)。
他にことわらないかぎり、ここで用いられるすべての
技術及び科学用語は本発明が属する当業者にとって普通
に理解されるとおりの意味を有する。ここで記載された
ものと同様の又はそれに相当するいかなる方法及び物質
も本発明の実施又は試験で用いることができるが、ここ
では好ましい方法及び物質が記載されている。以下で記
載されたすべての文献が参考のため本明細書に組み込ま
れる。他にことわらないかぎり、ここで用いられる技術
は当業者に周知の標準的方法である。その物質、方法及
び例は説明のみのためであって、限定のためではない。
技術及び科学用語は本発明が属する当業者にとって普通
に理解されるとおりの意味を有する。ここで記載された
ものと同様の又はそれに相当するいかなる方法及び物質
も本発明の実施又は試験で用いることができるが、ここ
では好ましい方法及び物質が記載されている。以下で記
載されたすべての文献が参考のため本明細書に組み込ま
れる。他にことわらないかぎり、ここで用いられる技術
は当業者に周知の標準的方法である。その物質、方法及
び例は説明のみのためであって、限定のためではない。
ここで用いられる用語“抗体”とは抗原と結合できる
免疫グロブリン分子の一部を意味する〔W.E.Paul,ed.,
“Fundamental lmmunology",Raven Press,N.Y.,1984,p
p.131-165参照〕。この定義によれば、用語“抗体”に
は、完全な免疫グロブリン、L及びH鎖可変領域のみを
含むFv断片、可変領域及び一部の不変領域を含むFab又
は(Fab)′2断片、一本鎖抗体〔Bird et at.,1988,Sci
ence,242,424-426;Huston et al.,1988,Proc.Nat.Acad,
Sci.USA,85,5879-5883〕等のような様々な形の修飾又は
変更抗体を含む。抗体は動物(特にマウス又はラット)
もしくはヒト起源であっても、又はキメラ〔Morrison e
t al.,1984,Proc.Nat.Acad,Sci.USA,81,6851-6855〕も
しくはヒト化〔Jones et al.,1986,Nature,321,522-525
及び公開された英国特許出願第8707252号〕であっても
よい。本発明において使用に適した抗体を産生する方法
は当業者に周知であり、Harlow & Lane,Antibodies:A
Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,19
88のような文献で記載されている。抗体鎖をコードする
遺伝子は当業者に公知のいかなるクローニング操作によ
りcDNA又はゲノム形でクローン化してもよい。例えば、
Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Man
ual,Cold Spring Harbor Laboratory,1982参照。ここで
用いられる用語“有意の細胞毒性なしに”とは、本発明
の融合タンパク質がいかなるはっきりとした程度又はい
かなる異常なレベルにも非標的細胞の機能に影響を与え
ないことを意味する。
免疫グロブリン分子の一部を意味する〔W.E.Paul,ed.,
“Fundamental lmmunology",Raven Press,N.Y.,1984,p
p.131-165参照〕。この定義によれば、用語“抗体”に
は、完全な免疫グロブリン、L及びH鎖可変領域のみを
含むFv断片、可変領域及び一部の不変領域を含むFab又
は(Fab)′2断片、一本鎖抗体〔Bird et at.,1988,Sci
ence,242,424-426;Huston et al.,1988,Proc.Nat.Acad,
Sci.USA,85,5879-5883〕等のような様々な形の修飾又は
変更抗体を含む。抗体は動物(特にマウス又はラット)
もしくはヒト起源であっても、又はキメラ〔Morrison e
t al.,1984,Proc.Nat.Acad,Sci.USA,81,6851-6855〕も
しくはヒト化〔Jones et al.,1986,Nature,321,522-525
及び公開された英国特許出願第8707252号〕であっても
よい。本発明において使用に適した抗体を産生する方法
は当業者に周知であり、Harlow & Lane,Antibodies:A
Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,19
88のような文献で記載されている。抗体鎖をコードする
遺伝子は当業者に公知のいかなるクローニング操作によ
りcDNA又はゲノム形でクローン化してもよい。例えば、
Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Man
ual,Cold Spring Harbor Laboratory,1982参照。ここで
用いられる用語“有意の細胞毒性なしに”とは、本発明
の融合タンパク質がいかなるはっきりとした程度又はい
かなる異常なレベルにも非標的細胞の機能に影響を与え
ないことを意味する。
組換え抗体−PE40融合タンパク質は1本又は2本のポ
リペプチド鎖から構成される。一本鎖融合タンパク質の
産生がここで説明されている。二本鎖融合タンパク質を
産生するためには、アミノ酸リンカーはVH及びVL配列間
に挿入されない。代わりに終結コドンがVH配列後に挿入
され、開始コドン及びリボソーム結合配列がVL配列前に
挿入される。本発明のもう1つの態様において、VL及び
VH配列は、H鎖ヒンジドメインと共に又はそれなしに、
一部又は全部のL及びH鎖不変領域、例えば全κL鎖不
変領域及びH鎖不変領域のCH1ドメインによって各々追
随されている。VL、VH及びPE40遺伝子はプラスミドにお
いていかなる順序であってもよく、このためPE40遺伝子
はL又はH鎖遺伝子いずれかの5′又は3′末端のいず
れかに結合される。当業者であれば、更に修飾、欠失、
挿入等が抗体及びPE40遺伝子に行われてもよいことを理
解するであろう。特に、欠失又は変更は、標的細胞に対
する融合タンパク質の細胞毒性を増加させるか又は抗体
に関する抗原のない細胞に対する非特異的細胞毒性を減
少させるために、PE40で又は抗体遺伝子をPE40に結合さ
せるリンカーで行ってもよい。すべてのこのような組立
ては当業者に周知の遺伝子工学方法で行われ(一般的に
Maniatis et al.,同士参照)、様々な臨床的又は生物学
的応用に特に適したものとする異なる性質のアフィニテ
ィ、特異性、安定性及び毒性を有したタンパク質を産生
してもよい。
リペプチド鎖から構成される。一本鎖融合タンパク質の
産生がここで説明されている。二本鎖融合タンパク質を
産生するためには、アミノ酸リンカーはVH及びVL配列間
に挿入されない。代わりに終結コドンがVH配列後に挿入
され、開始コドン及びリボソーム結合配列がVL配列前に
挿入される。本発明のもう1つの態様において、VL及び
VH配列は、H鎖ヒンジドメインと共に又はそれなしに、
一部又は全部のL及びH鎖不変領域、例えば全κL鎖不
変領域及びH鎖不変領域のCH1ドメインによって各々追
随されている。VL、VH及びPE40遺伝子はプラスミドにお
いていかなる順序であってもよく、このためPE40遺伝子
はL又はH鎖遺伝子いずれかの5′又は3′末端のいず
れかに結合される。当業者であれば、更に修飾、欠失、
挿入等が抗体及びPE40遺伝子に行われてもよいことを理
解するであろう。特に、欠失又は変更は、標的細胞に対
する融合タンパク質の細胞毒性を増加させるか又は抗体
に関する抗原のない細胞に対する非特異的細胞毒性を減
少させるために、PE40で又は抗体遺伝子をPE40に結合さ
せるリンカーで行ってもよい。すべてのこのような組立
ては当業者に周知の遺伝子工学方法で行われ(一般的に
Maniatis et al.,同士参照)、様々な臨床的又は生物学
的応用に特に適したものとする異なる性質のアフィニテ
ィ、特異性、安定性及び毒性を有したタンパク質を産生
してもよい。
ここで開示された例において、VL、VH及びPE40遺伝子
は単一プラスミドに含まれている。更に、合成後の組換
え抗体−PE40タンパク質は精製されるまで大腸菌宿主細
胞に内在したままである。本発明のもう1つの態様にお
いて、VL遺伝子及びいずれかのL鎖不変領域は1つのプ
ラスミド上に存在するが、VH遺伝子、いずれかのH鎖不
変領域及びPE40遺伝子は第二のプラスミド上に存在す
る。いずれのケースでも、VL及び/又はVH遺伝子は細胞
から組換え融合タンパク質の分泌を指示するシグナル配
列で前置されていてよい 〔Better et al.,1988,Science,240,1041-1043;Skerr
a & Pluckthun,1988,Science,240,1038-1041〕。
は単一プラスミドに含まれている。更に、合成後の組換
え抗体−PE40タンパク質は精製されるまで大腸菌宿主細
胞に内在したままである。本発明のもう1つの態様にお
いて、VL遺伝子及びいずれかのL鎖不変領域は1つのプ
ラスミド上に存在するが、VH遺伝子、いずれかのH鎖不
変領域及びPE40遺伝子は第二のプラスミド上に存在す
る。いずれのケースでも、VL及び/又はVH遺伝子は細胞
から組換え融合タンパク質の分泌を指示するシグナル配
列で前置されていてよい 〔Better et al.,1988,Science,240,1041-1043;Skerr
a & Pluckthun,1988,Science,240,1038-1041〕。
本発明の融合タンパク質は大腸菌、他の細菌宿主、酵
母並びにCOS、CHO、HeLa細胞系及びミエローマ細胞系の
ような様々なより高等の真核細胞を含めた様々な宿主細
胞で発現される。組換えタンパク質遺伝子は各宿主に関
して適切な発現コントロール配列に作動可能に結合され
る。大腸菌の場合、これにはT7、trp又はλプロモータ
ーのようなプロモーター、リボソーム結合部位、好まし
くは転写集結シグナルを含む。真核細胞の場合、コント
ロール配列にはプロモーター、好ましくは免疫グロブリ
ン遺伝子、SV40、サイトメガロウイリス等に由来するエ
ンハンサー及びポリアデニル化配列を含み、更にスプラ
イスドナー及びアクセプター配列も含む。本発明のプラ
スミドは、大腸菌の場合塩化カルシウム形質転換で、哺
乳動物細胞の場合リン酸カルシウム処理又は電気ポレー
ションのような周知方法で、選択宿主細胞中に移入でき
る。プラスミドで形質転換された細胞はamp、gpt、neo
及びhyg遺伝子のようなプラスミドに含まれる遺伝子で
与えられる抗生物質耐性によって選択できる。
母並びにCOS、CHO、HeLa細胞系及びミエローマ細胞系の
ような様々なより高等の真核細胞を含めた様々な宿主細
胞で発現される。組換えタンパク質遺伝子は各宿主に関
して適切な発現コントロール配列に作動可能に結合され
る。大腸菌の場合、これにはT7、trp又はλプロモータ
ーのようなプロモーター、リボソーム結合部位、好まし
くは転写集結シグナルを含む。真核細胞の場合、コント
ロール配列にはプロモーター、好ましくは免疫グロブリ
ン遺伝子、SV40、サイトメガロウイリス等に由来するエ
ンハンサー及びポリアデニル化配列を含み、更にスプラ
イスドナー及びアクセプター配列も含む。本発明のプラ
スミドは、大腸菌の場合塩化カルシウム形質転換で、哺
乳動物細胞の場合リン酸カルシウム処理又は電気ポレー
ションのような周知方法で、選択宿主細胞中に移入でき
る。プラスミドで形質転換された細胞はamp、gpt、neo
及びhyg遺伝子のようなプラスミドに含まれる遺伝子で
与えられる抗生物質耐性によって選択できる。
発現されると、組換え融合タンパク質は硫酸アンモニ
ウム沈降、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフ
ィー、ゲル電気泳動等を含めた当業者の標準操作に従い
精製できる〔一般的にR,Scopes,“Protein Purificatio
n",Springer-Verlag,N.Y.(1982)参照〕。少なくとも
約90〜95%均一率の実質上純粋な組成物が医薬用に好ま
しく、98〜99%以上の均一率が最も好ましい。部分的に
又は所望の均一率まで精製されると、ポリペプチドは治
療に(体外を含む)又はアッセイ操作を展開及び実施す
るような他の場合に用いられる〔一般的にImmunologica
l Methods,Vols.I and II,Lefkovits and Pernis,eds.,
Academic Press,New York,N.Y.(1979 and 1981)参
照〕。
ウム沈降、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフ
ィー、ゲル電気泳動等を含めた当業者の標準操作に従い
精製できる〔一般的にR,Scopes,“Protein Purificatio
n",Springer-Verlag,N.Y.(1982)参照〕。少なくとも
約90〜95%均一率の実質上純粋な組成物が医薬用に好ま
しく、98〜99%以上の均一率が最も好ましい。部分的に
又は所望の均一率まで精製されると、ポリペプチドは治
療に(体外を含む)又はアッセイ操作を展開及び実施す
るような他の場合に用いられる〔一般的にImmunologica
l Methods,Vols.I and II,Lefkovits and Pernis,eds.,
Academic Press,New York,N.Y.(1979 and 1981)参
照〕。
本発明の組換え融合タンパク質及び医薬組成物は、特
に非経口投与、即ち皮下、筋肉又は静脈内投与に有用で
ある。非経口投与用組成物は通常許容されるキャリア、
好ましくは水性キャリア、に溶解された抗体又はそのカ
クテルの溶液である。様々な水性キャリア、例えば水、
緩衝液、0.4%塩水、0.3%グリシン等が使用可能であ
る。これらの溶液は無菌であって、通常望ましくない物
質を含まない。これらの組成物は慣用的な周知の滅菌技
術で滅菌される。組成物はpH調整及び緩衝剤、毒性調整
剤等のような大体の生理条件に必要な薬学上許容される
補助物質、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩
化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含ん
でいてもよい。これらの処方剤における融合タンパク質
の濃度は様々であって、即ち重量で約0.5%以下、通常
約1%又は少なくとも約1%から多くて15又は20%まで
であり、選択される具体的投与方式に従い液体容量、粘
度、体重等に基づき主に選択される。
に非経口投与、即ち皮下、筋肉又は静脈内投与に有用で
ある。非経口投与用組成物は通常許容されるキャリア、
好ましくは水性キャリア、に溶解された抗体又はそのカ
クテルの溶液である。様々な水性キャリア、例えば水、
緩衝液、0.4%塩水、0.3%グリシン等が使用可能であ
る。これらの溶液は無菌であって、通常望ましくない物
質を含まない。これらの組成物は慣用的な周知の滅菌技
術で滅菌される。組成物はpH調整及び緩衝剤、毒性調整
剤等のような大体の生理条件に必要な薬学上許容される
補助物質、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩
化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含ん
でいてもよい。これらの処方剤における融合タンパク質
の濃度は様々であって、即ち重量で約0.5%以下、通常
約1%又は少なくとも約1%から多くて15又は20%まで
であり、選択される具体的投与方式に従い液体容量、粘
度、体重等に基づき主に選択される。
このように、筋肉内注射用の典型的医薬組成物は無菌
緩衝水1ml及び融合タンパク質10mgからなる。静脈内注
入用の典型的組成物は無菌リンゲル液250ml及びタンパ
ク質10mgからなる。非経口投与用組成物の実際の製造方
法は当業者に公知又は明白であって、 Remington′s Pharmaceutical Science,15th ed.,Mack
publishing Company,Easton,Pennsylvania(1980)のよ
うな文献で更に詳細に記載されているが、これは参考の
ためここに組み込まれる。
緩衝水1ml及び融合タンパク質10mgからなる。静脈内注
入用の典型的組成物は無菌リンゲル液250ml及びタンパ
ク質10mgからなる。非経口投与用組成物の実際の製造方
法は当業者に公知又は明白であって、 Remington′s Pharmaceutical Science,15th ed.,Mack
publishing Company,Easton,Pennsylvania(1980)のよ
うな文献で更に詳細に記載されているが、これは参考の
ためここに組み込まれる。
本融合タンパク質又はそのカクテル(即ち他のタンパ
ク質と一緒)を含有した組成物は、予防及び/又は治療
処置のために投与できる。治療適用の場合、組成物は疾
患及びその合併症を治癒又は少なくとも部分的に抑制す
るために充分な量で疾患のある患者に投与される。これ
を果たす上で充分な量は“治療有効量”として規定され
る。この用途に有効な量は疾患の程度及び患者健康の一
般的状態に依存している。
ク質と一緒)を含有した組成物は、予防及び/又は治療
処置のために投与できる。治療適用の場合、組成物は疾
患及びその合併症を治癒又は少なくとも部分的に抑制す
るために充分な量で疾患のある患者に投与される。これ
を果たす上で充分な量は“治療有効量”として規定され
る。この用途に有効な量は疾患の程度及び患者健康の一
般的状態に依存している。
予防適用の場合、本抗体又はそのカクテルを含有した
組成物は発病を予防するため、まだ発病していない患者
に投与される。このような量は“予防有効量”として規
定される。このケースにおける正確な量も患者の健康状
態及び一般的免疫レベルに依存している。
組成物は発病を予防するため、まだ発病していない患者
に投与される。このような量は“予防有効量”として規
定される。このケースにおける正確な量も患者の健康状
態及び一般的免疫レベルに依存している。
本組成物の単回又は複数回投薬は患者によって必要と
されかつ耐えられる用量及び頻度に応じて行われる。い
かなる場合でも、本組成物は患者を有効に治療する上で
充分な本発明のタンパク質の量を与えるべきである。
されかつ耐えられる用量及び頻度に応じて行われる。い
かなる場合でも、本組成物は患者を有効に治療する上で
充分な本発明のタンパク質の量を与えるべきである。
本発明の組換え融合タンパク質の様々な用途の中に
は、タンパク質の毒性作用により排除されうる特定ヒト
細胞起因性の様々な病状が含まれる。1つの好ましい適
用例は、T及びB細胞に起因する移植片対宿主疾患、臓
器移植拒絶、I型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関
節炎、全身性紅斑性狼瘡、重症筋無力症等のような自己
免疫症状の治療である。ここで開示された例は例示にす
ぎない。他の好ましい適用例は様々なタイプの悪性細胞
に起因する癌の治療用である。融合タンパク質は、イン
ビトロで、例えば移植前における骨髄からの有害細胞の
除去にも用いられる。融合タンパク質の抗体部分は所定
の用途に応じて選択される。抗体の標的として機能する
T細胞の膜上のタンパク質としてはCD2(T11)、CD3、C
D4及びCD8がある。標的として機能するB細胞上で主に
みられるタンパク質としてはCD10(CALLA抗原)、CD19
及びCD20がある。CD45はリンパ球細胞上に広く存在しう
る標的である。抗体に関するこれら及び他の可能な標的
リンパ球抗原はLeucocyte Typing III,A.J.McMicheal,e
d.,Oxford University Press,1987で記載されている。
抗体の標的として機能する癌細胞上でみられる抗原とし
ては癌胎児性抗原(CEA)、トランスフェリンレセプタ
ー、P-糖タンパク質、c-erbB2及びAbstracts of the Th
ird International Conference on Monoclonal Antibod
y Immunoconjugates for Cancer(San Diego,CA,1988)
で記載された抗原がある。当業者であれば、更に他のタ
イプの細胞で発現される抗原、例えば膜糖タンパク質又
は表皮増殖因子レセプター等のような増殖因子もしくは
ホルモンレセプター、と結合する抗体も選択してよいと
理解している。
は、タンパク質の毒性作用により排除されうる特定ヒト
細胞起因性の様々な病状が含まれる。1つの好ましい適
用例は、T及びB細胞に起因する移植片対宿主疾患、臓
器移植拒絶、I型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関
節炎、全身性紅斑性狼瘡、重症筋無力症等のような自己
免疫症状の治療である。ここで開示された例は例示にす
ぎない。他の好ましい適用例は様々なタイプの悪性細胞
に起因する癌の治療用である。融合タンパク質は、イン
ビトロで、例えば移植前における骨髄からの有害細胞の
除去にも用いられる。融合タンパク質の抗体部分は所定
の用途に応じて選択される。抗体の標的として機能する
T細胞の膜上のタンパク質としてはCD2(T11)、CD3、C
D4及びCD8がある。標的として機能するB細胞上で主に
みられるタンパク質としてはCD10(CALLA抗原)、CD19
及びCD20がある。CD45はリンパ球細胞上に広く存在しう
る標的である。抗体に関するこれら及び他の可能な標的
リンパ球抗原はLeucocyte Typing III,A.J.McMicheal,e
d.,Oxford University Press,1987で記載されている。
抗体の標的として機能する癌細胞上でみられる抗原とし
ては癌胎児性抗原(CEA)、トランスフェリンレセプタ
ー、P-糖タンパク質、c-erbB2及びAbstracts of the Th
ird International Conference on Monoclonal Antibod
y Immunoconjugates for Cancer(San Diego,CA,1988)
で記載された抗原がある。当業者であれば、更に他のタ
イプの細胞で発現される抗原、例えば膜糖タンパク質又
は表皮増殖因子レセプター等のような増殖因子もしくは
ホルモンレセプター、と結合する抗体も選択してよいと
理解している。
物質及び方法 下記例は限定ではなく説明のために示されている。
抗Tac(Fv)‐PE40に関する発現プラスミドの構築 ここでpVC70108と命名されたプラスミドは、開始メチ
オニンをコードするATC、VLをコードする318bpDNAセグ
メントに45bpリンカーで結合された抗TacVHをコードす
る348bpDNAセグメントを含むように組立てられ、次いで
VLはPEのアミノ酸253-613をコードするDNAセグメントに
結合された(第1図)。VH‐VL‐リンカー‐PE40DNAセ
グメント及びコードされた抗Tac(Fv)‐PE40融合タン
パク質の全配列が表1に示されている。VH及びVLの配列
は米国特許出願第182,682号明細書で示されているが、
これは特に参考のため本明細書に組み込まれる。
オニンをコードするATC、VLをコードする318bpDNAセグ
メントに45bpリンカーで結合された抗TacVHをコードす
る348bpDNAセグメントを含むように組立てられ、次いで
VLはPEのアミノ酸253-613をコードするDNAセグメントに
結合された(第1図)。VH‐VL‐リンカー‐PE40DNAセ
グメント及びコードされた抗Tac(Fv)‐PE40融合タン
パク質の全配列が表1に示されている。VH及びVLの配列
は米国特許出願第182,682号明細書で示されているが、
これは特に参考のため本明細書に組み込まれる。
第1図a及びbで示されるように、2組のオリゴヌク
レオチドが以下のものを作成するため、ポリメラーゼ鎖
反応(PCR)に基づく(Perkin Elmer Cetus,Gene Amp K
itを用いた)増幅に用いられた: (a)VH遺伝子の5′末端におけるNdeI部位、VHドメイ
ン及びリンカーの最初のアミノ末端9コドンしかる後Kp
nI部位(プラスミドpHTac2において抗TacH鎖cDNAと共に
VK073及びVK074を用いる); (b)KpnI部位を有するペプチドリンカーの7カルボキ
シ末端コドン、VLドメイン及びVLコード遺伝子の3′末
端におけるHindIII部位(プラスミドpLTac2においてL
鎖cDNAと共にVK075及びVK076を用いる)。
レオチドが以下のものを作成するため、ポリメラーゼ鎖
反応(PCR)に基づく(Perkin Elmer Cetus,Gene Amp K
itを用いた)増幅に用いられた: (a)VH遺伝子の5′末端におけるNdeI部位、VHドメイ
ン及びリンカーの最初のアミノ末端9コドンしかる後Kp
nI部位(プラスミドpHTac2において抗TacH鎖cDNAと共に
VK073及びVK074を用いる); (b)KpnI部位を有するペプチドリンカーの7カルボキ
シ末端コドン、VLドメイン及びVLコード遺伝子の3′末
端におけるHindIII部位(プラスミドpLTac2においてL
鎖cDNAと共にVK075及びVK076を用いる)。
pUC18におけるEcoRIインサートとして抗TacのH及び
L鎖をコードする全鎖長cDNAを有したプラスミドが鋳型
として用いられた。PCR増幅後、2つの断片、即ち
(1)H鎖の可変ドメイン及びペプチドリンカーのアミ
ノ末端部分を含む413bp断片;(2)ペプチドリンカー
のカルボキシ末端部分及びL鎖の可変ドメインを含む39
6bp断片が、単離された。413bp断片はNdeI及びKpnIで切
断され、377bp断片を得た。396bp断片はKpnI及びHindII
Iで制限され、340bp断片を生じた。それとは別に、PE由
来PE43をコードする遺伝子を有したプラスミドpVC20〔C
haudhary et al.,Proc.Natl.Acad,Sci.USA,85:2939-294
3,1988〕が、NdeI及びHindIIIで制限され、脱リン酸化
されて、3.75Kp断片を単離した。次いでこれは、先に単
離された377bp及び340bp断片と結合された。得られたプ
ラスミドpVC701はT7プロモーター下で融合遺伝子を含ん
でいる。この遺伝子はペプチドリンカー中に4つの余分
な塩基を含む。プラスミドpVC701はKpnIで切断され、
3′突出部分を除去するためT4DNAポリメラーゼで処理
されて、単離されたプラスミドpVC701020に結合され
た。pVC701020(4.4Kb)は抗Tacの可変ドメイン及びPE4
3から構成される融合タンパク質をコードしている。
L鎖をコードする全鎖長cDNAを有したプラスミドが鋳型
として用いられた。PCR増幅後、2つの断片、即ち
(1)H鎖の可変ドメイン及びペプチドリンカーのアミ
ノ末端部分を含む413bp断片;(2)ペプチドリンカー
のカルボキシ末端部分及びL鎖の可変ドメインを含む39
6bp断片が、単離された。413bp断片はNdeI及びKpnIで切
断され、377bp断片を得た。396bp断片はKpnI及びHindII
Iで制限され、340bp断片を生じた。それとは別に、PE由
来PE43をコードする遺伝子を有したプラスミドpVC20〔C
haudhary et al.,Proc.Natl.Acad,Sci.USA,85:2939-294
3,1988〕が、NdeI及びHindIIIで制限され、脱リン酸化
されて、3.75Kp断片を単離した。次いでこれは、先に単
離された377bp及び340bp断片と結合された。得られたプ
ラスミドpVC701はT7プロモーター下で融合遺伝子を含ん
でいる。この遺伝子はペプチドリンカー中に4つの余分
な塩基を含む。プラスミドpVC701はKpnIで切断され、
3′突出部分を除去するためT4DNAポリメラーゼで処理
されて、単離されたプラスミドpVC701020に結合され
た。pVC701020(4.4Kb)は抗Tacの可変ドメイン及びPE4
3から構成される融合タンパク質をコードしている。
pVC701020はHindIIIで制限され、5′突出部分を除去
するためS1ヌクレアーゼで処理され、BamHIで切断さ
れ、脱リン酸化されて、3.65Kp断片を単離した。それと
は別に、pVC701020はAvaIで切断され、S1ヌクレアーゼ
で処理され、BamHIで切断されて、750bp断片を単離し
た。3.65Kp及び750bp断片は互いに結合されて、プラス
ミドpVC70108を生じた。pVC70108は、15アミノ酸リンカ
ーでVLに結合されたVH、及び、PEのアミノ酸253-613に
結合されたVLをコードする融合遺伝子を有する。メチオ
ニンコドンはVHの5′末端で作成された。
するためS1ヌクレアーゼで処理され、BamHIで切断さ
れ、脱リン酸化されて、3.65Kp断片を単離した。それと
は別に、pVC701020はAvaIで切断され、S1ヌクレアーゼ
で処理され、BamHIで切断されて、750bp断片を単離し
た。3.65Kp及び750bp断片は互いに結合されて、プラス
ミドpVC70108を生じた。pVC70108は、15アミノ酸リンカ
ーでVLに結合されたVH、及び、PEのアミノ酸253-613に
結合されたVLをコードする融合遺伝子を有する。メチオ
ニンコドンはVHの5′末端で作成された。
先に示されてように、構築された遺伝子はT7プロモー
ターのコントロール下にある。プラスミドのコード領域
の正確性はDNA配列決定で確認された(データ示さ
ず)。
ターのコントロール下にある。プラスミドのコード領域
の正確性はDNA配列決定で確認された(データ示さ
ず)。
プラスミドpVC70108の寄託は1989年3月31日付でメリ
ーランド州ロックビルのATCCに受託番号67913として行
われた。寄託物は寄託日から30年間又は寄託サンプルの
最終請求日から5年間のいずれか長い期間にわたり生存
維持され、それが死滅したならば交換されるべきであ
り、法律の規定に従い無制限に本出願による特許権の発
行により公に利用される。特許商標局長は請求により寄
託物を入手することになる。
ーランド州ロックビルのATCCに受託番号67913として行
われた。寄託物は寄託日から30年間又は寄託サンプルの
最終請求日から5年間のいずれか長い期間にわたり生存
維持され、それが死滅したならば交換されるべきであ
り、法律の規定に従い無制限に本出願による特許権の発
行により公に利用される。特許商標局長は請求により寄
託物を入手することになる。
抗Tac(Fv)‐PE40の精製及び特徴 IPTG誘導で、プラスミドpVC70108を有する大腸菌株BL
21(λDE3)は、SDS-PAGE(1列目、第2図b)で示さ
れるように、多量の約65kDaのタンパク質を産生した。
免疫ブロットにおいて、65kDaキメラタンパク質はPEに
対する抗体と反応した(データ示さず)。融合タンパク
質は超音波処理スフェロブラスト(2列目、第2図b)
の100,000×gペレット(3列目、第2図b)に大部分
含まれていた。このペレットは抗Tac(Fv)‐PE40の製
造源として用いられた。塩酸グアニジン変性しかる後迅
速な希釈の技術がキメラタンパク質を溶解かつ復元する
ために用いられた〔Chaudhary et al.,1988,Nature,33
5,369-372;Siegall et al.,1988,Proc.Natl.Acad,Sci.U
SA,85,9738-9742〕。DTTは変性緩衝液から省略され、復
元は16時間行われた。復元及び透析後、サンプルはモノ
Qカラム(HR10/10)に3ml/minで適用された。カラムは
緩衝液A(20mMトリス塩酸,pH7.6)40mlで洗浄され、20
0ml直線勾配(0〜0.5M NaCl)で展開された。溶出した
タンパク質は280nmでモニターされた。分画(4ml)が集
められ、HUT-102細胞の細胞毒性に関して試験された。S
DS-PAGEのため、サンプルはレムリ(Laemmli)サンプル
緩衝液と共に煮沸され、10%ゲル上で電気泳動された。
モノマー形の融合タンパク質は0.2〜0.22M NaClで溶出
した(第2図b、4列目及び第2図a)。高分子量凝集
物は高イオン強度側で溶出された(分画42-50、第2図
a)。更にキメラタンパク質の精製がTSK-250ゲル濾過
カラムで行われ、キメラタンパク質は65kDaタンパク質
に関して予想された位置で対称ピークとして溶出した
(データ示さず)。SDS-PAGEではそのタンパク質が純度
95%以上であることを示し(5列目、第2図b)、N末
端アミノ酸配列分析ではそのタンパク質が予想N末端配
列met、gln、valを有することを示した。約200μgの高
度精製モノマー抗Tac(Fv)‐PE40が誘導前に0.6のOD
650まで増殖された細胞11から得られた。
21(λDE3)は、SDS-PAGE(1列目、第2図b)で示さ
れるように、多量の約65kDaのタンパク質を産生した。
免疫ブロットにおいて、65kDaキメラタンパク質はPEに
対する抗体と反応した(データ示さず)。融合タンパク
質は超音波処理スフェロブラスト(2列目、第2図b)
の100,000×gペレット(3列目、第2図b)に大部分
含まれていた。このペレットは抗Tac(Fv)‐PE40の製
造源として用いられた。塩酸グアニジン変性しかる後迅
速な希釈の技術がキメラタンパク質を溶解かつ復元する
ために用いられた〔Chaudhary et al.,1988,Nature,33
5,369-372;Siegall et al.,1988,Proc.Natl.Acad,Sci.U
SA,85,9738-9742〕。DTTは変性緩衝液から省略され、復
元は16時間行われた。復元及び透析後、サンプルはモノ
Qカラム(HR10/10)に3ml/minで適用された。カラムは
緩衝液A(20mMトリス塩酸,pH7.6)40mlで洗浄され、20
0ml直線勾配(0〜0.5M NaCl)で展開された。溶出した
タンパク質は280nmでモニターされた。分画(4ml)が集
められ、HUT-102細胞の細胞毒性に関して試験された。S
DS-PAGEのため、サンプルはレムリ(Laemmli)サンプル
緩衝液と共に煮沸され、10%ゲル上で電気泳動された。
モノマー形の融合タンパク質は0.2〜0.22M NaClで溶出
した(第2図b、4列目及び第2図a)。高分子量凝集
物は高イオン強度側で溶出された(分画42-50、第2図
a)。更にキメラタンパク質の精製がTSK-250ゲル濾過
カラムで行われ、キメラタンパク質は65kDaタンパク質
に関して予想された位置で対称ピークとして溶出した
(データ示さず)。SDS-PAGEではそのタンパク質が純度
95%以上であることを示し(5列目、第2図b)、N末
端アミノ酸配列分析ではそのタンパク質が予想N末端配
列met、gln、valを有することを示した。約200μgの高
度精製モノマー抗Tac(Fv)‐PE40が誘導前に0.6のOD
650まで増殖された細胞11から得られた。
抗Tac(Fv)‐PE40の細胞毒性試験 HUT-102細胞は無血清培地で2回洗浄され、24ウェル
プレート内の5%牛胎児血清含有RPMI1640培地に3×10
5細胞/ウェルでいれられた。様々な希釈率の抗Tac(F
v)‐PE40が0.2%ヒト血清アルブミン含有PBSで調製さ
れ、適切なウェルに加えられた。20時間後に細胞は90分
間かけて3H-ロイシンで標識され、細胞ペレットのTCA
沈降物中における放射能が測定された。結果は毒素無添
加のコントロールの%として表示される。競合の場合に
は10μgの抗Tac(Fv)‐PE40。
プレート内の5%牛胎児血清含有RPMI1640培地に3×10
5細胞/ウェルでいれられた。様々な希釈率の抗Tac(F
v)‐PE40が0.2%ヒト血清アルブミン含有PBSで調製さ
れ、適切なウェルに加えられた。20時間後に細胞は90分
間かけて3H-ロイシンで標識され、細胞ペレットのTCA
沈降物中における放射能が測定された。結果は毒素無添
加のコントロールの%として表示される。競合の場合に
は10μgの抗Tac(Fv)‐PE40。
抗Tac(Fv)‐PE40の競合結合分析 トレーサーとしてのI-125標識抗Tac(2μCi/μg)
が、結合緩衝液(10%牛胎児血清、100μg/mlヒトIgG、
0.1%ナトリウムアジド含有RPMI1640)0.2ml中で、様々
な濃度の競合物質とTac抗原源としての4×105HUT-102
細胞と共に、1.5ng/アッセイで用いられ、室温(22-24
℃)で2時間混ぜながらインキュベートされた。これら
の条件下で、トレーサーの濃度は50pM、Tacペプチドは5
00pMである。遊離トレーサーは計算によると10pMであ
り、遊離トレーサーが競合分析の仮定として(抗TacのK
aに関して1010M-1を用いた場合)1/Ka=100pM以下であ
るという条件を満足する。アッセイはコントロールの冷
抗Tac抗体と並行して行われ、結合/遊離トレーサー結
合50%阻害点(Ro/2)対log競合物質濃度の曲線シフト
が定量された。濃度は横座標の真数から得られ、構造体
Xに関するアフィニティ定数Kxは下記式から求められた
〔Berzofskyet al.,1981,Molec.Immunol,18,751-76
3〕: ([X]1/2−[抗Tac]1/2)=1/Kx−1/Ka 上記において[X]1/2はトレーサー結合がRo/2であると
きの競合物質の濃度を示す。抗Tacとの結合データに関
する標準スカッチャード(Scatchard)プロッティング
では、直線のグラフ及び9.7×109M-1のKaを示したが、
これは他の研究者により得られたものと同等である〔Ro
bb et al.,1984,J.Exp.Med.,160,1126-1146〕。抗Tac
(Fv)‐PE40に関する3.5×109M-1のKaは前記式から計
算された。すべての濃度はヒトIgGとの標準曲線に対す
るブラッドフォード(Bradford)タンパク質マイクロア
ッセイで測定された。競合分析の場合、これらの濃度
は、横座標に関する結合性タンパク質の濃度を得るため
過剰のHUT-102細胞と共に、放射性同位元素標識抗Tac
(Fv)‐PE40(0.44)及び放射性同位元素標識抗Tac
(0.8)との別々の試験で得られた結合性分画に基づき
標準化された。
が、結合緩衝液(10%牛胎児血清、100μg/mlヒトIgG、
0.1%ナトリウムアジド含有RPMI1640)0.2ml中で、様々
な濃度の競合物質とTac抗原源としての4×105HUT-102
細胞と共に、1.5ng/アッセイで用いられ、室温(22-24
℃)で2時間混ぜながらインキュベートされた。これら
の条件下で、トレーサーの濃度は50pM、Tacペプチドは5
00pMである。遊離トレーサーは計算によると10pMであ
り、遊離トレーサーが競合分析の仮定として(抗TacのK
aに関して1010M-1を用いた場合)1/Ka=100pM以下であ
るという条件を満足する。アッセイはコントロールの冷
抗Tac抗体と並行して行われ、結合/遊離トレーサー結
合50%阻害点(Ro/2)対log競合物質濃度の曲線シフト
が定量された。濃度は横座標の真数から得られ、構造体
Xに関するアフィニティ定数Kxは下記式から求められた
〔Berzofskyet al.,1981,Molec.Immunol,18,751-76
3〕: ([X]1/2−[抗Tac]1/2)=1/Kx−1/Ka 上記において[X]1/2はトレーサー結合がRo/2であると
きの競合物質の濃度を示す。抗Tacとの結合データに関
する標準スカッチャード(Scatchard)プロッティング
では、直線のグラフ及び9.7×109M-1のKaを示したが、
これは他の研究者により得られたものと同等である〔Ro
bb et al.,1984,J.Exp.Med.,160,1126-1146〕。抗Tac
(Fv)‐PE40に関する3.5×109M-1のKaは前記式から計
算された。すべての濃度はヒトIgGとの標準曲線に対す
るブラッドフォード(Bradford)タンパク質マイクロア
ッセイで測定された。競合分析の場合、これらの濃度
は、横座標に関する結合性タンパク質の濃度を得るため
過剰のHUT-102細胞と共に、放射性同位元素標識抗Tac
(Fv)‐PE40(0.44)及び放射性同位元素標識抗Tac
(0.8)との別々の試験で得られた結合性分画に基づき
標準化された。
抗Tac(Fv)‐PE40の選択的細胞毒性 抗Tac抗体はHUT-102細胞に多量に存在するIL-2レセプ
ターのp55サブユニット(Tac抗原)と結合することから
〔Uchiyama at al.,1981,J.Immunol.,126,1393-139
7〕、キメラタンパク質は前記のようにHUT-102細胞に対
する細胞毒性に関して最初に試験された。抗Tac(Fv)
‐PE40は20時間アッセイにおいて、0.15ng/ml(2.3×10
-12M)のID50で用量依存的にタンパク質合成を阻害し
た(第3図及び表2)。4ng/ml以上の濃度で、タンパク
質合成の完全阻害があった。数回の特異性コントロール
が行われた。過剰の抗Tac(10μg/ml)の添加はHUT-102
細胞において抗Tac(Fv)‐PE40の細胞毒性を妨げた
が、一方卵巣癌細胞上でみられる抗原に対するコントロ
ールモノクローナル抗体OVB3はそうでなかった(第3
図)。HUT102より少数のIL2レセプターを有するもう1
つのヒトT細胞系CrII.2も、2.7ng/mlのID50で抗Tac(F
v)‐PE40に対して非常に感受的であった(表2)。更
に、T細胞系、CEM、A431、KB及びOVCAR-3を含めたIL2
レセプターのない数種のヒト細胞系は、1μg/mlであっ
ても抗Tac(Fv)‐PE40により影響されなかった(表
2)。
ターのp55サブユニット(Tac抗原)と結合することから
〔Uchiyama at al.,1981,J.Immunol.,126,1393-139
7〕、キメラタンパク質は前記のようにHUT-102細胞に対
する細胞毒性に関して最初に試験された。抗Tac(Fv)
‐PE40は20時間アッセイにおいて、0.15ng/ml(2.3×10
-12M)のID50で用量依存的にタンパク質合成を阻害し
た(第3図及び表2)。4ng/ml以上の濃度で、タンパク
質合成の完全阻害があった。数回の特異性コントロール
が行われた。過剰の抗Tac(10μg/ml)の添加はHUT-102
細胞において抗Tac(Fv)‐PE40の細胞毒性を妨げた
が、一方卵巣癌細胞上でみられる抗原に対するコントロ
ールモノクローナル抗体OVB3はそうでなかった(第3
図)。HUT102より少数のIL2レセプターを有するもう1
つのヒトT細胞系CrII.2も、2.7ng/mlのID50で抗Tac(F
v)‐PE40に対して非常に感受的であった(表2)。更
に、T細胞系、CEM、A431、KB及びOVCAR-3を含めたIL2
レセプターのない数種のヒト細胞系は、1μg/mlであっ
ても抗Tac(Fv)‐PE40により影響されなかった(表
2)。
PE(抗Tac-PE)又はPE40と化学的に複合化された抗Ta
cはHUT102細胞を死滅させたことが報告された〔Kondo e
t al.,1988,J.Biol.Chem.,263,9470−9475;FitzGerald
et al.,1984,J.Clin.Invest.,74,966-971〕。チオエー
テル複合体が製造された場合、抗Tac-PEは約1.2ng/mlの
ID50を有し、同様に製造された抗Tac-PE40は13ng/mlのI
Dを有した。抗Tac(Fv)‐PE40(65kDa)は抗Tac-PEの
分子量(216kDa)の約30%であるため、本発明のキメラ
毒素はモルベースでみて抗Tac-PEよりも数倍活性でかつ
抗Tac-PE40よりも著しく活性である。化学的に製造され
た抗Tac-PE40又は組換え融合タンパク質IL-2-PE40〔Lor
berboum-Galski et al.,1988,Proc.Nat.Acad,Sci.USA,8
5,1922-1926〕よりも約10倍高い、標的HUT102細胞に対
する抗Tac(Fv)‐PE40の非常に高い活性は予想外であ
り、先行技術から予想しえなかった。特に、抗Tac(F
v)抗体はIL-2に関するKa=1011M-1よりも著しく低い、
前記のようなKa=3.5×109M-1の完全IL-2レセプターに
対するアフィニティを有するため、抗Tac(Fv)‐PE40
が他のいかなるIL-2-PE融合タンパク質よりも細胞毒性
であることは予想外である〔Tsudo et al.,1987,Proc.N
at.Acad,Sci.USA,84,5394-5398〕。
cはHUT102細胞を死滅させたことが報告された〔Kondo e
t al.,1988,J.Biol.Chem.,263,9470−9475;FitzGerald
et al.,1984,J.Clin.Invest.,74,966-971〕。チオエー
テル複合体が製造された場合、抗Tac-PEは約1.2ng/mlの
ID50を有し、同様に製造された抗Tac-PE40は13ng/mlのI
Dを有した。抗Tac(Fv)‐PE40(65kDa)は抗Tac-PEの
分子量(216kDa)の約30%であるため、本発明のキメラ
毒素はモルベースでみて抗Tac-PEよりも数倍活性でかつ
抗Tac-PE40よりも著しく活性である。化学的に製造され
た抗Tac-PE40又は組換え融合タンパク質IL-2-PE40〔Lor
berboum-Galski et al.,1988,Proc.Nat.Acad,Sci.USA,8
5,1922-1926〕よりも約10倍高い、標的HUT102細胞に対
する抗Tac(Fv)‐PE40の非常に高い活性は予想外であ
り、先行技術から予想しえなかった。特に、抗Tac(F
v)抗体はIL-2に関するKa=1011M-1よりも著しく低い、
前記のようなKa=3.5×109M-1の完全IL-2レセプターに
対するアフィニティを有するため、抗Tac(Fv)‐PE40
が他のいかなるIL-2-PE融合タンパク質よりも細胞毒性
であることは予想外である〔Tsudo et al.,1987,Proc.N
at.Acad,Sci.USA,84,5394-5398〕。
競合結合の検討では、抗Tac(Fv)‐PE40に関して3.5
×109M-1のアフィニティを示したが、これは9.7×109M
-1で測定された抗Tacの場合と比較して約1/3であった
(第4図)。これは抗ウシ成長ホルモンのFv構造体対Fa
b断片に関するアフィニティの1/4〔Bird et al.,1988,S
cience,242,423-426〕及び抗ジゴキシンのFv構造体対抗
ジゴキシンのFab断片に関して1/6〔Houston et al.,198
8,Proc.Nat.Acad,Sci.USA,85,5879-5883〕に匹敵しう
る。
×109M-1のアフィニティを示したが、これは9.7×109M
-1で測定された抗Tacの場合と比較して約1/3であった
(第4図)。これは抗ウシ成長ホルモンのFv構造体対Fa
b断片に関するアフィニティの1/4〔Bird et al.,1988,S
cience,242,423-426〕及び抗ジゴキシンのFv構造体対抗
ジゴキシンのFab断片に関して1/6〔Houston et al.,198
8,Proc.Nat.Acad,Sci.USA,85,5879-5883〕に匹敵しう
る。
Fv結合部位によるアフィニティの相対的保存度は抗BG
H及び抗ジゴキシン抗体で観察された場合と比較して抗T
acの方が明らかに優れている。
H及び抗ジゴキシン抗体で観察された場合と比較して抗T
acの方が明らかに優れている。
要約するに、ここで示されたデータは、抗Tac可変領
域をコードするcDNAと修飾形のシュードモナス外毒素を
コードするDNAの断片との融合による大腸菌内における
活性組換え免疫毒素の合成を明らかに証明している。こ
の業績は、当業者に周知の大腸菌又は他の発現ベクター
を用いて他のこ抗体との同様の活性組換え免疫毒素の調
製をここに可能とさせる。
域をコードするcDNAと修飾形のシュードモナス外毒素を
コードするDNAの断片との融合による大腸菌内における
活性組換え免疫毒素の合成を明らかに証明している。こ
の業績は、当業者に周知の大腸菌又は他の発現ベクター
を用いて他のこ抗体との同様の活性組換え免疫毒素の調
製をここに可能とさせる。
ここで記載された例及び態様は説明目的のみのためで
あって、それからみて様々な修正又は変更が当業者に示
唆されかつ本出願の精神及び範囲内並びに請求の範囲内
に含まれることが理解される。
あって、それからみて様々な修正又は変更が当業者に示
唆されかつ本出願の精神及び範囲内並びに請求の範囲内
に含まれることが理解される。
矢印はVH、リンカー、VL及びPE40領域を各々分けてい
る。
る。
細胞系OVCAR3、KB及びA431は毒素添加前日に24ウェル
プレートに1×105/mlで接種した。HUT-102及びCEMは2
回洗浄して、24ウェルプレートに3×105/mlで接種した
(第3図参照)。様々な希釈率の毒素調製物を加え、20
時間後細胞を1.5時間かけて3H-ロイシンで標識した。
細胞のTCA沈降物中における放射能を測定した。ID50と
は毒素無添加コントロールと比較してタンパク質合成を
50%阻害する毒素濃度である。すべてのアッセイは重複
して行われ、3回繰返された。
プレートに1×105/mlで接種した。HUT-102及びCEMは2
回洗浄して、24ウェルプレートに3×105/mlで接種した
(第3図参照)。様々な希釈率の毒素調製物を加え、20
時間後細胞を1.5時間かけて3H-ロイシンで標識した。
細胞のTCA沈降物中における放射能を測定した。ID50と
は毒素無添加コントロールと比較してタンパク質合成を
50%阻害する毒素濃度である。すべてのアッセイは重複
して行われ、3回繰返された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 A61K 39/395 ADP Z C12N 1/21 8828−4B C12P 21/02 C 9282−4B 21/08 9358−4B (72)発明者 フィッツジェラルド,デービッド アメリカ合衆国メリーランド州、シルバ ー、スプリング、ラッド、ストリート、 1731 (72)発明者 クイーン,ケリー、エル. アメリカ合衆国カリフォルニア州、パロ、 アルト、オーク、クリーク、ドライブ、 1300 (72)発明者 フォルドマン,トーマス、エイ. アメリカ合衆国メリーランド州、シルバ ー、スプリング、リックオーバー、ロー ド、3910 (56)参考文献 特開 平2−276590(JP,A) 米国特許4545985(US,A) Proc.Natl.Acad.Sc i.USA,Vol.85,No.6,P 1922−1926(1988)
Claims (14)
- 【請求項1】適切な発現ベクター中で組換え融合タンパ
ク質の合成を指示するDNAセグメントを含んでなる構築
物であって、 上記融合タンパク質が抗Tac(Fv)‐PE40であることを
特徴とする構築物。 - 【請求項2】DNAセグメントがプラスミド中に含まれ
る、請求項1に記載の構築物。 - 【請求項3】ATCCNo.67913のプラスミドを含んでなる、
請求項2に記載の構築物。 - 【請求項4】融合タンパク質が一本鎖ポリペプチドであ
る、請求項1に記載の構築物。 - 【請求項5】融合タンパク質が同一の非組換え融合タン
パク質よりも活性である、請求項1に記載の構築物。 - 【請求項6】H鎖可変ドメインに関するコード配列がL
鎖可変ドメインに関するコード配列で追随され、後者が
PE40遺伝子で追随されている、請求項1に記載の構築
物。 - 【請求項7】請求項1に記載の構築物で形質転換又はト
ランスフェクトされた、原核又は真核細胞。 - 【請求項8】請求項4に記載の構築物で形質転換又はト
ランスフェクトされた、請求項7に記載の細胞。 - 【請求項9】抗Tac(Fv)‐PE40組換え融合タンパク質
の産生方法であって、請求項7に記載の細胞を培養し、
培養物から抗Tac(Fv)‐PE40組換え融合タンパク質を
回収する工程を含んでなる方法。 - 【請求項10】抗Tac(Fv)‐PE40組換え融合タンパク
質の産生方法であって、請求項8に記載の細胞を培養
し、培養物から抗Tac(Fv)‐PE40組換え融合タンパク
質を回収する工程を含んでなる方法。 - 【請求項11】PEの少なくとも転位及びADPリボシル化
活性を有する、抗Tac(Fv)‐PE40組換え融合タンパク
質。 - 【請求項12】タンパク質が単一ポリペプチド鎖を有す
る、請求項11に記載の融合タンパク質。 - 【請求項13】抗体が結合するレセプター又は抗原を有
した細胞を死滅させる上で有効な量の請求項11に記載の
融合タンパク質及び薬学上許容されるキャリアを含んで
なる、組成物。 - 【請求項14】標的細胞毒性を発揮するための方法であ
って、 死滅させようとする標的細胞を細胞毒性量の請求項13に
記載の組成物と接触させ、上記標的細胞は抗体が結合す
るレセプター又は抗原を有した細胞であるが、但し組成
物は上記抗体の結合のためのレセプター又は抗原を欠く
細胞に有意の細胞毒性がないことを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US34136189A | 1989-04-21 | 1989-04-21 | |
US341,361 | 1989-04-21 | ||
PCT/US1990/002097 WO1990012592A1 (en) | 1989-04-21 | 1990-04-20 | Recombinant antibody-toxin fusion protein |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04504363A JPH04504363A (ja) | 1992-08-06 |
JPH0829101B2 true JPH0829101B2 (ja) | 1996-03-27 |
Family
ID=23337235
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2507079A Expired - Fee Related JPH0829101B2 (ja) | 1989-04-21 | 1990-04-20 | 組換え抗体―毒素融合タンパク質 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0469065B1 (ja) |
JP (1) | JPH0829101B2 (ja) |
AT (1) | ATE138688T1 (ja) |
AU (1) | AU641392B2 (ja) |
CA (1) | CA2053911C (ja) |
DE (1) | DE69027210T2 (ja) |
DK (1) | DK0469065T3 (ja) |
ES (1) | ES2091824T3 (ja) |
IL (1) | IL94159A0 (ja) |
WO (1) | WO1990012592A1 (ja) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU631200B2 (en) * | 1989-02-17 | 1992-11-19 | Merck & Co., Inc. | Production of modified pe40 |
ES2085329T3 (es) * | 1989-02-17 | 1996-06-01 | Merck & Co Inc | Agente anticanceroso proteico. |
US6099842A (en) * | 1990-12-03 | 2000-08-08 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant immunotoxin composed of a single chain antibody reacting with the human transferrin receptor and diptheria toxin |
US5571894A (en) * | 1991-02-05 | 1996-11-05 | Ciba-Geigy Corporation | Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor |
US5939531A (en) * | 1991-07-15 | 1999-08-17 | Novartis Corp. | Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor |
AU675413B2 (en) * | 1991-09-30 | 1997-02-06 | United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The | Recombinant immunotoxins |
JP3024311B2 (ja) | 1991-10-03 | 2000-03-21 | 味の素株式会社 | Il−2受容体重鎖に結合するポリペプチド |
US6146850A (en) * | 1991-11-04 | 2000-11-14 | Xoma Corporation | Proteins encoding gelonin sequences |
US5837491A (en) * | 1991-11-04 | 1998-11-17 | Xoma Corporation | Polynucleotides encoding gelonin sequences |
US5621083A (en) * | 1991-11-04 | 1997-04-15 | Xoma Corporation | Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins |
DE69334255D1 (de) * | 1992-02-06 | 2009-02-12 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür |
JP2001501801A (ja) * | 1995-10-19 | 2001-02-13 | ブリストル−マイヤーズ スクイッブ カンパニー | モノクローナル抗体br110およびその使用 |
IL116559A (en) | 1995-11-17 | 2005-11-20 | Yissum Res Dev Co | Chimeric protein consisting of a bacterial toxin and a myelin basic protein sequence |
IL116436A (en) | 1995-12-18 | 2006-12-31 | Yissum Res Dev Co | Fc?Á-PE CHIMERIC PROTEIN FOR TARGETED TREATMENT OF ALLERGY RESPONSES AND |
CA2269507A1 (en) * | 1996-10-23 | 1998-04-30 | Wake Forest University | Targeted cytotoxic cells |
CA2691075C (en) | 2007-06-15 | 2017-04-11 | Daniela Gast | Treatment of tumors using specific anti-l1 antibody |
US8932586B2 (en) | 2011-09-06 | 2015-01-13 | Intrexon Corporation | Modified forms of Pseudomonas exotoxin A |
US10400037B2 (en) | 2014-09-30 | 2019-09-03 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Binding molecules, especially antibodies, binding to L1CAM (CD171) |
WO2016146833A1 (en) | 2015-03-19 | 2016-09-22 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance |
EP3184547A1 (en) | 2015-10-29 | 2017-06-28 | F. Hoffmann-La Roche AG | Anti-tpbg antibodies and methods of use |
CA3045857A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Universita Degli Studi Magna Graecia Catanzaro | A monoclonal antibody targeting a unique sialoglycosilated cancer-associated epitope of cd43 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02276590A (ja) * | 1989-02-17 | 1990-11-13 | Merck & Co Inc | タンパク質抗ガン剤 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1203672B (it) * | 1982-05-12 | 1989-02-15 | Harvard College | Proteina ibrida comprendente frammenti proteici collegati da legami peptidici e relativo gene di fusione composizione contenente tale proteina |
US4545985A (en) * | 1984-01-26 | 1985-10-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins |
US4894443A (en) * | 1984-02-08 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Toxin conjugates |
US4892827A (en) * | 1986-09-24 | 1990-01-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
US4867962A (en) * | 1988-02-26 | 1989-09-19 | Neorx Corporation | Functionally specific antibodies |
-
1990
- 1990-04-20 CA CA002053911A patent/CA2053911C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-20 AT AT90907767T patent/ATE138688T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-04-20 WO PCT/US1990/002097 patent/WO1990012592A1/en active IP Right Grant
- 1990-04-20 JP JP2507079A patent/JPH0829101B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-04-20 DE DE69027210T patent/DE69027210T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-20 ES ES90907767T patent/ES2091824T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-20 EP EP90907767A patent/EP0469065B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-20 DK DK90907767.9T patent/DK0469065T3/da active
- 1990-04-20 AU AU55627/90A patent/AU641392B2/en not_active Expired
- 1990-04-22 IL IL94159A patent/IL94159A0/xx unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02276590A (ja) * | 1989-02-17 | 1990-11-13 | Merck & Co Inc | タンパク質抗ガン剤 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.85,No.6,P1922−1926(1988) |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU641392B2 (en) | 1993-09-23 |
EP0469065A4 (en) | 1992-07-08 |
EP0469065B1 (en) | 1996-05-29 |
CA2053911A1 (en) | 1990-10-22 |
JPH04504363A (ja) | 1992-08-06 |
WO1990012592A1 (en) | 1990-11-01 |
DE69027210T2 (de) | 1997-01-23 |
ATE138688T1 (de) | 1996-06-15 |
CA2053911C (en) | 1999-11-02 |
AU5562790A (en) | 1990-11-16 |
EP0469065A1 (en) | 1992-02-05 |
IL94159A0 (en) | 1991-01-31 |
DE69027210D1 (de) | 1996-07-04 |
ES2091824T3 (es) | 1996-11-16 |
DK0469065T3 (da) | 1996-07-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5863745A (en) | Recombinant antibody-toxin fusion protein | |
US5696237A (en) | Recombinant antibody-toxin fusion protein | |
JPH0829101B2 (ja) | 組換え抗体―毒素融合タンパク質 | |
US6099842A (en) | Recombinant immunotoxin composed of a single chain antibody reacting with the human transferrin receptor and diptheria toxin | |
JP3553933B2 (ja) | 高められた活性を有する組換シュードモナス外毒素 | |
CA2616987C (en) | Mutated pseudomonas exotoxins with reduced antigenicity | |
US5349053A (en) | Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses | |
US5932448A (en) | Bispecific antibody heterodimers | |
US5889157A (en) | Humanized B3 antibody fragments, fusion proteins, and uses thereof | |
EP0467536A2 (en) | Method of treating bladder cancer cells | |
AU636453B2 (en) | An improved toxin for construction of immunotoxins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090327 Year of fee payment: 13 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100327 Year of fee payment: 14 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |