JPH04504363A - 組換え抗体―毒素融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換え抗体−毒素融合タンパク質 本願は、参考のため本願に組み込まれる１９８６年９月２４日付で出願された係 属出願第０６／９１１，２２７号の一部継続である。親出願（第０６／９１１， ２２７号）明細書は、特異的レセプターが細胞上に存在している認識タンパク質 をコードするＤＮＡ配列と融合された、修飾シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ）外毒素（Ｐ　Ｅ）遺伝子からの組換えタンパク質の産生について教示す る。

ＰＥ遺伝子は、ＰＥ分子の様々なドメインの特定セグメント又は配列を変えるた めに修正きれた。これは親出願においてＩＬ−２−ＰＥ融合遺伝子の組立て及び 発現で例示された。本出願はＰＥを利用した改良毒素の産生、更に詳しくは適切 な抗原又はレセプターを有した細胞を有効かつ選択的に死滅させることができる 組換え抗体−毒素融合タンパク質の合成に関する。ここで記載された研究は米国 政府により一部援助された。

図面の簡単な説明 本発明の様々な目的、特徴及び多数の付随的利点は添付された図面に関連させて 以下の詳細な記載を読むことでより良く理解されるであろう； 的な構築を示す。プラスミドｐＶｃ７０１０８は、単一ポリペプチド鎖として、 抗Ｔａｃの様々なドメイン：Ｈ鎖のＶｕ可変ドメイン（成熟Ｈ鎖の最初の１１６ アミノ酸）、１５アミノ酸リンカ−［（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−８ｅ ｔ）３］、Ｌ鎖のＶＬ可変ドメイン（成熟り鎖の最初の１０６アミノ酸）と転位 及びＡＤＰリボシル化活性を有するＰＨのアミノ酸２５３−６１３とをコードす る融合遺伝子を含んでいる。コードされたタンパク質は抗体−毒素融合タンパク 質、又は更に具体的には抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０と呼ばれる。融合遺伝子 はシャイン・ダルガノ領域及び開始コドン（ＰＴ７）に結合されたＴ７プロモー ターのコントロール下にある。ｐＶｃ７０１０ｇを有する大腸菌株ＢＬ２１　（ λＤＥ３）はＩ　ＰＴＧ誘導でハイブリッドタンパク質を発現させるために用い られた。

Ａｍｐ　、β−ラクタマーゼ遺伝子；Ｂ、ＢａｍＨＩ。

Ａ、Ａｖａ　１．ＰＣＲに用いられるオリゴヌクレオチドは水平矢印として示さ れた。プラスミドｐＶｃ７０１において、４つの余分な塩基は斜線枠内に示され た。

第１図（ｂ）は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に用いられるオリゴヌクレオチ ドを示し、ＶＫＯ７４、ＶＩＣＯ７５及びＶＫＯ７６は各々２列で示されている 。

ＶＫ　Ｏ７３及びＶＫＯ７５（７）一部はＨ及びＬ　＠　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの非コ ード鎖に相補的であり、一方ＶＫＯ７４及びＶＫＯ７６の一部はＨ及びＬ鎖ｃＤ ＮＡのコード鎖に各々相補的である。ＶＫＯ７３及びＶＫＯ７４は抗Ｔａ（Ｈ鎖 ｃＤＮＡを用いてＶｕ上セグメント増幅するために用いられ、一方ＶＫ６７５及 びｖＫ０７６は第１図ａで示されるように抗ＴａｃＬ鎖ｃＤＮＡを用いてＶＬ上 セグメント生成するために用いられた。すべてのオリゴヌクレオチドは５’−３ ’方向に記載された。ＶＬ又はＶ　ｕ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのコード鎖又は非コード 鎖に相補的な配列は枠内に示されている。Ｖｏ及びＶＬ間のペプチドリンカ−を コードする配列は破線で下線が引かれている。

第２図（ａ）は、モノＱカラムクロマトグラフィーによる復元可溶性抗Ｔａ　ｃ 　（Ｆｖ）−ＰＥ４０の精製結果を示す。復元物質はモノＱカラムに適用され、 タンパク質がＮａＣ１勾配（０〜０．５Ｍ）で溶出され、４ｍ１分画が集められ た。活性モノマー抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０の位置は垂直矢印で示されてい る。

第２図（ｂ）は様々な精製段階におけるサンプルのＳＤＳ　−ＰＡＧＥの結果を 示す。ゲルはクマシーブルーで染色された。１列目、全細胞ベレット：２列目、 スフェロプラスト；３列目、超音波処理スフェロプラストの１００、ＯＯＯＸｇ ペレット；４列目、モノＱカラムによる分画（３２〜３３）のブール；５列目、 ＴＳＫ−２５０カラムによるピーク分画のブール；６列目、天然ＰＥ、Ｍｒ６６ ｋＤａ、分子量マーカーはｋＤａとしてＭ「に関し付記されている。

第３図は、ＩＬ２レセプターを発現するＨＵＴ　−１０２細胞での抗Ｔａｃ　（ Ｆｖ）−ＰＥ４０の細胞毒性の検討結果を示す。ＨＵＴ−１０２細胞における抗 Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０の細胞毒性は（・）抗Ｔ、ａｃ（Ｆｖ）−ＰＥ４０ 　；　（０）抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０＋１０Ｊｚｇ抗Ｔａｃ：（Δ）抗Ｔ ａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０＋１０μｇｏｖＢ３でタンパク質合成Ｇ　ＩＩ　定す ることにより決定された。

第４図は、抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０の競合結合分析について示す。ＨＵＴ −１０２細胞においてＴａｃ抗原と結合するｌ−１２５標識トレ一サー抗Ｔａｃ 抗体による抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０　（ロ）及び天然マウス抗Ｔａｃ抗体 （・）の競合データが水声れている。実線は結合競合をモデル化したコンピュー ター作成の理想曲線である。Ｒｏは競合物質の不存在下におけるトレーサーの結 合／遊離比であり、ＲＯ／２はトレーサー結合に関する５０％阻害点であって、 それから抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０に関して３．５Ｘ１０９Ｍ−１７）結合 アフィニティが、天然抗Ｔａｃに関する９、７Ｘ１０９Ｍ″″ｌと比較して、計 算された。

発明の詳細な説明 本発明による組換え免疫毒素は抗体−ＰＥ４０組換え融合タンパク質からなる。

組換え融合タンパク質は、この融合タンパク質の合成を指示するＤＮＡセグメン トを含んだ発現ベクター又はプラスミドにより産生される。

組成物は、抗体が結合するレセプター又は抗原を有した細胞を殺す上で有効な量 の抗体−ＰＥ４０組換え融合タンパク質及び薬学上許容されるキャリアを含む。

標的細胞毒性を発揮する方法は、死滅される標的細胞を細胞毒性量の抗体−ＰＥ ４０組換え融合タンパク質の組成物と接触させ、上記標的細胞は上記抗体が結合 するレセプター又は抗原を有した細胞であるが、但しその組成物は上記抗体の結 合のためのレセプター又は抗原を欠いた細胞に有意の細胞毒性を与えない（表２ ）。

他にことわらないかぎり、ここで用いられるすべての技術及び科学用語は本発明 が属する当業者にとって普通に理解されるとおりの意味を有する。ここで記載さ れたものと同様の又はそれに相当するいかなる方法及び物質も本発明の実施又は 試験で用いることができるが、ここでは好ましい方法及び物質が記載されている 。以下で記載されたすべての文献が参考のため本明細書に組み込まれる。他にこ とわらないかぎり、ここで用いられる技術は当業者に周知の標準的方法である。

その物質、方法及び例は説明のみのためであって、限定のためではない。

ここで用いられる用語“抗体”とは抗原と結合できる免疫グロブリン分子の一部 を意味する〔ν、Ｅ、Ｐａｕｌ＋ｅｄ、＊”Ｆｔ＋ｎｄｊｌｌｅＪ１ｔｊＬ１　 １１１１ｕｎＯＩＯｇｙ”、ＲａＶｅｎ　Ｐｒｅ８Ｓ、Ｎ、Ｙ、、１９８４．ｐ ｐ。

１３１−１８５参照〕。この定義によれば、用語“抗体°には、完全な免疫グロ ブリン、Ｌ及びＨ鎖可変領域のみを含むＦｖ断片、可変領域及び一部の不変領域 を含むＦａｂ又は（Ｆａｂ）’２断片、一本領抗体（Ｂｉｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、 １９８８゜５ｃｉｅｎｃｅ、２４２．４２４−４２８；Ｈｕｓｔｏｎ　ｅｔ　ａ ｌ、、１９８ｇ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａａａｄ、Ｓｃ１．ＵＳＡ、８５．５８７９−５８８３　）等のような様々な形 の修飾又は変更抗体を含む。抗体は動物（特にマウス又はラット）もしくはヒト 起源であっても、又はキメラ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４．Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υＳＡ、８１゜８８５１−６８５６　）も しくはヒト化［Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６゜Ｎａｔｕｒｅ、３２１， ５２２−５２５及び公開された英国特許出願第８７０７２５２号］であってもよ い。本発明において使用に適した抗体を産生ずる方法は当業者に周知であり、Ｈ ａｒｌｏｖ　＆Ｌａｎｅ、Ａｎｔ１ｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 １９１１８のような文献で記載されている。抗体鎖をコードする遺伝子は当業者 に公知のいかなるクローニング操作によりｃＤＮＡ又はゲノム形でクローン化し てもよい。例えば、Ｍａｎｉａｔｌｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ ｌ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９Ｂ２参 照。ここで用いられる用語“有意の細胞毒性なしに°とは、本発明の融合タンパ ク質がいかなるはっきりとした程度又はいかなる異常なレベルにも非標的細胞の 機能に影響を与えないことを意味する。

組換え抗体−ＰＥ４０融合タンパク質は１本又は２本のポリペプチド鎖から構成 される。一本領融合タンパク質の産生がここで説明されている。二本鎖融合タン パク質を産生ずるためには、アミノ酸リンカ−はｖＨ及びＶ　配列間に挿入され ない。代わりに終結コドンがＶ。

配列後に挿入され、開始コドン及びリポソーム結合配列がｖＬ配列前に挿入され る。本発明のもう１つの態様において、■　及びＶｕ配列は、Ｈ鎖ヒンジドメイ ンと共り に又はそれなしに、一部又は全部のし及びＨ鎖不変領域、例えば全にＬ鎖不変領 域及びＨ鎖不変領域のＣＨ１ドメインによって各々追随されている。ｖ　ＳｖＨ 及びＰＥ４０遺伝子はプラスミドにおいていかなる順序であってもよく、このた めＰＥ４０遺伝子はＬ又はＨ鎖遺伝子いずれかの５′又は３′末端のいずれかに 結合される。当業者であれば、更に修飾、欠失、挿入等が抗体及びＰＥ４０遺伝 子に行われてもよいことを理解するであろう。

特に、欠失又は変更は、標的細胞に対する融合タンパク質の細胞毒性を増加させ るか又は抗体に関する抗原のない細胞に対する非特異的細胞毒性を減少させるた めに、ＰＥ４０で又は抗体遺伝子をＰＥ４０に結合させるリンカ−で行ってもよ い。すべてのこのような組立ては当業者に周知の遺伝子工学方法で行われ（一般 的にＭａｎｌａｔｉｓｅｔ　ａｌ、、同上参照）、様々な臨床的又は生物学的応 用に特に適したものとする異なる性質のアフイニテイ、特異性、安定性及び毒性 を有したタンパク質を産生じてもよい。

０遺伝子は単一プラスミドに含まれている。更に、合成後の組換え抗体−ＰＥ４ ０タンパク質は精製さ杵るまで大腸菌宿主細胞に内在したままである。本発明の もう１つの態様において、Ｖｔ遺伝子及びいずれかのＬ鎖不変領域は１つのプラ スミド上に存在するが、ｖＨ遺伝子、いずれかのＨ鎖不変領域及びＰＥ４０遺伝 子は第二のプラスミド上に存在する。いずれのケースでも、ｖＬ及び／又はＶｕ 遺伝子は細胞から組換え融合タンパク質の分泌を指示するシグナル配列で前置さ れていてよい（Ｂｅｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８．５ｃｉｅｎｃｅ、２４ ０．１０４１−１０４３；５ｋｅｒｒａ＆　Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９８８．５ ｃｉｅｎｃｅ、２４０．１０３８−１０４１）。

本発明の融合タンパク質は大腸菌、他の細菌宿主、酵母並びにＣＯ８，ＣＨＯ１ ＨｅＬａ細胞系及びミエローマ細胞系のような様々なより高等の真核細胞を含め た様。

々な宿主細胞で発現される。組換えタンパク質遺伝子は各宿主に関して適切な発 現コントロール配列に作動可能に結合される。大腸菌の場合、これにはＴ７、ｔ ｒｐ又はλプロモーターのようなプロモーター、リポソーム結合部位、好ましく は転写終結シグナルを含む。真核細胞の場合、コントロール配列にはプロモータ ー、好ましくは免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウィルス等に由 来するエンハンサ−及びポリアデニル化配列を含み、更にスプライスドナー及び アクセプター配列も含む。本発明のプラスミドは、大腸菌の場合塩化カルシウム 形質転換で、哺乳動物細胞の場合リン酸カルシウム処理又は電気ボレーションの ような周知方法で、選択宿主細胞中に移入できる。プラスミドで形質転換された 細胞はａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏ及びｈｙｇ遺伝子のようなプラスミドに含まれる 遺伝子で与えられる抗生物質耐性によって選択できる。

発現されると、組換え融合タンパク質は硫酸アンモニウム沈降、アフィニティ力 ラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含めた当業界の標準操作に 従い精製できる〔一般的にＲ，５ｃｏｐｅｓ、”Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｒｉ ｃａ−ｔｉｏｎ’　、Ｓｐｒｌｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ、Ｙ、（１９８２） 参照〕。少なくとも約９０〜９５％均一率の実質上純粋な組成物が医薬用に好ま しく、９８〜９９％以上の均−率が最も好ましい。

部分的に又は所望の均−率まで精製されると、ポリペプチドは治療に（体外を含 む）又はアッセイ操作を展開及び実施するような他の場合に用いられる〔一般的 にＩｍｍｕｎｏｌｏｇｌｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｖｏｌｓ、Ｉ　ａｎｄ　ＩＩ ルｅｆ’ｋｏｖｉｔｓ　ａｎｄＰｅｒｎｌｓ、ｅｄｓ、、Ａｃａｄｅｍｌｃ　Ｐ ｒｅｓｓ、Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ、Ｎ、Ｙ、（１９γ９　ａｎｄ１９８１）参照〕。

本発明の組換え融合タンパク質及び医薬組成物は、特に非経口投与、即ち皮下、 筋肉内又は静脈内投与に有用好ましくは水性キャリア、に溶解された抗体又はそ のカクテルの溶液である。様々な水性キャリア、例えば水、緩衝液、０．４％塩 水、０．３％グリシン等が使用可能である。これらの溶液は無菌であって、通常 望ましくない物質を含まない。これらの組成物は慣用的な周知の滅菌技術で滅菌 される。組成物はｐＨ調整及び緩衝剤、毒性調整剤等のような大体の生理条件に 必要な薬学上許容される補助物質、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩 化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含んでいてもよい。これらの 処方剤における融合タンパク質の濃度は様々であって、即ち重量で約０．５％以 下、通常的１％又は少なくとも約１％から多くて１５又は２０％までであり、選 択される具体的投与方式に従い液体容量、粘度、体重等に基づき主に選択される 。

このように、筋肉内注射用の典型的医薬組成物は無菌緩衝水１１及び融合タンパ ク質１０Ｂからなる。静脈内注入用の典型的組成物は無菌リンゲル液２５０ｍ１ 及びタンパク質１０＋ｅｇからなる。非経口投与用組成物の実際の製造方法は当 業者に公知又は明白であって、ＲｅｌｉｎｇｔＯｎ’Ｓ　ＰｈａｒｌａＣｅｕｔ ｉｅａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、１５ｔｈ　ｅｄ、、Ｍａｃｋｐｕｂｌｉｓｈｌｎｇ 　Ｃｏ５ｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ（１９８０）のよ うな文献で更に詳細に記載されているが、これは参考のためここに組み込まれる 。

本融合タンパク質又はそのカクテル（即ち他のタンパク質と一緒）を含有した組 成物は、予防及び／又は治療処置のために投与できる。治療適用の場合、組成物 は疾患及びその合併症を治癒又は少なくとも部分的に抑制するために充分な量で 疾患のある患者に投与される。これを果たす上で充分な量は“治療有効量”とし て規定される。この用途に有効な量は疾患の程度及び患者健康の一般的状態に依 存している。

予防適用の場合、本抗体又はそのカクテルを含有した組成物は発病を予防するた め、まだ発病していない患者に投与される。このような量は“予防有効量１とし て規定される。このケースにおける正確な量も患者の健康状態及び一般的免疫レ ベルに依存している。

本組成物の単回又は複数回投薬は患者によって必要とされかつ耐えられる用量及 び頻度に応じて行われる。いかなる場合でも、本組成物は患者を有効に治療する 上で充分な本発明のタンパク質の量を与えるべきである。

本発明の組換え融合タンパク質の様々な用途の中には、タンパク質の毒性作用に より排除されうる特定ヒト細胞起因性の様々な病状が含まれる。１つの好ましい 適用例は、Ｔ及びＢ細胞に起因する移植片対宿主疾患、臓器移植拒絶、Ｉ型糖尿 病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、全身性紅斑性狼癒、重症筋無力症等のよ うな自己免疫症状の治療である。ここで開示された例は例示にすぎない。

他の好ましい適用例は様々なタイプの悪性細胞に起因する癌の治療用である。融 合タンパク質は、インビトロで、いられる。融合タンパク質の抗体部分は所定の 用途に応じて選択される。抗体の標的として機能するＴ細胞の膜上のタンパク質 としてはＣＤ２　（Ｔｌ　１）　、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８がある。標的とし て機能するＢ細胞上で主にみられるタンパク質としてはＣＤ　１０　（ＣＡＬＬ Ａ抗原）、ＣＤ１９及びＣＤ２０がある。ＣＤ４５はリンパ球細胞上に広く存在 しうる標的である。抗体に関するこれら及び他の可能な標的リンパ球抗原はＬｅ ｕｃｏｃｙｔｅＴｙｐｉｎｇ　Ｉｌｌ、Ａ、Ｊ、ＭｃＭｌｃｈｅａｌ、ｅｄ、、 ０ｘｆｏｒｄ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、　１９８７　で記載されてい る。抗体の標的として機能する癌細胞上でみられる抗原としては癌胎児性抗原（ ＣＥ−Ａ）、トランスフェリンレセプター、Ｐ−糖タンパク質、ｃ−ｅｒｂＢ２ 及びＡｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｈ１ｒｄＩｎｔｅｒｎａｔ１ｏｎａ ｌ　Ｃｏｎｆ’ｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　Ｉ’ｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ（Ｓａｎ　Ｄｌｅ ｇｏ、ＣＡ、１９８ｇ）で記載された抗原がある。当業者であれば、更に他のタ イプの細胞で発現される抗原、例えば膜糖タンパク質又は表皮増殖因子レセプタ ー等のような増殖因子もしくはホルモンレセプター、と結合する抗体も選択して よいと理解している。

物質及び方法 下記例は限定ではなく説明のために示されている。

抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０に関する発現プラスミドの構築 ここでｐＶｃ７０１０８と命名されたプラスミドは、開始メチオニンをコードす るＡＴＧ％ＶＬをコードする３１８ｂｐＤＮＡセグメントに４５ｂｐリンカ−で 結合された抗ＴａｃＶＨをコードする３　４８　ｂｐＤ　Ｎ　Ａセグメントを含 むように組立てられ、次いでＶＬはＰＥのアミノ酸２５３−６１３をフードする ＤＮＡセグメントに結合さレタ（第１図）、Ｖ　−Ｖ　−ＩＪシンカ−ＰＥ４０ ）ＩＬ ＤＮＡセグメント及びコードされた抗Ｔａｃ’（Ｆｖ）−ＰＥ４０融合タンパク 質の全配列が表１に示されている。

■　及びＶＬの配列は米国特許出願節１８２．６８２号明細書で示されているが 、これは特に参考のため本明細書に組み込まれる。

第１図ａ及びｂで示されるように、２組のオリゴヌクレオチドが以下のものを作 成するため、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に基づ＜　（Ｐｅｒｋｆｎ　Ｅｌｓ ｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、　ＧｅｎｅＡｍｐ　ｋｉｔを用いた）増幅に用いられた：（ ａ　）　Ｖ　ｎ遺伝子の５′末端におけるＮｄｅ１部位、Ｖｎ　ドメイン及びリ ンカ−の最初のアミノ末端９コドンしかる後Ｋｐｎ１部位（プラスミドｐＨＴａ ｃ２において抗ＴａｃＨ鎖ｃＤＮＡと共にＶＫＯ７３及びＶＫＯ７４を用いる） ； （ｂ）Ｋｐｎ　１部位を有するペプチドリンカ−の７カルボキシ末端コドン、■ 　ドメイン及びＶＬコード遭伝り 子の３′末端におけるＨｉｎｄｌＮ部位（プラスミドｐＬＴａｃ２においてＬ　 ＠　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａと共にＶＫＯ７５及びＶＫＯ７６を用いる）。

ｐＵｃ１８における）：ｃｏＲＩインサートとして抗ＴａｃのＨ及びＬ鎖をコー ドする全鎖長ｃＤＮＡを有したプラスミドが鋳型として用いられた。ＰＣＲ増幅 後、２つの断片、即ち（１）Ｈ鎖の可変ドメイン及びペプチドリンカ−のアミノ 末端部分を含む４１３ｂｐ断片；　（２）ペプチドリンカ−のカルボキシ末端部 分及びＬ鎖の可変ドメインを含む３９６ｂｐ断片が、単離された。４１３Ｊ）断 片はＮｄｅＩ及びＫｐｎｌで切断され、３７７ｂｐ断片を得た。３９６ｂｐ断片 はＫｐｎｌ及びＨｉｎｄｌｌｌで制限され、３４０ｂｐ断片を生じた。それとは 別に、ＰＥ由来ＰＥ４３をコードする遺伝子を有したプラスミドｐ　Ｖ　Ｃ２０ （Ｃｈａｕｄｈａｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ 。

ＵＳＡ、８５：２９Ｈ−２９４３，１９８８）が、Ｎｄｅｌ及びＨｉ　ｎｄｌｌ ｌで制限され、脱リン酸化されて、３．７５Ｋｐ断片を単離した。次いでこれは 、先に単離された３７７ｂｐ及び３４０ｂｐ断片と結合された。得られたプラス ミドｐｖＣ７０１はＴ７プロモーター下で融合遺伝子を含んでいる。

この遺伝子はペプチドリンカ−中に４つの余分な塩基を含む。プラスミドｐＶｃ ７０１はＫｐｎｌで切断され、３′突出部分を除去するためＴ４ＤＮＡポリメラ ーゼで処理されて、単離されたプラスミドｐＶｃ７０１０２０に結合された。ｐ Ｖｃ７０１０２０　（４，４Ｘｂ）　は抗Ｔａｃの可変ドメイン及びＰＥ４３か ら構成される融合タンパク質をコードしている。

ｐＶｃ７０１０２０はＨｉｎｄｌｌｌで制限され、５′突出部分を除去するため Ｓ１ヌクレアーゼで処理され、ＢａｍＨＩで切断され、脱リン酸化されて、３． ６５Ｋｐ断片を単離した。それとは別に、ｐＶｃ７０１０２０はＡｖａｌで切断 され、Ｓ１ヌクレアーゼで処理され、ＢａｍＨＩで切断されて、７５０　ｂｐ断 片を単離した。

３．６５Ｋｐ及び７５０ｂｐ断片は互いに結合されて、プラスミドｐＶｃ７０１ ０８を生シタ。ｐ　Ｖ　Ｃ７０１０８に！、１５アミノ酸リンカ−でＶ　に結合 されたＶ　、及び、Ｌ　Ｈ ＰＥのアミノ酸２５３−６１３に結合されたｖＬをコードする融合遺伝子を有す る。メチオニンコドンはＶｏの５′末端で作成された。

先に示されてように、構築された遺伝子はＴ７プロモーターのコントロール下に ある。プラスミドのコード領域の正確性はＤＮＡ配列決定で確認された（データ 示さず）。

プラスミドｐＶｃ７０１０８の寄託は１９８９年３月３１日付でメリーランド州 ロックビルのＡＴＣＣに受託番号６７９１３として行われた。寄託物は寄託臼か ら３０年間又は寄託サンプルの最終請求日から５年間のいずれか長い期間にわた り生存維持され、それが死滅したならば交換されるべきであり、法律の規定に従 い無制限に本出願による特許権の発行により公に利用される。特許商標局長は請 求により寄託物を入手することになる。

抗Ｔａ　ｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０の精製及び特徴ＩＰＴＯ誘導で、プラスミドｐ ｖｃ７０１０８を有する大腸菌株ＢＬ２１　（スＤＥ３）は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ （１列目、第２図ｂ）で示されるように、多量の約６５ｋＤａのタンパク質を産 生じた。免疫プロットにおいて、６５ｋＤａキメラタンパク質はＰＨに対する抗 体と反応した（データ示さず）。融合タンパク質は超音波処理スフェロプラスト （２列目、第２図ｂ）の１００．ＯＯＯＸｇペレット（３列目、第２図ｂ）に大 部分食まれていた。

このベレットは抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０の製造源として用いられた。塩酸 グアニジン変性しかる後迅速な希釈の技術がキメラタンパク質を溶解かつ復元す るために用いられた（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、１９ｇ１１．Ｎａｔ ｕｒｅ、８３５．８８９−ｓ’ｙ２：　Ｓｉｅｇａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９８ ８．Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃ１．ＤＮＡ。

８５．９７３８−９７４２）。ＤＴＴは変性緩衝液から省略され、復元は１６時 間行われた。復元及び透析後、サンプルはモノＱカラム（ＨＲＩＯ／１０）に３ 　ｍｌ／ｓｉｎで適用された。カラムは緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７ ，６）４０ｍ＋で洗浄され、２００１直線勾配（０〜０．５Ｍ　ＮａＣ１）で展 開された。溶出したタンパク質は２８０ｎ−でモニタ−された。分画（４１）が 集められ、ＨＵＴ−１０２細胞の細胞毒性に関して試験された。５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅのため、サンプルはレムリ（Ｌａｅａｎｌ　１）サンプル緩衝液と共に煮沸さ れ、１０％ゲル上で電気泳動された。モノマー形の融合タンパク質は０．２〜０ ．２２Ｍ　ＮａＣ１で溶出した（第２図す、４列目及び第２図ａ）。高分子量凝 集物は高イオン強度側で溶出された（分画４２−５０、第２図ａ）。更にキメラ タンパク質の精製がＴＳＫ−２５０ゲル濾過カラムで行われ、キメラタンパク質 は６５ｋＤａタンパク質に関して予想された位置で対称ピークとして溶出した（ データ示さず）。ＳＤＳ　−ＰＡＧＥではそのタンパク質が純度９５％以上であ ることを示しく５列目、第２図ｂ）、Ｎ末端アミノ酸配列分析ではそのタンパク 質が予想Ｎ末端配列ｍｅｔ、ｇｉｎ、ｖａｌを有することを示した。約２００μ ｇの高度精製モノマー抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０が誘導前に０．６の０Ｄ８ ５０まで増殖された細胞１１から得られた。

抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０の細胞毒性試験ＨＵＴ−１０２細胞は無血清培地 で２回洗浄され、２４ウエルプレート内の５％牛脂児血清含有ＲＰＭＩＩ６４０ 培地に３×１０５細胞／ウエルでいれられた。様々な希釈率の抗Ｔａｃ　（Ｆｖ ）−ＰＥ４０が０．２％ヒト血清アルブミン含をＰＢＳで調製され、適切なウェ ル−ロイシンで標識され、細胞ペレットのＴＣＡ沈降物中における放射能が測定 された。結果は毒素無添加のコントロールの％として表示される。競合の場合に は１０Ｍｇの抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０゜ 抗Ｔａ　ｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０の競合結合分析トレーサーとしてのｌ−１２５ 標識抗Ｔａｃ（２μＣ１／μｇ）が、結合緩衝液（１０％牛脂児血清、１００μ ｇ／ｌヒトＩｇＧ、０．１％ナトリウムアジド含有ＲＰＭ１１６４０）０．２ｍ ｌ中で、様々な濃度の競合物質とＴａｃ抗原源としての４Ｘ１０５ＨＵＴ−１０ ２細胞と共に、１．　５ｎｇ／アッセイで用いられ、室温（２２−２４℃）で２ 時間混ぜながらインキユベートされた。これらの条件下で、トレーサーの濃度は ５０ＭＭ、Ｔａｃペプチドは５００９Ｍである。遊離トレーサーは計算によると １０９Ｍであり、遊離トレーサーが競合分析の仮定として（抗ＴａｃのＫａに関 して１０１１０１Ｏを用いた場合）１／Ｋａ−１００ｐＭ以下であるという条件 を満足する。

アッセイはコントロールの冷抗Ｔ　ａ、　ｃ抗体と並行して行われ、結合／遊離 トレーサー結合５０％阻害点（Ｒｏ／２）対ｌｏｇ競合物質濃度の曲線シフトが 定量された。

濃度は横座標の真数から得られ、構造体Ｘに関するアフィニティ定数Ｋｘは下記 式からめられた（　Ｂｅｒｚｏｒｓｋｙｅｔ　ａｌ、、ＩＨｌ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｉ ａｍｕｎｏｌ、１８．７５１−７８３）　：（［Ｘ］、、、、−［抗Ｔａｃ］■ ７２）　−１７ＫＸ　−１／Ｋａ上記において［ｘ］１１２はトレーサー結合が Ｒｏ　／　２であるときの競合物質の濃度を示す。抗Ｔａｃとの結合データに関 する標準スカッチャード（Ｓｃａｔｅｈａｒｄ）プロッティングでは、直線のグ ラフ及び９．７×１０９Ｍ−’のＫａを示したが、これは他の研究者により得ら れたものと同等である［Ｒｏｂｂ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４．Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅ ｄ、、１Ｂ０．１Ｉ２Ｂ−１１４６）　、抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０に関す る３、５×１０９Ｍ−１のＫａは前記式から計算された。すべての濃度はヒトＩ ｇＧとの標準曲線に対するブラッドフォード（Ｂｒａｄｒｏｒｄ）タンパク質マ イクロアッセイで測定された。

競合分析の場合、これらの濃度は、横座標に関する結合性タンパク質の濃度を得 るため過剰のＨＵＴ−１０２細胞と共に、放射性同位元素標識抗Ｔａｃ　（Ｆｖ ）−ＰＥ４０　（０，４４）及び放射性同位元素標識抗Ｔａｃ（０，８）との別 々の試験で得られた結合性分画に基づき標準化された。

抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０の選択的細胞毒性抗Ｔａｃ抗体はＨＵＴ−１０２ 細胞に多量に存在するＩＬ−２レセプターのｐ５５サブユニット（Ｔａｃ抗原） と結合することから［Ｌｌｃｈｉｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、、ｌＨｌ、Ｊ。

Ｉｓｍｕｎｏｌ−，１２６，１３９３−１３９７）　、キメラタンパク質は前記 のようにＨＵＴ−１０２細胞に対する細胞毒性に関して最初に試験された。抗Ｔ ａｃ　ＣＦｖ）−ＰＥ４０は２０時間アッセイにおいて、０．　１５ｎｇ／５ｌ （２，３Ｘ　１０−”’Ｍ）のＩＤ５ｏで用量依存的にタンパク質合成を阻害し た（第３図及び表２）。４　ｎｇ／ｇｇ１以上の濃度で、タンパク質合成の完全 阻害があった。数回の特異性コントロールが行われた。過剰の抗Ｔａｃ（１０Ｍ ｇ／ｍｌ）の添加はＨＵＴ−１０２細胞において抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０ の細胞毒性を妨げたが、一方卵巣癌細胞上でみられる抗原に対するコントロール モノクローナル抗体０ｖＢ３はそうでなかツタ（第３図）　。ＨＵＴ１０２より 少数のＩＬ２レセプターを有するもう１つのヒトＴ細胞系Ｃｒ　ｔｌ、２も、２ 　、　７　ｎｇ／ｓｌのＩＤ５ｏで抗Ｔａｃ（Ｆｖ）−ＰＥ４０に対して非常に 感受的であった（表２）。更に、Ｔ細胞系、ＣＥＭ、Ａ４３１、ＫＢ及び０ＶＣ ＡＲ−３を含めたＩＬ２レセプターのない数種のヒト細胞系は、１ｐｇ／ｍｌで あっても抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０により影響されなかった（表２）。

ＰＥ（抗Ｔａｃ−ＰＥ）又はＰＥ４０と化学的に複合化された抗ＴａｃはＨＵＴ 　１０２細胞を死滅させたことが報告された（Ｋｏｎｄｏ　ｅＬ　ａｌ、、１９ ８８．Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｓ、。

２６３．９４７０−９４７５；ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４ ．Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、、７４．９１３８−９７１）。千オニーチル複合体が製造された 場合、抗Ｔａｃ−ＰＥは約１　、　２　ｎｇ／ｍｌのＩＤ５０を有し、同様に製 造された抗Ｔａ　ｃ　−ＰＥ４０は１３　ｎｇ／ｍｌのＩＤを有した。抗Ｔａｃ 　（Ｆｖ）−ＰＥ４０　（６５ｋＤａ）は抗Ｔａｃ−ＰＥの分子量（２１６ｋＤ ａ）の約３０％であるため、本発明のキメラ毒素はモルベースでみて抗Ｔａｃ− ＰＥよりも数倍活性でかつ抗Ｔａｃ−ＰＥ４０よりも著しく活性である。化学的 に製造された抗Ｔａｃ−ＰＥ４０又は組換え融合タンパクｔＩＬ−２−ＰＥ４０ 　［Ｌｏｒｂｅｒｂｏｕｓ−Ｇａｌｓｋｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９８ｇ、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ、Ａｃａｄ　。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５．１９２２−１９２６）よりも約１０倍高い、標的ＨＵＴ １０２細胞に対する抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０の非常に高い活性は予想外で あり、先行技術から予想しえなかった。特に、抗Ｔａｃ（Ｆｖ）抗体はＩＬ−２ に関するＫ　ａ　−１０”Ｍ−’よりも著しく低い、前記のようなＫａ−３，５ ｘ１０９Ｍ−’の完全！Ｌ−２レセプターに対するアフィニティを有するため、 抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０が他のいかなるＩＬ−２−ＰＥ融合タンパク質よ りも細胞毒性であることは予想外である（Ｔｓｕｄｏ　ｅｔａｌ、、１９Ｊ１７ ．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４．５３９４−５３９８　 ）。

競合結合の検討では、抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０に関して３゜５Ｘ１０９Ｍ −’のアフィニティを示したが、これは９．７ｘ１０９Ｍ”で測定された抗Ｔａ ｃの場合と比較して約１／３であった（第４図）。これは抗ウシ成長ホルモンの Ｆｖ構遺体対Ｆａｂ断片に関するアフィニティの１　／　４　［Ｂｌｒｄ　ｅｔ 　ａｌ、、１９８ｇ、５ｃｉｅｎｃｅ、２４２．４２８−４２６）及び抗ジゴキ シンのＦｖ構遺体対抗ジゴキシンのＦａｂ断片に関して１　／　６　（Ｈｏｕｓ ｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８ｇ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ、８５．５８７９−５８８３　）に匹敵しうる。

Ｆｖ結合部位によるアフィニティの相対的保存度は抗ＢＧＨ及び抗ジゴキシン抗 体で観察された場合と比較して抗Ｔａｃの方が明らかに優れている。

要約するに、ここで示されたデータは、抗Ｔａｃ可変領域をコードするｃＤＮＡ と修飾形のシュードモナス外毒素をコードするＤＮＡの断片との融合による大腸 菌内における活性組換え免疫毒素の合成を明らかに証明している。この業績は、 当業者に周知の大腸菌又は他の発現ベクターを用いて他の抗体との同様の活性組 換え免疫毒素の調製をここに可能とさせる。

ここで記載された例及び態様は説明目的のみのためであって、それからみて様々 な修正又は変更が当業者に示唆されかつ本出願の精神及び範囲内並びに請求の範 囲内に含まれることが理解される。

表１：抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０の配列７５０　フ８０ 矢印はＶ　１リンカ−１ＶＬ及びＰＥ４０領域を各４分Ｈ けている。

表２ 様々な細胞系に対する抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）−ＰＥ４０の細胞毒性（ＩＤ５ｏ） 細胞系　抗Ｔａｃ（Ｆｖ）−ＰＥ４０　Ｐ　Ｅｎｇ／ｍｌ　ｎｇ／ｍ１ １（ＵＴ−１０２０，１５１０ ０ＶＣＡＲ−３＞ｔｏｏｏ　ａ。

ＫＢ　＞１０００　１３０ Ａ４３１　）１０００　４ ＯＥＭ　＞１０００　２００ Ｃｒ、Ｉｌ、２　２．７　実施せず 細胞系０ＶＣＡＲ３、ＫＢ及びＡ４３１は毒素添加前日に２４ウエルプレートに ＩＸ１０５７ｍｌで接種した。

ＨＵＴ−１０２及びＣＥＭは２回洗浄して、２４ウエルプレートに３Ｘ１０５／ ｍｌで接種した（第３図参照）。

様々な希釈率の毒素調製物を加え、２０時時間線胞を１．５時間かけて３Ｈ−ロ イシンで標識した。細胞のＴＣＡ沈降物中における放射能を測定した。ＩＤ５ｏ とは毒素無添加コントロールと比較してタンパク質合成を５０％阻害する毒素濃 度である。すべてのアッセイは重複して行われ、３回繰返された。

ＮｏＣｌ　ｊＪ汐　（Ｍ）　（−−−）候え次回〇ｎｍ（−） ＦＩＧ、　２Ｂ １　２　３　４　５　６　ｋＤａ −−−龜−−■−−−一　１．−１１−−６８ＦＩＧ、　３ ０．０１　０．１　１　１０　１００ ＃　ｔ　ｊＪ　Ｂ　（ｎ９／ｍ１） １″″′″１１７１ｍ″′″Ｉ！！ＩＢＩ　（＃ＦＦｍｊｌｌ°“１°°ゝ　（ 至）平成　３　年　１０月　２１日

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．適切な発現ベクター中で粗換え融合タンパク質の合成を指示するＤＮＡセグ メントを含んでなる構築物であって、 上記融合タンパク質が抗体−ＰＥ４０であることを特徴とする構築物。
2. ２．抗体が抗Ｔａｃ（Ｆｖ）である、請求項１に記載の構築物。
3. ３．ＤＮＡセグメントがプラスミド中に含まれる、請求項２に記載の構築物。
4. ４．ＡＴＣＣＮｏ．６７９１３のプラスミドを含んでなる、請求項３に記載の構 築物。
5. ５．請求項１に記載の構築物で形質転換又はトランスフェクトされた、原核又は 真核細胞。
6. ６．ＰＥの少なくとも転位及びＡＤＰリボシル化活性を有する、抗体−ＰＥ４０ 組換え融合タンパク質。
7. ７．タンパク質が単一ポリペプチド鎖を有する、請求項６に記載の融合タンパク 質。
8. ８．抗体が抗Ｔａｃ（Ｆｖ）である、請求項７に記載の融合タンパク質。
9. ９．抗体が結合するレセプター又は抗原を有した細胞を死滅させる上で有効な量 の請求項６に記載の融合タンパク質及び薬学上許容されるキャリアを含んでなる 、組成物。
10. １０．標的細胞毒性を発揮するための方法であって、死滅させようとする標的細 胞を細胞毒性量の請求項９に記載の組成物と接触させ、上記標的細胞は抗体が結 合するレセプター又は抗原を有した細胞であるが、但し組成物は上記抗体の結合 のためのレセプター又は抗原を欠く細胞に有意の細胞毒性がないことを特徴とす る方法。