BR112019013107A2 - anticorpos, molécula de ligação, receptor de antígeno quimérico, vetor de expressão, composição farmacêutica, linfócito, ácido nucleico, célula de hibridoma, método para a produção do anticorpo monoclonal e usos - Google Patents

anticorpos, molécula de ligação, receptor de antígeno quimérico, vetor de expressão, composição farmacêutica, linfócito, ácido nucleico, célula de hibridoma, método para a produção do anticorpo monoclonal e usos Download PDF

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Abstract

a presente invenção refere-se a um anticorpo de camundongo monoclonal produzido pela célula de hibridoma depositada sob o número de acesso iclc, iclc pd no 16001. além disso, a invenção se refere a um anticorpo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões de determinação de complementaridade cdrh1, cdrh2 e cdrh3, e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões de determinação de complementaridade cdrl1, cdrl2 e cdrl3, em que cdrh1, cdrh2, cdrh3, cdrl1, cdrl2 e cdrl3 compreendem as sequências de aminoácido gftfssfgmh, yissgsgnfyyvdtvkg, styyhgsrgamdy, sasssvssmywy, dtskmas e qqwssyppit, respectivamente. em adição, a invenção se refere a anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção
ANTICORPOS, MOLÉCULA DE LIGAÇÃO, RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, VETOR DE EXPRESSÃO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, LINFÓCITO, ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA DE HIBRIDOMA, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DO ANTICORPO MONOCLONAL E USOS
Campo da Invenção [0001] A presente invenção refere-se a um anticorpo de camundongo monoclonal produzido pela célula de hibridoma depositada sob o número de acesso ICLC, ICLC PD n- 16001, anticorpos relacionados e moléculas de ligação e usos destes.
Antecedentes da Invenção [0002] CD43 é uma proteína transmembranar e um marcador de leucócito específico restrito a células da linhagem hematopoiética. No entanto, dentre estas células, CD43 é amplamente expresso na maioria dos componentes das células derivadas de medula óssea e periféricas. A forma do precursor de CD43 migra com um peso molecular aparente de 54 kD. Na sua forma madura, CD43 é fortemente glicosilado tendo um peso molecular entre 115 e 200 kD. Em geral, os timócitos e monócitos CD4+ expressam a forma de 115 kD, enquanto as células T CD4+ e CD8+ ativadas, células B, neutrófilos e plaquetas expressam uma forma de 130 kD. CD43 está envolvido em múltiplas funções, tais como adesão celular, apoptose e migração (Ostberg JR et al. Immunology today. 1998;19:546-50).
[0003] Glicoproteínas, tais como CD43 glicosilado, desempenham um papel importante na sinalização celular, reconhecimento imunológico e interação célula-célula devido a suas ramificações de glicano que conferem variabilidade de estrutura e especificidade de ligação aos ligantes de lectina (Ohtsubo K. et al. Cell 2006; 126, 855-867). As glicoproteínas do tipo mucina são caracterizadas por um alto teor de cadeias de carboidrato O-ligadas (O
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2/42 glicanos), e são secretados ou expressos na membrana de células hematopoiéticas e epiteliais. A biossintese de O-glicano se inicia no aparelho de Golgi com a fixação de N-acetil-galactosamina (GalNAc) aos resíduos de serina ou treonina por um UDP-N-acetil-D-galactosamina: polipeptídeo Nacetilgalactosaminiltransferase (GalNAc-transferase) gerando a estrutura de antigeno Tn de O-glicanos. O alongamento subsequente da ramificação de glicano O-ligado é catalisado por glicosiltransferases específicas de tecido através da adição de outros carboidratos, tais como galactose, fucose e ácido siálico, que resulta na síntese de um arranjo complexo de estruturas de Oglicano que diferem pela natureza e comprimento de cadeias de carboidrato Oligadas (Wopereis S. et al. Clin. Chem 2006; 52, 574-600). Em adição, oligossacarídeos podem ser modificados por sialilação, fucosilação, sulfatação, metilação ou acetilação. O truncamento de estruturas de O-glicano assim como a expressão anormal de O-glicanos específicos ocorre em células cancerígenas, sugerindo que a glicosilação aberrante pode contribuir para a progressão do câncer pela modificação da sinalização celular, adesão e antigenicidade (Hakomori S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002; 99, 10231-10233, Brockhausen I. EMBO Rep. 7 2006; 599-604).
[0004] Os antígenos oncofetais (OAs) são principalmente glicoproteínas e produtos de um ou mais genes que normalmente são altamente expressos somente durante o desenvolvimento fetal, reprimido progressivamente durante a diferenciação e, portanto, não expresso em tecidos adultos. Sua reexpressão em adultos é o resultado da ativação aberrante de genes controlados à medida que ela ocorre em câncer. Os epítopos oncofetais (OEs) são a parte do OA que é reconhecida pelo anticorpo. A identificação de OAs ou epítopos oncofetais específicos (OEs), cuja expressão é confinada ao tecido de câncer, pode não somente servir na detecção de processos oncogênicos precoces, mas mais importantemente, pode ser crucial no desenvolvimento de novas abordagens imunoterapêuticas para o câncer humano.
[0005] O objetivo da presente invenção é prover um anticorpo que permita a
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3/42 detecção de um OE e o desenvolvimento de novas abordagens imunoterapêuticas.
[0006] O problema é solucionado por um anticorpo de acordo com a invenção. Os dados mostrados nos exemplos indicam que, devido ao padrão específico da expressão restrita em tecidos fetais e reexpressão em malignidades, o epitopo reconhecido pelo anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada de acordo com a invenção pode ser considerado um OE. O último representa, portanto, um alvo potencialmente adequado para estratégias imunoterapêuticas inovadoras para o tratamento de câncer humano.
[0007] Adicionalmente, um receptor de antigeno quimérico (CAR) compreendendo o scFv de uma molécula de ligação com base no anticorpo de acordo com a invenção ligado a uma região intracelular compreendendo a cadeia de Οϋ3ζ, a região de sinalização do receptor de células T e os dois domínios coestimulatórios CD28 e 41 BB foi desenvolvido. Os linfócitos CD3+ que expressam o CAR de acordo com a invenção induzem citotoxicidade significativa contra células que expressam o epitopo reconhecido pelo anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada de acordo com a invenção.
[0008] Embora o efeito do anticorpo murino da invenção já tenha sido em parte descrito (Tassone et al., Tissue Antigen, 1994; De Laurentiis et al, Mol Cel Proteomics 2011; Cecco et al, Tissue Antigen, 1998; De Laurentiis et al, Int J Biol Macromol, 2006; Tassone et al, Int J Oncol, 2002; Tassone et al, Anticancer Res, 2002), o anticorpo por si só ou sua sequência assim como o epitopo, ao qual ele se liga, nunca foi tornado disponível ao público.
Sumário da Invenção [0009] Um anticorpo de camundongo produzido pela célula de hibridoma depositada sob ICLC PD n2 16001 é provido. Em adição, um anticorpo, que reconhece o mesmo epitopo que o anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada sob ICLC PD n2 16001 é provido.
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4/42 [0010] A invenção adicionalmente se refere a um anticorpo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões de determinação de complementaridade CDRH1, CDRH2 e CDRH3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões de determinação de complementaridade CDRL1, CDRL2 e CDRL3, em que CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, e CDRL3 compreendem as sequências de aminoácido GFTFSSFGMH, YISSGSGNFYYVDTVKG, STYYHGSRGAMDY, SASSSVSSMYWY, DTSKMAS, e QQWSSYPPIT, respectivamente.
[0011] Preferivelmente, o dito anticorpo é um anticorpo monoclonal.
[0012] Adicionalmente, uma molécula de ligação derivada do anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada sob ICLC PD n2 16001 ou do anticorpo da invenção acima é provido.
[0013] Além disso, um receptor de antigeno quimérico é provido, que compreende uma molécula de ligação de scFv de acordo com a invenção ligada a uma região intracelular compreendendo a cadeia de Οϋ3ζ, a região de sinalização do receptor de células T e aos dois domínios coestimulatórios CD28e41BB.
[0014] Além disso, um vetor de expressão é provido que compreende uma sequência de ácido nucleico, que codifica o receptor de antigeno quimérico de acordo com a invenção, o anticorpo de acordo com a invenção ou a molécula de ligação de acordo com a invenção.
[0015] A invenção adicionalmente provê um linfócito CD3+, um linfócito NK, uma célula assassina induzida por citocina (CIK), um linfócito gama-delta ou uma célula NKT compreendendo o receptor de antigeno quimérico de acordo com a invenção ou o vetor de expressão de acordo com a invenção.
[0016] Uma composição farmacêutica é provida compreendendo o anticorpo de acordo com a invenção ou a molécula de ligação de acordo com a invenção ou o linfócito CD3+, um linfócito NK, uma célula assassina induzida por citocina (CIK), um linfócito gama-delta ou uma célula NKT de acordo com a invenção.
[0017] Um ácido nucleico é provido, que codifica o anticorpo de acordo com a
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5/42 invenção ou a molécula de ligação de acordo com a invenção.
[0018] Uma célula de hibridoma é provida que produz o anticorpo de acordo com a invenção.
[0019] Um método para a produção do anticorpo de acordo com a invenção é provido, que compreende o isolamento do dito anticorpo da célula de hibridoma depositada sob ICLC PD n- 16001.
[0020] Um método para a identificação ou isolamento de células da leucemia linfoblástica aguda de células T, células T de linfoma, células da macroglobulinemia de Waldenstrom ou macrófagos associados a tumor é provido, que compreende o contato de uma amostra de células compreendendo as ditas células com o anticorpo de acordo com a invenção ou com a molécula de ligação de acordo com a invenção.
[0021] Um método para a produção de linfócitos CD3+, linfócitos NK, células assassinas induzidas por citocina (CIK), linfócitos gama-delta ou células NKT que expressam um receptor de antigeno quimérico de acordo com a invenção é provido compreendendo a introdução do vetor de expressão de acordo com a invenção nos ditos linfócitos CD3+, linfócitos NK, células assassinas induzidas por citocina (CIK), linfócitos gama-delta ou células NKT.
Descrição Detalhada da Invenção [0022] Em um primeiro aspecto, a invenção se refere a um anticorpo de camundongo monoclonal produzido pela célula de hibridoma depositada sob ICLC PD n2 16001.
[0023] A célula de hibridoma foi depositada no Centro Biotecnologie Avanzate (CBA), Interlay Cell Line Collection (ICLC), Largo Rosanna, 10, 16132 Genova, Itália sob o número de acesso ICLC PD n2 16001 em 4 de agosto de 2016. O anticorpo foi testado nos exemplos dados abaixo. Como mostrado nos exemplos, o anticorpo se liga a um epítopo sialoglicosilado específico em CD43.
[0024] Neste primeiro aspecto, a invenção adicionalmente se refere a um
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6/42 anticorpo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões de determinação de complementaridade CDRH1, CDRH2 e CDRH3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões de determinação de complementaridade CDRL1, CDRL2 e CDRL3, em que CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 e CDRL3 compreendem as sequências de aminoácido GFTFSSFGMH, YISSGSGNFYYVDTVKG, STYYHGSRGAMDY, SASSSVSSMYWY, DTSKMAS, e QQWSSYPPIT, respectivamente.
[0025] Estas sequências também são dadas em SEQ IDs N- 1 - 6.
[0026] As sequências de CDR mencionadas acima são as sequências de CDR do anticorpo de camundongo monoclonal produzido pela célula de hibridoma depositada sob ICLC PD n2 16001, como determinado por sequenciamento.
[0027] Como usado aqui, o termo “CDR” ou “região de determinação de complementaridade” significa os sítios de combinação de antigeno não contíguos encontrados dentro da região variável de ambos os polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Estas regiões particulares foram descritas por Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) e Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991) e por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) e por MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) onde as definições incluem a sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácido quando comparados uns contra os outros. Os resíduos de aminoácido que abrangem as CDRs, como definido por cada uma das referências citadas acima, são apresentados por comparação. Preferivelmente, o termo “CDR” é uma CDR, como definido por Kabat, com base nas comparações de sequência. CDRH1, CDRH2 e CDRH3 denotam as CDRs de cadeia pesada e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 denotam as CDRs de cadeia leve.
[0028] Este anticorpo monoclonal pode ter sequências framework de quaisquer espécies. Preferivelmente, ele pode ter um framework de camundongo ou humano.
[0029] Como usado aqui, o termo “resíduos de aminoácido framework (FR)” se
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7/42 refere àqueles aminoácidos na região framework de uma cadeia de imunoglobulina. O termo “região framework’ ou “região FR”, como usado aqui, inclui os resíduos de aminoácido que são parte da região variável, mas não são parte das CDRs (por exemplo, usando a definição Kabat de CDRs).
[0030] Os métodos para a produção de um anticorpo monoclonal com as sequências de CDR como mencionado acima são conhecidos na técnica e incluem a introdução das sequências de ácido nucleico que codificam as CDRs nos vetores de expressão adequados que codificam as sequências framework desejadas. Adicionalmente, os métodos são descritos abaixo.
[0031] Em um segundo aspecto, a invenção se refere a um anticorpo que reconhece o mesmo epítopo que o anticorpo de acordo com o primeiro aspecto.
[0032] Tipicamente, e como geralmente conhecido na técnica, um anticorpo é uma proteína que pertence à família de proteína das imunoglobulinas e é composto em suas regiões variáveis de regiões framework e regiões de determinação de complementaridade, como definido acima. Naturalmente, anticorpos são produzidos por células plasmáticas em resposta a um certo antigeno. Em geral, cada anticorpo tem duas imunoglobulinas de cadeia pesada idênticas e duas imunoglobulinas de cadeia leve idênticas. Cada cadeia pesada e cada cadeia leve podem ter uma região variável e uma constante. A região constante de uma cadeia pesada pode ser uma de cinco tipos de cadeias pesadas de Ig de mamífero: α, δ, ε, γ e μ. O tipo da cadeia pesada presente usualmente define a classe (isótipo) do anticorpo: anticorpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente. Similarmente, a região constante de uma cadeia leve pode ser uma de dois tipos de cadeias leves de Ig de mamífero: κ e λ. As regiões variáveis de cadeias pesadas e leves são usualmente feitas de uma combinação única de numerosas sequências de proteína permitindo a ligação a um antigeno particular.
[0033] De acordo com a invenção, o termo “anticorpo” também cobre isoladamente um anticorpo isolado.
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8/42 [0034] Em geral, cada cadeia pesada é conectada a uma das cadeias leves, pelo que as regiões variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve se combinam para formar um dos dois sítios de ligação a antígeno idênticos e suas regiões constantes se combinam para formar a região constante do anticorpo. Adicionalmente, ambos os construtos de uma cadeia pesada e uma cadeia leve podem ser conectados por meio das regiões constantes de suas cadeias pesadas, formando uma molécula na forma de “Y”, pelo que os dois braços descrevem a região variável de ligação a antígeno e a haste descreve a região constante.
[0035] O anticorpo de acordo com o segundo aspecto pode ser um anticorpo completo, significando que ele usualmente compreende uma cadeia pesada de três ou quatro domínios constantes e uma cadeia leve de um domínio constante assim como os respectivos domínios variáveis, pelo que cada domínio pode compreender adicionalmente modificações, tais como mutações, deleções ou inserções que não mudam a estrutura de domínio geral.
[0036] Adicionalmente, o anticorpo de acordo com o segundo aspecto da presente invenção pode formar um homo- ou heterodímero ou um homo- ou heteromultímero, pelo que “dímero” e “multímero” significa que dois e pelo menos três anticorpos, respectivamente, podem se combinar para formar um complexo. O prefixo “homo” significa que um complexo pode ser formado de moléculas de anticorpo idênticas, pelo que o prefixo “hetero” significa que um complexo pode ser formado de diferentes moléculas de anticorpo.
[0037] Em geral, o termo “anticorpo” é destinado a compreender todos os isótipos de imunoglobulina mencionados acima, isto é, o anticorpo pode ser um anticorpo IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM, incluindo qualquer subclasse destes isótipos. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo de IgG, mais preferido o anticorpo é um anticorpo de lgG1. Visto que o anticorpo pode ser expresso e produzido recombinantemente, o anticorpo também pode compreender duas diferentes regiões constantes de cadeias pesadas, por exemplo, uma cadeia pesada de IgG 1 e uma de lgG2 ou cadeias pesadas de diferentes espécies. No
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9/42 entanto, as cadeias pesadas preferivelmente são da mesma espécie. Além disso, o anticorpo pode compreender uma cadeia leve lambda ou uma kappa. [0038] O anticorpo que reconhece o mesmo epítopo que um dos anticorpos do primeiro aspecto da invenção pode ser adicionalmente um anticorpo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões de determinação de complementaridade CDRH1, CDRH2 e CDRH3, e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões de determinação de complementaridade CDRL1, CDRL2 e CDRL3, em que CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, e CDRL3 têm as sequências de aminoácido GFTFSSFGMH, YISSGSGNFYYVDTVKG, STYYHGSRGAMDY, SASSSVSSMYWY, DTSKMAS e QQWSSYPPIT, respectivamente.
[0039] Além disso, o anticorpo que reconhece o mesmo epítopo que um dos anticorpos do primeiro aspecto da invenção pode ser um anticorpo em que as CDRs, em comparação com as sequências mencionadas acima têm pelo menos uma troca de aminoácido conservativa, por exemplo, um aminoácido similar com estrutura química similar e propriedades e/ou função ao aminoácido original.
[0040] O anticorpo que reconhece o mesmo epítopo que um dos anticorpos do primeiro aspecto da invenção também pode ser um anticorpo que tem uma afinidade ou especificidade aumentada ou diminuída em comparação com um dos anticorpos do primeiro aspecto da invenção. Tais anticorpos são prontamente obtidos pelos métodos conhecidos na técnica e adicionalmente descritos aqui abaixo.
[0041] Geralmente, o anticorpo de acordo com o segundo aspecto da invenção pode ter uma sequência, especialmente em suas regiões variáveis, ou seja, pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% (por exemplo, pelo menos 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%) idêntica àquela do anticorpo de camundongo monoclonal produzido pela célula de hibridoma depositada sob ICLC PD n- 16001.
[0042] Usualmente, o anticorpo de acordo com a invenção pode ser um
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10/42 anticorpo monoclonal, um biespecífico ou um multiespecífico. Tais anticorpos são conhecidos na técnica. Como usado no contexto da presente invenção, o termo “monoclonal” pode ser entendido no sentido mais amplo descrevendo anticorpos produzidos por um clone único de linfócitos B ou anticorpos tendo a mesma sequência de aminoácido ou uma similar. O termo “biespecífico”, como usado aqui, pode ser entendido no sentido mais amplo descrevendo anticorpos que interagem com dois epítopos diferentes. O anticorpo biespecífico pode ser derivado de dois anticorpos monoclonais. Opcionalmente, estes dois epítopos diferentes podem ser localizados no mesmo antígeno, mas eles também podem ser localizados em dois antígenos diferentes. O termo “multiespecífico”, como usado aqui, pode ser entendido no sentido amplo descrevendo anticorpos que interagem com três ou mais tipos diferentes de epítopos. Opcionalmente, estes epítopos podem ser localizados no mesmo antígeno ou em dois ou mais antígenos.
[0043] Preferivelmente, o anticorpo de acordo com o aspecto dois da presente invenção é um anticorpo monoclonal. Adicionalmente, o anticorpo de acordo com o aspecto dois da presente invenção preferivelmente é um anticorpo biespecífico ou um multiespecífico.
[0044] Métodos para a produção de anticorpos são bem-conhecidos pelo técnico no assunto. Preferivelmente, anticorpos são produzidos pela fabricação de células de hibridoma. Métodos para a produção de células de hibridoma assim como métodos para a produção de anticorpos com a ajuda de células de hibridoma são bem-conhecidos pelo técnico no assunto. Geralmente, os camundongos são injetados com o antígeno desejado e assassinados após alguns dias a fim de isolar as células do baço que secretam o anticorpo contra o antígeno desejado. Em geral, a fusão destas células do baço que secretam anticorpo com células de mieloma não secretoras imortais resulta em células de hibridoma. Estas células de hibridoma são então usualmente selecionadas e o hibridoma que produz o anticorpo desejado é selecionado. O hibridoma selecionado pode ser então cultivado in vivo ou in vitro e o anticorpo desejado
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11/42 por ser isolado.
[0045] Anticorpos bifuncionais ou biespecíficos podem ter sítios de ligação ao antígeno de especificidades diferentes. Várias formas de anticorpos biespecíficos e sua produção são conhecidos pelo técnico no assunto. Por exemplo, estes incluem BSIgG, que são moléculas de IgG compreendendo duas cadeias pesadas distintas e duas cadeias leves distintas que são secretadas pelos assim chamados “hibridomas híbridos”, e conjugados de heteroanticorpo produzidos pela conjugação química de anticorpos ou fragmentos de anticorpo de especificidades diferentes (Segal DM et al. Current Opin. Immunol. 1999, 11:558-562; Van Spriel AB et al. Immunology Today 2000, 21:391-397).
[0046] Anticorpos biespecíficos podem ser gerados para distribuir células, citotoxinas ou fármacos para sítios específicos. Um uso importante pode ser para distribuir células citotóxicas hospedeiras, tais como células NK ou citotóxicas T para alvos celulares específicos. (P. J. Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 1990, 79: 315). Outro uso importante pode ser a distribuição de proteínas citotóxicas para alvos celulares específicos (V. Raso, T. Griffin, Cancer Res. 1981, 41:2073); S. Honda et al., Cytotechnology, 1990, 4:59). Um uso adicionalmente importante pode ser distribuir fármacos não proteícos anticâncer para alvos celulares específicos (J. Corvalan et al., Inti. J. Cancer Suppl. 1988, 2:22; M. Pimm et al., British J. of Cancer 1990, 61:508). Tais anticorpos biespecíficos podem ser preparados por ligação química cruzada (M. Brennan et al., 1985, Science 229:81), troca de dissulfeto ou a produção de hibridomas híbridos (quadromas). Quadromas podem ser construídos pela fusão de hibridomas que secretam dois tipos diferentes de anticorpos contra dois antígenos diferentes (Milstein and Cuello, Nature, 1983, 305: 537-539).
[0047] O termo “epítopo”, como usado no contexto da presente invenção, pode ser entendido no sentido mais amplo como uma porção de uma molécula CD43 capaz de ser reconhecida por e ligada pelo anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada sob ICLC PD n- 16001 em uma ou mais das regiões de
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12/42 ligação ao antigeno do anticorpo. A parte de um anticorpo que se liga ao epítopo é denominada um parátopo. Em muitos casos, epítopos têm propriedades conformacionais que geram especificamente sítios de ligação para o parátopo.
[0048] Epítopos usualmente consistem em grupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativa tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e geralmente têm características estruturais tridimensionais específicas assim como características de carga específica.
[0049] Adicionalmente, é compreendido e apreciado pelo técnico no assunto o fato de que a interação entre o epítopo e o anticorpo pode ser geralmente com base na estrutura principal do antigeno, isto é, uma sequência contínua de aminoácidos. Usualmente, a interação também pode ser com base na estrutura secundária, a estrutura terciária ou a estrutura quaternária do epítopo assim como as modificações pós-translacionais, tais como a glicosilação. A interação entre o epítopo e o anticorpo pode ser adicionalmente com base na estrutura tridimensional e características da superfície do antigeno resultantes, que podem envolver uma seção descontínua da sequência de aminoácido compreendendo aminoácidos em locais distantes na interação com o anticorpo. [0050] Um anticorpo reconhece “o mesmo epítopo” que o anticorpo de acordo com o primeiro aspecto, quando os dois anticorpos reconhecem epítopos idênticos ou que se sobrepõem estericamente. Em geral, os métodos mais amplamente usados e rápidos para a determinação de quando dois epítopos reconhecem epítopos idênticos ou que se sobrepõem estericamente são ensaios de competição, que usualmente podem ser configurados em todos os números de formatos diferentes, usando antigeno rotulado ou anticorpo rotulado. Por exemplo, o antigeno é imobilizado em uma placa de 96 poços, e a capacidade de anticorpos não rotulados de bloquear a ligação de anticorpos rotulados é medida usando marcadores radioativos ou enzimáticos.
[0051] Um anticorpo que reconhece “o mesmo epítopo” que o anticorpo de acordo com o primeiro aspecto usualmente se refere a um anticorpo que
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13/42 bloqueia a ligação do anticorpo de referência com seu antigeno em um ensaio de competição em 50% ou mais e, por outro lado, o anticorpo de referência usualmente bloqueia a ligação do anticorpo com seu antigeno em um ensaio de competição em 50% ou mais.
[0052] Em geral, o epítopo reconhecido por e ligado pelo anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada sob ICLC PD n- 16001 pode ser identificado por qualquer método de mapeamento de epítopo adequado conhecido na técnica em combinação com o anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada sob ICLC PD n- 16001.
[0053] Exemplos de tal método incluem a triagem de peptideos de comprimentos variáveis derivados de CD43 para a ligação ao anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada sob ICLC PD n2 16001, pelo que o menor fragmento que pode se ligar especificamente ao anticorpo contém usualmente a sequência do epítopo reconhecido pelo anticorpo. Em geral, peptideos CD43 podem ser produzidos sinteticamente ou por digestão proteolítica de CD43. Métodos para a identificação de peptideos que se ligam ao anticorpo são bem-conhecidos pelo técnico no assunto, tais como análise de espectrometria de massa. Em outro exemplo, espectrometria de NMR pode ser usada para identificar resíduos que interagem com um anticorpo da presente invenção. Por exemplo, um peptideo CD43 que foi rotulado uniformemente 15N e 2H pode ser misturado com um anticorpo não rotulado e aqueles aminoácidos no peptideo rotulado que interagem com o anticorpo não rotulado podem ser detectados à medida que muda sua posição dentro dos espectros de NMR. Tipicamente, a diferença entre os dois espectros permite a identificação dos aminoácidos em CD43 que são envolvidos na interação com o anticorpo. Preferivelmente, a análise de espectrometria de massa é usada para a identificação de peptideos que se ligam ao anticorpo.
[0054] De modo exemplar, o epítopo reconhecido por e ligado pelo anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada sob ICLC PD n2 16001 também pode ser identificado por um método compreendendo a amplificação de vários
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14/42 fragmentos de DNA de DNA CD43 por reação em cadeia da polimerase (PCR), integração destes fragmentos em um vetor de expressão compreendendo sua conexão a uma proteína de fusão de histidina e, seguindo a expressão da proteína, detecção do epitopo, por exemplo, por Western Blot.
[0055] Em uma realização preferida, o anticorpo de acordo com aspectos um ou dois reconhece um epitopo compreendendo um GaINAc que é O-ligado a CD43 humano.
[0056] Em um exemplo adicional, a fim de determinar o sítio em CD43 reconhecido por e ligado pelo anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada sob ICLC PD n2 16001, um vetor de expressão clonado com CD43 pode ser introduzido com a mutação por deleção por método de PCR para preparar séries mutantes, tais como a série mutante Escherichia coli (E. coli), que expressam proteínas tendo vários sítios deletados em CD43. Estes mutantes de E. coli podem ser cultivados e induzidos para a expressão. A análise Western blot pode ser realizada usando o lisado celular como um antigeno.
[0057] Métodos adicionais para a identificação do epitopo reconhecido por e ligado pelo anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada sob ICLC PD n2 16001 podem compreender a detecção por meio de imunoensaios, tais como ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA).
[0058] O termo “afinidade”, como usado no contexto da presente invenção, pode ser entendido no sentido mais amplo como a força da interação entre um epitopo e um sítio de ligação ao epitopo de um anticorpo. Métodos para a determinação de um valor absoluto para a afinidade de anticorpo, isto é, a constante de afinidade, são bem-conhecidos pelo técnico no assunto. No entanto, também valores relativos de afinidades de anticorpo podem ser geralmente determinados, isto é, a afinidade de dois anticorpos é comparada sem a determinação de seus valores absolutos. Métodos para a comparação das afinidades de anticorpos são bem-conhecidos pelo técnico no assunto. Por exemplo, a citometria de fluxo pode ser usada, pelo que as células tendo o
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15/42 epítopo desejado podem ser independentemente colocadas em contato com diferentes anticorpos, que são subsequentemente marcados com um anticorpo secundário imunofluorescente. Usualmente, após a detecção com citometria de fluxo, a intensidade dos sinais dos anticorpos pode ser comparada.
[0059] Métodos para a identificação de anticorpos de acordo com o segundo aspecto, que reconhecem o mesmo epítopo que o anticorpo de acordo com o anticorpo do primeiro aspecto, são bem-conhecidos pelo técnico no assunto. Por exemplo, anticorpos de acordo com o segundo aspecto podem ser identificados por exibição de fago com base nas bibliotecas de anticorpo.
[0060] Consequentemente, o anticorpo da invenção que reconhece o mesmo epítopo também pode ser um anticorpo humano.
[0061] Em outra realização preferida, o anticorpo de acordo com o segundo aspecto é um anticorpo quimérico. Em uma realização mais preferida, o anticorpo de acordo com o segundo aspecto é um anticorpo quimérico de acordo com o primeiro aspecto.
[0062] Um anticorpo quimérico é um anticorpo, pelo fato de que pelo menos uma região de uma imunoglobulina de uma espécie é fundida a outra região de uma imunoglobulina de outra espécie por engenharia genética a fim de reduzir sua imunogenicidade (vide, por exemplo, a patente norte-americana N2 4.816.567 e patente norte-americana N2 4.816.397).
[0063] Em outra realização preferida, o anticorpo de acordo com o segundo aspecto é um anticorpo humanizado. Em uma realização mais preferida, o anticorpo de acordo com o segundo aspecto é um anticorpo quimérico ou humanizado de acordo com o anticorpo do primeiro aspecto.
[0064] Em geral, anticorpos humanizados são um tipo particular de anticorpos quiméricos. Por exemplo, anticorpos humanizados podem ser produzidos pelo enxerto do DNA de um anticorpo humano no DNA que codifica o framework do anticorpo de camundongo ou pelo enxerto do DNA de um anticorpo de camundongo no DNA que codifica o framework do anticorpo humano. Preferivelmente, o DNA de um anticorpo humano é enxertado no DNA que
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16/42 codifica o framework do anticorpo de camundongo. Em geral, o enxerto de DNA compreende o enxerto de uma ou mais sequências de DNA no DNA que codifica o framework do anticorpo alvo. Opcionalmente, as regiões variáveis e constantes assim como as cadeias pesadas e leves podem ser parcialmente ou totalmente humanizadas. Preferivelmente, a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve de um anticorpo de camundongo são humanizadas. Mais preferivelmente, a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve de um anticorpo de camundongo são humanizadas pela mudança de uma sequência de DNA que codifica 1 a 50, preferivelmente, 1 a 30, mais preferivelmente 1 a 20 aminoácidos. O DNA enxertado pode compreender geralmente regiões de DNA dos seis loops hipervariáveis que determinam a especificidade do antigeno, também denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDR) ou regiões de DNA não compreendendo uma CDR ou ambos. Preferivelmente, a humanização compreende o enxerto de DNA não compreendendo CDRs.
[0065] Em geral, o construto de DNA resultante pode ser então usado para expressar e produzir anticorpos que são usualmente menos ou não imunogênicos em comparação com o anticorpo parental não humano. Isto inclui a produção de anticorpos modificados tais como anticorpos aglicosilados ou anticorpos afucosilados. Tais métodos são bem-conhecidos na técnica.
[0066] Consequentemente, o anticorpo da invenção que reconhece o mesmo epítopo também pode ser um anticorpo aglicosilado ou um anticorpo afucosilado.
[0067] Em outra realização preferida, o anticorpo monoclonal de acordo com o anticorpo do aspecto dois é capaz de induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) contra o subgrupo EGIL T3 de leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), contra células do linfoma linfoblástico de células T e contra células de macroglobulinemia de Waldenstrom (WM).
[0068] Os linfócitos pertencem ao grupo dos glóbulos brancos e são mediadores de imunidade humoral e mediada pelas células. Existem dois
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17/42 grupos de linfócitos, células B e células T.
[0069] Assim como muitos outros tipos celulares, as células B e T, podem se desenvolver anormalmente em tumores de células B e T. Devido aos numerosos estágios de desenvolvimento de células B e T em desenvolvimento, existem vários tipos de tumores. Ambas, as células B e células T, se originam de células progenitoras linfoides.
[0070] No caso de células B, esta célula progenitora linfoide se desenvolve por meio de muitos estágios de desenvolvimento da célula B cada um compreendendo um certo tipo de célula definível até que uma célula plasmática seja formada. Um destes estágios inclui a assim chamada “célula B secretora de IgM”, que finalmente se desenvolve em uma célula plasmática produtora de anticorpo. Um tumor que se origina de uma “célula B secretora de IgM” é denominada “macroglobulinemia de Waldenstrom” (WM). A WM é uma doença rara, indolente e incurável. Ela é caracterizada pelo acúmulo de medula óssea de células linfoplasmacíticas secretoras de IgM clonais.
[0071] As células T se desenvolvem de células progenitoras linfoides em células T maduras em somente alguns estágios de desenvolvimento. Os tumores podem se desenvolver especialmente a partir de células T maduras ou células progenitoras linfoides, as últimas levando à leucemia linfoblástica aguda de células B ou T, (B-ALL) e (T-ALL), respectivamente. A célula T de fenótipo T-ALL é responsável por cerca de 20% de todos os casos de leucemia linfoblástica aguda e ocorre mais frequentemente em adultos do que em crianças. T-ALL é intimamente relacionada ao linfoma linfoblástico de células T (T-LBL) e o diagnóstico diferencial entre as duas doenças é com base na localização predominante em sítios específicos, tais como medula óssea em TALL ou órgão linfoide secundário em T-LBL. O European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL) classificou T-ALL em quatro subgrupos de acordo com seu imunofenótipo (Bene MC, Leukemia 1995;9:1783):
1) EGIL T1 (pró-), caracterizado por positividade citoplasmática para CD3
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18/42 (cCD3) e expressão superficial de CD7;
2) EGIL T2 (pré-), caracterizado por positividade para cCD3, CD7 e positividade de CD2 ou CD5;
3) EGIL T3 (cortical), caracterizado por positividade para cCD3, CD1a e a presença ou a ausência de CD3 superficial (sCD3); e
4) EGIL T4 (leucemia madura), caracterizado pela positividade para cCD3 e sCD3 e negatividade para CD1a.
[0072] O termo “citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)”, como usado aqui, é a morte de uma célula ligada e marcada por anticorpos por uma célula efetora citotóxica, tal como células assassinas naturais (NK).
[0073] A fim de examinar, quando um anticorpo é capaz de induzir ADCC, o seguinte ensaio pode ser usado. Um ensaio de desgranulação por cocultura de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) de doadores saudáveis, que incluem as células efetoras, com células alvo que expressam o epítopo na presença de diferentes concentrações de anticorpo é realizado. 4 x 104 células alvo são semeadas em placa de fundo redondo de 96 poços e cultivadas por 30 minutos a 37°C, 5% de CO2 na presença de concentrações diferentes de anticorpo (0, 10, 50, 100 e 200 ug/mL) ou controle lgG1. Subsequentemente, 0,4 x 106 de PBMCs (células efetoras fixas (E): células alvo (T) = 10:1) do mesmo doador são adicionados a cada poço com 20 pL/mL de anticorpo monoclonal (mAb) anti-CD107a conjugado à ficoeritrina (PE) (BD) e as células são então incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 3 h. Após 1 h, 6 pg/mL de monensina são adicionados a cada poço (GolgiStop, BD). No final do período de incubação, as células são manchadas como anti-CD56 conjugado à aloficocianina (APC) e anti-CD3 conjugado ao complexo de piperidina clorofila proteína (PerCp) e analisadas em um citômetro de fluxo ATTUNE NxT (THERMO Scientific). Ao detectar as células CD3 7CD567CD107a+, as células NK (CD3 /CD56+) que induzem a lise das células alvo (CD107a+) são medidas. Um aumento de células CD37CD567CD107a+ de acordo com as concentrações de anticorpo crescentes, portanto, confirma 0 potencial de um
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19/42 anticorpo de induzir ADCC. Os dados resultantes permitem projetar abordagens com direcionamento imunológico, que, por exemplo, são uma necessidade urgente e clínica não satisfeita em leucemias linfoblásticas agudas de células T/linfomas linfoblásticos. Métodos adicionais para examinar, quando um anticorpo é capaz de induzir ADCC, também podem ser usados e são bem conhecidos pelo técnico no assunto.
[0074] Em um terceiro aspecto, a invenção se refere a uma molécula de ligação derivada de um anticorpo de acordo com o aspecto um ou aspecto dois.
[0075] De acordo com a invenção, uma molécula de ligação é uma molécula derivada do anticorpo de camundongo monoclonal produzido pela célula de hibridoma depositada sob ICLC PD n2 16001. Preferivelmente, a molécula de ligação é uma imunoglobulina compreendendo molécula, isto é, ela compreende pelo menos um domínio de imunoglobulina (Ig).
[0076] Em uma realização preferida, a molécula de ligação da invenção está sendo selecionada do grupo que consiste em anticorpos de cadeia única. Em uma realização mais preferida, a molécula de ligação está sendo selecionada do grupo que consiste em um fragmento variável de cadeia única (scFv), um multímero de um scFv, tais como um diacorpo, um triacorpo ou um tetracorpo, fragmentos de anticorpo, preferivelmente um Fab, um tandab e um flexicorpo.
[0077] A estrutura de um anticorpo e especialmente a função de suas CDRs são geralmente conhecidas na técnica (Carter PJ. Potent antibody therapeutics by design. Nature Rev. Immunol. 6:343-357, 2006). Fv (scFv) de cadeia única e multímeros destes, tandabs, diacorpos e flexicorpos são em geral formatos de anticorpo padrão conhecidos na técnica, por exemplo, de WO 1988/001649 A1, WO 1993/011161 A1, WO 1999/057150 A2 e EP1293514B1.
[0078] Em um scFv, as duas regiões variáveis de ligação ao antigeno da cadeia leve e pesada (VH Fv e VL Fv) de um anticorpo são em geral conectadas artificialmente por um peptídeo ligante, designado como fragmento variável de cadeia única ou anticorpo de cadeia única (Bird, et al. (1988) Science 242:423
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426; Orlandi, et al (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:3833-3837; Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991)). O sítio de ligação ao antigeno pode ser constituído dos domínios variáveis de cadeias leves e pesadas de um anticorpo monoclonal. Várias investigações mostraram que o fragmento scFv pode ter, de fato, a afinidade de ligação ao antigeno intrínseca total de um sítio de ligação do anticorpo completo.
[0079] No contexto desta invenção, os diacorpos são scFv com duas especificidades de ligação e podem ser monoespecíficos e bivalente ou biespecíficos e bivalentes.
[0080] Tandabs e flexicorpos são adicionalmente formatos de anticorpo que são, por exemplo, definidos em US2007031436 e EP1293514B1, respectivamente.
[0081] Os fragmentos de anticorpo que contêm os idiótipos da proteína podem ser gerados por técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, tais fragmentos incluem, mas não são limitados pelo, fragmento F(ab')2 que pode ser produzido por digestão de pepsina da molécula de anticorpo; O fragmento Fab' que pode ser gerado pela redução das pontes de dissulfeto do fragmento F(ab')2; o fragmento Fab que pode ser gerado pelo tratamento do anticorpo molecular com papaína e um agente redutor; e fragmentos Fv.
[0082] O anticorpo ou molécula de ligação da invenção pode ser adicionalmente ligado a uma substância ativa, preferivelmente uma toxina, uma nanoparticula, uma citocina ou um radionucleotídeo. Tais conjugados de anticorpo são conhecidos na técnica (Wu AM, Senter PD. Nature Biotechnol. 23:1137-1146, 2005, Pastan et al. Annu. Rev. Med. 58:221-237, 2007, WO 1990/012592 A1, WO 2007/030642 A2, WO 2004/067038 A1, WO 2004/003183 A1, US 2005/0074426 A1, WO 1994/004189 A1).
[0083] A invenção adicionalmente se refere, em seu aspecto adicional, a um receptor de antigeno quimérico (CAR) compreendendo uma molécula de ligação do aspecto três ligada a um domínio intracelular preferivelmente compreendendo um ou mais domínios de sinalização.
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21/42 [0084] Preferivelmente, a invenção se refere a um receptor de antigeno quimérico (CAR) compreendendo o scFv da realização preferida da molécula de ligação do aspecto três ligada a uma região intracelular compreendendo a cadeia Οϋ3ζ, a região de sinalização do receptor de células T e aos dois domínios coestimulatórios CD28 e 4-1 BB.
[0085] O CAR de acordo com a invenção é uma ferramenta relevante para o direcionamento de células malignas contendo o epítopo reconhecido e ligado pelo anticorpo monoclonal do aspecto um ou aspecto dois, quando expresso nas células T ou células NK. O termo “receptores de antigeno quiméricos” (CAR), como usado aqui, se refere a receptores sintéticos compreendendo uma porção de direcionamento que é associada com um ou mais domínios de sinalização em uma molécula de fusão única. Em geral, a porção de ligação de um CAR compreende scFv, mas ele também pode compreender outras entidades de ligação. As porções de ligação com base no receptor ou domínios ligantes também foram usadas com sucesso. Os domínios de sinalização para CARs podem ser derivados da região citoplasmática do Οϋ3ζ ou das cadeias gama do receptor Fc, mas também podem ser derivados de outras regiões citoplasmáticas. Os CARs de primeira geração mostraram redirecionar com sucesso a citotoxicidade de células T. Os domínios de sinalização de moléculas coestimulatórias, assim como domínios transmembranares e de articulação foram adicionados para formar CARs de segunda e terceira gerações, levando a alguns ensaios terapêuticos bem-sucedidos em seres humanos, onde as células T poderíam ser redirecionadas contra células malignas que expressam CD19 (Porter DL et al., N Eng J Med, 2011).
[0086] Em um quinto aspecto, a invenção se refere a um vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica o receptor de antigeno quimérico de acordo com o aspecto quatro, o anticorpo de acordo com os aspectos um e dois ou a molécula de ligação de acordo com a molécula de ligação de acordo com o aspecto três.
[0087] Geralmente, os vetores de expressão são plasmideos que são usados
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22/42 para introduzir uma sequência de ácido nucleico desejada, tal como um gene, em uma célula alvo, resultando na transcrição e translação da proteína codificada pela sequência de ácido nucleico, isto é, o receptor de antigeno quimérico, o anticorpo ou a molécula de ligação. Portanto, o vetor de expressão em geral compreende sequências regulatórias, tais como regiões promotoras e intensificadoras, assim como um sítio de poliadenilação a fim de direcionar a transcrição eficiente da sequência de ácido nucleico no vetor de expressão. O vetor de expressão pode compreender adicionalmente as regiões necessárias ou úteis adicionais, tais como um marcador selecionável para a seleção em células eucarióticas ou procarióticas, uma tag de purificação para a purificação da proteína resultante, um sítio de clonagem múltiplo ou uma origem de replicação.
[0088] Usualmente, o vetor de expressão pode ser um vetor viral ou um vetor não viral. Em geral, vários tipos de vetores virais, tais como vetores retrovirais, por exemplo, vetores lentivirais ou adenovirais, ou plasmídeos podem ser usados. Em uma realização preferida, o vetor de expressão de acordo com o aspecto cinco é um vetor viral. Em uma realização mais preferida, o vetor de expressão é um vetor lentiviral.
[0089] Em um sexto aspecto, a invenção se refere a um linfócito CD3+, um linfócito NK, uma célula assassina induzida por citocina (CIK), um linfócito gama-delta, uma célula NKT ou outra célula efetora imunológica compreendendo o antigeno quimérico de acordo com o aspecto quatro ou o vetor de expressão de acordo com o aspecto cinco.
[0090] Geralmente, CD3 é um complexo de quatro cadeias de sinalização associadas ao heterodímero α:β do receptor de células T em um complexo do receptor de células T funcionais. O complexo CD3 é usualmente exigido para a sinalização do receptor de células T. Em geral, o grupo de linfócitos CD3+ contém exclusivamente timócitos e células T. A detecção de células CD3+ pode ser alcançada por, por exemplo, citometria de fluxo.
[0091] Em um sétimo aspecto, a invenção se refere a uma composição
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23/42 farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal de acordo com os aspectos 1 ou 2 ou a molécula de ligação de acordo com o aspecto três ou o linfócito CD3+, o linfócito NK, a célula assassina induzida por citocina (CIK), o linfócito gama-delta, a célula NKT ou a outra célula efetora imunológica de acordo com o aspecto seis.
[0092] O termo “composição farmacêutica”, como usado aqui, pode ser usado intercambiavelmente com o termo “fármaco”.
[0093] O teor do anticorpo, da molécula de ligação ou do linfócito CD3+ na composição farmacêutica não é limitado na medida em que ele é útil para o tratamento ou prevenção, mas contém preferivelmente 0,0000001 - 10% em peso por composição total. Adicionalmente, o anticorpo, a molécula de ligação ou o linfócito CD3+ descritos aqui são preferivelmente empregados em um veículo. A escolha do veículo pode depender da via de administração e concentração do(s) agente(s) ativo(s) e o veículo pode ser na forma de uma composição liofilizada ou uma solução aquosa. Geralmente, uma quantidade apropriada de um sal farmaceuticamente aceitável é usado no veículo para tornar a composição isotônica. Os exemplos do veículo incluem, mas não limitados por, solução fisiológica, solução de Ringer e solução de dextrose. Preferivelmente, excipientes, veículos ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos nas dosagens e concentrações empregadas, incluindo tampões tais como citrato, fosfato e outros ácidos orgânicos; contraíons formadores de sal, por exemplo, polipeptídeos de sódio e potássio; com baixo peso molecular (> 10 resíduos de aminoácido); proteínas, por exemplo, albumina de soro ou gelatina; polímeros hidrofílicos, por exemplo, polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como histidina, glutamina, lisina, asparagina, arginina ou glicina; carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; monossacarídeos; dissacarídeos; outros açúcares, por exemplo, sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; agentes quelantes, por exemplo, EDTA; tensoativos não iônicos, por exemplo, Tween, Pluronics ou polietilenoglicol; antioxidantes incluindo metionina, ácido ascórbico e tocoferol; e/ou conservantes, por exemplo, cloreto
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24/42 de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, por exemplo, metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol). Os veículos adequados e suas formulações são descritos em maiores detalhes em Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985, Mack Publishing Co. A composição também pode conter pelo menos um composto adicionalmente ativo, tal como um agente quimioterapêutico.
[0094] Preferivelmente, o anticorpo, a molécula de ligação, o linfócito CD3+ e/ou o composto ativo são incluídos em uma quantidade eficaz. O termo “quantidade eficaz” se refere a uma quantidade suficiente para induzir uma resposta terapêutica detectável no indivíduo ao quem a composição farmacêutica deve ser administrada.
[0095] Em um oitavo aspecto, a invenção se refere a um ácido nucleico ou polinucleotídeo, que codifica o anticorpo de acordo com os aspectos um ou dois ou a molécula de ligação de acordo com o aspecto três.
[0096] Da mesma forma providos aqui são polinucleotídeos que codificam um anticorpo que são otimizados, por exemplo, por otimização de códon/RNA, substituição com sequências sinal heterólogas e eliminação de elementos de instabilidade de mRNA. Os métodos para gerar ácidos nucleicos otimizados que codificam um anticorpo ou um fragmento destes (por exemplo, cadeia leve, cadeia pesada, domínio VH ou domínio VL) para a expressão recombinante pela introdução de mudanças de códon e/ou eliminação de regiões inibitórias no mRNA podem ser realizados pela adaptação dos métodos de otimização descritos, por exemplo, nas patentes norte-americanas N— 5.965.726; 6.174.666; 6.291.664; 6.414.132; e 6.794.498, adequadamente. Por exemplo, sítios de splice potenciais e elementos de instabilidade (por exemplo, elementos ricos em A/T ou A/U) dentro do RNA podem ser mutados sem alterar os aminoácidos codificados pelas sequências de ácido nucleico para aumentar a estabilidade do RNA para a expressão recombinante. As alterações
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25/42 utilizam a degeneração do código genético, por exemplo, usando um códon alternativo para um aminoácido idêntico. Em algumas realizações, pode ser desejável alterar um ou mais códons para codificar uma mutação conservativa, por exemplo, um aminoácido similar com estrutura química similar e propriedades e/ou função como o aminoácido original. Tais métodos podem aumentar a expressão de um anticorpo ou fragmento destes em pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, ou 100 vezes ou mais em relação à expressão de um anticorpo codificado por polinucleotídeos que não foram otimizados.
[0097] Em certas realizações, uma sequência de polinucleotídeo otimizada que codifica um anticorpo descrito aqui ou um fragmento destes (por exemplo, domínio VL e/ou domínio VH) pode hibridizar um polinucleotídeo antissentido (por exemplo, complementar) de uma sequência de polinucleotídeo não otimizada que codifica um anticorpo descrito aqui ou um fragmento destes (por exemplo, domínio VL e/ou domínio VH). Em realizações específicas, uma sequência de nucleotídeo otimizada que codifica um anticorpo descrito aqui ou um fragmento hibridiza sob altas condições de estringência em polinucleotídeo antissentido de uma sequência de polinucleotídeo não otimizada que codifica um anticorpo descrito aqui ou um fragmento destes. Em uma realização específica, uma sequência de nucleotídeo otimizada que codifica um anticorpo descrito aqui ou um fragmento destes hibridiza sob condições de hibridização de alta estringência, estringência intermediária ou inferior em um polinucleotídeo antissentido de uma sequência de nucleotídeo não otimizada que codifica um anticorpo descrito aqui ou um fragmento destes. As informações referentes às condições de hibridização foram descritas, vide, por exemplo, a publicação do pedido de patente norte-americana N2 US 2005/0048549 (por exemplo, parágrafos 72 - 73).
[0098] Os polinucleotídeos da invenção podem ser obtidos e a sequência de nucleotídeo dos polinucleotídeos determinados, por qualquer método
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26/42 conhecido na técnica. As sequências de nucleotídeo que codificam anticorpos descritos aqui e as versões modificadas destes anticorpos podem ser determinadas usando métodos bem conhecidos na técnica, isto é, códons de nucleotídeo conhecidos por codificar aminoácidos particulares são montados de tal maneira a gerar um ácido nucleico que codifica o anticorpo. Tal polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos sintetizados quimicamente (por exemplo, como descrito em Kutmeier G et al., (1994), BioTechniques 17: 242-6), que, em suma, envolve a síntese de oligonucleotídeos de sobreposição contendo porções da sequência que codifica o anticorpo, anelamento e ligação daqueles oligonucleotídeos e a seguir amplificação dos oligonucleotídeos ligados por PCR.
[0099] Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo descrito aqui pode ser gerado de ácido nucleico de uma fonte adequada (por exemplo, um hibridoma) usando métodos bem-conhecidos na técnica (por exemplo, PCR e outros métodos de clonagem molecular). Por exemplo, a amplificação de PCR usando iniciadores sintéticos hibridizáveis nas extremidades 3’ e 5’ de uma sequência conhecida pode ser realizada usando DNA genômico obtido de células de hibridoma que produzem o anticorpo de interesse. Tais métodos de amplificação de PCR podem ser usados para obter ácidos nucleicos compreendendo a sequência que codifica a cadeia leve e/ou cadeia pesada de um anticorpo. Tais métodos de amplificação de PCR podem ser usados para obter ácidos nucleicos compreendendo a sequência que codifica a região de cadeia leve variável e/ou a região de cadeia pesada variável de um anticorpo. Os ácidos nucleicos amplificados podem ser clonados em vetores para a expressão em células hospedeiras e para a clonagem adicional, por exemplo, para gerar anticorpos quiméricos e humanizados.
[0100] Se um clone contendo um ácido nucleico que codifica um anticorpo particular não estiver disponível, mas a sequência da molécula do anticorpo é conhecida, um ácido nucleico que codifica a imunoglobulina pode ser quimicamente sintetizado ou obtido de uma fonte adequada (por exemplo, uma
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27/42 biblioteca de cDNA de anticorpo ou uma biblioteca de cDNA gerada de, ou ácido nucleico, preferivelmente poli A+ RNA, forma isolada de, qualquer tecido ou células que expressam o anticorpo, tais como células de hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo descrito aqui) por amplificação de PCR usando iniciadores sintéticos hibridizáveis nas extremidades 3’ e 5’ da sequência ou por clonagem usando uma sonda de oligonucleotídeo específica para a sequência genética particular para identificar, por exemplo, um clone de cDNA a partir de uma biblioteca de cDNA que codifica o anticorpo. Os ácidos nucleicos amplificados gerados por PCR podem ser então clonados em vetores de clonagem replicáveis usando qualquer método bem conhecido na técnica. [0101] O DNA que codifica os anticorpos da invenção descritos aqui pode ser prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves dos anticorpos). As células de hibridoma podem servir como uma fonte de tal DNA. Uma vez isoladas, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras, tais como células E. coli, células COS símias, células do ovário de hamster chinês (CHO) (por exemplo, células de CHO do CHO GS System™ (Lonza)), ou células de mieloma que não produzem de outra forma proteína de imunoglobulina, para obter a síntese dos anticorpos nas células hospedeiras recombinantes.
[0102] Para gerar anticorpos totais, os iniciadores de PCR incluindo sequências de nucleotideo VH ou VL, um sítio de restrição e uma sequência de flanqueamento para proteger o sítio de restrição podem ser usados para amplificar as sequências VH ou VL em clones de scFv ou outros clones. Utilizando técnicas de clonagem conhecidas pelos técnicos no assunto, os domínios de VH amplificados por PCR podem ser clonados em vetores que expressam uma região constante de cadeia pesada, por exemplo, a região constante gama 4 humana e os domínios de VL amplificados por PCR podem ser clonados em vetores que expressam uma região constante de cadeia leve,
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28/42 por exemplo, regiões constantes kappa ou lambda humanas. Em certas realizações, os vetores para expressar os domínios VH ou VL compreendem um promotor, um sinal de secreção, um sítio de clonagem para a região variável, domínios constantes e um marcador de seleção tal como neomicina. Os domínios VH e VL também podem ser clonados em um vetor que expressa as regiões constantes necessárias. Os vetores de conversão de cadeia pesada e vetores de conversão de cadeia leve são então cotransfectados em linhagens celulares para gerar linhagens celulares estáveis ou transientes que expressam anticorpos de comprimento total, por exemplo, IgG, usando técnicas conhecidas pelos técnicos no assunto.
[0103] O DNA também pode ser modificado, por exemplo, pela substituição da sequência de codificação pelos domínios constantes de cadeia pesada e leve humanos no lugar das sequências de murino ou pela união covalente à sequência de codificação de imunoglobulina de toda ou parte da sequência de codificação para um polipeptídeo que não a imunoglobulina.
[0104] A mutagênese dirigida ao local ou de alta densidade da região variável ou outros métodos de mutagênese podem ser usados para otimizar especificidade, afinidade etc. de um anticorpo monoclonal. Especialmente, estratégias de maturação da afinidade e estratégias de embaralhamento da cadeia (Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783) são conhecidos na técnica e podem ser empregados para gerar anticorpos humanos de alta afinidade.
[0105] Em um nono aspecto, a invenção se refere a uma célula de hibridoma que produz o anticorpo monoclonal de acordo com o anticorpo dos aspectos um ou dois.
[0106] Em um décimo aspecto, a invenção se refere ao hibridoma depositado sob ICLC PD n2 16001.
[0107] Em um décimo primeiro aspecto, a invenção se refere a um método para a produção do anticorpo monoclonal de acordo com os aspectos um ou dois, o dito método compreendendo o isolamento do dito anticorpo a partir da
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29/42 célula de hibridoma depositado sob ICLC PD n2 16001.
[0108] Em um décimo segundo aspecto, a invenção se refere a um método para a identificação ou isolamento de células da leucemia linfoblástica aguda de células T, células T de linfoma, células da macroglobulinemia de Waldenstrom ou macrófagos associados a tumor, compreendendo o contato de uma amostra de células compreendendo as ditas células com o anticorpo monoclonal de acordo com os aspectos um ou dois ou com a molécula de ligação de acordo com o aspecto três.
[0109] Em geral, macrófagos são as células não malignas mais representadas no microambiente tumoral. Estes macrófagos associados ao tumor (TAM) são considerados por adquirir um fenótipo inflamatório pró-tumoral e supressor imunológico e para favorecer a quimiorresistência, angiogênese, motilidade celular e intra/extravasamento. Portanto, o direcionamento de TAM pode representar uma nova opção clínica terapêutica e ainda não explorada para melhorar a eficácia de tratamentos anticâncer atuais.
[0110] Métodos para a identificação ou isolamento de células específicas, tais como células da leucemia linfoblástica aguda de células T, células T de linfoma, células da macroglobulinemia de Waldenstrom ou macrófagos associados a tumor, com base nos anticorpos ou moléculas de ligação em geral são bem-conhecidos pelo técnico no assunto, tais como métodos com base em classificação de células fluorescentes por citometria de fluxo, isolamento das células magnéticas ou classificação das células únicas, por exemplo, por classificadores de células.
[0111] Em um décimo terceiro aspecto, a invenção se refere a um método para a produção de linfócitos CD3+, linfócito NK, as células assassinas induzidas por citocina (CIK), linfócitos gama-delta, células NKT ou as outras células efetoras imunológicas que expressam um receptor de antígeno quimérico de acordo com o receptor de antígeno quimérico do aspecto quatro compreendendo a introdução do vetor de expressão de acordo com o vetor de expressão do aspecto cinco nos ditos linfócitos CD3+, linfócito NK, as células assassinas
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30/42 induzidas por citocina (CIK), linfócitos gama-delta, células NKT ou as outras células efetoras imunológicas.
[0112] Isto também inclui a possibilidade de produzir uma célula única ou introduzir o vetor de expressão em uma célula única.
[0113] Em um décimo quarto aspecto, a invenção se refere a um método para a identificação ou isolamento de linfócitos T CD45+, CD3+, CD8', CD127+, CCR7+, compreendendo o contato de uma amostra de células compreendendo os ditos linfócitos T com o anticorpo de acordo com os aspectos 1 ou 2 ou com a molécula de ligação de acordo com o aspecto três.
[0114] Uma realização preferida é o anticorpo de acordo com o anticorpo dos aspectos um ou dois, a molécula de ligação de acordo com o aspecto três, o vetor de expressão de acordo com o aspecto cinco, o linfócito CD3+, o linfócito NK, a célula assassina induzida por citocina (CIK), o linfócito gama-delta, a célula NKT ou a outra célula efetora imunológica de acordo com o aspecto seis ou a composição farmacêutica de acordo com o aspecto sete para o uso em um método para o tratamento de leucemia linfoblástica aguda de células T ou macroglobulinemia de Waldenstrom.
[0115] Em adição, da mesma forma, outras malignidades poderíam ser tratadas em que as células expressam o epitopo reconhecido pelo anticorpo do aspecto 1 e 2 da invenção.
[0116] Uma realização preferida adicional é o anticorpo de acordo com os aspectos um ou dois ou a molécula de ligação de acordo com o aspecto três para o uso em um método para a identificação ou isolamento de linfócitos T CD45+, CD3+, CD8’, CD127+, CCR7+.
[0117] Outra realização preferida é o anticorpo de acordo com o anticorpo dos aspectos um ou dois ou a molécula de ligação de acordo com o aspecto três para o uso em um método para o isolamento ou identificação de células da leucemia linfoblástica aguda de células T, células T de linfoma, células da macroglobulinemia de Waldenstrom ou macrófagos associados a tumor.
[0118] Uma realização preferida adicional é o anticorpo de acordo com o
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31/42 anticorpo dos aspectos um ou dois ou a molécula de ligação de acordo com o aspecto três para o uso em um método para o diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda de células T ou macroglobulinemia de Waldenstrom.
[0119] Em adição, da mesma forma, outras malignidades poderíam ser diagnosticadas em que as células expressam o epítopo reconhecido pelo anticorpo do aspecto 1 e 2 da invenção.
[0120] A seguir, a invenção é adicionalmente descrita pelas figuras e exemplos, que são destinados a explicar, mas não limitar a invenção.
Breve Descrição das Figuras [0121] Figura 1: Expressão do epítopo do anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada de acordo com a invenção em células mononucleares sanguíneas periféricas de um painel de doadores saudáveis e comparação com um anticorpo de detecção de CD43 da técnica anterior.
[0122] O gráfico de dispersão superior apresenta os dados obtidos por citometria de fluxo. O eixo x apresenta a dispersão para frente detectada (FSC), o eixo y descreve a dispersão lateral (SSC). Cada ponto corresponde a uma célula.
[0123] O histograma abaixo descreve no eixo x a intensidade de sinal de ficoeritrina. O eixo y se refere às intensidades de sinal para a intensidade máxima de sinal da amostra não manchada como sendo 100%. A curva não preenchida representa o controle não manchado, a curva preenchida com faixas horizontais representa as células manchadas de lgG1 misturadas (isto é, o controle negativo), a curva preenchida com faixas cruzadas representa as células manchadas UN1 mAb e a curva preenchida com faixas diagonais representa as células manchadas CD43).
[0124] Figura 2: A população celular reconhecida pelo anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada de acordo com a invenção.
[0125] A Figura 2 mostra quatro gráficos de dispersão. Os dois gráficos de dispersão à esquerda pertencem aos linfócitos. Os dois gráficos de dispersão à
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32/42 direita são de linfócitos detectados pelo anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada de acordo com a invenção.
[0126] Nos dois gráficos de dispersão no topo, o eixo x representa a intensidade de sinal de CD4, enquanto o eixo y descreva a intensidade de sinal de CD8. Nos dois gráficos de dispersão no fundo, o eixo x representa a intensidade de sinal de CD45ro e o eixo y representa a intensidade de sinal de CCR7.
[0127] A Figura 3 mostra dois histogramas. O histograma superior apresenta a expressão do epítopo UN1 detectado pelo anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada de acordo com a invenção (mAb UN1) em linhagem celular BCWM.1. O histograma no fundo apresenta a expressão de UN1 em linhagem celular MWCL.1. A curva não preenchida representa o controle não manchado, a curva preenchida com faixas horizontais representa as células manchadas mAb secundárias, a curva preenchida com faixas verticais representa as células manchadas misturadas mais as secundárias IgG e a curva preenchida com faixas diagonais representa as células manchadas por mAb UN1.
[0128] Figura 4: macrófagos associados ao tumor (TAM) reconhecidos pelo anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada de acordo com a invenção. As setas brancas indicam que TAM se infiltra em um espécime de carcinoma colorretal.
[0129] Figura 5: Macrófagos derivados de THP1 manchados com: lgG1 de controle na ausência de células tumorais (primeira fileira), UMG1-CH (anticorpo quimérico de acordo com o aspecto 2 desta invenção, onde a região Fc de murino original foi substituída com uma região Fc de lgG1 totalmente humana região Fc) na ausência de células tumorais (segunda fileira) e UMG1-CH na presença de linhagem de células cancerígenas pancreáticas PANC1 (terceira fileira e particular à esquerda). A primeira coluna representa o manchamento com DAPI, a segunda coluna o anticorpo mais anticorpo secundário rotulado com alexa-flúor 488 e a terceira coluna representa a imagem superimposta.
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33/42 [0130] Figura 6: Resultados do ensaio de desgranulação para avaliar ADCC em HPB-ALL (diagrama esquerdo) e linhagens celulares H9 (diagrama direito). Os números no eixo x representam as amostras diferentes, significando: nenhum alvo (1), E+T (2), Controle negativo (NC) 200 pg/mL (3), UMG1-CH 10 pg/mL (4), UMG1-CH 50 pg/mL (5), UMG1-CH 100 pg/mL (6), UMG1-CH 200 pg/mL (7), Controle positivo (PC) 200 pg/ml (8). O eixo y representa a porcentagem de células NK CD107a+ afetadas por ADCC relacionada ao número inteiro de células NK CD107a+testadas por amostra.
[0131] Figura 7: Resultados do ensaio de desgranulação para avaliar ADCC em linhagem celular BCWM.1. Os números no eixo x representam as diferentes amostras. A numeração é de acordo com aquela da Figura 6. O eixo y representa a porcentagem de células NK CD107a+ afetadas por ADCC relacionada ao número inteiro de células NK CD107a+ testadas por amostra.
[0132] Figura 8: Linfócitos que expressam CD3+ (CAR-T) foram capazes de liberar quantidade significativamente maior de Interferon gama (IFNy) na presença de células H9. O eixo y reporta a concentração de IFNy expressa em ng/mL. O eixo x reporta: células T não transduzidas (1), células T transduzidas com um CAR de controle (2) e células T transduzidas com CAR UMG-1 (3).
[0133] Figura 9: CAR-T foram capazes de liberar quantidade significativamente maior de interleucina 2 (IL-2) na presença de células H9. O eixo y representa a concentração de IL2 expressa em ng/mL. O eixo x reporta: células T não transduzidas (1), células T transduzidas com um CAR de controle (2) e células T transduzidas com CAR UMG-1 (3).
[0134] Figura 10: CAR-T foram capazes de induzir o assassinato seletivo de células H9. O eixo y reporta a razão de células mortas/vivas. O eixo x reporta: H9 sozinho (1), H9 na presença de células T não transduzidas (2), H9 na presença de células T transduzidas com um CAR de controle (3) e H9 na presença de células T transduzidas com CAR UMG-1 (4).
[0135] Figura 11: Esta figura mostra curvas de volume do tumor de um experimento in vivo comparando uma lgG1 de controle versus a versão
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34/42 humanizada de UN1-mAb (h-UN1) e a versão afucosilada de UN1-mAb (a-hUN1).
Exemplos [0136] Os seguintes exemplos são providos para o propósito de ilustrar a invenção, mas não devem ser interpretados como limitando a invenção. Os exemplos compreendem recursos técnicos e será apreciado o fato de que a invenção também se refere a quaisquer combinações dos recursos técnicos apresentados nesta seção exemplificativa.
Exemplo 1 [0137] A expressão do epítopo do anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada de acordo com a invenção sobre células mononucleares sanguíneas periféricas de um painel de doadores saudáveis e comparação com o anticorpo de detecção de CD43 da técnica anterior.
[0138] Primeiro, as células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) de doadores saudáveis diferentes foram obtidas por separação de gradiente Ficoll. Subsequentemente, as células foram semeadas em tubos de 5 mL e manchadas com 1 pg/mL de mAb produzido pela célula de hibridoma depositada sob o número de acesso ICLC, ICLC PD n2 16001 (mAb UN1) ou 1 pg/mL de um anticorpo de lgG1 de murino misturado em 100 pL de solução de ligação (solução fisiológica tamponada com fosfato (PBS) + 0,5% de soro bovino fetal (FBS)) e incubadas a 4°C por 30 minutos. As células foram então lavadas 2 vezes em solução de ligação e manchadas com um anticorpo secundário conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC) a 4°C no escuro por 30 minutos. Subsequentemente, as células foram lavadas 2 vezes em solução de ligação e adquiridas em um citômetro de fluxo ATTUNE NxT (THERMO Scientific). Um tubo para cada doador foi deixado não manchado e um tubo para cada doador foi manchado com o anticorpo secundário conjugado a FITC somente. Em geral, o anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada de acordo com a invenção foi capaz de reconhecer uma
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35/42 subpopulação de linfócito variável (faixa: 0 -15%) de doadores diferentes. Além disso, ela não mostrou qualquer reatividade com todas as outras populações celulares dentro das PBMCs, incluindo células derivadas mieloides, que, portanto, foram negativas para a expressão do respectivo antigeno (vide a Figura 1, topo).
[0139] Em contraste, quando foram testadas as mesmas PBMCs para a expressão de CD43 pelo uso de um clone comercial (S7 de Beckton Dickinson), verificou-se que todos os linfócitos e células mieloides eram positivas (vide a Figura 1, fundo).
[0140] Consequentemente, o anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada de acordo com a invenção exibe um padrão de reatividade restrito específico e propriedades que os anticorpos contra CD43 já existentes não têm.
Exemplo 2 [0141] A população celular reconhecida pelo anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada de acordo com a invenção.
[0142] Para caracterizar a subpopulação de linfócito detectada pelo anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada de acordo com a invenção, foi realizada uma classificação imune-magnética dos respectivos linfócitos (Easysep do-it-yourself, Stemcell technologies). Em suma, 15 pg do anticorpo foram misturados com os componentes providos pelo fabricante para obter uma solução pronta para a separação imunomagnética. Esta solução foi adicionada a PBMCs de 3 doadores diferentes tendo pelo menos 10% de linfócitos detectados pelo anticorpo, após o bloqueio FcR, e as células foram incubadas à temperatura ambiente (r.t.) por 15 minutos. Subsequentemente, nanoparticulas magnéticas EasySep® foram adicionadas à solução e as células foram incubadas por adicionalmente 10 minutos a r.t. A solução foi então colocada em um ímã e as células não ligadas foram removidas. As células detectadas pelo anticorpo de acordo com a invenção foram quase todas linfócitos T CD45+CD3+CD4+CD8 CD127+CCR7+com a maioria deles CD45ro'
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36/42 (vide a Figura 2 e Tabela 1).
Tabela 1: Marcador de células positivas para antígeno UN1
MARCADOR +/-
CD45 +
CD3 +
CD4 +
CD8 -
CD127 +
CCR7 +
CD45ra +
CD56 -
Exemplo 3 [0143] O anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada de acordo com a invenção (mAb UN1) reconhece linhagens celulares T-ALL e macroglobulinemia de Waldenstrom.
[0144] Várias linhagens de células cancerígenas (Tabela 2) foram avaliadas para a expressão de UN1 (MM: mieloma múltiplo). Em suma, as células foram semeadas em tubos de 5 mL e manchadas com 1 pg/mL de mAb UN1 ou 1 pg/mL de um anticorpo de lgG1 de murino misturado em 100 pL de solução de ligação (solução fisiológica tamponada com fosfato (PBS) + 0,5% de soro bovino fetal (FBS)) e incubadas a 4°C por 30 minutos. As células foram então lavadas 2 vezes em solução de ligação e manchadas com um anticorpo secundário conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC) a 4°C no escuro por 30 minutos. Subsequentemente, as células foram lavadas 2 vezes em solução de ligação e adquiridas em um citômetro de fluxo ATTUNE NxT (THERMO Scientific). Um tubo para cada linhagem celular foi deixado não manchado e um tubo para cada linhagem celular foi manchado com o anticorpo secundário conjugado a FITC somente. Foi observado que as linhagens celulares T-ALL pertencentes à classificação EGIL T3 e macroglobulinemia de Waldenstrom (Figura 3) foram todos positivos para a expressão de UN1.
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Tabela 2: Expressão de UN1 de linhagens de células cancerígenas.
Linhagens celulares Tipo de câncer UN1 +/-
H929 MM -
AMO MM -
U266 MM -
KMS11 MM -
8226 MM -
BCWM.1 WM +
MWCL.1 WM +
H9 linfoma T +
HPB-ALL T-ALL +
MOLT-4 T-ALL +
JURKAT T-ALL -
CEM T-ALL +/-
HSB2 T-ALL -
Thp1 Leucemia monocítica -
MOJ Glioblastoma -
SKMEL Melanoma -
HCC Mama -
MCF-7 Mama -
5637 Bexiga -
CAPAN 1 Pancreático -
BXPC3 Pancreático -
Exemplo 4 [0145] O anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada de acordo com a invenção (mAb UN1) reconhece macrófagos associados a tumor.
[0146] Como já descrito, CD43 é um marcador de leucócito específico geralmente restrito a células diferentes da linhagem hematopoiética. Verificou
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38/42 se que o epítopo específico ligado por mAb UN1 e na isoforma CD43 é altamente expresso por macrófagos associados a tumor (TAM).
[0147] Pela avaliação dos espécimes de diferentes tipos de câncer através da imuno-histoquímica (Tabela 3, Figura 4), observou-se que macrófagos UN1 + são um componente com alta infiltração da maioria de tumores, com um alto grau de infiltração específico e particular em câncer pancreático e ovariano.
[0148] Além disso, ele foi avaliado em um modelo de diferenciação de macrófagos sobre quando a expressão de UN1 muda na presença ou ausência de células cancerígenas cocultivadas.
[0149] Para este propósito, células de leucemia monocítica THP1 foram usadas, que, como mostrado anteriormente, não expressam UN1. Para obter macrófagos MO não polarizados humanos diferenciados (THP1-M), estas células foram cultivadas por 48 horas em meio apropriado completo na presença de 50 ng/mL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). Os meios foram então substituídos com meio fresco sem PMA. Nesta etapa, em poços selecionados, a linhagem de células cancerígenas pancreáticas PANC1 em uma razão 1:1 por 48 horas foi adicionada. Todas as células foram então preparadas para a análise de imunofluorescência. Em suma, após a fixação, THP1-M foram manchadas com UMG1-CH ou controle de lgG1 humano e incubados a 4°C durante a noite. Um mAb secundário anti-humano de FITC foi então adicionado às células por 2 horas. Após a lavagem, o meio de montagem antidesvanecimento com DAPI (Vectashield, Vectorlabs) foi adicionado às células e lamelas acabadas para a leitura.
[0150] Como mostrado na Figura 5 à direita, os macrófagos derivados de THP1 manchados com lgG1 de controle foram completamente negativos, enquanto aqueles manchados com UMG1-CH foram fracamente positivos. De modo interessante, na presença de PANC1, macrófagos derivados de THP1 se tornaram brilhantes para a expressão de UN1. Um aspecto particular da interação entre macrófagos derivados de THP1 (seta branca) e PANC1 (seta vermelha) é mostrado (Figura 5, à esquerda). Estas descobertas demonstram
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39/42 que o epítopo específico de UN1 é significativamente suprarregulado quando macrófagos são cocultivados e interagem com células cancerígenas dentro de um microambiente tumoral reconstituído. Esta suprarregulação é relevante por si só como alvo bem representado para abordagens terapêuticas focalizadas para purga de macrófago associado a tumor. Além deste potencial relevante como ferramenta terapêutica, mAb UN1, também deve prover utilidade para a detecção, análise de papel prognóstico e estudos preditivos.
Tabela 3: Infiltração de TAM UN1 + em vários tumores
Tipo de câncer Infiltração de TAM UN1 + (+: baixo; ++: médio; +++: alto)
Linfoma de Hodgkin IIIIIBIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
Linfoma não de Hodgkin ++
Plasmacitoma i β
Câncer colorretal +
Câncer pancreático
Câncer pulmonar ++
Câncer da próstata
Câncer de mama ++
Câncer ovariano
Câncer de bexiga ++
Melanoma
Exemplo 5 [0151] O mAb quimérico UMG1-CH (de acordo com o aspecto 2 desta invenção) é uma ferramenta imunoterapêutica ativa para leucemias linfoblásticas agudas de células T/linfomas linfoblásticos.
[0152] Para determinar a atividade potencial de mAb UMG1-CH como ferramenta imunoterapêutica, sua capacidade de induzir citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) foi avaliada primeiro. Com este fim, um ensaio de desgranulação por cocultura de PBMCs a partir de doadores saudáveis (células efetoras) com linhagens celulares HPB-ALL ou H9 T-ALL (células alvo) foi realizado na presença de concentração diferente de mAb UMG1-CH como a seguir:
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40/42 [0153] 4 x 104 células alvo foram semeadas em placa de fundo redondo com 96 poços e cultivadas por 30 minutos a 37°C, 5% de CO2 na presença de concentrações diferentes de mAb UMG1-CH (0, 10, 50, 100, 200 pg/mL) ou lgG1 de controle negativo ou positivo quimérico (NC e PC, respectivamente, 200 pg/mL cada) na dose mais alta (200 pg/mL). Subsequentemente, 0,4 x 106 PBMCs (E:T = 10:1 fixadas) a partir do mesmo doador foram adicionadas a cada poço com 20 pL/mL de mAb anti-CD107a conjugado a PE (BD) e as células foram então incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 3 h. Após 1h, 6 pg/mL de monensina foram adicionados a cada poço (GolgiStop, BD). No final do período de incubação, as células foram manchadas com anti-CD56 conjugado a APC e anti-CD3 conjugado a PerCp e analisadas em um citômetro de fluxo ATTUNE NxT (THERMO Scientific). Verificou-se que as células CD3/CD56+/CD107a+ aumentam significativamente de acordo com a concentração de mAb UMG1-CH, assim confirmando 0 potencial de mAb UMG1-CH como indutor de ADCC (Figura 6).
[0154] Estes dados permitem projetar abordagens com direcionamento imunológico, que são uma necessidade clínica urgente e não satisfeita em leucemias linfoblásticas agudas de células T/linfomas linfoblásticos.
Exemplo 6 [0155] O mAb quimérico UMG1-CH (aspecto dois desta invenção) é uma ferramenta imunoterapêutica ativa para macroglobulinemia de Waldenstrom.
[0156] Para investigar 0 potencial imunoterapêutico de mAb UMG1-CH, foi avaliada sua capacidade de induzir a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Com este fim, foi realizado um ensaio de desgranulação por cocultura de células NK purificadas a partir de doadores saudáveis (células efetoras) e linhagem celular BCWM.1 (células alvo) na presença de concentrações diferentes de mAb UMG1-CH ou controles negativos/positivos. Foi selecionado 0 mAb cetuximabe como controle negativo e 0 mAb rituximabe como controle positivo. Especificamente, 105 células alvo foram semeadas em placa de fundo redondo de 96 poços e cultivadas por 30
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41/42 minutos a 37°C, 5% de CO2 na presença de concentração diferente de mAb UMG1-CH (0, 10, 50, 100, 200 pg/mL), 200 ug/mL de cetuximabe ou 200 pg/ml de rituximabe. Subsequentemente, 105 células NK (E:T = 1:1 fixadas) do mesmo doador foram adicionadas a cada poço com 20 pL/mL de mAb antiCD107a conjugado a PE (BD) e as células foram então incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 2 h. Após 1 h, 6 pg/mL de monensina foram adicionados a cada poço (GolgiStop, BD). No final do período de incubação, as células foram manchadas com anti-CD56 conjugado a APC e anti-CD3 conjugado a PerCp e analisadas em um citômetro de fluxo ATTUNE NxT (THERMO Scientific). Verificou-se que as células de CD3-/CD56+/CD107a+ aumentam significativamente de acordo com a concentração de mAb UMG1-CH, alcançando exatamente 0 mesmo efeito obtido com rituximabe, assim confirmando 0 potencial do mAb como indutor de ADCC (Figura 7).
Exemplo 7 [0157] O receptor de antígeno quimérico (CAR)-UMGI induz citotoxicidade significativa contra as células que expressam 0 epítopo do anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada de acordo com a invenção.
[0158] Para melhorar adicionalmente 0 potencial imunoterapêutico do anticorpo produzido pela célula de hibridoma depositada de acordo com a invenção como ferramenta imunoterapêutica, um CAR de terceira geração foi se desenvolvendo. Especificamente, um CAR-T foi projetado pelo acoplamento de um domínio extracelular, consistindo em um scFv derivado da sequência do anticorpo, com uma região intracelular consistindo na cadeia Οϋ3ζ, a região de sinalização do TCR e 2 domínios coestimulatórios, CD28 e 4-1 BB, assim imitando a ativação fisiológica de células T. Com este fim, 0 anticorpo scFv foi clonado com os 3 domínios coestimulatórios selecionados em um cassete de CAR para gerar um vetor lentiviral. Subsequentemente, as partículas virais foram usadas para transduzir linfócitos CD3+ a partir de doadores saudáveis em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5 e a eficiência de transdução foi avaliada por citometria de fluxo (cerca de 38%). CAR-T contra 0 epítopo do
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42/42 anticorpo foram finalmente testados quanto a sua capacidade de liberar IFNy e IL-2 na presença de células alvo e quanto a sua capacidade de citotoxicidade seletiva. Como mostrado na Figura 8 e Figura 9, CAR-UMG1 foi capaz de liberar quantidades significativamente maiores de Interferon gama (IFNy) e interleucina 2 (IL-2) somente na presença de células H9. Adicionalmente, somente CAR-UMG1 foi capaz de induzir o assassinato seletivo de células H9 (vide a Figura 10) assim demonstrando a capacidade do CAR resultante de reconhecer células H9 e induzir a ativação de células T.
Exemplo 8 [0159] Este exemplo reporta curvas de volume do tumor de um experimento in vivo comparando uma lgG1 de controle versus a versão humanizada de UN1mAb (h-UN1) e a versão afucosilada de UN1-mAb (a-h-UN1). Neste experimento, 15 camundongos NOD-SCID-g-chain-null (NSG) foram subcutaneamente enxertados com 5x106 células HPB-ALL. Os camundongos foram então randomizados para receber semanalmente a administração intraperitoneal de 15 mg/kg de lgG1 de controle, h-UN1 ou a-h-UN1 partindo do dia 1 até a morte, volume do tumor>2000 mm3 ou toxicidade inaceitável. O volume do tumor foi avaliado em dias alternados e o volume médio de cada grupo em cada ponto no tempo é reportado na Figura 11. Partindo do dia 29, ambos h-UN1 e a-h-UN1 apresentaram uma incidência de doença significativamente reduzida, confirmando in vivo a forte atividade de ambos os anticorpos.

Claims (21)

  1. Reivindicações
    1. Anticorpo de camundongo monoclonal, caracterizado por ser produzido pela célula de hibridoma depositada sob o número de acesso ICLC, ICLC PD n216001.
  2. 2. Anticorpo, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões de determinação de complementaridade CDRH1, CDRH2 e CDRH3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões de determinação de complementaridade CDRL1, CDRL2 e CDRL3, em que CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, e CDRL3 compreendem as sequências de aminoácido SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5 e SEQ ID No 6, respectivamente.
  3. 3. Anticorpo que reconhece o mesmo epítopo que o anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, preferivelmente, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo monoclonal ou biespecífico ou pelo anticorpo ser um anticorpo humano, quimérico ou humanizado, mais preferivelmente um anticorpo quimérico ou humanizado do anticorpo, de acordo com a reivindicação 1.
  4. 4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo anticorpo ser capaz de induzir a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) contra o subgrupo EGIL T3 de células da leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), contra células do linfoma linfoblástico de células T e contra células de macroglobulinemia de Waldenstrom (WM).
  5. 5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo anticorpo reconhecer um epítopo compreendendo um GaINAc que é O-ligado a CD43 humano.
  6. 6. Molécula de ligação, caracterizada por ser derivada dos anticorpos, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, preferivelmente sendo selecionados do grupo que consiste em anticorpos de cadeia única, preferivelmente sendo selecionados do grupo que consiste em um scFv, um
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    2/4 multímero de scFv como um diacorpo, um triacorpo ou um tetracorpo, fragmentos de anticorpo, preferivelmente um Fab, um tandab e um flexicorpo.
  7. 7. Receptor de antígeno quimérico, caracterizado por compreender uma molécula de ligação, conforme definida na reivindicação 5, ligada a um domínio intracelular preferivelmente compreendendo um ou mais domínios de sinalização.
  8. 8. Vetor de expressão, caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica o receptor de antígeno quimérico, conforme definido na reivindicação 7, o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou a molécula de ligação, conforme definida na reivindicação 6, preferivelmente em que o vetor é um viral ou não viral, mais preferivelmente um viral, ainda mais preferivelmente um vetor lentiviral.
  9. 9. Linfócito CD3+, um linfócito NK, uma célula assassina induzida por citocina (CIK), um linfócito gama-delta ou uma célula NKT, caracterizados por compreender o receptor de antígeno quimérico, conforme definido na reivindicação 6, ou o vetor de expressão, conforme definido na reivindicação 8.
  10. 10. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou a molécula de ligação, conforme definida na reivindicação 6, ou o linfócito CD3+, o linfócito CD3+, o linfócito NK, a célula assassina induzida por citocina (CIK), o linfócito gama-delta ou a célula NKT, conforme definido na reivindicação 7.
  11. 11. Ácido nucleico, caracterizado por codificar o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou a molécula de ligação, conforme definido na reivindicação 6.
  12. 12. Célula de hibridoma, caracterizada por produzir o anticorpo monoclonal, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
  13. 13. Hibridoma, caracterizado por ser depositado sob o número de acesso ICLC, ICLC PD n2 16001.
  14. 14. Método para a produção do anticorpo monoclonal, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, sendo o dito método caracterizado
    Petição 870190058289, de 24/06/2019, pág. 48/67
    3/4 por compreender o isolamento do dito anticorpo da célula de hibridoma depositada sob o número de acesso ICLC, ICLC PD n2 16001.
  15. 15. Método para a identificação ou isolamento de linfócitos T CD45+, CD3+, CD8', CD127+, CCR7+, caracterizado por compreender o contato de uma amostra de células compreendendo os ditos linfócitos T com o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou com a molécula de ligação, conforme definida na reivindicação 6.
  16. 16. Método para a identificação ou isolamento de células da leucemia linfoblástica aguda de células T, células T de linfoma, células da macroglobulinemia de Waldenstrom ou macrófagos associados a tumor, caracterizado por compreender o contato de uma amostra de células compreendendo as ditas células com o anticorpo monoclonal, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou com a molécula de ligação, conforme definida na reivindicação 6.
  17. 17. Método para a produção de linfócitos CD3+, linfócitos NK, células assassinas induzidas por citocina (CIK), linfócitos gama-delta ou células NKT que expressam um receptor de antigeno quimérico, conforme definidos na reivindicação 6, caracterizado por compreender a introdução do vetor de expressão, conforme definido na reivindicação 8, nos ditos linfócitos CD3+, linfócitos NK, células assassinas induzidas por citocina (CIK), linfócitos gamadelta, ou célula NKT.
  18. 18. Uso do anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, da molécula de ligação, conforme definida na reivindicação 6, do vetor de expressão, conforme definido na reivindicação 8, do linfócito CD3+, do linfócito NK, da célula assassina induzida por citocina (CIK), do linfócito gama-delta ou a célula NKT, conforme definidos na reivindicação 9, ou da composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 10, caracterizados por serem para o preparo de um medicamento para o tratamento de leucemia linfoblástica aguda de células T ou macroglobulinemia de Waldenstrom.
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    4/4
  19. 19. Anticorpo, conforme definido qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou a molécula de ligação, conforme definida na reivindicação 6, caracterizados por serem para o uso para a preparação de um método para a identificação ou isolamento de linfócitos T CD45+, CD3+, CD8', CD127+, CCR7+.
  20. 20. Anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou a molécula de ligação, conforme definida na reivindicação 6, caracterizados por serem para o uso um método para o isolamento ou identificação de células da leucemia linfoblástica aguda de células T, células T de linfoma, células da macroglobulinemia de Waldenstrom ou macrófagos associados a tumor.
  21. 21. Anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou a molécula de ligação, conforme definida na reivindicação 6, caracterizados por serem para o uso para a preparação deem um método para o diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda de células T ou macroglobulinemia de Waldenstroõm.
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