MX2007014118A - Epitope cd43 especifico de leucemia aguda y linfoma linfoblastico y uso del mismo. - Google Patents

Epitope cd43 especifico de leucemia aguda y linfoma linfoblastico y uso del mismo.

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Kyeong-Cheon Jung
Eun-Young Chol
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Abstract

La presente invencion se relaciona a un epitope CD43 expresado sobre celulas de leucemia aguda humana y linfoma linfoblastico y su uso. Mas particularmente. La presente invencion se relaciona a un epitope CD43 expresado sobre celulas de leucemia aguda humana, linfoma linfoblastico, pero no sobre celulas hematopoyeticas maduras, celulas madre hematopoyeticas y celulas no hematopoyeticas, y a su aplicacion de diagnostico y terapeutica sobre leucemia aguda y linfoma linfoblastico.

Description

EPITOPE CD43 ESPECIFICO DE LEUCEMIA AGUDA Y LINFOMA LINFOBLÁSTICO Y USO DEL MISMO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a un epítope CD43 expresado sobre células de leucemia aguda y linfoma linfoblástico humanas y su uso. Más particularmente, la presente invención se relaciona a un epítope CD43 expuesto sobre células de leucemia aguda y linfoma linfoblástico humanas, pero no sobre células hematopoyéticas maduras y células madre hematopoyéticas, y a su aplicación de diagnóstico y terapéutica sobre leucemia aguda y linfoma linfoblástico . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La molécula CD43, también llamada sialoforina o leucosialina, en una molécula de superficie de la célula expresada en la mayoría de las células hematopoyéticas excepto eritrocitos. CD43 humano tiene un dominio extracelular similar a mucina de 235 aminoácidos (aa), un dominio de transmembrana de 23 aa y un dominio intracitoplásmico de 123 aa, todos codificados por un exón (Pallant y colaboradores, Proc Nall Acad Sci USA. 1989, 86:1328-32; Shelley y colaboradores., Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86:2819-23). El dominio extracelular de CD43 humano es rico en los aminoácidos serina (46 residuos) y treonina (47 residuos), la mayoría de los cuales llevan aproximadamente 80 cadenas de carbohidrato enlazadas a 0. Además, CD43 lleva una cadena de carbohidrato enlazada a N. La estructura de estos 0-glicanos varía de un tipo de célula a otra (Carlsson y colaboradores., JBiol Chem. 1986, 261:12787-95). El gen de CD43 consiste de dos exones, separados por un intrón de 378 bp, mediante lo cual el producto de traducción completo es codificado por el segundo exón (Shelley y colaboradores., Biochem J. 1990, 270:569-76). CD43 se ha creído que es un marcador de tipo leucocito específico restringido a la mayoría de leucocitos, plaquetas y células madre hematopoyéticas, excepto para eritrocitos (Remold-O'Donnell y colaboradores., Blood. 1987, 70:104-9; Fukuda, Glycobiology . 1991, 1:347-56). Sin embargo, la expresión de CD43 en células de tumor humanas de origen no hematopoyético, tal como una línea de células de cáncer de cerviz uterino humanas (CaSKI), una línea de células de cáncer de pulmón humano (A549), una línea de células de adenocarcinoma de seno humano (MCF7), una línea de células de fibrosarcoma humano (HT 1080), y líneas de células de adenocarcinoma colónicas humanas (COLÓ 205, HT 29, Caco-2, DLD-1 y SW480), ha sido demostrada (Fernández-Rodríguez y colaboradores, Tu our Biol . 2002, 23:193-201). CD43 también se expresa en el tejido de cáncer de colon humano (Sikut y colaboradores, Int J Cáncer. 1999, 82:52-8; Jung y colaboradores, Korean J Pa thol . 38:8- Los estudios biosintéticos muestran que el precursor de CD43, con un tamaño predicho de alrededor de 40 kDa (incluyendo un N-glicano) , migra con una masa molecular aparente 54 kDa en la electroforesis. Este precursor es subsecuentemente convertido a una molécula glicosilada madura con tamaño de 115 kDa hasta más de 200 kDa debido a la glicosilación variable. Los timocitos, linfocitos T CD4+ y monocitos expresan más de una isoforma de 115 kDa, mientras que una forma de 130 kDa se encuentra principalmente en las células T CD4+ activadas, células T en reposo y activadas CD8', neutrófilos, plaquetas y células B (Rosenstein y colaboradores., Immunol Res. 1999, 20:89-99). Se observa que más de una isoforma se puede coexpresar sobre la superficie del mismo ce 11. Un patrón de glicosilación 0 post-traduccional herméticamente regulado da por resultado estas isoformas de peso molecular características que son diferencialmente expresadas en diferentes tipos de células. Especialmente, la expresión del núcleo 2 ß-1, 6-N-acetilglucosaniiniltransferasa (C2GnT) da por resultado la expresión de la isoformas CD43 de 130 kDa en timocitos y células T (Piller y colaboradores., JBiol Chem. 1988, 263:15146-50) . Hasta recientemente, más de 17 anticuerpos CD43 antihumanos se han reportado. La mayoría de estos anticuerpos reaccionan con epítopes de carbohidratos sobre el dominio extracelular y todos los anticuerpos anti-CD43 conocidos detectan la proteína CD43 expresadas sobre células hematopoyéticas maduras (Tabla 1) . Así, no son eficientes en detectar o erradicar la célula leucémica o de linfoma. TABLA 1 Anticuerpo Células Células Epítope *Referenc?a Ant?-CD4 positivas de negativas de CD43 CD43 T305 Células de T Granulocitos, Núcleo-2 1,2 CD4+ eritrocitos, activadas, plaquetas células de T carbohidrato CD8 timocitos, precursores eloides en médula ósea LlO Células T, Eritrocitos 1-78 3 timocitos, resistente líneas de sialidasa 1-78 células B, monocitos, neutróf ílos, plaquetas L2 Células T, Eritrocitos timocitos, líneas de células B, monocitos , neutróf ílos , plaquetas 34 -3C1 Células de Plaquetas Carbohidrato médula ósea eritrocitos sensible timocitos, sialidasa células T, monocitos, granulocitos MEM-59 La mayoría de Carbohidrato 5, 6 leucocitos, sensible células de neurammidasa médula CD34' MT-1, L60 Células T, Células monocitos DFT1 Células Células B Carbohidrato monocitos sensible neurammidasa 1G10 Células T, Células células NK, Eritrocitos granulocitos CBF.78 Células T, Resistente a subcon untos neurammidasa de monocitos y granulocitos RDF/AD-9 Células T, Células B Carbohidrato monocitos, sensible células neurammidasa granulocitos 161-46 Células T, Células B Resistente monocitos, neuraminidasa células B granulocitos 4D2 COLÓ 205, Intracelular 10 K562, Jurkat (337-343) 4D1 Células T CD4+ Células B Carbohidrato Mukasa y activados, de nucleo-2 colaboradores, monocitos 199? *1. Fox y colaboradores, J Immunol . 1983, 131:762-7 ; 2. Saitoh y colaboradores, Blood. 1991, 77:1491-9;3. Remold-0' Donnell y colaboradores, Blood. 1987, 70:104-9;4. Borche y colaboradores, Eur Jlmmunol . 1987, 17:1523-6; 5. Stefanova y colaboradores, Fol ia Biol ( Praha ) . 1988, 34:255-65;6. Alvarado y colaboradores, Eur J Immunol 1995, 25:1051-5; 7. Stross y colaboradores, J Clin Pathol. 1989, 42:953-61; 8. Horejsi y colaboradores, 1997, In K shimo to T, y colaboradores, Leucocyte Typmg, Vol. VI: White Cell Differen tia tion ñn tigens 494 . Garland, New York y London; 9. Tkaczuk y colaboradores, Ti ssue An tigens . 1999, 54:1-15; 10. Sikut y colaboradores, In t J Cáncer. 1999, 82:52-8; 11. Mukasa y colaboradores, In t Immunol . 1999, 11:259-68. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la presente invención es proporcionar un epítope CD43 asociado con leucemia aguda, leucemia crónica con crisis del blasto y linfoma linfoblástico donde el epítope se expone sobre las cé_ulas de leucemia aguda y lmfoma linfoblástico humanas, pero no sobre células hematopoyéticas maduras y células hematopoyéticas. Así, la presente invención proporciona un polipéptido aislado para el epítope de CD43 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Otro objetivo de ]a presente invención es proporciona material que reconoce el epítope CD43. De preferencia, la presente invención proporciona un anticuerpo o su fragmento que específicamente enlaza a un epítope de CD43 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Un tercer objetivo de la presente invención es proporcionar un método para producir materiales que reconocen el epítope CD43. Un cuarto objetivo de la presente invención es proporcionar material para la diagnosis de leucemia aguda, leucemia crónica con crisis de blasto, y linfoma linfoblástico . Un quinto objetivo de la presente invención es proporcionar un método para diagnosticar leucemia aguda, leucemia crónica con crisis de blasto y linfoma linfoblástico . Así, la presente invención proporciona un método para diagnosticar leucemia aguda que comprende células de leucemia en una muestra biológica con el anticuerpo de epítope anti-CD43 y detectar la reacción positiva al anticuerpo de epítope anti-CD43. La presente invención proporciona un método para diagnosticar la leucemia crónica con de blasto que comprende incubar en células de HP PrecisionScan LTX.Ink ]_eucem_a en una muestra biológica con anticuerpo de epítope anti-CD43 y detectar la reacción positiva al anticuerpo de epítope anti-CD43. La presente invención proporciona un método para diagnosticar linfoma linfoblástico que comprende incubar células de linfoma en una muestra biológica con el anticuerpo epítope anti-CD43 de acuerdo con la reivindicación 6, y detectar la reacción positiva al anticuerpo de epítope anti-CD43. Un sexto objetivo de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que puede exterminar células de tumor de leucemia aguda, leucemia crónica con crisis de blasto y linfoma linfoblástico . Un séptimo objetivo de la presente invención es proporcionar un método para diagnosis mediante el uso del material de diagnóstico de la presente invención. Además, la presente invención es para proporcionar un método -para el tratamiento mediante el uso del material terapéutico de la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Una apreciación más completa de la invención, y muchas de las ventajas propuestas de la misma, serán fácilmente evidentes ya que la misma llega a ser mejor entendida por referencia a la siguiente descripción detallada cuando se considera en conjunción con el dibujo acompañante, en donde: La FIG. 1 es una fotografía del manchado inmunohistoquímico del timo mediante el sobrenadante del clon de hibridoma que produce anticuerpo monoclonal EB-1 específico contra el epítope CD43. La FIG. 2 es una fotografía de la reactividad del anticuerpo monoclonal EB-1 sobre la superficie de timocitos humanos utilizando la citometría de flujo de triple color. La FIG. 3 es una fotografía de la reactividad del anticuerpo monoclonal EB-1 sobre la superficie de leucocitos de sangre periférica humana y células madre hematopoyéticas de sangre del cordón umbilical utilizando la citometría de flujo de color triple. La FIG. 4 es una fotografía de la reactividad del anticuerpo monoclonal EB-1 sobre la superficie de las células de médula ósea humanas utilizando la citometría de flujo de triple color. La FIG. 5 es una fotografía de la reactividad del anticuerpo monoclonal EB-1 sobre la superficie de la línea de células 29T transfectadas con CD43 humana utilizando la citometría de flujo de color individual. La FIG. 6 es una fotografía de la reactividad del anticuerpo monoclonal EB-1 sobre la superficie de la línea de célula Molt-4 humana con o sin tratamiento con sialidasa utilizando la citometría de flujo de color individual. La FIG. 7 es una fotografía del análisis de SDA-PAGE de timocito humano y el lisado de línea de célula Molt-4 con o sin tratamiento con sialidasa, seguido por el inmunomanchado con el anticuerpo monoclonal EB-1. La FIG. 8 es un diagrama esquemático de 11 tipos de mutantes de supresión de CD43. La FIG. 9 es una fotografía del análisis de SDA-PAGE de 11 tipos de mutantes de supresión de CD43 seguida por el inmunomanchado con el anticuerpo monoclonal EB-1 y el anticuerpo policlonal anti-GST. La FIG. 10 es una fotografía de la reactividad del anticuerpo monoclonal EB-1 sobre la superficie de las células leucémicas humanas utilizando la citometría de flujo de color individual.
II La FIG. 11 es una fotografía del manchado inmunohistoquímico del tejido de linfoma linfob] ástico mediante el anticuerpo monoclonal EB-1. La FIG. 12 es una fotografía de la reactividad EB-1 y los anticuerpos monoclonales MllC clase I anti humanos utilizando la citometría de flujo de color sobre la superficie de células leucémicas en la sangre periférica de ratones deficientes de RAG-1 en los cuales las células CCRF-CEM se inyectaron intravenosamente y se trataron con anticuerpo EB-1 o de control. La FIG. 13 es una fotografía de la reactividad de dos anticuerpos ant?-CD43 adicionales (EB-2 y EB-3), que se produjeron mediante la inmunización de ratones con el epítope CD43, sobre la superficie de la línea de células ETA transfectada con CD43, timocitos humanos, leucocitos de sangre periférica humana y muestra de leucemia humana utilizando la citometria de flujo de color individual. La FIG. 14 es una fotografía del análisis de SDA-PAGE de 5 tipos de mutantes de supresión de CD43, seguido por el inmunomanchado con anticuerpos monoclonales EB-2 y EB-3. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES La presente invención es para proporcionar un epítope CD43 expuestos sobre las células de tumor de leucemia aguda, leucemia crónica con crisis de blasto y linfoma linfoblástico, pero no sobre células hematopoyeticas maduras y células madre hematopoyéticas. El CD43 de la presente invención es un CD43 de preferencia humano, la secuencia que se ha enviado al NCBI GenBank ba o el acceso No. M61827. El epítope CD43 y cualquier polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID N0:1 (después en la presente, EP6), y más de preferencia incluye la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2 (después en la presente, EP9) . EP6: Pro Leu Tip Thr Ser He (SEQ ID N0:1) EP9: Glu Gly Ser Pro Leu Tip Thr Ser He (SEQ ID NO:2) . En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un polipéptido de menos de 200 aminoácidos en longitud, más de preferencia en menos de 100 aminoácidos en longitud, más de preferencia a menos de 50 aminoácidos en longitud, que comprende una secuencia de aminoácido de la SEQ ID N0:1 o SCQ ID NO:2. La presente invención también proporciona un polipéptido que consiste esencialmente una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:1 o SEQ ID NO: 2. La presente invención también proporciona un polipéptido que consiste una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. El epítope de CD43 (EP6 y EP9) podría ser purificado de te idos humanos, químicamente sintetizado, o producido mediante biotecnología. La presente invención también proporciona material que reconoce el epítope CD43 de la presente invención. El material se selecciona del grupo que consiste de anticuerpo, su fragmento y ligandos, y el anticuerpo de preferencia selecciona del grupo que consiste de anticuerpo monoclonal y policlonal, y más de preferencia se origina de humano y animal . Los anticuerpos comprenden partes de anticuerpos que incluyen la región de reconocimiento de antígenos (VH y V ) , así tiene la capacidad para reconocer el antígeno preferencialmente . Además, también incluye el fragmento de anticuerpo, tal como F(ab')2, Fab y Fv . De preferencia el fragmento de anticuerpo (Fv) comprende un fragmento de polipéptido de cadena individual de anticuerpo, llamado Fv de cadena individual, que se prepara al insertar un péptido de enlace entre dos polipéptidos, VH y VI para incrementar la estabil dad al calor. La presente invención además proporciona anticuerpos quiméricos que reconocen el epítope CD43 de la presente invención. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el cual las regiones variables de anticuerpos derivados de una especie, se combinan con las regiones constantes de anticuerpos derivados de una especie diferente o alternativamente se refiere a anticuerpos injertados de CDR. Los anticuerpos quiméricos se construyen mediante de tecnologías de DNA recombinante, y son descritos en Shaw, y colaboradores., J. Immun . , 138:4534 (1987), Sun, LK. , y colaboradores., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:214-218 (1987), por ejemplo. Otras técnicas conocidas se pueden utilizar para generar anticuerpos injertados de CDR y quiméricos. "CDR" o "región de determinación complementapedad" o "región hipervapable" se define como la secuencia de aminoácidos sobre las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo que forma la estructura de circuito tridimensional que contribuye a la formación del sitio de enlace de antígeno. Como se utiliza en la presente, el término anticuerpo "injertado de CDR" se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos en la cual por lo menos partes de una o más secuencias de CDR en el dominio ligero y/o variables se ha remplazado por partes análogas de secuencias de CDR de un anticuerpo que tiene especificidad de enlace diferente para un antígeno o receptor dado. Los términos "región variable de cadena ligera" y "región variable de cadena pesada" se refieren a las regiones o dominios de la porción N-terminal de las cadenas ligera y pesa respectivamente que tiene una secuencia de aminoácidos primaria variada para cada anticuerpo. La región variable del anticuerpo consiste del dominio amino terminal de las cadenas ligera y pesada ya que se pliegan con untamente para formar un sitio de enlace tr dimensional para un anticuerpo. Las secuencias de CDR análogas se dicen que son "injertadas" sobre el sustrato o el anticuerpo recipiente. El anticuerpo "donador" es el anticuerpo que proporciona la secuencia CDR, y el anticuerpo que recibe las secuencias sustituidas es el anticuerpo de "sustrato". Uno de habilidad en la técnica puede fácilmente producir estos anticuerpos injertados de CDR utilizando las enseñanzas proporcionadas en la presente en combinación con métodos bien conocidos en la técnica (ver Borrebaeck, C.A., Antibody Engineepng: A Practical Guide, W.H. Freeman y Company, New York, 1992, incorporada por referencia). Esta invención además proporciona anticuerpos humanizados que reconocen el epítope CD43 de la presente invención. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos que contiene secuencia de anticuerpos no humanos (por ejemplo mupnos) así como anticuerpos humanos. Tales anticuerpos son anticuerpos quiméricos que contiene secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En general el anticuerpo humanizado comprenderá sustanclalmente todo de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos sustanclalmente todos los circuitos hipervariables corresponden aquellos de una inmunoglobulina no humana y todo sustanclalmente o todas las regiones de FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. Del anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente aquella de inmunoglobulina humana. Ver, por ejemplo, Cabilly U.S. Pat. No. 4,816,567; Queen y colaboradores. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; y ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press 1996) . En una modalidad preferida de la presente invención, el anticuerpo se enlaza a un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos mostrados en SEQ ID N0:1. El anticuerpo es un fragmento que puede además comprender material de marcación que es seleccionado del grupo de radioisótopos, toxinas, y materiales fluorescentes y materiales de manchado. Los ejemplos de los materiales fluorescentes son fluoresceína-5-isotiociana o (FITC), ficoeritrina (PE), aloficocianina (APC), y biotina, pero no limitado a los mismos. El anticuerpo o su fragmento además puede comprender un material tóxico seleccionado del grupo que consiste de radioisótopos, sustancias químicas tóxicas, proteínas tóxicas y agentes anti-tumorales . El anticuerpo o su fragmento se combinan con las proteínas tóxicas para producir de fusión. Los ejemplos de las proteínas tóxicas incluyen ricina, saporión, gelonina, nomordina, toxoide de dipteria y toxina de seudomonas, pero no limitado a los mismos . La presente invención también proporciona un método para inducir el material, y proporciona células que producen el anticuerpo. El método para producir anticuerpo o fragmento incluye las etapas de (a) inmunizar un animal con polipéptido, proteina o fragmentos de proteína que contiene o células que expresan el epitope de CD43, (b) extraer esplenocitos del animal inmunizado, (c) fusionar los esplenocitos con células de mieloma, y (d) clasificar las células de hibridoma que producen anticuerpos contra el epítope CD43. El material se puede obtener mediante el cultivo in vi tro o inyección en los animales de células que producen los materiales. El material se puede obtener de la ascitis de animales en las cuales las células que producen los materiales son inyectados intraperitonealmente. Los materiales se pueden purificar del sobrenadante de cultivo o ascitis mediante la cromatografía de intercambio iónico o la cromatografía de columna de afinidad. En una modalidad, la presente invención se relaciona a una composición farmacéutica para tratar la leucemia aguda, la leucemia crónica con crisis de blasto, linfoma linfoblástico que comprende un anticuerpo de epítope anti-CD43 o su fragmento, y un portador farmacéuticamente aceptable.
La administración del anticuerpo es un fragmento de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo utilizando cualquiera de los modos aceptados de administración de composic ones farmacéuticas. Así, por ejemplo, puede ser la administración. El material de reconocimiento de antígeno puede ser administrado oralmente o 10 más de preferencia parenteralmente en los pacientes, en la forma de polvo sólido, semisólido, liofilizado, o formas de dos ficación líquida tales, por ejemplo, tabletas, supositorios, pildoras, capsulas de gelatina elásticas blandas y duras, polvos, soluciones, suspensiones, aerosoles o lo similares, de preferencia en formas de dosificación unitarias adecuadas para la administración simple de dosificaciones precisas. Las composiciones farmacéuticas generalmente incluirán un portador excipiente farmacéutica convencional y el anticuerpo de la nvención como el/un agente activo, y, además, pueden incluir otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, portadores adyuvantes, diluentes, vehículos, o combinaciones de los mismos. Tales excipientes, portadores o aditivos farmacéuticamente aceptables así como métodos para hacer las composiciones farmacéuticas para varios modos de administración son bien conocidos para aquellos de habilidad en técnica. La dosificación del componente activo puede ser seleccionada dependiendo de la condición del sujeto, por ejemplo, 3 mg a 6,000 mg por 1 día.
En una modalidad, la presente invención se relaciona a un método para tratar la leucemia aguda, la leucemia crónica con crisis de blasto, linfoma de linfoblástico utilizando el anticuerpo o su fragmento, que selecciona el grupo de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, fragmento de anticuerpo de polipéptido de cadena individual y ligando. El anticuerpo de fragmento de anticuerpo de preferencia se selecciona del grupo que consiste de anticuerpo monoclonales m policlonales además de preferencia se origina de humano y animal. De preferencia el anticuerpo o su fragmento además incluye material tóxico que se selecciona al grupo que consiste de radioisótopos sustancias químicas tóxicas, proteínas tóxicas y agentes anti-tumorales . Además, la presente invención proporciona un método para la diagnosis de leucemia aguda, leucemia crónica con crisis de blasto y linfoma linfoblástico utilizando el anticuerpo o su fragmento. El método incluye las etapas de (a) incubar el anticuerpo o su fragmento con una célula en una muestra biológica (b) detectar la muestra que muestra reacción pos tiva contra el anticuerpo. El tumor es de preferencia leucemia aguda, leucemia crónica con crisis de blasto o linfoma li nfoblástico . Además, la presente invención proporciona un equipo de diagnóstico para leucemia aguda, leucemia crónica con crisis de blasto y linfoma linfoblástico utilizando el material. El equipo de diagnóstico podrá incluir el método para la detección de la reacción de antígeno de un anticuerpo además del material. El método de detección de preferencia se selecciona del grupo que consiste de citometría de flujo, inmunohistoquími ca , ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA), radioinmunoensayos (RÍA), inmunoensayo de enzima (DÍA), inmunoensayo de fluorescencia (FIA) e inmunoensayo de luminescencia (LIA) . El método de detección incluye de los materiales de marcación, que podrían ser seleccionados en el grupo de enzimas (tales como la peroxidasa de rábano picante (HRP), materiales fluorescentes (taLes como FITC), materiales luminescentes (tales como luminol , isolunmoL y lucigenina), e isótopos (tales como I, H, C y I), pero no se considera limitativo de los mismos de ninguna manera. La reactividad del material de reconocimiento de anfígeno podría ser confirmada utilizando el dispositivo que detecta la reacción de enzima, fluorescencia, luminescencia, o radiación. El equipo de diagnóstico podrá ser en equipo de citometría de flujo, equipo de ínmunohistoquím ca , equipo de ELISA o equipo de tiras incluyendo el anticuerpo o su fragmento . La presente invención además es explicada en más detalle con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos, sin embargo no deben ser interpretados como limitativos del alcance de la presente invención de ninguna manera . EJEMPLO 1 Con el fin de descubrir una proteína de superficie de célula específica sobre timocitos, timocitos humanos se administraron a ratones Balb/c para producir anticuerpos a timocitos humanos mediante los siguientes ejemplos. 107 de timocitos humanos se administraron intraperi onealmente y se inmunizaron en ratones Balb/c en intervalos de dos semanas por seis semanas. El bazo de los ratones Balb/c se removió 3 días después de la última administración para preparar la suspensión de células del bazo. Los anticuerpos monoclonales se produjeron al fusionar las células del bazo de Balb/c inmunizados con timocitos humanos con células de mieloma de ratón SP2/0-Agl4 resistentes a 9-azaguanina . Método de fusión de células seguido por el método de Koeler y Milstein (Koeler & Milstein Na ture, 1975, 256, 495-497) . 108 células del bazo se fusionaron con células de mieloma 107 utilizando polietilenglicol 4000 al 50%. Las células se lavaron y se resuspendieron en el medio de Eagle modificado de Dulbeco (DMEM) que contiene albúmina de suero bovino al 20%, hipoxantina 100 µM, aminopterina 0.44 µM y timidina 16 ?M (media HAT) . Las células se introdujeron a cuatro placas de 96 cavidades y se cultivaron a 37°C, e incubadora de C02 al 5%. Cuando se formaron las colonias después de dos semanas, el sobrenadante se preparo y la reactividad del anticuerpo se observo utilizando la inmunohistoquimica y citometría de flujo. La cavidad que contiene mas de 1 O5 células por cavidad se considero como grupo positivo. Las células se tomaron de la cavidad que contiene anticuerpo altamente reactivo y se subclonaron 0.5 células por cavidad al limitar el ensayo de dilución para producir clon de hibpdoma estable con alta reactividad de anticuerpo. Este clon de hibridomas secreta anticuerpo en el medio y el sobrenadante se almacenó para las siguientes etapas. EJEMPLO 2 Con el fin de descubrir un clon que secreta anticuerpos que reconoce el antigeno de superficie de célula especifico sobre timocitos entre los clones de hibridoma producidos por el Ejemplo 1, el manchado de inmunoperoxidasa se llevó a cabo sobre la platina de 4 µm de grosor de tejido fresco y el te do incrustado en parafina fijado en formalina utilizando el sobrenadante del clon de hibpdo a producido por el Ejemplo 1 de acuerdo con el método de manchado del complejo de avidina/biotina (ABC) al enlazar avidina con biotina. Cl sobrenadante de célula monoclonal se utilizó como anticuerpo primario. El tejido incrustado en parafina se trató con el suero de ratón normal y se de o reposar durante 1 hora par aprevenir el manchado antecedente no específico después de la remoción de la parafina. Después de la adición de un anticuerpo primario, se dejaron permanecer durante la noche y se lavaron tres veces con solución salina regulada de fosfato (PBS) . Inmunoglobulina anti ratón de cabra biotinilada usada como un anticuerpo secundario de adicionó. Esta se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora, se lavó tres veces con PBS. Luego conjugado de estreptavidina y peroxidada de rábano picante se adicionó. Tetraclorohidrato de 3, 3' -diaminobezidina (DAB) y solución de H202 manufacturada por DAKO se adicionó a las células manchadas, se trató durante 20 minutos y se lavó tres veces con PBS. Se observó bajo microscopía de luz después de la cobertura con el vidrio de cubierta. Las líneas de clon de hibridoma que producen anticuerpo específico para timocitos humanos se seleccionaron. Uno de los clones cuyos timocitos reconocieron anticuerpo fue nombrado como EB-1. La FIG. 1 es una fotografía de timo de manchado inmunohistoquímico con el sobrenadante de clon de hibridomas que produce anticuerpo EB-1. Como se muestra en la FIG. 1, la mayoría de los timocitos es positivamente manchado. La superficie de la célula de los timocitos se mancho fuertemente de modo que el antígeno reconocido por el anticuerpo de EB-1 es el antígeno de superficie de célula . EJEMPLO 3 Para evaluar la reactividad del anticuerpo EB-1 de acuerdo con las etapas de desarrollo de timocitos se llevó a cabo la citometría de flujo. Timos humanos, que se removieron del paciente durante la cirugía cardiaca, se desmenuzaron finamente y la suspensión de célula individual se preparó. lxlO6 células se suspendieron en 100 µl PBS, y se distribuyeron en tubos de prueba. 300 µl es sobrenadante de cultivo EB-1 se adicionó y se agitó. La solución se hizo reaccionar a 4°C durante 30 minutos, se centrifugó a 1,500 rpm durante 5 minutos, y la pelotilla se lavó dos veces con PBS para remover el anticuerpo sin reaccionar. La pelotilla de suspendió en 50 µl de solución que contiene anticuerpo secundario diluido (Ig de ratón ant?-30 de cabra conjugado con riTC manufacturado por Zaimed, reaccionado a 4°C durante 30 minutos en un cuarto oscuro. Después del lavado dos veces, la pelotilla se suspendió en 50 µl de solución que contiene anticuerpo ant?-CD8 conjugado con ficoeritpna (PE) y anticuerpo ant?-CD4, conjugado con a Loficoacianí na (APC), se h zo reaccionar a 4°C durante 30 minutos en cuarto obscuro, y luego se lavó dos veces. Finalmente 200 µl de PBS se adicionó a la pelotilla de célula después de la centrifugación. Los timocitos se clasificaron en cuatro subconjuntos de acuerdo con el patrón de expresión de CD4 y CD8 (es decir, timocitos negativos dobles CD4 CDS, timocito positivo doble CD4+CD8+, y timocitos positivos individuales CD4+CD8 o CD4CD8+) y la relación de células positivas de EB-1 y la intensidad de manchado EB-1 se analizó mediante la citometría de flujo. La FIG. 2 muestra los resultados del análisis citométrico de flujo de tres colores que muestran en actividad de BB-1 contra todos los subconjuntos de timocitos, particularmente la intensidad de manchado más alta sobre timocitos positivo doble. En la FIG. 2, la línea sólida representa el manchado mediante el anticuerpo de EB-1 y el perfil de manchado negativo mediante un anticuerpo relevante se muestra como el histograma lleno. EJEMPLO 4 Con el fin de obtener alta concentración de anticuerpo secretado por el clon de hibridoma que secreta EB-1, se prepararon ascitis. Tres semanas después 0.5 ml de prístina se administraron intraperitonealmente en ratones de Balb/c, 107 de clon de hibridoma EB-1 cultivada en DMEM que contiene suero bovino al 10%. Después de 2 o 3 semanas, se recolectaron la ascitis. Luego la concentración de anticuerpo fue de 5 a 10 mg/ml. Solamente las inmunoglobulinas que responden a timocitos humanos se purificaron debido a que hay muchas proteínas contaminantes tal como albúmina en ascitis. Para purificar el anticuerpo de la ascitis que contiene alta cantidad de anticuerpos obtenidos de ratones de Balb/c en los cuales las células de hibridoma monoclonales EB-1 se administraron intraperitonealmente, se realizaron la cromatografía de Q-Sefarosa y la cromatografía de hidroxiapatita (Gel Bio-gel HTP manufacturado por Farmacias) . 3.14 g de sulfato de amonio 10 ml de ascitis se adicionaron lentamente sobre hielos (precipitado con 50% de (NH4)2 S04) . La mezcla se centrifugó a 15,000 rpm durante 30 minutos, se resuspendió en agua desionizada y se dializó en un litro de solución reguladora (fosfato 20 niM, pH 7.4) . La solución se pasó y se absorbió en la columna de Q-Sefarosa previamente equilibrada con solución reguladora (fosfato 20 mM, pH 7.4), y luego la solución reguladora se pasó nuevamente a través de la columna para remover las proteínas libres en la columna, después de lo cual la proteína absorbida en la columna se eluyó con el gradiente lineal de 0 M a 0.8 M de NaCl utilizando la solución reguladora I (fosfato 20 mM, pH 7.4 ) y la solución reguladora II (fosfato 20 mM y NaCl 8.5 M, pH 7.4). Cada fracción se electroforizó en SDA-PAGE y las fracciones que contiene anticuerpo EB-1 se recolectaron . Las fracciones luego se dializaron en solución reguladora (fosfato 20 mM, pH 6.8), y se colocaron a través de la columna de hidroxiapatita previamente equilibrada con solución reguladora (fosfato 20 mM, pH 6.8) . La fracción en la solución reguladora (fosfato 20 mM, pH 6.8) pasó a través de la columna para remover las proteínas libres y se eluyó con un gradiente lineal de 0 a 0.3 M de fosfato utilizando la solución reguladora III (fosfato 20 mM, pH 6.8) y la solución reguladora (fosfato 300 mM, pH 6.8). Cada fracción se electrofor zó en SDS-PAGE y las fracciones que contienen más de 95% de anticuerpo EB-1 se recolectaron. El anticuerpo EB-1 recolectado se dializó en colusión reguladora apropiada y se almacenó. 5 a 10 mg de anticuerpo BB-1 se prepararon de 1 ml de ascitis mediante experimentos. EJEMPLO 5 El presente ejemplo se llevó a cabo de acuerdo con el análisis de citométrico de flujo del Ejemplo 3 para investigar si el anticuerpo EB-1 es reactivo contra leucocitos normales excepto timo utilizando el anticuerpo EB-1 purificado del Ejemplo 4 como anticuerpo primario. Para este análisis, el anticuerpo CB-1 purificado se combinó directamente con FITC o PE, caso en el cual no fue necesario usar el anticuerpo secundario para fluorescencia, o el anticuerpo EB-1 conjugado con biotina se utilizo combinado con estreptavidina conjugada de fluorescencia. La Tabla 2 enseguida muestra la reactividad del anticuerpo EB-1 sobre la superficie de célula de leucocitos de sangre periférica normales, células mononucleares de sangre periférica activados cultivadas en el medio que contiene 10 µg/ml de Fitohemagl uti ni na (PHA) o 5 µg/ml de anticuerpo ant?-CD3, célula del bazo normal, timocitos normales y células madre hematopoyéticas CD34+AC 133+ en la sangre del cordón umbilical. Todas estas fueron negativas al anticuerpo EB-1, excepto para timocitos. Los resultados representativos del análisis citométrico de flujo de leucocito normal se muestra en la Fig. 3, en la cual la línea sólida representa el manchado mediante el anticuerpo EB-1, y el perfil de manchado negativo con un anticuerpo irrelevante se muestra como histograma lleno. TABLA 2 Células Positividad-EB-1 Células de sangre periférica Eritrocitos Linfocitos Monocitos Granulocitos Plaquetas Sangre periférica activada PHA (10 ?g/ml) Anticuerpo Anti-CD3 (5 µg/ml) Esplenoci'tos Timocitos +-I- Células madre hematopoyéticas CD34+AC 133+ en la sangre del cordón umbilical Manchado negativo ** Manchado positivo en más de 90% de células PHA, Fitohemagluti nina EJEMPLO 6 El presente ejemplo se llevó a cabo de acuerdo con el ensayo inmunohistoquímico del Ejemplo 2 para confirmar si el anticuerpo EB-1 es reactivo contra el tejido normal excepto el timo utilizando el anticuerpo EB-1 purificado del Ejemplo 4, anticuerpo primario. La Tabla 3 enseguida es la reactividad del anticuerpo EB- en cada uno de los varios te idos. Excepto para timocitos, todos los otros tejidos incluyendo el tejido linfoide periférico, cerebelo, páncreas, ovario y testículos, piel, pulmón, drenal y riñon fueron negativos para el manchado. TABLA 3 Órgano No. de casos No. de EB-1 positivo Sistema Linfoide Ganglio linfático 18 0 Lengua 3 ' 0 Timo 6 6 Bazo 4 0 Sistema Nervioso Cerebro 4 0 Cerebelo 4 0 Sistema Digestivo Esófago 3 0 Estómago 10 o Intestino Delgado 2 o Intestino Grueso 2 o Hígado 7 o Páncreas 4 o Apéndice vermiforme 4 o Sistema Reproductor Testículo 2 0 Ovario 8 0 Útero 4 0 Los Otros Pulmón 8 0 Riñon 9 0 Glándula renal 5 0 Piel 4 0 Ejeutiplo 7 El presente ejemplo se llevó a cabo de acuerdo con el análisis de citométrico de flujo del Ejemplo 3 para si el. anticuerpo EB-1 es reactivo contra células de médula ósea normales utilizando el anticuerpo EB-1 purificado del Ejemplo 4 como anticuerpo primario. Para este análisis, el anticuerpo EB-1 conjugado con biotina y la estreptavidina conjugada con APC se utilizó en combinación con anti-CDlO, anti-CD33, anti-CD38, anti-CD71, o anti-AC133, conjugado con FITC, y anti-CD34 conjugado con PE. La FIG. 4 es el resultado del análisis citrométrico de flujo de tres colores, en el cual se confinaron las células CD34+. Células madre pluripotentes se definieron como CD34+AC133+ (FIG. 4A) o CD34+CD38~ d?m (FIG. 4B) en la médula ósea o la sangre del cordón umbilical y no muestran reactividad contra el anticuerpo EB-1 en todo. Además, las células CD34+CD33+ (FIG. 4D) que contienen virtualmente todas las células formadoras de colonia tales como células progenitoras capaces de formar granulocitos, eritrocitos, monocitos, megacariocitos (CFU-GEMM) , CFU-GM, eritrocitos de unidad de formación de impulso, y células progenitoras relacionadas con eritroides CD34+CD7 lbr?ght (FIG. 4E) también no se mancharon por el anticuerpo EB-1. En contraste, el manchado positivo del anticuerpo EB-1 se observó sobre la mayoría de precursores CD34+CD10+ relacionados con linfoides (FIG. 4C) . En resumen de los resultados, la reactividad EB-1 fue restringida a timocitos y algunos precursores hematopoyéticos en la médula ósea, pero no se encontraron en algunas otras células hematopoyéticas incluyendo células de la sangre periférica maduras y células madre hematopoyéticas y tejidos no hematopoyéticos. EJEMPLO 8 Con el fin de clarificar el antígeno reconocido por el anticuerpo EB-1, una librería de cDNA timocitos humanos se preparó utilizando poli (A) + RNA y el vector de expresión de pcDNA3 manufacturado por Invitrogen. Esta librería contuvo 3.5 x 106 colonias independientes. La cepa de hospedero bacteriano utilizado fue MC1061/P3 de Escherichia coli . El plásmido pMIK/D3T 31 se construyó al insertar el fragmento Xhol del clon de cDNA sintasa Gb3, pD3T 31 (Haraguchi y colaboradores., Proc. Natl. Acad. Sci. U S. A. 1994, 91: 10455-9), en el vector de expresión pMIK/Neo. Los plásmidos de la librería de cDNA se amplificaron una vez y se transfectaron en células 293T junto con el plásmido pMK/D3T-31 utilizando DEAE-dextrano como es descrito previamente (Davis y colaboradores, Methods in Molecular Biology, Elsevier Science, New York 1986:285-289). Las células 293T subconfluentes , 1.5xl06 en placas de 10-cm se cotransfectaron con 8µg cada uno del plásmido de librería de cDNA y pMIK/D3T-31. Después de 60 h, las células transfectadas se desunieron de las placas y se incubaron con el anticuerpo EB-1 en una disolución 1:200 sobre hielo durante 45 minutos. Las células se colocaron sobre placas recubiertas con IgM anti ratón de cabra como es descrito previamente (Wysocki y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. 1978, 75:2844-8). El DNA de plásmido se. rescató de las células colocadas en placas y se transformaron en 293T. El DNA de plasmido expandido se transfectó nuevamente, y el mismo procedimiento cuatro veces más. Después 96 acumulaciones que contienen 30 colonias cada una se prepara y se clasificaron por la reactividad de EB-1. Finalmente, 17 clones de dos acumulaciones positivas se clasificaron, y tres colonias individuales que dirigieron la reactividad EB-1 sobre 293T se aislaron utilizando la transfección de DEAE dextrano de micro escala y el ensayo de inmunofluorescencia. El plásmido cDNA aislado se digirió mediante Xhol y HindIII y se clonó en el vector BlueScript (pBSK) KS(-?-)de fagémido. Los mutantes de supresión de este clon se prepararon con equipo de supresión de Kilo-Secuencia. La secuenciación de terminación de diseoxinucleótido se realizó por ya sea los cebadores de tintes T3/T7 o cuatro terminadores de dideoxi a la medida adicionales con el equipo de secuenciación de ciclo terminador de tinte PRISM y el secuenciador DNA modelo 377 manufacturado por Applied Biosystems. La búsqueda de impulso utilizando la secuencia de DNA identificada a través de este procedimiento reveló que el antígeno reconocido por el anticuerpo EB-1 es CD43 humano. Para confirmar que el anticuerpo EB-1 reconoció los antígenos CD43, humano, en células 293T transfectadas con CD43 humano, se mancharon con anticuerpo EB-1 y un anticuerpo anti-CD43 bien conocido, DFT-1. Como se muestra en la FIG. 5, el anticuerpo EB-1 no fue reactivo contra las células 293T de tipo silvestre, mientras que las células 293T transfectadas con CD43 se mancharon por ambos de los anticuerpos EB-1 y DFT 1. Así, EB-1 es un anticuerpo monoclonal contra CD43 humano. Como CD43 es una proteína densamente glicosilada, los inventores se investigaron si el tratamiento con sialidasa de las moléculas CD43 modifica la inmunoreactividad del anticuerpo EB-1 contra el antígeno CD43. La FIG. 6 muestra un análisis citométrico de flujo de células Molt-4 con o sin tratamiento con sialidasa. La línea de guiones representan el perfil de manchado negativa mediante un anticuerpo irrelevante, y la línea sólida delgadas y gruesas representan la inmunoreactividad del anticuerpo EB-1 sobre las células Molt-4, no tratadas y tratadas con sialidasa respectivamente. La inmunoreactividad del anticuerpo BB-1 sobre las células Molt-4 no fue afectada por el tratamiento de sialidasa. Para confirmar estos resultados, SDS-PAGE y el manchado de Western se llevaron a cabo. Ix 10' de timocitos humanos o células de tumor Molt-4 con o sin tratamiento con sialidasa se suspendieron en 1 ml de solución reguladora de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 74, NaCl 150 mM, Nonidet P-40 0.5% p/v y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)), 1 mM, se agitaron a 4°C durante 30 minutos, y se centrifugaron a 13,000 g durante 15 minutos para la remoción de los núcleos. El sobrenadante se separó mediante electroforesis sobre geles de dodecil sulfato poliacplamidas al 10% (SDS-PAGE) bajo las condiciones reducidas. La concentración de acrilamida de los geles de separación fue 10% y los marcadores de peso molecular apropiados se utilizaron. La transferencia electroforética de proteínas a membranas de nitrocelulosa se hizo un 45 V durante 16 horas. Después de la transferencia de proteína, las membranas de nitrocelulosa se incubaron por dos horas con solución reguladora de bloqueo que contiene leche descremada al 5% y Tween-20 al 0.05% en PBS, y luego se incubaron durante la noche con anticuerpo EB-1 diluido en solución reguladora de bloqueo en 1? g/ml de concentración. Las membranas se enjuagaron tres veces con solución reguladora de lavado (PBS con Tween 20 al 0.05%) y se incubaron durante 1 h con mmunog 1 obulina G anti ratón de cabra purificada por afinidad conjugada con peroxidada a rábano picante diluida 1:3000 en solución reguladora de boqueo. Después de tres lavados, cada banda de proteina reactiva se detecto mediante el equipo de quimiluminescencia aumentadas (ECL) manufacturado por Amersham Pharmacia Biotech. La FIG. 7 muestra un análisis de SDA-PAGE y manchado de Western de timocitos (A & B) y el lisado de célula Molt-4 (C & D) con el anticuerpo EB-1. Las granjas A y C representan la electroforesis de lisado celular que no se trata con sialidasa, mientras que las franjas B y D fue la electroforesis de lisado tratado con sialidasa. El anticuerpo EB-1 reconoció ambas de las moléculas CD43. Tratadas y no tratadas con sialidasa. Esto sugiere que el anticuerpo EB-1 podría reconocer la región un glicosilada de la molécula CD43. EJEMPLO 9 Con el fin de determinar el epítope CD43 reconocido por el anticuerpo EB-1, se construyeron mutantes de CD43. La secuencia de codificación para el gen CD43 se amplificó a partir de un cDNA de CD43 y se utilizó para la construcción de vectores de expresión. Por ejemplo, para producir la proteína de fusión de glutationa-S-transferasa (GST) , se construían plásmidos recombinantes de CD43 al clonar fragmento de PCR en el vector pGEX-2T manufacturado por Pharmacia. Los cavadores utilizados para la amplificación de PCR se seleccionaron basados en la secuencia en GeneBank y se modificaron para contener BamHl y cualquiera de los sitios de restricción EcoRl, o Bglll para facilitar la clonación. Ambos productos de PCR purificados y el vector pGEX-2T se digirieron con BamHl y ya sea Bglll o EcoRl a 37°C durante la noche, se ligaron con DNA ligasa T4 manufacturada a 16°C durante la noche, y luego se utilizaron para transformar células TOP10F' competentes de E. coli . La FIG. 8 muestra un diagrama esquemático de 11 mutantes de supresión de CD43. Por ejemplo, el pGEXl-253 representa el vector pGEX-2T que contiene del 1ro al 253avo aminoácidos de CD43 humano. Para expresar proteína de fusión de GST que contiene secuencias de CD43 humanas, células TOP10 de E. coli transformadas con plásmidos recombinantes se cultivaron a 37°C durante la noche en el medio de caldo Luria (LB) que contiene 50 µg/ml de ampicilina. Las células cultivadas durante la noche se diluyeron 20 veces con medio LB fresco que contiene la misma concentración de ampicilina y se cultivaron a 37°C por 3 a 4 h hasta que se alcanzó un valor de densidad óptica de 0.6. La expresión del gen se indujo al adicionar IPTG en el cultivo una concentración final de 1 niM. Después de 4 h de incubación a 37°C con agitación constante, las células se formaron en pelotillas mediante centrifugación a 6000 g durante 15 minutos a 4°C y se resuspendieron con 3 ml de solución reguladora de lisis (Tris-HCl 50 M, pH 8.0, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM) para cada gramo de células empacadas. La suspensión se incubó sobre hielo durante 30 min con una concentración final de PMSF 0.2 mM. Para el manchado de Western de mutante de CD43 con el anticuerpo BB-1, las alícuotas de cada lisado de proteína de fusión GST-CD43 se separaron mediante electroforesis sobre geles de dodecií sulfato de sodio (SDS) poliacrilamida al 10% seguido por el manchado sobre membranas de nitrocelulosas . La membrana de nitrocelulosa se mancho con anticuerpo EB-1 o anticuerpo policlonal anti-GST y cada banda de proteína reactiva se detecto mediante quimioluminiscencia aumentado de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 8. La FIG. 9 muestra el análisis de manchado de Western del mutante CD43 con los anticuerpos EB-1 (A) y anti-GST (B) . La franja 1 representa pGEXl-253, franja 2 pGEXl-98, franja 3 pGEXl-87, franja 4 pGEXl-81, franja 5 pGEXl-75, franja 6 pGEXl-70, franja 7 pGEX70-99, franja 8 pGEX71-81, franja 9 pGEX73-81, franja 10 pGEX76-81, franja 11 pGEX73-80, franja 12 pGEX2T, y franja 13 lisado de timocito humano. Como se muestra en la FIG. 9, pGEX73-81 contiene la secuencia mínima para el reconocimiento del antígeno de CD43 mediante EB-1 y así el epítope de CD43 para el anticuerpo EB-1 es el 73rd a 81st aminoácido de la secuencia de CD43. La secuencia es como sigue, Glu Gly Ser Pro Leu Trp' Thr Ser He (SEQ ID NO:2). Por lo tanto, estas secuencias muy útil en el aspecto que el epítope reconocido por el anticuerpo EB-1 no expresado sobre células de sangre madura, célula madre hematopoyéticas, subconjuntos de precursor hematopoyéticos en médula ósea o cualquiera de los tejidos no hematopoyético. EJEMPLO 10 Los ejemplos 3, 5, 6 y 7 muestran que la inmunoreactividad de EB-1 es restringida a subconjuntos de precursores hematopoyéticos en médula ósea excepto para células madre hematopoyéticas. En este ejemplo la reexpresión del epítope de CD43 reconocido por el anticuerpo EB-1 sobre células leucémicas se investigaron de acuerdo con el análisis citométrico de flujo del Ejemplo 3. La sangre periférica se recolecto en el tubo EDTA de paciente se leucemia y eritrocitos y granulocito maduro se removieron mediante centrifugación utilizando Ficoll-Hypaque manufacturado por Amersham Pharmacia Biotech. Las células purificadas se mancharon con FITC-conjugado con EB-1 y se analizaron utilizando citómetro de flujo. La Tabla 4 enseguida es el resultado del análisis de marcador de muestras leucémicas utilizando el anticuerpo EB-1 mediante la citometría de flujo. En 31 de 38 casos de leucemia (81.6%), que incluyen leucemia mielógena aguda (AML) , Leucemia linfógena aguda (ALL) y leucemia mielógena crónica (CML) con crisis de blasto, células de tumor se mancharon mediante el anticuerpo EB-1. La FIG. 10 muestra el patrón de manchado citométrico de flujo de representativo de célula de leucémicas utilizando el anticuerpo EB-1. La línea sólida representa el manchado mediante el anticuerpo EB-1 y el perfil de manchado negativo con un anticuerpo relevante se muestra como el histograma lleno . TABLA 4 Tipo de leucemia No. de Positividad CB-1 Casos No. de casos AML 22 20 90.9 Ml 6 6 100.0 M2 8 7 87.5 M3 1 1 100.0 M4 4 4 100.0 Otros 3 2 66.7 ALL 13 9 69.2 CML con crisis de blasto 3 2 66.7 Total 38 31 81.6 El presente ejemplo también se llevó a cabo de acuerdo con el análisis mmunohi stoquimico del Ejemplo 2 para investigar si el anticuerpo EB-1 es reactivo contra las células de linfoma li nfoblástico utilizando el anticuerpo EB-1 purificado del Ejemplo 4 como anticuerpo primario. La FIG. 11 muestra el patrón de inmunomanchado representativo del tejido de linfoma lmfoblástico del anticuerpo EB-1. Como un total, 4 de cada 9 (44.4%) de casos de linfoma linfoblástico mostraron manchado positivo por anticuerpo de EB-1. Por lo tanto, el anticuerpo EB-1 y su epítope CD43 podrían ser herramientas potentes de diagnóstico y terapéuticas para varios tipos de leucemia aguda, leucemia crónica con crisis de blastos y linfoma linfoblástico . EJEMPLO 11 Con el fin de determinar potencial terapéutico del anticuerpo EB-1, inmunotoxina EB-1 y el modelo de leucemia humana en ratones se desarrollaron. Para producir inmunotoxina, saporina manufacturada por Sigma, y el anticuerpo EB-1 se conjugaron por la vía de un enlace de disulfuro entre grupos sulfidrilo (SH) químicamente insertados (Polito y colaboradores., 2004). El modelo de leucemia humana en ratones se estableció por la inyección de 2x105 CCRF-CEM entre 300 µl Blume de PBS en la vena de la cola de ratones deficientes de RAG-1, una semana después, cada ratón se trató con cuatro dosis de 100 µg de ya sea el anticuerpo EB-1, la inmunotoxina De saporina de EB-1 o el anticuerpo irrelevante como una inyección de bolo (en un volumen de 300 µl de PBS) en la vena de la cola un día si y otro no (es decir, día, 7, 9, 11 y 13) . Cuatro semanas después de la inyección intravenosa de células CCRF-CEM, una muestra de sangre del plexo retro-orbital se mancho con anticuerpo EB-1 conjugado con FITC y el anticuerpo MHC clase I antihumano conjugado con PE de acuerdo con el análisis citométrico de flujo del Ejemplo 3 y 10. La FIG. 12 es un resultado representativo del análisis citométrico de flujo de células leucémicas en la sangre de los ratones. En los ratones de control, 23.4% de células en la sangre periférica fueron ambos humanos (células CCRF-CEM positivas de MHC clase I humanas y CD43) donde las células CCRF-CEM se redujeron hasta 1.3% en el ratón tratado con inmunotoxina de saporina de EB-1. La carga de célula leucémica también se disminuyó aproximadamente dos veces en el ratón tratado con el anticuerpo EB-1 solamente, comparado con a que en el ratón de control. Así, el anticuerpo EB-1 podría proporcionar herramientas efectivas para el tratamiento de células leucémicas agudas a través de suministro de material tóxico en las células de tumor, la citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC), u otros mecanismos. EJEMPLO 12 El anticuerpo EB-1 reconoce el 73rd a 81st aminoácido de la secuencia de CD43, Glu Gly Ser Pro Leu Tip Thr Ser He (SEQ ID NO: 2) . El presente ejemplo se llevó a cabo para desarrollar nuevos anticuerpos anti-CD43 que son útiles para la diagnosis y tratamiento de leucemia en linfoma. El fragmento de DNA que codifica el 70th a 98th aminoácido se la secuencia de CD43 que incluye la SEQ ID NO : 2 se clonaron en el vector pQE-40, luego se utilizaron para trasformar células TOP10F' de E. Col l competentes. Las células TOP10F' transformadas se cultivaros de acuerdo con los métodos del Ejemplo 9, y la proteína de fusión de CD43 se purifico de lisado de E. coli al pasar el lisado E. coli a través de una columna de Níquel manufacturada por Amersham Pharmacia Biotech. 100 µg de proteína de fusión SY-CD43 se mezcló con adyuvante de Freund completo y se administró intraperitonealmente y se inmunizó en los ratones Balb/c. cuatro semanas después, dos dosis de 100 µg adicionales de proteína de fusión SY-CD43 mezcladas con adyuvante de Freund incompleto en intervalo de dos semanas se administraron intraperitonelamente . Tres días después de refuerzo final, el bazo se removió de los ratones inmunizados y las células de hibridomas se prepararon de acuerdo con método de fusión del Ejemplo 1. es sobrenadante de cultivo de la célula de hibpdoma se clasificó utilizando células EL4 de murino transfectadas con CD43 humano mediante citometría de flujo, y dos clones de h bridoma que son reactivos contra las células que EL4 transfectadas con CD43 se seleccionaron y se nombraron EB-2 y EB-3, respectivamente. La FIG. 13 muestra el análisis citométrico de flujo de la línea de célula EL4 transfectadas con CD43, timocitos humano, células de sangre periférica humanas y células de leucemia aguda humanas mediante los anticuerpos EB-2 y EB-3. La línea de células EL4 transfectadas con CD43, timocitos humanos y células leucémicas humanas fueron positivas, pero las células de la sangre de la periférica humanas fueron negativas a ambos de los anticuerpos EB-2 y EB-3. Así, el patrón de manchado de ambos de los anticuerpos EB-2 y EB-3 es similar a aquel de EB-1. Ejemplo 13 El presente ejemplo se llevó a cabo para determinar el epítope CD43 reconocido por anticuerpos EB-2 y EB-3 de acuerdo con SDS-PAGE y manchado de Western del Ejemplo 9 utilizando mutantes de supresión de CD43. La FIG. 14 muestra el análisis de manchado de Western del mutante CD43 con EB-2 y EB-3. El epítope CD43 para los anticuerpos EB-3 es similar a aquel para EB 1. Esto es, el epítope mínimo para ambos de los anticuerpos EB-1 y EB-3 son 73rd o 81st aminoácidos de secuencia de CD43 (SEQ ID NO: 2; Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser He) . Sin embargo, el anticuerpo EB-2 nos podría reconocer la secuencia de péptidos más pequeña que EB-1 y EB-3. El epítope mínimo para EB-2 es 76th o 8151 aminoácidos de la secuencia de CD43. La secuencia es como sigue, Pro Leu Trp Thr Ser He (SEQ ID NO : 1 ) . El epítope CD43 de la presente invención es útil para la diagnosis de leucemia aguda, leukemia crónica con crisis de blasto y linfoma linfoblástico mediante la determinación de si este epítope CD43 expresado en el examen de tejido o el examen de sangre periférica debido a que éste es el epítope CD43 de la presente invención que no se encuentra en el tejido no hematopoyético normal, células de sangre maduras y timocitos aceptos de sangre periférica activados. El epítope CD43 de la presente invención se puede utilizar como material objetivo para el tratamiento de leucemia aguda, leucemia crónica con crisis de blasto y linfoma linfoblástico debido a que no se expresa sobre células madre hematopoyéticas y el tejido normal excepto los timocitos y subconjuntos de precursores hematopoyético en la médula ósea. La ' descripción de modalidades ejemplares de polipéptidos biológicamente activos es ilustrativa de la presente invención. Debido a la variación que será evidente para aquellos expertos en la técnica, sin embargo, la presente invención no se propone para ser limitada a las modalidades particulares descritas en lo anterior. El alcance de la invención se define en las siguientes reivindicaciones.

Claims (30)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un polipéptido aislado para el epítope de CD43, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
  2. 2. Un polipéptido aislado de conformidad con 1a reivindicación 1 , caracterizado porque es de menos de 100 aminoácidos en longitud.
  3. 3. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es de menos de 50 aminoácidos en longitud.
  4. 4. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el epítope de CD43 es específicamente expresado sobre timocitos, subconjuntos de precursores hematopoyéticos en médula ósea, células de leucemia aguda, células de blasto de leucemia crónica con crisis de blasto y células de linfoma linfoblástico.
  5. 5. EJ polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación, caracterizado porque el epítope de CD43 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
  6. 6. Un anticuerpo o su fragmento que especí ficamente enlaza a un epítope CD43, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l.
  7. 7. Un anticuerpo o su fragmento que enlaza a un péptido, caracterizado porque consiste de una secuencia de aminoácidos de la SLQ TD NO:l.
  8. 8. El anticuerpo o su fragmento de conformidad con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, caracterizado porque el epítope de CD43 es específicamente expuesto en timocitos, subconjuntos de precursores hematopoyéticos en médula ósea, células de leucemia aguda, células de blasto de leucemia crónica con crisis de blasto y células de linfoma linfoblástico pero no en células hematopoyéticas maduras, células madre hematopoyéticas, y células no hematopoyéticas.
  9. 9. El anticuerpo o su fragmento de conformidad con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, caracterizado porque el anticuerpo específicamente enlaza a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
  10. 10. El anticuerpo o su fragmento de conformidad con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, caracterizado porque el anticuerpo se produce al inmunizar un animal con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:1, y al clasificar el anticuerpo que específicamente enlaza a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l.
  11. 11. El anticuerpo o su fragmento de conformidad con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, caracterizado porque el anticuerpo es - un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal.
  12. 12. El anticuerpo o su fragmento de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo es anticuerpo monoclonal humano o animal.
  13. 13. El anticuerpo o su fragmento de conformidad con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado.
  14. 14. El anticuerpo o su fragmento de conformidad con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, caracterizado porque el anticuerpo o su fragmento es marcado con el compuesto seleccionado del grupo que consiste de radioisótopo, material fluorescente, material luminiscente, enzima, y material de manchado.
  15. 15. El anticuerpo o su fragmento de conformidad con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, caracterizado porque el anticuerpo o su fragmento es enlazado a un material tóxico seleccionado del grupo que consiste de radioisót'opos, sustancias químicas tóxicas, proteínas tóxicas y agentes antitumorales .
  16. 16. El anticuerpo o su fragmento de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo o su fragmento se combina con las proteínas tóxicas para producir una proteína de fusión.
  17. 17. Una célula, caracterizada porque produce el anticuerpo o su fragmento de conformidad con la reivindicación 6 o reivindicación 7.
  18. 18. Un método para diagnosticar leucemia aguda, caracterizado porque comprende células de leucemia en una muestra biológica con el anticuerpo de epítope anti-CD43 de conformidad con la reivindicación 6 o reivindicación 7, y detectar la reacción inmune positiva al anticuerpo de epítope anti-CD43.
  19. 19. El método para diagnosticar leucemia aguda de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la detección de la reacción inmune positiva podría ser confirmada utilizando el dispositivo que detecta la reacción de enzima, fluorescencia, luminescencia, o radiación.
  20. 20. Un método para diagnosticar leucemia crónica con crisis de blasto, caracterizado porque comprende incubar células de leucemia en una muestra biológica con anticuerpo de epítope anti-CD43 de conformidad con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, y detectar la reacción inmune positiva al anticuerpo de epitope anti-CD43.
  21. 21. Un método. para diagnosticar linfoma linfoblas tico, caracterizado porque comprende incubar células de linfoma en una muestra biológica con el anticuerpo de epítope anti-CD43 de conformidad con la reivindicación 6 o reivindicación 7, y detectar la reacción inmune positiva al anticuerpo de epítope anti-CD43.
  22. 22. Un método para tratar la leucemia aguda, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de epítope anti-CD43 de conformidad con la reivindicación 6 o la reivindicación 7.
  23. 23. Un método para tratar la leucemia aguda de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado por el anticuerpo de epítope de anti-CD43 es enlazado a un material tóxico seleccionado del grupo que consiste de radioisótopos, sustancias químicas tóxicas, proteínas tóxicas y agentes antitumorales .
  24. 24. Un método para tratar la leucemia crónica con crisis de blasto, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de epítope anti-CD43 de conformidad con la reivindicación 6 o reivindicación 7.
  25. 25. Un método par tratar el linfoma linfoblástico, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de epítope anti-CD43 de conformidad con la reivindicación 6 o la reivindicación 7.
  26. 26. Una composición farmacéutica para tratar la leucemia aguda, caracterizada porque comprende un anticuerpo de epítope anti-CD43 de conformidad con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, y un portador farmacéuticamente aceptable .
  27. 27. Una composición farmacéutica para tratar la leucemia crónica con crisis de blasto, caracterizada porque comprende un anticuerpo de epítope anti-CD43 de conformidad con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, y un portador farmacéuticamente aceptable.
  28. 28. Una composición farmacéutica para tratar linfoma lmfoblas tico, caracterizada porque comprende un anticuerpo de epítope ant?-CD43 de conformidad con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, y un portador farmacéuticamente aceptable.
  29. 29. Un equipo de diagnóstico para leucemia, caracterizado porque comprende un anticuerpo de epítope anti-CD43 de conformidad con la reivind cación 6 o la reivindicación 7.
  30. 30. Un equipo de diagnóstico para lmfoma, caracterizado porque comprende un anticuerpo de epítope anti-CD43 de conformidad con la reivindicación 6 o la reivindicación 7.
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