BRPI0611044A2 - polipeptÍdio isolado, anticorpos ou respectivos fragmentos, cÉlula, mÉtodos de diagnàstico e de tratamento da leucemia aguda, da leucemia crânica com crise de blastos e do linfoma linfoblÁstico, composiÇÕes farmacÊuticas e kits de diagnàstico - Google Patents

polipeptÍdio isolado, anticorpos ou respectivos fragmentos, cÉlula, mÉtodos de diagnàstico e de tratamento da leucemia aguda, da leucemia crânica com crise de blastos e do linfoma linfoblÁstico, composiÇÕes farmacÊuticas e kits de diagnàstico Download PDF

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Kyeong-Cheon Jung
Eun-Young Choi
Seong-Pyo Park
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Abstract

Polipeptidio Isolado, Anticorpos ou Respectivos Fragmentos, Célula, Métodos de Diagnóstico e de Tratamento da Leucemia Aguda, da Leucemia Crônica com Crise de Blastos e do Linfoma Linfoblástico, Composições Farmacêuticas e Kits de Diagnóstico A presente invenção relaciona-se com um epitopo de GD43 expresso na leucemia aguda humana e nas células do linfoma linfoblástico e seu uso. Mais particularmente, a presente invenção relaciona-se com um epitopo CD43 expresso na leucemia aguda humana e nas células do linfoma linfoblástico, mas, não em células hematopoiéticas maduras e células-tronco hematopoiéticas e células não hematopoiéticas e à sua aplicação diagnóstica e terapêutica sobre a leucemia aguda e o linfoma linfoblástico.

Description

"Polipeptídio Isolado, Anticorpos ou Respectivos Fragmentos,Célula, Métodos de Diagnóstico e de Tratamento da LeucemiaAguda, da Leucemia Crônica com Crise de Blastos e do LinfomaLinfoblástico, Composições Farmacêuticas e Kits de Diagnóstico"
Relatório Descritivo
Referência Remissiva
a Pedido Correlato
Este Pedido reivindica prioridade e o benefício de PedidoProvisório US 60/679.910, depositado em 11 de maio de 2005 e11/312.126, depositado em 20 de dezembro de 2005 na Repartição dePatentes e Marcas dos Estados Unidos e do Pedido de Patente Coreano2005-0077906 depositado no Escritório Coreano de Propriedade Intelec-tual em 24 de agosto de 2005, cujos conteúdos inteiros são aqui incorpo-rados por referência.
Campo da Invenção
A presente invenção relaciona-se com um epítopo CD43expresso na leucemia aguda humana e células do linfoma linfoblástico eseu uso. Mais particularmente, a presente invenção relaciona-se comum epítopo CD43 expresso na leucemia aguda humana e células dolinfoma linfoblástico, mas, não em células hematopoiéticas maduras ecélulas-tronco hematopoiéticas e células não hematopoiéticas e com asua aplicação diagnostica e terapêutica sobre a leucemia aguda e olinfoma linfoblástico.
Antecedentes da Invenção
A molécula de CD43, também chamada de sialoforina ou leucossi-alina, é uma molécula de superfície celular expressa na maioria decélulas hematopoiéticas exceto eritrócitos. O CD43 humano tem umdomínio extracelular semelhante a mucina de 235 aminoácidos (aa), umdomínio de transmembrana de 23 as e um domínio intracitoplásmico123, todos codificados por um exon (Pallant e colaboradores., Proc NatlAcad Sei USA. 1989, 86:1328-32; Shelley e colaboradores, ProeNatlAeadSei USA 1989, 86:2819-23). O domínio extracelular do CD43 humano érico em aminoácidos de serina (46 resíduos) e treonina (47 resíduos), amaioria dos quais carrega mais ou menos 80 cadeias de carboidratoligado a O. Além disso, o CD43 carrega 1 cadeia de carboidrato ligado aΝ. A estrutura destes glicanos 0 varia a partir de um tipo de célula atéoutro (Carlsson e colaboradores, J. Biol Chem. 1986, 261:12787-95).
O gene CD43 consiste em dois exons, separados por umintron 378 bp, pelo que o produto de translação inteira é codificado pelosegundo exon (Shelley e colaboradores, Biochem J. 1990, 270:569-76).Tem-se acreditado que o CD43 é um específico marcador do tipo leucóci-to restrito à maioria dos leucócitos, plaquetas e células-tronco hemato-poiéticas, com exceção de eritrócitos (Remold-OOonnell e colaboradores,Blood, 1987, 70:104-9; Fukuda, Glycobiology, 1991, 1:347-56). Todavia,a expressão de CD43 em células Tumor humanas de origem não hema-topoiética, tal como uma linha de células de câncer da cerviz uterinahumana (CaSKI), uma linha de células de câncer de pulmão humano(A549), uma linha de células de adenocarcinoma do seio humano(MCF7), uma linha de células do fibrossarcoma humano (HT 1080) elinhas de células de adenocarcinoma humano do cólon (COLO 205, HT29, Caco-2, DLD-I e SW480), foi demonstrada (Fernandez-Rodriguez ecolaboradores, Tumour Biol 2002, 23:193-201). O CD43 é tambémexpresso em tecido caqnceroso de cólon humano (Sikut e colaboradores,Int J Câncer. 1999, 82:52-8; Jung e colaboradores, Korean J Pathol38:8-14).
Estudos biossintéticos mostram que o precursor do CD43,com um tamanho predito de cerca de 40 kDa (incluindo um N-glicano),migra com uma massa molecular aparente de 54 kDa por eletroforese.
Este precursor é subseqüentemente convertido numa molécula glicosila-da madura de tamanho a partir de 115 kDa até mais do que 200 kDadevido a glicosilação variável. Timócitos, linfócitos T CD4+ T e monócitosexpressam mais de uma isoforma de 115 kDa, enquanto uma forma de130 kDa é encontrada principalmente em células ativadas T CD4+, CD8'células T em repouso e ativadas, neutrófilos, plaquetas e células B(Rosenstein e colaboradores, Immunol Res. 1999, 20:89-99). Parece quemais de uma isoforma pode ser co-expressa na superfície do mesmo cc11. Resulta um padrão de glicosilação 0 pós-translacional firmementeregulado nestas isoformas característica de peso molecular que sãodiferencialmente expressas em diferentes tipos de células. Especialmen-te, a expressão do núcleo 2 β-l, 6-N-acetilglucosaminiltransferase(C2GnT) resulta na expressão da isoforma CD43 de 130 kDa em timóci-tos e células T (Piller e colaboradores, J. Biol Chem. 1988, 263:15146-50).
Até recentemente, mais de 17 anticorpos de CD43 anti-humanos tinham sido reportados. A maioria destes anticorpos reagecom epítopos de carboidrato no domínio extracelular e todos os sabidosanticorpos anti-CD43 conhecidos detectam a proteína de CD43 expressaem células hematopoiéticas maduras (Tabela 1). Deste modo, não sãoeficientes em detectar ou erradicar as células leucêmicas ou de linfoma.<table>table see original document page 5</column></row><table><table>table see original document page 6</column></row><table><table>table see original document page 7</column></row><table>Sumário da Invenção
Um objetivo da presente invenção é proporcionar um epítopoCD43 associado a linfoma linfoblástico e leucemia crônica com crise deblastos e leucemia aguda onde o epítopo é exposto em células de leuce-mia aguda humana e linfoma linfoblástico, mas, não em células hemato-poiéticas maduras e células-tronco hematopoiéticas. Deste modo, apresente invenção proporciona um polipeptídio isolado para epítopoCD43 compreendendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
Outro objetivo da presente invenção é prover material quereconheça o epítopo CD43. Preferentemente, a presente invenção proveum anticorpo ou seu fragmento que se liga especificamente a um epítopoCD43 compreendendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
Um terceiro objetivo da presente invenção é proporcionar ummétodo de produção dos materiais que reconhecem o epítopo CD43.
Um quarto objetivo da presente invenção é prover materialpara a diagnose da leucemia aguda, da leucemia crônica com crise deblastos e do linfoma linfoblástico.
Um quinto objetivo da presente invenção é proporcionar ummétodo de diagnóstico da leucemia aguda, da leucemia crônica com crisede blastos e do linfoma linfoblástico. Deste modo, a presente invençãoproporciona um método de diagnóstico da leucemia aguda compreen-dendo células de leucemia numa amostra biológica com anticorpo deepítopo anti-CD43 e detectar a reação positiva ao anticorpo de epítopoanti-CD43. A presente invenção proporciona um método de diagnósticoda leucemia crônica com crise de blastos compreendendo incubarcélulas de leucemia numa amostra biológica com anticorpo anti-CD43epitope e detectar a reação positiva ao anticorpo de epítopo anti-CD43. A presente invenção proporciona um método de diagnóstico dolinfoma linfoblástico compreendendo incubar células de linfoma numaamostra biológica com anticorpo de epítopo anti-CD43, de acordo com aReivindicação 6, e detectar a reação positiva ao anticorpo de epítopoanti-CD43.Um sexto objetivo da presente invenção é prover umacomposição farmacêutica que pode matar células tumorígenas de leuce-mia aguda, de leucemia crônica com crise de blastos e do linfoma linfo-blástico.
Um sétimo objetivo da presente invenção é proporcionar ummétodo para diagnose por uso do material de diagnóstico da presenteinvenção.
Além disso, a presente invenção é para proporcionar ummétodo de tratamento por uso do material terapêutico da presenteinvenção.
Breve Descrição dos Desenhos
Uma avaliação mais completa da invenção e muitas dasvantagens subordinadas da mesma serão prontamente evidentes àmedida que a mesma se torna melhor entendida por referência à descri-ção detalhada seguinte, quando considerada em conjunto com o desenhoanexo, em que:
a Figura 1 é uma fotografia da mancha imunohisto-química do timo pelo sobrenadante de clone de hibridoma que produzanticorpo monoclonal EB-I específico contra o epítopo.
a Figura 2 é uma fotografia da reatividade do anticor-po monoclonal EB-I sobre a superfície de timócitos humanos usandocitometria de fluxo de cor tripla.
a Figura 3 é uma fotografia do reatividade de anticor-po monoclonal EB-1 sobre a superfície de leucócitos de sangue periféricohumano e células-tronco hematopoiéticas de sangue de cordão usandocitometria de fluxo de cor tripla.
a Figura 4 é uma fotografia da reatividade do anticor-po monoclonal EB-I sobre a superfície de células de medula ósseahumana usando citometria de fluxo de cor tripla.
a Figura 5 é uma fotografia da reatividade do Anticor-po monoclonal BB-I sobre a superfície de linha de células 29T transfec-tadas por CD43 humano usando citometria de fluxo de cor única.a Figura 6 é uma fotografia da reatividade do anticor-po monoclonal EB-1 sobre a superfície de linha de células Molt-4 huma-nas com ou sem tratamento de sialidase usando citometria de fluxo decor única.
a Figura 7 é uma fotografia de análise de SDA-PAGEde timócito humano e lisato de linha de células Molt-4 com ou semtratamento de sialidase, seguido de immunoblotting com anticorpomonoclonal EB-1.
a Figura 8 é um diagrama esquemático de 11 tipos demutantes de deleção de CD43.
a Figura 9 é uma fotografia de análise de SDA-PAGEde 11 tipos de mutantes de deleção de CD43, seguido por immunoblot-ting com anticorpo monoclonal EB-1 e anticorpo policlonal anti-GST.
a Figura 10 é uma fotografia da reatividade do anti-corpo monoclonal EB-I sobre a superfície de células leucêmicas huma-nas usando citometria de fluxo de cor única.
a Figura 11 é uma fotografia de coloração imunohis-toquímica de tecido de linfoma linfoblástico por anticorpo monoclonalEB-1.
a Figura 12 é uma fotografia da reatividade de anti-corpos monoclonais EB-I e classe I de MHC anti-humanos usandocitometria de fluxo de cor dual sobre a superfície de células leucêmicasno sangue periférico de ratos deficientes em RAG-1 em que foram injeta-das células CCRF-CEM por via intravenosa e tratadas com EB-I ouanticorpos de controle.
a Figura 13 é uma fotografia da reatividade de doisanticorpos anti-CD43 adicionais (EB-2 e EB-3), que foram produzidospor imunização de ratos com epítopo CD43, sobre a superfície de linhade células ETA transfectadas com CD43, timócitos humanos, leucócitosde sangue periférico humano e amostra de leucemia humana usandocitometria de fluxo de cor única.
a Figura 14 é uma fotografia de análise de SDA-PAGEde 5 tipos de mutantes de deleção CD43, seguida por immunoblottingcom anticorpos monoclonais EB-2 e EB-3.
Descrição Detalhadas das Modalidades
A presente invenção é para proporcionar um epítopo CD43exposto sobre as células tumor de leucemia aguda, leucemia crônica comcrise de blastos e linfoma linfoblástico, mas, não em células hematopoié-ticas maduras e células-tronco hematopoiéticas. O CD43 da presenteinvenção é preferentemente um CD43 humano, cuja seqüência foisubmetida para o NCBI GenBank sob o acesso N0 M61827. O epítopoCD43 é qualquer polipeptídio que inclui seqüência de aminoácidos emSEQ ID NO: 1 (doravante, EP6) e, com maior preferência, inclui seqüên-cia de aminoácidos em SEQ 1:.D NO: 2 (em seguida, EP9).
EP6: Pro Leu Tip Thr Ser Ile (SEQ ID NO: 1)
EP9: Glu Gly Ser Pro Leu Tip Thr Ser Ile (SEQ ID NO: 2).
Numa modalidade preferida, a presente invenção proporcio-na um polipeptídio de menos do que 200 aminoácidos de comprimento,com maior preferência, menos do que 100 aminoácidos de comprimento,com maior preferência, menos do que 50 aminoácidos de comprimento,compreendendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:l ou SEQID NO:2.
A presente invenção também proporciona um polipeptídioque consiste essencialmente numa seqüência de aminoácidos de SEQ IDNO:l ou SEQ ID NO:2. A presente invenção também proporciona umpolipeptídio que consiste numa seqüência de aminoácidos de SEQ IDNO: 1 ou SEQ ID NO:2.
O epítopo CD43 (EP6 e EP9) poderia ser purificado a partirde tecidos humanos, sintetizado quimicamente ou produzido por biotec-nologia.
A presente invenção é também para prover material quereconhece o epítopo CD43 da presente invenção. O material é seleciona-do a partir do grupo que consiste em anticorpo, seu fragmento e ligantese o anticorpo é preferentemente selecionado a partir do grupo queconsiste em anticorpo monoclonal e policlonal e, com maior preferência,é originado a partir de humano e animal.
Os anticorpos compreendem partes de anticorpo incluindo aregião de reconhecimento de antígeno ( Vh e VL), assim, tem a capacidadede reconhecer preferencialmente antígeno. Além disso, inclui tambémfragmento de anticorpo, tal como Ffab^, Fab e Fv. Preferencialmente, ofragmento de anticorpo (Fv) compreende um fragmento de polipeptídio decadeia única de anticorpo, assim chamada cadeia única Fv, que épreparado inserindo um peptídio de elo entre dois polipeptídios, Vh e Vlpara aumentar estabilidade ao calor.
A presente invenção provê ainda anticorpos quiméricos quereconhecem o epítopo CD43 da presente invenção. Conforme aquiusada, a palavra "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo em queas regiões variáveis de anticorpos derivados a partir de uma espécie sãocombinadas com as regiões permanentes de anticorpos derivados apartir de uma espécie diferente ou alternativamente refere-se a anticor-pos enxertados CDR. Os anticorpos quiméricos são construídos portecnologia de DNA recombinante e são descritos em Shaw e colaborado-res, J. Immun., 138:4534 (1987), Sun, LK., e colaboradores., Proc. NatlAcad. Sei. EUA, 84:214-218 (1987), por exemplo.
Outras técnicas conhecidas podem ser usadas para geraranticorpos enxertados e quiméricos CDR. "CDR" ou "região de determi-nação de complementaridade" ou "região hipervariável" é definida comoas seqüências de aminoácido sobre as cadeias leves e pesadas de umanticorpo que formam a estrutura de laço tridimensional que contribuipara a formação do site de ligação do antígeno.
Conforme aqui usada, a palavra anticorpo "enxertado CDR"refere-se a um anticorpo tendo uma seqüência de aminoácidos em quepelo menos partes de uma ou mais seqüências de CDR no domínio levee/ou variável foram substituídas por partes análogas de seqüências deCDR a partir de um anticorpo tendo uma especificidade de ligaçãodiferente para um dado antígeno ou receptor.As condições "região variável de cadeia leve" e "região variávelde cadeia pesada" referem-se às regiões ou domínios na parte terminal Ndas cadeias leves e pesadas respectivamente que têm uma seqüência deaminoácidos primários variados para cada anticorpo. A região variáveldo anticorpo consiste no domínio terminal amino das cadeias leves epesadas quando se dobram em conjunto para formar um sítio de ligaçãotridimensional a um anticorpo.
As seqüências CDR análogas são ditas serem "enxertadas"sobre o substrato ou anticorpo recipiente. O anticorpo "doador" é oanticorpo que fornece a seqüência de CDR e o anticorpo que recebe asseqüências substituídas é o anticorpo de "substrato". Uma pessoa decapacodade na técnica pode produzir prontamente estes anticorposenxertados CDR usando os ensinamentos aqui proporcionados emcombinação com métodos bem conhecidos na técnica (ver Borrebaeck,C.A., Antibody Engineenng: A Practical Guide, W.H. Freeman and Com-pany, Nova Iorque, 1992, incorporada por referência).
Esta invenção provê ainda anticorpos humanizados quereconhecem o epítopo CD43 da presente invenção. Conforme aquiusada, a palavra "anticorpo humanizado" refere-se a formas de anticor-pos que contêm seqüências a partir de anticorpos não humanos (porexemplo, murino), assim como também anticorpos humanos. Essesanticorpos são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínimaderivada a partir de imunoglobulina não humana. Em geral, o anticorpohumanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um etipicamente dois domínios variáveis, em que todo ou substancialmentetodos os laços hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobu-lina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR sãoaquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpohumanizado compreenderá opcionalmente também pelo menos umaparte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a deuma imunoglobulina humana. Ver, por exemplo, Cabilly, Patente US4.816.567; Queen e colaboradores, (1989) Proc. Nat'l Acad. Sei. USA86:10029-10033; e Antibody Engineenng: A Practical Approach (OxfordUniversity Press 1996).
Numa modalidade preferida da presente invenção, o anticor-po liga-se a um peptídio que consiste na seqüência de aminoácidosmostrada em SEQ ID NO:l.
O anticorpo ou seu fragmento podem ainda compreendermaterial de etiqueta que é selecionado a partir do grupo de radioisóto-pos, toxinas, materiais fluorescentes e materiais de coloração. Osexemplos dos materiais fluorescentes são fluorescein-5-isotiocianatos(FITC), ficoeritrina(PE), aloficocianina(APC) e biotina, mas, sem limitaçãoa eles.
O anticorpo ou seu fragmento podem ainda compreender ummaterial tóxico selecionado a partir do grupo que consiste em radioisóto-pos, substâncias químicas tóxicas, proteínas tóxicas e agentes anti-tumorígenos. O anticorpo ou seu fragmento é combinado com as proteí-nas tóxicas para produzir uma proteína de fusão. Os exemplos dasproteínas tóxicas incluem ricina, saporion, gelonina, momordina, toxóideda difteria e toxina de pseudomonas, mas, sem limitação a eles.
A presente invenção proporciona também um método paraproduzir o material e provê células que produzem o anticorpo. O métodode produção de anticorpo ou seu fragmento inclui as etapas de (a)imunizar um animal com polipeptídio, proteína ou fragmentos de proteí-na contendo ou células que expressam o epítopo CD43, (b) extrairesplenócitos a partir do animal imunizado, (c) fundir os esplenócitos comcélulas de mieloma e (d) triar células de hibridoma que produzem anti-corpos contra o epítopo CD43. O material pode ser obtido por cultura invitro ou injeção nos animais de células de produção dos materiais. 0material pode ser obtido a partir das ascites de animais em que ascélulas que produzem os materiais são intraperitonealmente injetadas.Os materiais podem ser purificados a partir do sobrenadante de culturaou ascites por cromatografia de troca de íons ou cromatografia de colunade afinidade.Numa modalidade, a presente invenção relaciona-se comuma composição farmacêutica para tratar a leucemia aguda, a leucemiacrônica com crise de blastos, o linfoma linfoblástico compreendendo umanticorpo de epítopo anti-CD43 ou seu fragmento e um portador farma-ceuticamente aceitável.
A administração do anticorpo ou seu fragmento de acordocom a invenção pode ser realizada usando quaisquer dos modos aceitosde administração de composições farmacêuticas. Desta maneira, aadministração pode ser, por exemplo, o material de reconhecimento deantígeno pode ser administrado oralmente ou, com maior preferência,parenteralmente nos pacientes, na forma de pó sólido, semi-sólido,liofilizado ou formas de dosagem líquida, tais como, por exemplo, table-tes, supositórios, pílulas, cápsulas de gelatina elástica mole e dura, pós,soluções, suspensões ou aerossóis ou similares, preferentemente emformas de dosagem da unidade adequada para administração simples dedosagens precisas. As composições farmacêuticas incluirão geralmenteum portador ou excipiente farmacêutico convencional e o anticorpo dainvenção como o/um agente ativo e, além disso, podem incluir outrosagentes medicinais, agentes farmacêuticos, portadores, adjuvantes,diluentes, veículos ou combinações dos mesmos. Esses excipientes,portadores ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis, assim comotambém métodos de fazer composições farmacêuticas para vários modosou administração são conhecidos daquelas pessoas de competência natécnica. A dosagem adequada do componente ativo pode ser selecionadadependendo da condição do sujeito, por exemplo, 3 mg para 6.000 mgpor 1 dia.
Numa modalidade, a presente invenção relaciona-se com ummétodo de tratar a leucemia aguda, a leucemia crônica com crise deblastos, o linfoma linfoblástico usando o anticorpo ou seu fragmento,que é selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpo, fragmen-to de anticorpo, fragmento de anticorpo de polipeptídio de cadeia única eligante. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo é preferentementeselecionado a partir do grupo que consiste em anticorpos monoclonais epoliclonais e, com maior preferência, é originado a partir de humano eanimal. De preferência, o anticorpo ou seu fragmento inclui aindamaterial tóxico que é selecionado a partir do grupo que consiste emradioisótopos, substâncias químicas tóxicas, proteínas tóxicas e agentesanti- tumorígeno s.
Além disso, a presente invenção proporciona um método dediagnose da leucemia aguda, da leucemia crônica com crise de blastos edo linfoma linfoblástico usando o anticorpo ou seu fragmento. O métodoinclui as etapas de (a) incubar o anticorpo ou seu fragmento com umacélula numa amostra biológica e (b) detectar a amostra mostrando areação positiva contra o anticorpo. O tumor é preferentemente leucemiaaguda, leucemia crônica com crise de blastos ou linfoma linfoblástico.
Além disso, a presente invenção prvê um kit de diagnósticopara leucemia aguda, leucemia crônica com crise de blastos e linfomalinfoblástico que usa o material. O kit de diagnóstico poderia incluir ométodo para a detecção de reação de anticorpo-antígeno além do materi-al. O método de detecção é selecionado, de preferência, a partir do grupoque consiste em citometria de fluxo, imunohistoquímica, ensaio imuno-adsorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), imunoen-saio de enzima (EIA), imunoensaio de fluorescência (FIA) e imunoensaiode luminescência (LIA). O método de detecção inclui os materiais deetiquetagem, que poderiam ser selecionados a partir do grupo de enzi-mas (tais como peroxidase de rábano (HRP)), materiais fluorescentes (taiscomo FITC), materiais luminescentes (tais como luminol, isoluminol elucigenina) e isótopos (tais como 125I, 3H, 14C e 131I), mas, não deve serconsiderado como limitativo da mesma de forma nenhuma. A reativida-de do material de reconhecimento de antígeno poderia ser confirmadausando dispositivo de detecção da reação de enzima, fluorescência,luminescência ou radiação. O kit de diagnose pode ser feito em kit decitometria de fluxo, kit de imunohistoquímica, kit de ELISA ou kit de tiraincluindo o anticorpo ou seu fragmento.A presente invenção é ainda explicada com mais detalhe comreferência aos exemplos seguintes. Estes exemplos, todavia, não devemser interpretados como limitativos do âmbito da presente invenção demaneira nenhuma.
Exemplo 1
A fim de descobrir uma proteína de superfície celular especí-fica em timócitos, foram administrados timócitos humanos em ratosBalb/c para produzir anticorpos para timócitos humanos pelos exemplosseguintes.
IO7 de timócitos humanos foram intraperitonealmenteadministrados e imunizados em camundongos Balb/c em intervalo deduas semanas durante seis semanas. O baço de camundongos Balb/cfoi removido 3 dias depois da última administração para preparar para asuspensão de células do baço. Os anticorpos monoclonais foram produ-zidos fundindo as células de baço de Balb/c imunizados com timócitoshumanos com células de mieloma de camundongo SP2/0-Agl4 resisten-tes a 9-azaguaninas. O método da fusão celular seguiu o método deKoeler e Milstein (Koeler & Milstein, Nature, 1975, 256, 495-497). IO8células de baço foram fundidas com IO7 células de mieloma usando 50%de polietilenoglicol 4000. As células foram lavadas e re-suspendidas emmeio de Eagle modificado de Dulbeco (DMEM) contendo albumina desoro bovino a 20%, 100 μΜ de hipoxantina, 0,44 μΜ de aminopterina e16 μΜ de timidina (mídia HAT). As células foram introduzidas emquatro placas de 96 poços e propagadas artificialmente às 37°C e incu-badora a 5% de CO2. Quando colônias foram formadas depois de duassemanas, o sobrenadante foi preparado e foi observada a reatividade doanticorpo usando imunohistoquímica e citometria de fluxo.
O poço contendo mais de IO5 células por poço foi considera-do como grupo positivo. As células foram tiradas do poço que continhaanticorpo altamente reativo e subclonadas 0,5 por poço por ensaio dediluição de limitação para produzir clone de hibridoma estável comelevada reatividade de anticorpo. Este clone de hibridoma secretaanticorpo na mídia e o sobrenadante foi armazenado para as próximasetapas.
Exemplo 2
A fim de descobrir um clone que secrete anticorpo de reco-nhecimento do antígeno específica da superfície celular em timócitosentre os clones de hibridoma produzidos pelo Exemplo 1, foi executada acoloração da imunoperoxidase no slide de 4 pm de espessura de tecidofresco e tecido embutido em parafina fixado em formalina usando osobrenadante do clone de hibridoma produzido pelo Examplo 1 deacordo com o método de coloração do complexo de biotina-avidina (ABC)por ligação da avidina com a biotina. O sobrenadante de célula mono-clonal foi usado como anticorpo primário. O tecido embutido em parafi-na foi tratado com soro de camundongo normal e deixado permanecerpor 1 hora para impedir coloração de fundo não específica, depois daremoção da parafina. Depois de adicionar um anticorpo primário, foramdeixados permanecer durante a noite e lavados três vezes com soluçãosalina tamponado de fosfato (PBS). Foi adicionada a imunoglobulinaanti camundongo de cabra biotinilada usada como anticorpo secundário.Foi deixada permanecer à temperatura ambiente por 1 hora, lavada trêsvezes com PBS. Depois, foi adicionado o conjugado de estreptavidina eperoxidase de rábano. Foram adicionados 3,3'-diaminobezidina tetraclo-reto (DAB) e solução de H2O2 fabricada por DAKO para corar as células,tratadas por 20 minutos e lavadas três vezes com PBS. Foi observadosob microscopia de luz depois de coberta com vidro de cobertura.
As linhas de clone de hibridoma produzindo anticorpoespecífico para timócitos humano foram selecionadas. Um dos clonescujo anticorpo reconheceu timócitos foi nomeado como EB-1. A Figura 1é uma fotografia da coloração imunohistoquímica do timo com o sobre-nadante do clone de hibridoma que produziu anticorpo de EB-1. Con-forme mostrado na Figura 1, a maioria de timócitos é corada positiva-mente. A superfície celular dos timócitos foi fortemente manchada assimo antígeno reconhecido pelo anticorpo EB-I é antígeno de superfíciecelular.
Exemplo 3
Para avaliar a reatividade do anticorpo EB-I de acordo comas fases de desenvolvimento de timócitos, foi realizada a citometria defluxo. Timos humanos, que foram removidos a partir do paciente duran-te cirurgia cardíaca, foram finamente retalhados e foi preparada suspen-são de célula única. IxlO6 células foram suspensas em 100 μ 1 de PBS edistribuídas em tubos de ensaio. 100 μ 1 de sobrenadante de cultura deEB-I foram adicionados e agitados. A solução foi feita reagir a 4°Cdurante 30 minutos, centrifugada a 1.500 rpm durante 5 minutos e apelota foi lavada duas vezes com PBS para remover o anticorpo nãoreagido. A pelota foi suspensa em 50 μ 1 de solução contendo anticorposecundário diluído (Ig de camundongo anti-30 cabra conjugada comFITC fabricada por Zymed, reagida a 4°C durante 30 minutos em ambi-ente escuro. Depois de lavar duas vezes, a pelota foi suspensa em 50 μ 1de solução contendo anticorpo ficoeritrina (PE)- anti-CD8 conjugado eanticorpo aloficocianina (APC)-anti-CD4 conjugado, reagida a 4°Cdurante 30 minutos em ambiente escuro e, depois, lavada duas vezes.Finalmente, adicionaram-se 200 μΐ de PBS à pelota de célula depois decentrifugação. Os timócitos são classificados em quatro subconjuntos deacordo com o padrão de expressão de CD4 e CD8 (isto é, timócitos CD4CD8 duplos negativos, timócitos CD4+CD8+ duplos positivos e timócitosCD4+CD8 ou CD4CD8+ positivos únicos) e a relação de células positivasde EB-I e a intensidade e a coloração de EB-Iforam analisadas porcitometria de fluxo. A Figura 2 mostra os resultados de citometria defluxo de três cores mostrando a reatividade de BB-I contra todos ossubconjuntos de timócitos, particularmente a intensidade de coloraçãomais elevada em timócitos de duplos positivos. Na Figura 2, a linha acheio representa a coloração por anticorpo EB-I e o perfil de coloraçãonegativa por anticorpo irrelevante é mostrado como histograma cheio.
Exemplo 4
A fim de obter concentração elevada de anticorpo secretadopor clone de hibridoma de EB-1, foram preparados ascites. Três sema-nas depois de 0,5 ml de prístino ser administrado intraperitonealmenteem camundongo Balb/c, IO7 de clone de hibridoma EB-I cultivado emDMEM contendo 10% soro bovino. Depois de 2 a 3 semanas, foramcoletados os ascites. Então, a concentração de anticorpo era de 5 a 10mg/ml. Apenas imunoglobulinas respondendo a timócitos humanosforam purificadas, porque há muitas proteínas contaminantes tais comoalbumina em ascites. Para purificar o anticorpo a partir de ascitescontendo elevada quantidade de anticorpos obtidos a partir de camun-dongo Balb/ c em que foram intraperitonealmente administradas célulasde hibridoma monoclonal EB-1, foi realizada a cromatografia de Q-Sepharose e hidroxiapatite (Bio-gel HTP Gel fabricado por Pharmacia).
3,14 g de sulfato de amônio por 10 ml de ascites foramlentamente adicionados sobre gelo (precipitado com 50% de (NH4)2 SO4).A mistura foi centrifugada a 15.000 rpm durante 30 minutos, re-suspendida em água desionizada e dialisada em 1 litro de soluçãotampão (fosfato 20 mM, pH 7,4). A solução foi passada e absorvida emcoluna de Q-Sepharose previamente equilibrada com solução tampão (20fosfato de mM, pH 7,4) e, depois, a solução tampão foi novamentepassada através da coluna para remover proteínas livres na coluna, apóso que a proteína absorvida na coluna foi eluída com gradiente linear 0 Mpara 0,8 M de NaCl usando solução tampão I (fosfato 20 mM, pH 7,4) esolução tampão II (fosfato 20 mM e 8,5 M de NaCl, pH 7,4). Cada fraçãofoi submetida a eletroforese em SDA-PAGE e foram coletadas as fraçõescontendo anticorpo EB-1.
As frações foram, então, dialisadas em solução tampão(fosfato 20 mM, pH 6,8) e passadas através de coluna de hidroxiapatitepreviamente equilibrada com solução tampão (fosfato 20 mM, pH 6,8). Afração em solução tampão (fosfato 20 mM, pH 6,8) passada através dacoluna para remover proteínas livres e foi eluída com um gradiente linear0 a 0,3 M de fosfato usando solução tampão III (fosfato 20 mM, pH 6,8) esolução tampão (fosfato 300 mM, pH 6,8). Cada fração foi sumetida aeletroforese em SDS-PAGE e foram coletadas as frações contendo maisde 95% de anticorpo EB-1. O anticorpo EB-I coletado foi dialisado emsolução tampão apropriada e armazenado. Prepararam-se de 5 a 10 mgde anticorpo BB-I a partir de 1 ml de ascites por experimentos repetidos.
Exemplo 5
O presente exemplo foi realizado de acordo com a análisecitométrica de fluxo do Exemplo 3 para investigar se o anticorpo EB-I éreativo contra leucócitos normais exceto timo usando anticorpo EB-Ipurificado a partir do Exemplo 4 como anticorpo primário. Para estaanálise, o anticorpo EB-I purificado foi combinado diretamente comFITC ou PE, caso em que não foi necessário usar o anticorpo secundáriopara fluorescência ou o anticorpo EB-1 conjugado com biotina foi usadocombinado com estreptavidina conjugada fluorescente-.
A Tabela 2 abaixo mostra a reatividade do anticorpo EB-Isobre a superfície celular de leucócitos de sangue periférico normal,células mononucleares de sangue periférico ativadas, cultivadas em meiocontendo 10 pg/ml de Fitohemaglutinina (PHA) ou 5 pg/ml de anticorpoanti-CD3, célula de baço normal, timócitos normais e células-troncohematopoiéticas CD34+AC 133+ em sangue de cordão. Todas elas eramnegativas para o anticorpo EB-1, com exceção dos timócitos. Os resul-tados representativos de análise citométrica de fluxo de leucócitosnormais são mostrados na Figura 3, em que a linha a cheio representa acoloração por anticorpo EB-I e o perfil de coloração negativa por umanticorpo irrelevante é mostrado como histograma preenchido.Tabela 2
<table>table see original document page 22</column></row><table>
* Coloração negativa
** Coloração positiva em mais de 90% de célulasPHA, Fitohemaglutinina
Exemplo 6
O presente Exemplo foi realizado de acordo com o ensaioimunohistoquímico do Exemplo 2 para confirmar se o anticorpo BB-I éreativo contra tecido normal exceto timo usando o anticorpo EB-Ipurificado a partir do Exemplo 4 como anticorpo primário. A Tabela 3abaixo é a reatividade do anticorpo EB-1 em cada um dos vários tecidos.
Com exceção dos timócitos, todos os outros tecidos incluindo o tecidolinfóide periférico, cerebelo, pâncreas, ovário e testículos, pele, pulmão,adrenal e rim foram negativos à coloração.Tabela 3
<table>table see original document page 23</column></row><table>
Exemplo 7
O presente exemplo foi realizado de acordo com análisecitométrica de fluxo do Exemplo 3 sobre se o anticorpo EB-I é reativocontra células normais da medula óssea usando o anticorpo EB-Ipurificado a partir do Exemplo 4 como anticorpo primário. Para estaanálise, foi usado anticorpo EB-I conjugado com biotina e estreptavidinaconjugada com APC em combinação com anti-CDIO, anti-CD33, anti-CD38, anti-CD71, ou anti-AC133 conjugados com FITC e PE- - conjuga-do com anti-CD34. A Figura 4 é o resultado de três análises citométricasde fluxo de cor, em que células CD34+ foram gated. As células-troncopluripotentes foram definidas como células de medula óssea ou desangue de cordão CD34+AC133+ (Figura 4A) ou CD34+CD38/dim (Figura4B) e elas não mostraram nenhuma reatividade contra anticorpos EB-1.Além disso, as células CD34+CD33+ (Figura 4D) que contêm virtualmentetodas as células formadoras de colônia tais como células progenitorascapazes de formar granulócitos, eritrócitos, monócitos, megacariócitos(CFU-GEMM), CFU-GM, e eritrócitos de unidade formadora de explosão ecélulas progenitoras ligadas a eritróides CD34+CD7 Ibrilhante (Figura 4E)também não foram coradas por anticorpo EB-1. Em contraste, foiobservado anticorpo EB-I de coloração positiva na maioria dos precurso-res CD34+CD10 ligados a linfóide (Figura 4C).
Como resumo dos resultados, a reatividade de EB-I foirestringida a timócitos e alguns precursores hematopoiéticos na medulaóssea, mas, não encontrada em nenhumas outras células hematopoiéti-cas incluindo células de sangue periférico e células-tronco hematopoiéti-co maduras e tecidos não hematopoiéticos.
Exemplo 8
A fim de esclarecer o antígeno reconhecido pelo anticorpoEB-1, foi preparada uma biblioteca cDNA de timócitos humanos usandopoli(A)+ RNA e o vetor de expressão pcDNA3 fabricado por Invitrogen.Esta biblioteca continha 3,5 χ IO6 colônias independentes. A cepa dehospedeiro bacteriano usada era Escherichia coli MC1061/P3. O plas-mídio pMIK/D3T 31 foi construído inserindo fragmento de XhoI do clonecDNA da sintase Gb3, pD3T 31 (Haraguchi e colaboradores, Proc. NatlAcad. Sei. U S. A. 1994, 91:10455-9), no vetor de expressãopMIK/Neo.
Os plasmídios da cDNA biblioteca foram aplificados uma etransfectados em células 293T em conjunto com o plasmídio pMIK/D3T-31 usando dextrana DEAE conforme descrito previamente (Davis ecolaboradores, Methods in Molecular Biology, Elsevier Science, NovaIorque 1986:285-289). Células 293 T subconfluentes, 1,5x106 em placasde 10 cm foram co-transfectadas com 8μ§ cada do plasmídio da bibliote-ca de cDNA e pMIK/D3T-31. Depois de 60 h, as células transfectadasforam destacadas das placas e incubadas com anticorpo EB-I numa1:200 diluição sobre gelo durante 45 minutos. As células foram plaque-adas em placas cobertas com IgM de cabra anti camundongo comodescrito previamente (Wysocki e colaboradores de., Proc. Natl. Acad. Sei.U. S. A. 1978, 75:2844-8). O plasmídio DNA foi recuperado a partir dascélulas garimpadas e transformado em 293T. O DNA expandido doplasmídio foi novamente transfectado e o mesmo procedimento foirepetido quatro vezes mais. Depois disso, foram preparadas 96 piscinascontendo 30 colônias cada e tríadas quanto à reatividade EB-1. Final-mente, foram triados 17 clones a partir de duas piscinas positivas eforam isoladas três colônias únicas que dirigiram a reatividade do EB-Isobre 293T usando transfecção em microescala DEAE-dextrana e ensaiode imunofluorescência.
O plasmídio de cDNA isolado foi digerido por XhoI e HindIII eclonado no vetor phagemid BlueScript (pBSK) KS(+). Os mutantes dedeleção deste clone foram preparados com um kit de deleção de Kilo-Sequence. A seqüência de terminação de dideoxinucleotídio foi realizadapor iniciadores de corante T3/T7 ou quatro terminadores de dideoxiadicionais de uso com o kit de sequenciação de ciclo terminator decorante PRISM e seqüenciador de DNA modelo 377 fabricado por AppliedBiosystems. A explosão de busca usando a seqüência de DNA identifica-da através deste procedimento revelou que o antígeno reconhecido poranticorpo EB-I é CD43 humano.
Para confirmar que o anticorpo EB-I reconheceu antígenosCD43 humanos, células 293 T transfectada CD43 humanas foramcoradas com anticorpo EB-I e um anticorpo anti-CD43bem conhecido,DFT-1. Como mostrado na Figura 5, o anticorpo EB-I não era reativocontra células 293 T do tipo selvagem, enquanto células 293 T transfec-tadas CD43 foram coradas tanto por anticorpos EB-I como DFT 1.Deste modo, EB-I é um anticorpo monoclonal contra CD43 humano.
Como CD43 é uma proteína fortemente glicosilada, investi-gamos se o tratamento de sialidase das moléculas de CD43 modifica aimunorreatividade do anticorpo EB-I contra o antígeno CD43. A Figura6 mostra uma análise citométrica de fluxo de células Molt-4 com ou semtratamento de sialidase. A linha pontilhada representa o perfil decoloração negativa por um anticorpo irrelevante e as linhas a cheio finase espessas representam a imunorreatividade do anticorpo EB-I sobre ascélulas Molt-4 não tratadas e tratadas, respectivamente. A imunorreati-vidade do anticorpo BB-I sobre as células Molt-4 não foi afetada pelotratamento da sialidase.
Para confirmar estes resultados, foram realizados blottingSDS-PAGE e Western. IxlO' de timócitos humanos ou células de tumorMolt-4 com ou sem tratamento de sialidase foram suspensas em 1 ml desolução tampão de Iise (Tris-HC150 mm, pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,5%p/v de Nonidet P-40 e fluoreto de fenilmetilsulfonila 1 mM (PMSF)),agitados a 4°C durante 30 minutos e centrifugados a 13.000 g durante15 minutos para remoção dos núcleos. O sobrenadante foi separado poreletroforese em géis de poliacrilamida- sulfato de dodecil sódio a 10%(SDS-PAGE) sob condições reduzidas. A concentração de acrilamida dosgéis de separação era 10% e foram usados marcadores de peso molecula-res apropriados. A transferência eletroforética de proteínas para mem-branas de nitrocelulose foi feita a 45 V durante 16 horas. Depois datransferência de proteína, as membranas de nitrocelulose foram incuba-das durante duas horas com tampão de blocagem contendo 5% de leitedesnatado e 0,05% Tween-20 em PBS e, depois, incubado durante anoite com anticorpo EB-I diluído em tampão de blocagem a concentra-ção de lg/ml. As membranas foram enxaguadas três vezes com tampãode lavagem (PBS com 0,05% Tween 20) e incubadas durante 1 h comimunoglobulina G anti camundongo de cabra purificada por afinidadeconjugada com peroxidase de rábano diluída a 1:3000 em tampão deblocagem. Depois de três lavagens, cada faixa de proteína reativa foidetectada por kit de quimioluminiscência aumentada (ECL) fabricado porAmersham Pharmacia Biotech. A Figura 7 mostra uma análise deblotting Western e SDA-PAGE de lisato de timócito (A&B)e célula Molt-4(C & D) com o anticorpo EB-1. As pistas AeC representam a eletrofore-se do lisato de célula que não é tratado com sialidase, enquanto aspistas BeD eram a eletroforese do lisato tratado de sialidase. O anti-corpo EB-I reconheceu tanto as moléculas CD43 tratadas como nãotratadas com sialidase. Isto sugere que o anticorpo EB-I poderia reco-nhecer a região não glicosilada da molécula CD43.
Exemplo 9
A fim de definir o epítopo CD43 reconhecido pelo anticorpoEB-1, foram construídos mutantes de CD43. A seqüência de codificaçãopara o gene de CD43 humano foi amplificada a partir de um cDNA CD43e usada para a construção de vetores de expressão. Por exemplo, paraproduzir a proteína de fusão da glutationa-S-transferase (GST), foramconstruídos plasmídios recombinantes de CD43 clonando fragmentos dePCR no vetor pGEX-2T fabricado por Pharmacia. Os iniciadores usadospara ampliflcação de PCR foram selecionados com base na seqüência noGeneBank e modificados para conter BamHI e EcoRl ou sítios de restri-ção de BglII para facilitar a clonagem de ambos os produtos PCR purifi-cados e o vetor pGEX-2T foi digerido com BamHI e BglII ou EcoRl a 37°Cdurante a noite, ligado usando ligase de DNA T4 fabricado a 16°Cdurante a noite e, então, usado para transformar as células TOPlOFcompetentes da E. coli. A Figura 8 mostra um diagrama esquemático de11 mutantes de deleção de CD43. Por exemplo, o pGEXl-253 representao vetor pGEX-2T que contém do Io ao 253° aminoácidos do CD43humano.Para expressar as proteínas de fusão de GST que contêmseqüências de CD43 humano, células TOPlO de E. coli transformadascom os plasmídios recombinantes foram cultivadas a 37°C durante anoite em meio Luria troth (LB) contendo 50 g/ml de ampicilina. Ascélulas cultivadas durante a noite foram diluídas 20 vezes com meio deLB fresco contendo a mesma concentração de ampicilina e cultivadas a37°C durante 3 a 4 h até que fosse alcançado um valor de densidadeóptica de 0,6. A expressão de gene foi induzida adicionando IPTG àcultura até uma concentração final de 1 mM. Depois de 4 h de incuba-ção a 37°C com agitação permanente, as células foram peletizadas porcentrifugação a 6.000 g durante 15 minutos a 4°C e então re-suspendidas com 3 ml de tampão de Iise (Tris-HCI50 mM, pH 8,0, EDTA1 mM, NaCl 100 mM) para cada grama de células acumuladas. Asuspensão foi incubada em gelo durante 30 minutos com uma concen-tração final de PMSF 0,2 mm.
Para blotting Western de mutantes de CD43 com anticorpoBB-1, foram separadas alíquotas de cada lisato de proteína de fusão deGST-CD43 por eletroforese em géis de poliacrilamida-sulfato de dodecilasódio 10% (SDS) seguidos por blotting sobre membranas de nitrocelulo-se. A membrana de nitrocelulose foi corada com anticorpo EB-I ouanticorpo policlonal anti-GST e cada faixa de proteína reativa foi detec-tada por quimioluminiscência aumentada de acordo com o procedimentodo Exemplo 8. A Figura 9 mostra a análise Western blotting do CD43mutante com anticorpos EB-I (A) e anti-GST (Β). A pista 1 representapGEX1-253, a pista 2 pGEXl-98, a pista 3 pGEXl-87, a pista 4 pGEXl-81, a pista 5 pGEXl-75, a pista 6 pGEXl-70, a pista 7 pGEX70-99, apista 8 pGEX71-81, a pista 9 pGEX73-81, a pista 10 pGEX76-81, a pistaII pGEX73-80, a pista 12 pGEX2T e a pista 13 lisato de timócito huma-no. Como mostrado na Figura 9, pGEX73-81 contém a seqüênciamínima para reconhecimento do antígeno CD43 por EB-I e, deste modo,o epítopo CD43 para o anticorpo EB-I é a seqüência do 73° ao 81°aminoácido de CD43. A seqüência é como segue, Glu Gly Ser Pro LeuTrp Thr Ser Ile (SEQ ID NO: 2). Portanto, esta seqüência é muito útil noaspecto de que o epítopo reconhecido pelo anticorpo EB-1 não é expressoem célula de sangue maduras, células-tronco hematopoiéticas, subcon-juntos de precursores hematopoiéticos na medula óssea ou quaisquertecidos não hematopoiéticos.
Exemplo 10
Os Exemplos 3, 5, 6 e 7 mostram que a imunorreatividadede EB-1 é restringida a subconjuntos de precursores hematopoiéticos namedula óssea com exceção de células-tronco hematopoiéticas. NesteExemplo, foi investigada a expressão de epítopo CD43 reconhecido peloanticorpo EB-I em células leucêmicas de acordo com a análise citomé-trica de fluxo do Exemplo 3. O sangue periférico foi coletado em tubo deEDTA a partir de pacientes de leucemia e foram removidos eritrócitos egranulócitos maduros por centrifugação usando Ficoll-Hypaque fabrica-da por Amersham Pharmacia Biotech. As células purificadas foramcoradas com EB-I conjugado com FITC e analisadas usando citômetrode fluxo. A Tabela 4 abaixo são os resultados de análise de marcador deamostras leucêmicas usando o anticorpo EB-I por citometria de fluxo.
Em 31 dentre 38 casos de leucemia (81,6%), que incluem leucemiamielogenosa aguda (AML), leucemia de linfogenosa aguda (ALL) e leuce-mia mielogenosa crônica (CML) com crise de blastos, as células de tumorsão coradas pelo anticorpo EB-1. A Figura 10 mostra o padrão decoloração citométrico de fluxo representativo das células leucêmicasusando o anticorpo EB-1. A linha a cheio representa a coloração peloanticorpo EB-I e o perfil de coloração negativo por um anticorpo irrele-vante é mostrado como histograma preenchido.Tabela 4
<table>table see original document page 30</column></row><table>
O presente exemplo foi também realizado de acordo com aanálise imunohistoquímica do Exemplo 2 para investigar se o anticorpoEB-I é reativo contra células de linfoma linfoblástico usando anticorpoEB-I purificado a partir do Exemplo 4 como anticorpo primário. AFigura 11 mostra ao padrão de imunocoloração representativo do tecidode linfoma linfoblástico por anticorpo EB-1. Como um todo, 4 dentre 9(44,4%) casos de linfoma linfoblástico mostraram coloração positiva peloanticorpo EB-1.
Portanto, o anticorpo EB-I e seu epítopo CD43 poderiam serpoderosas ferramentas diagnosticas e terapêuticas para vários tipos deleucemia aguda, leucemia crônica com crise de blastos e linfoma linfo-blástico.
Exemplo 11
A fim de determinar o potencial terapêutico do anticorpo EB-1, foram desenvolvidos modelo de EB-I imunotoxina e da leucemiahumana em camundongos. Para produzir a imunotoxina, a saporinafabricada por Sigma e o anticorpo EB-I foram conjugados via umaligação de dissulfeto entre grupos sulfidril (SH) inseridos quimicamente(Polito e colaboradores, 2004). O modelo de leucemia humana emcamundongos foi estabelecido pela injeção de 2x105 células de CCRF-CEM num volume de 300 μΐ de PBS na veia da cauda de camundongosdeficientes em RAG-1. Uma semana mais tarde, cada camundongo foitratado com quatro doses de 100 yg do anticorpo EB-1, da imunotoxinade EB-l-saporina ou anticorpo irrelevante como uma injeção de bolus(num volume de 300 μΐ de PBS) na veia da cauda a cada dois dias (istoé, dias 7, 9, 11 e 13). Quatro semanas depois da injeção intravenosa decélulas de CCRF-CEM, a amostra de sangue a partir do plexo retro-orbital foi corada com anticorpo EB-I conjugado com FITC e anticorpoclasse I MHC anti-humano conjugado com PE de acordo com a análisecitométrica de fluxo dos Exemplos 3 e 10. A Figura 12 é o resultadorepresentativo da análise citométrica de fluxo de células leucêmicas emsangue a partir dos camundongos. Em camundongos de controle, 23,4%das células no sangue periférico eram células CCRF-CEM positivas daclasse I ambos os humano CD43" e MHC humanas, onde as células deCCRF-CEM estavam reduzidas até 1,3% no camundongo tratado comimunotoxina de EB-l-saporina. A carga de células leucêmicas estavatambém diminuída cerca de duas vezes no camundongo tratado somentecom anticorpo EB-1, em comparação com aquela no camundongo decontrole. Deste modo, o anticorpo EB-I poderia proporcionar ferramen-tas efetivas para o tratamento de células leucêmicas agudas através daliberação de material tóxico nas células tumorígenas, citotoxicidade(ADCC) mediada por células dependentes de anticorpo ou outros meca-nismos.
Exemplo 12
O anticorpo EB-I reconhece a seqüência do 73° até o 81°aminoácido de CD43, Glu Gly Ser Pro Leu Tip Thr Ser Ile (SEQ ID NO: 2).O presente Exemplo foi realizado para desenvolver novos anticorpos anti-CD43 que são úteis para a diagnose e tratamento da leucemia e dolinfoma. O fragmento de DNA que codifica a seqüência do 70° até o 98°aminoácido de CD43 que inclui SEQ ID NO:2 foi clonada no vetor pQE-40 e, depois, usado para transformar as células TOPlOF' competentes daE. coli. As células transformadas do TOPlOF foram cultivadas de acordocom os métodos do Exemplo 9 e a proteína de fusão de CD43 foi purifi-cada a partir do lisato de rolo de E. pelo transcurso de lisato de E.coliatravés de coluna de níquel fabricada por Amersham Pharmacia Biotech.100 μg de proteína de fusão de SY-CD43 foram misturados com adju-vante completo de Freund e administrados intraperitonealmente eimunizadas nos camundongos Balb/c. Quatro semanas mais tarde,mais duas doses de 100 ]ig de proteína de fusão de SY-CD43 misturadascom adjuvante de Freund incompleto em intervalo de duas semanasforam administradas intraperitonealmente. Três dias depois da impul-são, o baço foi removido a partir dos camundongos imunizados e ascélulas de hibridoma foram preparadas de acordo com o método de fusãodo Exemplo 1. A cultura sobrenadante das células de hibridoma foitriada usando células EL4 de murino transfectadas por CD43 humanopor citometria de fluxo e foram selecionados dois clones de hibridomaque são reativos contra as células de EL4 transfectadas por CD43 edesignados como EB-2 e EB-3, respectivamente. A Figura 13 mostra aanálise citométrica de fluxo da linha de células EL4 transfectadas porCD43, timócito humano, células de sangue periférico humano e célulashumanas de leucemia aguda por anticorpos EB-2 e EB-3. A linha decélulas EL4 transfectada por CD43, timócitos humanos e células leucê-micas humanas foram positivas, mas, as células de sangue humanoperiférico foram negativas para tanto para os anticorpos EB-2 como EB-3. Deste modo, padrão de coloração de ambos os anticorpos EB-2 e EB-3 é semelhante àquele de EB-1.
Exemplo 13
O presente exemplo foi realizado para determinar o epítopoCD43 reconhecido por anticorpos EB-2 e EB-3 de acordo com o SDS-PAGE e Western blotting do Exemplo 9 usando mutantes de deleçãoCD43. A Figura 14 mostra a análise Western blotting do mutante CD43com EB-2 e EB-3. O epítopo CD43 para anticorpos EB-3 é semelhanteàquele para EB-1. Ou seja, o epítopo mínimo para ambos os anticorposEB-I e EB-3 são a seqüência do 73° até o 81° dos aminoácidos de CD43(SEQ ID NO: 2; Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser lie). Todavia, o anticor-po EB-2 poderia reconhecer a seqüência de peptídio menor do que EB-1e EB-3. O epítopo mínimo para EB-2 é a seqüência de aminoácidos do76° até o 81° de CD43. As seqüências são como se segue, Pro Leu TrpThr Ser Ile (SEQ ID NO: 1).
O epítopo CD43 da presente invenção é útil para a diagnoseda leucemia aguda, da leucemia crônica com crise de blastos e dolinfoma linfoblástico por determinação se este epítopo CD43 está expres-so após exame tecidular ou exame de sangue periférico porque esteepítopo CD43 da presente invenção não é encontrado em tecido nãohematopoiético normal, células de sangue maduro e sangue periféricoativado exceto timócitos. O epítopo CD43 da presente invenção pode serusado como material alvo para o tratamento da leucemia aguda, daleucemia crônica com crise de blastos e do linfoma linfoblástico, porquenão é expresso em células-tronco hematopoiéticas e tecido normal excetotimócitos e subconjuntos de precursores hematopoiéticos na medulaóssea.
A descrição de modalidades exemplificativas de polipeptídiosbiologicamente ativos é ilustrativa da presente invenção. Em razão davariação que será evidente para aquelas pessoas qualificada na técnica,todavia, não se pretende que a presente invenção fique limitada àsmodalidades particulares acima descritas. O âmbito da invenção édefinido nas reivindicações seguintes.Listagem de Seqüências
<110> DiNonAInc.
<120> Polipeptídio Isolado, Anticorpos ou Respectivos Fragmentos,Célula, Métodos de Diagnóstico e de Tratamento da Leucemia Aguda, daLeucemia Crônica com Crise de Blastos e do Linfoma Linfoblástico,Composições Farmacêuticas e Kits de Diagnóstico
<130> OP060571KR <150> <151> US 60/679,910 2005-05-11<150> <151> KR 10-2005-0077906 2005-08-24<150> <151> <160> US 11/312,126 2005-12-20 2 <170> KopatentIn 1.71<210> <211> <212> <213> 1 6 PRT Seqüência Artificial<220> <223> EP 6<400> 1 Pro Leu Trp Thr Ser Ile 1 5 <210> <211> <212> <213> 2 9 PRT Seqüência Artificial
<220>
<223> EP 9<400> 2
Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile1 5

Claims (30)

"Polipeptídio Isolado, Anticorpos ou Respectivos Fragmentos,Célula, Métodos de Diagnóstico e de Tratamento da LeucemiaAguda, da Leucemia Crônica com Crise de Blastos e do LinfomaLinfoblástico, Composições Farmacêuticas e Kits de Diagnóstico"
1. - Polipeptídio Isolado, para o epítopo de CD43, caracterizado porque compreende uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:l.
2. - Polipeptídio Isolado, de acordo com a Reivindicação 1, caracteri-zado por que é de menos do que 100 aminoácidos de comprimento.
3. - Polipeptídio Isolado, de acordo com a Reivindicação 1, caracteri-zado por que é de menos do que 50 aminoácidos de comprimento.
4. - Polipeptídio Isolado, de acordo com a Reivindicação 1, caracteri-zado por que o epítopo de CD43 é especificamente expresso em timóci-tos, subconjunto de precursores hematopoiéticos na medula óssea,células de leucemia aguda, células blastos de leucemia crônica comcrise de blastos e células do linfoma linfoblástico.
5. - Polipeptídio Isolado, de acordo com a Reivindicação 1, caracteri-zado por que o epítopo de CD43 compreende uma seqüência de amino-ácidos de SEQ ID NO:2.
6. - Anticorpo ou Respectivo Fragmento, caracterizado por que seliga especificamente a um epítopo de CD43 e compreende uma seqüên-cia de aminoácidos de SEQ ID NO:l.
7. - Anticorpo ou Respectivo Fragmento, caracterizado por que seliga a um peptídio que consiste numa seqüência de aminoácidos deSEQ ID NO: 1.
8. - Anticorpo ou Respectivo Fragmento, de acordo com a Reivindica-ção 6 ou a Reivindicação 7, caracterizado por que o epítopo de CD43 éespecificamente exposto em timócitos, subconjunto de precursoreshematopoiéticos na medula óssea, células da leucemia aguda, célulasblastos da leucemia crônica com crise de blastos e células do linfomalinfoblástico, mas, não células hematopoiéticas não maduras, células-tronco hematopoiéticas e células não hematopoiéticas.
9. - Anticorpo ou Respectivo Fragmento, de acordo com a Reivindica-ção 6 ou a Reivindicação 7, caracterizado por que o anticorpo se ligaespecificamente a um polipeptídio que compreende a seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO:2.
10. - Anticorpo ou Respectivo Fragmento, de acordo com a Reivindi-cação 6 ou a Reivindicação 7, caracterizado por que o anticorpo éproduzido imunizando um animal com um polipeptídio que compreendea seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO :1 e triando o anticorpo quese liga especificamente a um polipeptídio que compreende a seqüênciade aminoácidos de SEQ ID NO:l.
11. - Anticorpo ou Respectivo Fragmento, de acordo com a Reivindi-cação 6 ou a Reivindicação 7, caracterizado por que o anticorpo é umanticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal.
12. - Anticorpo ou Respectivo Fragmento, de acordo com a Reivindi-cação 11, caracterizado por que o anticorpo é humano ou anticorpomonoclonal animal.
13. - Anticorpo ou Respectivo Fragmento, de acordo com a Reivindi-cação 6 ou a Reivindicação 7, caracterizado por que o anticorpo é umanticorpo quimérico ou humanizado.
14. - Anticorpo ou Respectivo Fragmento, de acordo com a Reivindi-cação 6 ou a Reivindicação 7, caracterizado por que o anticorpo ou oseu fragmento é etiquetado com o composto selecionado a partir dogrupo que consiste em radioisótopo, material fluorescente, materialluminescente, enzima e material corante.
15. - Anticorpo ou Respectivo Fragmento, de acordo com a Reivindi-cação 6 ou a Reivindicação 7, caracterizado por que o anticorpo ou oseu fragmento é ligado a um material tóxico selecionado a partir dogrupo que consiste em radioisótopos, substâncias químicas tóxicas,proteínas tóxicas e agentes anti-tumorígenos.
16. - Anticorpo ou Respectivo Fragmento, de acordo com a Reivindi-cação 15, caracterizado por que o anticorpo ou o seu fragmento écombinado com as proteínas tóxicas para produzir uma proteína defusão.
17. - Célula, caracterizada por que produz o anticorpo ou o seu frag-mento de acordo com a Reivindicação 6 ou a Reivindicação 7.
18. - Método de Diagnóstico da Leucemia Aguda, caracterizado porque compreende células de leucemia numa amostra biológica comanticorpo de epítopo anti-CD43 de acordo com a Reivindicação 6 ou aReivindicação 7 e detectar a reação imunopositiva ao anticorpo deepítopo anti-CD43.
19. - Método de Diagnóstico da Lfeucemia Aguda, de acordo com aReivindicação 18, caracterizado por que a detecção da reação imuno-positiva poderia ser confirmada usando um dispositivo de detecção dareação da enzima, fluorescência, luminescência ou radiação.
20. - Método de Diagnóstico da Leucemia Crônica com Crise deBlastos, caracterizado por que compreende incubar células de leuce-mia numa amostra biológica com anticorpo de epítopo anti-CD43 deacordo com a Reivindicação 6 ou a Reivindicação 7 e detectar a reaçãoimunopositiva ao anticorpo de epítopo anti-CD43.
21. - Método de Diagnóstico do Linfoma Linfoblástico, caracterizadopor que compreende incubar células de linfoma numa amostra biológicacom anticorpo de epítopo anti-CD43 de acordo com a Reivindicação 6ou a Reivindicação 7 e detectar a reação imunopositiva ao anticorpo deepítopo anti-CD43.
22. - Método de Tratamento da Leucemia Aguda, caracterizado porque compreende administrar uma quantidade terapeuticamente efetivade um anticorpo de epítopo anti-CD43 de acordo com a Reivindicação 6ou a Reivindicação 7.
23. - Método de Tratamento da Leucemia Aguda de acordo com aReivindicação 22, caracterizado por que o anticorpo de epítopo anti-CD43 é ligado a um material tóxico selecionado a partir do grupo queconsiste em radioisótopos, substâncias químicas tóxicas, proteínastóxicas e agentes anti-tumorígenos.
24. - Método de Diagnóstico da Lreucemia Crônica com Crise deBlastos, caracterizado por que compreende administrar uma quanti-dade terapeuticamente efetiva de um anticorpo de epítopo anti-CD43 deacordo com a Reivindicação 6 ou a Reivindicação 7.
25. - Método de Diagnóstico do Linfoma Linfoblástico, caracterizadopor que compreende administrar uma quantidade terapeuticamenteefetiva de um -anticorpo de epítopo anti-CD43 de acordo com a Reivin-dicação 6 ou a Reivindicação 7.
26. - Composição Farmacêutica, para tratamento da leucemia aguda,caracterizada por que compreende um anticorpo de epítopo anti-CD43,de acordo com a Reivindicação 6 ou a Reivindicação 7, e um portadorfarmaceuticamente aceitável.
27. - Composição Farmacêutica, para tratamento da leucemia crônicacom crise de blastos, caracterizada por que compreende um anticorpode epítopo anti-CD43, de acordo com a Reivindicação 6 ou a Reivindica-ção 7, e um portador farmaceuticamente aceitável.
28. - Composição Farmacêutica, para tratamento do linfoma linfoblás-tico, caracterizada por que compreende um anticorpo de epítopo anti-CD43, de acordo com a Reivindicação 6 ou a Reivindicação 7, e umportador farmaceuticamente aceitável.
29. - Kit de Diagnóstico, para leucemia, caracterizado por que com-preende um anticorpo de epítopo anti-CD43 de acordo com a Reivindi-cação 6 ou a Reivindicação 7.
30. - Kit de Diagnóstico, para linfoma, caracterizado por que compre-ende um anticorpo de epítopo anti-CD43 de acordo com a Reivindicação 6 ou a Reivindicação 7.
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