PL168720B1 - Sposób wytwarzania nowego bispecyficznego przeciwciala BR 96 PL - Google Patents
Sposób wytwarzania nowego bispecyficznego przeciwciala BR 96 PLInfo
- Publication number
- PL168720B1 PL168720B1 PL90307121A PL30712190A PL168720B1 PL 168720 B1 PL168720 B1 PL 168720B1 PL 90307121 A PL90307121 A PL 90307121A PL 30712190 A PL30712190 A PL 30712190A PL 168720 B1 PL168720 B1 PL 168720B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antibody
- cells
- human
- antibodies
- chibr
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 67
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 66
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims abstract description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- SHZGCJCMOBCMKK-SXUWKVJYSA-N alpha-L-fucose Chemical compound C[C@@H]1O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-SXUWKVJYSA-N 0.000 claims 1
- 238000003491 array Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 124
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 71
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 36
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 24
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 22
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 14
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 12
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 11
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 10
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 8
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 8
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 8
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 8
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 7
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 7
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 6
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 6
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 4
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- MXKCYTKUIDTFLY-ZNNSSXPHSA-N alpha-L-Fucp-(1->2)-beta-D-Galp-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->3)]-beta-D-GlcpNAc-(1->3)-D-Galp Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](NC(C)=O)[C@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](CO)OC(O)[C@@H]3O)O)O[C@@H]2CO)O[C@H]2[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O2)O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MXKCYTKUIDTFLY-ZNNSSXPHSA-N 0.000 description 4
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 4
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 4
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 3
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- FOCMISOLVPZNSV-CANPYCKCSA-N N-[(E,2R,3S)-1-[5-[5-[3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3-hydroxyoctadec-4-en-2-yl]octadecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@H](COC1OC(CO)C(OC2OC(CO)C(OC3OC(CO)C(O)C(O)C3NC(C)=O)C(O)C2O)C(O)C1O)[C@@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC FOCMISOLVPZNSV-CANPYCKCSA-N 0.000 description 3
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 3
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 3
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 2
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 2
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- -1 radioisotopes Substances 0.000 description 2
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 2
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- WSWCOQWTEOXDQX-MQQKCMAXSA-M (E,E)-sorbate Chemical compound C\C=C\C=C\C([O-])=O WSWCOQWTEOXDQX-MQQKCMAXSA-M 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000798109 Homo sapiens Melanotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 101000848653 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 26 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 1
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101710084578 Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 208000018554 digestive system carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 125000003900 glycosphingolipid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 208000019855 heavy chain deposition disease Diseases 0.000 description 1
- 102000046101 human AFP Human genes 0.000 description 1
- 102000049905 human MELTF Human genes 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 231100000110 immunotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002625 immunotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229940051875 mucins Drugs 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 229940075554 sorbate Drugs 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania nowego bispecyficznego przeciwciala BR 96 wiazacego dwa rózne antygeny, z których jeden wiazany jest równiez przez mysie przeciwcialo m onoklonalne BR(IgG 3) i przez ludzko-mysie chimeryczne przeciwcialo m onoklonalne ChiBR96, znamienny tym, ze prowadzi sie fuzje dwu hybrydom a majacych rózne m arkery selekcyjne, z których jedna wydziela przeciwcialo wykazujace te sam a co BR 96 lub ChiBR 96 specyficznosc, a druga hybrydom a wydziela przeciwcialo wykazujace inna specyficznosc, prow adzi sie hodowle takiego hybrydu hybrydom alnego w obecnosci dwóch m arkerów selekcyjnych i wyselekcjonowane bispecyficzne przeciwcialo oczyszcza sie od innych mozliwych kom binacji lekko i ciezko lancuchowych. PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego bispecyficznego przeciwciała BR 96. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania bispecyficznego przeciwciała BR 96 wiążącego dwa różne antygeny, z których jeden wiązany jest również przez mysie przeciwciało monoklonalne BR(IgGe) i przez ludzko-mysie chimeryczne przeciwciało monoklonalne ChiBR 96. Przeciwciała te mają kilka dodatkowych zalet. Po pierwsze, ulegają one internalizacji do komórek rakowych, z którymi się wiążą. Przeciwciała BR 96 są więc użyteczne do zastosowań terapeutycznych, na przykład, jako przeciwciałowy składnik koniugatów przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna, gdzie pożądana jest internalizacja koniugatu. Po drugie, przeciwciała pośredniczą w zależności od przeciwciała cytotoksyczności komórkowej „ADCC“, i zależnej od dopełniacza cytotoksyczności „CDC“. Po trzecie, przeciwciała w formie nieskoniugowanej mogą zabijać antygenododatnie komórki nowotoworowe, jeśli obecne są w dostatecznym stężeniu. Przeciwciała użyteczne są także w metodach diagnostycznych, takich jak wykrywanie raków metodami in vitro lub in vivo.
Przeciwciała monoklonalne na ludzkie różnicujące antygeny towarzyszące nowotworowi zapewniają możliwość „ukierunkowywania1' różnych czynników antynowotworow'ych, takich jak radioizotopy, leki chemioterapeutyczne i toksyny. [Baldwin i Byers, (red.), w: „Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy“, Londyn, Academic Press (1985)]. Ponadto, korzystną cechą pewnych przeciwciał monoklonalnych jest możliwość zabijania komórek nowotworowych przez ADCC lub CDC w obecności ludzkich komórek efektorowych lub surowicy [Hellstrom i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)], i niewiele jest przeciwciał monoklonalnych, które posiadają bezpośrednią aktywność przeciwnowotworową, niezależną od żądanego komponentu gospodarza [Drebin i in., Oncogene 2: 387 - 394 (1988)].
Znanych jest wiele przeciwciał monoklonalnych reagujących z antygenami towarzyszącymi rakowi [patrz np. Papsidero, „Recent Progress In The immunological Monitoring Of Carcinomas Using Monoclonal Antibodies, Semin, Surg. Oncol., 1 (4): 171-81 (1985); Schlom i in., „Potential Clinical Utility Of Monoclonal Antibodies In The Management Of Human Carcinomas, Important Adv. Oncol., 170-92 (1985)]; Allum i in., „Monoclonal Antibodies In The Diagnosis And Treatment of Malignant Conditions, Surg. Ann., 18:41-64 (1986), i Houghton i in., „Monoclonal Antibodies: Potential Applications To The Treatment Of Cancer, Semin, Oncol., 13(2) : 165-79 (1986)].
Te znane przeciwciała monoklonalne mogą wiązać się z różnorodnymi antygenami towarzyszącymi rakowi włącznie z glikoproteinami, glikolipidami i mucynami (patrz np. Fink i in.,
168 720 „Monoclonal Antibodies As Diagnostic Reagents for The Identification And Characterization Of Human Tumor Antigens“, Prog, Clin. Pathol., 9:121-33 (1984)]. Na przykład, przeciwciała monoklonalne wiążące się z antygenami glikoproteinowymi na specyficznych typach raków obejmują te onicone w patentow/wm 7ipHn Amrywlri trr 4.7777 570 ίηΓ7ΡΡηνπαΙα m/onnUnnalne na v|yik>unv »» |yuuvmv n j m >-ί,. ł^jv\*h· i m > / «> z » s »» » iiw nie-drobnokomórkowego raka płuc), opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 753 894 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka piersi), opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 579 827 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka żołądkowo-jelitowego) i opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4713 352 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka nerki). Przeciwciało monoklonalne B72.3, będące jednym z najbardziej badanych przeciwciał, rozpoznaje towarzyszący nowotworowi antygen mucynowy o masie cząsteczkowej wyższej niż 1000 kd, który jest specyficznie eksprymowany na licznych różnych rakach. Wykazano zatem, że B72.3 reaguje z 84% raków piersi, 94% raków okrężnicy, 100% raków jajnika i 96% nie-drobnokomórkowych raków płuc (patrz Johnston, „Applications of Monoclonal Antibodies In Clinical Cytology As Exemplified By Studies With Monoclonal Antibody B72.3“, Acta Cytol., 1(5):537-56 (1987) i opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 612 282 Schloma i in.]. Inne opatentowane przeciwciało monoklonalne, KC-4, [patrz opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4708930], rozpoznaje antygen białkowy o masie cząsteczkowej 400-500 kd eksprymowany na licznych rakach, takich jak rak okrężnicy, prostaty, płuc i piersi. Okazało się, że ani przeciwciało B72.3 ani przeciwciało KC-4 nie ulega internalizacji do komórek rakowych z którymi reagują.
Ujawniono przeciwciała monoklonalne reagujące z antygenami glikolipidowymi towarzyszącymi komórkom nowotworowym. Na przykład, Young i in., „Production Of Monoclonal Antibodies Specific For Two Distinct Steric Portions Of The Glycolipid Ganglio-N-Triosylceramide (Asialo GM2)“, J. Exp. Med., 150:1008-1019 (1979) ujawniają wytwarzanie dwóch przeciwciał monoklonalnych specyficznych wobec asialo GM2, glikosfingolipidowego antygenu powierzchni komórkowej, który jak ustalono, jest markerem komórek BALB/c V3T3 stransformowanych wirusem mięsaka mysiego Kirstein. Patrz także Kniep i in., „Gangliotriaosylceramide (Asialo GM2) A Glycossphingolipid Marker For Celi Lines Derived From Patients With Hodgkin's Disease“, J. Immunol., 131(3): 1591-94 (1983) i opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 507 391 (przeciwciało monoklonalne na ludzkiego czerniaka).
Inne przeciwciała monoklonalne reagujące z glikolipidowymi antygenami na komórkach rakowych obejmują te opisane przez Rosena i in., „Analysis Of Human Small Cell Lung Cancer Differentiation Antigens Using A Panel Of Rat Monoclonal Antibodies“, Cancer Reasearch, 44: 2052-61 (1984) (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc], Varki'ego i in., „Antigens Associated with a Human Lung Adenocarcinoma Defined by Monoclonal Antibodies“, Cancer Research 44:681-87 (1984); (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego gruczolakoraka płuc, żołądka i okrężnicy i czerniaka) i opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 579 827 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego gruczolakoraka okrężnicy). Patrz także Hellstrom i in., „Antitumor Effects Of L6, An IgG2a Antibody That Reacts With Most Human Carcinomas“, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7059-63 (1986), którzy opisują przeciwciało monoklonalne L6 rozpoznające węglowodanowy antygen eksprymowany na powierzchni ludzkiego nie-drobnokomórkowego raka płuc, raka piersi i raka okrężnicy.
Dodatkowe przeciwciała monoklonalne przejawiające wysoką, specyficzną reaktywność wobec większości komórek z szerokiego zakresu raków są bardzo potrzebne. Jest tak z powodu heterogenności antygenowej wielu raków, często wymagają, w diagnozie lub terapii, stosowania licznych różnych przeciwciał monoklonalnych na ten sam guz nowotworowy. Istnieje dalsze zapotrzebowanie, zwłaszcza w terapii, na tak zwane przeciwciała „Internalizowanc, tj. przeciwciała które są łatwo pobierane przez komórki nowotworowe, z którymi się wiążą. Przeciwciała tego typu znajdują zastosowanie w metodach terapeutycznych wykorzystujących koniugaty przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna, w których przeciwncwotworcwy czynnik terapeutyczny związany jest z przeciwciałem w celu dostarczenia do nowotworu, gdzie przeciwciało wiąże się z antygenem towarzyszącym nowotworowi, wobec którego jest ono reaktywne, i „uwalnia“ czynnik przeciwnowotworowy do wewnątrz komórek nowotworowych [patrz np. Embleton i in., „Antibody Targeting Of Anti-Cancer Agents“, w: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, str. 317-44 (Academic Press, 1985)]. Przeciwciała na antygeny towarzyszące nowotworowi, które nie są
168 720 zdolne do internalizacji do komórek nowotworowych, z którymi się wiążą, na ogół nie są użyteczne do przygotowywania koniugatów z lekami lub toksynami przeciwnowotworowymi, ponieważ mogłyby nie być zdolne do osiągnięcia swojego miejsca działania w komórce. Mogą być konieczne inne node>icorn akv możno byiłz-i irynA w z i rzecz^wwAiołn hiiiv pvwj0viu u-L/j mvŁ.nu <sjł\s jr v w iciupn rumv yiŁWin1 oittltt.
Znanych jest kilka mogących ulegać internalizowaniu przeciwciał reagujących z antygenami limfocytów. W przeciwieństwie, przeciwciała takie są rzadkie kiedy traktuje się masywne nowotwory. Jednym z nielicznych przykładów mogącego ulegać internalizowaniu przeciwciała reagującego z rakami jest przeciwciało ujawnione w Domingo i in., „Transferrin Receptor As A Target For Antibody-Drug Conjugates“ Methods Enzymol. 11:238-47 (1985). Przeciwciało to reaguje z ludzką glikoproteiną będącą receptorem transferyny eksprymowaną na komórkach nowotworowych. Jednakże, ponieważ receptor transferyny eksprymowany jest także na wielu normalnych tkankach i często na wysokim poziomie, stosowanie przeciwciała skierowanego przeciwko receptorowi transferyny w koniugacie przeciwciało-lek przeciwciało-toksyna może wywierać znaczący wpływ toksyczny na normalne komórki. Wykorzystanie tego przeciwciała do specyficznego zabijania lub hamowania komórek nowotworowych jest dlatego sprawą sporną. Innym mogącym ulegać internalizowaniu przeciwciałem jest BR64 wiążące się z wieloma rakami.
Technika fuzji komórek dla wytwarzania przeciwciał monoklonalnych [Kohler i Milstein, Naturę (London) 256: 495 (1975)] pozwoliła rozwinąć liczne mysie przeciwciała monoklonalne reagujące z antygenami, włącznie z antygenami uprzednio nieznanymi. Mysie przeciwciała monoklonalne mogą jednakże zostać rozpoznane jako substancje obce i zneutralizowane przez ludzki układ immunologiczny, tak że ich możliwości w terapii u ludzi nie są realizowane. Dlatego też ostatnie wysiłki skupiają się na wytworzeniu tak zwanych przeciwciał „chimerycznych14 poprzez wprowadzenie DNA do komórek ssaków w celu otrzymania ekspresji genów immunoglobulin [Oi i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:825 (1983); Potter i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7161; Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6581 (1984); Sahagan i in., J. Immunol. 137:1066 (1986); Sun i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6581 (1984); Sahagan i in., J. Immunol. 137:1066 (1986); Sun i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214 (1987)].
Przeciwciała chimeryczne są cząsteczkami immunoglobulin zawierającymi część pochodzącą od ludzi i część pochodzenia nie-ludzkiego. Bardziej szczegółowo, region wiążący antygen (region zmienny) przeciwciała chimerycznego pochodzi ze źródła nie-ludzkiego (np. od myszy), a region stały przeciwciała chimerycznego, nadający immunoglobulinom biologiczną funkcję efektorową pochodzi ze źródła ludzkiego. Przeciwciało chimeryczne powiino mieć specyficzność -wiązania antygenu nie-ludzkiej cząsteczki przeciwciała, a funkcję efektorową nadaną przez ludzką cząsteczkę przeciwciała.
Na ogół procedury stosowane do wytwarzania przeciwciał chimerycznych obejmują następujące etapy:
a) identyfikowanie i klonowanie właściwego odcinka genu kodującego wiążącą antygen część cząsteczki przeciwciała; ten odcinek genu (znany jako BDJ, regiony zmienny, różnorodny i łączący dla ciężkich łańcuchów lub VJ, regiony zmienny, łączący dla lekkich łańcuchów lub po prostu jako v lub region zmienny) może być w formie albo cDNA, albo genomowej;
b) klonowanie odcinków genu kodującego region stały lub jego pożądaną część;
c) ligowanie regionu zmiennego z regionem stałym, tak że całkowite przeciwciało chimeryczne jest zakodowane w formie umożliwiającej transkrypcję i translację
d) ligowanie tej konstrukcji z wektorem zawierającym merker selekcyjny i regiony kontrolujące gen, takie jak promotory, sekwencje wzmacniające ekpresję i sygnały dołączania poli(A);
e) amplifikowanie tej konstrukcji w bakteriach;
f) wprowadzanie tego DNA do komórek eukariotycznych (transfekcja), najczęściej limfocytów ssaków;
g) selekcjonowanie komórek eksprymujących marker selekcyjny;
h) poszukiwanie komórek eksprymujących pożądane przeciwciało chimeryczne; i
k) testowanie przeciwciała pod kątem odpowiedniej specyficzności wiązania i funkcji efektorowych.
Zgodnie z tymi metodami manipulowano, w celu wytworzenia białek chimerycznych, przeciwciałami o kilku odrębnych specyficznościach wiązania antygenów [np. anty-TNP: Boulianne i
168 720 in., Nature 312:643 (1984); i anty-antygeny przeciwnowotworowe: Sahagani in., J. Immunol. 137: 1066 (1966)]. Podobnie, przez wiązanie nowych sekwencji z sekwencjami 'kodującymi region wiązania antygenu osiągnięto kilka różnych funkcji efektorowych. Niektóre z nich obejmują enzymy [Nleuberger i in., Nłature 312.604 (19o4)], sLaie regiony iimMunogiobuiin z innych gatunków i stałe regiony innego łańcucha immunoglobulinowego [Sharon i in., Nature 309: 364 (1984); Tan i in. J. Immunol. 135: 3565-3567 (1985)].
Odkrycie rekombinacji homologicznej w komórkach ssaków pozwoliło na skierowanie nowych sekwencji do specyficznych loci chromosomalnych. Rekombinacja homologiczna występuje gdy hodowanie komórek ssaków integrują egzogenny DNA z DNA chromosomalnym w miejscu chromosomu zawierającym sekwencje homologiczne do sekwencji plaumidowych [Folger i in., Mol. Cell. Biol. 2: 1372-1387 (1982); Folger i in., Symp. Quant. Biol. 49: 123-138 (1984); Kucherlapatiiin., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3153-3157 (1984); Lin i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1391-1395 (1985); do Saint Vincent i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2002-2006 (1983); Shaul i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA82: 3781-3784 (1985)]. Możliwość rekombinacji homologicznej w komórkach pozwała na modyfikację genów endogennych insitu. Znaleziono warunki w których sekwencje chromosomalne można modyfikować poprzez wprowadzanie do komórki plazmidowego DNA zawierającego odcinek DNA homologiczny do docelowego locus, i odcinek nowych sekwencji z pożądaną modyfikacją [Thomas i in., Cell 44: 419-428 (1986); Smithies i in., Nature 317: 230-234 (1985); Smith i in., Symp. Quant. Biol. 49: 171-181 (1984)]. Wynikiem rekombinacji homologicznej pomiędzy chromosomalnym DNA komórki ssaka i egzogennym DNA plazmidowym może być integracja plazmidu lub zastąpienie pewnych sekwencji homologicznymi sekwencjami plazmidowymi. Wynikiem tego może być umieszczenie pożądanej nowej sekwencji w ewentualnym locus docelowym.
Sposób rekombinacji homologicznej oceniono przy użyciu genów umożliwiających selekcję dominantów, takich jak NEO lub HPRT dla kilku typów komórek [Song i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6820-6824 (1987); Rubinitz i Subramani, Mol. Cell Biol. 6:1608-1614 (1986); i Liskay, Celi 35: 157-164 (1983)]. Ostatnio opisano procedury modyfikowania cząsteczek przeciwciał i wytwarzania cząsteczek przeciwciał chimerycznych przy użyciu rekombinancji homologicznej w celu ukierunkowanej modyfikacji genu [Fell i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8507-8511 (1989); i będące jednocześnie przedmiotem postępowania patentowego zgłoszenia patentowego St. Zjedn. Ameryki nr kolejny 243 873 złożone 14 września 1988 roku i nr kolejny 468 035 złożone 22 stycznia 1990 roku].
Najbardziej bezpośrednią drogą klinicznego stosowania przeciwnowotworowych przeciwciał monoklonalnych jest podawanie ich w formie niezmodyfikowanej, przy użyciu przeciwciał monoklonalnych przejawiających aktywność przeciwnowotworową in vitro lub w modelach zwierzęcych. Wydaje się, że większość przeciwciał , monoklonalnych na antygeny nowotworowe nie posiada żadnej aktywności przeciwnowotworowej, lecz znane są pewne przeciwciała monoklonalne, które pośredniczą w zależnej od dopełniacza cytotoksyczności (CDC), tj. zabijające ludzkie komórki nowotworowe w obecności ludzkiej surowicy jako źródła wypełniacza [patrz np. Hellstrom i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1499-1502 (1985)], lub zależnej od przeciwciała cytotoksyczności komórkowej (ADCC) wraz z komórkami efektorowymi, takimi jak ludzkie komórki NK lub makrofagi. W celu wykrycia aktywności ADCC lub CDC testuje się zdolność przeciwciał monoklonalnych do lizowania hodowanych, znakowanych 51 Cr nowotworowych komórek docelowych przez 4-godzinny okres inkubacji.
Komórki docelowe znakuje się 51 Cr i następnie eksponuje przez 4 godziny na połączenie komórek efektorowych (w formie limfocytów ludzkich oczyszczonych przez zastosowanie podłoża rozdzielającego limfocyty) i przeciwciała, które dodaje się w stężeniach pomięczy 0,1 μ g/ml. Jako dowód lizy komórek nowotworowych (cytotoksyczności) mierzy się uwalnianie 51 Cr z komórek docelowych. Kontrole obejmują inkubację samych komórek docelowych, lub z albo limfocytami albo przeciwciałem monoklonalnym oddzielnie. Mierzy się całkowitą ilość 51 Cr, który może zostać uwolniony i oblicza ADCC jako procent zabijania komórek docelowych obserwowany z przeciwciałem monoklonalnym plus komórki efektorowe w porównaniu z inkubowanymi samymi komórkami docelowymi. Procedura dla CDC identyczna jest do procedury stosowanej do wykrywania ADCC z tym wyjątkiem, że w miejsce komórek efektorowych dodaje się surowicę ludzką jako źródło dopełniacza (rozcieńczoną 1:3 do 1:6).
168 720
Terapeutyczne stosowanie przeciwciał monoklonalnych z aktywnością ADCC lub CDC rozważa się ponieważ często mają one aktywność przeciwnowotworową in vivo. Z drugiej strony, przeciwciała pozbawione in vitro aktywności ADCC i CDC, in vivo, o ile nie są zastosowane jako itpo7np nnonuiipiołn
HVV£jilV. /.VVI V1U1U monoklonalnego do aktywacji dopełniacza gospodarza może być korzystna terapeutycznie nie tylko dlatego, że komórki nowotworowe mogą zostać zabite, lecz także dlatego ponieważ może wzrosnąć dopływ krwi do nowotworu, ułatwiając zatem pobieranie leków [patrz Hellstrom i in., „Immunological Approaches to Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, and Anti-Idiotypes, w: Cocalently Modified Antigens and Antibodies in Diagnosis and Therapy, Quash and Rodwell, red. Marcel Dekker, str. 15-18 (1989)]. Wśród mysich przeciwciał monoklonalnych, najpowszechniej z ADCC i CDC związane są izotypy IgG2a i IgG3. Przeciwciała posiadające zarówno aktywność ADCC jak i CDC z wysoką specyficznością zabijają tylko komórki nowotworowe, z którymi się wiążą i jest nieprawdopodobne aby prowadziły do wpływów toksycznych, jeśli zwiążą się niespecyficznie w płucach, wątrobie lub innych organach. Może to zapewnić takim przeciwciałom przewagę nad przeciwciałami znakowanymi radioaktywnie lub pewnymi typami immunokoniugatów.
Jest zatem oczywiste, że przeciwciało, które przejawia wyższy stopień specyficzności wobec szerokiego zakresu raków, samo posiada aktywność przeciwnowotworową i zdolne jest do łatwego ulegania internalizacji przez komórki nowotworowe, może być bardzo korzystne w terapii nowotworów.
Internalizowane przeciwciała o wysokiej specyficzności wobec szeregu ludzkich raków, a bardziej szczegółowo, nowe przeciwciała oznaczone jako przeciwciała BR 96, są mysimi przeciwciałami monoklonalnymi i przeciwciałami chimerycznymi wiążącymi się z antygenem błony komórkowej, którego obecność stwierdzono na ludzkich komórkach rakowych. Przeciwciała są w wysokim stopniu reaktywne wobec komórek rakowych, takich jak otrzymane z raka piersi płuc, okrężnicy i jajnika, nie przejawiając, lub przejawiając ograniczoną aktywność z normalnymi komórkami ludzkimi lub innymi typami nowotworów, takimi jak chłoniaki lub mięsaki. Ponadto, przeciwciała te są internalizowane przez komórki rakowe, z którymi się wiążą i same zdolne są do zabijania komórek nowotworowych, tj. w formie nieskoniugowanej i bez komórek efektorowych lub dopełniacza. Przeciwciała BR 96 są zatem szczególnie użyteczne w zastosowaniach terapeutycznych, na przykład do reagowania z komórkami nowotworami, i w koniugatach jako specyficzny wobec celu nośnik różnych czynników posiadających wpływy przeciwnowotworowe, włącznie z lekami chemioterapeutycznymi, toksynami, modulatorami odpowiedzi immunologicznej, enzymami i izotopami radioaktywnymi. Przeciwciała można zatem stosując jako składnik różnych immunokoniugatów, włącznie z koniugatami przeciwciało-lek i przeciwciało-toksyna, gdzie szczególnie korzystna jest internalizacja koniugatu, a po znakowaniu izotopem radioaktywnym jego dostarczenie do nowotoworu. Przeciwciała BR 96 mogą także być korzystne terapeutycznie nawet w formie niezmodyfikowanej. Ponadto przeciwciała użyteczne są w przeznaczonych do wykrywania raka metodach diagnostycznych in vitro lub in vivo.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego bispecyficznego przeciwciała BR 96 wiążącego dwa różne antygeny, z których jeden wiązany jest również przez mysie przeciwciało monoklonalne BR(IgG 3) i przez ludzko-mysie chimeryczne przeciwciało monoklonalne Chi BR 96, polegający na tym, że prowadzi się fuzję dwu hybrydoma mających różne markery selekcyjne, z których jedna wydziela przeciwciało wykazujące tę samą co BR 96 lub Chi BR 96 specyficzność, a druga hybrydoma wydziela przeciwciało wykazujące inną specyficzność, prowadzi się hodowlę takiego hybrydu hybrydomalnego w obecność dwóch markerów selekcyjnych i wyselekcjonowane bispecyficzne przeciwciało oczyszcza się od innych możliwych kombinacji lekko i ciężko łańcuchowych.
Korzystnie wyselekcjonowuje się przeciwciało mające region wiążący antygen, wykazujący tę samą specyficzność co przeciwciało BR 96 lub przeciwciało ChiBR 96 i jednocześnie rozpoznający część epitopu zawierającego fukozę α 1-3 wariantu antygenu Ley.
Wyniki wstępnych poszukiwań epitopów przeprowadzonych z przeciwciałem monoklonalnym wskazywały, że antygen na komórkach rakowych, z którym one się wiążą jest fukozylowaną odmianą antygenu Lewis Y. Antygen Lewis Y (Ley) został opisany przez Abe i in., J. Biol. Chem.
168 720
258: 8934 (1983); Lloyd i in., Immunogenetics 17:537 (1983); Brown i in.,Biosci. Rep. 3:163(1983); Hellstrom i in., Cancer Res. 46: 3917 (1986). Fukozylowany antygen Lewis Y został opisany przez Abe i in., Cancer Res. 46: 2639-2644 (1986).
B ispecy ινζ,ην i yf:
jiwciało monoklonalne BR 96 otrzymywane sposobem według wynalazku wytwarza się stosując dobrze znane techniki z wykorzystaniem hybrydom po raz pierwszy wprowadzone przez Kohlera i Milsteina [patrz, Kohler i Milstein, „Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Pre-Defined Specificity, Nature, 256: 495-97 (1975). Patrz także Brown i in., „Structural Characterisation Of Human Melanoma-Associated Antigen p97 with Monoclonal Antibodies, J. Immunol., 127 (2): 539-46 (1981); Brown i in., „Protein Antigens Of Normal And Malignant Human Cells Identified By Immunoprecipitation With Monoclonal Antibodies, J. Biol.Chem. 255: 4980-83 (1980); Yeh i in., „Cell Surface Antigens Of Human Identified By Monoclonal Antibody, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 (6): 297-31 (1979); i Yeh i in., „A Cell-Surface Antigen Which is Present In the Ganglioside Fraction And Shared By Human Melanoma, Int. J. Cancer. 29: 269-75 (1982)].
Techniki te obejmują iniekcję immunogenu (np. komórek lub ekstraktów komórkowych niosących antygen lub oczyszczonego antygenu) zwierzęciu (np. myszy), tak aby u zwierzęcia tego wywołać pożądaną odpowiedź immunologiczną (tj. przeciwciała). Po odpowiednim czasie otrzymuje się ze zwierzęcia limfocyty wytwarzające przeciwciała, albo ze śledziony, węzłów chłonnych albo z krwi obwodowej. Korzystnie, limfocyty otrzymuje się ze śledziony. Limfocyty pochodzące ze śledziony poddaje się następnie fuzji z linią komórek szpiczaka, zazwyczaj w obecności czynnika indukcyjnego fuzję, takiego jak glikol polietylenowy (PEG). Zgodnie ze standardowymi technikami, do fuzji zastosować można każdą z licznych linii komórek szpiczaka, na przykład linie szpiczaka P3-NS1/1Ag4-1, P3-x63-Ag8 lub Sp2/0 Agl4. Linie te dostępne są w American Type Culture Collection, („ATCC) w Rockville, Maryland.
Otrzymane komórki, obejmujące pożądane hybrydomy, hoduje się następnie na podłożu selekcyjnym, takim jak podłoże HAT, w którym niesfuzjowane rodzicielskie komórki szpiczaka lub ewentualnie limfocyty zamierają. Przeżywają tylko komórki hybrydomy, i można je hodować w warunkach ograniczających dla otrzymania wyizolowanych klonów:· Supernatanty hybrydom testuje się na obecność przeciwciał o pożądanej specyficzności np. technikami· oznaczeń immunologicznych stosując antygen, który został użyty do immunizacji. Klony dodatnie można następnie subklonować w warunkach ograniczających i izolować można wytwarzane przeciwciała monoklonalne. Hybrydomy wytworzone według tych metod można namnażać in· vitro i in vivo (w płynie puchlinowym z jamy otrzewnowej) stosując znane techniki [patrz Fink i in.; •supra str, 123, Fig.
6-11]. Powszechnie stosowane metody oczyszczania przeciwciał monoklonalhych obejmują wytrącanie siarczanem amonu, chromatografię jonowymienną i chromatografię powinowactwa [patrz np. Zola i in., „Techniques For The Production AndCharacterization Of Monoclonal Hybridoma Antibodies, w: Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques And Applications, Hurell (red.), str. 51-52 (CRC Press 1982)]. ’ '
Przeciwciało monoklonalne oznaczone BR 96, wytworzono poprzez opisane tu poniżej techniki z wykorzystaniem hybrydom stosując jako immunogen linię komórkową raka piersi 3396. Hybrydomę BR 96, przygotowaną jak opisano tu poniżej i wytwarzającą przeciwciało BR 96, zdeponowano 22 lutego 1989 w ATCC, gdzie jest w następujący sposób identyfikowana: BR 96 ATCC nr identyfikacyjny, HB 10036.
Przeciwciało BR 96 należy do podklasy IgG3. Przeciwciało przejawia wysoką specyficzność wobec komórek raka różnych typów organów, na przykład nowotworów piersi, płuc, okrężnicy i jajnika, jak również hodowanych linii komórkowych założonych z różnych raków piersi, płuc i okrężnicy. Ponadto przeciwciało BR 96 nie przejawia wiązania· z'innymi typami komórek nowotworowych, takich jak linie komórkowe komórek T chłoniaka, CEM ' i MOLT-4, linia komórkowa komórek B chłoniaka P3HR-1 i linie komórkowe czerniaka. Przeciwciało BR 96 może być internalizowane przez antygenododatnie komórki nowotworowe, jest toksyczne' wobec antygenododatnich komórek nowotworowych, pośredniczy w aktywności ADCC i CDC i, co zaskakujące, samo tj. w formie niezmodyfikowanej, jest cytotoksyczne. Przeciwciała BR 96 wydają się rozpoznawać antygen Ley. ' '
168 720
Chimeryczne (mysie/ludzkie) pzeciwciało wytworzono stosując dwuetapową procedurę rekombinacji homologicznej opisaną przez Fella i in., w Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86; 8507-8511 (1989). Ta dwuetapowa metoda obejmuje użycie docelowego wektora kodującego ludzki ciężki łańcuch IgGgammał do transfckowania mysiej łiniΐ komórkowej hybrydotny eksprymującej mysie przeciwciało monoklonalne BR 96 (hybrydoma ATCC nr HB 10036) w celu wytworzenia hybrydomy eksprymującej chimerycznie przeciwciało BR 96 zawierające ludzki ciężki łańcuch IgGgammal. Hybrydomę tę transfekuje się następnie wektorem docelowym zawierającym DNA kodujący ludzki lekki łańcuch kappa (K) w celu wytworzenia hybrydomy mysiej eksprymującej przeciwciało chimeryczne BR 96 zawierające ludzki ciężki łańcuch IgGgammal i ludzki lekki łańcuch K. Wektorami docelowymi użytymi do transfekcji hybrydom są wektor pHgammalHCDD 4 strawiony enzymem Xba1 (Oncogen, Seattle, WA) i wektor pSV 2gpt/CK strawiony HindIII (Oncogen, Seattle, WA).
Chimeryczną hybrydomę BR 96, określaną tu jako ChiBR96, przygotowaną jak opisano tu poniżej i wytwarzająca chimeryczne ludzkie/mysie przeciwciało BR 96, zdeponowano 23 maja 1990 w ATCC, gdzie jest w następujący sposób identyfikowana: ChiBR 96 ATCC nr identyfikacyjny: HB .10460.
Po zidentyfikowaniu hybrydomy eksprymującej chimeryczne przeciwciało, prowadzi się jej hodowlę i izoluje się pożądane cząsteczki chimeryczne z supernatantu hodowli komórkowej stosując dobrze znane techniki izolowania przeciwciał monoklonalnych.
Używany tutaj termin „przeciwciało BR 96“ obejmuje całe, nienaruszone przeciwciała poliklonalne i monoklonalne, takie jak mysie przeciwciało monoklonalne wytwarzane przez hybrydomę ATCC nr HB 10036, i cząsteczki przeciwciał chimerycznych, takich jak przeciwciało chimeryczne BR 96 wytwarzane przez hybrydomę ATCC nr 10460. Opisane powyżej przeciwciało BR 96 obejmuje wszystkie jego fragmenty zawierające aktywny region wiązania antygenu przeciwciała, takie jak fragmenty Fab, F(ab ')2 i Fv, stosując dobrze znane techniki [patrz np. Rouseaux i in., „Optimal Conditions For The Preparation of Proteolytic Fragments From Monoclonal IgG of Different Rat IgG Subclasses“, w: Methods Enzymol., 121: 663-69 (Academic Press 1986)].
Przeciwciało BR 96 nie przejawia żadnego immunohistologicznie wykrywalnego wiązania z normalnymi tkankami ludzkimi z głównych organów, takich jak nerki, śledziona, wątroba, skóra, płuca, piersi, okrężnica, mózg, tarczyca, serca, węzły chłonne lub jajniki. Przeciwciało nie wiąże się także z leukocytami krwi obwodowej. Przeciwciało BR 96 przejawia ograniczone wiązanie z pewnymi komórkami w migdałkach i jądrach, i wiąże się z komórkami groniastymi w trzustce oraz z komórkami nabłonkowymi w żołądku i przełyku. A zatem, przeciwciało BR 96 przewyższa najbardziej znane przeciwciała przeciwnowotworowe wysokim stopniem specyficzności wobec komórek nowotworowych w porównaniu z komórkami normalnymi [patrz np. Hellstrom i in., „Immunological Approaches To Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, And Antibodies In Diagnosis And Therapy, Quash/Rodwell (red.), str. 1-39 (Marcell Dekker, Inc., 1989) i Bagshawe, „Tumour Markers - Where Do We Go From Here“, Br. J. Cancer, 48: 167-75 (1983)]. ... . .
Techniki immunohistochemiczne obejmują barwienie próbek biologicznych, takich jak próbki tkanki, przeciwciałem BR 96 według wynalazku, a następnie wykrywanie na próbce obecności przeciwciała skompleksowanego z jego antygenem. Tworzenie takich kompleksów przeciwciało-antygen z próbką wskazuje na obecność w tkance komórek rakowych. Wykrywanie przeciwciała na próbce przeprowadzać można stosując znane techniki, takich jak techniki immunoenzymatyczne, np. technikę barwienia immunoperoksydazą lub technikę awidyna-biotyna (ABC), lub techniki immunofluorescencyjne [patrz np. Ciocea i in., „Immunohistochemical Techniques Using Monoclonal Antibodies“, Meth. Enzymol. 121: 162-79 (1986); Hellstrom i in., „Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma“, Cancer Research, 46: 3917-23 (1986); i Kimball (red.), Introduction To Immunology (wyd. II), str. 113-117 (Macmillan Pub. Co. 1986)]. Barwienie immunoperoksydazą zastosowano na przykład, jak opisano w przykładzie II infra, do wykazania reaktywności przeciwciała BR 96 z rakami płuc,· piersi, okrężnicy i jajnika, i niskiej reaktywności przeciwciała z próbkami normalnych tkanek ludzkich.
Serologiczne techniki diagnostyczne obejmują wykrywanie i określanie ilościowe antygenów towarzyszących nowotworom, które uległy sekrecji lub zostały „zrzucone“ do surowicy lub innych
168 720 płynów biologicznych pacjentów cierpiących na raka. Antygeny takie można wykryć w płynach ciała stosując znane techniki, takie jak oznaczenia radioimmunologiczne (RIA) lub ELISA, w których przeciwciało reagujące ze „zrzuconym antygenem stosowane jest do wykrywania obecnrsćoł on+MnoriM -τάΙιτλ-ι-ι Γτ«\<-»♦--r-i-r TTr\ti1n i ności antygenu w pióuce piynu [ putiz np. uotila i in.
, 1 WU-Dllt oaiiuwi nal Antibodies To Human AFP“, J. Immunol. Methods, 42: 11 (1981) i Allum i in., supra na str. 48-51]. Oznaczeń tych, stosując ujawnione przeciwciała BR 96, można dlatego użyć do wykrywania w płynach biologicznych glikolipidowych antygenów reagujących z przeciwciałami BR 96, a zatem wykrywania ludzkiego raka u pacjentów. A zatem jak wynika z powyższych danych, przeciwciała BR 96 stosować można w większości oznaczeń obejmujących reakcje antygen-przeciwciało. Oznaczenia te obejmują, ale nie są ograniczone do standardowych technik RIA, zarówno na płynnej jak i stałej fazie, jak również oznaczeń ELISA, technik immunofluorescencyjnych i innych oznaczeń immunocytochemicznych [patrz np. Sikora i in., (red.), Monoclonal Antibodies, str. 32-52 (Blackwell Scientific Publications 1984)].
Zestawy diagnostyczne do oznaczeń opisanych powyżej zawierają przeciwciało monoklonalne BR 96, jego fragmenty, fuzje białek lub przeciwciało chimeryczne według wynalazku, i koniugat zawierający czynnik specyficznie wiążący przeciwciało i znacznik zdolny do wytwarzania wykrywalnego sygnału. Odczynniki mogą także zawierać czynniki pomocnicze, takie jak czynniki buforujące i czynniki stabilizujące białka (np. polisacharydy). Zestawy diagnostyczne mogą dalej zawierać, tam gdzie jest to konieczne, inne składniki układu wywoływania sygnału włącznie z czynnikami obniżającymi interferencję z tłem, odczynnikami kontrolnymi lub aparatem bądź pojemnikiem do przeprowadzania testu. Innego rodzaju zestaw diagnostyczny zawierać może koniugat przeciwciał i znacznik zdolny do wytwarzania wykrywalnego sygnału. Czynniki pomocnicze, jak wspomniane powyżej także mogą być obecne.
Przeciwciało BR 96 skoniugować można z drugim przeciwciałem tworząc heterokoniugat przeciwciał do traktowania komórek nowotworowych, jak opisał Segal w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4676980.
Ponadto, jak opisano wcześniej, w celach terapeutycznych stosować można chimeryczne lub inne rekombinowane przeciwciała BR 96, takie jak bispecyficzne przeciwciało BR 96 otrzymywane sposobem według wynalazku. Na przykład fuzje białka zawierające przynajmniej region wiążący antygen przeciwciała połączony z co najmniej aktywną funkcjonalnie częścią drugiego białka posiadającego aktywność przeciwnowotworową, np. limfokiną lub onkostatyną, zastosować można do leczenia ludzkiego raka in vivo. Znane techniki rekombinacji zastosować można do konstruowania bispecyficznych przeciwciał BR 96 otrzymywanych sposobem według wynalazku gdzie jedna specyficzność wiązania przeciwciała jest specyficznością BR 96 [patrz np. opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4474893].
Również przeciwciała antyidiotypowe do przeciwciała BR 96 można zastosować terapeutycznie w aktywnej immunizacji przeciwnowotworowej i terapii nowotworów [patrz np. Hellstrom i in., „Immunological Approaches To Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, And Anti-Idiotypes“, w: Cocalently Modified Antigens And Antibodies In Diagnosis And Therapy, supra, str. 35-41],
Dlatego też jest oczywiste, że bispecyficzne przeciwciało BR 96 ma zastosowanie do sporządzania kompozycji farmaceutycznych użytecznych do leczenia ludzkich raków. Przykładem są kompozycje farmaceutyczne do stosowania w leczeniu ludzkich raków zawierające skuteczną farmaceutycznie ilość przeciwciała BR 96 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Kompozycje mogą dodatkowo zawierać inne przeciwciała lub koniugaty do leczenia raka (np. mieszaninę przeciwciał).
Kompozycje przeciwciał można podawać używając konwencjonalnych sposobów podawania obejmujących, lecz nie ograniczonych do dożylnego, dootrzewnowego, doustnego, śródchłonnego lub bezpośrednie podawanie do nowotworu. Korzystne jest podawanie dożylne.
Kompozycje przeciwciał mogą mieć różne formy dawkowania obejmujące, lecz nie ograniczone do ciekłych roztworów lub zawiesin, tabletek, pigułek, proszków, czopków, polimerycznych mikrokapsułek lub mikrovehiculum, liposomów i roztworów iniekcyjnych lub infuzyjnych. Korzystna forma zależy od sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego.
168 720
Kompozycje przeciwciał zawierają także konwencjonalne, farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i znane adjuwanty, takie jak albumina surowicy ludzkiej, wymieniacze jonowe, alumina, tlenek glinu, lecytyna, substancje buforowe, takie jak fosforany, glicyna, kwas sorbiowy, sorbinian nAfacu i cole 1uK elektrolity takie iak ciarmran -nrotammy
M x M w ł w vivłv n w a A w u* «λ a womM-·.» λ w j ·
Najbardziej skuteczny sposób podawania i dawkowania dla danej kompozycji zależy od przebiegu i zaawansowania choroby, zdrowia pacjenta i odpowiedzi na leczenie i orzeczenia leczącego lekarza. Przeto, dawkowanie kompozycji powinno być określane dla pojedynczego pacjenta. Niemniej jednak, skuteczna dawka kompozycji przeciwciał może pozostawać w zakresie od około 1 do około 2000 mg/m?.
W celu umożliwienia pełniejszego zrozumienia opisanego tu wynalazku, poniżej przedstawia się następujące przykłady, zilustrowane na rysunkach (fig. 1-8). Fig. 1 jest digramem wektora phgamma1HC-D używanego w procedurze elektroporacji opisanej w przykładzie II. Fig. 2 jest diagramem wektora pSV 2gpt/Ck używanego w procedurze elektroporacji opisanej w przykładzie II. Figura 3 jest wykresem przedstawiającym wyniki testu współzawodnictwa wiązania porównującym wiązanie mysiego przeciwciała monoklonalnego BR 96 z wiązaniem chimerycznego przeciwciała BR 96 opisanej w przykładzie II. Fig. 4 przedstawia wyniki analizy FACS cytotoksyczności przeciwciał wobec komórek raka piersi 3396 opisanej w przykładzie III. Fig. 5 przedstawia wyniki analizy FACS cytotoksyczności przeciwciał wobec komórek ludzkiego gruczolakoraka płuc 2987 opisanej w przykładzie III. Fig. 6 przedstawia wyniki analizy FACS cytotoksyczności przeciwciał wobec komórek MCF-7 opisanej w przykładzie III. Fig. 7 przedstawia procent hamowania włączania tymidyny do DNA komórek raka piersi 3396 traktowanych mysią immunotoksyną BR 96-RA i chimeryczną (Chi)BR 96-RA przy różnych stężeniach opisany w przykładzie III. Fig. 8 przedstawia procent hamowania włączania tymidyny do DNA komórek raka piersi 3630 traktowanych mysią immunotoksyczną BR 96-RA i chimeryczną ChiBR 96-RA przy różnych stężeniach opisany w przykładzie III.
Przykład I. Wytwarzanie monoklonalnego przeciwciała BR 96.
Monoklonalne przeciwciało BR 96 wtywarza się stosując technikę fuzji hybrydomowej, opisaną wcześniej 'przez M. Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) supra i Yeh et al., Int. J. Cencer (1982) supra. W skrócie, trzymiesięczne myszy BALB/c uodporniano, stosując jako immunogen ekspantowane komórki hodowli gruczolakoraka piersi ludzkich, oznaczanego 3396 lub M 3396 (z gruczolakoraka piersi pochodzącego od pacjenta, hodowane w hodowli Oncogen, Leattle, Washington, St. Zjedn. Am.). Mysz otrzymała iniekcje w pięciu dawkach, przy czym jako pierwsze cztery dawki, mysz otrzymywała jedną iniekcję dootrzewnowo i 1 iniekcję podskórną w czterech miejscach na ciele. Jako piątą dawkę mysz otrzymywała tylko jedną iniekcję dootrzewnowo. Łącznie jako każdą dawkę wstrzykiwano około 107 komórek. W trzy dni po ostatnim szczepieniu usuwano myszy śledzionę i komórki śledziony zawieszano w pożywce hodowlanej RPMI. Następnie komórki śledziony poddawano fuzji z komórkami szpiczaka myszy P3-X63-Ag 8.653 w obecności glikolu polietylenowego (PEG) i pozwalano na wzrost komórek we wgłębieniach płytki do mikromiareczkowania w selektywnej pożywce MAT, jak opisano w publikacji Yeh et al., supra [patrz Kohler and Milstein, Naturę, 256: 495 - 97 (1975) i Eur. J. Immunol., 6 : 511 - 19 (1976)]. Mieszaninę zaszczepiono tak, aby utworzyć hodowle o małej gęstości, pochodzące od pojedynczych komórek lub klonów powstałych w wyniku fuzji.
Supernatanty z tych hodowli hybrydomowych poddawano następnie skriningowi, aby określić bezpośrednio aktywność wiązania z linią komórkową raka piersi, 3396, i z linią komórkową fibroblastów uzyskaną na drodze biopsji skóry za pomocą próby ELISA, podobnej do opisanej w publikacji Donillard et al., „Enzyme-Linked Immunosorbent Assay For Sereening Monoclonal Antibody Production Using Enzyme - Labeled Second Antibody“, Meth. Enzymol., 92 : 168 - 74 (1983).
Zgodnie z tą próbą, antygen (z którym poddano skriningowi przeciwciało dla określenia jego reaktywności) unieruchomiono na płytkach do mikromiareczkowania i następnie inkubowano z supernatantami hybrydomowymi. Jeśli supernatant zawierał pożądane przeciwciało, było one wiązane z unieruchomionym antygenem i wykrywane przez dodanie konjugatu antyimmunoglobuliny z enzymem i podłoża przeciwciała enzymu, co prowadziło do dających się zmierzyć zmian gęstości optycznej. Podczas prowadzonych badań, komórki raka piersi lub kontrolne komórki
168 720 fibroblastów umieszczono na płytce do hodowli tkankowej z 96 wgłębieniami (Costar Cambrige, MA) i inkubowano przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C (5% CO 2). Komórki doprowadzono następnie do końcowego stężenia we wgłębieniu wynoszącego 0,5% za pomocą
100μΐ świeżo przyrządzonego 1% aldehydu glutarowego i inkubowano w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym przemyto trzykrotnie 1 X roztworem solanki buforowanej fosforanem (PBS). Następnie komórki blokowano w ciągu 30 minut 5% białkiem surowicy bydlęcej (BSA) w PBS i ponownie przemyto trzykrotnie PBS.
Następnie dodano supernatanty z hodowli hybrydomowych w ilości DO pl/wgłębienie, zawartość wgłębień inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej i komórki przemyto trzykrotnie PBS. Następnie dodano kozią antymysią peroksydazę chrzanową (Zymed, CA) rozcieńczoną w 0,1% BSA i PBS do stężenia 100 ul/w^głębienie. Mieszaninę reakcyjną inkubowano albo w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej albo w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C, po czym komórki przemyto trzykrotnie PBS. Następnie dodano o-fenylenodwuaminę (OPD) w ilości 100 ul/wgłębienie i płytki inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej w ciągu 5-45 minut. Przeciwciała związane z komórkami wykrywano poprzez zmianę barwy we wgłębieniach, występującą w ciągu 1-10 minut. Reakcję przerwano dodatkiem 100 μΐ H2SO4/wgłębienie i dokonano odczytu absorbancji na automatycznym urządzeniu odczytującym Dynatech (Alexandria VA) Microelisa przy 490 nm.
Należy zauważyć, że próbę tę można przeprowadzić stosując nienaruszone komórki lub oczyszczone rozpuszczalne ekstrakty antygenowe lub komórkowe w postaci unieruchomionego antygenu. Gdy jako antygen stosowano rozpuszczalny antygen lub ekstrakty komórkowe, antygen umieszczono początkowo na płytkach w ilości 50 |ul/wgłębienie w PBS i płytki przed rozpoczęciem próby inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Gdy jako antygen stosuje się nienaruszone komórki, można je stosować świeże lub po unieruchomieniu. W każdym przypadku komórki umieszczano najpierw na płytkach w ilości 104 komórek w 50 ul/wgłębienie w pożywce hodowlanej i inkubowano przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C (3% CO 2).
W ten sposób wyselekcjonowano hybrydomy wytwarzające przeciwciała wiązane przez linię komórkową raka piersi, a nie przez komórki ludzkich fibroblastów i badano je w urządzeniu do sortowania komórek FACS na leukocytach krwi obwodowej. (PB1s), jak opisano w przykładzie II. Hybrydomy ujemne wobec PB1s klonowano, ekspandowano in vitro i badano dalej pod kątem specyficzności przeciwciał. Hybrydomy wytwarzające przeciwciała reagujące z rakiem piersi ludzkiej ponownie klonowano, ekspandowano i wstrzykiwano pierwotnie uczulonym trzymiesięcznym myszom BALB/c, gdzie wzrastały powodując wodobrzusze.
Postępując w opisany wyżej sposób, uzyskano hybrydomy linii komórkowej BR 96, klonowane i wstrzykiwane myszom w celu rozwinięcia się nowotworu powodujące wodobrzusze. Jak ujawniono poprzednio, hybrydomy BR 96 zdeponowano w kolekcji ATCC. Monoklonalne przeciwciała BR 96 oczyszczano z płynów wodobrzusza za pomocą chromatografii powinowactwa na unieruchomionym rekombinantowym białku A (Repligen, Cambridge, MA). Sklarowane płyny rozcieńczono równą objętością buforu wiążącego (1m fosforan potasowy, pH 8) i nanoszono na kolumnę z białkiem A, poprzednio zrównoważonym buforem wiążącym. Kolumnę obficie przemyto buforem wiążącym i następnie eluowano przeciwciało 50 milimolowym roztworem kwasu fosforowego, pH 3. Oczyszczoną frakcję zawierającą przeciwciało zabojętniono 1m roztworem Tris, pH 9, i następnie dializowano wobec roztworu soli buforowanego fosforanem. Oczyszczone BR 96 odsączono wreszcie w warunkach jałowości i przechowywano w stanie schłodzonym lub zamrożonym.
Przykład II. Otrzymywanie i charakterystyka chimerycznego przeciwciała BR 96 (ChiBR
96).
Mysie/ludzkie przeciwciało chimeryczne BR 96 („ChiBR 96“) wytwarza się stosując dwuetapowy protokół rekombinancji homologicznej jak opisali Fell i in., w Proc. Natl. Acad. Sci., 86,8507 - 8511 (1989).
Transfekcja DNA ludzkiego łańcucha ciężkiego.
Mysią linię komórek hybrydoma BR'96, ATCC na HB10036 poddaje się transfekcji (8 · 106 komórek) h γ1 (HC-D) zdeponowano w Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, NRRL No. 18599) (fig. 1) za pomocą elektroporacji (Gene Pulser; Biorad Laboratories, Richmond, CA) przy 250 V, przy ustawieniu kapacytancji 960|uFd, w izotonicznym buforo12
168 720 wanym fosforanami roztworze soli (PBS) i z oczyszczonym fragmentem restrykcyjnym XbaI o 6,2 kilozasady (30pl/ml) wektora h /iHC-D. Po upływie 48 godzin komórki osadza się w 96dołkowych płytkach przy 104 komórek/dołek. Selekcję pod względem NeoR prowadzi się w podłożu
IMDM (GIBCO,
7n ιι;ι orn i o /ιλXI X J Z_CX W 1V1 CłJ CjV j 111
10% obj/obj płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i antybiotyczny aminoglikozyd G418 (GIBCO) w stężeniu 2,0 mg/ml.
Wykrywanie wydzielonego przeciwciała stanowiącego ludzką IgG (Hu γ 1) za pomocą ELISA.
Supernatanty hodowli poddaje się screeningowi stosując kanapkowy test ELISA po upływie dwóch tygodni od transfekcji. Jako przeciwciało wychwytujące stosuje się kozie przeciwciało przeciw ludzkiej IgG, Fc-swoiste (CALTAG, San Francisco, CA) i jako przeciwciało do wykrycia związanej ludzkiej IgG stosuje się kozie przeciwciało α-ludzka IgG, Fe-swoiste, sprzężone z peroksydazą z chrzanu HRPO (CALTAG). Komórki z dołów HuIgG pozytywnych subklonuje się za pomocą rozcieńczenia i rozcieńczeniowe klony poddaje screeningowi za pomocą ELISA w celu wykrycia ludzkiej IgG γ i uprzednio opisaną metodą. Klony zawierające ludzką IgG γ 1 poddaje się też screeningowi za pomocą ELISA w celu wykrycia mysiego łańcucha ciężkiego IgG 3. Koziego przeciwciała przeciw mysiej IgG 3 (Southern Biotechnology Assoc., Inc., Birmingham, AL) używa się też jako wychwytującego przeciwciała, a kozie przeciwciało przeciwmysie sprzężone z HRPO (Southern Biotechnology Assoc., Inc) jest przeciwciałem zastosowanym do wykrycia mysiej IgG 3.
Wybiera się jeden z klonów pozytywnych wobec ludzkiej IgG γ i i negatywnych wobec mysiej IgG3 (Hu γ1+, MuG3-). Otrzymuje on oznaczenie ChiHBR 96. Tę linię komórek hybrydoma chimerycznego pod względem łańcucha ciężkiego charakteryzuje się pod względem swoistości antygenowej na komórkach MCF-7 i co do poziomu ekspresji za pomocą ilościowego testu ELISA pod względem ekspresji ludzkiej IgG na komórkach MCF7. Linia komórek ChiHBR 96 przeprowadza ekspresję około 20 Mg/ml przeciwciała stanowiącego antygenowo swoistą ludzką IgG.
Transfekcja DNA łańcucha lekkiego.
Hybrydoma ChiHBR 96 (8 · 106 komórek) poddaje się transfekcji za pomocą elektroporacji, jak opisano powyżej, ale stosując (30 Mg/ml) ludzki wektor rekombinantowy łańcucha lekkiego pSV 2gpt/CK (NRRL No.B 18507) zawierający sekwencję łańcucha lekkiego K immunologlobuliny ludzkiej przedstawioną na fig. 2, przeprowadzony w postać liniową z użyciem HindIII. Po upływie 48 godzin komórki osadza się w 96-dołkowych płytkach przy 104 komórek/dołek. Selekcję pod względem gpt prowadzi się w podłożu IMDM zawierającym 10% obj/obj FBS, hipoksantynę w stężeniu 15 Mg/ml, ksantynę w stężeniu 250Mg/ml i kwas mikofenolowy (MA) w stężeniu 2,25 Mg/ml.
Wykrywanie wydzielonego przeciwciała ludzkiego kappa (Hu K) za pomocą ELISA.
Supernatanty hodowli poddaje się screeningowi z zastosowaniem kanapkowego testu ELISA, jak opisano powyżej, po upływie dwóch tygodni od transfekcji. Wychwytującym przeciwciałem jest kozie przeciwciało α-ludzkie K (CALTAG), a przeciwciałem stosowanym do wykrycia związanego ludzkiego K jest kozie HPRO-przeciwciało przeciw ludzkiemu K (CALTAG). Dołki zawierające ludzkie przeciwciało K subklonuje się za pomocą rozcieńczenia i poddaje screeningowi za pomocą ELISA w celu wykrycia ludzkiego lub mysiego łańcucha K. Koziego przeciwciała przeciw mysiemu K (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) używa się jako przeciwciała wychwytującego i koziego przeciwciała przeciw mysiemu K sprzężonego z HRPO (Fisher Scientific) używa się jako przeciwciała do wykrycia obecności mysiego łańcucha K. Jeden z klonów pozytywnych wobec ludzkiego K, negatywnych wobec mysiego K, wybiera się do analizowania swoistości antygenowej na komórkach MCF-7 i co do poziomu ekspresji za pomocą ilościowego testu ELISA pod względem ekspresji ludzkiej IgG na komórkach MCF-7. Wybrano linię komórek swoistą wobec komórek MCF-7 i HuIgG+, MuIgG3, Huk+, MuK_. Otrzymuje ona oznaczenie chimeryczne BR 96 (ChiBR 96).
Wyjściowa ekspresja ciężkiego i lekkiego łańcucha chimerycznego przeciwciała antygenowo swoistego BR 96 (Chi-BR 96) wynosi około 25 Mg/ml. W wyniku zastosowania czterech kolejnych nawrotów klonowania linii w miękkiej agarozie z nawarstwieniem króliczym przeciwciałem aHuIgG w celu wykrycia komórek wydzielających największą ilość chimerycznego przeciwciała [Coffino i in., J. Cell. Physiol., 89,429-440 (1972)]otrzymujesię linię komórek hybrydoma (ChiBR
168 720
96) wydzielającą około 130 ug/ml chimerycznego przeciwciała. Hybrydoma ChiBR 96 zdeponowano w ATCC 23 maja 1990 pod numerem depozytowym ATCC No. HP 10460.
Wiązanie ChiBR 96.
nriwinriwortwn oło GA i mvi ’ ’ Ił H1V »ł Π Ł.VVX Tł Viuau .✓ V» X LUJ \
1V£V pi nowotworowego na komórkach MCF-7 oznacza się za pomocą testu kompetycyjnego wiązania ELISA [Hellstrom i in., Cancer Res., 50, 2449 - 2454 (1990)]. Mówiąc krótko, przylegającą linię komórek MCF-7 obarczoną antygenem nanosi się na 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania przy 3 · 104 komórek/dołek i pozwala na wzrost do zlewania się w ciągu około 3-4 dni. Podłoże wzrostowe odrzuca się i komórki utrwala 0,5% aldehydem glutarowym w PBS (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) przy 100 /U/dołek w ciągu 30 minut. Odrzuca się aldehyd glutarowy i płytkę przemywa łagodnie PBS trzy razy. Następnie zablokowuje się płytkę buforem wiążącym (0,1% BSA w DNEM) przy 200 pl/dołek w ciągu godziny, albo przechowuje przez nieokreślony okres czasu w temperaturze -20°C. Bufor wiążący odrzuca się i do dołków dodaje się próbki i standardy. Płytki przykrywa się i inkubuje przez noc w temperaturze 4°C. Próbki i standardy odrzuca się i płytki przemywa PBS trzy razy. Do dołków dodaje się koniugat HRP rozcieńczony 1% surowicą końską w PBS, 100 jul/dołek i inkubuje w ciągu godziny w temperaturze 37°C. ELISA prowadzi się z chromagenem 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyną (TMB) (Genetic Systems. Seattle, WA) w buforze cytrynianowym. Rozwijanie się zabarwienia zatrzymuje się 3N H2SO4 i płytkę odczytuje na czytniku Tetertek Microplate przy 450 nm. W tym badaniu ustala się, w jakim rozmiarze biotynylowane przeciwciało ChiBR 96 (0,3 jug/ml) oddziaływuje kompetycyjnie albo z nieznakowanym ChiBR 96 albo ze znakowanym mysim przeciwciałem monoklonalnym BR 96 wobec antygenu. Związane biotynylowane przeciwciało ChiBR 96 wykrywa się z użyciem kompleksu awidynaHRPO i oznacza standardowymi odczynnikami ELISA.
Jak to przedstawiono na fig. 3, zachodzenie na siebie 2 krzywych wiązania wskazuje na to, że dwa przeciwciała mają tę samą swoistość i względne powinowactwo do antygenu nowotworowego.
Przykład III. Charakterystyka przeciwciała ChiBR 96 i fragmentów F(ab ')2 BR 96.
Cytotoksyczność nie zmodyfikowanego ChiBR 96 i fragmentów F(ab ')2 BR 96.
Na żywe komórki, w zawiesinie, z antygenowo pozytywnych pod względem BR 96 linii carcinoma 3396, 2987 i MCF-7, działa się ChiBR 96 i fragmentami F(ab')2, w celu określenia cytotoksyczności tych przeciwciał w porównaniu z monoklonalnym przeciwciałem BR 96. Testy cytotoksyczności wykonuje się w badaniu FACS. Wyniki tych eksperymentów przedstawione są na fig. 4, 5 i 6 jako procentowe zabicie komórek wobec stężenia przeciwciała w ug/ml.
Figury 4 i 6 pokazują, że chimeryczne przeciwciało BR 96 i fragmenty F(ab ')2 BR 96 (IgG3) są podobne do przeciwciała monoklonalnego BR 96 pod względem cytotoksyczności wobec komórek 3396 i MCF-7. Fig. 5 wykazuje, że wpływ cytotoksyczny na komórki 2987 jest znacznie mniejszy niż na komórki innych raków sutka (figury 4 i 6). Wyniki te sugerują, że wyższy stosunek wiązania (tabela 1) jest ważny pod względem zabijania przez te przeciwciała i/lub, że różne komórki nowotworowe mogą mieć odmienną wrażliwość na zabijanie przez te przeciwciała. Wyniki te objaśniają fakt, że przeciwciało ChiBR 96 i fragmenty F(ab')2 są cytotoksyczne jako takie, to jest w postaci nie sprzężonej, a także objaśniają, że cytotoksyczność przeciwciał BR 96 nie jest zależna od regionu Fc.
Internalizacja ChiBR 96.
Internalizację przeciwciała ChiBR 96 w komórkach carcinoma ocenia się w porównaniu z internalizacją przeciwciała monoklonalnego BR 96. Przeciwciała sprzęga się z toksyną-łańcuchem A rycyny z utworzeniem immunotoksyn ChiBR 96-RA (1-4 łańcuchów A rycyny na cząsteczkę przeciwciała) i BR 96-RA (1-2 łańcuchów A rycyny na cząsteczkę przeciwciała). Mierzy się internalizację przez linie komórek carcinoma 3396 i 3630 stosując test zahamowania włączania tymidyny.
Wykresy procentowego zahamowania włączania tymidyny wobec stężenia immunotoksyny dla każdej badanej linii komórek są przedstawione na fig. 7 i 8. Fig. 7 przedstawia procentowe zahamowanie włączania tymidyny przez linię komórek raka sutka 3396 spowodowane internalizacją ChiBR 96-RA i BR 96-RA. Jak przedstawiono na wykresie, ChiBR 96 internalizowane jest podobnie do BR 96 i okazuje się co najmniej tak skuteczne jak BR 96 w zabijaniu komórek nowotworowych. Podobne wyniki otrzymuje się z linią komórek raka sutka 3630 (fig. 6).
168 720
Aktywność ADCC przeciwciała ChiBR 96.
Oznaczenia aktywności ADCC ChiBR 96 dokonuje się z zastosowaniem następujących linii komórek: linie komórek raka sutka 3396,3630 i 3680 (Oncogen, Seattle, WA) MCF-7 (ATCC No. HTB22), linię komórek raka jajnika 3633-3 (O^oge^, Seattle, WA) oraz linie komórek raka płuca 2987, 3655-3 i 2981 (Oncogen, Seattle, WA). Wyniki przedstawione są w poniższej tabeli 1 dla różnych stężeń przeciwciała.
Tabela 1
Aktywność ADCC ChiBR 96
| Lima komórek | Przeciwciało | NK | Stężenie przeciwciała (ug/ml) | ||||
| 10 | 1 0,1 | 0,01 | 0,001 | ||||
| Rak sutka | |||||||
| 3396 | BR 96 | 28 | 86 | 74 | 58 | 27 | 25 |
| ChiBR 96 | 88 | 79 | 60 | 34 | 26 | ||
| MCF-7 | BR 96 | 16 | 82 | 69 | 54 | 17 | 15 |
| ChiBR 96 | 90 | 82 | 57 | 25 | 17 | ||
| MCF-7 | BR 96 | 22 | 73 | 69 | 48 | 22 | 22 |
| ChiBR 96 | 76 | 70 | 57 | 33 | 26 | ||
| 3630 | BR 96 | 30 | 69 | 64 | 42 | 30 | 34 |
| ChiBR 96 | 69 | 56 | 42 | 36 | 36 | ||
| 3680 | BR 96 | 13 | 73 | 67 | 58 | 34 | 38 |
| ChiBR 96 | 70 | 71 | 61 | 39 | 30 | ||
| Rak jajnika | |||||||
| 3633-3 | BR 96 | 20 | 92 | 90 | 64 | 28 | 23 |
| ChiBR 96 | 88 | 88 | 54 | 43 | 29 | ||
| Rak płuca | |||||||
| 2987 | BR 96 | 11 | 51 | 57 | 41 | 9 | 7 |
| ChiBR 96 | 69 | 65 | 51 | 28 | 15 | ||
| 3655-3 | BR 96 | 4 | 49 | 37 | 0 | 0 | 0 |
| ChiBR 96 | 39 | 35 | 12 | 6 | 5 | ||
| 2981 | BR 96 | 3 | 4 | 3 | 3 | 4 | 5 |
| ChiBR 96 | 5 | 4 | 3 | 4 | 4 |
Wyniki przedstawione w tabeli 1 dla różnych stężeń przeciwciała wskazują, że ChiBR 96 pośredniczy w aktywności ADCC w podobnym rozmiarze co BR 96. Aktywność ADCC można obserwować przy stężeniach przeciwciał niższych, niż stężenia, w których przeciwciało ChiBR 96 jest cytotoksyczne jako takie. Gdy stosuje się samo przeciwciało ChiBR 96 jako kontrolę, daje ono 0% zabicia w badanych stężeniach. Aktywność ADCC stwierdza tylko w przypadku linii komórek wiążących przeciwciało BR 96.
Zdolność ChiBR 96 do pośredniczenia w cytotoksyczności, w której pośredniczy dopełniacz.
Określenia zdolności ChiBR 96 do zabijania komórek nowotworowych w obecności surowicy ludzkiej jako źródła dopełniacza (CDC) dokonuje się stosując linie komórek raka sutka 3396, MCF-7,3630 i 3680, linię komórek raka jajnika 3633-3 oraz linie komórek raka płuca 3655-3, 2987 i 2981. Tabela 2 przedstawia wyniki.
Jak przedstawiono w tabeli 2, ChiBR 96 wywiera działanie cytotoksyczne (CDC) podobne do zdziałania BR 96 w obecności surowicy ludzkiej zawierającej dopełniacz. BR 96 i ChiBR 96 nie są cytotoksyczne w żadnym ze stężeń. Surowica ludzka również nie jest cytotoksyczna.
Powyższe dane wykazują, że pełne przeciwciało BR 96 i chimeryczne przeciwciało są internalizowane przez komórki carcinoma, z którymi się wiążą, są cytotoksyczne jako takie w postaci nie zmodyfikowanej i wykazują aktywność ADCC wobec komórek przeprowadzających ekspresję większej ilości epitopów.
168 720
Tabela 2
Aktywność CDC ChiBR 96
Stężenie przeciwciała (pg/ml)
Linia komórek
Przeciwciało
| 10 1 | 0,1 | 0,01 | |||
| Rak sutka | |||||
| 3396 | BR 96 | 100 | 99 | 78 | 13 |
| ChiBR 96 | 86 | 92 | 13 | 2 | |
| MCF-7 | BR 96 | 94 | 100 | 63 | 2 |
| ChiBR 96 | 92 | 83 | 2 | 0 | |
| 3630 | BR 96 | 94 | 100 | 82 | 9 |
| ChiBR 96 | 86 | 86 | 33 | 9 | |
| 3680 | BR 96 | 100 | 100 | 19 | 7 |
| ChiBR 96 | 87 | 100 | 5 | 9 | |
| Rak jajnika | |||||
| 3633-3 | BR 96 | 98 | 98 | 21 | 0 |
| ChiBR 96 | 100 | 100 | 26 | 1 | |
| Rak płuca | |||||
| 3655-3 | BR 96 | 91 | 22 | 0 | 0 |
| ChiBR 96 | 46 | 3 | 0 | 0 | |
| 2987 | BR 96 | 100 | 100 | 1 | 0 |
| ChiBR 96 | 100 | 43 | 0 | 0 | |
| 2981 | BR 96 | 0 | 3 | 3 | 2 |
| ChiBR 96 | 1 | 1 | 2 | 10 |
Hf
Fi 9· 2
0,3 ug/ml biotynylowanego chimerycznego BR 96
—o-chimeryczne SR96 -Β-mysie BR96
0,30,2Fig.3 °Ί
0,0 Γ......'1 τ 11 ιιιΐ| -ι r ιιιιιΐ|
0,001 0,01 0,1
l ilJIIHj l Ι'ΊΙΙΊΊΊ) I I I ΓΙΊΤΤ]......| | ||||jq
10 100 1000 jjg/ml
168 720 % martwych docelowa linia
Fig. 4 % martwych docelowa linia komórek komórkowa H2987
Fig. 5
168 720 % martwych docelowa linia
Fig. 6
Fig. 7
168 720
Fig. 8
Fig.1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł
Claims (2)
1. Sposób wytwarzania nowego bispecyficznego przeciwciała BR 96 wiążącego dwa różne antygeny, z których jeden wiązany jest również przez mysie przeciwciało monoklonalne BR(IgG 3) i przez ludzko-mysie chimeryczne przeciwciało monoklonalne ChiBR96, znamienny tym, że prowadzi się fuzję dwu hybrydoma mających różne markery selekcyjne, z których jedna wydziela przeciwciało wykazujące tę samą co BR 96 lub ChiBR 96 specyficzność, a druga hybrydoma wydziela przeciwciało wykazujące inną specyficzność, prowadzi się hodowlę takiego hybrydu hybrydomalnego w obecności dwóch markerów selekcyjnych i wyselekcjonowane bispecyficzne przeciwciało oczyszcza się od innych możliwych kombinacji lekko i ciężko łańcuchowych.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wysclekcjjmowuje się przeciwciało mające region wiążący antygen, wykazują tę samą specyficzność co przeciwciało BR 96 lub przeciwciało ChiBR 96 i jednocześnie rozpoznający część epitopu zawierającego fukozę α 1-3 wariantu antygenu Ley.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US37494789A | 1989-06-30 | 1989-06-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL168720B1 true PL168720B1 (pl) | 1996-03-29 |
Family
ID=23478864
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL90307120A PL168700B1 (pl) | 1989-06-30 | 1990-06-29 | Sposób wytwarzania nowego ludzko-mysiego chimerycznego przeciwcialamonoklonalnego PL |
| PL90307121A PL168720B1 (pl) | 1989-06-30 | 1990-06-29 | Sposób wytwarzania nowego bispecyficznego przeciwciala BR 96 PL |
| PL90285859A PL167620B1 (pl) | 1989-06-30 | 1990-06-29 | Sposób wytwarzania nowego mysiego przeciwciala monoklonalnego BR96 PL |
| PL90307119A PL168711B1 (pl) | 1989-06-30 | 1990-06-29 | Sposób wytwarzania rekombinantu nowego przeciwciala obejmujacego region wiazaniantygenu mysiego przeciwciala monoklonalnego BR 96 PL |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL90307120A PL168700B1 (pl) | 1989-06-30 | 1990-06-29 | Sposób wytwarzania nowego ludzko-mysiego chimerycznego przeciwcialamonoklonalnego PL |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL90285859A PL167620B1 (pl) | 1989-06-30 | 1990-06-29 | Sposób wytwarzania nowego mysiego przeciwciala monoklonalnego BR96 PL |
| PL90307119A PL168711B1 (pl) | 1989-06-30 | 1990-06-29 | Sposób wytwarzania rekombinantu nowego przeciwciala obejmujacego region wiazaniantygenu mysiego przeciwciala monoklonalnego BR 96 PL |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD297418A5 (pl) |
| PL (4) | PL168700B1 (pl) |
| ZA (1) | ZA905131B (pl) |
-
1990
- 1990-06-29 PL PL90307120A patent/PL168700B1/pl unknown
- 1990-06-29 PL PL90307121A patent/PL168720B1/pl unknown
- 1990-06-29 PL PL90285859A patent/PL167620B1/pl unknown
- 1990-06-29 PL PL90307119A patent/PL168711B1/pl unknown
- 1990-06-29 ZA ZA905131A patent/ZA905131B/xx unknown
- 1990-07-02 DD DD90342440A patent/DD297418A5/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DD297418A5 (de) | 1992-01-09 |
| PL168700B1 (pl) | 1996-03-29 |
| ZA905131B (en) | 1991-04-24 |
| PL168711B1 (pl) | 1996-03-29 |
| PL285859A1 (en) | 1991-03-11 |
| PL167620B1 (pl) | 1995-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5491088A (en) | Monoclonal antibody BR 96 and chimeric monoclonal antibodies having the variable region of MAB BR96, which bind to a variant of ley antigen on human carcimona cells | |
| US5242824A (en) | Monoclonal antibody to human carcinomas | |
| JP4124486B2 (ja) | ガン細胞を特異的に検出する抗原結合フラグメント、このフラグメントをコードするヌクレオチド、ならびにガンの予防および検出のためのその使用 | |
| AU2005252699B2 (en) | Transferrin receptor antibodies | |
| US5688657A (en) | Monoclonal antibodies against human colon carcinoma-associated antigens and uses therefor | |
| US5171665A (en) | Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors | |
| JP3492373B2 (ja) | モノクローナル抗体 | |
| JP2000511421A5 (pl) | ||
| WO1991013974A1 (en) | Monoclonal antibody and immunoconjugates for the treatment and detection of b cell disorders | |
| CA2948743C (en) | Antibody binding to carbonic anhydrase and use thereof | |
| US7384631B2 (en) | Methods of diagnosis and treatment by binding p75/AIRM1 | |
| USRE39760E1 (en) | Monoclonal antibodies against human colon carcinoma-associated antigens and uses therefor | |
| PL168720B1 (pl) | Sposób wytwarzania nowego bispecyficznego przeciwciala BR 96 PL | |
| CA2255540C (en) | Antigen binding fragments that specifically detect cancer cells, nucleotides encoding the fragments, and use thereof for the prophylaxis and detection of cancers | |
| US7115722B1 (en) | Antigen binding fragments that specifically detect cancer cells, nucleotides encoding the fragments, and use thereof for the prophylaxis and detection of cancers | |
| WO1990006772A1 (en) | Novel monoclonal antibody to human carcinomas | |
| NZ505305A (en) | Antigen binding fragments that inhibit an antibody comprising amino acid sequences of H and L chain V regions of a scFv from binding to the surface of a cancer cell |