PL168720B1 - Sposób wytwarzania nowego bispecyficznego przeciwciala BR 96 PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania nowego bispecyficznego przeciwciala BR 96 wiazacego dwa rózne antygeny, z których jeden wiazany jest równiez przez mysie przeciwcialo m onoklonalne BR(IgG 3) i przez ludzko-mysie chimeryczne przeciwcialo m onoklonalne ChiBR96, znamienny tym, ze prowadzi sie fuzje dwu hybrydom a majacych rózne m arkery selekcyjne, z których jedna wydziela przeciwcialo wykazujace te sam a co BR 96 lub ChiBR 96 specyficznosc, a druga hybrydom a wydziela przeciwcialo wykazujace inna specyficznosc, prow adzi sie hodowle takiego hybrydu hybrydom alnego w obecnosci dwóch m arkerów selekcyjnych i wyselekcjonowane bispecyficzne przeciwcialo oczyszcza sie od innych mozliwych kom binacji lekko i ciezko lancuchowych. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego bispecyficznego przeciwciała BR 96. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania bispecyficznego przeciwciała BR 96 wiążącego dwa różne antygeny, z których jeden wiązany jest również przez mysie przeciwciało monoklonalne BR(IgGe) i przez ludzko-mysie chimeryczne przeciwciało monoklonalne ChiBR 96. Przeciwciała te mają kilka dodatkowych zalet. Po pierwsze, ulegają one internalizacji do komórek rakowych, z którymi się wiążą. Przeciwciała BR 96 są więc użyteczne do zastosowań terapeutycznych, na przykład, jako przeciwciałowy składnik koniugatów przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna, gdzie pożądana jest internalizacja koniugatu. Po drugie, przeciwciała pośredniczą w zależności od przeciwciała cytotoksyczności komórkowej „ADCC“, i zależnej od dopełniacza cytotoksyczności „CDC“. Po trzecie, przeciwciała w formie nieskoniugowanej mogą zabijać antygenododatnie komórki nowotoworowe, jeśli obecne są w dostatecznym stężeniu. Przeciwciała użyteczne są także w metodach diagnostycznych, takich jak wykrywanie raków metodami in vitro lub in vivo.

Przeciwciała monoklonalne na ludzkie różnicujące antygeny towarzyszące nowotworowi zapewniają możliwość „ukierunkowywania¹' różnych czynników antynowotworow'ych, takich jak radioizotopy, leki chemioterapeutyczne i toksyny. [Baldwin i Byers, (red.), w: „Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy“, Londyn, Academic Press (1985)]. Ponadto, korzystną cechą pewnych przeciwciał monoklonalnych jest możliwość zabijania komórek nowotworowych przez ADCC lub CDC w obecności ludzkich komórek efektorowych lub surowicy [Hellstrom i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)], i niewiele jest przeciwciał monoklonalnych, które posiadają bezpośrednią aktywność przeciwnowotworową, niezależną od żądanego komponentu gospodarza [Drebin i in., Oncogene 2: 387 - 394 (1988)].

Znanych jest wiele przeciwciał monoklonalnych reagujących z antygenami towarzyszącymi rakowi [patrz np. Papsidero, „Recent Progress In The immunological Monitoring Of Carcinomas Using Monoclonal Antibodies, Semin, Surg. Oncol., 1 (4): 171-81 (1985); Schlom i in., „Potential Clinical Utility Of Monoclonal Antibodies In The Management Of Human Carcinomas, Important Adv. Oncol., 170-92 (1985)]; Allum i in., „Monoclonal Antibodies In The Diagnosis And Treatment of Malignant Conditions, Surg. Ann., 18:41-64 (1986), i Houghton i in., „Monoclonal Antibodies: Potential Applications To The Treatment Of Cancer, Semin, Oncol., 13(2) : 165-79 (1986)].

Te znane przeciwciała monoklonalne mogą wiązać się z różnorodnymi antygenami towarzyszącymi rakowi włącznie z glikoproteinami, glikolipidami i mucynami (patrz np. Fink i in.,

168 720 „Monoclonal Antibodies As Diagnostic Reagents for The Identification And Characterization Of Human Tumor Antigens“, Prog, Clin. Pathol., 9:121-33 (1984)]. Na przykład, przeciwciała monoklonalne wiążące się z antygenami glikoproteinowymi na specyficznych typach raków obejmują te onicone w patentow/wm 7ipHn Amrywlri trr 4.7777 570 ίηΓ7ΡΡηνπαΙα m/onnUnnalne na v|yik>unv »» |yuuvmv n j m >-ί,. ł^jv\*h· i m > / «> z » s »» » iiw nie-drobnokomórkowego raka płuc), opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 753 894 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka piersi), opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 579 827 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka żołądkowo-jelitowego) i opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4713 352 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka nerki). Przeciwciało monoklonalne B72.3, będące jednym z najbardziej badanych przeciwciał, rozpoznaje towarzyszący nowotworowi antygen mucynowy o masie cząsteczkowej wyższej niż 1000 kd, który jest specyficznie eksprymowany na licznych różnych rakach. Wykazano zatem, że B72.3 reaguje z 84% raków piersi, 94% raków okrężnicy, 100% raków jajnika i 96% nie-drobnokomórkowych raków płuc (patrz Johnston, „Applications of Monoclonal Antibodies In Clinical Cytology As Exemplified By Studies With Monoclonal Antibody B72.3“, Acta Cytol., 1(5):537-56 (1987) i opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 612 282 Schloma i in.]. Inne opatentowane przeciwciało monoklonalne, KC-4, [patrz opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4708930], rozpoznaje antygen białkowy o masie cząsteczkowej 400-500 kd eksprymowany na licznych rakach, takich jak rak okrężnicy, prostaty, płuc i piersi. Okazało się, że ani przeciwciało B72.3 ani przeciwciało KC-4 nie ulega internalizacji do komórek rakowych z którymi reagują.

Ujawniono przeciwciała monoklonalne reagujące z antygenami glikolipidowymi towarzyszącymi komórkom nowotworowym. Na przykład, Young i in., „Production Of Monoclonal Antibodies Specific For Two Distinct Steric Portions Of The Glycolipid Ganglio-N-Triosylceramide (Asialo GM2)“, J. Exp. Med., 150:1008-1019 (1979) ujawniają wytwarzanie dwóch przeciwciał monoklonalnych specyficznych wobec asialo GM2, glikosfingolipidowego antygenu powierzchni komórkowej, który jak ustalono, jest markerem komórek BALB/c V3T3 stransformowanych wirusem mięsaka mysiego Kirstein. Patrz także Kniep i in., „Gangliotriaosylceramide (Asialo GM2) A Glycossphingolipid Marker For Celi Lines Derived From Patients With Hodgkin's Disease“, J. Immunol., 131(3): 1591-94 (1983) i opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 507 391 (przeciwciało monoklonalne na ludzkiego czerniaka).

Inne przeciwciała monoklonalne reagujące z glikolipidowymi antygenami na komórkach rakowych obejmują te opisane przez Rosena i in., „Analysis Of Human Small Cell Lung Cancer Differentiation Antigens Using A Panel Of Rat Monoclonal Antibodies“, Cancer Reasearch, 44: 2052-61 (1984) (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc], Varki'ego i in., „Antigens Associated with a Human Lung Adenocarcinoma Defined by Monoclonal Antibodies“, Cancer Research 44:681-87 (1984); (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego gruczolakoraka płuc, żołądka i okrężnicy i czerniaka) i opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 579 827 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego gruczolakoraka okrężnicy). Patrz także Hellstrom i in., „Antitumor Effects Of L6, An IgG2a Antibody That Reacts With Most Human Carcinomas“, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7059-63 (1986), którzy opisują przeciwciało monoklonalne L6 rozpoznające węglowodanowy antygen eksprymowany na powierzchni ludzkiego nie-drobnokomórkowego raka płuc, raka piersi i raka okrężnicy.

Dodatkowe przeciwciała monoklonalne przejawiające wysoką, specyficzną reaktywność wobec większości komórek z szerokiego zakresu raków są bardzo potrzebne. Jest tak z powodu heterogenności antygenowej wielu raków, często wymagają, w diagnozie lub terapii, stosowania licznych różnych przeciwciał monoklonalnych na ten sam guz nowotworowy. Istnieje dalsze zapotrzebowanie, zwłaszcza w terapii, na tak zwane przeciwciała „Internalizowanc, tj. przeciwciała które są łatwo pobierane przez komórki nowotworowe, z którymi się wiążą. Przeciwciała tego typu znajdują zastosowanie w metodach terapeutycznych wykorzystujących koniugaty przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna, w których przeciwncwotworcwy czynnik terapeutyczny związany jest z przeciwciałem w celu dostarczenia do nowotworu, gdzie przeciwciało wiąże się z antygenem towarzyszącym nowotworowi, wobec którego jest ono reaktywne, i „uwalnia“ czynnik przeciwnowotworowy do wewnątrz komórek nowotworowych [patrz np. Embleton i in., „Antibody Targeting Of Anti-Cancer Agents“, w: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, str. 317-44 (Academic Press, 1985)]. Przeciwciała na antygeny towarzyszące nowotworowi, które nie są

168 720 zdolne do internalizacji do komórek nowotworowych, z którymi się wiążą, na ogół nie są użyteczne do przygotowywania koniugatów z lekami lub toksynami przeciwnowotworowymi, ponieważ mogłyby nie być zdolne do osiągnięcia swojego miejsca działania w komórce. Mogą być konieczne inne node>icorn akv możno byiłz-i irynA w z i rzecz^wwAiołn hiiiv pvwj0viu u-L/j mvŁ.nu <sjł\s jr v w iciupn rumv yiŁWin¹ oittltt.

Znanych jest kilka mogących ulegać internalizowaniu przeciwciał reagujących z antygenami limfocytów. W przeciwieństwie, przeciwciała takie są rzadkie kiedy traktuje się masywne nowotwory. Jednym z nielicznych przykładów mogącego ulegać internalizowaniu przeciwciała reagującego z rakami jest przeciwciało ujawnione w Domingo i in., „Transferrin Receptor As A Target For Antibody-Drug Conjugates“ Methods Enzymol. 11:238-47 (1985). Przeciwciało to reaguje z ludzką glikoproteiną będącą receptorem transferyny eksprymowaną na komórkach nowotworowych. Jednakże, ponieważ receptor transferyny eksprymowany jest także na wielu normalnych tkankach i często na wysokim poziomie, stosowanie przeciwciała skierowanego przeciwko receptorowi transferyny w koniugacie przeciwciało-lek przeciwciało-toksyna może wywierać znaczący wpływ toksyczny na normalne komórki. Wykorzystanie tego przeciwciała do specyficznego zabijania lub hamowania komórek nowotworowych jest dlatego sprawą sporną. Innym mogącym ulegać internalizowaniu przeciwciałem jest BR64 wiążące się z wieloma rakami.

Technika fuzji komórek dla wytwarzania przeciwciał monoklonalnych [Kohler i Milstein, Naturę (London) 256: 495 (1975)] pozwoliła rozwinąć liczne mysie przeciwciała monoklonalne reagujące z antygenami, włącznie z antygenami uprzednio nieznanymi. Mysie przeciwciała monoklonalne mogą jednakże zostać rozpoznane jako substancje obce i zneutralizowane przez ludzki układ immunologiczny, tak że ich możliwości w terapii u ludzi nie są realizowane. Dlatego też ostatnie wysiłki skupiają się na wytworzeniu tak zwanych przeciwciał „chimerycznych¹⁴ poprzez wprowadzenie DNA do komórek ssaków w celu otrzymania ekspresji genów immunoglobulin [Oi i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:825 (1983); Potter i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7161; Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6581 (1984); Sahagan i in., J. Immunol. 137:1066 (1986); Sun i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6581 (1984); Sahagan i in., J. Immunol. 137:1066 (1986); Sun i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214 (1987)].

Przeciwciała chimeryczne są cząsteczkami immunoglobulin zawierającymi część pochodzącą od ludzi i część pochodzenia nie-ludzkiego. Bardziej szczegółowo, region wiążący antygen (region zmienny) przeciwciała chimerycznego pochodzi ze źródła nie-ludzkiego (np. od myszy), a region stały przeciwciała chimerycznego, nadający immunoglobulinom biologiczną funkcję efektorową pochodzi ze źródła ludzkiego. Przeciwciało chimeryczne powiino mieć specyficzność -wiązania antygenu nie-ludzkiej cząsteczki przeciwciała, a funkcję efektorową nadaną przez ludzką cząsteczkę przeciwciała.

Na ogół procedury stosowane do wytwarzania przeciwciał chimerycznych obejmują następujące etapy:

a) identyfikowanie i klonowanie właściwego odcinka genu kodującego wiążącą antygen część cząsteczki przeciwciała; ten odcinek genu (znany jako BDJ, regiony zmienny, różnorodny i łączący dla ciężkich łańcuchów lub VJ, regiony zmienny, łączący dla lekkich łańcuchów lub po prostu jako v lub region zmienny) może być w formie albo cDNA, albo genomowej;

b) klonowanie odcinków genu kodującego region stały lub jego pożądaną część;

c) ligowanie regionu zmiennego z regionem stałym, tak że całkowite przeciwciało chimeryczne jest zakodowane w formie umożliwiającej transkrypcję i translację

d) ligowanie tej konstrukcji z wektorem zawierającym merker selekcyjny i regiony kontrolujące gen, takie jak promotory, sekwencje wzmacniające ekpresję i sygnały dołączania poli(A);

e) amplifikowanie tej konstrukcji w bakteriach;

f) wprowadzanie tego DNA do komórek eukariotycznych (transfekcja), najczęściej limfocytów ssaków;

g) selekcjonowanie komórek eksprymujących marker selekcyjny;

h) poszukiwanie komórek eksprymujących pożądane przeciwciało chimeryczne; i

k) testowanie przeciwciała pod kątem odpowiedniej specyficzności wiązania i funkcji efektorowych.

Zgodnie z tymi metodami manipulowano, w celu wytworzenia białek chimerycznych, przeciwciałami o kilku odrębnych specyficznościach wiązania antygenów [np. anty-TNP: Boulianne i

168 720 in., Nature 312:643 (1984); i anty-antygeny przeciwnowotworowe: Sahagani in., J. Immunol. 137: 1066 (1966)]. Podobnie, przez wiązanie nowych sekwencji z sekwencjami 'kodującymi region wiązania antygenu osiągnięto kilka różnych funkcji efektorowych. Niektóre z nich obejmują enzymy [Nleuberger i in., Nłature 312.604 (19o4)], sLaie regiony iimMunogiobuiin z innych gatunków i stałe regiony innego łańcucha immunoglobulinowego [Sharon i in., Nature 309: 364 (1984); Tan i in. J. Immunol. 135: 3565-3567 (1985)].

Odkrycie rekombinacji homologicznej w komórkach ssaków pozwoliło na skierowanie nowych sekwencji do specyficznych loci chromosomalnych. Rekombinacja homologiczna występuje gdy hodowanie komórek ssaków integrują egzogenny DNA z DNA chromosomalnym w miejscu chromosomu zawierającym sekwencje homologiczne do sekwencji plaumidowych [Folger i in., Mol. Cell. Biol. 2: 1372-1387 (1982); Folger i in., Symp. Quant. Biol. 49: 123-138 (1984); Kucherlapatiiin., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3153-3157 (1984); Lin i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1391-1395 (1985); do Saint Vincent i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2002-2006 (1983); Shaul i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA82: 3781-3784 (1985)]. Możliwość rekombinacji homologicznej w komórkach pozwała na modyfikację genów endogennych insitu. Znaleziono warunki w których sekwencje chromosomalne można modyfikować poprzez wprowadzanie do komórki plazmidowego DNA zawierającego odcinek DNA homologiczny do docelowego locus, i odcinek nowych sekwencji z pożądaną modyfikacją [Thomas i in., Cell 44: 419-428 (1986); Smithies i in., Nature 317: 230-234 (1985); Smith i in., Symp. Quant. Biol. 49: 171-181 (1984)]. Wynikiem rekombinacji homologicznej pomiędzy chromosomalnym DNA komórki ssaka i egzogennym DNA plazmidowym może być integracja plazmidu lub zastąpienie pewnych sekwencji homologicznymi sekwencjami plazmidowymi. Wynikiem tego może być umieszczenie pożądanej nowej sekwencji w ewentualnym locus docelowym.

Sposób rekombinacji homologicznej oceniono przy użyciu genów umożliwiających selekcję dominantów, takich jak NEO lub HPRT dla kilku typów komórek [Song i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6820-6824 (1987); Rubinitz i Subramani, Mol. Cell Biol. 6:1608-1614 (1986); i Liskay, Celi 35: 157-164 (1983)]. Ostatnio opisano procedury modyfikowania cząsteczek przeciwciał i wytwarzania cząsteczek przeciwciał chimerycznych przy użyciu rekombinancji homologicznej w celu ukierunkowanej modyfikacji genu [Fell i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8507-8511 (1989); i będące jednocześnie przedmiotem postępowania patentowego zgłoszenia patentowego St. Zjedn. Ameryki nr kolejny 243 873 złożone 14 września 1988 roku i nr kolejny 468 035 złożone 22 stycznia 1990 roku].

Najbardziej bezpośrednią drogą klinicznego stosowania przeciwnowotworowych przeciwciał monoklonalnych jest podawanie ich w formie niezmodyfikowanej, przy użyciu przeciwciał monoklonalnych przejawiających aktywność przeciwnowotworową in vitro lub w modelach zwierzęcych. Wydaje się, że większość przeciwciał , monoklonalnych na antygeny nowotworowe nie posiada żadnej aktywności przeciwnowotworowej, lecz znane są pewne przeciwciała monoklonalne, które pośredniczą w zależnej od dopełniacza cytotoksyczności (CDC), tj. zabijające ludzkie komórki nowotworowe w obecności ludzkiej surowicy jako źródła wypełniacza [patrz np. Hellstrom i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1499-1502 (1985)], lub zależnej od przeciwciała cytotoksyczności komórkowej (ADCC) wraz z komórkami efektorowymi, takimi jak ludzkie komórki NK lub makrofagi. W celu wykrycia aktywności ADCC lub CDC testuje się zdolność przeciwciał monoklonalnych do lizowania hodowanych, znakowanych ⁵¹ Cr nowotworowych komórek docelowych przez 4-godzinny okres inkubacji.

Komórki docelowe znakuje się 51 Cr i następnie eksponuje przez 4 godziny na połączenie komórek efektorowych (w formie limfocytów ludzkich oczyszczonych przez zastosowanie podłoża rozdzielającego limfocyty) i przeciwciała, które dodaje się w stężeniach pomięczy 0,1 μ g/ml. Jako dowód lizy komórek nowotworowych (cytotoksyczności) mierzy się uwalnianie 51 Cr z komórek docelowych. Kontrole obejmują inkubację samych komórek docelowych, lub z albo limfocytami albo przeciwciałem monoklonalnym oddzielnie. Mierzy się całkowitą ilość 5¹ Cr, który może zostać uwolniony i oblicza ADCC jako procent zabijania komórek docelowych obserwowany z przeciwciałem monoklonalnym plus komórki efektorowe w porównaniu z inkubowanymi samymi komórkami docelowymi. Procedura dla CDC identyczna jest do procedury stosowanej do wykrywania ADCC z tym wyjątkiem, że w miejsce komórek efektorowych dodaje się surowicę ludzką jako źródło dopełniacza (rozcieńczoną 1:3 do 1:6).

168 720

Terapeutyczne stosowanie przeciwciał monoklonalnych z aktywnością ADCC lub CDC rozważa się ponieważ często mają one aktywność przeciwnowotworową in vivo. Z drugiej strony, przeciwciała pozbawione in vitro aktywności ADCC i CDC, in vivo, o ile nie są zastosowane jako itpo7np nnonuiipiołn

HVV£jilV. /.VVI V1U1U monoklonalnego do aktywacji dopełniacza gospodarza może być korzystna terapeutycznie nie tylko dlatego, że komórki nowotworowe mogą zostać zabite, lecz także dlatego ponieważ może wzrosnąć dopływ krwi do nowotworu, ułatwiając zatem pobieranie leków [patrz Hellstrom i in., „Immunological Approaches to Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, and Anti-Idiotypes, w: Cocalently Modified Antigens and Antibodies in Diagnosis and Therapy, Quash and Rodwell, red. Marcel Dekker, str. 15-18 (1989)]. Wśród mysich przeciwciał monoklonalnych, najpowszechniej z ADCC i CDC związane są izotypy IgG2a i IgG3. Przeciwciała posiadające zarówno aktywność ADCC jak i CDC z wysoką specyficznością zabijają tylko komórki nowotworowe, z którymi się wiążą i jest nieprawdopodobne aby prowadziły do wpływów toksycznych, jeśli zwiążą się niespecyficznie w płucach, wątrobie lub innych organach. Może to zapewnić takim przeciwciałom przewagę nad przeciwciałami znakowanymi radioaktywnie lub pewnymi typami immunokoniugatów.

Jest zatem oczywiste, że przeciwciało, które przejawia wyższy stopień specyficzności wobec szerokiego zakresu raków, samo posiada aktywność przeciwnowotworową i zdolne jest do łatwego ulegania internalizacji przez komórki nowotworowe, może być bardzo korzystne w terapii nowotworów.

Internalizowane przeciwciała o wysokiej specyficzności wobec szeregu ludzkich raków, a bardziej szczegółowo, nowe przeciwciała oznaczone jako przeciwciała BR 96, są mysimi przeciwciałami monoklonalnymi i przeciwciałami chimerycznymi wiążącymi się z antygenem błony komórkowej, którego obecność stwierdzono na ludzkich komórkach rakowych. Przeciwciała są w wysokim stopniu reaktywne wobec komórek rakowych, takich jak otrzymane z raka piersi płuc, okrężnicy i jajnika, nie przejawiając, lub przejawiając ograniczoną aktywność z normalnymi komórkami ludzkimi lub innymi typami nowotworów, takimi jak chłoniaki lub mięsaki. Ponadto, przeciwciała te są internalizowane przez komórki rakowe, z którymi się wiążą i same zdolne są do zabijania komórek nowotworowych, tj. w formie nieskoniugowanej i bez komórek efektorowych lub dopełniacza. Przeciwciała BR 96 są zatem szczególnie użyteczne w zastosowaniach terapeutycznych, na przykład do reagowania z komórkami nowotworami, i w koniugatach jako specyficzny wobec celu nośnik różnych czynników posiadających wpływy przeciwnowotworowe, włącznie z lekami chemioterapeutycznymi, toksynami, modulatorami odpowiedzi immunologicznej, enzymami i izotopami radioaktywnymi. Przeciwciała można zatem stosując jako składnik różnych immunokoniugatów, włącznie z koniugatami przeciwciało-lek i przeciwciało-toksyna, gdzie szczególnie korzystna jest internalizacja koniugatu, a po znakowaniu izotopem radioaktywnym jego dostarczenie do nowotoworu. Przeciwciała BR 96 mogą także być korzystne terapeutycznie nawet w formie niezmodyfikowanej. Ponadto przeciwciała użyteczne są w przeznaczonych do wykrywania raka metodach diagnostycznych in vitro lub in vivo.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego bispecyficznego przeciwciała BR 96 wiążącego dwa różne antygeny, z których jeden wiązany jest również przez mysie przeciwciało monoklonalne BR(IgG 3) i przez ludzko-mysie chimeryczne przeciwciało monoklonalne Chi BR 96, polegający na tym, że prowadzi się fuzję dwu hybrydoma mających różne markery selekcyjne, z których jedna wydziela przeciwciało wykazujące tę samą co BR 96 lub Chi BR 96 specyficzność, a druga hybrydoma wydziela przeciwciało wykazujące inną specyficzność, prowadzi się hodowlę takiego hybrydu hybrydomalnego w obecność dwóch markerów selekcyjnych i wyselekcjonowane bispecyficzne przeciwciało oczyszcza się od innych możliwych kombinacji lekko i ciężko łańcuchowych.

Korzystnie wyselekcjonowuje się przeciwciało mające region wiążący antygen, wykazujący tę samą specyficzność co przeciwciało BR 96 lub przeciwciało ChiBR 96 i jednocześnie rozpoznający część epitopu zawierającego fukozę α 1-3 wariantu antygenu Le^y.

Wyniki wstępnych poszukiwań epitopów przeprowadzonych z przeciwciałem monoklonalnym wskazywały, że antygen na komórkach rakowych, z którym one się wiążą jest fukozylowaną odmianą antygenu Lewis Y. Antygen Lewis Y (Ley) został opisany przez Abe i in., J. Biol. Chem.

168 720

258: 8934 (1983); Lloyd i in., Immunogenetics 17:537 (1983); Brown i in.,Biosci. Rep. 3:163(1983); Hellstrom i in., Cancer Res. 46: 3917 (1986). Fukozylowany antygen Lewis Y został opisany przez Abe i in., Cancer Res. 46: 2639-2644 (1986).

B ispecy ινζ,ην i yf:

jiwciało monoklonalne BR 96 otrzymywane sposobem według wynalazku wytwarza się stosując dobrze znane techniki z wykorzystaniem hybrydom po raz pierwszy wprowadzone przez Kohlera i Milsteina [patrz, Kohler i Milstein, „Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Pre-Defined Specificity, Nature, 256: 495-97 (1975). Patrz także Brown i in., „Structural Characterisation Of Human Melanoma-Associated Antigen p97 with Monoclonal Antibodies, J. Immunol., 127 (2): 539-46 (1981); Brown i in., „Protein Antigens Of Normal And Malignant Human Cells Identified By Immunoprecipitation With Monoclonal Antibodies, J. Biol.Chem. 255: 4980-83 (1980); Yeh i in., „Cell Surface Antigens Of Human Identified By Monoclonal Antibody, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 (6): 297-31 (1979); i Yeh i in., „A Cell-Surface Antigen Which is Present In the Ganglioside Fraction And Shared By Human Melanoma, Int. J. Cancer. 29: 269-75 (1982)].

Techniki te obejmują iniekcję immunogenu (np. komórek lub ekstraktów komórkowych niosących antygen lub oczyszczonego antygenu) zwierzęciu (np. myszy), tak aby u zwierzęcia tego wywołać pożądaną odpowiedź immunologiczną (tj. przeciwciała). Po odpowiednim czasie otrzymuje się ze zwierzęcia limfocyty wytwarzające przeciwciała, albo ze śledziony, węzłów chłonnych albo z krwi obwodowej. Korzystnie, limfocyty otrzymuje się ze śledziony. Limfocyty pochodzące ze śledziony poddaje się następnie fuzji z linią komórek szpiczaka, zazwyczaj w obecności czynnika indukcyjnego fuzję, takiego jak glikol polietylenowy (PEG). Zgodnie ze standardowymi technikami, do fuzji zastosować można każdą z licznych linii komórek szpiczaka, na przykład linie szpiczaka P3-NS1/1Ag4-1, P3-x63-Ag8 lub Sp2/0 Agl4. Linie te dostępne są w American Type Culture Collection, („ATCC) w Rockville, Maryland.

Otrzymane komórki, obejmujące pożądane hybrydomy, hoduje się następnie na podłożu selekcyjnym, takim jak podłoże HAT, w którym niesfuzjowane rodzicielskie komórki szpiczaka lub ewentualnie limfocyty zamierają. Przeżywają tylko komórki hybrydomy, i można je hodować w warunkach ograniczających dla otrzymania wyizolowanych klonów:· Supernatanty hybrydom testuje się na obecność przeciwciał o pożądanej specyficzności np. technikami· oznaczeń immunologicznych stosując antygen, który został użyty do immunizacji. Klony dodatnie można następnie subklonować w warunkach ograniczających i izolować można wytwarzane przeciwciała monoklonalne. Hybrydomy wytworzone według tych metod można namnażać in· vitro i in vivo (w płynie puchlinowym z jamy otrzewnowej) stosując znane techniki [patrz Fink i in.; •supra str, 123, Fig.

6-11]. Powszechnie stosowane metody oczyszczania przeciwciał monoklonalhych obejmują wytrącanie siarczanem amonu, chromatografię jonowymienną i chromatografię powinowactwa [patrz np. Zola i in., „Techniques For The Production AndCharacterization Of Monoclonal Hybridoma Antibodies, w: Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques And Applications, Hurell (red.), str. 51-52 (CRC Press 1982)]. ’ '

Przeciwciało monoklonalne oznaczone BR 96, wytworzono poprzez opisane tu poniżej techniki z wykorzystaniem hybrydom stosując jako immunogen linię komórkową raka piersi 3396. Hybrydomę BR 96, przygotowaną jak opisano tu poniżej i wytwarzającą przeciwciało BR 96, zdeponowano 22 lutego 1989 w ATCC, gdzie jest w następujący sposób identyfikowana: BR 96 ATCC nr identyfikacyjny, HB 10036.

Przeciwciało BR 96 należy do podklasy IgG3. Przeciwciało przejawia wysoką specyficzność wobec komórek raka różnych typów organów, na przykład nowotworów piersi, płuc, okrężnicy i jajnika, jak również hodowanych linii komórkowych założonych z różnych raków piersi, płuc i okrężnicy. Ponadto przeciwciało BR 96 nie przejawia wiązania· z'innymi typami komórek nowotworowych, takich jak linie komórkowe komórek T chłoniaka, CEM ' i MOLT-4, linia komórkowa komórek B chłoniaka P3HR-1 i linie komórkowe czerniaka. Przeciwciało BR 96 może być internalizowane przez antygenododatnie komórki nowotworowe, jest toksyczne' wobec antygenododatnich komórek nowotworowych, pośredniczy w aktywności ADCC i CDC i, co zaskakujące, samo tj. w formie niezmodyfikowanej, jest cytotoksyczne. Przeciwciała BR 96 wydają się rozpoznawać antygen Le^y. ' '

168 720

Chimeryczne (mysie/ludzkie) pzeciwciało wytworzono stosując dwuetapową procedurę rekombinacji homologicznej opisaną przez Fella i in., w Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86; 8507-8511 (1989). Ta dwuetapowa metoda obejmuje użycie docelowego wektora kodującego ludzki ciężki łańcuch IgGgammał do transfckowania mysiej łiniΐ komórkowej hybrydotny eksprymującej mysie przeciwciało monoklonalne BR 96 (hybrydoma ATCC nr HB 10036) w celu wytworzenia hybrydomy eksprymującej chimerycznie przeciwciało BR 96 zawierające ludzki ciężki łańcuch IgGgammal. Hybrydomę tę transfekuje się następnie wektorem docelowym zawierającym DNA kodujący ludzki lekki łańcuch kappa (K) w celu wytworzenia hybrydomy mysiej eksprymującej przeciwciało chimeryczne BR 96 zawierające ludzki ciężki łańcuch IgGgammal i ludzki lekki łańcuch K. Wektorami docelowymi użytymi do transfekcji hybrydom są wektor pHgammalHCDD 4 strawiony enzymem Xba1 (Oncogen, Seattle, WA) i wektor pSV 2gpt/CK strawiony HindIII (Oncogen, Seattle, WA).

Chimeryczną hybrydomę BR 96, określaną tu jako ChiBR96, przygotowaną jak opisano tu poniżej i wytwarzająca chimeryczne ludzkie/mysie przeciwciało BR 96, zdeponowano 23 maja 1990 w ATCC, gdzie jest w następujący sposób identyfikowana: ChiBR 96 ATCC nr identyfikacyjny: HB .10460.

Po zidentyfikowaniu hybrydomy eksprymującej chimeryczne przeciwciało, prowadzi się jej hodowlę i izoluje się pożądane cząsteczki chimeryczne z supernatantu hodowli komórkowej stosując dobrze znane techniki izolowania przeciwciał monoklonalnych.

Używany tutaj termin „przeciwciało BR 96“ obejmuje całe, nienaruszone przeciwciała poliklonalne i monoklonalne, takie jak mysie przeciwciało monoklonalne wytwarzane przez hybrydomę ATCC nr HB 10036, i cząsteczki przeciwciał chimerycznych, takich jak przeciwciało chimeryczne BR 96 wytwarzane przez hybrydomę ATCC nr 10460. Opisane powyżej przeciwciało BR 96 obejmuje wszystkie jego fragmenty zawierające aktywny region wiązania antygenu przeciwciała, takie jak fragmenty Fab, F(ab ')2 i Fv, stosując dobrze znane techniki [patrz np. Rouseaux i in., „Optimal Conditions For The Preparation of Proteolytic Fragments From Monoclonal IgG of Different Rat IgG Subclasses“, w: Methods Enzymol., 121: 663-69 (Academic Press 1986)].

Przeciwciało BR 96 nie przejawia żadnego immunohistologicznie wykrywalnego wiązania z normalnymi tkankami ludzkimi z głównych organów, takich jak nerki, śledziona, wątroba, skóra, płuca, piersi, okrężnica, mózg, tarczyca, serca, węzły chłonne lub jajniki. Przeciwciało nie wiąże się także z leukocytami krwi obwodowej. Przeciwciało BR 96 przejawia ograniczone wiązanie z pewnymi komórkami w migdałkach i jądrach, i wiąże się z komórkami groniastymi w trzustce oraz z komórkami nabłonkowymi w żołądku i przełyku. A zatem, przeciwciało BR 96 przewyższa najbardziej znane przeciwciała przeciwnowotworowe wysokim stopniem specyficzności wobec komórek nowotworowych w porównaniu z komórkami normalnymi [patrz np. Hellstrom i in., „Immunological Approaches To Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, And Antibodies In Diagnosis And Therapy, Quash/Rodwell (red.), str. 1-39 (Marcell Dekker, Inc., 1989) i Bagshawe, „Tumour Markers - Where Do We Go From Here“, Br. J. Cancer, 48: 167-75 (1983)]. ... . .

Techniki immunohistochemiczne obejmują barwienie próbek biologicznych, takich jak próbki tkanki, przeciwciałem BR 96 według wynalazku, a następnie wykrywanie na próbce obecności przeciwciała skompleksowanego z jego antygenem. Tworzenie takich kompleksów przeciwciało-antygen z próbką wskazuje na obecność w tkance komórek rakowych. Wykrywanie przeciwciała na próbce przeprowadzać można stosując znane techniki, takich jak techniki immunoenzymatyczne, np. technikę barwienia immunoperoksydazą lub technikę awidyna-biotyna (ABC), lub techniki immunofluorescencyjne [patrz np. Ciocea i in., „Immunohistochemical Techniques Using Monoclonal Antibodies“, Meth. Enzymol. 121: 162-79 (1986); Hellstrom i in., „Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma“, Cancer Research, 46: 3917-23 (1986); i Kimball (red.), Introduction To Immunology (wyd. II), str. 113-117 (Macmillan Pub. Co. 1986)]. Barwienie immunoperoksydazą zastosowano na przykład, jak opisano w przykładzie II infra, do wykazania reaktywności przeciwciała BR 96 z rakami płuc,· piersi, okrężnicy i jajnika, i niskiej reaktywności przeciwciała z próbkami normalnych tkanek ludzkich.

Serologiczne techniki diagnostyczne obejmują wykrywanie i określanie ilościowe antygenów towarzyszących nowotworom, które uległy sekrecji lub zostały „zrzucone“ do surowicy lub innych

168 720 płynów biologicznych pacjentów cierpiących na raka. Antygeny takie można wykryć w płynach ciała stosując znane techniki, takie jak oznaczenia radioimmunologiczne (RIA) lub ELISA, w których przeciwciało reagujące ze „zrzuconym antygenem stosowane jest do wykrywania obecnrsćoł on+MnoriM -τάΙιτλ-ι-ι Γτ«\<-»♦--r-i-r TTr\ti1n i ności antygenu w pióuce piynu [ putiz np. uotila i in.

, 1 WU-Dllt oaiiuwi nal Antibodies To Human AFP“, J. Immunol. Methods, 42: 11 (1981) i Allum i in., supra na str. 48-51]. Oznaczeń tych, stosując ujawnione przeciwciała BR 96, można dlatego użyć do wykrywania w płynach biologicznych glikolipidowych antygenów reagujących z przeciwciałami BR 96, a zatem wykrywania ludzkiego raka u pacjentów. A zatem jak wynika z powyższych danych, przeciwciała BR 96 stosować można w większości oznaczeń obejmujących reakcje antygen-przeciwciało. Oznaczenia te obejmują, ale nie są ograniczone do standardowych technik RIA, zarówno na płynnej jak i stałej fazie, jak również oznaczeń ELISA, technik immunofluorescencyjnych i innych oznaczeń immunocytochemicznych [patrz np. Sikora i in., (red.), Monoclonal Antibodies, str. 32-52 (Blackwell Scientific Publications 1984)].

Zestawy diagnostyczne do oznaczeń opisanych powyżej zawierają przeciwciało monoklonalne BR 96, jego fragmenty, fuzje białek lub przeciwciało chimeryczne według wynalazku, i koniugat zawierający czynnik specyficznie wiążący przeciwciało i znacznik zdolny do wytwarzania wykrywalnego sygnału. Odczynniki mogą także zawierać czynniki pomocnicze, takie jak czynniki buforujące i czynniki stabilizujące białka (np. polisacharydy). Zestawy diagnostyczne mogą dalej zawierać, tam gdzie jest to konieczne, inne składniki układu wywoływania sygnału włącznie z czynnikami obniżającymi interferencję z tłem, odczynnikami kontrolnymi lub aparatem bądź pojemnikiem do przeprowadzania testu. Innego rodzaju zestaw diagnostyczny zawierać może koniugat przeciwciał i znacznik zdolny do wytwarzania wykrywalnego sygnału. Czynniki pomocnicze, jak wspomniane powyżej także mogą być obecne.

Przeciwciało BR 96 skoniugować można z drugim przeciwciałem tworząc heterokoniugat przeciwciał do traktowania komórek nowotworowych, jak opisał Segal w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4676980.

Ponadto, jak opisano wcześniej, w celach terapeutycznych stosować można chimeryczne lub inne rekombinowane przeciwciała BR 96, takie jak bispecyficzne przeciwciało BR 96 otrzymywane sposobem według wynalazku. Na przykład fuzje białka zawierające przynajmniej region wiążący antygen przeciwciała połączony z co najmniej aktywną funkcjonalnie częścią drugiego białka posiadającego aktywność przeciwnowotworową, np. limfokiną lub onkostatyną, zastosować można do leczenia ludzkiego raka in vivo. Znane techniki rekombinacji zastosować można do konstruowania bispecyficznych przeciwciał BR 96 otrzymywanych sposobem według wynalazku gdzie jedna specyficzność wiązania przeciwciała jest specyficznością BR 96 [patrz np. opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4474893].

Również przeciwciała antyidiotypowe do przeciwciała BR 96 można zastosować terapeutycznie w aktywnej immunizacji przeciwnowotworowej i terapii nowotworów [patrz np. Hellstrom i in., „Immunological Approaches To Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, And Anti-Idiotypes“, w: Cocalently Modified Antigens And Antibodies In Diagnosis And Therapy, supra, str. 35-41],

Dlatego też jest oczywiste, że bispecyficzne przeciwciało BR 96 ma zastosowanie do sporządzania kompozycji farmaceutycznych użytecznych do leczenia ludzkich raków. Przykładem są kompozycje farmaceutyczne do stosowania w leczeniu ludzkich raków zawierające skuteczną farmaceutycznie ilość przeciwciała BR 96 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Kompozycje mogą dodatkowo zawierać inne przeciwciała lub koniugaty do leczenia raka (np. mieszaninę przeciwciał).

Kompozycje przeciwciał można podawać używając konwencjonalnych sposobów podawania obejmujących, lecz nie ograniczonych do dożylnego, dootrzewnowego, doustnego, śródchłonnego lub bezpośrednie podawanie do nowotworu. Korzystne jest podawanie dożylne.

Kompozycje przeciwciał mogą mieć różne formy dawkowania obejmujące, lecz nie ograniczone do ciekłych roztworów lub zawiesin, tabletek, pigułek, proszków, czopków, polimerycznych mikrokapsułek lub mikrovehiculum, liposomów i roztworów iniekcyjnych lub infuzyjnych. Korzystna forma zależy od sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego.

168 720

Kompozycje przeciwciał zawierają także konwencjonalne, farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i znane adjuwanty, takie jak albumina surowicy ludzkiej, wymieniacze jonowe, alumina, tlenek glinu, lecytyna, substancje buforowe, takie jak fosforany, glicyna, kwas sorbiowy, sorbinian nAfacu i cole 1uK elektrolity takie iak ciarmran -nrotammy

M ^x M w ł w vivłv n w a A w u* «λ a womM-·.» λ w j ·

Najbardziej skuteczny sposób podawania i dawkowania dla danej kompozycji zależy od przebiegu i zaawansowania choroby, zdrowia pacjenta i odpowiedzi na leczenie i orzeczenia leczącego lekarza. Przeto, dawkowanie kompozycji powinno być określane dla pojedynczego pacjenta. Niemniej jednak, skuteczna dawka kompozycji przeciwciał może pozostawać w zakresie od około 1 do około 2000 mg/m^?.

W celu umożliwienia pełniejszego zrozumienia opisanego tu wynalazku, poniżej przedstawia się następujące przykłady, zilustrowane na rysunkach (fig. 1-8). Fig. 1 jest digramem wektora phgamma1HC-D używanego w procedurze elektroporacji opisanej w przykładzie II. Fig. 2 jest diagramem wektora pSV 2gpt/Ck używanego w procedurze elektroporacji opisanej w przykładzie II. Figura 3 jest wykresem przedstawiającym wyniki testu współzawodnictwa wiązania porównującym wiązanie mysiego przeciwciała monoklonalnego BR 96 z wiązaniem chimerycznego przeciwciała BR 96 opisanej w przykładzie II. Fig. 4 przedstawia wyniki analizy FACS cytotoksyczności przeciwciał wobec komórek raka piersi 3396 opisanej w przykładzie III. Fig. 5 przedstawia wyniki analizy FACS cytotoksyczności przeciwciał wobec komórek ludzkiego gruczolakoraka płuc 2987 opisanej w przykładzie III. Fig. 6 przedstawia wyniki analizy FACS cytotoksyczności przeciwciał wobec komórek MCF-7 opisanej w przykładzie III. Fig. 7 przedstawia procent hamowania włączania tymidyny do DNA komórek raka piersi 3396 traktowanych mysią immunotoksyną BR 96-RA i chimeryczną (Chi)BR 96-RA przy różnych stężeniach opisany w przykładzie III. Fig. 8 przedstawia procent hamowania włączania tymidyny do DNA komórek raka piersi 3630 traktowanych mysią immunotoksyczną BR 96-RA i chimeryczną ChiBR 96-RA przy różnych stężeniach opisany w przykładzie III.

Przykład I. Wytwarzanie monoklonalnego przeciwciała BR 96.

Monoklonalne przeciwciało BR 96 wtywarza się stosując technikę fuzji hybrydomowej, opisaną wcześniej 'przez M. Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) supra i Yeh et al., Int. J. Cencer (1982) supra. W skrócie, trzymiesięczne myszy BALB/c uodporniano, stosując jako immunogen ekspantowane komórki hodowli gruczolakoraka piersi ludzkich, oznaczanego 3396 lub M 3396 (z gruczolakoraka piersi pochodzącego od pacjenta, hodowane w hodowli Oncogen, Leattle, Washington, St. Zjedn. Am.). Mysz otrzymała iniekcje w pięciu dawkach, przy czym jako pierwsze cztery dawki, mysz otrzymywała jedną iniekcję dootrzewnowo i 1 iniekcję podskórną w czterech miejscach na ciele. Jako piątą dawkę mysz otrzymywała tylko jedną iniekcję dootrzewnowo. Łącznie jako każdą dawkę wstrzykiwano około 10⁷ komórek. W trzy dni po ostatnim szczepieniu usuwano myszy śledzionę i komórki śledziony zawieszano w pożywce hodowlanej RPMI. Następnie komórki śledziony poddawano fuzji z komórkami szpiczaka myszy P3-X63-Ag 8.653 w obecności glikolu polietylenowego (PEG) i pozwalano na wzrost komórek we wgłębieniach płytki do mikromiareczkowania w selektywnej pożywce MAT, jak opisano w publikacji Yeh et al., supra [patrz Kohler and Milstein, Naturę, 256: 495 - 97 (1975) i Eur. J. Immunol., 6 : 511 - 19 (1976)]. Mieszaninę zaszczepiono tak, aby utworzyć hodowle o małej gęstości, pochodzące od pojedynczych komórek lub klonów powstałych w wyniku fuzji.

Supernatanty z tych hodowli hybrydomowych poddawano następnie skriningowi, aby określić bezpośrednio aktywność wiązania z linią komórkową raka piersi, 3396, i z linią komórkową fibroblastów uzyskaną na drodze biopsji skóry za pomocą próby ELISA, podobnej do opisanej w publikacji Donillard et al., „Enzyme-Linked Immunosorbent Assay For Sereening Monoclonal Antibody Production Using Enzyme - Labeled Second Antibody“, Meth. Enzymol., 92 : 168 - 74 (1983).

Zgodnie z tą próbą, antygen (z którym poddano skriningowi przeciwciało dla określenia jego reaktywności) unieruchomiono na płytkach do mikromiareczkowania i następnie inkubowano z supernatantami hybrydomowymi. Jeśli supernatant zawierał pożądane przeciwciało, było one wiązane z unieruchomionym antygenem i wykrywane przez dodanie konjugatu antyimmunoglobuliny z enzymem i podłoża przeciwciała enzymu, co prowadziło do dających się zmierzyć zmian gęstości optycznej. Podczas prowadzonych badań, komórki raka piersi lub kontrolne komórki

168 720 fibroblastów umieszczono na płytce do hodowli tkankowej z 96 wgłębieniami (Costar Cambrige, MA) i inkubowano przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C (5% CO 2). Komórki doprowadzono następnie do końcowego stężenia we wgłębieniu wynoszącego 0,5% za pomocą

100μΐ świeżo przyrządzonego 1% aldehydu glutarowego i inkubowano w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym przemyto trzykrotnie 1 X roztworem solanki buforowanej fosforanem (PBS). Następnie komórki blokowano w ciągu 30 minut 5% białkiem surowicy bydlęcej (BSA) w PBS i ponownie przemyto trzykrotnie PBS.

Następnie dodano supernatanty z hodowli hybrydomowych w ilości DO pl/wgłębienie, zawartość wgłębień inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej i komórki przemyto trzykrotnie PBS. Następnie dodano kozią antymysią peroksydazę chrzanową (Zymed, CA) rozcieńczoną w 0,1% BSA i PBS do stężenia 100 ul/w^głębienie. Mieszaninę reakcyjną inkubowano albo w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej albo w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C, po czym komórki przemyto trzykrotnie PBS. Następnie dodano o-fenylenodwuaminę (OPD) w ilości 100 ul/wgłębienie i płytki inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej w ciągu 5-45 minut. Przeciwciała związane z komórkami wykrywano poprzez zmianę barwy we wgłębieniach, występującą w ciągu 1-10 minut. Reakcję przerwano dodatkiem 100 μΐ H2SO4/wgłębienie i dokonano odczytu absorbancji na automatycznym urządzeniu odczytującym Dynatech (Alexandria VA) Microelisa przy 490 nm.

Należy zauważyć, że próbę tę można przeprowadzić stosując nienaruszone komórki lub oczyszczone rozpuszczalne ekstrakty antygenowe lub komórkowe w postaci unieruchomionego antygenu. Gdy jako antygen stosowano rozpuszczalny antygen lub ekstrakty komórkowe, antygen umieszczono początkowo na płytkach w ilości 50 |ul/wgłębienie w PBS i płytki przed rozpoczęciem próby inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Gdy jako antygen stosuje się nienaruszone komórki, można je stosować świeże lub po unieruchomieniu. W każdym przypadku komórki umieszczano najpierw na płytkach w ilości 10⁴ komórek w 50 ul/wgłębienie w pożywce hodowlanej i inkubowano przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C (3% CO 2).

W ten sposób wyselekcjonowano hybrydomy wytwarzające przeciwciała wiązane przez linię komórkową raka piersi, a nie przez komórki ludzkich fibroblastów i badano je w urządzeniu do sortowania komórek FACS na leukocytach krwi obwodowej. (PB1s), jak opisano w przykładzie II. Hybrydomy ujemne wobec PB1s klonowano, ekspandowano in vitro i badano dalej pod kątem specyficzności przeciwciał. Hybrydomy wytwarzające przeciwciała reagujące z rakiem piersi ludzkiej ponownie klonowano, ekspandowano i wstrzykiwano pierwotnie uczulonym trzymiesięcznym myszom BALB/c, gdzie wzrastały powodując wodobrzusze.

Postępując w opisany wyżej sposób, uzyskano hybrydomy linii komórkowej BR 96, klonowane i wstrzykiwane myszom w celu rozwinięcia się nowotworu powodujące wodobrzusze. Jak ujawniono poprzednio, hybrydomy BR 96 zdeponowano w kolekcji ATCC. Monoklonalne przeciwciała BR 96 oczyszczano z płynów wodobrzusza za pomocą chromatografii powinowactwa na unieruchomionym rekombinantowym białku A (Repligen, Cambridge, MA). Sklarowane płyny rozcieńczono równą objętością buforu wiążącego (1m fosforan potasowy, pH 8) i nanoszono na kolumnę z białkiem A, poprzednio zrównoważonym buforem wiążącym. Kolumnę obficie przemyto buforem wiążącym i następnie eluowano przeciwciało 50 milimolowym roztworem kwasu fosforowego, pH 3. Oczyszczoną frakcję zawierającą przeciwciało zabojętniono 1m roztworem Tris, pH 9, i następnie dializowano wobec roztworu soli buforowanego fosforanem. Oczyszczone BR 96 odsączono wreszcie w warunkach jałowości i przechowywano w stanie schłodzonym lub zamrożonym.

Przykład II. Otrzymywanie i charakterystyka chimerycznego przeciwciała BR 96 (ChiBR

96).

Mysie/ludzkie przeciwciało chimeryczne BR 96 („ChiBR 96“) wytwarza się stosując dwuetapowy protokół rekombinancji homologicznej jak opisali Fell i in., w Proc. Natl. Acad. Sci., 86,8507 - 8511 (1989).

Transfekcja DNA ludzkiego łańcucha ciężkiego.

Mysią linię komórek hybrydoma BR'96, ATCC na HB10036 poddaje się transfekcji (8 · 10⁶ komórek) h γ¹ (HC-D) zdeponowano w Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, NRRL No. 18599) (fig. 1) za pomocą elektroporacji (Gene Pulser; Biorad Laboratories, Richmond, CA) przy 250 V, przy ustawieniu kapacytancji 960|uFd, w izotonicznym buforo12

168 720 wanym fosforanami roztworze soli (PBS) i z oczyszczonym fragmentem restrykcyjnym XbaI o 6,2 kilozasady (30pl/ml) wektora h /iHC-D. Po upływie 48 godzin komórki osadza się w 96dołkowych płytkach przy 10⁴ komórek/dołek. Selekcję pod względem Neo^R prowadzi się w podłożu

IMDM (GIBCO,

7n ιι;ι orn i o /ιλXI X J Z_CX W 1V1 CłJ CjV j 111

10% obj/obj płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i antybiotyczny aminoglikozyd G418 (GIBCO) w stężeniu 2,0 mg/ml.

Wykrywanie wydzielonego przeciwciała stanowiącego ludzką IgG (Hu γ 1) za pomocą ELISA.

Supernatanty hodowli poddaje się screeningowi stosując kanapkowy test ELISA po upływie dwóch tygodni od transfekcji. Jako przeciwciało wychwytujące stosuje się kozie przeciwciało przeciw ludzkiej IgG, Fc-swoiste (CALTAG, San Francisco, CA) i jako przeciwciało do wykrycia związanej ludzkiej IgG stosuje się kozie przeciwciało α-ludzka IgG, Fe-swoiste, sprzężone z peroksydazą z chrzanu HRPO (CALTAG). Komórki z dołów HuIgG pozytywnych subklonuje się za pomocą rozcieńczenia i rozcieńczeniowe klony poddaje screeningowi za pomocą ELISA w celu wykrycia ludzkiej IgG γ i uprzednio opisaną metodą. Klony zawierające ludzką IgG γ 1 poddaje się też screeningowi za pomocą ELISA w celu wykrycia mysiego łańcucha ciężkiego IgG 3. Koziego przeciwciała przeciw mysiej IgG 3 (Southern Biotechnology Assoc., Inc., Birmingham, AL) używa się też jako wychwytującego przeciwciała, a kozie przeciwciało przeciwmysie sprzężone z HRPO (Southern Biotechnology Assoc., Inc) jest przeciwciałem zastosowanym do wykrycia mysiej IgG 3.

Wybiera się jeden z klonów pozytywnych wobec ludzkiej IgG γ i i negatywnych wobec mysiej IgG3 (Hu γ¹⁺, MuG3-). Otrzymuje on oznaczenie ChiHBR 96. Tę linię komórek hybrydoma chimerycznego pod względem łańcucha ciężkiego charakteryzuje się pod względem swoistości antygenowej na komórkach MCF-7 i co do poziomu ekspresji za pomocą ilościowego testu ELISA pod względem ekspresji ludzkiej IgG na komórkach MCF7. Linia komórek ChiHBR 96 przeprowadza ekspresję około 20 Mg/ml przeciwciała stanowiącego antygenowo swoistą ludzką IgG.

Transfekcja DNA łańcucha lekkiego.

Hybrydoma ChiHBR 96 (8 · 10⁶ komórek) poddaje się transfekcji za pomocą elektroporacji, jak opisano powyżej, ale stosując (30 Mg/ml) ludzki wektor rekombinantowy łańcucha lekkiego pSV 2gpt/CK (NRRL No.B 18507) zawierający sekwencję łańcucha lekkiego K immunologlobuliny ludzkiej przedstawioną na fig. 2, przeprowadzony w postać liniową z użyciem HindIII. Po upływie 48 godzin komórki osadza się w 96-dołkowych płytkach przy 104 komórek/dołek. Selekcję pod względem gpt prowadzi się w podłożu IMDM zawierającym 10% obj/obj FBS, hipoksantynę w stężeniu 15 Mg/ml, ksantynę w stężeniu 250Mg/ml i kwas mikofenolowy (MA) w stężeniu 2,25 Mg/ml.

Wykrywanie wydzielonego przeciwciała ludzkiego kappa (Hu K) za pomocą ELISA.

Supernatanty hodowli poddaje się screeningowi z zastosowaniem kanapkowego testu ELISA, jak opisano powyżej, po upływie dwóch tygodni od transfekcji. Wychwytującym przeciwciałem jest kozie przeciwciało α-ludzkie K (CALTAG), a przeciwciałem stosowanym do wykrycia związanego ludzkiego K jest kozie HPRO-przeciwciało przeciw ludzkiemu K (CALTAG). Dołki zawierające ludzkie przeciwciało K subklonuje się za pomocą rozcieńczenia i poddaje screeningowi za pomocą ELISA w celu wykrycia ludzkiego lub mysiego łańcucha K. Koziego przeciwciała przeciw mysiemu K (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) używa się jako przeciwciała wychwytującego i koziego przeciwciała przeciw mysiemu K sprzężonego z HRPO (Fisher Scientific) używa się jako przeciwciała do wykrycia obecności mysiego łańcucha K. Jeden z klonów pozytywnych wobec ludzkiego K, negatywnych wobec mysiego K, wybiera się do analizowania swoistości antygenowej na komórkach MCF-7 i co do poziomu ekspresji za pomocą ilościowego testu ELISA pod względem ekspresji ludzkiej IgG na komórkach MCF-7. Wybrano linię komórek swoistą wobec komórek MCF-7 i HuIgG+, MuIgG3, Huk+, MuK^_. Otrzymuje ona oznaczenie chimeryczne BR 96 (ChiBR 96).

Wyjściowa ekspresja ciężkiego i lekkiego łańcucha chimerycznego przeciwciała antygenowo swoistego BR 96 (Chi-BR 96) wynosi około 25 Mg/ml. W wyniku zastosowania czterech kolejnych nawrotów klonowania linii w miękkiej agarozie z nawarstwieniem króliczym przeciwciałem aHuIgG w celu wykrycia komórek wydzielających największą ilość chimerycznego przeciwciała [Coffino i in., J. Cell. Physiol., 89,429-440 (1972)]otrzymujesię linię komórek hybrydoma (ChiBR

168 720

96) wydzielającą około 130 ug/ml chimerycznego przeciwciała. Hybrydoma ChiBR 96 zdeponowano w ATCC 23 maja 1990 pod numerem depozytowym ATCC No. HP 10460.

Wiązanie ChiBR 96.

nriwinriwortwn oło GA i mvi ’ ’ Ił H1V »ł Π Ł.VVX Tł Viuau .✓ V» X LUJ \

1V£V pi nowotworowego na komórkach MCF-7 oznacza się za pomocą testu kompetycyjnego wiązania ELISA [Hellstrom i in., Cancer Res., 50, 2449 - 2454 (1990)]. Mówiąc krótko, przylegającą linię komórek MCF-7 obarczoną antygenem nanosi się na 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania przy 3 · 10⁴ komórek/dołek i pozwala na wzrost do zlewania się w ciągu około 3-4 dni. Podłoże wzrostowe odrzuca się i komórki utrwala 0,5% aldehydem glutarowym w PBS (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) przy 100 /U/dołek w ciągu 30 minut. Odrzuca się aldehyd glutarowy i płytkę przemywa łagodnie PBS trzy razy. Następnie zablokowuje się płytkę buforem wiążącym (0,1% BSA w DNEM) przy 200 pl/dołek w ciągu godziny, albo przechowuje przez nieokreślony okres czasu w temperaturze -20°C. Bufor wiążący odrzuca się i do dołków dodaje się próbki i standardy. Płytki przykrywa się i inkubuje przez noc w temperaturze 4°C. Próbki i standardy odrzuca się i płytki przemywa PBS trzy razy. Do dołków dodaje się koniugat HRP rozcieńczony 1% surowicą końską w PBS, 100 jul/dołek i inkubuje w ciągu godziny w temperaturze 37°C. ELISA prowadzi się z chromagenem 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyną (TMB) (Genetic Systems. Seattle, WA) w buforze cytrynianowym. Rozwijanie się zabarwienia zatrzymuje się 3N H2SO4 i płytkę odczytuje na czytniku Tetertek Microplate przy 450 nm. W tym badaniu ustala się, w jakim rozmiarze biotynylowane przeciwciało ChiBR 96 (0,3 jug/ml) oddziaływuje kompetycyjnie albo z nieznakowanym ChiBR 96 albo ze znakowanym mysim przeciwciałem monoklonalnym BR 96 wobec antygenu. Związane biotynylowane przeciwciało ChiBR 96 wykrywa się z użyciem kompleksu awidynaHRPO i oznacza standardowymi odczynnikami ELISA.

Jak to przedstawiono na fig. 3, zachodzenie na siebie 2 krzywych wiązania wskazuje na to, że dwa przeciwciała mają tę samą swoistość i względne powinowactwo do antygenu nowotworowego.

Przykład III. Charakterystyka przeciwciała ChiBR 96 i fragmentów F(ab ')2 BR 96.

Cytotoksyczność nie zmodyfikowanego ChiBR 96 i fragmentów F(ab ')2 BR 96.

Na żywe komórki, w zawiesinie, z antygenowo pozytywnych pod względem BR 96 linii carcinoma 3396, 2987 i MCF-7, działa się ChiBR 96 i fragmentami F(ab')2, w celu określenia cytotoksyczności tych przeciwciał w porównaniu z monoklonalnym przeciwciałem BR 96. Testy cytotoksyczności wykonuje się w badaniu FACS. Wyniki tych eksperymentów przedstawione są na fig. 4, 5 i 6 jako procentowe zabicie komórek wobec stężenia przeciwciała w ug/ml.

Figury 4 i 6 pokazują, że chimeryczne przeciwciało BR 96 i fragmenty F(ab ')2 BR 96 (IgG3) są podobne do przeciwciała monoklonalnego BR 96 pod względem cytotoksyczności wobec komórek 3396 i MCF-7. Fig. 5 wykazuje, że wpływ cytotoksyczny na komórki 2987 jest znacznie mniejszy niż na komórki innych raków sutka (figury 4 i 6). Wyniki te sugerują, że wyższy stosunek wiązania (tabela 1) jest ważny pod względem zabijania przez te przeciwciała i/lub, że różne komórki nowotworowe mogą mieć odmienną wrażliwość na zabijanie przez te przeciwciała. Wyniki te objaśniają fakt, że przeciwciało ChiBR 96 i fragmenty F(ab')2 są cytotoksyczne jako takie, to jest w postaci nie sprzężonej, a także objaśniają, że cytotoksyczność przeciwciał BR 96 nie jest zależna od regionu Fc.

Internalizacja ChiBR 96.

Internalizację przeciwciała ChiBR 96 w komórkach carcinoma ocenia się w porównaniu z internalizacją przeciwciała monoklonalnego BR 96. Przeciwciała sprzęga się z toksyną-łańcuchem A rycyny z utworzeniem immunotoksyn ChiBR 96-RA (1-4 łańcuchów A rycyny na cząsteczkę przeciwciała) i BR 96-RA (1-2 łańcuchów A rycyny na cząsteczkę przeciwciała). Mierzy się internalizację przez linie komórek carcinoma 3396 i 3630 stosując test zahamowania włączania tymidyny.

Wykresy procentowego zahamowania włączania tymidyny wobec stężenia immunotoksyny dla każdej badanej linii komórek są przedstawione na fig. 7 i 8. Fig. 7 przedstawia procentowe zahamowanie włączania tymidyny przez linię komórek raka sutka 3396 spowodowane internalizacją ChiBR 96-RA i BR 96-RA. Jak przedstawiono na wykresie, ChiBR 96 internalizowane jest podobnie do BR 96 i okazuje się co najmniej tak skuteczne jak BR 96 w zabijaniu komórek nowotworowych. Podobne wyniki otrzymuje się z linią komórek raka sutka 3630 (fig. 6).

168 720

Aktywność ADCC przeciwciała ChiBR 96.

Oznaczenia aktywności ADCC ChiBR 96 dokonuje się z zastosowaniem następujących linii komórek: linie komórek raka sutka 3396,3630 i 3680 (Oncogen, Seattle, WA) MCF-7 (ATCC No. HTB22), linię komórek raka jajnika 3633-3 (O^oge^, Seattle, WA) oraz linie komórek raka płuca 2987, 3655-3 i 2981 (Oncogen, Seattle, WA). Wyniki przedstawione są w poniższej tabeli 1 dla różnych stężeń przeciwciała.

Tabela 1

Aktywność ADCC ChiBR 96

Lima komórek	Przeciwciało	NK	Stężenie przeciwciała (ug/ml)
10	1 0,1	0,01	0,001
Rak sutka
3396	BR 96	28	86	74	58	27	25
	ChiBR 96		88	79	60	34	26
MCF-7	BR 96	16	82	69	54	17	15
	ChiBR 96		90	82	57	25	17
MCF-7	BR 96	22	73	69	48	22	22
	ChiBR 96		76	70	57	33	26
3630	BR 96	30	69	64	42	30	34
	ChiBR 96		69	56	42	36	36
3680	BR 96	13	73	67	58	34	38
	ChiBR 96		70	71	61	39	30
Rak jajnika
3633-3	BR 96	20	92	90	64	28	23
	ChiBR 96		88	88	54	43	29
Rak płuca
2987	BR 96	11	51	57	41	9	7
	ChiBR 96		69	65	51	28	15
3655-3	BR 96	4	49	37	0	0	0
	ChiBR 96		39	35	12	6	5
2981	BR 96	3	4	3	3	4	5
	ChiBR 96		5	4	3	4	4

Wyniki przedstawione w tabeli 1 dla różnych stężeń przeciwciała wskazują, że ChiBR 96 pośredniczy w aktywności ADCC w podobnym rozmiarze co BR 96. Aktywność ADCC można obserwować przy stężeniach przeciwciał niższych, niż stężenia, w których przeciwciało ChiBR 96 jest cytotoksyczne jako takie. Gdy stosuje się samo przeciwciało ChiBR 96 jako kontrolę, daje ono 0% zabicia w badanych stężeniach. Aktywność ADCC stwierdza tylko w przypadku linii komórek wiążących przeciwciało BR 96.

Zdolność ChiBR 96 do pośredniczenia w cytotoksyczności, w której pośredniczy dopełniacz.

Określenia zdolności ChiBR 96 do zabijania komórek nowotworowych w obecności surowicy ludzkiej jako źródła dopełniacza (CDC) dokonuje się stosując linie komórek raka sutka 3396, MCF-7,3630 i 3680, linię komórek raka jajnika 3633-3 oraz linie komórek raka płuca 3655-3, 2987 i 2981. Tabela 2 przedstawia wyniki.

Jak przedstawiono w tabeli 2, ChiBR 96 wywiera działanie cytotoksyczne (CDC) podobne do zdziałania BR 96 w obecności surowicy ludzkiej zawierającej dopełniacz. BR 96 i ChiBR 96 nie są cytotoksyczne w żadnym ze stężeń. Surowica ludzka również nie jest cytotoksyczna.

Powyższe dane wykazują, że pełne przeciwciało BR 96 i chimeryczne przeciwciało są internalizowane przez komórki carcinoma, z którymi się wiążą, są cytotoksyczne jako takie w postaci nie zmodyfikowanej i wykazują aktywność ADCC wobec komórek przeprowadzających ekspresję większej ilości epitopów.

168 720

Tabela 2

Aktywność CDC ChiBR 96

Stężenie przeciwciała (pg/ml)

Linia komórek

Przeciwciało

	10 1	0,1	0,01
Rak sutka
3396	BR 96	100	99	78	13
	ChiBR 96	86	92	13	2
MCF-7	BR 96	94	100	63	2
	ChiBR 96	92	83	2	0
3630	BR 96	94	100	82	9
	ChiBR 96	86	86	33	9
3680	BR 96	100	100	19	7
	ChiBR 96	87	100	5	9
Rak jajnika
3633-3	BR 96	98	98	21	0
	ChiBR 96	100	100	26	1
Rak płuca
3655-3	BR 96	91	22	0	0
	ChiBR 96	46	3	0	0
2987	BR 96	100	100	1	0
	ChiBR 96	100	43	0	0
2981	BR 96	0	3	3	2
	ChiBR 96	1	1	2	10

Hf

Fi 9· 2

0,3 ug/ml biotynylowanego chimerycznego BR 96

—o-chimeryczne SR96 -Β-mysie BR96

0,30,2Fig.3 °Ί

0,0 Γ......'1 τ 11 ιιιΐ| -ι r ιιιιιΐ|

0,001 0,01 0,1

l ilJIIHj l Ι'ΊΙΙΊΊΊ) I I I ΓΙΊΤΤ]......| | ||||jq

10 100 1000 jjg/ml

168 720 % martwych docelowa linia

Fig. 4 % martwych docelowa linia komórek komórkowa H2987

Fig. 5

168 720 % martwych docelowa linia

Fig. 6

Fig. 7

168 720

Fig. 8

Fig.1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims (2)

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania nowego bispecyficznego przeciwciała BR 96 wiążącego dwa różne antygeny, z których jeden wiązany jest również przez mysie przeciwciało monoklonalne BR(IgG 3) i przez ludzko-mysie chimeryczne przeciwciało monoklonalne ChiBR96, znamienny tym, że prowadzi się fuzję dwu hybrydoma mających różne markery selekcyjne, z których jedna wydziela przeciwciało wykazujące tę samą co BR 96 lub ChiBR 96 specyficzność, a druga hybrydoma wydziela przeciwciało wykazujące inną specyficzność, prowadzi się hodowlę takiego hybrydu hybrydomalnego w obecności dwóch markerów selekcyjnych i wyselekcjonowane bispecyficzne przeciwciało oczyszcza się od innych możliwych kombinacji lekko i ciężko łańcuchowych.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wysclekcjjmowuje się przeciwciało mające region wiążący antygen, wykazują tę samą specyficzność co przeciwciało BR 96 lub przeciwciało ChiBR 96 i jednocześnie rozpoznający część epitopu zawierającego fukozę α 1-3 wariantu antygenu Le^y.