PL168700B1 - Sposób wytwarzania nowego ludzko-mysiego chimerycznego przeciwcialamonoklonalnego PL - Google Patents

Abstract

Sposób w ytw arzania now ego ludzko-m ysiego chim erycznego przeciw ciala m o- noklonalnego BR96, znamienny tym, ze hybrydome zdeponow ana w ATCC pod nr HB10036 transfekuje sie ludzkim wektorem gamma 1/HC-D kodujacym ludzki ciezki lancuch IgG gamma 1, hodowle supematantów poddaje sie skriningowi, wyselekcjonowuje sie hybrydome i hybrydome te wytwarzajaca ciezkolancuchowe ludzkie przeciwciala IgG gamma 1 transfekuje sie ludzkim wektorem docelowym pSV 2gpt/CK kodujacym ludzki lekki lancuch K, otrzymuje sie wyselekcjonowana hybrydome wydzielajaca ludzko-mysie chime- ryczne lekko i ciezko lancuchowe przeciwcialo monoklonalne oznaczone ChiBR96 zdepo- nowana w ATCC pod nr H B 10460. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego ludzko-mysiego chimerycznego przeciwciała monoklonalnego BR 96. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania mysich przeciwciał monoklonalnych i chimerycznych reagujących z antygenem błony komórkowej związanym z wieloma ludzkimi rakami, włącznie z rakami okrężnicy, piersi, jajników i płuc. Mysie przeciwciało monoklonalne jest w wysokim stopniu specyficzne wobec raków, nie przejawiając żadnej lub bardzo niską reaktywność wobec normalnych tkanek ludzkich lub innych typów nowotworów, takich jak chłoniaki lub mięsaki. Przeciwciała wytwarzane sposobem według wynalazku mają kilka dodatkowych zalet. Po pierwsze, ulegają one internalizacji do komórek rakowych, z którymi się wiążą. Ludzko-mysie chimeryczne przeciwciała monoklonalne BR-96 otrzymywane sposobem według wynalazku są więc użyteczne do zastosowań terapeutycznych, na przykład, jako przeciwciałowy składnik koniugatów przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna, gdzie pożądana jest internalizacja koniugatu. Po drugie, przeciwciała pośredniczą w zależnej od przeciwciała cytotoksyczności komórkowej ADCC, i zależnej od dopełniacza cytotoksyczności CDC. Po trzecie, przeciwciała w formie nieskoniugowanej mogą zabijać antygenododatnie komórki nowotworowe, jeśli obecne są w dostatecznym stężeniu. Przeciwciała użyteczne są także w metodach diagnostycznych, takich jak wykrywanie raków metodami in vitro lub in vivo.

Przeciwciała monoklonalne na ludzkie różnicujące antygeny towarzyszące nowotworowi zapewniają możliwość ukierunkowywania różnych czynników antynowotworowych, takich jak radioizotopy, leki chemioterapeutyczne i toksyny [Baldwin i Byers, (red.), w: Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therepy, Londyn, Academic Press (1985)]. Ponadto, korzystną cechą pewnych przeciwciał monoklonalnych jest możliwość zabijania komórek nowotworowych przez ADCC lub CDC w obecności ludzkich komórek efektorowych lub surowicy [Hellstrom i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] i niewiele jest przeciwciał monoklonalnych, które posiadają bezpośrednią aktywność przeciwnowotworową, niezależną od żadnego komponentu gospodarza [Drebin i in., Oncogene 2:367-394 (1988)].

Znanych jest wiele przeciwciał monoklonalnych reagujących z antygenami towarzyszącymi rakowi [patrz np. Papsidero, Recent Progress In The Immunological Monitoring of Carcinomas Using Monoclonal Antibodies, Semin. Surg. Oncol., 1 (4): 171-81 (1985); Schlom i in., Potential Clinical Utility of Monoclonal Antibodies In The Management Of Human Carcinomas, Important Adv. Oncol., 170-92 (1985); Allum. i in., Monoclonal Antibodies In The Diagnosis And Treatment of Malignant Conditions, Surg. Ann., 18:41-64 (1985) i Houghton i in., Monoclonal Antibodies: Potential Applications To The Treatment of Cancer, Semin. Oncol., 13/2/: 165-79 (1986)].

168 700

Te znane przeciwciała monoklonalne mogą wiązać się z różnorodnymi antygenami towarzyszącymi rakowi włącznie z glikoproteinami, glikolipidami i mucynami [patrz np. Fink i in., Monoclonal Antibodies As Diagnostic Reagents for The Identification And Characterization Of Human Tumor Antigens, Prog. Clin. Pathol., 9:121-33 (1984)]. Na przykład, przeciwciała monoklonalne wiążące się z antygenami glikoproteinowymi na specyficznych typach raków obejmują te opisane w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 737 579 (przeciwciała monoklonalne na nie-drobnokomórkowego raka płuc), opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 753 894 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka piersi), opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 579 827 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka żołądkowo-jelitowego) i opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 713 352 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka nerki). Przeciwciało monoklonalne B72.3, będące jednym z najbardziej badanych przeciwciał, rozpoznaje towarzyszący nowotworowi antygen mucynowy o masie cząsteczkowej wyższej niż 1 000 kd, który jest specyficznie eksprymowany na licznych różnych rakach. Wykazano zatem, że B72.3 reaguje z 84% raków piersi, 94% raków okrężnicy, 100% raków jajnika i 96% nie-drobnokomórkowych raków płuc (patrz Johnston, Applications of Monoclonal Antibodies In Clinical Cytology As Exemplified By Studies With Monoclonal Antibody N72.3, Acta Cytol., l/5/:537-56 (1987) i opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 612 282 Schloma i in.). Inne opatentowane przeciwciało monoklonalne, KC-4, (patrz opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 708 930), rozpoznaje antygen białkowy o masie cząsteczkowej 400-500 kd eksprymowany na licznych rakach, takich jak rak okrężnicy, prostaty, płuc i piersi. Okazało się, że ani przeciwciało B72.3 ani przeciwciało KC-4 nie ulega internalizacji do komórek rakowych, z którymi reagują.

Ujawniono przeciwciała monoklonalne reagujące z antygenami glikolipidowymi towarzyszącymi komórkom nowotworowym. Na przykład, Young i in., Production Of Monoclonal Antibodies Specific For Two Distinct Steric Portions Of The Glycolipid Ganglio-N-Triosylceramide (Asialo GM2), J. Exp. Med., 150:1008-1019 (1979) ujawniają wytwarzanie dwóch przeciwciał monoklonalnych specyficznych wobec asialo GM2, glikosfingolipidowego antygenu powierzchni komórkowej, który, jak ustalono, jest markerem komórek BALR/c V3T3 stransformowanych wirusem mięsaka mysiego Kristein. Patrz także Kniep i in., Gangliotriaosylceramide (Asialo GM2) A Glycossphingolipid Marker For Celi Lines Derived From Patients With Hodgkin's Disease, J. Immunol., 131/3/: 1591-94 (1983) i opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 507 391 (przeciwciało monoklonalne na ludzkiego czerniaka).

Inne przeciwciała monoklonalne reagujące z glikolipidowymi antygenami na komórkach rakowych obejmują te opisane przez Rosena i in., Analysis Of Human Small Cell Lung Cancer Differentiation Antigens Using A Panel Of Monoclonal Antibodies, Cancer Research. 44:205261 (1984) (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc), Varki'ego i in., Antigens Associated with a Human Lung Adenocarcinoma Defined by Monoclonal Antibodies, Cancer Research 44:681-87 (1984); przeciwciała monoklonalne na ludzkiego gruczolakoraka płuc, żołądka i okrężnicy i czerniaka) i opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 579 827 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego gruczolakoraka okrężnicy). Patrz także Hellstrom i in., Antitumor Effects Of L6, An IgG2a Antibody That Reacts With Most Human Carcinomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7059-63 (1986), którzy opisują przeciwciało monoklonalne L 6 rozpoznające węglowodanowy antygen eksprymowany na powierzchni ludzkiego nie-drobnokomórkowego raka płuc, raka piersi i raka okrężnicy.

Dodatkowe przeciwciała monoklonalne przejawiające wysoką, specyficzną reaktywność wobec większości komórek z szerokiego zakresu raków są bardzo potrzebne. Jest tak z powodu heterogenności antygenowej) wielu raków, które często wymagają, w diagnozie lub terapii, stosowania licznych różnych przeciwciał monoklonalnych na ten sam guz nowotworowy. Istnieje dalsze zapotrzebowanie, zwłaszcza w terapii, na tak zwane przeciwciała internalizowane, tj. przeciwciała, które są łatwo pobierane przez komórki nowotworowe, z którymi się wiążą. Przeciwciała tego typu znajdują zastosowanie w metodach terapeutycznych wykorzystujących koniugaty przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna, w których przeciwnowotworowy czynnik terapeutyczny związany jest z przeciwciałem w celu dostarczenia do nowotworu, gdzie przeciwciało wiąże się z antygenem towarzyszącym nowotworowi, wobec którego jest ono reaktywne i uwalnia czynnik przeciwnowotworowy do wewnątrz komórek nowotworowych [patrz np.

168 700

Embleton i in., Antibody Targeting Of Anti-Cancer Agents, w: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, str. 317-44 (Academic Press, 1985)]. Przeciwciała na antygeny towarzyszące nowotworowi, które nie są zdolne do internalizacji do komórek nowotworowych, z którymi się wiążą na ogół nie są użyteczne do przygotowywania koniugatów z lekami lub toksynami przeciwnowotworowymi, ponieważ mogłoby nie być zdolne do osiągnięcia swojego miejsca działania w komórce. Mogą być konieczne inne podej ścia, aby można było użyć w terapii takie przeciwciała.

Znanych jest kilka mogących ulegać internalizowaniu przeciwciał reagujących z antygenami limfocytów. W przeciwieństwie, przeciwciała takie są rzadkie, kiedy traktuje się masywne nowotwory. Jednym z nielicznych przykładów mogącego ulegać internalizowaniu przeciwciała reagującego z rakami jest przeciwciało ujawnione w Domingo i in. Transferrin Receptor As A Target For Antibody-Drug Conjugates Methods Enzymol, 112:238-47 (1985). Przeciwciało to reaguje z ludzką glikoproteiną będącą receptorem transferyny eksprymowaną na komórkach nowotworowych. Jednakże, ponieważ receptor transferyny eksprymowany jest także na wielu normalnych tkankach, i często na wysokim poziomie, stosowanie przeciwciała skierowanego przeciwko receptorowi transferyny w koniugacie przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna może wywierać znaczący wpływ toksyczny na normalne komórki. Wykorzystanie tego przeciwciała do specyficznego zabijania lub hamowania komórek nowotworowych jest dlatego sprawą sporną. Innym mogącym ulegać internalizowaniu przeciwciałem jest BR64, wiążące się z wieloma rakami.

Technika fuzji komórek dla wytwarzania przeciwciał monoklonalnych [Kohler i Milstein, Naturę (London) 256; 495 (1975)] pozwoliła rozwinąć liczne mysie przeciwciała monoklonalne reagujące z antygenami, włącznie z antygenami uprzednio nieznanymi. Mysie przeciwciała monoklonalne mogą jednakże zostać rozpoznane jako substancje obce i zneutralizowane przez ludzki układ immunologiczny, tak że ich możliwości w terapii u ludzi nie są realizowane. Dlatego też ostatnie wysiłki skupiają się na wytworzeniu tak zwanych przeciwciał chimerycznych poprzez wprowadzenie DNA do komórek ssaków w celu otrzymania ekspresji genów immunoglobulin [Ol i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:825 (1983); Potter i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7161; Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6581 (1984); Sahagan i in., J. Immunol. 137:1066 (1985); Sun i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214 (1987)].

Przeciwciała chimeryczne są cząsteczkami immunoglobulin zawierającymi część pochodzącą od ludzi i część pochodzenia nie-ludzkiego. Bardziej szczegółowo, region wiążący antygen (region zmienny) przeciwciała chimerycznego pochodzi ze źródła nie-ludzkiego (np. od myszy), a region stały przeciwciała chimerycznego, nadający immunoglobulinom biologiczną funkcję efektorową pochodzi ze źródła ludzkiego. Przeciwciało chimeryczne powinno mieć specyficzność wiązania antygenu nie-ludzkiej cząsteczki przeciwciała, a funkcję efektorową nadaną przez ludzką cząsteczkę przeciwciała.

Na ogół procedury stosowane do wytwarzania przeciwciał chimerycznych obejmują następujące etapy:

a) identyfikowanie i klonowanie właściwego odcinka genu kodującego wiążącą antygen część cząsteczki przeciwciała; ten odcinek genu (znany jako VDJ, regiony zmienny, różnorodny i łączący dla ciężkich łańcuchów lub VJ, regiony zmienny, łączący dla lekkich łańcuchów lub po prostu jako V lub region zmienny) może być w formie albo cDNA, albo genomowej,

b) Klonowanie odcinków genu kodujących region stały lub jego pożądaną część,

c) ligowanie regionu zmiennego z regionem stałym, tak że całkowite przeciwciało chimeryczne jest zakodowane w formie umożliwiającej transkrypcję i translację,

d) ligowanie tej konstrukcji z wektorem zawierającym· marker selekcyjny i regiony kontrolujące gen, takie jak promotory, sekwencje wzmacniające ekspresję i sygnały dołączania poli/A/,

e) amplifikowanie tej konstrukcji w bakteriach,

f) wprowadzanie tego DNA do komórek eukariotycznych (transfekcja), najczęściej limfocytów ssaków,

g) selekcjonowanie komórek eksprymujących marker selekcyjny,

h) poszukiwanie komórek eksprymujących pożądane przeciwciało chimeryczne i

168 700

k) testowanie przeciwciała pod kątem odpowiedniej specyficzności wiązania i funkcji efektorowych.

Zgodnie z tymi metodami manipulowano, w celu wytworzenia białek chimerycznych, przeciwciałami o kilku odrębnych specyficznościach wiązania antygenów [np. anty-TNP: Boullanne i in., Nature 312; 643 (1984) i anty-antygeny przeciwnowotworowe: Sahagan i in., J. Immunol. 137; 1066 (1986)]. Podobnie, przez wiązanie nowych sekwencji z sekwencjami kodującymi region wiązania antygenu osiągnięto kilka różnych funkcji efektorowych. Niektóre z nich obejmują enzymy [Neuberger i in., Nature 312; 604 (1984)], stałe regiony immunoglobulin z innych gatunków i stałe regiony innego łańcucha immunoglobulinowego [Sharon i in., Nature 309; 364 (1984); Tan i in., Immunol. 135; 3565-3567 (1986)].

Odkrycie rekombinacji homologicznej w komórkach ssaków pozwoliło na skierowanie nowych sekwencji do specyficznych loci chromosomalnych. Rekombinacja hemologiczna występuje, gdy hodowane komórki ssaków integrują egzogenny DNA z DNA chromosomalnym w miejscu chromosomu zawierającym sekwencje homologiczne do sekwencji plazmidowych (Folger i in., Mol. Cell. Biol. 2; 1372-1387 (1982); Folger i in., Symp. Quant. Biol. 49; 123-138 (1984); Kucherlapati i in., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81; 3153-3157 (1984); Lin i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82; 1391-1395 (1985); de Saint Vincent i in., Proc. Natl. Acad. Aci. USA 80; 2002-2006 (1983); Shaul i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82; 3781-3784 (1985)]. Możliwość rekombinacji homologicznej w komórkach pozwala na modyfikację genów endogennych in situ. Znaleziono warunki, w których sekwencje chromosomalne można modyfikować poprzez wprowadzanie do komórki plazmidowego DNA zawierającego odcinek DNA homologiczny do docelowego locus, i odcinek nowych sekwencji z pożądaną modyfikacją [Thomas i in., Cell 44; 419-428 (1986); Smithies i in., Nature 317; 230-234 (1985); Smith i in., Symp. Quant. Biol. 49; 171-181 (1984)]. Wynikiem rekombinacji homologicznej pomiędzy chromosomalnym DNA komórki ssaka i egzogennym DNA plazmidowym może być integracja plazmidu lub zastąpienie pewnych sekwencji homologicznymi sekwencjami plazmidowymi, wynikiem, tego może być umieszczenie pożądanej nowej sekwencji w endogennym locus docelowym.

Sposób rekombinacji homologicznej oceniono przy użyciu genów umożliwiających selekcję dominantów, takich jak NEO lub HPRT dla kilku typów komórek [Song i in., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84; 6820-6824 (1987); Rubinitz i Subramani, Mol. Cell Biol. 6; 1608-1614 (1986); i Liskay, Celi 35; 157-164 (1983)]. Ostatnio opisano procedury modyfikowania cząsteczek przeciwciał i wytwarzania cząsteczek przeciwciał chimerycznych przy użyciu rekombinacji homologicznej w celu ukierunkowanej modyfikacji genu [Fell i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86; 8507-8511 (1989)].

Najbardziej bezpośrednia droga klinicznego stosowania przeciwnowotworowych przeciwciał monoklonalnych jest podawanie ich w formie niezmodyfikowanej, przy użyciu przeciwciał monoklonalnych przejawiających aktywność przeciwnowotworową in vitro lub w modelach zwierzęcych. Wydaje się, że większość przeciwciał monoklonalnych na antygeny nowotworowe nie posiada żadnej aktywności przeciwnowotworowej, lecz znane są pewne przeciwciała monoklonalne, które pośredniczą w zależnej od dopełniacza cytotoksyczności (CDC), tj. zabijające ludzkie komórki nowotworowe w obecności ludzkiej surowicy jako źródła dopełniacza [patrz np. Hellstrom i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82; 1499-1502 (1985)], lub zależnej od przeciwciała cytotoksyczności komórkowej (ADCC) wraz z komórkami efektorowymi, takimi jak ludzkie komórki Nk lub makrofagi. W celu wykrycia aktywności ADCC lub CDC testuje się zdolność przeciwciał monoklonalnych do lizowania hodowanych, znakowanych 51 c_r nowotworowych komórek docelowych przez 4-godzinny okres inkubacji.

Komórki docelowe znakuje się 51cr i następnie eksponuje przez 4 godziny na połączenie komórek efektorowych (w formie limfocytów ludzkich oczyszczonych przez zastosowanie podłoża rozdzielającego limfocyty) i przeciwciała, które dodaje się w stężeniach pomiędzy 0,1 μ/ml a 10 pJml. Jako dowód lizy komórek nowotwyrowych (cytotoksoccności) mrerzy się uwalnianie 51cr z komórek docelowych. Kontrole obejmują inkubację samych komórek docelowych, lub z albo limfocytami albo przeciwciałem moóokloóalnym oddzielnie. Mierzy się całkowitą ilość 51cr, który może zostać uwolniony i oblicza ADCC jako procent zabijania komórek docelowych obserwowany z przeciwciałem monoklonalnym plus komórki efektorowe

168 700 w porównaniu z inkubowanymi samymi komórkami docelowymi. Procedura dla CDC identyczna jest do procedury stosowanej do wykrywania ADCC z tym wyjątkiem, że w miejsce komórek efektorowych dodaje się surowicę ludzką jako źródło dopełniacza (rozcieńczoną 1:3 do 1:6).

Terapeutyczne stosowanie przeciwciał monoklonalnych z aktywnością ADCC lub CDC rozważa się ponieważ często mają one aktywność przeciwnowotworową in vivo. Z drugiej strony, przeciwciała pozbawione in vitro aktywności ADCC i CDC, in vivo, o ile nie są zastosowane jako nośniki czynników przeciwnowotworowych, zazwyczaj są nieskuteczne. Zdolność przeciwciała monoklonalnego do aktywacji dopełniacza gospodarza może być korzystna terapeutycznie nie tylko dlatego, że komórki nowotworowe mogą zostać zabite, lecz także dlatego ponieważ może wzrosnąć dopływ krwi do nowotworu, ułatwiając zatem pobieranie leków [patrz Hellstrom i in., Immunological Approaches to Tumor Therapy; Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines. and Anti-Idiotypes, w: Covalently Modified Antigens and Antibodies in Diagnosis and Therapy, Quash and Rodwell, red. Marcel Dekker, str. 15-18 (1989)]. Wśród mysich przeciwciał monoklonalnych, najpowszechniej z ADCC i CDC związane są izotopy IgG2a i IgG 3. Przeciwciała posiadające zarówno aktywność ADCC jak CDC z wysoką specyficznością zabijają tylko komórki nowotworowe, z którymi się wiążą i jest nieprawdopodobne, aby prowadziły do wpływów toksycznych, jeśli zwiążą się niespecyficznie w płucach, wątrobie lub innych organach. Może to zapewnić takim przeciwciałom przewagę nad przeciwciałami znakowanymi radioaktywnie lub pewnymi typami immunokoniugatów.

Bardzo nieliczne przeciwciała same są zdolne do zabijania komórek nowotworowych, to jest w nieobecności komórek efektorowych lub dopełniacza jak w ADCC lub CDC. BR96 jest takim przeciwciałem, ponieważ może ono samo zabijać komórki przy stężeniu przeciwciała około 10 [mml lbb wyższym. Precciwcaaaa aaki e s ą scczególnie interesująee, pnnieważ mgg ą nne interferować z pewnymi aluccowzmi zdarzeniami w przeżywaniu komórek nowotworowych.

Jest zatem oczywiste, że przeciwciało, które przejawia wyższy stopień specyficzności wobec szerokiego zakresu raków, samo posiada aktywność przeciwnowptworową i zdolne jest do łatwego ulegania internalizacji przez komórki nowotworowe, może być bardzo korzystne w terapii nowotworów.

Sposób według wynalazku dostarcza intepnalicowanych przeciwciał o wysokiej specyficzności wobec szeregu ludzkich raków. Bardziej szczegółowo, nowe przeciwciało otrzymywane sposobem według wynalazku, oznaczone jako przeciwciała BR96, jest ludzko-mysim chimerycznym przeciwciałem monoklonalnym wiążącym się z antygentem błony komórkowej, którego obecność stwierdzono na ludzkich komórkach rakowych. Przeciwciała są w wysokim stopniu reaktywne wobec komórek rakowych, takich jak otrzymane z raka piersi, płuc, okrężnicy i jajnika, nie przejawiając, lub przejawiając ograniczoną reaktywność z normalnymi komórkami ludzkimi lub innymi typami nowotworów, takimi jak chłoniaki lub mięsaki.

Ponadto, przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku internalizowane są przez komórki rakowe, z którymi się wiążą i same zdolne są do zabijania komórek nowotworowych, tj. w formie nieżkoniugowanej i bez komórek efektorowych lub dopełniacza. Przeciwciała BR96 są zatem szczególnie użyteczne w zastosowaniach terapeutycznych, na przykład do reagowania z komórkami nowotworowymi, i w koniugatach jako specyficzny wobec celu nośnik różnych czynników posiadających wpływy przeciwnpwotwprowe, włącznie z lekami chzmiotzpapeutycznymi, toksynami, modulatorami odpowiedzi immunologicznej, enzymami i izotopami radioaktywnymi. Przeciwciała można zatem stosować jako składnik różnych immunokoniugatów, włącznie z koniugatami przeciwciało-lek i przeciwciało-toksyna, gdzie szczególnie korzystna jest internalizacja koniugatu, a po znakowaniu izotopem radioaktywnym jego dostarczenie do nowotworu. Przeciwciała BR96 mogą także być korzystne terapeutycznie nawet w formie niezmodyfikowanej. Ponadto przeciwciała użyteczne są w przeznaczonych do wykrywania raka metodach diagnostycznych in vitro lub in vivo.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ludzko-mysiego chimerycznego przeciwciała monpklpnalnego BR96 polegający na tym, że hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod nr HB10036 transfeRuje się ludzkim wektorem gamma 1/HC-D kodującym ludzki ciężki łańcuch IgG gamma 1, hodowlę supematantów poddaje się skriningowi, wzżelekcjonowuje się hybry168 700

Ί domę tą wytwarzającą ciężkołańcuchowe ludzkie przeciwciała IgG gamma 1 transfekuje się ludzkim wektorem docelowym pSV 2gpt/Ck kodującym ludzki lekki łańcuch K, otrzymuje się wyselekcjonowaną hybrydomę wydzielającą ludzko-mysie chimeryczne lekko i ciężko łańcuchowe przeciwciało monoklonalne oznaczone ChiBR 96 jak zdeponowano w ATCC pod nr HB 10460.

Chimeryczną hybrydomę BR96, określoną jako ChiBR96, otrzymaną sposobem według wynalazku i wytwarzającą chimeryczne ludzko-mysie przeciwciało BR96, zdeponowano 23 maja 1990 w ATCC, gdzie jest w następujący sposób identyfikowana: ChiBR96 ATCC Nr identyfikacyjny: HB 10460.

Po zidentyfikowaniu hybrydomy eksprymującej chimeryczne przeciwciało, prowadzi się jej hodowlę i izoluje się pożądane cząsteczki chimeryczne z supematantu hodowli komórkowej stosując dobrze znane techniki izolowania przeciwciał monoklonalnych.

Używany tutaj termin przeciwciało BR96 obejmuje całe, nienaruszone przeciwciała poliklonalne i monoklonalne, takie jak mysie przeciwciało monoklonalne wytwarzane przez hybrydomę ATCC Nr HB 10036, i cząsteczki przeciwciał chimerycznych, takich jak przeciwciało chimeryczne BR96 wytwarzane przez hybrydomę ATCC Nr 10460.

Opisane powyżej przeciwciało BR96 obejmuje wszystkie jego fragmenty zawierające aktywny region wiązania antygenu przeciwciała, takie jak fragmenty Fab, F/ab '/2 i Fv, stosując dobrze znane techniki [patrz np. Rouseaux i in., Optimal Conditions For The Preparation of Proteolytic Fragments From Monoclonal IgG of Different Rat IgG Subclasses w: Methods Enzymol., 121; 663-69 (Academic Press 1986)].

Przeciwciało monoklonalne wytwarza się stosując dobrze znane techniki z wykorzystaniem hybrydom po raz pierwszy wprowadzone przez Kohlera i Milsteina [patrz Kohler i Milstein, Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Pre-Defined Specificity, Nature, 256; 495-97 (1975). Patrz także Brown i in., Structural Characterisation Of Human MelanomaAssociated Antigen p97 with Monoclonal Antibodies, J. Immunol., 127 /2/; 539-46 (1981); Brown i in., Protein Antigens Of Normal And Malignant Human Cells Identified By Immunoprecipitation with Monoclonal Antibodies, J. Biol. Chem. 255; 4980-83 (1980); Yeh i in., Cell Surface Antigens Of Human Identified By Monoclonal Antibody, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 /6/; 297-31 (1979) i Yeh i in., A Cell-Surface Antigen which is Present In the Gangiloside Fractionn And Shared By Human Helanoma, Int. J. Cancer, 29; 269-75 (1982)].

Techniki te obejmują iniekcję immunogenu (np. komórek lub ekstraktów komórkowych niosących antygen lub oczyszczonego antygenu) zwierzęciu (np. myszy), tak aby u zwierzęcia tego wywołać pożądaną odpowiedź immunologiczną (tj. przeciwciała). Po odpowiednim czasie otrzymuje się ze zwierzęcia limfocyty wytwarzające przeciwciała, albo ze śledziony, węzłów chłonnych albo z krwi obwodowej. Korzystnie limfocyty otrzymuje się ze śledziony. Limfocyty pochodzące ze śledziony poddaje się następnie fuzji z linią komórek szpiczaka, zazwyczaj w obecności czynnika indukującego fuzję, takiego jak glikol polietylenowy (PEG). Zgodnie ze standardowymi technikami, do fuzji zastosować można każdą z licznych linii szpiczaka, na przykład linie szpiczaka P3-NS1/1A_g4-1, P3-X63-Ag8 lub Sp2/0Ag14. Linie te dostępne są w American Type Culture Collection, (ATCC) w Rockville, Haryland.

Otrzymane komórki, obejmujące pożądane hybrydomy, hoduje się następnie na podłożu selekcyjnym, takim jak podłoże HAT, w którym niesfuzjowane rodzicielskie komórki szpiczaka lub ewentualnie limfocyty zamierają. Przeżywają tylko komórki hybrydomy, i można je hodować w warunkach ograniczających dla otrzymania wyizolowanych klonów. Supernatanty hybrydom testuje się na obecność przeciwciał o pożądanej specyficzności np. technikami oznaczeń immunologicznych stosując antygen, który został użyty do immunizacji. Klony dodatnie można następnie subklonować w warunkach ograniczających i izolować można wytwarzane przeciwciała monoklonalne. Hybrydomy wytworzone według tych metod można namnażać in vitro i in vivo, ( w płynie puchlinowym z jamy otrzewnowej) stosując znane techniki (patrz Fink i in., supra str. 123, fig. 6-11). Powszechnie stosowane metody oczyszczania przeciwciał monoklonalnych obejmują wytrącanie siarczanem amonu, chromatografię jono-wymienną i chromatografię powinowactwa (patrz np. Zola i in., Techniques For The Production And Charakterization

168 700

Of Monoolonal Hybridoma Antibodies, w: Mcóoolonal Hybridoma Am^dies; Technigues Anf Applications, Hurell (red.), str. 51-52 (CRS Press 1982)]

Przeciwciało mcnoklonalóe oznaczone BR96, wytworzono poprzez opisane tu poniżej techniki z wykorzystaniem hybrydom stosując jako immunogen linię komórkową raka piersi 3396. Hybrydomę BR96, przygotowaną jak opisano tu powyżej i wytwarzającą przeciwciało BR96, zdeponowano 22 lutego 1989 w ATCC, gdzie jest w następujący sposób identyfikowana: BR96 ATCC Nr identyfikacyjny : HB 10036

Przeciwciało BR96 należy do podklasy IgG 3. Przeciwciało przejawia wysoką specyficzność wobec komórek raka różnych typów organów, na przykład nowotworów piersi, płuc, okrężnicy i jajnika, jak również hodowanych linii komórkowych założonych z różnych raków piersi, płuc i okrężnicy. Ponadto przeciwciało BR96 nie przejawia wiązania z innymi typami komórek nowotworowych, takich jak linie komórkowe komórek T chłoniaka, CEM i MOLT-4, linia komórkowa komórek B chłOTiaka P3HR-1 i linie komórkowe czerniaka. Przeciwciało BR96 może być interóalizcwaóe przez antygenododatnie komórki nowotworowe, jest toksyczne wobec antygenodcdatnioh komórek nowotworowych, pośredniczy w aktywności ADCC i CDC i, co zaskakujące, samo, tj, w formie niezmcdyfimcwanej, jest cytctoksyozne. PrzeciwciałaBR96 wydają się rozpoznawać antygen Ley

Ponadto, przeciwciało BR96 nie przejawia żadnego immunohretolcgicznre wykrywalnego wiązania z normalnymi tkankami ludzkimi z głównych organów, takich jak nerki, śledziona, wątroba, skóra, płuca, piersi, okrężnica, mózg, tarczyca, serce, węzły chłonne lub jajniki. Przeciwciało nie wiąże się także z leukocytami krwi obwodowej. Przeciwciało BR96 przejawia ograniczone wiązanie z pewnymi komórkami w migdałkach i jądrach, i wiąże się z komórkami graniastymi w trzustce oraz z komórkami nabłonkowymi w żołądku i przełyku. A zatem, przeciwciało BR96 przewyższa najbardziej znane przeciwciała przeciwncwctwcrcwe wysokim stopniem specyficzności wobec komórek nowotworowych w porównaniu z komórkami normalnymi [patrz np. Hellstrom i in., Immunolog^al Approaches To Tumor Therapy; Mcóocloóal AnUbodies, Tumor Vaooióee, And Aótibodiee In Diagnosis And Therapy, Quash/ROdwell (red.), str. 1-39 (Marcell Dekker, Inc., 1989) i Bagshawe, Tumour Markers - where Do We Go From Here, Br. J. Cancer, 48; 167-75 (1983)].

Przeciwciało BR96 użyteczne jest także do zastosowań diagnostycznych, zarówno in vitro jak in vivo, do wykrywania ludzkich raków posiadających antygen wobec którego przeciwciała są specyficzne. Metody diagnostyczne in vitro obejmują immunohietologiczne wykrywanie antygenów komórek nowotworowych (np. na tkance ludzkiej, komórkach lub wyciętych próbkach nowotworów) lub serologiczne wykrywanie antygenów towarzyszących nowotworom (np. w próbkach krwi lub innych płynów biologicznych).

Techniki immunchietoohemiczne obejmują barwienie próbek biologicznych, takich jak próbki tkanki, przeciwciałem BR96, a następnie wykrywanie na próbce obecności przeciwciała skomplekecwaóego z jego antygenem. Tworzenie takich kompleksów przeciwciało-antygen z próbką wskazuje na obecność w tkance komórek rakowych. Wykrywanie przeciwciała na próbce przeprowadzać można stosując znane techniki, takie jak techniki immunoeózymatyczóe, np. technikę barwienia immuóoperckeydazą lub technikę awidyna - blotyna (ABC), lub techniki rmmunoflucresoeóoyjne [patrz np. Clocca i in., Immunohietcchemrcal Technigues Using Moóoclonal Antibcdiee, Meth. Enzymol., 121: 562 - 79 (1086); Hellstrom i in., Monoclcnal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma, Cancer Research 46: 3917 - 23 (1986); i Kimball (red.), Introduction To Immuóology (wyd. II), str. 113 - 117 (Macmillan Pub. Co. (1986)]. Barwienie immunoperoksydazą zastosowano naprzykład jak opisano w przykładzie II do wykazania reaktywności przeciwciała BR96 z rakami płuc, piersi, okrężnicy i jajnika i niskiej reaktywności przeciwciała z próbkami normalnych tkanek ludzkich.

Serologiczne techniki diagnostyczne obejmują wykrywanie i określanie ilościowe antygenów towarzyszących nowotworom, które uległy sekrecji lub zostały zrzucone do surowicy lub innych płynów biologicznych pacjentów cierpiących na raka. Antygeny takie można wykryć w płynach ciała stosując znane techniki, takie jak oznaczenia radioimmuóologiczne (MA) lub ELISA, w których przeciwciało reagujące ze zrzuconym antygenem stosowane jest do wykrywania obecności antygenu w próbce płynu [patrz np. Uotila i in., Two-Site Sanówich

168 700

ELISA With Monoclonal Antibodies To Human AFP, J. Immunol. Methods, 42: 11 (1981) i Allum i in., supra na str. 48-551)]. Oznaczeń tych, stosując ujawnione przeciwciała BR96, można dlatego użyć do wykrywania w płynach biologicznych glikolipidowych antygenów reagujących z przeciwciałami BR96, a zatem wykrywania ludzkiego raka u pacjentów. Jak wynika z powyższych danych, przeciwciała BR96 stosować można w większości oznaczeń obejmujących reakcje antygen - przeciwciało. Oznaczenia te obejmują, ale nie są ograniczone do standardowych technik RIA zarówno na płynnej jak i stałej fazie, jak również oznaczeń ELISA, technik immunofluorescencyjnych i innych oznaczeń immunocytochemicznych [patrz np. Sikora i in., (red.), Monoclonal Antibodies, str. 32 - 52 (Blackwell Scientific Publications (1984)].

Możliwe jest tworzenie w oparciu o przeciwciało BR96 zestawów diagnostycznych do oznaczeń opisanych powyżej. W jednym rozwiązaniu, zestaw diagnostyczny zawiera przeciwciało monoklonalne BR96, jego fragmenty, fuzje białek lub przeciwciało chimeryczne otrzymywane sposobem według wynalazku i koniugat zawierający czynnik specyficznie wiążący przeciwciało i znacznik zdolny do wytwarzania wykrywalnego sygnału. Odczynniki mogą także zawierać czynniki pomocnicze, takie jak czynniki buforujące i czynniki stabilizujące białka (np. polisacharydy). Zestawy diagnostyczne mogą dalej zawierać, tam gdzie jest to konieczne, inne składniki układu wywoływania sygnału włącznie z czynnikami obniżającymi interferencję z tłem, odczynnikami kontrolnymi lub aparatem bądź pojemnikiem do przeprowadzania testu. Zestaw diagnostyczny może zawierać koniugat przeciwciał i znacznik zdolny do wytwarzania wykrywalnego sygnału. Czynniki pomocnicze, jak wspomniane powyżej także mogą być obecne.

Przeciwciało BR96 użyteczne jest także w zastosowaniach diagnostycznych in vivo do wykrywania raka u ludzi. Jedno takie podejście obejmuje wykrywanie nowotworów in vivo techniką uwidaczniania nowotworu (tumor imaging). Według tego podejścia przeciwciało BR96 znakuje się odpowiednim czynnikiem wytwarzającym wykrywalny sygnał. Przykłady takich odczynników, których można użyć obejmują, ale nie są ograniczone do znaczników radioaktywnych, takich jak 1311, 111 in, 123i, 99mtc, 32p, 125i, 3h i 14c, znaczników fluorescencyjnych, takich jak fluoresceina i rodamina oraz czynników chemiluminescencyjnych, takich jak lucyferyna. Przeciwciało można wyznakować takim odczynnikiem stosując znane techniki. Na przykład patrz Wensel i Meares, Radioimmunoimaging And Radioimmunotherapy, Elsevier, Nowy Jork (1983) dla technik dotyczących radioaktywnego znakowania przeciwciał [patrz także Colcher i in., Use Of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice, Meth. Enzymol., 121: 602 - 16 (1986)].

W przypadku przeciwciała znakowanego radioaktywnie przeciwciało podaje się pacjentowi, lokalizuje się nowotwór posiadający antygen, z którym przeciwciało reaguje i jest wykrywany lub uwidaczniany in vivo przy użyciu znanych technik, takich jak skanowanie radiojądrowe przy użyciu np. kamery promieniowania gamma lub temografii emisyjnej [patrz np. Bradwell i in., Developments in Antibody Imaging w: Monoclonal antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin i in., (red.), str. 65 - 85 (Academic Press 1985)]. Przeciwciało podaje się pacjentowi w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, takim jak woda, roztwór soli, płyn Ringera, płyn Hanka lub nośnikach niewodnych, takich jak oleje. Nośnik może także zawierać substancje wzmacniające izotoniczność i chemiczną stabilność przeciwciała, takie jak bufory lub środki ochronne. Przeciwciała podaje się na przykład dożylnie, przy dawkowaniu wystarczającym do zapewnienia dostatecznej emisji gamma aby umożliwić uwidocznienie nowotworowego miejsca docelowego. Aby umożliwić lokalizację docelowego nowotworu, pomiędzy podaniem przeciwciała a detekcją należy zapewnić wystarczający upływ czasu. Dla ogólnej dyskusji na temat uwidaczniania nowotworów patrz Allum i in., supra, str. 51 - 55.

Jak opisano wcześniej, w celach terapeutycznych stosować można chimeryczne przeciwciała BR96 otrzymywane sposobem według wynalazku. Na przykład fuzję białka zawierające przynajmniej region wiążący antygen przeciwciała połączony z co najmniej aktywną funkcjonalnie częścią drugiego białka posiadającego aktywność przeciwnowotworową, np. limfokina lub onkostatyna, zastosować można do leczenia ludzkiego raka in vivo.

Kompozycje farmaceutyczne do stosowania w leczeniu ludzkich raków zawierają skuteczną farmaceutycznie ilość przeciwciała BR96 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Kom10

168 700 pozycje zawierają przeciwciało chimeryczne a ponadto mogą dodatkowo zawierać inne przeciwciała lub koniugaty do leczenia raka (np. mieszaninę przeciwciał).

Kompozycje przeciwciał można podawać używając konwencjonalnych sposobów podawania obejmujących lecz nie ograniczonych do dożylnego, dootrzewnowego, doustnego, śródchłonnego lub bezpośrednie podawanie do nowotworu. Korzystne jest podawanie dożylne.

Kompozycje przeciwciał mogą mieć różne formy dawkowania obejmujące, lecz nie ograniczone do ciekłych roztworów lub zawiesin, tabletek, pigułek, proszków, czopków, polimerycznych mikrokapsułek lub mikrovehiculum, liposomów i roztworów iniekcyjnych lub infuzyjnych. Korzystna forma zależy od sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego.

Kompozycje przeciwciał korzystnie zawierają także konwencjonalne, farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i znane adjuwanty, takie jak albumina surowicy ludzkiej, wymieniacze jonowe, tlenek glinu, lecytyna, substancje buforowe, takie jak fosforany, glicyna, kwas sorbowy, sorbinian potasu i sole lub elektrolity, takie jak siarczan protaminy.

Najbardziej skuteczny sposób podawania i dawkowania zależy od przebiegu i zaawansowania choroby, zdrowia pacjenta, odpowiedzi na leczenie i orzeczenia leczącego lekarza. Przeto, dawkowanie kompozycji powinno być określane dla pojedynczego pacjenta. Niemniej jednak, dawka skuteczna kompozycji przeciwciał może pozostać w zakresie od około 1 do około 2000 mg/m².

W celu umożliwienia pełniejszego zrozumienia opisanego wynalazku, poniżej przedstawia się następujące przykłady i opis figur.

Figura 1 jest diagramem wektora phgammmaiHC-D używanego w procedurze elektroporacji opisanej w przykładzie II.

Figura 2 jest diagramem wektora pSV2gpt/CK używanego w procedurze elektroporacji opisanej w przykładzie II.

Figura 3 jest wykresem przedstawiającym wyniki testu współzawodnictwa wiązania porównującym wiązanie mysiego przeciwciała monoklonalnego BR96 z wiązaniem chimerycznego przeciwciała BR96 wytworzonego sposobem według wynalazku opisanego w przykładzie iI.

Figura 4 przedstawia wyniki analizy FACS cytotoksyczności przeciwciał według wynalazku wobec komórek raka piersi 3396, jak opisano w przykładzie III.

Figura 5 przedstawia wyniki analizy FACS cytotoksyczności przeciwciał według wynalazku wobec komórek ludzkiego gruczolaka płuc 2987, jak opisanego w przykładzie III.

Figura 6 przedstawia wyniki analizy FACS cytotoksyczności przeciwciał według wynalazku wobec komórek MCF-7, jak opisano w przykładzie lii.

Figura 7 przedstawia procent hamowania włączania tymidyny do DNA komórek raka piersi 3396 traktowanych mysią immunotoksyną BR96 i chimeryczną (Chi)BR96-RA przy różnych stężeniach, jak opisano w przykładzie III.

Figura 8 przedstawia procent hamowania włączania tymidyny do DNA komórek raka piersi 3630 traktowanych mysią immunotoksyną BR96 i chimeryczną (Ch)BR96-RA przy różnych stężeniach, jak opisano w przykładzie ΠΙ.

Przykład I. Wytwarzanie monoklonalnego przeciwciała BR96.

Monoklonalne przeciwciało BR96 wytwarza się stosując technikę fuzji hybrydowej, opisaną wcześniej przez M. Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) supra i Yeh et al., Int. J. Cancer (1982) supra. W skrócie, trzymiesięczne myszy BALB/c uodporniono, stosując jako immunogen eksploatowane komórki hodowli gruczolakoraka piersi ludzkich, oznaczanego 3396 lub M 3396 (z gruczolakoraka piersi pochodzącego od pacjenta, hodowane w hodowli Oncogen, Seattle, Washington, St. Zjedn. Ameryki). Mysz otrzymała iniekcje w pięciu porcjach, przy pierwszych czterech porcjach, mysz otrzymywała jedną iniekcję dootrzewnowo i 1 iniekcję podskórną w czterech miejscach na ciele myszy. W piątej porcji mysz otrzymywała tylko jedną iniekcję dootrzewnowo. Łącznie w każdej porcji wstrzykiwano około 10⁷ komórek. W trzy dni po ostatnim szczepieniu usuwano myszy śledzionę i komórki śledziony zawieszano w pożywce hodowlanej RPMI.

168 700

Następnie komórki śledziony poddawano fuzji z komórkami szpiczaka myszy P3-X63-Ag 8.653 w obecności glikolu polietylenowego (PEG) i pozwolono na wzrost komórek we wgłębieniach płytki do mikromiareczkowania w selektywnej pożywce MAT, jak opisano w publikacji Yeh et al., supra [patrz Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 - 97 (1975) i Eur. J. Immunol., 6: 511 - 19 (1976)]. Mieszaninę zaszczepiono tak, aby utworzyła hodowle o małej gęstości, pochodzące od pojedynczych komórek lub klonów, powstałych w wyniku fuzji.

Supematanty z tych hodowli hybrydonowych poddawano następnie skriningowi, aby określić bezpośrednio aktywność wiązania z linią komórkową raka piersi 3396, i z linią komórkową fibroblastów uzyskaną na drodze biopsji skóry za pomocą próby ELISA, podobnej do opisanej w publikacji Donillard et al., Enzymo-Linked Immunosorbent Assay For Screening Monoclonal Antibody Production Using Enzyme - Laceled Second Antibody, Meth. Enzymol., 92:168-74(1983).

Zgodnie z tą próbą, antygen (z którym poddano skriningowi przeciwciało dla określenia jego reaktywności) unieruchomiono na płytkach do mikromiareczkowania i następnie inkubowano z supematantami hybrydonowymi. Jeśli supernatant zawierał pożądane przeciwciało, było ono wiązane z unieruchomionym antygenem i wykrywane przez dodanie konjugatu antyimmunoglobuliny z enzymem i podłoża przeciwciała enzymu, co prowadziło do dających się zmierzyć zmian gęstości optycznej. Podczas prowadzonych badań, komórki raka piersi lub kontrolne komórki fibroblastów umieszczono na płytce do hodowli tkankowej z 96 wgłębieniami (Coster Cambridge, MA) i inkubowano przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C (5% CO₂).

Komórki doprowadzono następnie do końcowego stężenia we wgłębieniu wynoszącego 0,5% za pomocą 100 μΐ świeżo przyrządzonego 1% aldehydu glutarowego i inkubowano w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym przemyto trzykrotnie 1 x roztworem solanki buforowanej fosforanem (PBS). Następnie komórki blokowano w ciągu 30 minut 5% białkiem surowicy bydlęcej (BSA) w PBS i ponownie przemyto trzykrotnie PBS. Następnie dodano supematanty z hodowli hybrydonowych w ilości 100 μΐ/wgłębienie, zawartość wgłębień inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej i komórki przemyto trzykrotnie PBS. Następnie dodano kozią antymysią peroksydazę chrzanową (Zymed, CA) rozcieńczoną w 0,1% BSA i PBS do stężenia 100 μΐ/wbiębienie. Mieszań inę reakcyj ną inkubowano al bo w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej albo w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C, po czym komórki przemyto trzykrotnie PBS. Następnie dodano a-fenylenadμuaminę (OPD) w ilości 100 μΙ/wgłębienie i płytki ibkubaμaao w ciemności w temperaturze pokojowej w ciągu 5-45 minut. Przeciwciała związane z komórkami wykrywano poprzez zmianę barwy we wgłębieniach, występującą w ciągu 10 - 10 minut. Reakcję przerwano dodatkiem 100 μl H2SOWwgłębianie i dokonano odczytu absanbabcji na automatycznym urządzeniu odczytującym Dynatech (Alexandria VA) Microelisa przy 490 nm.

Należy zauważyć, że próbę tę można przeprowadzić stosując nienaruszone komórki lub oczyszczone rozpuszczalne ekstrakty antygenowe lub komórkowe w postaci unieruchomiaaeco antygenu. Gdy jako antygen stosowano rozpuszczalny antygen lub ekstrakty komórkowe, antygen umieszczano początkowo na płytkach w ilości 50 μl/wnłębSeniw wPBS i płyiid z^rzed rozpoczęciem próby inkuboμono przez noc w temperaturze pokojowej. Gdy jako antygen stosuje się nienaruszone komórki, można je stosować świeże lub po unieruchomieniu. W każdym przypadku komórki umieszczano najpierw na płytkach w ilości 10⁴ komórek w 50 μl/wcłębiebie w pożywce hodowlanej i inkubawano przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C (5% CO 2).

W ten sposób wyselekcjonowano hybrydom wytwarzające przeciwciała wiązane przez linię komórkową raka piersi a nie przez komórki ludzkich fibrablastóμ i badano je w urządzeniu do sortowania komórek FACS na leukocytach krwi obwodowej (PBLS), jak opisano w przykładzie II. Hybrydomy ujemne wobec PBLS klonowano, ekspandowano in vitro i badano dalej pod kątem specyficzności przeciwciał. Hybrydomy wytwarzające przeciwciała reagujące z rakiem piersi ludzkiej ponownie klonowano, ekspandowano i wstrzykiwano pierwotnie uczulonym trzymiesięcznym myszom BALB/c, gdzie wzrastały powodując wodobrzusze.

168 700

Postępując w opisany wyżej sposób, uzyskano hybrydomy linii komórkowej BR96, klonowano i wstrzykiwano myszom w celu rozwinięcia się nowotworu powodujące wodobrzusze. Jak ujawniono poprzednio, hybrydomy BR96 zdeponowano w kolekcji ATCC. Monoklonalne przeciwciała BR96 oczyszczano z płynów wodobrzusza za pomocą chromatografii powinowactwa na unieruchomionym rekombinantowym białku A (Repligen, Cambridge, MA). Sklarowane płyny rozcieńczono równą objętością buforu wiążącego (1m fosforan potasowy, pH 8) i nanoszono na kolumnę z białkiem A, poprzednio zrównoważoną buforem wiążącym. Kolumnę obficie przemyto buforem wiążącym i następnie eluowano przeciwciało 50 milimolowym roztworem kwasu fosforowego, pH 3. Oczyszczoną frakcję zawierającą przeciwciało zobojętniono 1m roztworem Tris, pH 9, i następnie dializowano wobec roztworu soli buforowanego fosforanem. Oczyszczone BR96 odsączono wreszcie w warunkach jałowości i przechowywano w stanie schłodzonym lub zamrożonym.

Przykład II. Otrzymywanie i charakterystyka chimerycznego przeciwciała BR96 (ChiBR96)

Mysie/ludzkie przeciwciało chimeryczne BR96 według wynalazku (ChiBR96) wytwarza się stosując dwuetapowy protokół rekombinacji homologicznej jak opisali Fell i in., w Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 8507 - 8511 (1989).

Transfekcja DNA ludzkiego łańcucha ciężkiego

Mysią linię komórek hybrydoma BR96, ATCC nr HB10036 otrzymaną jak opisano powyżej, poddaje się transfekcji (8-10⁶ komórek/h γΙ/HC-D (fig. 1) (zdeponowano w Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, NrRL No. 18599) (Figura 15) za pomocą elektroporacji (Gene Pulsar; Biorad Laboratories, Richmonnd, CA) przy 250V, przy ustawieniu kapacytancji 960 gFd, w izotonicznym buforowanym fosforanami roztworze soli (PBS) i z oczyszczonym fragmentem restrykcyjnym Xbal o 6,2 kilozasady (30 μ/ml) wektora h y 1/HC-D. Po upływie 48 godzin komórki osadza się w 96-dołkowych płytkach przy 10⁴ komórek/dołek. Selekcję pod względem Neo^R prowadzi się w podłożu IMDM (GIBCO, Grand Island, NY) zawierającym 10% obj/obj płodowej surowicy bydlęcej (PBS) i antybiotyczny aminoglikozyd G418 (GIBCO) w stężeniu 2,0 mg/ml.

Wykrywanie wydzielonego przeciwciała stanowiącego ludzką IgH (Hu γ 1) za pomocą ELISA

Supematanty hodowli poddaje się screeningowi stosując kanapkowy test ELISA po upływie dwóch tygodni od transfekcji. Jako przeciwciało wychwytujące stosuje się kozie przeciwciało przeciw ludzkiej IgG, Fc-swoiste (CALTAG, San Francisco, CA) i jako przeciwciało do wykrycia związanej ludzkiej IgG stosuje się kozie przeciwciało α-ludzka IgG, Fc-swoiste, sprzężone z peroksydazą z chrzanu HRPO (CALTAG). Komórki z dołków HulgG pozytywnych subklonuje się za pomocą rozcieńczenia i rozcieńczeniowe klony poddaje screeningowi za pomocą ELISA w celu wykrycia ludzkiej IgG γ 1 uprzednio opisaną metodą. Klony zawierające ludzką IgG γ 1 poddaje się też screeningowi za pomocą ELISA w celu wykrycia mysiego łańcucha ciężkiego IgG3. Koziego przeciwciała przeciw mysiej IgG3 (Southern Biotechnology Assoc., Inc., Birmingham, AL) używa się też jako wychwytującego przeciwciała, a kozie przeciwciało przeciwmysie sprzężone z HRPO (Southern Biotechnology Assoc., Inc.) jest przeciwciałem zastosowanym do wykrycia mysiej IgG3.

Wybiera się jeden z klonów pozytywnych wobec ludzkiej IgG γ 1 i negatywnych wobec mysiej IgG 3 (Hu γ 1⁺, MuG3'). Otrzymuje on oznaczenie ChiBR96. Tę linię komórek hybrydoma chimerycznego pod względem łańcucha ciężkiego charakteryzuje się pod względem swoistości antygenowej na komórkach MCF-7 i co do poziomu ekspresji za pomocą ilościowego testu ELISA pod względem ekspresji ludzkiej IgG na komórkach MCF7. Linia komórek ChiBR96 przeprowadza ekspresję około 20 /OitiI pzzeciwciida stnnowiąeeoo antygenowo swoistą ludzką IgG.

Transfekcja DNA łańcucha lekkiego.

Hybrydoma ChiBR96 (8· 106 komórek) poddaje się transfekcji za pomocą elektroporacji, jak opisano powyżej, ale stosując (30 gg/ml) ludzki wektor rekombiaaatowy łańcucha lekkiego

168 700 pSV 2gpt/CK (NRRL No. B 18507) zawierający sekwencję łańcucha lekkiego K immunoglobuliny ludzkiej przedstawioną na fig. 2, przeprowadzony w postać liniową z użyciem HindIII. Po upływie 48 godzin komórki osadza się w 96-dołkowych płytkach przy 10⁴ komórek/dołek. Selekcję pod względem gpt prowadzi się w podłożu IMDM zawierającym 10% obj/obj PBS, hipoksantynę w stężeniu 15 gg/ml, ksantynę w stężeniu 250 gg/ml i kwas mikofenolowy (MA) w stężeniu 2,25 gg/ml.

Wykrywanie wydzielonego przeciwciała ludzkiego kappa (Hu K) za pomocą ELISA.

Supematanty hodowli poddaje się screeningowi z zastosowaniem kanapkowego testu ELISA, jak opisano powyżej, po upływie dwóch tygodni od transfekcji. Wychwytującym przeciwciałem jest kozie przeciwciało α-ludzkie K (CALTAG), a przeciwciałem stosowanym do wykrycia związanego ludzkiego K jest kozie HRPO-przeciwciało przeciw ludzkiemu K (CALTAG). Dołki zawierające ludzkie przeciwciało K subklonuje się za pomocą rozcieńczenia i poddaje screeningowi za pomocą ELISA w celu wykrycia ludzkiego lub mysiego łańcucha K. Koziego przeciwciała przeciw mysiemu K (Fischer Scientific, Pittsburgh, PA) używa się jako przeciwciała wychwytującego i koziego przeciwciała przeciw mysiemu K sprzężonego z HRPO (Fischer Scientific) używa się jako przeciwciała do wykrycia obecności mysiego łańcucha K. Jeden z klonów pozytywnych wobec ludzkiego, K, negatywnych wobec mysiego K, wybiera się do analizowania swoistości antygenowej na komórkach MCF-7 i co do poziomu ekspresji za pomocą ilościowego testu ELISA pod względem ekspresji ludzkiej IgG na komórkach MCF-7. Wybrano linię komórek swoistą wobec komórek MCF-7 i HuIgG+, MuIgG3', HuK+, MuK'. Otrzymuje ona oznaczenie: chimeryczne BR96 (ChiBr96).

Wyjściowa ekspresja ciężkiego i lekkiego łańcucha chimerycznego przeciwciała antygenowego swoistego BR96 (ChiBR96) wynosi około 25 gh/ml. W wyniku zastosowania czterech kolejnych nawrotów klonowania linii w miękkiej agarozie z nawarstwieniem króliczym przeciwciałem a HulgG w celu wykrycia komórek wydzielających największą ilość chimerycznego przeciwciała [Coffino i in., J. Celi. Physiol., 79. 429-440 (1972)] otrzymuje się linię komórek hybrydoma (ChiBr96) wydzielającą około 130 gg/ml chimerycznego przeciwciała. Hybrydoma ChiBR96 zdeponowano w ATCc 23 maja 1990 pod numerem depozytowym ATCC No. HP 10460.

Wiązanie ChiBR96.

Względne powinowactwo przeciwciała ChiBR96 i mysiego przeciwciała BR96 do antygenu nowotworowego na komórkach MCF-7 oznacza się za pomocą testu kompetycyjnego wiązania ELISA [Hellstrom i in., Cancer Res., 50, 2449 - 2454 (1990)]. Mówiąc krótko, przylegającą linię komórek MCF-7 obarczoną antygenem nanosi się na 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania przy 3-104 komórek/dołek i pozwala na wzrost do zlewania się w ciągu około 3-4 dni. Podłoże wzrostowe odrzuca się i komórki utrwala 0,5% aldehydem glutarowym w PBS (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) przy 100 gl/dołek w ciągu 30 minut. Odrzuca się aldehyd glutarowy i płytkę przemywa łagodnie PBS trzy razy. Następnie zablokowuje się płytkę buforem wiążącym (0,1 % BSA w DNEM) przy 200 gl/dołek w ciągu godziny, albo przechowuje przez nieokreślony okres czasu w temperaturze -20°C. Bufor wiążący odrzuca się i do dołków dodaje się próbki i standardy. Płytki przykrywa się i inkubuje przez noc w temperaturze 4°C. Próbki i standardy odrzuca się i płytki przemywa PBS trzy razy. Do dołków dodaje się koniugat HRP rozcieńczony 1% surowicą końską w PBS, 100 gl/dołek i inkubuje w ciągu godziny w temperaturze 37°C. ELISA prowadzi się z chromagenem 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyną (tMb) (Genetic Systems, Seattle, WA) w buforze cytrynianowym. Rozwijanie się zabarwienia zatrzymuje się 3N H2SO4 i płytkę odczytuje na czytniku Titertek Microplate przy 450 nm. W tym badaniu ustala się, w jakim rozmiarze biotynylowane przeciwciało ChiBR96 (0,3 gg/ml) oddziaływuje kompetencyjnie albo z nieznakowanym ChiBR96 albo ze znakowanym mysim przeciwciałem monoklonalnym BR96 wobec antygenu. Związane biotynylowane przeciwciało ChiBR96 wykrywa się z użyciem kompleksu awidyna-HRPO i oznacza standardowymi odczynnikami ELISA.

168 700

Jak to przedstawiono na fig. 3, zachodzenie na siebie 2 krzywych wiązania wskazuje na to, że dwa przeciwciała mają tę samą swoistość i względne powinowactwo do antygenu nowotworowego.

Przykład III. Charakterystyka przeciwciała ChiBR96 i fragmentów F(ab')₂ BR96

CytctckeyozócCć nie zmodyfikowanego ChiBR96 i fragmentów F(ab ')₂

Na żywe komórki, w zawiesinie, z antygenowo pozytywnych pod względem BR96 linii carcrócma 3396, 2987 i MCF-7, działa się ChiBR96 i fragmentami F(ab’)2, otrzymanymi jak opisano w przykładzie II w celu określenia cytctcksyozócści tych przeciwciał w porównaniu z moncklcóalóym przeciwciałem BR96 według wynalazku. Testy cytotoksyczócśor wykonuje się w badaniu FACS. Wyniki tych eksperymentów przedstawione są na fig. 4-6 jako procentowe zabicie komórek wobec stężenia przeciwciała w gg/ml.

Figury 4 i 6 pokazują, że chimeryczne przeciwciało BR96 i fragmenty F(ab')2 BR96 (IgG3) są podobne do przeciwciała mcóoklonalóegc BR96 pod względem cytotoksyczności wobec komórek 3396 i MCF-7. Fig. 5 wykazuje, że wpływ cytotoksyczny na komórki 2987jest znacznie mniejszy niż na komórki innych raków sutka (Fig. 4 i 6). Wyniki te sugerują, że wyższy stosunek wiązania jest ważny pod względem zabijania przez te przeciwciała i/lub, że różne komórki nowotworowe mogą mieć odmienną wrażliwość na zabijanie przez te przeciwciała. Wyniki te objaśniają fakt, że przeciwciało ChiBR96 i fragmenty F(ab ')2 są cytotoksyczne jako takie, to jest w postaci nie sprzężonej, a także objaśniają, że cytotcksyczóość przeciwciał BR96 nie jest zależna od regionu Fc.

Internalizacja ChiBR96.

Internalizację przeciwciała ChiBR96 w komórkach carc^oma ocenia się w porównaniu z internalizacją przeciwciała mcncklcnalnegc BR96. Przeciwciała sprzęga się z toksyną-łańcuchem A rycyny z utworzeniem immuóotokeyó ChiBR96-RA (1-4 łańcuchów A rycyny na cząsteczkę przeciwciała) i BR96-RA (1-2 łańcuchów A rycyny na cząsteczkę przeciwciała). Mierzy się internalizację przez linię komórek drcmoma 3396 i 3630 stosując test zahamowania włączania tymidyny.

Wykresy procentowego zahamowania włączania tymidyny wobec stężenia immuóotcksyóy dla każdej badanej linii komórek są przedstawione na fig. 7 i 9. Fig. 7 przedstawia procentowe zahamowanie włączania tymidyny przez linię komórek raka sutka 3396 spowodowane internalizacją ChiBR96-RA i BR96-RA. Jak przedstawiono na wykresie, ChiBR96 internal^wane jest podobnie do BR96 i okazuje się co najmniej tak skuteczne jak BR96 w zabijaniu komórek nowotworowych. Podobne wyniki otrzymuje się z linią komórek raka sutka 3630 (fig. 8).

Aktywność ADCC przeciwciała ChiBR96.

Oznaczenia aktywności ADCC ChiBR96 dokonuje się tak jak opisano poniżej dla oznaczania aktywności przeciwciała mcnckloóalnego.

Oznaczenia aktywności ADCC przeciwciała moncklonalnego BR96 dokonuje się sposobem opisanym przez Hellstroma i in., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 1499 - 1502 (1985). Mówiąc krótko, stosuje się test szybkiego uwalniania ⁵¹Cr z pomiarem uwalniania ⁵¹Cr, jak opisali Cerrotmi i in., Adv. Immunol., 18, 67 - 132 (1974), świadczącego o lizie komórek nowotworowych (cytctckeyczncCć). Limfocyty krwi obwodowej od zdrowych osobników ludzkich oddziela się na Fiooll-Hypaque [Hellstrom i in., Int. J. Cancer, 27,281 - 285 (1981)] w celu dostarczenia komórek efektorowych odpowiadających 5% reaktywności naturalnych komórek oytotcksyoznych wobec komórek SK-MEL-28. 10⁶ komórek znakuje się przez inkubację ze 100 gCi (1 Ci = 37 BGq) 51Cr w ciągu 2 godzin w temperaturze 37°C, po czym przemywa się je trzykrotnie i ponownie zawiesza w podłożu. Znakowane komórki osadza się (2· 10 Komórek/dołek w 20 gl) w płytkach do mikromiareozkcwaóra z dnami dołków w kształcie litery V (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA).

Następnie dodaje się oczyszczone przeciwciało BR96 (10 1 gg/ml i 0,1 gm/ml , a po nim limfocyty (2.10 5/dołek, w 100 gl). Mieszaniny inkubuje się w ciągu 2 do 4 godzin, po czym płytki odwirowuje się przy 400 x g. Usuwa się supematanty i mierzy radioaktywność w 100 gl próbkach za pomocą licznika promieniowania γ. Na grupę wypadają dwa powtórzenia, rozrzut między nimi jest mniejszy od 10%. Przeprowadza się szereg prób krzyżowych, w których

168 700 bada się komórki docelowe raka płuc (lub okrężnicy) i czerniaka równolegle przeciwciałem monoklonalnym BR96 z przeciwciałem mpnoklpnalnym MG-22 przeciw czerniakowi [Hellstrom i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,1499 -1502 (1985)], które nie wrąże się z większością komórek carcinoma. Włączone kontrole obejmują inkubację samych komórek docelowych, albo z limfocytami bądź z samym przeciwciałem mpnpklρnalnzm oddzielnie.

Uwalnianie spontaniczne definiuje żięjako impulsy na minutę (cpm) uwolnione od podłoża przez komórki docelowe nie eksponowane ani na przeciwciała, ani na limfocyty, a uwalnianie ogółem jako ilość impulsów na minutę dla komórek docelowych poddanych lizie osmotycznej na końcu badania. Procent cytotpkżzczności oblicza się jako:

uwalnianie w grupie badanej - uwalnianie spontaniczne uwalnianie ogółem - uwalnianie spontaniczne

Komórki zfektorowz charakteryzuje się przez ocenę ich wrażliwości na inkubację z przeciwciałem przeciw markerowi powierzchniowemu Leu-11 b i dopełniaczem świnki morskiej stosując sposoby postępowania opisane przez Hellstroma i in., w Monoclonal Anfibodies and Cancer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series, wyd. Reisfeld & Sell, Liss, New York, tom XXVII, str. 149 - 164 (1985). Przeprowadza się to w celu pomiaru ekspresji markera Leu-11b charakteryzującego naturalne komórki cztotpkszczne (NK) i wyraża jako ADCC, w której pośredniczą limfocyty, przeciw ludzkim komórkom czerniaka w obecności przeciwciała mρnpklpnalnego BR96. Badanie prowadzono z zastosowaniem następujących linii komórek: linie komórek raka sutka 3396, 3630 i 3680 (Oncogm, Seanle, WA) i MCF-7 (ATCC No. HTB22); linię komórek raka jajnika 3633-3 (Oncogen, Szattlz, WA), oraz linie komórek raka płuc 2987, 3655-3 i 2981 (Oncogm, Seattle, WA). Wyniki przedstawione są w poniższej' tabeli 1 dla różnych stężeń przeciwciała.

Tabela 1

Aktywność ADCC ChiBR96

Linia komórek	Prczciwciałp	NK	Stężenie przeciwciała (ąg/ml)
10	1	0,1	0,01	0,001
Rak sutka 3396	BR96	28	86	74	58	27	25
	ChiBR96		88	79	60	34	26
MCF-7	BR96	16	82	69	54	17	15
	ChiBR96		90	82	57	25	17
MCF-7	BR96	22	73	69	48	22	22
	ChiBR96		76	70	57	33	26
3630	BR96	30	69	64	42	30	34
3680	ChiBR96		69	56	42	36	36
	BR96	13	73	67	58	34	38
	ChiBR96		70	71	61	39	30
Rak jajnika	BR96	20	92	90	64	28	23
3633-3	ChiBR96		88	88	54	43	29
Rak płuc	BR96	11	51	57	41	9	7
2987	ChiBR96		69	65	51	28	15
	BR96	4	49	37	0	0	0
3655-3	ChiBR96		39	35	12	6	5
	BR96	3	4	3	3	4	5
2981	ChiBR96		5	4	3	4	4

168 700

Wyniki przedstawione w tabeli 1 dla różnych stężeń przeciwciała wskazują, że ChiBR96 pośredniczy w aktywności ADCC w podobnym rozmiarze co BR96. Aktywność ADCC można obserwować przy stężeniach przeciwciał niższych, niż stężenia, w których przeciwciało ChiBR96 jest cytotoksyczne jako takie. Gdy stosuje się samo przeciwciało ChiBR96 jako kontrolę, daje ono 0% zabicia w badanych stężeniach. Aktywność ADCC stwierdza tylko w przypadku linii komórek wiążących przeciwciało BR96.

Zdolność ChiBR96 do pośredniczenia w cytotoksyczności, w której pośredniczy dopełniacz.

Określenia zdolności ChiBR96 do zabijania komórek nowotworowych w obecności surowicy ludzkiej jako źródła dopełniacza (CDC) stosując linie komórek raka sutka 3396, MCF-7, 3630 i 3680; linię komórek raka jajnika 3633-3, oraz linie komórek raka płuca 3655-3, 2987 i 2981. Tabeli 2 przedstawia wyniki.

Tabela 2

Aktywność CDC ChiBR96

Linia komórek	Przeciwciało	Stężenie przeciwciała (ptg/ml)
10	1	0,1	0,01
Rak sutka 3396	BR96	100	99	78	13
	ChiBR96	86	92	13	2
MCF-7	BR96	94	100	63	2
	ChiBR96	92	83	2	0
3630	BR96	94	100	82	9
	ChiBR96	86	86	33	9
3680	BR96	100	100	19	7
	ChiBR96	87	100	5	9
Rak jajnika 3633 -3	BR96	98	98	21	0
	ChiBR96	100	100	26	1
Rak płuca 3655-3	BR96	91	22	0	0
	ChiBR96	46	3	0	0
2987	BR96	100	100	1	0
	ChiBR96	100	43	0	0
2981	BR96	0	3	3	2
	CHiBR96	1	1	2	10

Jak przedstawiono w tabeli 2, ChiBR96 wywiera działanie cytotoksyczne (CDC) podobne do działania BR96 w obecności surowicy ludzkiej zawierającej dopełniacz. BR96 i ChiBR96 nie są cytotoksyczne w żadnym ze stężeń. Surowica ludzka również nie jest cytotoksyczna.

Powyższe dane wykazują, że pełne przeciwciało BR96 i chimeryczne przeciwciało są intemalizowane przez komórki carcinoma, z którymi się wiążą, są cytotoksyczne jako takie w postaci nie zmodyfikowanej i wykazują aktywność ADCC i CDC wobec komórek przeprowadzających ekspresję większej ilości epitopów.

Przykład IV. Lokalizacja i biodystrybucja przeciwciał BR96.

W celu ustalenia charakterystyk biodystrybucji zastosowano znaczone jodem promieniotwórczym monoklonalne przeciwciała BR96. Podawanie rozpoczęto w 24 godziny po wszczepieniu nowotworu, w dniu 2. Zarówno BR96, jak i kontrolny MAbs podawano w tej samej dawce i według tego samego planu, jakkolwiek w niektórych przypadkach następowały zmiany

168 700 momentu zapoczątkowania terapii. Dawkę leczniczą w 0,2 ml PBS podawano dożylnie do żyły ogonowej myszy. Normalny plan obejmował podawanie dawki raz na trzy dni, ogółem 5 dawek (Q3Dx5). W dniu 19 i 21 od wszczepienia nowotworu H2987 w początkowym doświadczeniu przeprowadzono dodatkowe dwa wstrzyknięcia. W szczególności, do lokalizacji w nowotworze i różnych innych organach zastosowano całe IgG 3, BR96, przeciwciało chimeryczne i fragment F(ab')2, wraz z odpowiednimi przeciwciałami kontrolnymi (całe mnanklnnalne przeciwciało FA6, chimeryczne 96,5 i chimeryczne 96,5 F(ab')2·

Przed doświadczalną lokalizacją zwierzętom wstrzyknięto komórki nowotworowe postąpiwszy jak w przykładzie VIII, w celu przeprowadzenia badań wpływu terapii. Pozwolono, by nowotwory wzrastały w ciągu około 2 tygodni. Po tym okresie czasu 100 μg przeciwciała BR96 lub fragmentu poddano znaczeniu ^I25I z użyciem 10 μg Iodogen przez 10 minut, w temperaturze pokojowej, zgodnie z zaleceniami producenta. Kontrolne przeciwciała lub fragmenty poddano znaczeniu ¹³¹J z użyciem tej samej metody. Te znaczone przeciwciała rozcieńczono odpowiednimi nie znaczonymi przeciwciałami do uzyskania dawki stosowanej w terapii doświadczalnej.

Specyficzne i niespecyficzne przeciwciała zmieszano i podano dożylnie razem, do żyły ogonowej myszy. Po z góry określonym czasie wybrano losowo myszy z grupy, znieczulono je, wykrwawiono przez splot oczodołowy i uśmiercono. Usunięto różne tkanki, zważono je i poddano zliczaniu przy użyciu licznika zdolnego do rozróżnienia sygnałów od dwóch promieniotwórczych izotopów jodu. Na podstawie tych danych obliczono procentową wstrzykniętą dawkę i procentową wstrzykniętą dawkę na gram. Dane zgromadzone dla 24 punktu czasowego doświadczenia lokalizacyjnego zestawiono w tabeli 3.

Tabela 3

Zestawienie wyników prób biodystrybucji

	Przeciw- ciało	Dawka (mg)	Linia komórek nowotworowych
Krew	Nowotwór	Wątroba	Śledziona	Nerki	Płuca
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1)	BR96-G3	1,0	H2987	10,2	6,8	2,2	1,0	3,4	4,7
	FA6	1,0		6,3	2,1	2,1	1,6	2,4	3,2
2)	BR96-G3	0,3	H2707	9,0	7,0	1,8	1,6	2,7	3,7
	FA6	0,3		5,9	2,7	2,0	1,8	2,2	2,8
3)	ChiBR96	0,32	H2707	7,2	8,2	1,4	1,6	2,0	3,5
	Chi96, 5	0,32		7,5	2,3	1,8	1,6	1,9	3,5
4)	F(ab’)2		H2707
	BR96	0, 65		<0,3	<0, 3	<0,3	<0,3	<0,3	<0, 3
	96,5	0, 65		<0,3	<0, 3	<0,3	<0,3	<0,3	<0, 3

Jedyną tkanką wykazującą znaczące różnice między specyficznym i niespecyficznym przeciwciałem jest nowotwór. Wszystkie inne badane tkanki wykazały w przybliżeniu równy pobór specyficznych i niespecyficznych przeciwciał. Jedynym może wyjątkiem jest niższy poziom we krwi niespecyficznego przeciwciała FA6. Wskazuje to na przyspieszone oczyszczanie krwi z tego przeciwciała. Jednakże różnica między poziomem specyficznych i niespecyficznych przeciwciał w nowotworze jest większa niż różnica w poziomie fA6 i BR96 we krwi.

168 700

Z danych w tabeli 3 wynika także, że procentowa dawka obecna w danym organie jest stała, bez względu na wielkość dawki podanej. Wskazywałoby to zatem na fakt, iż ilość przeciwciał w nowotworze jest wyższa, gdy poda się wyższą dawkę. Ponadto nie ma widocznej różnicy między dwiema liniami nowotworowymi pod względem poboru przeciwciał specyficznych i niespecyficznych.

Z tabeli 3 wynika również, że F(ab')2 jest usuwana z organizmu zwierzęcia znacznie szybciej niż IgG3 czy chimeryczne BR96. Może to tłumaczyć spadek skuteczności fragmentu w porównaniu ze skutecznością całego przeciwciała w terapii. Tak więc wszelkie działanie przeciwnowotworowe fragmentu musi być wywierane bardzo szybko i zachodzić w krótkim okresie czasu, przed wydaleniem fragmentu.

Chimeryczne bR96 ulega lokalizacji na poziomie porównywalnym z IgG3 BR96. W porównaniu z kontrolnym przeciwciałem chimerycznym wyższa ilość znajdowała się jedynie w nowotworze. Sugeruje to, iż zwiększenie skuteczności chimerycznego przeciwciała w porównaniu z mysim BR96 wynika ze stałego regionu podstawienia u człowieka. Równie ważne jest to, że wydaje się, iż stały region podstawienia u człowieka nie wpływa na zdolność chimerycznego przeciwciała do umiejscowienia się w nowotworze i nie oddziaływuje niekorzystnie na jego biodystrybucję.

Reasumując, IgG3 i inne postacie BR96 są zdolne do specyficznego umiejscowienia się w miejscu występowania nowotworu. Co więcej, zarówno lokalizacja, jak i działanie przeciwnowotworowe wystąpiły w tych wstępnych doświadczeniach przy podobnych dawkach. Pośrednim dowodem lokalizacji fragmentów F(ab ')2 jest działanie przeciwnowotworowe fragmentów w terapii doświadczalnej. Działanie takie musi wystąpić przed upływem 24 godzin.

168 700

Fig. 1

Fig. 2

168 700

Fig.3 % martwych docelowa linia komórek komórkowa H3396

Fig. A

168 700 % martwych docelowa linia komdrek komórkowa H2987

Fig. 5 % martwych docelowa linia

stężenie przeciwciała (xjg/ml)

Fig. 6

168 700 % hamowania

H3396

steżenie przeciwciała (mcg/ml)

Fig. 7

Fig. 8

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,.50 zł

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób wytwarzania nowego ludzko-mysiego chimerycznego przeciwciała monoklonalnego BR96, znamienny tym, że hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod nr HB 10036 transfekuje się ludzkim wektorem gamma 1/HC-D kodującym ludzki ciężki łańcuch IgG gamma 1, hodowlę supematantów poddaje się skriningowi, wyselekcjonowuje się hybrydomę i hybrydomę tę wytwarzającą ciężkołańcuchowe ludzkie przeciwciała IgG gamma 1 transfekuje się ludzkim wektorem docelowym pSV 2gpt/CK kodującym ludzki lekki łańcuch K, otrzymuje się wyselekcjonowaną hybrydomę wydzielającą ludzko-mysie chimeryczne lekko i ciężko łańcuchowe przeciwciało monoklonalne oznaczone ChiBR96 zdeponowaną w AtCc pod nr HB 10460.