JP6758388B2 - 抗−ｃｄ４３抗体およびその癌治療用途 - Google Patents

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Description

ＣＤ４３の細胞外領域に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片、抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌治療用組成物、ＣＤ４３の細胞外領域に結合する抗−ＣＤ４３抗体を有効成分として含む癌幹細胞阻害用組成物、および癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法が提供される。
ＣＤ４３は、赤血球を除いた多くの造血細胞で発現する細胞表面蛋白質である。ヒトＣＤ４３、ｓｉａｌｏｐｈｏｒｉｎまたはｌｅｕｋｏｓｉａｌｉｎとして知られている、は、２３５個のアミノ酸から構成されたｍｕｃｉｎｅ−ｌｉｋｅ細胞外ドメイン、２３個のアミノ酸からなる膜透過ドメイン、そして１２３個のアミノ酸から構成された細胞質内ドメインからなり、関連する遺伝情報は１つのエクソンに暗号化されている。ヒトＣＤ４３の細胞外ドメインには多くのセリン（４６残基）とトレオニン（４７残基）アミノ酸があり、そのアミノ酸の大部分がＯ−ｌｉｎｋｅｄ糖鎖（Ｏ−糖鎖）を保有している。付加的に、ＣＤ４３にＮ−糖鎖も連結されている。Ｏ−糖鎖の構造は、細胞の類型によって差が大きいことが知られている。ＣＤ４３は、３７８個の塩基対からなるイントロンでエクソンを２つに区分することができ、２番目のエクソンに全体転写物質情報が暗号化されている。
ＣＤ４３は、１つのＮ−糖鎖を含めて約４０ｋＤａに達する前駆物質に合成され、連続的な成熟糖化過程を経て１１５ｋＤａ〜２００ｋＤａに達する物質に転換される。厳格に調節される転写後の糖化過程は、類型によって特徴的な分子量同型蛋白質を形成し、これは、細胞の類型によって異なって発現できる。
ＣＤ４３の糖化抗原決定部位は、最近、白血球に制限された特異的標識子として知られており、血液癌腫標識子としての特異的な有用性が究明された。その理由から、多くの研究において、ＣＤ４３糖化抗原決定部位に結合する抗体の診断または治療目的の使用可能性が探られた。ＣＤ４３を認知するげっ歯類単クローン抗体は、ＣＤ３４過発現系統標識子の陰性骨髄造血幹細胞（Ｂａｚｉｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ，８７（４）：１２７２−８１）とヒトＴ−リンパ芽球性細胞（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．
（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２７６８６−９５）で細胞自滅死を誘導することが知られた。しかし、このような抗体は、ほとんど成熟した（非癌腫）造血細胞で発現するＣＤ４３の細胞外ドメインに位置した糖鎖抗原決定部位と反応するため、癌細胞の検出または治療に効果的でない。したがって、血液癌腫の診断、追跡、治療のために、より改善されたＣＤ４３糖化抗原決定部位結合物質の開発が必要である。
一方、癌の発生と再発に異常な幹細胞が位階的に（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ）関与するという癌幹細胞（ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）の仮説が知られている。
人体のすべての組織は、器官特有の幹細胞（ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）に起源する。器官特有の幹細胞は自己再生（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）可能であり、各器官を構成するすべての細胞に分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）する能力を有している。このような器官特有の幹細胞は、分化の形態が主に定められた器官内の細胞形態にのみ分化できる点で、胚芽幹細胞と区別される。
癌幹細胞の仮説は大きく２つの構成要素からなるが、第一、腫瘍は組織の幹細胞から発生することと、第二、その細胞から発生して構成された腫瘍は幹細胞の基本特性を有していなければならないことと、である。
癌幹細胞は、無制限の再生能力を有する癌細胞であって、免疫抑制ネズミに注入した時、高効率的に腫瘍を生成することができ、該形成された腫瘍では、原発腫瘍が有していた固有の異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）がよく表現される細胞と定義される。
癌幹細胞の仮説は最近、幹細胞生物学の発達に伴ってより具体化され始めた。１９９７年、急性骨髄性白血病で癌幹細胞となり得る一端の細胞を免疫抑制ネズミに移植してヒトの白血病がネズミで再現されることが発表されるにつれ、癌幹細胞の仮説は一歩進むようになった（Ｂｏｎｎｅｔ Ｄ，Ｄｉｃｋ ＪＥ；Ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｓ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ａｓ ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｔｈａｔ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ１９９７；３：７３０−７）。
悪性腫瘍の示す多様な異質性が幹細胞の多様な分化性と一致し、多くの標的治療にもかかわらず、絶えず発現する癌細胞の薬物抵抗性も幹細胞の基本特性と一致する。癌幹細胞は、自己複製能力（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）によって新しい癌腫塊を形成し得ることから、癌幹細胞でない腫瘍細胞を手術で完全に除去し抗癌化学治療を施しても、癌幹細胞が残っていれば癌は再び再発する。
したがって、癌を完全に治療するためには、癌幹細胞を阻害または除去する技術の開発が求められる。
他の例は、ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む固形癌の治療用薬学組成物を提供する。
他の例は、ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を固形癌の治療を必要とする対象（患者）に投与する段階を含む固形癌の治療方法を提供する。
他の例は、ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の固形癌の治療のための用途を提供する。
前記抗原決定部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１のアミノ酸配列を含むＣＤ４３の細胞外領域内の連続する６〜９個のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、先に説明した抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を含むことができる。
前記固形癌の治療のための薬学組成物、方法、および用途は、癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞の阻害効果を有することを特徴とするものであってもよい。一例において、前記固形癌は、胃癌であってもよく、前記血液癌は、白血病であってもよい。
他の例は、ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害用薬学組成物を提供する。
他の例は、ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌患者、例えば、固形癌患者に投与する段階を含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害方法を提供する。
他の例は、ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害のための用途を提供する。
前記抗原決定部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１のアミノ酸配列を含むＣＤ４３の細胞外領域内の連続する６〜９個のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、先に説明した抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を含むことができる。一例において、前記固形癌は、胃癌であってもよい。
他の例は、ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片と癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞が結合された接合体を提供する。他の例は、ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を癌試料、例えば、固形癌試料または癌患者、例えば、固形癌患者に投与する段階を含む抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片と癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞が結合された接合体を生成する方法を提供する。前記接合体またはこれを生成する方法は、癌の治療だけでなく、多様な臨床的、診断的、および／または実験的目的で使用可能である。
他の例は、前記ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位を含む固形癌治療剤のスクリーニングのための製剤を提供する。他の例は、前記ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位を用いる固形癌治療剤のスクリーニング方法を提供する。他の例は、前記ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位の固形癌治療剤のスクリーニングのための用途を提供する。前記抗原決定部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１のアミノ酸配列を含むＣＤ４３の細胞外領域内の連続する６〜９個のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。前記のようにスクリーニングされた固形癌治療剤は、癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞の阻害効果を有することを特徴とするものであってもよい。一例において、前記固形癌は、胃癌であってもよい。
他の例は、前記ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位を含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害剤のスクリーニングのための製剤を提供する。他の例は、前記ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位を用いる癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法を提供する。他の例は、前記ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位の癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害剤のスクリーニングのための用途を提供する。前記抗原決定部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１のアミノ酸配列を含むＣＤ４３の細胞外領域内の連続する６〜９個のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。一例において、前記固形癌は、胃癌であってもよい。
他の例は、新規な抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を提供する。前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合するものであってもよい。前記抗原決定部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１のアミノ酸配列を含むＣＤ４３の細胞外領域内の連続する６〜９個のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ；ＶＨ）および軽鎖可変領域（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ；ＶＬ）を含む。
前記重鎖可変領域は、Ｎ−末端からＣ−末端方向に順次に、第１相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）（ＣＤＲ１Ｈ）、第２ＣＤＲ（ＣＤＲ２Ｈ）、および第３ＣＤＲ（ＣＤＲ３Ｈ）を含むことができる。
一例において、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域の必須成分として、ＧＹＸ１ＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０；Ｘ１は、すべてのアミノ酸の中から選択されたものであってもよいし、例えば、ＦまたはＹであってもよい）のアミノ酸配列（例えば、ＧＹＦＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）またはＧＹＹＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２））を含むＣＤＲ１Ｈ、ＲＩＮＰＮＸ２ＧＤＳＦＹＮＱＫＦＸ３Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３；Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立にすべてのアミノ酸の中から選択されたものであってもよいし、例えば、Ｘ２は、ＮまたはＳであり、Ｘ３は、ＱまたはＫである）のアミノ酸配列（例えば、ＲＩＮＰＮＮＧＤＳＦＹＮＱＫＦＱＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４）、ＲＩＮＰＮＳＧＤＳＦＹＮＱＫＦＱＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）、ＲＩＮＰＮＮＧＤＳＦＹＮＱＫＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）、またはＲＩＮＰＮＳＧＤＳＦＹＮＱＫＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７））を含むＣＤＲ２Ｈ、およびＥＧＹＹＧＧＲＧＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３Ｈを含むことができる。
前記軽鎖可変領域は、Ｎ−末端からＣ−末端方向に順次に、第１ＣＤＲ（ＣＤＲ１Ｌ）、第２ＣＤＲ（ＣＤＲ２Ｌ）、および第３ＣＤＲ（ＣＤＲ３Ｌ）を含むことができる。
一例において、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域の必須成分として、ＲＴＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１Ｌ；Ｘ４ＴＸ５ＲＬＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０；Ｘ４およびＸ５は、それぞれ独立にすべてのアミノ酸の中から選択されてもよいし、例えば、Ｘ４は、Ｎ、Ｑ、またはＡであり、Ｘ５は、ＳまたはＡである）のアミノ酸配列（例えば、ＮＴＳＲＬＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１、ＮＴＡＲＬＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２）、ＱＴＳＲＬＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３）、またはＡＴＳＲＬＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４））のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２Ｌ；およびＱＱＳＮＭＦＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３Ｌを含むことができる。
他の例は、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片、および薬学的に許容可能な担体を含む癌の予防および／または治療用薬学組成物を提供する。
他の例は、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量を癌の予防および／または治療を必要とする患者に投与する段階を含む癌の予防および／または治療方法を提供する。
他の例は、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の癌の予防および／または治療、または抗癌剤の製造に用いるための用途を提供する。
一具体例において、前記癌の予防および／または治療用薬学組成物、方法、および用途において、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、単独有効成分として提供されたり、抗癌剤などの細胞毒性物質と併用投与されたり、抗癌剤などの細胞毒性物質と接合された接合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；ＡＤＣ）形態で提供される。
他の例は、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を用いて試料における癌細胞の検出方法を提供する。前記検出方法は、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を試料に接触させる段階と、前記試料における抗原−抗体反応を検出する段階とを含むことができる。
他の例は、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を暗号化する核酸分子を提供する。
他の例は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供する。前記組換えベクターは、前記核酸分子を宿主細胞で発現させるための発現ベクターとして使用できる。
他の例は、前記核酸分子または前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。前記組換え細胞は、前記核酸分子または前記組換えベクターを宿主細胞に形質転換させて得られたものであってもよい。
他の例は、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。前記製造方法は、前記核酸分子を宿主細胞で発現させる段階を含むことができる。前記発現させる段階は、前記組換え細胞を培養する段階を含むことができ、任意に、前記得られた細胞培養物から抗体を分離および／または精製する段階を追加的に含むことができる。
一具体例において、前記製造方法は次を含む：
（ａ）前記核酸分子または前記組換えベクターで形質転換された組換え細胞を準備する段階と、
（ｂ）前記核酸分子の十分な発現のための条件および／または期間で前記組換え細胞を培養する段階と、
（ｃ）前記（ｃ）段階で得られた培養物から抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を分離および／または精製する段階。
前記のように、癌を完全に治療するためには、癌幹細胞を阻害または除去する技術の開発が必要であり、そのためには、癌幹細胞を他の細胞から分離できる癌幹細胞標識子を選定する過程が必要である。
本発明において、ＣＤ４３が癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞表面に発現することが最初に提案される。ＣＤ４３は、赤血球を除いた大部分の白血球と造血幹細胞、血小板に制限的な特定の白血球マーカーとして知られていたが、癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞に発現するという事実はまだ知られていない。
また、ＣＤ４３の細胞外領域のうち特定部位を特異的に認識および／または結合する抗−ＣＤ４３抗体が癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害効能を有することが提案される。
ＣＤ４３（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ４３）は、Ｌｅｕｋｏｓｉａｌｉｎまたはｓｉａｌｏｐｈｏｒｉｎとも呼ばれ、赤血球を除いた大部分の造血細胞表面に発現する主要膜通過蛋白質（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。前記ＣＤ４３は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）などの霊長類、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）などのげっ歯類などを含む哺乳類に由来するものであってもよい。例えば、前記ＣＤ４３は、ヒトＣＤ４３（例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ５１９４９．１（遺伝子（ｍＲＮＡ）：Ｍ６１８２７．１）、ＮＰ＿００１０２５４５９．１（遺伝子（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００１０３０２８８．１）、ＮＰ＿００３１１４．１（遺伝子：ＮＭ＿００３１２３．３）など）、マウスＣＤ４３（例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０３２８９９．１（遺伝子：ＮＭ＿００１０３７８１０．１）、ＮＰ＿０３３２８５．１（遺伝子：ＮＭ＿００９２５９．４）など）などであってもよい。この例において、前記ＣＤ４３は、ヒトＣＤ４３（蛋白質：ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ５１９４９．１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）；遺伝子（ｍＲＮＡ）：Ｍ６１８２７．１）であってもよい。
本発明の一例は、ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む固形癌の治療用薬学組成物を提供する。
他の例は、ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を固形癌の治療を必要とする患者に投与する段階を含む固形癌の治療方法を提供する。
他の例は、ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の固形癌の治療のための用途を提供する。
前記ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害活性を示すことを特徴とする。
したがって、本発明の他の例は、ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害用薬学組成物を提供する。
他の例は、ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌患者、例えば、固形癌患者に投与する段階を含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害方法を提供する。
他の例は、ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害のための用途を提供する。
本明細書において、別途の定義がない限り、前記ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１のアミノ酸配列を含むＣＤ４３の細胞外領域内の連続する６〜９個のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味するものであってもよい。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１：Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ
前記抗原決定部位は、ＣＤ４３蛋白質の細胞外領域に位置しかつ、正常状態では外部環境に露出していないが、細胞が癌細胞化されたり癌幹細胞化されると外部に露出するものであってもよい。したがって、前記抗原決定部位を特異的に認識したり、および／またはこれに特異的に結合する抗体または抗体の抗原結合断片は、癌細胞および／または癌幹細胞を特異的に標的化および／または阻害するものであってもよい。
前記抗原決定部位が位置するＣＤ４３の細胞外領域は、ＣＤ４３（ＡＡＡ５１９４９．１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）の７３番目から８１番目までのアミノ酸部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４）であってもよい。したがって、前記抗原決定部位は、ＣＤ４３（ＡＡＡ５１９４９．１）中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４内のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１を含む連続する６個〜９個のアミノ酸配列部位であってもよい。
前記抗原決定部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１〜１３４からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであってもよいし、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４のアミノ酸配列を有するものであってもよい：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２：Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３：Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４：Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ
本発明の抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、先に説明した抗原結合部位を認識したり、これに特異的に結合するすべての抗体または抗原結合断片からなる群より選択された１種以上であってもよい。
本明細書において、用語「ＪＬ−１」は、ＣＤ４３または前記のようなＣＤ４３の抗原決定部位を意味するために使用される。
本発明において、抗体またはその抗原結合断片は、動物由来抗体、キメリック抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、およびこれらの抗原結合断片からなる群より選択されたものであってもよい。前記抗体は、組換え的または合成的に生産されたものであってもよい。
所望の抗原を被免疫動物に免疫させて生産する動物由来抗体は、一般に治療目的でヒトに投与時に免疫拒絶反応が起こることがあり、このような免疫拒絶反応を抑制すべくキメリック抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が開発された。キメリック抗体は、遺伝工学的方法を利用して抗−アイソタイプ（ａｎｔｉ−ｉｓｏｔｙｐｅ）反応の原因となる動物由来抗体の不変領域をヒト抗体の不変領域に置換したものである。キメリック抗体は、動物由来抗体に比べて抗−アイソタイプ反応において相当部分改善されたが、依然として動物由来アミノ酸が可変領域に存在していて、潜在的な抗−イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）反応に対する副作用を内包している。このような副作用を改善すべく開発されたものがヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。これは、キメリック抗体の可変領域のうち抗原の結合に重要な役割を果たすＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｉｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）部位をヒト抗体骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に移植して作製される。
ヒト化抗体を作製するためのＣＤＲ移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）技術において最も重要なのは、動物由来抗体のＣＤＲ部位を最もよく受け入れられる最適化したヒト抗体を選定するものであり、そのために、抗体データベースの活用、結晶構造（ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の分析、分子モデリング技術などが活用される。しかし、最適化したヒト抗体骨格に動物由来抗体のＣＤＲ部位を移植しても、動物由来抗体の骨格に位置しかつ、抗原結合に影響を及ぼすアミノ酸が存在する場合があるため、抗原結合力が保存されない場合が相当数存在するので、抗原結合力を復元するための追加的な抗体工学技術の適用は必須といえる。
前記抗体または抗原結合断片は、生体から分離された（生体に存在しない）もの、または非自然的に生産（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）されたものであってもよいし、例えば、合成的または組換え的に生産されたものであってもよい。
本発明において、「抗体」とは、免疫系内で抗原の刺激によって作られる物質を意味するものであって、その種類は特に制限されず、自然的または非自然的（例えば、合成的または組換え的）に得られる。抗体は、生体外のみならず、生体内でも非常に安定し半減期が長いため、大量発現および生産に有利である。また、抗体は本質的にダイマー（ｄｉｍｅｒ）構造を有するため、接着能（ａｖｉｄｉｔｙ）が非常に高い。
完全な抗体は、２個の全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖と二硫化結合で連結されている。抗体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域とに分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、およびエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。
用語、「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３とヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖およびその断片をすべて含む意味で解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびその断片をすべて含む意味で解釈される。
用語、「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖は、それぞれ３個のＣＤＲを含むことができる（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。前記ＣＤＲは、抗体が抗原または抗原決定部位に結合するにあたって主な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、用語、「特異的に結合」または「特異的に認識」は、当業者に通常公知となっている意味と同一のものであって、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的反応をすることを意味する。
用語、「抗原結合断片」は、免疫グロブリンの全体構造に対するその断片で、抗原が結合可能な部分を含むポリペプチドの一部を意味する。例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２であってもよいが、これに限定されない。
前記抗原結合断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域、および重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を有する構造で１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖のＣＨ１ドメインのＣ−末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有する点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変部位だけを有している最小の抗体片で、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は当業界で幅広く公知である。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合で連結されたり、またはＣ−末端で直接連結されていて、二重鎖Ｆｖと同じくダイマーのような構造をなすことができる。前記リンカーは、１〜１００個または２〜５０個の任意のアミノ酸からなるペプチドリンカーであってもよいし、当業界に適切な配列が知られている。前記抗原結合断片は、蛋白質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術により作製することができる。
用語「ヒンジ領域（ｈiｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）」は、抗体の重鎖に含まれている領域であって、ＣＨ１およびＣＨ２領域の間に存在し、抗体内の抗原結合部位の柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供する機能をする領域を意味する。例えば、前記ヒンジは、ヒト抗体に由来するものであってもよいし、具体的には、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来するものであってもよい。
抗−ＣＤ４３抗体は、多クローン抗体または単クローン抗体でもよいし、例えば、単クローン抗体であってよい。単クローン抗体は、当業界で広く知られた方法通りに製造される。例えば、ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ手法を用いて製造される。
一方、典型的なＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）フォーマットを用いて、ＣＤ４３との結合能に基づいて個別単クローン抗体をスクリーニングすることができる。結合体に対して分子的相互作用を検定するための競争的ＥＬＩＳＡ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ）、細胞−基盤分析（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ａｎａｌｙｓｉｓ、またはｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅなどのような機能性分析により阻害活性に対して検定することができる。その後、強い阻害活性に基づいて選択された単クローン抗体メンバーに対して、ＣＤ４３に対するそれぞれの親和度（Ｋｄ ｖａｌｕｅｓ）を検定することができる。
例えば、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ４３（例えば、ヒトＣＤ４３、マウスＣＤ４３など）またはＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に対する結合親和度（Ｋｄ；例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ａｎａｌｙｓｉｓで測定）が１ｍＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または３ｎＭ以下であってもよいし、例えば、１ｐＭ〜１ｍＭ、１ｐＭ〜１００ｎＭ、１ｐＭ〜１０ｎＭ、１ｐＭ〜５ｎＭ、１ｐＭ〜３ｎＭ、１０ｐＭ〜１ｍＭ、１０ｐＭ〜１００ｎＭ、１０ｐＭ〜１０ｎＭ、１０ｐＭ〜５ｎＭ、１０ｐＭ〜３ｎＭ、１００ｐＭ〜１ｍＭ、１００ｐＭ〜１００ｎＭ、１００ｐＭ〜１０ｎＭ、１００ｐＭ〜５ｎＭ、１００ｐＭ〜３ｎＭ、１ｎＭ〜１ｍＭ、１ｎＭ〜１００ｎＭ、１ｎＭ〜１０ｎＭ、１ｎＭ〜５ｎＭ、または１ｎＭ〜３ｎＭであってもよい。
他の例は、前記抗−ＣＤ４３抗体の単クローン抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を提供する。前記ハイブリドーマ細胞株は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００１０のＨ−ＪＬ１細胞株であってもよい。
前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、細胞毒性物質などからなる群より選択された１種以上と共に適用可能である。
したがって、前記薬学組成物は、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片に加えて、細胞毒性物質などからなる群より選択された１種以上を追加的に含むものであってもよい。また、前記治療、または阻害方法は、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を投与する段階に加えて、細胞毒性物質などからなる群より選択された１種以上を投与する段階を追加的に含むことができる。
具体的には、本発明の他の例は、（１）ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片、および（２）細胞毒性物質などからなる群より選択された１種以上を有効成分として含む固形癌の治療用薬学組成物を提供する。
他の例は、（１）ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を固形癌の治療を必要とする患者に投与する段階と、（２）細胞毒性物質などからなる群より選択された１種以上の薬学的有効量を固形癌の治療を必要とする患者に投与する段階とを含む固形癌の治療方法を提供する。
他の例は、（ｉ）ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片、および（ｉｉ）細胞毒性物質などからなる群より選択された１種以上を有効成分として含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害用薬学組成物を提供する。
他の例は、（ｉ）ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌患者、例えば、固形癌患者に投与する段階と、（ｉｉ）細胞毒性物質などからなる群より選択された１種以上を癌患者、例えば、固形癌患者に投与する段階とを含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害用薬学組成物を提供する。
前記薬学組成物において、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片と細胞毒性物質などからなる群より選択された１種以上は、互いに接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）または混合されて１つの製剤に剤形化されたり、それぞれ別個の製剤に剤形化されて混合されたものであってもよい。前記方法において、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を投与する段階と、細胞毒性物質などからなる群より選択された１種以上を投与する段階は、同時または順序に関係なく順次に行われる。
前記細胞毒性物質は、癌細胞、特に固形癌細胞に対して毒性を有するすべての物質であってもよいし、放射線同位元素、細胞毒素化合物（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、細胞毒性蛋白質、抗癌剤などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記細胞毒素蛋白質は、リシン（ｒｉｃｉｎ）、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、デボウガニン（ｄｅｂｏｕｇａｎｉｎ）、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｘｉｎ）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記放射線同位元素としては、１３１Ｉ、１８８Ｒｈ、９０Ｙなどからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記細胞毒素化合物は、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ；ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ；ＭＭＡＦ）、Ｎ２’−ジアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）マイタンシン（Ｎ２’−ｄｅａｃｅｔｙｌ−Ｎ２’−（３−ｍｅｒｃａｐｔｏ−１−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ；ＤＭ１）、ＰＢＤ（Ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）ｄｉｍｅｒなどからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。
前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片と前記細胞毒性物質などからなる群より選択された１種以上は、互いに結合（例えば、共有結合、ペプチド結合などによる）されて接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）または融合蛋白質（細胞毒性物質および／または標識物質が蛋白質の場合）の形態で使用できる。前記抗体（または抗原結合断片）と細胞毒性物質の結合は、本発明の属する技術分野でよく知られた技術によるものであってもよい。
前記有効成分（抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片、および／または細胞毒性物質および／または標識物質）は、薬学的に許容可能な担体と共に適用（投与）可能であり、前記薬学的に許容可能な担体は、薬物の製剤化に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。前記抗−ＣＤ４３抗体は、前記成分のほか、薬学組成物の製造に通常使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などからなる群より選択された１種以上を追加的に含むことができる。
前記有効成分または薬学組成物は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、または直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、蛋白質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。また、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、活性物質が標的細胞に移動可能な任意の装置によって投与される。
本明細書において、「薬学的有効量」は、薬物が薬学的に意味のある効果を奏し得る量を意味する。１回投与のための有効成分の薬学的有効量は、製剤化方法、投与方式、患者の年令、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因に応じて多様に処方される。例えば、１回投与のための有効成分（例えば、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片）の薬学的有効量は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、または０．０２〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記１回投与のための薬学的有効量は、単位用量形態で１つの製剤に製剤化されたり、適切に分量して製剤化されたり、多用量容器内に入れて製造される。
前記固形癌は、血液癌以外のすべての非血液癌を意味するものであってもよい。例えば、前記固形癌は、肺癌（例えば、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌）、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼球内黒色腫、直膓癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、胃腸癌、胃癌、膵臓癌、膠芽腫、頸部癌、卵巣癌、肝癌、胆嚢癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳癌、骨肉腫などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。例えば、前記固形癌は、胃癌、乳癌、肺癌、大腸癌、肝癌、胆嚢癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、卵巣癌、子宮頸部癌、前立腺癌、または膀胱癌であってもよい。前記癌は、原発性癌だけでなく、転移性癌も含む。また、前記固形癌は、既存の抗癌剤（ｅ．ｇ．，小分子抗癌剤（ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ）、抗代謝剤、アルキル化剤、抗生剤、ビンカアルカロイド、酵素、ホルモン剤、標的治療剤、および／または抗体治療剤など）に対して抵抗性を有する癌であってもよく、既存の抗癌剤（ｅ．ｇ．，小分子抗癌剤（ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ）、抗代謝剤、アルキル化剤、抗生剤、ビンカアルカロイド、酵素、ホルモン剤、標的治療剤、および／または抗体治療剤など）の治療後に再発した癌であってもよい。
前記固形癌の治療効果は、癌細胞（特に、癌幹細胞）またはこれを含む癌組織の成長抑制（量的減少）、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）効果だけでなく、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、侵襲（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）などを抑制して、これによる癌の悪化を抑制する効果を含む。
本明細書において、「癌幹細胞阻害」は、癌幹細胞の成長抑制（量的減少）、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）などのすべての癌幹細胞の量的および／または機能的阻害、および／またはこれにより前記癌幹細胞が関与する癌の治療および／または改善を意味する。
本明細書において、「患者」は、癌（例えば、固形癌または血液癌）の治療、および／または癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞の阻害を必要とする患者を意味するもので、すべての哺乳類、例えば、ヒトであってもよく、癌に苦しめられていたり、癌の症状を持ったり、癌発病の危険がある患者、またはこれから分離された細胞、組織、体液またはその培養物であってもよい。
他の例は、ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片と癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞が結合された接合体を提供する。他の例は、ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を生体から分離された癌試料、例えば、固形癌試料に接触させたり、または癌患者、例えば、固形癌患者に投与する段階を含む抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片と癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞が結合された接合体を生成する方法を提供する。前記方法は、生体内または生体外で行われるものであってもよい。前記接合体またはこれを生成する方法は、固形癌の治療だけでなく、多様な臨床的、診断的、および／または実験的目的で使用可能である。例えば、癌試料に抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を接触時、接合体生成の有無を検出して癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞の存在の有無を確認および／または癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞可視化のための用途に使用可能である。この時、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、標識物質を追加的に含むものであってもよい。前記標識物質は、放射線同位元素、蛍光物質、クロモゲン（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）、染色物質などからなる群より選択された１種以上であってもよい。前記蛍光物質は、通常使用可能なすべての蛍光物質であってもよいし、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ：ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ：ＰＥ）、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＡＰＣ）、またはビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記標識物質は、前記抗体または抗原結合断片に通常の方法（例えば、共有結合、配位結合、イオン結合などの化学結合）で結合（連結）されたものであってもよい。前記抗体（または抗原結合断片）と標識物質の結合は、本発明の属する技術分野でよく知られた技術によるものであってもよい。
前記癌試料は、癌細胞株、または癌患者から分離されたり人工的に培養された細胞、組織、体液などであってもよい。前記固形癌試料は、固形癌細胞株、または固形癌患者から分離されたり人工的に培養された細胞、組織、体液などであってもよい。
他の例は、ＣＤ４３、具体的にはＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位の癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞検出のためのマーカーとしての用途を提供する。具体的には、一例は、ＣＤ４３、具体的にはＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位と相互作用する物質を含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞検出用組成物を提供する。他の例は、細胞試料にＣＤ４３、具体的にはＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位と相互作用する物質を接触させる段階と、前記ＣＤ４３、具体的にはＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位と相互作用する物質間の相互作用の有無または程度を測定する段階とを含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞の検出方法を提供する。この場合、ＣＤ４３、具体的にはＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位と相互作用する物質間の相互作用が存在したりその水準が高い場合、前記細胞試料は、癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞を含むと決定（確認）することができる。前記相互作用する物質は、ＣＤ４３、具体的にはＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位と相互作用可能なすべての物質、例えば、化学物質（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ）、抗体、抗体の抗原結合断片、アプタマーなどからなる群より選択された１種以上であってもよい。前記相互作用の有無は、前記相互作用する物質を用いる通常の蛋白質分析方法、例えば、免疫クロマトグラフィー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、マイクロアレイ法などを利用して測定することができるが、これに制限されるわけではない。前記細胞試料は、哺乳類、例えば、ヒトから分離された細胞、組織、またはその培養物であってもよいし、例えば、癌患者、例えば、固形癌患者から分離された癌細胞、癌組織、またはその培養物であってもよい。
他の例は、前記ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位の固形癌治療剤のスクリーニングのための用途を提供する。
他の例は、前記ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位を含む固形癌治療剤のスクリーニングのための製剤を提供する。
他の例は、前記ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に候補化合物を接触させる段階と、前記抗原決定部位に結合する候補化合物を選択して固形癌治療剤の候補物質として決定する段階とを含む、固形癌治療剤のスクリーニング方法を提供する。
前記のようにスクリーニングされた固形癌治療剤は、癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞の阻害効果を有することを特徴とするものであってもよい。
したがって、他の例は、前記ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位の癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害剤のスクリーニングのための用途を提供する。
他の例は、前記ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位を含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害剤のスクリーニングのための製剤を提供する。
他の例は、前記ＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位に候補化合物を接触させる段階と、前記抗原決定部位に結合する候補化合物を選択して癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害剤の候補物質として決定する段階とを含む、癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
前記抗原決定部位に結合する候補化合物は、前記抗原決定部位に対する結合親和度（Ｋｄ；例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ａｎａｌｙｓｉｓで測定）が１ｍＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または３ｎＭ以下であってもよいし、例えば、１ｐＭ〜１ｍＭ、１ｐＭ〜１００ｎＭ、１ｐＭ〜１０ｎＭ、１ｐＭ〜５ｎＭ、１ｐＭ〜３ｎＭ、１０ｐＭ〜１ｍＭ、１０ｐＭ〜１００ｎＭ、１０ｐＭ〜１０ｎＭ、１０ｐＭ〜５ｎＭ、１０ｐＭ〜３ｎＭ、１００ｐＭ〜１ｍＭ、１００ｐＭ〜１００ｎＭ、１００ｐＭ〜１０ｎＭ、１００ｐＭ〜５ｎＭ、１００ｐＭ〜３ｎＭ、１ｎＭ〜１ｍＭ、１ｎＭ〜１００ｎＭ、１ｎＭ〜１０ｎＭ、１ｎＭ〜５ｎＭ、または１ｎＭ〜３ｎＭであってもよい。
前記抗原決定部位は先に説明した通りであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１〜１３４の中から選択されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。前記抗原決定部位は、ＣＤ４３蛋白質の全体または前記抗原決定部位を含む一部として提供されたり、化学的に合成または組換え的に生産されたものであってもよい。
前記候補化合物は、人工的に合成されたり、天然の各種化合物、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド構造体または蛋白質構造体（例えば、抗体、抗体の抗原結合断片、ペプチボディ、ナノボディなど）、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アンチセンス−ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ）、アプタマー、天然物抽出物などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
前記候補化合物と抗原決定部位の結合は、候補化合物と抗原決定部位の複合体の形成を確認することにより行われ、これは、当業界で公知の多様な方法により行うことができる。例えば、通常の酵素反応、蛍光、発光および／または放射線検出により測定され、具体的には、免疫クロマトグラフィー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｏｒｅｓｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）などからなる群より選択された方法によって測定されるが、これに制限されるわけではない。
一例において、前記のようにスクリーニングされた固形癌治療剤または癌幹細胞阻害剤は、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体類似蛋白質構造体（例えば、ペプチボディ、ナノボディ）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
他の例において、前記のようにスクリーニングされた固形癌治療剤を有効成分として含む固形癌の治療用薬学組成物を提供する。他の例は、前記のようにスクリーニングされた固形癌治療剤の薬学的有効量を固形癌の治療を必要とする患者に投与する段階を含む固形癌の治療方法を提供する。一例において、前記固形癌は、胃癌であってもよい。
他の例は、前記のようにスクリーニングされた癌幹細胞阻害剤を有効成分として含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害用薬学組成物を提供する。他の例は、前記のようにスクリーニングされた癌幹細胞阻害剤の薬学的有効量を癌患者、例えば、固形癌患者に投与する段階を含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害方法を提供する。一例において、前記固形癌は、胃癌であってもよい。
他の例は、新規な抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を提供する。前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、先に説明したようなＣＤ４３の細胞外領域に位置する抗原決定部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合するものであってもよい。前記抗原決定部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１のアミノ酸配列を含むＣＤ４３の細胞外領域内の連続する６〜９個のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ；ＶＨ）および軽鎖可変領域（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ；ＶＬ）を含む。前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、動物由来抗体（例えば、マウス抗体）、キメリック抗体、またはヒト化抗体であってもよく、単クローン抗体または多クローン抗体であってもよいし、非自然的（例えば、化学的または生物学的合成、組換え的方法など）に生産されたものであってもよい。
前記重鎖可変領域は、Ｎ−末端からＣ−末端方向に順次に、第１相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）（ＣＤＲ１Ｈ）、第２ＣＤＲ（ＣＤＲ２Ｈ）、および第３ＣＤＲ（ＣＤＲ３Ｈ）を含むことができる。
一例において、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域の必須成分として、ＧＹＸ１ＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０；Ｘ１は、すべてのアミノ酸の中から選択されたものであってもよいし、例えば、ＦまたはＹであってもよい）のアミノ酸配列（例えば、ＧＹＦＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）またはＧＹＹＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２））を含むＣＤＲ１Ｈ、ＲＩＮＰＮＸ２ＧＤＳＦＹＮＱＫＦＸ３Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３；Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立にすべてのアミノ酸の中から選択されたものであってもよいし、例えば、Ｘ２は、ＮまたはＳであり、Ｘ３は、ＱまたはＫである）のアミノ酸配列（例えば、ＲＩＮＰＮＮＧＤＳＦＹＮＱＫＦＱＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４）、ＲＩＮＰＮＳＧＤＳＦＹＮＱＫＦＱＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）、ＲＩＮＰＮＮＧＤＳＦＹＮＱＫＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）、またはＲＩＮＰＮＳＧＤＳＦＹＮＱＫＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７））を含むＣＤＲ２Ｈ、およびＥＧＹＹＧＧＲＧＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３Ｈを含むことができる。
前記重鎖可変領域は、前記相補性決定部位（ＣＤＲ）のＮ−末端側および／またはＣ−末端側に免疫グロブリンの骨格部位（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）を追加的に含むことができる。より具体的には、前記重鎖可変領域は、Ｎ−末端からＣ−末端方向に順次に、第１ｆｒａｍｅｗｏｒｋ（ＦＲ１Ｈ）、第１相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）（ＣＤＲ１Ｈ）、第２ｆｒａｍｅｗｏｒｋ（ＦＲ２Ｈ）、第２ＣＤＲ（ＣＤＲ２Ｈ）、第３ｆｒａｍｅｗｏｒｋ（ＦＲ３Ｈ）、第３ＣＤＲ（ＣＤＲ３Ｈ）、および第４ｆｒａｍｅｗｏｒｋ（ＦＲ４Ｈ）を含むことができる。
一具体例において、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化されたものであり、
（ｉ）ＦＲＩＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４のうちいずれか１つの１番目から３０番目までのアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい；
（ｉｉ）ＣＤＲ１Ｈは、ＧＹＸ１ＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０；Ｘ１は、すべてのアミノ酸の中から選択されたものであってもよいし、例えば、ＦまたはＹであってもよい）のアミノ酸配列を含むものであってもよいし、例えば、ＧＹＦＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）またはＧＹＹＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２）のアミノ酸配列を含むことができる；
（ｉｉｉ）ＦＲ２Ｈは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４のうちいずれか１つの３６番目から４９番目までのアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる；
（ｉｖ）ＣＤＲ２Ｈは、ＲＩＮＰＮＸ２ＧＤＳＦＹＮＱＫＦＸ３Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３；Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立にすべてのアミノ酸の中から選択されたものであってもよいし、例えば、Ｘ２は、ＮまたはＳであり、Ｘ３は、ＱまたはＫである）のアミノ酸配列を含むものであってもよいし、例えば、ＲＩＮＰＮＮＧＤＳＦＹＮＱＫＦＱＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４）、ＲＩＮＰＮＳＧＤＳＦＹＮＱＫＦＱＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）、ＲＩＮＰＮＮＧＤＳＦＹＮＱＫＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）、またはＲＩＮＰＮＳＧＤＳＦＹＮＱＫＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）のアミノ酸配列を含むことができる；
（ｖ）ＦＲ３Ｈは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４のうちいずれか１つの６７番目から９８番目までのアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる；
（ｖｉ）ＣＤＲ３Ｈは、ＥＧＹＹＧＧＲＧＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８）のアミノ酸配列を含むことができる；
（ｖｉｉ）ＦＲ４Ｈは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４のうちいずれか１つの１１２番目から１２２番目までのアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
前記軽鎖可変領域は、Ｎ−末端からＣ−末端方向に順次に、第１ＣＤＲ（ＣＤＲ１Ｌ）、第２ＣＤＲ（ＣＤＲ２Ｌ）、および第３ＣＤＲ（ＣＤＲ３Ｌ）を含むことができる。
一例において、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域の必須成分として、ＲＴＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１Ｌ；Ｘ４ＴＸ５ＲＬＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０；Ｘ４およびＸ５は、それぞれ独立にすべてのアミノ酸の中から選択されてもよいし、例えば、Ｘ４は、Ｎ、Ｑ、またはＡであり、Ｘ５は、ＳまたはＡである）のアミノ酸配列（例えば、ＮＴＳＲＬＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１、ＮＴＡＲＬＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２）、ＱＴＳＲＬＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３）、またはＡＴＳＲＬＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４））のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２Ｌ；およびＱＱＳＮＭＦＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３Ｌを含むことができる。
前記軽鎖可変領域は、前記相補性決定部位（ＣＤＲ）のＮ−末端側および／またはＣ−末端側に免疫グロブリンの骨格部位（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）を追加的に含むことができる。より具体的には、前記重鎖可変領域は、Ｎ−末端からＣ−末端方向に順次に、第１ｆｒａｍｅｗｏｒｋ（ＦＲ１Ｌ）、第１ＣＤＲ（ＣＤＲ１Ｌ）、第２ｆｒａｍｅｗｏｒｋ（ＦＲ２Ｌ）、第２ＣＤＲ（ＣＤＲ２Ｌ）、第３ｆｒａｍｅｗｏｒｋ（ＦＲ３Ｌ）、第３ＣＤＲ（ＣＤＲ３Ｌ）、および第４ｆｒａｍｅｗｏｒｋ（ＦＲ４Ｌ）を含むことができる。
一具体例において、
（ｖｉｉｉ）ＦＲ１Ｌは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９のうちいずれか１つの１番目から２３番目までのアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい；
（ｉｘ）ＣＤＲ１Ｌは、ＲＴＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９）のアミノ酸配列を含むことができる；
（ｘ）ＦＲ２Ｌは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９のうちいずれか１つの３５番目から４９番目までのアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい；
（ｘｉ）ＣＤＲ２Ｌは、Ｘ４ＴＸ５ＲＬＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０；Ｘ４およびＸ５は、それぞれ独立にすべてのアミノ酸の中から選択されてもよいし、例えば、Ｘ４は、Ｎ、Ｑ、またはＡであり、Ｘ５は、ＳまたはＡである）のアミノ酸配列を含むことができ、例えば、ＮＴＳＲＬＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１、ＮＴＡＲＬＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２）、ＱＴＳＲＬＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３）、またはＡＴＳＲＬＨＳ（（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４）を含むものであってもよい。
（ｘｉｉ）ＦＲ３Ｌは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９のうちいずれか１つの５７番目から８８番目までのアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
（ｘｉｉｉ）ＣＤＲ３Ｌは、ＱＱＳＮＭＦＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５）のアミノ酸配列を含むことができる；
（ｘｉｖ）ＦＲ４Ｌは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９のうちいずれか１つの９７番目から１０８番目までのアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
一具体例において、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことができる。前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、または９４のアミノ酸配列を含むものであってもよい。前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、または１０９のアミノ酸配列を含むものであってもよい。
例えば、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化されたものであってもよいし、次に定義される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むものが例示される：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｇ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｈ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｊ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｋ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｌ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｍ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｎ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｏ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；または
（ｐ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。
一具体例において、前記ヒト化された抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片に含まれているフレームワークのアミノ酸配列は次のように例示されるが、これに制限されるわけではない：
（ｉ）ＦＲ１Ｈは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：８３〜９４のうちいずれか１つの１番目から３０番目までのアミノ酸残基を含むことができる；
（ｉｉ）ＦＲ２Ｈは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：８３〜９４のうちいずれか１つの３６番目から４９までのアミノ酸残基を含むことができる；
（ｉｉｉ）ＦＲ３Ｈは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：８３〜９４のうちいずれか１つの６７番目から９８番目までのアミノ酸残基を含むことができる；
（ｉｖ）ＦＲ４Ｈは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：８３〜９４のうちいずれか１つの１１２番目から１２２番目までのアミノ酸残基を含むことができる；
（ｖ）ＦＲ１Ｌは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：９５〜１０９のうちいずれか１つの１番目から２３番目までのアミノ酸残基を含むことができる；
（ｖｉ）ＦＲ２Ｌは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：９５〜１０９のうちいずれか１つの３５番目から４９番目までのアミノ酸残基を含むことができる；
（ｖｉｉ）ＦＲ３Ｌは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：９５〜１０９のうちいずれか１つの５７番目から８８番目までのアミノ酸残基を含むことができる；
（ｖｉｉｉ）ＦＲ４Ｌは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：９５〜１０９のうちいずれか１つの９７番目から１０８番目までのアミノ酸残基を含むことができる。
他の実施例において、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、ヒト免疫グロブリンから誘導されたヒト重鎖不変領域および／またはヒト軽鎖不変領域を追加的に含むことができる。前記ヒト免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭなどからなる群より選択されたものであってもよい。例えば、前記ヒト重鎖不変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０の１２３−４５２番目のアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよいし；前記ヒト軽鎖不変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の１０８−２１４番目のアミノ酸、または前記アミノ酸配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
他の例において、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸残基が糖化されないことを特徴とするものであってもよい。そのために、抗体、特に重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域に糖化モチーフ、例えば、Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎモチーフ（ｅ．ｇ．，「Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ」（Ｘは、すべてのアミノ酸残基であってもよい））が含まれている場合、前記モチーフを変形させることができる。例えば、前記Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎモチーフが「Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ」（Ｘは、すべてのアミノ酸残基であってもよい）の場合、前記モチーフ内の「Ｎ」、「Ｓ／Ｔ」またはこれらすべてをそれぞれ元と異なるアミノ酸に置換させることができる。一例において、前記糖化されない抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤＲ２Ｌとして、ＮＴＡＲＬＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２）、ＱＴＳＲＬＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３）、またはＡＴＳＲＬＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４）を含むものであってもよい。他の例として、前記糖化されない抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、１０８、または１０９のアミノ酸配列を含むものであってもよい。
前記抗−ＣＤ４３抗体または抗原結合断片は、先に説明したＣＤ４３の特定抗原決定部位に特異的に結合するもので、動物抗体（例えば、マウス抗体）、キメリック抗体、ヒト化抗体、およびこれらの抗原結合断片からなる群より選択されたものであってもよい。前記動物抗体は、ヒト以外の動物種に由来するものであってもよいし、例えば、ネズミ、ハツカネズミ、ヤギ、ギニーピッグ、ロバ、ウサギ、ウマ、ラマ、ラクダ、鳥類（例えば、ニワトリ、カモなど）などに由来するものであってもよいが、これに限定されるものではない。このような動物抗体からキメリック抗体および／またはヒト化抗体を作製する技術は、関連技術分野でよく知られている。ヒト化抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、または任意のｓｕｂｃｌａｓｓのような任意の好適なアイソタイプであってもよい。
本明細書において、抗体のＣＤ４３に対する結合特異性は、抗体が非−ＣＤ４３ペプチドに比べてＣＤ４３に対してより高い親和力を有したり、ＣＤ４３の他の部位または他の細胞外領域と比較して先に説明したＣＤ４３の抗原決定部位に対してより高い親和力を有することを意味することができる。
抗体と抗原（より具体的には、抗原結合部位）との結合（抗原−抗体結合）は、関連技術分野で知られたすべての方法によって測定される。例えば、抗原−抗体結合は、ＥＬＩＳＡ、流細胞分析器、免疫化学染色、ＢＩＡｃｏｒｅ光学バイオセンサなどからなる群より選択された１つ以上の方法によって測定されるが、これに制限されるわけではない。
本明細書で使用された抗原結合断片という用語は、抗原（ＣＤ４３）または先に説明したＣＤ４３の抗原決定部位を特異的に認識および／またはこれに特異的に結合する能力を有する抗体の一部分（断片）を意味する。例えば、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片などからなる群より選択される。
一例において、抗−ＣＤ４３抗体の抗原結合断片は、抗−ＣＤ４３ｓｃＦｖであってもよい。前記抗−ＣＤ４３ｓｃＦｖは、先に説明したＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含んだり、先に説明した重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むものであってもよい。
前記抗−ＣＤ４３ｓｃＦｖにおいて、先に説明した重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、適切なリンカーを介して連結されたものであってもよい。前記リンカーは、１〜１００個または２〜５０個の任意のアミノ酸からなるペプチドリンカーであってもよいし、当業界における適切な配列が知られている。一例において、前記ペプチドリンカーは、（ＧＧＧＸ６Ｓ；Ｘ６は、ＧまたはＡ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６）または（ＧＧＧＸ６Ｓ）ｎ（ｎは、１〜５の整数で、各繰り返し単位に含まれているＸ６は、それぞれ独立にＧまたはＡである）で表現され、例えば、ＧＧＧＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８）のアミノ酸配列を含むことができるが、これに制限されるわけではない。
一例において、前記抗−ＣＤ４３ｓｃＦｖは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：５０、５２、５４、５６、または５８のアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これに制限されるわけではない。
一例において、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、細胞死滅（例えば、細胞自殺（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）のようなプログラム化された細胞死滅を含む）を誘導可能な細胞毒性物質と接合されて標的細胞に細胞毒性を示すことができる。前記細胞毒性物質は、関連技術分野において細胞、特に癌細胞に対して毒性を示すことが知られたすべての化合物（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄ；抗癌剤など）、蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどからなる群より選択された１種以上であってもよいし、例えば、放射線同位元素、細胞毒素化合物（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、細胞毒性蛋白質、抗癌剤などからなる群より選択された１種以上であってもよい。前記細胞毒素蛋白質は、リシン（ｒｉｃｉｎ）、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、デボウガニン（ｄｅｂｏｕｇａｎｉｎ）、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｘｉｎ）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記放射線同位元素としては、１３１Ｉ、１８８Ｒｈ、９０Ｙなどからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記細胞毒素化合物は、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ；ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ；ＭＭＡＦ）、Ｎ２’−ジアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）マイタンシン（Ｎ２’−ｄｅａｃｅｔｙｌ−Ｎ２’−（３−ｍｅｒｃａｐｔｏ−１−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ；ＤＭ１）、ＰＢＤ（Ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）ｄｉｍｅｒなどからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。
他の例において、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な標識が接合された接合体形態で提供される。前記接合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ４３または先に説明したＣＤ４３の抗原決定部位の存在を検出するのに有用に使用できる。前記検出可能な標識は、関連技術分野で同相的に知られたすべての標識物質の中から選択され、例えば、放射線標識（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５１、１３１１、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍなど）、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁性標識、ビオチンのような化学的物質などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。抗体または抗原結合断片の用途に応じて適切な標識を選択することは、関連技術分野における通常の知識を有する者にとって明確な事項である。
他の例は、前記抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防および／または治療用薬学組成物を提供する。他の例は、前記抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌幹細胞阻害用薬学組成物を提供する。他の例は、前記抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌の予防および／または治療を必要とする対象に投与する段階を含む、癌の予防および／または治療方法を提供する。他の例は、前記抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌の予防および／または治療を必要とする対象に投与する段階を含む、癌幹細胞阻害方法を提供する。前記薬学的有効量は、前記投与対象において所望の抗癌効果、例えば、治療的効果（例えば、癌細胞死滅率の増加、癌組織の減少、癌転移抑制など）を得るのに効果的な量を意味する。前記薬学組成物および方法において、前記抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、単独または細胞毒性物質と接合された接合体形態で使用できる。細胞毒性物質は先に説明された通りである。
前記癌は、ＣＤ４３、具体的には、先に説明したＣＤ４３の抗原決定部位を発現するすべての癌であってもよい。一例において、前記癌は、血液癌（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）であってもよいし、例えば、急性骨髄球性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性リンパ球性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性単球性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。他の例において、前記癌は、後述する固形癌の中から選択された１種以上であってもよい。
前記抗体または抗原結合断片は、細胞表面にＣＤ４３、特に先に説明したＣＤ４３の抗原決定部位を発現する腫瘍細胞上のＣＤ４３またはＣＤ４３抗原決定部位に結合するのに十分な量で投与され、その量は、関連技術分野における通常の知識を有する者によって困難なく決定可能である。
前記言及された薬学的有効量または十分な量は、投与対象から期待される効果を提供するための量を意味する。期待される効果は、細胞表面に発現するＣＤ４３（またはＣＤ４３の抗原決定部位）に対する抗体の結合を伴うはずであり、前記結合は、抗体、抗原結合断片、または前記抗体または断片に接合された細胞毒性物質を介した細胞毒性（例えば、ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）またはｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＣＤＣ））の発揮であってもよい。他の例において、前記期待される効果は、細胞毒性が少なかったり無い細胞の表面で発現するＣＤ４３に対する抗体の結合を引き出し、これによって、前記結合は、ＣＤ４３＋細胞、そして患者から前記ＣＤ４３＋細胞（例えば、抗体または断片は、検出可能なマーカーとして標識されている所）を検出し、選択的に除去（例えば、白血球分離搬出法）するために熟練した受取人が行うことができる。要求される抗体分子の量は、患者において患者、人種、年齢、そして患者の一般的な状態、特定化合物の投与、投与の方法などへの依存から異なり得る。したがって、それは、「正確な充分量」を指定することが可能でないことがある。しかし、任意の個別的な場合において、適当な量は、規則的な実験を利用して１つの日常的記述によって決定可能である。用量はまた、状況の危急性に合わせて調整され、最適な投与量を導出可能に調整することができる。例えば、いくつかの用量は、毎日、毎週、毎月または他の適正な時間間隔で提供される。
前記言及された薬学的有効量または充分量は、抗体またはその抗原結合断片が投与されていたり、投与予定の患者から得られた生物学的サンプル（例えば、体液サンプル（例えば、血液サンプルなど）、細胞／組織サンプル（例えば、腫瘍細胞／組織サンプルなど）など）において細胞に抗体が結合することをモニタリングすることにより決定可能である。前記生物学的サンプルは、抗体または断片の投与後の特定時間（例えば、投与後、約５、１０、５または２０分）に患者から取ることができる。関連技術分野でよく知られた方法を用いて、サンプル内の細胞表面上の抗体または断片の存在（つまり、細胞表面のＣＤ４３またはその抗原決定部位と抗原−抗体反応によって結合した抗体またはその抗原結合断片）に対して分析することができる。あるいは、前記得られた生物学的サンプルは、サンプル内の生きている細胞の生存率または数を測定するための通常的分析に使用できる。抗体または断片の投与後にＣＤ４３−陽性細胞の数が減少するという事実（例えば、抗体または断片を投与する前に得たサンプルなどのような対照群サンプルと比較した時、抗体または断片を投与したサンプル内の生きている細胞数の減少）に基づいて、抗体媒介細胞毒性を測定することができる。前記細胞毒性は、抗体単独（例えば、細胞毒性物質と接合しない非−接合抗体またはその抗原結合断片）によって媒介されたり、および／または抗体または断片に接合された細胞毒性物質に媒介される。
本明細書で提供されたＣＤ４３抗原決定部位に特異的に結合する抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、投与された患者のサンプルにおける標的ＣＤ４３−陽性細胞の水準を対照群サンプル（例えば、抗体または断片の投与前に患者から得たサンプル）のＣＤ４３−陽性細胞の水準と比較して１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上減少させることができる。一例において、ＣＤ４３陽性細胞は、癌細胞、例えば、悪性造血細胞（例えば、白血病細胞）、および／または癌幹細胞であってもよい。
他の例において、前記抗体またはその抗原結合断片の投与量（薬学的有効量）は、体外細胞基盤毒性実験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）により推定して決定可能である。例えば、前記抗体または断片の標的であるＣＤ４３陽性細胞の数を減少させるための抗体または断片の濃度を決定するために、ＣＤ４３陽性細胞（例、ＣＥＭ７細胞株）を用いた体外細胞基盤実験を行うことができる。試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での細胞の数を減少（例えば、前記抗体または断片の不在時における細胞数と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％減少）させるために決定される抗体または断片の濃度は、生体内実験（ｉｎ ｖｉｖｏ）で必要とするＣＤ４３陽性細胞数を減少させるのに十分な投与量を決定する根拠として採用される。その他にも、前記投与量は、患者の体重、血液量、クリアランス率（ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｒａｔｅ）などのような要素を考慮して決定可能である。
本明細書に使用された用語「対象または患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、ヒト、ゴリラ、チンパンジーなどの哺乳類を含む動物の中から選択されたり、前記動物から分離された細胞、組織、体液またはその培養物であってもよい。前記哺乳類は、ヒトを含むことができる。本明細書に提供された発明は、ヒトまたは獣医学分野におけるＣＤ４３陽性細胞の特異的標的化のために応用可能であり、これは、関連技術分野における当業者が明確に理解できる内容である。通常、「動物」は、ヒト、サルなどの霊長類だけでなく、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、ヤギ、ロバ、イヌ、ネコなどの家畜と伴侶動物、およびマウス、ラットなどの実験用動物を通称するために使用できる。ウマの場合、娯楽または家畜産業に使用されるウマだけでなく、競走用産業に利用されるウマも含まれる。
必要に応じて、本明細書で提供される方法は、第２の治療手段（例えば、治療剤）を行うことを追加的に含むことができる。例えば、本発明の方法は、他の化学療法化合物（第２有効成分）を必要とする対象に投与することを含むことができる。前記第２有効成分の投与は、本明細書で提供される抗体またはその抗原結合断片の投与と同時に行われたり、順序に関係なく（抗体などの投与前または後）順次に行われる。
他の側面において、本明細書で提供される抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の癌治療；抗癌剤の製造；癌幹細胞阻害；および／または癌幹細胞阻害剤の製造のための用途が提供される。
本明細書に記載の薬学組成物、方法、および用途において、前記癌は、固形癌または血液癌であってもよいし、原発性癌または転移性癌であってもよい。一例において、前記癌は、造血性悪性腫瘍（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）であってもよい。前記造血性悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、急性単核球性白血病、またはホジキンリンパ種であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記血液癌は、癌幹細胞を含む癌であってもよい。
他の例において、前記癌は、固形癌であってもよい。前記固形癌は、肺癌（例えば、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌）、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼球内黒色腫、直膓癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、胃腸癌、胃癌、膵臓癌、膠芽腫、頸部癌、卵巣癌、肝癌、胆嚢癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳癌、骨肉腫などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。例えば、前記固形癌は、胃癌、乳癌、肺癌、大腸癌、肝癌、胆嚢癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、卵巣癌、子宮頸部癌、前立腺癌、または膀胱癌であってもよい。前記癌は、原発性癌だけでなく、転移性癌も含む。また、前記固形癌は、既存の抗癌剤（ｅ．ｇ．，小分子抗癌剤（ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ）、抗代謝剤、アルキル化剤、抗生剤、ビンカアルカロイド、酵素、ホルモン剤、標的治療剤、および／または抗体治療剤など）に対して抵抗性を有する癌であってもよく、既存の抗癌剤（ｅ．ｇ．，小分子抗癌剤（ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ）、抗代謝剤、アルキル化剤、抗生剤、ビンカアルカロイド、酵素、ホルモン剤、標的治療剤、および／または抗体治療剤など）治療後に再発した癌であってもよい。前記固形癌は、癌幹細胞を含む癌であってもよい。
前記固形癌の治療効果は、癌細胞（特に、癌幹細胞）またはこれを含む癌組織の成長抑制（量的減少）、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）効果だけでなく、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、侵襲（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）などを抑制して、それによる癌の悪化を抑制する効果を含む。
本明細書で提供される抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、多様な経路で投与され、経口または非経口的経路で投与される。例えば、適切な投与経路の例として、静脈、動脈、筋肉内注射または注入などがあり、一例において、静脈注射に投与されるが、これに制限されるわけではない。
一例において、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、単独または第２治療化合物（例、化学治療化合物）と共に投与されるための形態に剤形化される。
さらに他の側面において、本明細書で提供された抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および賦形剤からなる群より選択された１種以上の添加剤を含む薬学組成物が提供される。一例において、前記薬学組成物に含まれている抗体は、細胞毒性物質が連結または接合された形態のものが含まれる。適切な薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および賦形剤は、関連技術分野における当業者によく知られている事項であり、その例として、食塩水、溶剤（例えば、注射用剤）、分散媒（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｍｅｄｉａ）、抗真菌性および／または抗菌性製剤、界面活性剤、等張性製剤、吸収性製剤などが挙げられるが、これに制限されるわけではない。
一例において、前記薬学組成物は、多様な用量単位形態の注射可能な製剤などのような多様な形態の製剤に製剤化される。
前記薬学組成物の剤形と後続投与は、関連技術分野における通常の技術による。投薬は、治療に対する対象の状態、薬物反応性などに依存するが、好ましい効果が続けば持続することが好ましい。前記薬学組成物の投与量、投与方法、そして繰り返し頻度を投与対象の年齢、性別、病的状態、薬物反応性などを考慮して決定可能であり、これは、関連技術分野における通常の知識を有する者にとって明確な事項である。
さらに他の例は、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の生産方法を提供する。前記製造方法は、前記核酸分子を宿主細胞で発現させる段階を含むことができる。前記発現させる段階は、前記組換え細胞を培養する段階を含むことができ、任意に、前記得られた細胞培養物から抗体を分離および／または精製する段階を追加的に含むことができる。
一具体例において、前記製造方法は、
前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を暗号化する核酸分子またはこれを含む組換えベクターで形質転換された組換え細胞を前記核酸分子の十分な発現のための条件および／または期間で培養する段階と、
前記培養された細胞または得られた培養物から抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を分離および／または精製する段階とを含むことができる。
前記組換え細胞は、宿主細胞を前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を暗号化する核酸分子またはこれを含む組換えベクターで形質転換させて得られたものであってもよい。
他の例は、前記分離および／または精製する段階から得られた精製された抗−ＣＤ４３抗体または抗原結合断片を提供する。前記得られた抗体または抗原結合断片は、細胞で発現または細胞外に分泌時に連結されていた他の成分から分離された組換え分子であってもよい。一例において、前記分離および／または精製された抗体または抗原結合断片は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の純度を有するものであってもよい。関連技術分野における当業者は、分離および／または精製程度は、抗体または抗原結合断片の使用目的および／または使用形態に依存することを明確に理解するであろう。例えば、動物、特に人間の体内投与を目的とする場合に、前記抗体または抗原結合断片の精製純度は比較的高い水準が要求され、体外実験に使用される場合、許容可能な不純物（例えば、宿主細胞および／または培養物由来の成分（蛋白質など）など）が含まれる。
他の例は、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を暗号化する核酸分子を提供する。一具体例において、前記核酸分子は、前記抗体または抗原結合断片の重鎖可変部位（ＶＨ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を暗号化する核酸分子、軽鎖可変部位（ＶＬ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を暗号化する核酸分子、またはこれらの組み合わせを含むことができる。前記重鎖可変部位を暗号化する核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１、５、９、１３、１７、２１、２５、および２９からなる群より選択されたヌクレオチド配列を含むことができる。前記軽鎖可変部位を暗号化する核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３、７、１１、１５、１９、２３、２７、および３１からなる群より選択されたヌクレオチド配列を含むことができる。
前記核酸分子は、適切な発現ベクターに含まれる。前記発現ベクターは、宿主細胞で外来遺伝子を発現させるために通常使用されるすべてのベクターであってもよいし、例えば、ｐＴＴ５、ｐＡＰＥＸ３ｐ、ｐｃＤＮＡ３．２（−）などが例示されるが、これに限定されるものではない。
他の例は、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を暗号化する核酸分子またはこれを含む組換えベクター（または発現ベクター）を含む組換え細胞を提供する。前記組換え細胞は、前記核酸分子または組換えベクターを宿主細胞に導入させて得られたもので、前記核酸分子を発現させることができる細胞である。前記宿主細胞の例として、原核細胞（例、Ｅ．Ｃｏｌｉなど）または原生細胞、動物細胞（例、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ−２９３Ｅ、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、これらの特定遺伝子変形（例えば、欠失）細胞など）、植物細胞、真菌細胞（例、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）、昆虫細胞（例、Ｓｆ９細胞など）のような真核細胞が挙げられるが、これに制限されず、外来遺伝子を発現させることができるすべての細胞の中から選択される。
他の例は、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を細胞試料に接触させる段階と、前記試料内の抗原−抗体結合の有無を確認する段階とを含む、ＣＤ４３の検出方法またはＣＤ４３陽性細胞の検出方法を提供する。前記方法によれば、前記細胞試料内に含まれている細胞表面におけるＣＤ４３の発現の有無を確認することができ、したがって、前記方法は、ＣＤ４３の発現に関連する疾病の診断に適用可能である。したがって、他の例は、前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を細胞試料に接触させる段階と、前記試料内の抗原−抗体結合の有無を確認する段階とを含む、ＣＤ４３関連疾病の診断方法またはＣＤ４３関連疾病の診断に情報を提供する方法を提供する。前記ＣＤ４３関連疾病は、ＣＤ４３の検出またはＣＤ４３の増加に関連する疾病で、癌であってもよいし、前記癌は、固形癌または血液癌であってもよく、特にＣＤ４３の増加に関連する造血性悪性腫瘍（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病）であってもよい。他の具体例において、ＣＤ４３関連疾病は、癌幹細胞を含む癌であってもよい。
前記方法において、抗原−抗体結合は、前記抗体（またはその抗原結合断片）とＣＤ４３蛋白質との間の複合体の形成の有無を検出することにより確認することができる（つまり、前記抗体−ＣＤ４３蛋白質の複合体の形成が検出されると、抗原−抗体結合が存在すると確認する）。この時、相対的な比較のために、対照細胞試料に対して同一の試験を行って、試験細胞試料から得られた結果と比較することができる。前記対照細胞試料は、よく知られたＣＤ４３陰性細胞、または正常細胞（ｎｏｎ−ｃａｎｃｅｒ ｏｒ ｎｏｎ−ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ）の中から選択されたものであってもよい。
一例において、前記検出方法または診断方法は、
（１）試験細胞試料および対照細胞試料に前記抗体またはその抗原結合断片をそれぞれ接触させる段階と、
（２）前記抗体または抗原結合断片と前記細胞との間の複合体の形成の有無または水準を測定する段階とを含むことができる。この時、試験細胞試料における複合体の存在または対照細胞試料と比較して相対的に高い複合体の水準が測定される場合、前記試験細胞試料内のＣＤ４３が存在し、または前記細胞がＣＤ４３を発現する細胞（つまり、ＣＤ４３陽性細胞）であることを確認することができる。前記細胞試料は、生体から分離されたものであってもよく、前記方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われるものであってもよい。
他の例は、前記抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を含むＣＤ４３の検出または可視化（イメージング）のための組成物を提供する。さらに他の例は、前記抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を用いるＣＤ４３の検出または可視化（イメージング）方法を提供する。前記組成物および方法は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のみならず、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのＣＤ４３の検出および／または可視化に適用可能である。前記組成物および方法において、前記抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な標識と接合された形態であってもよいし、例えば、前記検出可能な標識は、放射線標識（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５１、１３１１、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍなど）、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁性標識、ビオチンのような化学的物質などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されず、関連技術分野で明確に知られた通常の検出手段によって検出可能なすべての標識であってもよい。先に説明したように、このような生体外および／または生体内でのＣＤ４３の検出および／または可視化は、ＣＤ４３陽性細胞数の増加に関連する疾病、例えば、癌、より具体的には、癌幹細胞を含む癌または造血性悪性腫瘍の診断に使用できる。
前記ＣＤ４３の検出および／または可視化方法（ｉｎ ｖｉｖｏ）は次を含むことができる：
（ｉ）前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を試験対象に投与する段階と、
（ｉｉ）前記抗体またはその抗原結合断片の複合体の形成の有無または複合体の形成程度（水準）を測定する段階とを含むことができる。
前記複合体は、前記抗体またはその抗原結合断片と試験対象の体内の細胞表面に発現したＣＤ４３との複合体またはＣＤ４３を発現する細胞（ＣＤ４３陽性細胞）との間の抗原−抗体結合によって形成された複合体であってもよい。前記抗体またはその抗原結合断片は、先に説明したような検出可能な標識（特に、生体適合性標識）と接合された形態で使用できる。前記可視化方法は、ＣＤ４３の発現を特徴とする細胞、例えば、癌幹細胞の可視化に適用可能である。
前記投与対象における抗体または抗原結合断片の複合体の形成の有無または形成程度は、対照対象（例えば、ＣＤ４３関連疾病を有しない対象またはＣＤ４３（過）発現細胞を含まない対象）における複合体の形成の有無または形成程度と比較して相対的に評価される。このような比較のために、前記方法は、
（ｉ−１）前記抗−ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片を試験対象および対照対象にそれぞれ投与する段階と、
（ｉｉ−１）前記試験対象および対照対象における抗体またはその抗原結合断片の複合体の形成の有無または複合体の形成程度（水準）をそれぞれ測定する段階と、
（ｉｉｉ）試験対象で測定された結果を対照対象における結果と比較する段階とを含むことができる。
前記方法は、試験対象のＣＤ４３関連疾病の診断またはＣＤ４３の発現を特徴とする癌幹細胞の確認（検出）に適用可能である。この場合、前記段階（ｉｉ）または（ｉｉ−１）で複合体の形成または対照対象と比較して複合体の形成水準の増加が測定される場合、前記試験対象をＣＤ４３関連疾病患者として判断したり、前記試験対象が癌幹細胞を有するものと判断することができる。
生体内または生体外抗原（または抗原を表面に発現する細胞）−抗体複合体の形成は、関連技術分野における通常の手段によって測定され、このような通常の手段は、関連技術分野における当業者にとって明確な内容である。例えば、前記複合体は、抗体または抗原結合断片を適切な検出可能な標識で標識し、前記標識の信号を測定したり適切な検出方法によって確認することができる。前記適切な検出方法は、関連技術分野における通常のすべての方法であってもよいし、例えば、ＥＬＩＳＡ、流細胞測定（Ｆｌｏｗ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｓｙｓｔｅｍ；ＦＡＣＳ）、免疫組織化学染色などであってもよいが、これに制限されるわけではない。
関連技術分野における通常の専門家であれば、本明細書に記載の発明が説明された事項以外の変形および／または修正の余地があることを明確に理解することができる。本明細書に提供された発明は、記載された思想および／または範囲内におけるすべての変形および／または修正を含むことが理解されなければならない。また、本明細書に提供された発明は、本明細書に明示または参照されたすべての段階、特徴、組成物および／または化合物をそれぞれまたは総合的に含むことができる。
特定の具体例を次の実施例を参照して説明するが、これらの実施例は例示のみの目的のために設計され、先に言及された発明の範囲を限定するものではない。
理解されるように、本発明における開発および記述された塩基配列は、例えば、親和度成熟やＭＨＣ ｃｌａｓｓ２の結合力のモチーフを予測し除去して、免疫原性を減少して結合力を増加させる、この技術分野におけるよく知られた方法で修正された。この文書で開発および記述した塩基配列の治療剤の有用性は、抗体依存的細胞媒介毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、血清半減期、生物分類、Ｆｃ受容体結合力またはこの作用の組み合わせによる機能的特性を調節することにより向上できる。このような変形は、蛋白質工学、糖鎖工学または化学的方法によって行うことができる。要求された治療剤の適用により、このような活動の増加または減少は有利になる。
抗体の親和度成熟に対する数多くの方法は業界で周知である。これらの大部分は、親和力を増加させるために、突然変異パネルまたは変形蛋白質のライブラリーを生成し、スクリーニングおよび選択する一般的な戦略に基づいている。突然変異の誘発は、例えば、ＰＣＲエラーの誘発と遺伝子シャッフリング、突然変異誘発物質の放射線または化学物質の使用、エラーが発生しやすい複製機械を用いた突然変異遺伝子種類の使用、自然親和度成熟機械を活用した体細胞超突然変異の接近によってＤＮＡ水準で時々起こる。また、突然変異の誘発は、レプリカーゼを用いてＲＮＡ水準でも起こる。改善された変形蛋白質によるライブラリーに基づくスクリーニング方法は、ファージ、酵母、リボソーム、バクテリアまたは哺乳動物細胞のような多様なディスプレイ技術に基づいており、業界で周知である。親和度成熟は、３Ｄ蛋白質で発見された部位特異的変異または遺伝子合成のよって明確および予測可能になった。ＡＤＣＣまたはＣＤＣを増加させる方法は、業界における熟練した技術者に知られている。
抗体の血清半減期および生体分布度を変調する多数の方法は、抗体および新生児Ｆｃ受容体、異化作用からＩｇＧの保護に重要な役割の受容体の相互作用を変え、高い血清抗体の濃度を維持させる。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ６，２７７，３７５；６，８２１，５０５；７，０８３，７８４、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ７，２１７，７９７と、ＷＯ２０００／４２０７２の特許を参照すればよい。Ｆｃ受容体とこれらの受容体に媒介機能の結合力を調節する不変領域のアミノ酸置換の他の例は、ＦｃＲｎに結合力と血清半減期を含み、特許にＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｓ２００９０１４２３４０；２００９００６８１７５；と２００９００９２５９９；に説明されている。
抗体分子に連結されている糖鎖は、Ｆｃ受容体と糖鎖受容体の相互作用に影響を及ぼして血清半減期を含む抗体の活性に影響を与える。したがって、抗体の活性を調節する糖鎖形態は治療剤の有利な点を付与することができる。操作された糖鎖形態を生成する方法は、業界でよく知られているが、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ６，６０２，６８４；７，３２６，６８１；７，３８８，０８１；およびＷＯ２００８／００６５５４に記載されているものに限定されない。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加して半減期を延長する方法は、蛋白質の血清半減期を延長するのに用いている。
本明細書に使用されたものとして、「配列相同性」または「％同一性」は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の同一順序に配列されたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の個数の、全体ヌクレオチドまたはアミノ酸の個数に対する比率を示す。
いずれか１つのポリペプチドに対する、他のポリペプチドの％同一性は、空白の生成に対する不利益＝５と、空白の増加に対する不利益＝０．３のＧＡＰ分析法によって決定可能である。クエリー塩基配列は長さが少なくとも５０個のアミノ酸であり、ＧＡＰ分析は少なくとも５０個のアミノ酸の領域に２つの塩基配列の領域を合わせる。さらに好ましくは、クエリー塩基配列の長さは少なくとも１００個のアミノ酸であり、ＧＡＰ分析法は少なくとも１００個のアミノ酸の領域上に２つの塩基配列の領域を合わせる。さらに好ましくは、クエリー塩基配列の長さは少なくとも１００個のアミノ酸であり、ＧＡＰ分析法は少なくとも１００個のアミノ酸の領域上に２つの塩基配列の領域を合わせる。よりさらに好ましくは、クエリー塩基配列の長さは少なくとも２５０個のアミノ酸で、ＧＡＰ分析法は少なくとも２５０個のアミノ酸の領域上に２つの塩基配列を整列する。よりさらに好ましくは、クエリー塩基配列の長さは少なくとも２５０個のアミノ酸で、ＧＡＰ分析法は少なくとも２５０個のアミノ酸の領域上に２つの塩基配列を整列する。最も好ましくは、議論とされている２つのポリペプチドの全体長さのアミノ酸塩基配列を整列するのである。
同定されたポリペプチドに対して、％同一性が高いほど好ましいことは容易に理解されるであろう。したがって、適用可能であれば、最小限の％同一性の数値に照らして、ポリペプチドは、好ましくは少なくとも９５％以上、さらに好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％以上、さらに好ましくは少なくとも９９％以上、さらに好ましくは９９．１％以上、さらに好ましくは９９．２％以上、さらに好ましくは９９．３％以上、さらに好ましくは９９．４％以上、さらに好ましくは９９．５％以上、さらに好ましくは９９．６％以上、さらに好ましくは９９．７％、さらに好ましくは９９．８％、よりさらに好ましくは９９．９％のアミノ酸配列の同一性は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに関連づけられたアミノ酸配列を含んでいることが好ましい。
本明細書におけるポリペプチドのアミノ酸またはヌクレオチド配列変異は、化学的または放射線処理によって生体内で核酸の突然変異によってヌクレオチドの変化により導入されて生成されたものであってもよい。このような突然変異の例は、欠失、挿入またはアミノ酸配列の残基の置換を含む。１９８８、Ｈａｒａｙａｍａによって説明される本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャッフリング技術に属しており、また、試験管内による方法は、エンコーディングポリペプチドの変形からポリヌクレオチドを生成する。このようなＤＮＡシャッフリング技術は、ムギ以外の植物種からＲｈｔ−Ｂ１のような、本発明に関連する遺伝子配列を使用することができる。突然変異／変形ＤＮＡから得られた生産品は、例えば、過増殖表現型を有するかを確認するために、本文書で記述された手法を用いてスクリーニングすることができる。
例えば、アミノ酸配列の欠失は、一般に、約１〜１５個のアミノ酸残基の範囲、例えば、１〜１０個のアミノ酸残基または連続する１〜５個のアミノ酸残基の欠失を含むことができる。
例えば、アミノ酸配列の置換は、ポリペプチド内のアミノ酸残基のうち１つ以上のアミノ酸残基が欠失し、その場に元のアミノ酸残基と異なる１つ以上のアミノ酸残基が挿入されたものを含むことができる。
本明細書に使用されたものとして、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、またはｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載された成分、段階、数値などを含む開放型意味で使用され、これを除いた成分、段階、数値などを排除するための意図で解釈されず、場合によって、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」を意味することが排除されない。
本明細書で言及されたすべての文献は参照として本明細書に含まれる。
本発明は、血液癌または固形癌細胞だけでなく、癌幹細胞まで治療可能な抗体および前記抗体が認知する抗原決定部位およびこれを認知する抗体またはその抗原結合断片を提供することによって、癌のより強力で根本的な治療が可能であり、効果的な癌治療剤の開発に寄与することができる。
図１は、ヒト胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７（左）とＡＧＳ（右）におけるＣＤ４３の発現をｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ法で確認した結果である（Ｘ軸：ＣＤ４３の発現率、Ｙ軸：Ｒｅａｄｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒｓ）。 図２Ａ〜２Ｃは、多様な固形癌細胞株におけるＣＤ４３の発現をｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ法で確認した結果である（２Ａ：胃癌細胞株；２Ｂ：大腸癌細胞株；２Ｃ：肝癌細胞株）。 図２Ａ〜２Ｃは、多様な固形癌細胞株におけるＣＤ４３の発現をｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ法で確認した結果である（２Ａ：胃癌細胞株；２Ｂ：大腸癌細胞株；２Ｃ：肝癌細胞株）。 図２Ａ〜２Ｃは、多様な固形癌細胞株におけるＣＤ４３の発現をｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ法で確認した結果である（２Ａ：胃癌細胞株；２Ｂ：大腸癌細胞株；２Ｃ：肝癌細胞株）。 図３は、ヒト胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７、ＳＮＵ−７１９、ＡＧＳに対する（抗−ＣＤ４３抗体）−ＭＭＡＥ接合体の細胞毒性を確認した結果である。 図４は、ヒト胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７、ＳＮＵ−７１９、ＡＧＳに対する（抗−ＣＤ４３抗体）−ＤＭ１接合体の細胞毒性を確認した結果である。 図５は、ヒト胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７、ＡＧＳに対する（抗−ＣＤ４３抗体）−Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ接合体の細胞毒性を確認した結果である。 図６は、ヒト胃癌細胞株移植された胃癌動物モデルにおける抗−ＣＤ４３抗体単独および抗−ＣＤ４３抗体−Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ接合体の抗癌効果を確認した結果である。 図７は、ヒト起源の多様な固形癌組織におけるＣＤ４３抗原決定部位の発現をｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ法で確認した結果である（Ｍ；ｍｅｄｕｌｌａ（髄質）、Ｃ；ｃｏｒｔｅｘ（皮質））。 図８は、ヒト起源の多様な固形癌の疾患別ＣＤ４３抗原決定部位の発現をｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ法で確認した結果である（Ａ；ｓｉｇｎｅｔ ｒｉｎｇ ｃｅｌｌ胃癌（Ｓｔｏｍａｃｈ ｓｉｇｎｅｔ ｒｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｂ；乳管浸潤腺癌（Ｂｒｅａｓｔ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｄｕｃｔ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｃ；膵臓癌（Ｐａｎｃｒｅａｓ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｄ；腎臓癌（Ｋｉｄｎｅｙ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｅ；肺癌（ｌｕｎｇ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｆ；扁平細胞癌（ＬａｒｙｎＸ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｇ；膀胱癌（Ｇａｌｌ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｈ；子宮扁平細胞癌（Ｃｅｒｖｉｘ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｉ；子宮頸部扁平細胞癌（Ｕｔｅｒｕｓ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｊ；膀胱癌（Ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、Ｋ；肺扁平細胞癌（Ｌｕｎｇ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｌ；顆粒性肉腫（Ｅａｒ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ））。 図９は、ヒトの胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７の癌幹細胞におけるＣＤ４３、ＣＤ４４、およびＣＤ１３３の発現をｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ法で確認した結果である。 図１０は、胸腺組織を抗−ＣＤ４３単クローン抗体（ＹＧ５）で免疫組織化学染色した結果である。 図１１は、胸腺細胞に対する抗−ＣＤ４３単クローン抗体（ＹＧ５）の反応性を測定した流細胞測定グラフである。 図１２は、１１種のＣＤ４３欠損型突然変異（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）を図式的に示す図である。 図１３は、１１種のＣＤ４３欠損型突然変異に対する抗−ＣＤ４３（ＥＢ−１）単クローン抗体の反応性を確認したウェスタンブロットの結果である。 図１４は、抗−ＣＤ４３抗体の重鎖および軽鎖発現プラスミドの作製過程を例として示す模式図である。 図１５は、正常血液細胞にノイラミニダーゼ処理後、抗−ＣＤ４３抗体のＣＤ４３ｅｐｉｔｏｐｅに対する結合力を示すグラフである。 図１６は、抗−ＣＤ４３抗体の組換えＣＥＡＣＡＭ５とＣＥＡＣＡＭ６に対する交差反応性を測定した結果を示すグラフである。 図１７は、腫瘍幹細胞（ｔｕｍｏｒ ｓｐｈｅｒｅ）におけるＣＤ４３ｅｐｉｔｏｐｅの発現程度を示すグラフである。 図１７は、腫瘍幹細胞（ｔｕｍｏｒ ｓｐｈｅｒｅ）におけるＣＤ４３ｅｐｉｔｏｐｅの発現程度を示すグラフである。 図１８は、ＣＥＭ７またはＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（低いＣＤ４３抗原決定部位の発現）に対する抗−ＣＤ４３抗体の細胞毒性を示すグラフであって、抗−ＣＤ４３抗体は直接的な細胞毒性がないことを示す。 図１９は、毒素（ｓａｐｏｒｉｎ）が接着された抗−ＪＬ−１抗体（ｓａｐｏｒｉｎ接合抗−ＪＬ−１抗体）を処理した目的細胞の生存率を示すグラフであって、ｓａｐｏｒｉｎ接合抗−ＪＬ−１抗体によって細胞自滅死が起こることを示す。 図２０は、図１９で説明した細胞死滅試験において抗−ＪＬ−１抗体（抗−ＣＤ４３抗体）（げっ歯類、ヒト抗体とも）のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ現象を示すグラフであって、マウスＪＬ−１抗体を３０分間冷蔵状態で細胞に処理した後、３７℃の条件に移した後、グラフのｘ軸に表示されたそれぞれの時間の時に１０６細胞を取って、冷蔵温度でａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＰＥ二次抗体を１０分間処理し、細胞を洗浄して固定した後、流細胞分析器で分析して得られた結果である。 図２１は、抗原を発現する細胞において抗−ＪＬ−１抗体によって誘導される同種細胞凝集現象を示すイメージで、それぞれ３００、０００個の細胞に抗−ＪＬ−１抗体４０ｕｇ／ｍＬの開始濃度で処理して、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した後、定められた時間に応じて顕微鏡写真を撮ってイメージを得ており、本図は、抗体処理２時間経過時点で得られたイメージである。 図２２は、正常骨髄細胞における低くて異質的なＪＬ−１抗原の発現を示す結果であって、正常骨髄の単核球をｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＪＬ１で染色した後、続いて、Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｆ（ａｂ）２−ＰＥで染色して観察し、Ｈｉｓｔｏｇｒａｍ ｏｖｅｒｌａｙはリンパ球に限って表現したものである。 図２３は、末梢血液細胞におけるＪＬ−１抗原の発現率を示すもので、低い発現率を確認することができ、前記結果は２つの正常ヒトＰＢＭＣサンプルをマウス抗−ヒトＪＬ−１（青色線：（ｄ））で染色して測定した。 図２４は、正常骨髄細胞にｓａｐｏｒｉｎを結合させた抗−ＪＬ−１抗体を予め処理した場合の（ＪＬ１＋）と、予め処理しない場合（ＪＬ１−）の骨髄下位集合（ｓｕｂｓｅｔ）のコロニー形成程度を測定した結果を示すグラフであって、ｓａｐｏｒｉｎを結合させた抗−ＪＬ−１抗体を予め処理した場合（ＪＬ１＋）に、骨髄下位集合（ｓｕｂｓｅｔ）のコロニーを形成しないことを確認することができ、前記結果は骨髄を分離して白血球を収穫し、ＣＤ３４＋細胞はＪＬ−１の陽性と陰性に分けて分離収穫し、収穫した細胞をｃｙｔｏｋｉｎｅと共にＭｅｔｈｏｃｕｌｔに入れた後、測定した。 図２５は、細胞株を用いた白血病ＡＬＬ異種移植モデルにおいて抗−ＪＬ１抗体自体と結合された毒素と抗−ＪＬ１抗体の治療効果を示すグラフであって、（Ａ）はＣＥＭ７ｌｅｕｋｅｍｉａ ｍｏｄｅｌでの結果を、（Ｂ）はＮＡＬＭ−６ｍｏｄｅｌ（Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ：ＮＡＬＭ６（Ｂ−ＡＬＬ））での結果をそれぞれ示し、試験は次の条件下で行った：Ｍｉｃｅ：ＮＯＤ−ＳＣＩＤ（８／ｇｒｏｕｐ）；接種：０日目１０７ｃｅｌｌｓ；投与：１５ｕｇ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ＋１００ｕｇ ｂｕｌｋ ＩｇＧ ｉ．ｖ．１ｘ／ｗｅｅｋ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｄａｙ８；終了時点：マヒ状態。 図２６は、主要ＡＭＬ ｂｌａｓｔと下位集合物（ｓｕｂｓｅｔ）におけるＪＬ−１の発現程度を示す。 図２７は、キメリックヒト化ＪＬ１による細胞死滅効果（ＡＤＣＣ ａｎｄ ＣＤＣ）を示すグラフであって、ＡはＣＥＭ７細胞株を効果器細胞（ＰＢＭＣ）とＪＬ１キメリック抗体または対照群との間に培養した後、細胞毒性をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを用いて測定した結果であり、ＢはＣＥＭ７細胞株を培養培地とＪＬ１キメリック抗体をウサギ補体と共に培養した後、細胞毒性をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを用いて測定した結果である。この時、対照群は実験と無関係なＩｇＧ１イソタイプ抗体を使用した。 図２８は、脱フコシル化された時、ＪＬ−１キメラ抗体のＡＤＣＣ活性が増加することを示す結果である。 図２９は、ｉｎ ｖｉｖｏでいずれとも結合しないキメリック抗体自体のＣＥＭ７細胞株での効果を示すグラフである。 図３０は、白血病幹細胞（Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＬＳＣ）下位集合（ｓｕｂｓｅｔ）におけるＪＬ１の発現を示す結果である。 図３１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで毒素（サポリン：ＳＡＰ）と接合した抗−ＪＬ１抗体（ＣＣＣ）を用いたコロニーの分析結果（コロニーの平均個数）を示すグラフであって、抗原−陽性ＡＭＬの細胞死滅効果を示し、細胞はＪＬ１−サポリンまたはマウスＩｇＧ１−サポリンと共に幹細胞コロニーｍａｔｒｉｘに入れて観察した。 図３２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで毒素（サポリン：ＳＡＰ）を接合させた抗−ＪＬ１抗体（ＣＣＣ）が抗原陽性の主要ＡＭＬの増殖に及ぼす影響を示すグラフである。 図３３は、ＮＳＧマウスにおいて毒素が結合された抗体による主要ＡＭＬ癌細胞成長の抑制効果（ｉｎ ｖｉｖｏ）を示すグラフであって、ＪＬ−１＋ＡＭＬ患者から５×１０７個の骨髄細胞を収穫し、放射線照射を受けたＮＳＧマウス３０匹に静脈注射し、８週後に前記マウスにＪＬ１−ｄｅｂｏｕｇａｎｉｎ（ＤＢ）、ｈＩｇＧ１−ＤＢ、またはＰＢＳを４週間４５ｕｇの用量で毎週投与した後、骨髄と脾臓を収穫し、生着と腫瘍生成を観察した。 図３４および３５は、多様なヒト化／最適化した変形抗体が原型（マウス）ＪＬ−１抗体と比較した時、同等のバインディングプロファイルを示すことを確認した結果であって、図３４は、ＣＥＭ７細胞を親原型ＪＬ−１抗体と３種類のヒト化に変形させた抗体で染色して観察した結果であり、変形した「Ｃｏｍｂｏ Ａ」が最も良いプロファイルを示すが、その他の試験抗体もすべてＣＥＭ７細胞で細胞毒性を有意な程度に示すことが確認され； 図３５は、最終３個の変形抗体を内在化細胞毒性分析方法で試験した結果を示すもので、抗体をａｎｔｉｈｕｍａｎ ＩｇＧ−ｓａｐｏｒｉｎと予め混合した後、細胞に処理して、３日後に細胞毒性を測定した結果である。 図３６は、最高２ラウンドと３ラウンドのクローンのアミノ酸配列の整列結果を示すもので、それぞれ親クローンとよりヒト化されたクローンのアミノ酸配列を比較したものである。このうち、１５３−２８が３６−１０Ｑ６Ｒに由来し、２５７−１０は４５−３７に由来した。ＣＤＲｓは太くて下線のフォントで表示した。 図３７Ａは、流動細胞計測法によってＪＬ−１陽性ＣＥＭ７細胞においてＡＲＴ１４０リード候補のＩｇＧとの結合程度を示すグラフであり、図３７Ｂは、陰性対照群のＵ９３７細胞での結果を示すグラフである。 図３７Ａは、流動細胞計測法によってＪＬ−１陽性ＣＥＭ７細胞においてＡＲＴ１４０リード候補のＩｇＧとの結合程度を示すグラフであり、図３７Ｂは、陰性対照群のＵ９３７細胞での結果を示すグラフである。 図３８Ａは、細胞基盤ＥＬＩＳＡ（懸濁液に生きている細胞）によってＪＬ−１陽性ＣＥＭ７細胞においてＡＲＴ１４０リード候補とＩｇＧとの結合程度を示すグラフであり、図３８Ｂは、陰性対照群のＵ９３７細胞での結果を示すグラフである。 図３８Ａは、細胞基盤ＥＬＩＳＡ（懸濁液に生きている細胞）によってＪＬ−１陽性ＣＥＭ７細胞においてＡＲＴ１４０リード候補とＩｇＧとの結合程度を示すグラフであり、図３８Ｂは、陰性対照群のＵ９３７細胞での結果を示すグラフである。 図３９Ａは、流動細胞計測法によってリード候補群とクイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ）突然変異のＩｇＧがＪＬ−１陽性ＣＥＭに結合する程度を示すグラフであり、図３９Ｂは、陰性対照群のＵ９３７細胞での結果を示すグラフである。 図３９Ａは、流動細胞計測法によってリード候補群とクイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ）突然変異のＩｇＧがＪＬ−１陽性ＣＥＭに結合する程度を示すグラフであり、図３９Ｂは、陰性対照群のＵ９３７細胞での結果を示すグラフである。 図４０Ａ−４０Ｃは、流動細胞計測法によってクイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ）突然変異のＩｇＧがＪＬ−１陽性ＣＥＭに結合する程度を示すグラフである。 図４０Ａ−４０Ｃは、流動細胞計測法によってクイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ）突然変異のＩｇＧがＪＬ−１陽性ＣＥＭに結合する程度を示すグラフである。 図４０Ａ−４０Ｃは、流動細胞計測法によってクイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ）突然変異のＩｇＧがＪＬ−１陽性ＣＥＭに結合する程度を示すグラフである。 図４１Ａ−４１Ｃは、細胞基盤ＥＬＩＳＡ（懸濁液に生きている細胞）によってＪＬ−１陽性ＣＥＭ７と結合するクイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ）突然変異のＩｇＧの確認した結果を示すグラフである。 図４１Ａ−４１Ｃは、細胞基盤ＥＬＩＳＡ（懸濁液に生きている細胞）によってＪＬ−１陽性ＣＥＭ７と結合するクイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ）突然変異のＩｇＧの確認した結果を示すグラフである。 図４１Ａ−４１Ｃは、細胞基盤ＥＬＩＳＡ（懸濁液に生きている細胞）によってＪＬ−１陽性ＣＥＭ７と結合するクイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ）突然変異のＩｇＧの確認した結果を示すグラフである。 図４２は、キメリック抗体ＤＮＰ００１のエピトープ結合活性を示すグラフである。 図４３は、ヒト化抗体の糖化部位アミノ酸残基除去変異抗体を製造するために置換される軽鎖可変領域の糖化部位アミノ酸を例として示す。 図４４は、ヒト化抗体の糖化部位アミノ酸残基除去変異抗体に対する糖化部位に結合するコンカナバリンＡ（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ）−ＨＲＰを用いたウェスタンブロッティングの結果である。 図４５は、ヒト化抗体の糖化部位アミノ酸残基除去変異抗体の抗原（ＣＤ４３）陽性細胞のＣＥＭ７細胞との結合力を示すグラフである。 図４６は、キメリック抗−ＣＤ４３抗体と糖化部位アミノ酸残基除去されたヒト化抗−ＣＤ４３抗体の抗原（ＣＤ４３）陽性細胞のＣＥＭ７細胞との結合力を示すグラフである。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これは例示に過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするものではない。下記記載の実施例は、発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形できることは当業者にとって自明である。
実施例１．抗−ＣＤ４３抗体の製造
１−１．マウス抗体の製造
１−１−１．単一クローン抗体生産細胞の製造
ヒト胸腺細胞を抗原として注入したＢａｌｂ／ｃ白ネズミの脾臓細胞と８−アザグアニン（８−ａｚａｇｕａｎｉｎｅ）耐性（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）マウスの骨髄腫細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５８１）の融合により作った。
Ｂａｌｂ／ｃ白ネズミに６週間２週間隔で１０７個のヒト胸腺細胞（ソウル大学病院）を腹腔内注射して免疫反応を誘導し、最後の追加接種後３日目に脾臓を摘出して細胞浮遊液を作った。ケラーとミルステイン（Ｋｏｅｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ１９７５）の方法により、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）で１０８個の脾臓細胞と１０７個の骨髄腫細胞を５０％ポリエチレングリコール４００を用いて細胞融合した。融合された細胞は洗浄した後、２０％ウシ胎児血清、１００ｕＭヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）、０．４４ｕＭアミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）および１６ｕＭチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）が補充されたＤＭＥＭ培養液（ＨＡＴ培養液）に再浮遊させ、細胞は９６−ウェルプレート（９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に分注し、３７℃、５％ＣＯ２が供給される培養器で培養した。
２週後、集落の形成が観察されると、上清液を取って抗体力価を免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）および流細胞測定（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて測定した。
陽性集団は、ウェル（ｗｅｌｌ）あたり１０５個以上の細胞が単一に形成された場合とした。上清液の抗体力価が高い群落が形成されたウェルから細胞を取って、制限希釈試験（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）方法によりサブクローニングして抗体力価が高い単一クローン細胞を得た。単一クローン細胞の培養液は上清液を取って後の実験のために保管した。
１−１−２．胸腺細胞の細胞表面蛋白質に対する抗体を生産する単一クローン細胞の選別
胸腺の凍結組織（ソウル大学病院）およびパラフィン包埋組織（ソウル大学病院）を４マイクロメートルの厚さに薄切して使用した。パラフィン包埋組織はパラフィン除去過程を経た後、正常ヤギ血清（ＢｉｏＧｅｎｅｘ社製品）を加えた後、室温で１時間放置した。前記組織にそれぞれ一次抗体（ダイノナ（株）、Ｄｉｎｏｎａ）を塗布した後、４℃の低温室に一晩置いて反応させた後、翌日、リン酸塩緩衝食塩水で３回洗浄した。二次抗体としてビオチン結合ヤギ抗−マウス免疫グロブリン（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ；２滴、ＤＡＫＯ）を用いて１時間室温に放置した後、リン酸塩緩衝食塩水で３回洗浄し、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰ接合体を処理した。これにＨ２Ｏ２−アミノエチルカルバゾール（Ｈ２Ｏ２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｚｏｌｅ）溶液を塗布した後、２０分間処置し、リン酸塩緩衝食塩水で３回水洗した後、光学顕微鏡で発色を観察した。
その結果、ヒト胸腺細胞にだけ特異に反応する抗体を生産する単一クローン細胞株Ｈ−ＪＬ１を選別することができた。前記得られた細胞株は、１９９７年１月１３日付で大韓民国ソウル市鍾路区蓮建洞所在の韓国細胞株研究財団（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ；ＫＣＬＲＦ）に寄託して、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００１０を与えられた。
前記選別した単一クローン細胞株の上清液で胸腺組織を免疫組織化学染色し、胸腺細胞が陽性に染色されたことを確認した（図１０）。また、陽性に染色された胸腺細胞は細胞の周辺部に強く染色される様相を示し、前記単一クローン細胞株は細胞表面蛋白質に対する抗体を生産することが分かった。
胸腺細胞の発達段階で前記抗体の反応を確認するために流細胞測定を行った。心臓手術のために摘出したヒトの胸腺を小さい片に切断し、ガラススライドで引いて胸腺細胞を採取した。分離した胸腺細胞に前記抗体（１×１０＾５細胞／抗体１０ｕｇ／ｍｌ）を３０分間４℃で反応させた後、冷リン酸塩緩衝食塩水で洗浄し、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）が結合されたヤギ抗−マウス免疫グロブリン抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を３０分間４℃で反応させた。冷リン酸塩緩衝食塩水で洗浄し、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）が結合された抗−ＣＤ８抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とＡＰＣが結合された抗−ＣＤ４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を５ｕｌずつ入れて、３０分間４℃で反応させた。冷リン酸塩緩衝食塩水で洗浄し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて流細胞測定を行った。ＣＤ４とＣＤ８の発現様相によって、胸腺細胞をＣＤ４−ＣＤ８−胸腺細胞→ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺細胞→ＣＤ４＋ＣＤ８−あるいはＣＤ４−ＣＤ８＋胸腺細胞に区分し、前記抗体は４種類の胸腺細胞にすべて反応したが、特にＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺細胞に高く反応した（図１１参照）。図１１において、灰色領域は陰性対照群であり、実線は選別された抗体で染色したグラフである。
１−１−３．選別した単クローン細胞株から単クローン抗体の生産
１０％ウシ胎児血清が含まれているＤＭＥＭ培地で培養した単クローン細胞１０７個をプリスタン（ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを３週前に予め腹腔内注射したＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔に注射し、２−３週後にマウスの腹水を採取した。前記腹水から５−１０ｍｇ／ｍｌの高濃度抗体を得ることができた。
腹水から抗体を精製するために、Ｑ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製品）クロマトグラフィーおよびヒドロキシルアパタイト（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅ、Ｂｉｏ−ｇｅｌ ＨＴＰ Ｇｅｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製品）クロマトグラフィーを施した。腹水１０ｍｌあたり３．１４ｇのアムモニウムスルフェート（（ＮＨ４）２ＳＯ４）を加えて氷上で徐々に溶かした（５０％（ＮＨ４）２ＳＯ４沈殿）。この混合物を１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、沈殿物を脱イオン水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ）に溶かした後、１Ｌの緩衝液（２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７．４）に透析した。
前記溶液を緩衝溶液（２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７．４）で予め平衡させたＱ−セファロースカラムに通過させて吸着させた後、緩衝溶液Ｉ（２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７．４）および緩衝溶液ＩＩ（２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて、ＮａＣｌの濃度勾配を０Ｍから０．８Ｍの線形勾配で流して、溶出物を得た。各分画は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥして、多量の抗体が含有された分画を集めた。前記分画は緩衝液（２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ６．８）に透析し、緩衝溶液（２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ６．８）で予め平衡させたヒドロキシルアパタイトカラムに通過させながら吸着させた後、緩衝溶液ＩＩＩ（２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ６．８）および緩衝溶液ＩＶ（３００ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ６．８）を用いて、リン酸の濃度勾配が０Ｍから０．３Ｍまでとなるように線形勾配で流して、溶出物を得た。分画は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥして、抗体の純度が９５％以上となる分画だけを集めた。前記実験により、腹水１ｍｌあたり５−１０ｍｇの単クローン抗体を回収することができた。
前記得られた抗体をＹＧ５と名付けた。
１−１−４．ＣＤ４３の抗原決定部位の分析
＜ＣＤ４３の一部切片を含む構造体の構築＞
図１２に示すように、それぞれのＣＤ４３欠損型突然変異を作製し、前記欠損型突然変異に対するＹＧ５抗体の反応性を確認して、ＣＤ４３の抗原決定部位を分析した。ＣＤ４３蛋白質（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ６１８２７．１）は計４００個のアミノ酸からなり、１から１９番目のアミノ酸配列は信号配列であり、２０から２５４番目のアミノ酸配列は細胞外ドメインであり、２５５から２７７番目のアミノ酸配列はトランスメンブレンドメインであり、２７８から４００番目のアミノ酸配列は細胞内ドメインである。
欠損型突然変異それぞれはグルタチオン−Ｓ−転移酵素（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＧＳＴ）のＣ末端に融合発現するようにＤＮＡ構造体を作製した後、これをｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）ベクターに挿入した。以下、ＣＤ４３蛋白質の１から２５３番目のアミノ酸配列を含むベクターをｐＧＥＸ１−２５３とし、１から９８番目のアミノ酸配列を含むベクターをｐＧＥＸ１−９８、１から８７番目のアミノ酸配列を含むベクターをｐＧＥＸ１−８７、１から８７番目のアミノ酸配列を含むベクターをｐＧＥＸ１−８１、１から７５番目のアミノ酸配列を含むベクターをｐＧＥＸ１−７５、１から７０番目のアミノ酸配列を含むベクターをｐＧＥＸ１−７０、７０から９８番目のアミノ酸配列を含むベクターをｐＧＥＸ７０−９８とし、前記と同一の原理でｐＧＥＸ７１−８１、ｐＧＥＸ７６−８１、ｐＧＥＸ７３−８１、そしてｐＧＥＸ７３−８０と名付けた。
欠損型突然変異をコーディングする配列はヒトＣＤ４３ｃＤＮＡから増幅させて使用し、ＰＣＲプライマーはＧｅｎｅｂａｎｋ上の配列から作製し、ただし、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ制限酵素部位が含まれるようにした。ＰＣＲ産物はＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩで切断した後、同一制限酵素部位のｐＧＥＸ−２Ｔに連結させた後、Ｅ．ｃｏｌｉコンピテントＴＯＰ１０Ｆ’細胞［Ｆ’［ｌａｃＩｑ、Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ）］、ｍｃｒＡ、Ｄ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）、８０ｌａｃＺＤＭ１５、ｌａｃＸ７４、ｄｅｏＲ、ｒｅｃＡ１、ａｒａＤ１３９Ｄ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７、ｇａｌＫ、ｒｐｓＬ（ＳｔｒＲ）、ｅｎｄＡ１、ｎｕｐＧ］に形質導入した。形質転換体の塩基配列は分析して、欠損型突然変異配列を再確認した。
＜ＧＳＴ−ＣＤ４３欠損型突然変異体融合蛋白質の発現＞
形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞は５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンが添加されたＬＢ培地で３７℃で一晩培養し、培養された細胞をＬＢ培地で２０倍希釈した後、ＯＤ０．６となるように３〜４時間培養した。培養物にＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を最終濃度１ｍＭで添加して４時間さらに培養した後、６，０００ｇで１５分間遠心分離した。細胞だけを得て、細胞１ｇあたり３ｍｌの溶解（ｌｙｓｉｓ）緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で懸濁した後、最終濃度０．２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を加えた後、３０分間氷上に置いた。
＜ＣＤ４３抗原決定部位の分析＞
計１１種の欠損型突然変異を発現するそれぞれの形質転換体の溶解質（ｌｙｓａｔｅ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ＹＧ５抗体および抗−ＧＳＴ抗体でそれぞれウェスタンブロットを実施した。
図１３は、１１種の欠損型突然変異に対するＹＧ５抗体の反応性を確認したウェスタンブロットで、ＡはＹＧ５抗体を用いたものであり、ＢはＧＳＴ抗体を用いたものである。また、レーン１はｐＧＥＸ１−２５３であり、レーン２はｐＧＥＸ１−９８であり、レーン３はｐＧＥＸ１−８７であり、レーン４はｐＧＥＸ１−８１であり、レーン５はｐＧＥＸ１−７５であり、レーン６はｐＧＥＸ１−７０であり、レーン７はｐＧＥＸ７０−９８であり、レーン８はｐＧＥＸ７１−８１であり、レーン９はｐＧＥＸ７３−８１であり、レーン１０はｐＧＥＸ７６−８１であり、レーン１１はｐＧＥＸ７３−８０であり、レーン１２はｐＧＥＸ−２Ｔであり、レーン１３はヒト胸腺細胞である。図１９に示されるように、ＹＧ５抗体に対して反応性を有する最小単位の欠損型突然変異はｐＧＥＸ７３−８１で確認され、ＣＤ４３の抗原決定基は７３〜８１番目のアミノ酸配列（Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）であることが分かる。
前記実施例をまとめると、ＹＧ５は、従来知られた他の抗体とは異なり、ＣＤ４３糖蛋白質の糖成分でない７３−８１番目のアミノ酸配列を直接認知し、この配列は造血細胞発達段階中、主にリンパ球前駆細胞と胸腺細胞では露出してＹＧ５抗体が認知可能であり、造血幹細胞と成熟白血球および血小板では７８−８１番目のアミノ酸配列周囲の糖化や構造変化で遮られてＹＧ５抗体が認知できないことが分かる。
１−２．キメリック抗体の製造
前記作製された抗−ＣＤ４３マウス抗体ＹＧ５のアミノ酸配列に基づいて、抗−ＣＤ４３キメリック抗体を作製した。
１−２−１．プラスミドの作製
抗−ＣＤ４３キメリック抗体の発現のために、重鎖発現用プラスミドと軽鎖発現用プラスミドをそれぞれ作製した。重鎖発現用プラスミドはｐＯｐｔｉＶＥＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ベクターを使用し、軽鎖発現用プラスミドはｐｃＤＮＡ３．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ベクターを使用した。抗体発現のための重鎖および軽鎖の可変領域コーディングｃＤＮＡはＩｇ−Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いてクローニングし、ｐＧｅｍ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に挿入した後、シーケンシングによりＤＮＡ塩基配列を確認し、ＩＭＧＴ ｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）を通してマウス抗体遺伝子を確認した。
追加的なアミノ酸の挿入なしに抗体それぞれの可変領域コーディングｃＤＮＡと不変領域コーディングｃＤＮＡを連続的なアミノ酸配列として発現させるために、前記クローニングした可変領域のコーディング塩基配列と周知のｈｕｍａｎ ＩｇＧ１不変領域（重鎖）およびｋａｐｐａ不変領域（軽鎖）コーディング塩基配列を連結した遺伝子片それぞれを合成（Ｂｉｏｎｅｅｒ社）した。このように合成した重鎖および軽鎖発現遺伝子は制限酵素Ｘｈｏ ＩとＳａｌ Ｉで切断した後、重鎖遺伝子片はｐＯｐｔｉＶｅｃベクターに、軽鎖遺伝子片はｐｃＤＮＡ３．３ベクターにそれぞれｌｉｇａｔｉｏｎして、完全な抗体発現用プラスミドを作製した（ｐｃＤＮＡ３．３−ａｎｔｉ−ＣＤ４３軽鎖発現プラスミドおよびｐＯｐｔｉＶＥＣ−ａｎｔｉ−ＣＤ４３重鎖発現プラスミド）。
このような重鎖および軽鎖発現プラスミドの作製過程を図１４に模式的に示した。
２−１−２．形質転換
前記作製されたｐｃＤＮＡ３．３−ａｎｔｉ−ＣＤ軽鎖発現プラスミドとｐＯｐｔｉＶＥＣ−ａｎｔｉ−ＣＤ４３重鎖発現プラスミドをＣＨＯ細胞由来のＤＧ４４細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせて形質転換過程を行った。
まず、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ３日前に浮遊状態のＤＧ４４細胞を５％ＦＢＳが含まれているＭＥＭａ培地に適応させることにより、付着状態の細胞に変換させて形質転換効率を高められるように適応させた。形質転換はＥｆｆｅｃｔｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで行った。形質転換前日に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で継代培養して付着状態で適応されたＤＧ４４細胞を準備し、形質転換に使用されたＤＮＡの量はｐｃＤＮＡ３．３−ａｎｔｉ−ＣＤ軽鎖発現プラスミドとｐＯｐｔｉＶＥＣ−ａｎｔｉ−ＣＤ４３重鎖発現プラスミドそれぞれ２ｕｇずつ同量の組み合わせで使用した。形質転換は４８時間行った。形質転換された細胞群を選別するために、流細胞分析器（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）および酵素免疫法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ：ＥＬＩＡ）を用いてＥ＃４、Ｅ＃５の２つのｃｌｏｎｅを選定した。このように選別された細胞群は３０ｎＭメトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ：ＭＴＸ）と４００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）が含有された５％Ｄｉａｌｙｚｅｄ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍを含むＭＥＭａ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ Ａｌｐｈａ）選別培地で培養を始めて、漸進的にＭＴＸとＧ４１８の濃度を高めていきながら形質転換細胞群を選別した。
２−１−３．形質転換細胞の培養および抗体の精製
前記選別された形質転換細胞群（２４．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、生存率（％）９０％以上）をｐｏｗｅｒ ＣＨＯ２ ＣＤＭ（Ｌｏｎｚａ；最終培地量８８０Ｌ）で３７℃および５％ＣＯ２の条件下で発現量が６００ｍｇ／Ｌ（ＩＰＣ（ｉｎ−ｐｒｏｃｅｓｓ ｃｏｎｔｒｏｌ）の基準による）に到達するまで培養した。
前記のように得られた培養液８００Ｌを取って、ｃｅｌｌ ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＰＯＤ ｆｉｌｔｅｒ（１．１／０．２ｕｍ）使用）過程を経た後、３段階のカラム工程（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（固定相：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、平衡緩衝液：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｐＨ７．５、溶離緩衝液：２０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ３．０）；ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（固定相：ＳＰ ＦＦ、平衡緩衝液：２０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ５．５、溶離緩衝液：２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、１５０ｍＭ、ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｐＨ６．１）；ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（固定相：Ｑ ＦＦ、平衡緩衝液：２０ｍＭ Ｓｏｉｄｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、ｐＨ６．５））により抗体を精製した。
前記クロマトグラフィーの条件は下記の通りにした：

最終原液のｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎは、ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ／ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ＵＦ／ＤＦ）工程によりバッファー交換および濃縮過程を同時に行って完成し、最終蛋白質の濃度は１１．５ｍｇ／ｍＬに調節した。
このような工程で抗−ＣＤ４３キメリック抗体を得ており、ＤＮＰ００１と名付けた。
２−１−４．キメリック抗体のエピトープ部位の結合力の確認
前記作製されたキメリック抗体ＤＮＰ００１（マウス抗体のようなＣＤＲ部位を有する）がマウス抗体と同一の抗原決定部位（エピトープ）に結合するかを確認するために、抗原決定部位ペプチドを合成してｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍｅ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）蛋白質に化学的に結合した後、ＥＬＩＳＡを行った。
−抗原決定部位ペプチド合成配列（ＤＮ２と命名）
ＥＧＳＰＬＷＴＳＩＧＡＳＴＧＳＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９；抗原決定部位は下線で表示する）
前記合成されたＤＮ２ペプチドをＥＤＣリンカーを介してＢＳＡ蛋白質に接合させてＤＮ２ペプチド−ＢＳＡ接合体を製造した。この時、ペプチド：ＢＳＡ蛋白質のＭｏｌａｒ ｒａｔｉｏを１５：１で使用した。
前記製造されたＤＮ２ペプチド−ＢＳＡ接合体をウェルあたり５０ｕｇ／ｍｌでコーティングした後、多様な濃度勾配でキメリック抗体ＤＮＰ００１を結合させて前記接合体に結合された抗体を検出して、キメリック抗体のＤＮ２ペプチド−ＢＳＡ接合体に対する反応性を測定した。前記結合された抗体は抗−ヒト抗体−ＨＲＰ（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｉｇ−ＨＲＰ）を用いて検出し、４５０ｎｍにおけるＯＤ値を測定して下記の表および図４２に示した。

前記表および図４２の結果のように、キメリック抗体ＤＮＰ００１は濃度依存的に抗原決定部位ペプチドに結合することを確認した。
実施例２：ヒト固形癌細胞株におけるＣＤ４３抗原決定部位の発現度調査
様々な固形癌細胞株におけるＣＤ４３の発現程度を調べるために、免疫染色（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）および流細胞分析を行った。
分析に使用された細胞株情報は次の通りである：
具体的には、前記それぞれの細胞株を１００ｍｍの細胞培養容器に接種および培養し、表面の７０〜８０％程度が培養細胞で密集した時、培養細胞をリン酸塩緩衝溶液で洗浄した後、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理して解離させた後、遠心分離した。沈殿された細胞を再び緩衝液に浮遊させて１×１０５ずつ分注し、前記実施例１−１で製造された抗ＣＤ４３抗体（ＹＧ５）−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）を１．５μｌずつ入れて、４℃の冷蔵庫で２０分間反応させた。４℃で２０分間反応させた細胞を緩衝液（１ｘＰｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ）４ｍｌで再び洗浄後、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）で分析した。比較のために、抗−ＣＤ４３抗体の代わりにＤＦＴ−１抗体（２ｕｌ、Ａｎｃｅｌｌ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、前記と同一の試験を行った。
前記得られた結果を図１および図２Ａ−２Ｃに示した。図１において、Ｘ軸は提示された細胞株において抗体ＹＧ５に反応する抗原ＣＤ４３の発現率を示すものであり、Ｙ軸はＲｅａｄｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒｓ（ｃｏｕｎｔｓ）を意味する。図１および図２Ａ−２Ｃに示されるように、大腸癌ではＤｕｋｅ’ｓ類型Ｂ腺癌（ＬＳ１７４Ｔ）で約６０％の発現率を示し、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９で約５０、３７％の発現率を示し、その他にも様々な種類の固形癌細胞株でＣＤ４３（抗原決定部位）の発現が確認された。
実施例３：抗ＣＤ４３抗体の癌細胞に対する細胞毒性試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
３−１．抗体−毒素接合体の作製
単クローン抗体のサポリン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）接合は既存の方法により実施した（Ｐｏｌｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００４）。抗体（ＤＮＰ００１；実施例１−２で製造）とサポリンをそれぞれ２ｍｇ／ｍｌ（抗体の濃度）と８ｍｇ／ｍｌ（サポリンの濃度）の濃度で５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｂｏｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．０）に溶かした後、２−ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ（Ｓｉｇｍａ）をそれぞれ０．４ｍＭと１．０ｍＭの濃度で処理した。その後、抗体とサポリンを１０：１の比率で混合して室温で１６時間反応させ、抗体−サポリン接合体をゲルろ過（ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）で精製した。以下、準備された接合体を抗−ＣＤ４３−サポリン接合体と記載する。
前記方法を参照して、抗ＣＤ４３抗体（ＤＮＰ００１；実施例１−２で製造）とモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ；Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）が接合された抗−ＣＤ４３−ＭＭＡＥ接合体、抗ＣＤ４３抗体（ＤＮＰ００１）とＮ２’−ジアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）マイタンシン（ＤＭ１；Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＬＬＣ）が接合された抗−ＣＤ４３−ＤＭ１接合体、およびＣＤ４３抗体（ＤＮＰ００１）とＤｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＬＬＣ）が接合された抗ＣＤ４３抗−ＣＤ４３−Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ接合体と抗ＣＤ４３抗体（ＤＮＰ００１）−ＤＭ１接合体をそれぞれ準備した。
３−２．胃癌細胞に対する抗ＣＤ４３抗体−毒素接合体の細胞毒性
前記実施例３−１で準備された抗体−毒素接合体（抗−ＣＤ４３−サポリン接合体、抗−ＣＤ４３−ＤＭ１接合体、抗−ＣＤ４３−ＭＭＡＥ接合体、および抗−ＣＤ４３−Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ接合体）の胃癌細胞に対する細胞毒性を試験した。
試験前日、胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７、ＡＧＳ、およびＳＮＵ７１９をそれぞれウェルあたり４×１０３個ずつｐｌａｔｔｉｎｇした。前記準備されたそれぞれの抗体−毒素接合体を１００００ｎｇ／ｍｌ（（抗−ＣＤ４３抗体）−ＭＭＡＥ接合体および（抗−ＣＤ４３）−ＤＭ１接合体の場合）または１０００ｎｇ／ｍｌ（（抗−ＣＤ４３）−Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ接合体の場合）の濃度でそれぞれの胃癌細胞株に処理し、２４時間、４８時間、７２時間後にそれぞれのウェルにＥｚＣｙｔｏｘ（Ｄａｅｉｌ ｌａｂ、Ｋｏｒｅａ）を１０ｕｌずつ添加して、３７℃、ＣＯ２培養器で１時間培養後、ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙで測定した。
前記得られた各接合体の細胞毒性を図３（（抗−ＣＤ４３抗体）−ＭＭＡＥ接合体）、図４（（抗−ＣＤ４３）−ＤＭ１接合体）および図５（（抗−ＣＤ４３）−Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ接合体）に示した。細胞毒性は次の数式で算定した：
細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；％）＝［１−（生存細胞の個数／最初細胞の個数）］×１００
図３、４、および５から確認されるように、抗−ＣＤ４３−ＤＭ１接合体および抗−ＣＤ４３−ＭＭＡＥ接合体は３種の細胞株ともにおいて細胞毒性を示し、抗−ＣＤ４３−Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ接合体はＮＣＩ−Ｎ８７とＡＧＳにおいて細胞毒性を示すことを確認することができる。
実施例４：抗ＣＤ４３抗体の動物モデルにおける抗癌効果試験（ｉｎ ｖｉｖｏ）
４−１．胃癌動物モデル（Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ）の準備
前記実施例２の結果からＣＤ４３の発現が確認された細胞株（ＮＣＩ−Ｎ８７；ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−５８２２）を用いて胃癌動物モデルを作製した。まず、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を２．８×１０７個準備した。前記準備された細胞をヌードマウスの右側脇腹に５×１０６個／１００ｕｌ（ＲＰＭＩ）皮下接種した。接種したヌードマウスを対照群（ＰＢＳ投与）、試験群にランダム配分し、癌細胞を接種した３日後から前記実施例１−２で作製された抗ＣＤ４３抗体（ＤＮＰ００１）を１２ｍｇ／ｋｇの量で週２回、３週間、尾静脈に注射したり、前記実施例３−１で準備された抗−ＣＤ４３−デュオカルマイシン接合体（ＤＮＰ００１−Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）０．２ｍｇ／ｋｇを週１回、３週間、腹腔内注射した。腫瘍の大きさは毎週２回ずつ治療剤を投与する前に測定し、腫瘍の大きさは次の式で計算した：
腫瘍の大きさ（ｍｍ３）＝（長軸×短縮２）／２
前記得られた結果を図６に示した。図６に示されるように、試験開始後７日から、対照群に比べてＤＮＰ００１−Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ投与群（Ｄ−Ｄｕｏ）において腫瘍の成長が抑制され始め、２６日後、ＤＮＰ００１−Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ、ＤＮＰ００１単独、ＰＢＳを投与したマウスの平均的な腫瘍の大きさはそれぞれ４４７．２ｍｍ３、５１０．９ｍｍ３、７８４．６ｍｍ３であり、抗−ＣＤ４３−Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ接合体と抗−ＣＤ４３抗体を投与した群の場合、対照群に比べてそれぞれ約４３％および３４％程度腫瘍の成長が抑制されることを確認した。このような結果は、抗−ＣＤ４３抗体単独および抗−ＣＤ４３−Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ接合体の顕著な胃癌成長阻害効果を示すのである。
実施例５：ヒト固形癌組織におけるＣＤ４３の分布度調査
胃癌でのみならず、多様な固形癌におけるＣＤ４３の発現を確認し、ＣＤ４３を標的に多様な固形癌（胃癌、ｓｉｇｎｅｔ ｒｉｎｇ ｃｅｌｌ胃癌、乳癌、乳癌中の乳管浸潤腺癌、腎臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、子宮癌、子宮頸部癌、膀胱癌、顆粒性肉腫）に対する治療的効能を試験する可能性を確認するために、多様なヒト起源腫瘍組織に免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を行った。
免疫組織化学染色は次の順序で進行させた。固形癌組織はパラフィン包埋された固形癌組織（忠北大学病院）を使用した。まず、パラフィン固形癌スライドをキシレン１０分ずつ３回、１００％アルコール５分ずつ２回、８０％アルコール３分、５０％アルコール１分、２０％アルコール１分間脱−パラフィン過程を進行させた後、流水に２回洗浄した。次に、１ｘＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）に１０分間浸漬した。１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ｐＨ８．０のｂｕｆｆｅｒを入れて、１５分間電子レンジで抗原再生過程を進行させ、抗原再生過程が終わった後、流水に速やかに冷やした後、１ｘＴＢＳに２０分間浸漬した。０．１％Ｈ２Ｏ２＋１００％メタノールで１０分間内在性ペルオキシダーゼを除去し、流水に２回洗浄した。次に、内在性ビオチンと抗原−抗体非特異反応を除去するためにブロッキング過程を進行させた。前記ブロッキング過程は、ａｖｉｄｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＶＥＣＴＯＲ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を前記組織に４滴落として１５分間常温で反応させた後、１ｘＰＢＳで水洗した後、ｂｉｏｔｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎを４滴落として常温で１５分間反応させることにより行った。
実施例１−１で作製された抗−ＣＤ４３（ＹＧ５）抗体とＤＦＴ−１抗体（対照群；Ａｎｃｅｌｌ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をそれぞれ１０ｕｇ／ｍｌ、５ｕｇ／ｍｌを１５０ｕｌの１ｘＴＢＳに懸濁して組織を覆い、１時間３０分間常温で反応させた。１ｘＴＢＳＴ（１ｘＴＢＳ＋０．１％ｔｗｅｅｎ２０）で１５分ずつ３回水洗した後、二次抗体（抗−マウス／ウサギＨＲＰ；ＤＡＫＯ）を２滴ずつ組織に覆い、３０分間常温で反応させた。次に、１ｘＴＢＳＴ（１ｘＴＢＳ＋０．１％ｔｗｅｅｎ２０）で１５分ずつ３回洗浄した後、ＤＡＢ（Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）で発色反応させた。１ｘＴＢＳで５分間２回水洗し、ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇした後、流水に洗浄した。次に、脱水過程を進行させた後、ｍｏｕｎｔｉｎｇする。
前記得られた結果を図７および図８、および表１に示した。それぞれの組織におけるＣＤ４３陽性率を判断する基準は次の通りである：陰性：０、陽性：腫瘍部位にＹＧ５が染色された程度に応じて１〜３等級に区分

（前記表１中、
Ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙは、ＹＧ５が染色されていない陰性の組織を除いた陽性組織の数を当該癌の全体組織数で割って得られた数値；
Ｔｏｔａｌは、染色に用いた組織の総数；
Ｐｏｓｉｔｉｖｅは、使用した組織のうち、ＹＧ５に対して陽性反応を示した組織の数をそれぞれ意味する）
表１、図７および図８から確認されるように、胃癌、ｓｉｇｎｅｔ ｒｉｎｇ ｃｅｌｌ胃癌、乳癌、乳癌中の乳管浸潤腺癌、腎臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、子宮癌、子宮頸部癌、膀胱癌、顆粒性肉腫などのように主に上皮細胞に発生する腫瘍でＣＤ４３が発現することを確認することができる。
実施例６：胃癌の癌幹細胞におけるＣＤ４３の発現
多様な腫瘍の癌幹細胞におけるＣＤ４３の発現程度を試験した。ＣＤ４４とＣＤ１３３（Ｐｒｏｍｉｎｉｎ−１）は公知の癌幹細胞標識子（Ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒ）である。癌幹細胞標識子ＣＤ４４およびＣＤ１３３とｔｒｉｐｌｅ−ｓｔａｉｎｉｎｇしてＣＤ４３の発現を確認することによって、ＣＤ４３がＣＤ４４またはＣＤ４４＋ＣＤ１３３＋陽性グループで発現することを確認した。
ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を１００ｍｍの細胞培養容器に接種および培養し、培養容器表面の７０〜８０％程度が培養細胞で密集した時、培養細胞をリン酸塩緩衝溶液で洗浄した後、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理して解離させた後、遠心分離した。沈殿された細胞を再び緩衝液に浮遊させ、抗−ＣＤ４４−ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）（１０μｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、抗−ＣＤ１３３−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）（１０μｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、および抗−ＣＤ４３抗体（実施例１で作製；ＹＧ５）−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ；１．５μｌ、Ｄｉｎｏｎａ）と４℃の冷蔵庫で２０分間反応させた後、反応しない抗体は水洗し、１％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定した後、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）で分析した。陰性対照群として、抗−ＣＤ４４抗体および抗−ＣＤ１３３抗体の代わりにｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１を用いて同一の試験を行った。
前記得られた結果を図９に示した。
図９から確認されるように、胃癌の癌幹細胞におけるＣＤ４３の発現を確認した結果、胃癌の癌幹細胞を鑑別できる標識が（ＣＤ４４またはＣＤ１３３）が陽性の細胞でＣＤ４３が陽性であることが確認された。このような結果は、本発明による抗ＣＤ４３抗体が特有に胃癌の癌幹細胞表面に発現したＣＤ４３と結合できることを示すのである。
実施例７：多様な固形癌幹細胞におけるＣＤ４３の発現調査
前記実施例６に提示された同様の方法で、実施例５に提示されたＣＤ４３陽性固形癌の癌幹細胞におけるＣＤ４３の発現を確認した。
実施例５に提示されたそれぞれのＣＤ４３陽性組織に起源した細胞（乳癌、肺癌、大腸癌、肝癌および胆嚢癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸部癌、膀胱癌起源細胞株）を用いた。それぞれの細胞を１００ｍｍの細胞培養容器に接種および培養した後、培養容器表面の７０〜８０％程度が培養細胞で密集した時、培養細胞をリン酸塩緩衝溶液で洗浄した後、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理して解離させた後、遠心分離した。沈殿された細胞塊を再び緩衝液に浮遊させ、１００倍に希釈した抗−ＣＤ４４−ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）、抗−ＣＤ４４−ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）、抗−ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）−ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）、抗−ＣＤ１３３−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）、抗−ＣＤ４３抗体−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）と４℃の冷蔵庫で２０分間反応させた後、反応しない抗体は水洗した後、１％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定した後、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）で分析した。
その結果、実施例５でＣＤ４３陽性で現れた組織起源細胞の癌幹細胞におけるＣＤ４３の発現を確認した結果、それぞれの癌幹細胞を鑑別できる標識が（ＣＤ４４、ＣＤ１３３、またはＥｐＣＡＭ）が陽性の細胞でＣＤ４３も陽性であることが確認された。
実施例８：患者のｆｒｅｓｈ癌組織の癌幹細胞におけるＣＤ４３の発現試験
前記実施例５の結果に基づき、患者の癌組織における癌幹細胞標識子を用いて分類後、ＣＤ４３の発現を確認した。
患者の新鮮な癌組織を細かく単一細胞化した。単一化された腫瘍細胞は１７００ｒｐｍで３分間遠心分離後、上層液は捨てて、１０％ＦＢＳが含まれている培地１０ｍｌで再浮遊した後、１７００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上層液は捨てて、１０ｍｌの１ｘＰＢＳで再浮遊した後、計数する。細胞をＦＡＣＳチューブに分配した後、抗−ＣＤ４４−ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）、抗−ＣＤ４４−ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）、抗−ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）−ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）、抗−ＣＤ１３３−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）、抗−ＣＤ４３抗体−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）と４℃の冷蔵庫で２０分間反応させた後、反応しない抗体は水洗した後、１％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定した後、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）で分析した。
前記のように、患者の癌組織の癌幹細胞でＣＤ４３胃癌の癌幹細胞におけるＣＤ４３の発現を確認した結果、患者の癌組織起源癌幹細胞でＣＤ４３が陽性と確認された。
実施例９：抗ＣＤ４３抗体による癌幹細胞のｃｏｌｏｎｙ形成阻害（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
前記実施例６に提示された同様の方法で、実施例５に提示されたＣＤ４３陽性固形癌のＣＤ４３が陽性の癌幹細胞の抗−ＣＤ４３抗体によるｃｏｌｏｎｙ形成阻害を確認した。
実施例５に提示されたそれぞれのＣＤ４３陽性組織に起源した細胞（乳癌、肺癌、大腸癌、肝癌および胆嚢癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸部癌、膀胱癌起源細胞株）を用いた。それぞれの細胞を１００ｍｍの細胞培養容器に接種および培養した後、培養容器表面の７０〜８０％程度が培養細胞で密集した時、培養細胞をリン酸塩緩衝溶液で洗浄した後、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理して解離させた後、遠心分離した。沈殿された細胞塊を再び緩衝液に浮遊させ、１０７の腫瘍細胞あたり２０ｕｇ／ｍｌの濃度で抗−ＣＤ４３抗体を入れて、４℃の冷蔵庫で３０分間反応させた後、反応しない抗体は１ｘＰＢＳで水洗する。次に、マグネチックビーズが結合されたＩｇＧを２０ｕＬ添加した後、４℃の冷蔵庫で１５分間反応させた後、１ｘＰＢＳで水洗した後、ＭＡＣＳ ｓｐｅｒａｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍでＣＤ４３陽性細胞を分類する。
分類したＣＤ４３陽性細胞と陰性細胞を抗ＣＤ４４−ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）、抗−ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）−ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）、抗−ＣＤ１３３−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）、抗−Ｍｉｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄ抗体−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ、２０ｕｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と４℃の冷蔵庫で１５分間反応させた後、水洗した後、１％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定した後、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）で分析した。
前記実施例で得られたＣＤ４３陽性細胞と陰性細胞をｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ（１００ＩＵ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇ、１００ｕｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、２０ｎｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｈｒＥＧＦ）、１０ｎｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｈｒｂＦＧＦ）、２％Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ、１％Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）が含有）を含むｗｅｌｌに、各ｗｅｌｌあたり５，０００個の数でｕｌｔｒａ ｌｏｗ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）に入れる。次に、抗−ＣＤ４３抗体と対照群抗体を１００ｕｇ／ｍｌずつ入れて培養する。この後、ｓｐｈｅｒｅｓを観察する。同一の実験を患者のｆｒｅｓｈな癌組織でＣＤ４３陽性細胞を分類して進行させた。
その結果、様々な腫瘍と患者の癌組織中のＣＤ４３陽性癌幹細胞に抗−ＣＤ４３抗体を投与した結果、対照群に比べて癌幹細胞のｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓを阻害することを確認した。このような結果は、抗−ＣＤ４３抗体の癌幹細胞の顕著な腫瘍形成阻害効果を示すのである。
実施例１０：様々な癌動物モデルにおける抗ＣＤ４３抗体の抗癌効果試験（ｉｎ ｖｉｖｏ）
前記実施例７、８の結果からＣＤ４３の発現が確認された細胞株とｆｒｅｓｈな癌組織を用いて動物モデルを作製し、方法は前記実施例４と同一である。対照群（ＰＢＳ投与）と試験群にランダムにマウスを配分し、癌細胞を接種した３日後から前記実施例２で作製された抗ＣＤ４３抗体（ＤＮＰ００１ｍＡｂ）８ｍｇ／ｋｇを週２回、３週間、尾静脈に注射したり、前記実施例３−１で準備された抗−ＣＤ４３−サポリン、ＤＭ１、ＭＭＡＥ、Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ接合体０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇを週１回、３週間、腹腔内注射した。腫瘍の大きさは毎週２回ずつ治療剤を投与する前に測定した。
実施例１１：ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）処理後における正常血液細胞に対する結合力変化試験
正常血液に発現するＣＤ４３を認知する抗体（ＤＦＴ−１）と腫瘍特異ＣＤ４３を認知する抗ＣＤ４３抗体（ＹＧ５）がノイラミニダーゼ処理された正常リンパ球に対して結合力に変化があるかを確認した。
健康な人から１０ｍｌの血液を採血し、赤血球溶解溶液（ＲＢＣ ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ；ＮＨ４Ｃｌ、ＮａＨＣＯ３、ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）４０ｍｌを添加して、常温で１０分間溶解した。赤血球が溶解した血液は１７００ｒｐｍで５分間遠心分離後に上層液を除去し、１０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。３×１０６個のリンパ球を前記得られた赤血球溶解溶液１３０ｕｌに懸濁し、ノイラミニダーゼ（ＥＬＰＩＳ、Ｋｏｒｅａ）５０ｕｌとバッファー２０ｕｌを入れて、３７℃で５０分間反応させた後、ＰＢＳで洗浄した。ノイラミニダーゼによってＣＤ４３を認知する抗体の抗原決定部位に変化があるかを確認するために、ＦＩＴＣとＰＥが結合されたＤＦＴ−１およびＹＧ５抗体を入れて、４℃で１５分間反応させた後、ＰＢＳ４ｍｌで洗浄後、流細胞分析器で測定して、正常リンパ球に対する力価を測定した。
前記得られたＣＤ４３に対する２つの抗体（ＤＦＴ−１およびＹＧ５）の力価を流細胞分析器で確認した結果を図１５に示した。図１５から確認されるように、ＤＦＴ−１はノイラミニダーゼを処理する前に高い力価を示したが、ノイラミニダーゼを処理した後には力価がほとんど現れないのに対し、ＹＧ５はノイラミニダーゼを処理する前には力価が現れなかったものの、ノイラミニダーゼを処理した後には１６．１６％の力価が現れることを確認した。このような結果は、本発明による抗−ＣＤ４３抗体（ＹＧ５）がＣＤ４３蛋白質のｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎされた抗原決定部位を認知しないことを確認することができ、これは、本発明による抗−ＣＤ４３抗体が正常細胞には結合せず癌細胞特異的に結合し、特に癌幹細胞特異的に結合することを示すのである。
実施例１２：ＣＥＡＣＡＭ５とＣＥＡＣＡＭ６に対する交差反応性試験
ＣＤ４３蛋白質を認知すると知られている５Ｆ１クローンはＣＤ４３とＣＥＡＣＡＭ６を同時に認知し、２つの蛋白質のｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎされた位置に結合することが知られている。抗−ＣＤ４３抗体がＣＥＡＣＡＭ５とＣＥＡＣＡＭ６蛋白質と交差反応を示すかを確認し、キフネンシン（ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅ）とフコシダーゼ（ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ）によるＣＤ４３抗原決定部位のｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎの変化による抗−ＣＤ４３抗体の結合力の変化を確認した。
ｒＣＥＡＣＡＭ５−ｈＦＣ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ：１１０７７−Ｈ０３Ｈ−５０）とｒＣＥＡＣＡＭ６−ｈＦＣ（ＤｉｎｏｎＡ ｉｎｃ．）組換え蛋白質をｍａｘｉｓｒｏｐ ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅにｗｅｌｌあたり１００ｎｇ入れて、３７℃で１時間反応させて抗体をコーティングした後、１ｘｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液（ｓｉｇｍａ）をｗｅｌｌあたり２００ｕｌ入れて、３７℃で１時間反応させてブロッキングした。ｒＣＥＡＣＡＭ５−ｈＦＣとｒＣＥＡＣＡＭ６−ｈＦＣ蛋白質がコーティングされたｗｅｌｌにＩｇＧ１、ＹＧ５、ＤＦＴ−１、９Ａ６、または８Ｆ５単クローン抗体（８Ｆ５：Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１５Ｏｃｔ，６７，３２−４１，９Ａ６：ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ｓｃ−５９８９９）をそれぞれｗｅｌｌあたり１００ｎｇずつ入れて、３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳで水洗して、結合しない抗原を除去した。この後、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を希釈して入れて、３０分反応させた後、ＰＢＳで水洗した後、ＴＭＢ溶液をｗｅｌｌあたり５０ｕｌずつ入れて、１０分間反応させた後、硫酸５０ｕｌを入れて反応を中止させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
前記得られた結果を図１６に示した。図１６に示されるように、抗−ＣＤ４３抗体（ＹＧ５）は組換え蛋白質ＣＥＡＣＡＭ５とＣＥＡＣＡＭ６に対する反応性がほとんどないことが分かる。
また、ＣＥＭ７細胞（ＡＴＣＣから入手したＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＣＣＬ−１１９）をｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ培養しながら、ＣＤ４３の細胞表面の発現水準がｏｒｉｇｉｎａｌ ｃｅｌｌ対比５０％以上増加したと選別された細胞；以下、同一である）にｆｕｃｏｓｉｄａｓｅとｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅを処理した後、抗−ＣＤ４３抗体の結合力の変化を試験した結果、結合力に変化はないことを確認した。このような結果は、本発明で提供される抗体（例えば、（抗−ＣＤ４３抗体（ＹＧ５））がＣＤ４３の糖条件が変化した状態でもＣＤ４３との結合力を維持することを示すものであり、これは、本発明で提供される抗体の抗原結合部位は糖に非依存的であることを意味する。反面、既存のＣＤ４３抗体の５Ｆ１は糖依存的なエピトープ結合力を示すことが知られていて、前記結果から、本発明で提供される抗体が既存の抗体と差別性を有することが裏付けられる。
実施例１３：胃癌細胞の３次元培養実験（Ｔｕｍｏｒ ｓｐｈｅｒｅ ａｓｓａｙ）
胃癌細胞株のＮＣＩ−Ｎ８７細胞を実験する前に、１５０ｍｍ ｄｉｓｈの８０〜９０％となるように準備する。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞は１ｘＴｒｙｐｓｉｎ・ＥＤＴＡを処理して浮遊させた後、水洗した。準備されたＮＣＩ−Ｎ８７細胞をｍｅｄｉａ（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ）、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥＧＦ＆ｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で再浮遊した後、６ｗｅｌｌ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ａｔｔａｃｈｅｄ ｐｌａｔｅ）に１×１０５／２ｍｌで分注した後、３７℃、ＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒで５日間培養した。光学顕微鏡で各ｗｅｌｌの細胞を撮影し、１ｘＴＥ２００ｕｌ ｓｉｎｇｌｅ細胞化してＰＢＳで水洗した後、正常ｍｏｕｓｅの血清を１／５０を入れて、４℃で１０分間ブロッキングした。次に、細胞を１００ｕｌずつ流細胞分析チューブに分注し、抗−ＣＤ４４抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ：１７−０４４１−８２）と抗−ＣＤ４３抗体（ＹＧ５、ＤＦＴ−１）をそれぞれ１０ｕｌ、１ｕｌずつ入れて、４℃で１５分間反応させた。前記と同様の方法で水洗した後、サンプルあたり１％（ｗ／ｖ）ｐａｒａｆｏｒｍ ａｌｄｅｈｙｄｅを３００ｕｌの量で入れて細胞を固定した後、流細胞分析を行った。
前記得られた結果を図１８Ａ（培養時の結果）および１８Ｂ（５日間培養後の結果）に示した。各図の上段は顕微鏡の撮影イメージであり、下段は流細胞分析の結果を示すグラフである。図１８Ａおよび１８Ｂに示されるように、５日間ｔｕｍｏｒ ｓｐｈｅｒｅ培養したＮＣＩ−Ｎ８７細胞を流細胞分析した結果、ＣＤ４４とＣＤ４３ダブル陽性細胞の増加が確認され、時間の経過に伴ってｔｕｍｏｒ ｃｏｌｏｎｙを形成することが確認された。また、ｔｕｍｏｒ ｓｐｈｅｒｅを形成するにつれ、ＣＤ４３の発現が増加することを確認した。このような結果は、腫瘍幹細胞でＣＤ４３の発現が特異的に増加することを示すのである。
実施例１４：懸濁液内の浮遊細胞を用いた変形した細胞結合力の測定ＥＬＩＳＡプロトコル
この分析法は、ポリ−Ｄ−リシンｐｌａｔｅで背景信号を減少させ、ｓｃＦｖまたはＩｇＧの結合力を評価するためのＥＬＩＳＡ実験に懸濁液内の浮遊細胞を使用できるか否かを確認するためのパイロット研究で設計された。
方法：
１．細胞収集段階。
ａ．Ｃｅｌｌを５０ｍＬ ｆａｌｃｏｎ ｔｕｂｅに入れて、５００ｘｇで５分間遠心分離してペレット化させた（ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ）；
ｂ．前記得られたｃｅｌｌ ｐｅｌｌｅｔを１０ｍｌ ＰＢＳで１回洗い落とし、５００ｘｇで５分間遠心分離してｃｅｌｌをペレット化させた；
ｃ．１ｍｌ ＰＢＳでｃｅｌｌｓを再懸濁させた後、ｃｅｌｌを計数した（ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）；
ｄ．Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ＋３％ＦＣＳ）で細胞を希釈させた（細胞希釈濃度：５×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ（１０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ））；
ｅ．Ｖ−ｂｏｔｔｏｍｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにｗｅｌｌあたりｃｅｌｌ ｓｔｏｃｋ５０ｕｌずつ添加した。
２．Ｗｅｌｌあたり５０ｕＬの周辺細胞質抽出物（ａｎｔｉ−ＣＤ４３ｓｃＦｖ）またはＩｇＧ１（所望の最終濃度×２倍濃縮されたｓｔｏｃｋ；例えば、最終濃度が２５ｕｇ／ｍｌを所望する場合に５０ｕｇ／ｍｌ ｓｔｏｃｋ準備）を入れた（Ｌａｙｏｕｔ分析法により、ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅまたはｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで準備する）。
前記サンプルを用心深く４回ピペッティングして混合した。
３．室温で１時間培養した。
４．５００ｘｇで５分間遠心分離してｃｅｌｌをペレット化させた。
５．ｐｌａｔｅを用心深くひっくり返したり吸入（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）により上層液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を除去した。
６．２００ｕｌ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒでｃｅｌｌを洗浄し、サンプルを４回ピペッティングして混合した。
７．５００ｘｇで５分間遠心分離してｃｅｌｌをペレット化させた。
８．ｐｌａｔｅを用心深くひっくり返したり吸入により上層液を除去した。
９．Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに１：１，５００希釈させたａｎｔｉ−Ｆｌａｇ ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗体１００ｕＬをｃｅｌｌ ｐｅｌｌｅｔに添加して用心深く再懸濁させ、室温に３０分間培養した。
１０．５００ｘｇで５分間遠心分離してｃｅｌｌをペレット化させた。
１１．ｐｌａｔｅを用心深くひっくり返したり吸入により上層液を除去した。
１２．２００ｕｌ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを入れて用心深くｃｅｌｌを洗浄し、得られたサンプルを４回ピペッティングして混合した。
１３．５００ｘｇで５分間遠心分離してｃｅｌｌをペレット化させた。
１４．ｐｌａｔｅを用心深くひっくり返したり吸入により上層液を除去した。
１５．２００ｕｌ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを入れて用心深くｃｅｌｌを洗浄し、得られたサンプルを４回ピペッティングして混合した。
１６．５００ｘｇで５分間遠心分離してｃｅｌｌをペレット化させた。
１７．ｃｅｌｌをＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ８０ｕｌに用心深く再懸濁させ、室温で５分間培養した後、１Ｍ ＨＣｌで反応を停止した。
１８．標準９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにサンプルを１００ｕｌずつ移した。
１９．４５０ｎｍにおけるｐｌａｔｅ（吸光度）を読んだ。
実施例１５：懸濁液内の浮遊細胞を用いた変形した細胞結合力の測定ＦＡＣＳプロトコル
本分析法は、ポリ−Ｄ−リシンｐｌａｔｅで背景信号を減少させ、ｓｃＦｖまたはＩｇＧの結合力を評価するためのＥＬＩＳＡ実験に懸濁液内の浮遊細胞を使用できるか否かを確認するための他の方法で設計された。
方法：
１．流細胞分析法（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）：
ａ．細胞収集段階：
ｉ．５００ｘｇで５分間遠心分離して５０ｍｌファルコンチューブにｃｅｌｌをペレット化させた（ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ）；
ｉｉ．前記得られたｃｅｌｌ ｐｅｌｌｅｔを１０ｍｌ ＰＢＳで１回洗い落とし、５００ｘｇで５分間遠心分離してｃｅｌｌをペレット化させた；
ｉｉｉ．１ｍｌ ＰＢＳでｃｅｌｌｓを再懸濁させた後、ｃｅｌｌを計数した（ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）；
ｉｖ．Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ＋３％ＦＣＳ）で細胞を希釈させた（細胞希釈濃度：５×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ（１０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ））；
ｖ．Ｖ−ｂｏｔｔｏｍｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓにＣｅｌｌをｗｅｌｌあたり５０ｕｌずつ添加した。
２．Ｌａｙｏｕｔ分析方法により、ｄｕｐｌｉｃａｔｅあるいはｔｒｉｐｌｉｃａｔｅでｗｅｌｌあたり５０ｕｌ ＩｇＧを入れた後（所望の最終濃度×２倍濃縮されたｓｔｏｃｋ；例えば、最終濃度が２５ｕｇ／ｍｌを所望する場合に５０ｕｇ／ｍｌ ｓｔｏｃｋ準備）、得られたサンプルを４回ピペッティングして混合した。
３．室温で３０分間インキュベーティングした。
４．Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ２００ｕｌを入れた。
５．５００ｘｇで５分間遠心分離してｃｅｌｌをペレット化させた。
６．ｐｌａｔｅを用心深くひっくり返したり吸入（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）により上層液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を除去した。
７．２００ｕｌ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを入れてｃｅｌｌを柔らかく洗い落とした後、ピペットを用いて４回程度均等に混合した。
８．５００ｘｇで５分間遠心分離してｃｅｌｌをペレット化させた。
９．培地を除去した。
１０．Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに１：２００で希釈したｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ２００ｕｌをＣｅｌｌ ｐｅｌｌｅｔに入れて用心深く再懸濁させ、光が遮断された所で１時間程度ｉｃｅに放置した。
１１．５００ｘｇで５分間遠心分離してｃｅｌｌをペレット化させた。
１２．培地を除去した。
１３．２００ｕｌ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを入れてｃｅｌｌを柔らかく洗い落とした後、ピペットを用いて４回程度均等に混合した。
１４．５００ｘｇで５分間遠心分離してｃｅｌｌをペレット化させた。
１５．Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ２００ｕｌを入れてｃｅｌｌ ｐｅｌｌｅｔを柔らかく再懸濁させた。
１６．Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いてｐｌａｔｅを読んだ。
実施例１６：ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｃＦｖ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓを用いたｓｃＦｖ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ
本実施例は、ＣＥＭ７とＵ９３７ｃｅｌｌ（ＡＴＣＣＲ ＣＲＬ１５９３．２ＴＭ）に対するｓｃＦｖの結合程度を試験したもので、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｅｒｉｐｌａｓｍで発現するｓｏｌｕｂｌｅ ｓｃＦｖｓを用い、ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによるｓｃＦｖ ｃｅｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ分析のためにデザインされた。
方法：
１日目：クローン接種
１．Ｓｔａｒｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ：
ａ．２００ｕｌ ２ＹＴ（２ｘ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）＋５％（ｗ／ｖ）グリコース＋アンピシリンを９６−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに満たした。
ｂ．所望のクローン（ａｎｔｉ−ＣＤ４３（ｍＪＬ１）ｓｃＦｖ ｃｏｄｉｎｇ ＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９；Ｓｈ７４１−１１２ｓｃＦｖ ｃｏｄｉｎｇ ＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１；Ｓｈ１４５−１１２ｓｃＦｖ ｃｏｄｉｎｇ ＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３；Ｓｈ１４６−１１２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５；またはＳｈ４３４−１１２ｓｃＦｖ ｃｏｄｉｇ ＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）と共に、比較群となり得るｓｃＦｖｓを含めてｗｅｌｌに接種した。
２．６５０ｒｐｍ、３７℃の条件でｓｈａｋｉｎｇしながら、一晩中培養した。
２日目：ｓｃＦｖｓの発現
Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ：
３．Ｉｎｏｃｕｌａｔｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｔｅｓ：ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔの最終用途に応じて、１つのサンプルあたり１つ以上のｗｅｌｌを接種することができる。
ａ．１．０ｍＬ／ｗｅｌｌ ｏｆ ２ＹＴ＋Ａｍｐ（ｎｏｇｌｕｃｏｓｅ）で９６ｄｅｅｐ−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを満たした。
ｂ．種菌培養したものをＯＤ６００で０．１の値を有するように希釈した後、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに接種した。６５０ｒｐｍ、３０℃の条件で２〜４時間ｓｈａｋｉｎｇしながら培養した。周期的にＯＤ ｐｌａｔｅでサンプルを採取して、ＯＤ６００における混濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）を測定した。ＯＤ６００値が０．７から１．０の間となるように細胞を育てた。
４．発現ＰｌａｔｅｓにおけるｓｃＦｖ発現の誘導：
ａ．ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔ ｃｕｌｔｕｒｅの発現誘導のために、ＩＰＴＧ（ｓｔｏｃｋ ＩＰＴＧを１：１００で希釈）を添加した２ＹＴ＋Ａｍｐを発現ｐｌａｔｅに１００ｕｌずつ入れる。
ｂ．６５０ｒｐｍおよび２２℃の条件でｓｈａｋｉｎｇしながら、一晩中培養した。
３日目：ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔの準備およびｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ
Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓ：
５．ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔの準備：
ａ．Ｃｅｌｌを２０００ｘｇで１０分間遠心分離してＰｅｌｌｅｔ化させた。
ｂ．発現ｐｌａｔｅにある上層液を漂白剤の入っている容器に払い落し、紙タオル上に載せて、ｐｌａｔｅに残っている培地を除去した。
ｃ．それぞれのｗｅｌｌに７５ｕＬの冷ＰＰＢ（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ）＋ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（５０ｍＬあたり１つのタブレット；ｃＯｍｐｌｅｔｅ；Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ：０４６９３１１６００１）を入れて、ピペッティングを４回程度して再懸濁させた後、１０００ｒｐｍおよび４℃の条件で１０分間培養した。
ｄ．それぞれのｗｅｌｌに２２５ｕＬの冷Ｈ２Ｏ＋ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（５０ｍＬあたり１つのタブレット）を入れて、ピペッティングを４回程度して再懸濁させた後、１０００ｒｐｍおよび４℃の条件で１時間ｓｈａｋｉｎｇしながら培養した。
ｅ．Ｐｌａｔｅを３０００ｘｇで１０分間遠心分離する。
ｆ．Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｓ（約２７０ｕＬ）をｆｉｌｔｅｒ ｓｔａｃｋ（ｅｎｓｕｒｅ Ａ１ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ）に移し入れた。
ｉ．上部分：１．２ｕｍ ９６ｗｅｌｌ ｆｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅ
ｉｉ．中間部分：１００Ｋ ９６ｗｅｌｌ ｆｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅ
ｉｉｉ．下部分：９６−ｗｅｌｌ、ｆｌａｔ ｂａｓｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｌａｔｅ。
ｇ．Ｐｌａｔｅを４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
ｈ．（もし必要であれば）ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ分析準備のために、それぞれのクローンに対するサンプルを集める。
６．Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：
ａ．ｓｃＦｖ ｓａｍｐｌｅｓ：ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｓの使用
ｂ．細胞の収集：
ｉ．Ｃｅｌｌを５０ｍＬ ｆａｌｃｏｎ ｔｕｂｅに入れて、５００ｘｇで５分間遠心分離してペレット化させた（ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ）。
ｉｉ．１０ｍＬ ＰＢＳを用いてｃｅｌｌ ｐｅｌｌｅｔを１回洗い、５００ｘｇで５分間遠心分離してｃｅｌｌをペレット化させた。
ｉｉｉ．１ｍＬ ＰＢＳでｃｅｌｌを再懸濁させた後、ｃｅｌｌを計数した（ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）。
ｉｖ．Ｃｅｌｌを０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）で希釈した。
ｖ．Ｖ−ｂｏｔｔｏｍｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓにｗｅｌｌあたり２０ｕｌ ｃｅｌｌ ｓｔｏｃｋを入れた。
ｃ．ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔをｗｅｌｌあたり２０ｕｌずつｄｕｐｌｉｃａｔｅ（ｓｃＦｖ）で入れた。
そして、ピペッティングを４回程度してサンプルを柔らかく混合した。
ｄ．室温で３０分間放置した。
ｅ．１８０ｕＬ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを入れた。
ｆ．５００ｘｇで５分間遠心分離してｃｅｌｌをペレット化させた。
ｇ．ｐｌａｔｅを用心深くひっくり返したり吸入（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）により上層液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を除去した。
ｈ．Ｃｅｌｌに２００ｕＬ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを入れて柔らかく洗い落とし、ピペッティングを４回程度してサンプルが均等に混合できるようにした。
ｉ．Ｃｅｌｌを５００ｘｇで５分間遠心分離してペレット化させた。
Ｊ．培地を除去した。
ｋ．予め準備しておいたｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに５ｕｇ／ｍＬ ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ：６３７３１０）を５０ｕｌを入れてｃｅｌｌを柔らかく再懸濁させた。この抗体は光に敏感であるため、ｐｌａｔｅは光から最大限保護されなければならない。光から保護された状態で３０分間ｉｃｅに放置した。
ｌ．Ｃｅｌｌを５００ｘｇで５分間遠心分離してペレット化させた。
ｍ．培地を除去した。
ｎ．Ｃｅｌｌに２００ｕＬ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを入れて柔らかく洗い落とし、ピペッティングを４回程度してサンプルが均等に混合できるようにした。
ｏ．Ｃｅｌｌを５００ｘｇで５分間遠心分離してペレット化させた。
ｐ．Ｃｅｌｌに２００μＬ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを入れて柔らかく再懸濁させた。
ｑ．Ｇｕａｖａ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（／／Ｍｅｒｃｋｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてｐｌａｔｅを読んだ。黄色の蛍光を認知できるように、ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒは予め準備されなければならない。
実施例１７：鋳型となるｍｕｒｉｎｅ ａｎｔｉ−ＣＤ４３ ａｎｔｉｂｏｄｙの機能的な特徴
本実験は、抗体治療に適した標的ｅｐｉｔｏｐｅ（ＪＬ−１）を検証するために行われた。本実験では、前記エピトープに結合するｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＣＤ４３単クローン抗体（重鎖：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４；重鎖コーディングＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３；重鎖発現ベクター（ｐＴＴ５ ｂａｓｅｄ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５；軽鎖：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、軽鎖コーディングＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６；軽鎖発現ベクター（ｐＴＴ５ ｂａｓｅｄ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）が使用された。
ＪＬ−１抗原（ＣＤ４３）を３７℃で４時間培養した時、細胞から有意な量の抗原が漏れ出ないことを確認した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析法によりｂｕｆｆｅｒに混合されているａｎｔｉ−ＣＤ４３抗体と実際のＭｏｌｔ−４（ＣＤ４３＋急性リンパ球性白血病細胞株；ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５８２）またはＨＬ−６０（ＡＴＣＣ）の上層液に混合されているａｎｔｉ−ＣＤ４３抗体を比較した時、大きさの側面において大して差がないことを確認することができた。
また、正常なヒトの血清内で循環しているＪＬ−１抗原（ＣＤ４３）の量が抗−ＣＤ４３抗体が標的に結合することを有意に妨げる程度に十分でないことを確認した。白血病細胞に結合する抗−ＣＤ４３抗体に対する５０％ヒト血清の効果をｉｎ ｖｉｔｒｏ上で評価した（ＩＦ（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ測定）。前記得られた結果を表２に示した。
前記表２に示されるように、血清が抗−ＣＤ４３抗体がＭｏｌｔ−４細胞またはＨＬ−６０細胞に結合するのを妨げないことを確認することができる。
また、ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎされないｎａｋｅｄ抗−ＣＤ４３抗体が分離された標的細胞に対して直接的な細胞毒性効果を有しないことを確認した。そのために、９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＣＤ４３＋ＣＥＭ７細胞（ＣＥＭ７−ｈｉｇｈ ａｎｔｉｇｅｎで表示）およびＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ｏｒｉｇｉｎａｌ ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ）；ＣＥＭ７−ｍｅｄｉｕｍ ａｎｔｉｇｅｎで表示）をそれぞれ４０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの量で入れて、マウスＣＤ４３抗体（先に準備されたｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＣＤ４３単クローン抗体）を系列希釈して処理し、細胞毒性は培養３日目にＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ）を用いて決定した。比較のために、ＣＤ４３を低濃度で発現するＨ９Ｋ細胞（Ｈ９Ｋ−ｌｏｗ ａｎｔｉｇｅｎ）に対して同一の試験を行った。
前記得られた結果を図１８に示した。図１８に示されるように、マウスＣＤ４３抗体はＣＤ４３＋ＣＥＭ７（ＣＥＭ７−ｈｉｇｈ ａｎｔｉｇｅｎ）やＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＣＥＭ−ｍｅｄｉｕｍ ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＭ７細胞に比べてＣＤ４３がより少なく発現している）に対して細胞毒性を示さないことを確認することができる。
ＣＥＭ７、ＣＣＲＲＦ−ＣＥＭ、Ｎａｌｍ６（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−３２７３）およびＨＬ−６０（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４０）などの細胞株はそれぞれ異なるＪＬ−１抗原（ＣＤ４３）の発現水準を示す（記載の順序で高発現から低発現の順である）。各細胞（２０，０００個）にｓａｐｏｒｉｎ接合抗−ＣＤ４３抗体（接合体の作製は実施例３−１参照；抗−ＣＤ４３抗体は先に準備されたｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＣＤ４３単クローン抗体である）またはＩｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌを２０ｕｇ／ｍＬから希釈した濃度で処理し、培養３日目に細胞生存率をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｍを用いて測定した。前記比較のために使用されたＩｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌとしてマウスＩｇＧ１を使用した。
前記得られた結果を図１９に示した。図１９に示されるように、Ｓａｐｏｒｉｎ接合抗−ＣＤ４３抗体（図１９にｍＪＬ−１で表示）処理時に、ＣＥＭ７の細胞生存率が最も大きく減少すると観察され、ＣＥＭとＮＡＬＭ６細胞が後に続いた。標的を発現しないＨＬ−６０では、最も低い細胞毒性（最も低い細胞生存率の減少）が観察された。図１９のように、毒素が連結されている抗−ＣＤ４３抗体は標的細胞の死滅を誘導する。Ｓａｐｏｒｉｎが連結されている抗−ＣＤ４３抗体を処理したＣＥＭ７、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｎａｌｍ−６およびＨＬ−６０細胞は、細胞に存在する抗原の発現量に比べて効果的に細胞を死滅させる活性を示している。Ｓａｐｏｒｉｎは細胞内に流入した場合にのみ細胞毒性効果を発揮する。
抗−ＣＤ４３抗体のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを試験した。マウス抗−ＣＤ４３抗体（先に準備されたｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＣＤ４３単クローン抗体）を３０分間冷蔵状態で細胞（ＣＥＭ７）に処理し、３７℃の条件に移した後、図２０のｘ軸に表示されたそれぞれの時間の時に１０６細胞を取って、冷蔵温度でａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＰＥ二次抗体（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＳＣ３７３８）を１０分間処理し、細胞を洗浄して固定した後、流細胞分析器で分析した（実施例１５参照）。
前記得られた結果を図２０に示した。図２０に示されるように、抗−ＣＤ４３抗体は抗原に結合すると細胞内部に入るが、当該データは時間の経過に伴って細胞表面にある抗体が細胞内部に入って消える程度を測定して示している。データは、図１９で参照したのと同じく、細胞死滅分析において抗−ＣＤ４３抗体（ｍｏｕｓｅ抗体とｈｕｍａｎｉｚｅｄ抗体の両場合とも）のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを証明している。
一方、抗原を発現する細胞で抗−ＣＤ４３抗体によって誘導される同種細胞凝集現象を試験した。そのために、３００，０００個の細胞（ＣＥＭ７、ＣＣＲＲＦ−ＣＥＭ、またはＨＬ−６０）に抗−ＣＤ４３抗体（先に準備されたｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＣＤ４３単クローン抗体）４０ｕｇ／ｍＬの開始濃度で処理して、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した後、定められた時間（抗体処理２時間経過時点）に顕微鏡写真を撮ってイメージを得た。前記得られたイメージを図２１に示した。図２１は、抗−ＣＤ４３抗体（抗−ＪＬ−１抗体で表示）によって誘導される同種細胞凝集現象を示すイメージで、抗−ＣＤ４３抗体がｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ４３発現ｃｅｌｌのｈｏｍｏｔｙｐｉｃ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎを誘導し、その程度は抗原（ＣＤ４３）の発現水準と関連があることを示す。
また、ヒト正常骨髄細胞におけるＣＤ４３の発現様相を試験した。正常骨髄の単核球をマウス抗−ＣＤ４３抗体（先に準備されたｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＣＤ４３単クローン抗体）で染色した後、続いて、Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｆ（ａｂ）２−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ：１１５−０３５−０７２）で染色して、実施例１５に記載の方法で観察した。
前記得られた結果を図２２に示した。図２２において、Ｈｉｓｔｏｇｒａｍ ｏｖｅｒｌａｙはリンパ球に限って表現したものである。図２２から明らかなように、多数のｎｏｒｍａｌ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ試料で抗−ＣＤ４３抗体（ＪＬ１で表示）染色で測定した時、低いもののｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓなＣＤ４３の発現を確認することができ、いくつかのｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌからも確認される。つまり、前記結果は、正常骨髄細胞における低くて異質的なＣＤ４３の発現を示す結果といえる。
一方、多数の人のｎｏｒｍａｌ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ試料（ソウル大学病院）でｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙでＣＤ３４＋ＣＤ３８−ｃｅｌｌ（ＦＡＣＳで試験してＣＤ４３の発現およびＣＤ３８非発現細胞に選別された造血幹細胞；以下、同一である）のＣＤ４３発現を測定することによって、ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌで識別されるＣＤ４３ ｐｒｏｔｅｉｎ発現が欠乏したことを確認し、ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗで群集を形成したｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌでも発現の欠乏を確認した。前記確認方法を簡単に記載すれば次の通りである：３０ＮＳＧ ｍｉｃｅ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤｘｃｏｍｍｏｎ ｇ ｃｈａｉｎ欠乏）に０日目に臍帯造血幹細胞を接種した。１２週後に、すべてのｍｉｃｅのＰＢＬ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）が最終的に分化したｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌで分析された。試験に使用されたすべてのｍｉｃｅは免疫体系が還元され、４週間、抗−ＣＤ４３抗体（先に準備されたｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＣＤ４３単クローン抗体）−ｔｏｘｉｎ（サポリン）ｃｏｎｊｕｇａｔｅまたはｖｅｈｉｃｌｅ（ＰＢＳ）を投与した。処理して４週後に、免疫細胞の存在下で免疫動物らを分析した。比較のために、抗−ＣＤ４３抗体の代わりにｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１−ｔｏｘｉｎ（サポリン）接合体を用いて同一の試験を行った。
前記得られた結果を下記表３に示した：
（前記表中、ＪＬ１はＣＤ４３を示す；ＰＭＮ：ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ；ＬＮ：ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）
前記表３から明らかなように、ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌから得られたｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ＨＳＣｓ）でＮＳＧ ｍｉｃｅを還元し、４週間、抗−ＣＤ４３抗体−ｔｏｘｉｎ（サポリン）接合体を処理した時、造血区画のいかなる損失も観察されなかった。このような結果は、抗−ＣＤ４３抗体−ｔｏｘｉｎ（サポリン）接合体が造血幹細胞や中間前駆体細胞を死滅させないことを示す。
多様なヒト正常組織においてマウス抗−ＣＤ４３抗体を用いて免疫組織化学法（ＩＨＣ）を行い、得られた結果を下記表４に示した。
前記表４から明らかなように、胸腺以外に他のいずれの組織でもＣＤ４３に対して特定的に染色されるものを見出すことができなかった。
２つの正常ヒトＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）サンプルをマウス抗−ヒトＣＤ４３（ＪＬ−１で表示：（ｄ））で染色して、ＣＤ４３抗原の発現率を測定した（実施例１５（ＦＡＣＳ）参照）。得られた結果を図２３に示した。図２３に示されるように、低い発現率を確認することができる。
正常骨髄細胞にｓａｐｏｒｉｎを結合させたマウス抗−ＣＤ４３抗体（１０ｕｌ／ｍｌ）を予め処理した場合（ＪＬ１＋）と、予め処理しない場合（ＪＬ１−）の骨髄下位集合（ｓｕｂｓｅｔ）のコロニー形成程度を測定した。ヒトから骨髄を分離して白血球を収穫し、ＣＤ３４＋細胞はＪＬ−１（ＣＤ４３）の陽性と陰性に分けて分離収穫し、収穫した細胞をｃｙｔｏｋｉｎｅと共にＭｅｔｈｏｃｕｌｔに入れた後、測定した。前記得られた結果を図２４に示した。図２４に示されるように、ｓａｐｏｒｉｎを結合させた抗−ＣＤ４３抗体を予め処理した場合（ＪＬ１＋）に骨髄下位集合（ｓｕｂｓｅｔ）のコロニーを形成しないことを確認することができる。
一方、細胞株を用いた白血病ＡＬＬ ｘｅｎｏｇｒａｆｔマウスモデル（ＣＥＭ７細胞をマウスに移植して得られた急性白血病マウスモデル）において抗−ＣＤ４３抗体自体（ｎａｋｅｄ）と、毒素が結合された抗−ＣＤ４３抗体−毒素（ｄｅｂｏｕｇａｎｉｎ）接合体の治療効果を試験した。前記抗−ＣＤ４３抗体として先に準備されたｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＣＤ４３単クローン抗体を使用した。前記得られた結果を図２５に示した。図２５において、抗−ＣＤ４３はＪＬ１で表示した。図２５において、（Ａ）はＣＥＭ７ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｍｏｄｅｌでの結果を、（Ｂ）はＮＡＬＭ−６ｍｏｄｅｌ（Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ：ＮＡＬＭ６（Ｂ−ＡＬＬ））での結果をそれぞれ示し、試験は次の条件下で行った：Ｍｉｃｅ：ＮＯＤ−ＳＣＩＤ（８／ｇｒｏｕｐ）；接種：０日目１０７ｃｅｌｌｓ；投与：１５ｕｇ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ＋１００ｕｇ ｂｕｌｋ ＩｇＧ ｉ．ｖ．１ｘ／ｗｅｅｋ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｄａｙ８；終了時点：マヒ状態。図２５から明らかなように、ＣＥＭ７またはＮＡＬＭ−６ｃｅｌｌを接種したＡＬＬ ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルｍｉｃｅにｎａｋｅｄ（ｎｏｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）ａｎｔｉ−ＣＤ４３抗体を処理すれば、病気が発生しなかったり遅延される。
一方、主要ＡＭＬ（Ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋａｅｍｉａ）ｂｌａｓｔと下位集合物（ｓｕｂｓｅｔ）におけるＣＤ４３の発現程度を測定した。前記結果を図２６に示した。図２６から明らかなように、ＣＤ４３ｐｒｏｔｅｉｎ（ＪＬ１で表示）の発現がｐｒｉｍａｒｙ ＡＭＬ ｂｌａｓｔと特定部分集合のｐｒｅｖａｌｅｎｃｅで分析された。約６０％のＡＭＬ群でＣＤ４３が発現した。
実施例１８：Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ−ＣＤ４３ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙの作製
ｍｏｕｓｅ ＣＤ４３抗体（重鎖：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４；重鎖コーディングＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３；重鎖発現ベクター：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、軽鎖：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７；軽鎖コーディングＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６；軽鎖発現ベクター（ｐＴＴ５ ｂａｓｅｄ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）の重鎖、軽鎖それぞれのＣＤＲ部位配列（ＣＤＲＨ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１（ＧＹＦＭＮ）；ＣＤＲＨ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４（ＲＩＮＰＮＮＧＤＳＦＹＮＱＫＦＱＧ）；ＣＤＲＨ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８（ＥＧＹＹＧＧＲＧＹＡＬＤＹ）；ＣＤＲＬ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９（ＲＴＳＱＤＩＳＮＹＬＮ）；ＣＤＲＬ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１（ＮＴＳＲＬＨＳ）；ＣＤＲＬ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５（ＱＱＳＮＭＦＰＹ））を維持し、ヒト抗体遺伝子をコーディングしているｇｅｒｍｌｉｎｅの配列に基づいてＦｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎに対する部位の配列を組換えたｓｃＦｖ形態の組換えヒューマナイズド抗体ライブラリーを作製した。
作製されたｓｃＦｖ抗体ライブラリーは通常のｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ方法で発現させてスクリーニングし、陽性と検出されたクローンでＣＤＲ以外の部位または一部ＣＤＲ内の部位配列を置換させたｖａｒｉａｎｔｓを表現するサブ−ライブラリー（ｓｕｂ−ｌｉｂｒａｒｙ）を作製してスクリーニングを繰り返した。
このようなｌｉｂｒａｒｙの作製とｄｉｓｐｌａｙ方法の様々なサイクルを繰り返すことによって、親クローン抗体と非常に類似の抗原親和度を示すヒューマナイズ抗体ｖａｒｉａｎｔ配列を確保した。
前記確保されたヒト化抗−ＣＤ４３抗体の重鎖配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：４０、４２、４４、および４６に示し、軽鎖配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示しており、重鎖可変領域と軽鎖可変領域をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、および８３（重鎖可変領域）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、および８３（軽鎖可変領域）に示した。
また、変形したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３（重鎖可変領域）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５（軽鎖可変領域）から変異したヒト化抗−ＣＤ４３抗体の変異体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：８４〜９４（重鎖可変領域）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：９６〜１０６（軽鎖可変領域）に示した。
ｓｃＦｖ形態の抗体は、前記得られた重鎖可変領域および軽鎖可変領域をＧＧＧＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８）に連結させて製造した。
実施例１９：Ｈｕｍａｎｉｚｅｄまたはｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉ−ＣＤ４３ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙによる抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ；Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）と補体依存毒性（ＣＤＣ；Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）。
前記製造されたキメリック抗−ＣＤ４３抗体（ＤＮＰ００１；実施例２−１−３）による細胞死滅効果（ＡＤＣＣ ａｎｄ ＣＤＣ）を試験した。まず、ＣＥＭ７細胞株を効果器細胞（ＰＢＭＣ；ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）と抗−ＣＤ４３キメリック抗体または対照群（ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１）と共に４時間培養した後、細胞毒性をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを用いて測定して、その結果を図２７のＡに示した。ＣＥＭ７細胞株を培養培地と抗−ＣＤ４３キメリック抗体をウサギ補体（ｃｅｄａｒｌａｎｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＣＬ３０５１）と共に培養した後、細胞毒性をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを用いて測定して、その結果を図２７のＢに示した。図２７において、抗−ＣＤ４３キメリック抗体をＪＬ−１で表示した。図２７に示すように、ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉ−ＣＤ４３ ａｎｔｉｂｏｄｙがｈｕｍａｎ ＩｇＧ１対照群抗体と比較してｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ（ＡＤＣＣとＣＤＣ）をｉｎ ｖｉｔｒｏ水準で誘導することを確認することができる。
図２８は、脱フコシル化（抗体にＫｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅを処理して脱フコシル化させる）された時、ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉ−ＣＤ４３ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＪＬ−１で表示）がｉｎ ｖｉｔｒｏ水準でＣＥＭ７に対するＡＤＣＣ活性が強化されることを示す。
図２９は、ｉｎ ｖｉｖｏでいずれとも結合しないキメリック抗体自体のＣＥＭ７細胞株における効果を示すグラフである。図２９に示すように、ｎａｋｅｄ（ｎｏｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）とｄｅｂｏｕｇａｎｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉ−ＣＤ４３抗体がＣＥＭ７ ｃｅｌｌの接種された動物（ＡＬＬ（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）白血病モデル）の生存を向上させることが確認された。
白血病幹細胞（Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＬＳＣ）下位集合（ｓｕｂｓｅｔ）におけるＣＤ４３の発現を試験した。ＡＭＬ（Ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）患者の骨髄はＣＤ４５抗体（ＢＤ）、ＣＤ３４抗体（ＢＤ）、ＣＤ３８抗体（ＢＤ）、ＣＤ４３抗体（ＤＮＰ００１）、またはｍＩｇＧ１（ｃｏｎｔｒｏｌ）をＡｌｅｘａ４８８で染色して観察し、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−白血病幹細胞を区画化してＣＤ４３の発現程度を評価し、対照群と比較して示した。前記結果を図３０に示した（ＪＬ１：ＣＤ４３）。図３０から明らかなように、ＣＤ４３抗原がｌｅｕｋｅｍｉａ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ（ＬＳＣ）部分集合（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−）で発現する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで毒素（サポリン：ＳＡＰ）と接合したｃｈｉｍｅｒｉｃ抗−ＣＤ４３抗体（ＣＣＣ）を用いたコロニーの平均個数を測定して図３１に示した。前記結果は、抗原−陽性ＡＭＬの細胞死滅効果を示し、細胞はＣＤ４３抗体−サポリン接合体またはマウスＩｇＧ１−サポリン接合体と共に幹細胞コロニーｍａｔｒｉｘに入れて観察した。
また、ｉｎ ｖｉｔｒｏで毒素（サポリン：ＳＡＰ）を接合させたｃｈｉｍｅｒｉｃ抗−ＣＤ４３抗体（ＣＣＣ）が抗原陽性の主要ＡＭＬの増殖に及ぼす影響を測定して図３２に示した。前記結果は、前記ＣＣＣが主要ＡＭＬの増殖を減少させることを示す。前記結果は、主要ＡＭＬ亜細胞（ｂｌａｓｔ）をＣＤ４３抗体−サポリン接合体またはマウスＩｇＧ１−サポリン接合体が含まれている培養培地に入れて、３日後に細胞増殖程度を測定して得られたものであり、前記結果から、ＪＬ１−サポリンを含む培地で培養時、細胞成長が遅くなり（Ａ）、死滅細胞の比率が増加すること（Ｂ）を確認することができる。
前記図３１および３２から明らかなように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｃｏｌｏｎｙ ａｓｓａｙ（図３１）とｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ（図３２）で確認すると、ｔｏｘｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ抗体はＣＤ４３−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｒｉｍａｒｙ ＡＭＬに対して細胞毒性がある。
ＮＳＧマウスで毒素が結合された抗体による主要ＡＭＬ癌細胞成長の抑制効果（ｉｎ ｖｉｖｏ）を試験した。ＣＤ４３＋ＡＭＬ患者から５×１０７個の骨髄細胞を収穫し、放射線照射を受けたＮＳＧマウス３０匹に静脈注射し、８週後に前記マウスにｃｈｉｍｅｒｉｃ ＣＤ４３抗体−ｄｅｂｏｕｇａｎｉｎ（ＤＢ）接合体（ＪＬ１−ＤＢで表示）、ｈＩｇＧ１−ＤＢ接合体（Ｉｓｏｔｙｐｅ−ＤＢで表示）、またはＰＢＳ（ｖｅｈｉｃｌｅ）を４週間４５ｕｇの用量で毎週投与した後、血液と骨髄と脾臓を取って、生着と腫瘍生成を観察した。前記得られた結果を図３３に示した。図３３から明らかなように、ｐｒｉｍａｒｙ ＡＭＬ癌細胞の成長はｉｎ ｖｉｖｏ水準のＮＳＧ ｍｉｃｅでｔｏｘｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ＣＤ４３ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙによって阻害する。
図３４および３５は、多様なヒト化／最適化した変形抗体が鋳型（マウス）ＣＤ４３抗体と比較した時、同等のバインディングプロファイルを示すことを確認した。ＣＥＭ７細胞を親鋳型ＣＤ４３抗体（ＡＲＴ１４０ＪＬ１；ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＣＤ４３抗体；重鎖：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４；軽鎖：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）と３種類のヒト化に変形させた抗体（２５７−１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６＆１０５）；４５６−Ｄ１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４＆１０６）；ＣｏｍｂｏＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２＆４））で染色して蛍光強度を測定して、その結果を図３４に示した。図３４から明らかなように、変形した「Ｃｏｍｂｏ Ａ」が最も良いプロファイルを示すが、その他の試験抗体もすべてＣＥＭ７細胞で細胞毒性を有意な程度に示すことが確認された。細胞毒性物質と接合された抗体の細胞内在化を試験するために、分析最終３種の変形抗体とサポリンとの接合体をａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−ｓａｐｏｒｉｎと予め混合した後、ＣＥＭ７細胞に処理して、３日後に細胞毒性を測定して、図３５に示した。図３５に示すように、３種の変形抗体とサポリンとの接合体を用いた場合、細胞毒性が顕著に高いことが明らかになった。
図３４および３５から明らかなように、多様なｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ−ＣＤ４３ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｎｔのｂｉｎｄｉｎｇ水準とｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性の水準はｍｕｒｉｎｅ ＣＤ４３抗体（ＡＲＴ１４０ ＪＬ１）と比較した時、同等であった。ＲＳＶ Ｆ ｐｒｏｔｅｉｎのＡ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｉｔｅにある抗原決定基に対するｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＩｇＧ）であるＳｙｎａｇｉｓは対照群として使用された。
図３７Ａと３７Ｂは、多数のｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ−ＣＤ４３抗体ｖａｒｉａｎｔ（図３６参照）は、ｍｕｒｉｎｅ ＣＤ４３抗体（ＡＲＴ１４０ ＪＬ１）と比較した時、ｃｅｌｌ表面にあるＣＤ４３抗原に結合することをｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙにより示す。Ｕ９３７細胞は、表面にＣＤ４３抗原の発現が欠乏したｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして使用された。
図３８Ａと３７Ｂは、多水のｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ−Ｊ ＣＤ４３抗体ｖａｒｉａｎｔ（図３６参照）は、ｍｕｒｉｎｅ ＣＤ４３抗体（ＡＲＴ１４０ ＪＬ１）と比較した時、ｃｅｌｌ表面にあるＣＤ４３抗原に結合することをｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）により示す。Ｕ９３７細胞は、表面にＣＤ４３抗原の発現が欠乏したｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして使用された。
図３９Ａおよび３９Ｂは、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ ｍｕｔａｎｔ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ−ＣＤ４３抗体ｖａｒｉａｎｔ（Ｃｏｍｂｏ Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１（重鎖可変領域）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３（軽鎖可変領域））、Ｃｏｍｂｏ Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１（重鎖可変領域）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３（軽鎖可変領域））、Ｃｏｍｂｏ Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５（重鎖可変領域）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７（軽鎖可変領域）））、ｍｕｒｉｎｅ ＣＤ４３抗体（ＡＲＴ１４０ ＪＬ１）とｒｏｕｎｄ３ ｐａｒｅｎｔａｌ ｆｒａｍｅｗｏｒｋと比較した時、ｃｅｌｌ表面にあるＣＤ４３に結合することをｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙにより示す。
図４１Ａ−４１Ｃは、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ ｍｕｔａｎｔ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ−ＣＤ４３抗体ｖａｒｉａｎｔ（Ｃｏｍｂｏ Ａ、Ｃｏｍｂｏ Ｂ、Ｃｏｍｂｏ Ｃ）は、ｍｕｒｉｎｅ ＣＤ４３抗体（ＡＲＴ１４０ ＪＬ１）とｒｏｕｎｄ３ ｐａｒｅｎｔａｌ ｆｒａｍｅｗｏｒｋと比較した時、ｃｅｌｌ表面にあるＪＬ１抗原に結合することをＥＬＩＳＡにより示す。
実施例２０：ヒト化抗体の糖化部位アミノ酸残基除去変異抗体の製造
実施例１８で得られたヒト化抗−ＣＤ４３抗体（２５７−１０；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（重鎖可変領域）＋ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５（軽鎖可変領域）含む）の軽鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５）に糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）可能性のあるアミノ酸配列があることを発見し、これを除去するための変異（ｍｕｔａｎｔ）抗体を製造した。
軽鎖抗原結合部位（軽鎖可変領域）の糖化は、抗体の抗原結合能力および抗体物性に否定的な影響を招く可能性が高く、後の大量生産時、生産性の低下に影響を及ぼし得るため、潜在的な糖化可能性のあるアミノ酸を他のアミノ酸に置換することによって、治療剤としての抗体開発の可能性を高めることができる。
ヒト化抗−ＣＤ４３抗体の軽鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５）の糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）可能性のあるアミノ酸として５０番目の位置のアミノ酸残基アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）と５２番目の位置のアミノ酸残基セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）を選択した（図４３参照）。前記変異抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の５０番目の位置のアミノ酸残基アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）をグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）またはアラニン（Ａｌａ、Ａ）に置換、および／または５２番目の位置のアミノ酸残基セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）をアラニン（Ａｌａ、Ａ）に置換して製造し、このように得られた変異抗体の軽鎖可変領域をＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１０７（Ｓ５２Ａ）、１０８（Ｎ５０Ｑ）、および１０９（Ｎ５０Ａ）に示した。
［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０７（Ｓ５２Ａ）］
ＤＴＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＮＴＡＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＮＭＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０８（Ｎ５０Ｑ）］
ＤＴＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＱＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＮＭＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０９（Ｎ５０Ａ）］
ＤＴＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＮＭＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）と前記得られた変異抗体の軽鎖可変領域を含むＩｇＧ１形態の抗体を作製し、糖化部位に結合するコンカナバリンＡ（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ）−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてウェスタンブロッティングを行った。
前記得られた結果を図４４に示した。図４４に示されるように、糖化部位アミノ酸に変移させていない抗体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５を含む；ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）では、軽鎖部位および重鎖部位ともコンカナバリンＡ（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ）が結合したものの、前記３種類の変異抗体（ｓｃＦｖ）では、軽鎖部位で結合が起こらないことを確認することができる。このような結果は、抗体の軽鎖部位の糖化が除去されたことを意味する。
また、前記変異抗体のＣＤ４３陽性細胞のＣＥＭ７細胞との結合力を測定して、抗原結合力を分析した。前記得られた結果を図４５に示した。図４５に示されるように、前記変異抗体は、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅと同等程度の抗原結合力を示す。
キメリック抗体（ＤＮＰ００１）と糖化除去したヒト化抗体（重鎖可変領域；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６；軽鎖可変領域：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）を抗原（ＣＤ４３）陽性細胞のＣＥＭ７細胞に結合させ、Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで分析した。前記得られた結果を図４６に示した。図４６に示すように、変異ヒト化抗体がキメリック抗体よりさらに向上したＣＤ４３発現細胞の結合力を示すことを確認することができる。

Claims (22)

  1. 抗ＣＤ４３抗体又はその抗原結合断片を含む、固形癌を治療するための、又は癌幹細胞を阻害するための薬学組成物であって、抗ＣＤ４３抗体又はその抗原結合断片が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０のＣＤＲ１Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３のＣＤＲ２Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８のＣＤＲ３Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９のＣＤＲ１Ｌ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４のＣＤＲ２Ｌ、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５のＣＤＲ３Ｌを含む、薬学組成物。
  2. 抗原決定部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１、１３２、１３３、及び１３４から選択されたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１または１１２のＣＤＲ１Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４、１１５、１１６または１１７のＣＤＲ２Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８のＣＤＲ３Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９のＣＤＲ１Ｌ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４のＣＤＲ２Ｌ、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５のＣＤＲ３Ｌを含む、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 前記抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１のＣＤＲ１Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４のＣＤＲ２Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８のＣＤＲ３Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９のＣＤＲ１Ｌ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４のＣＤＲ２Ｌ、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５のＣＤＲ３Ｌを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９の軽鎖可変領域を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記固形癌は、胃癌、乳癌、肺癌、大腸癌、肝癌、胆嚢癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸部癌、または膀胱癌である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 細胞毒性物質および標識物質からなる群より選択された１種以上を追加的に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記細胞毒性物質は、リシン、サポリン、ゲロニン、モモルジン、デボウガニン、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、放射線同位元素、デュオカルマイシン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、Ｎ２’−ジアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）マイタンシン（ＤＭ１）、およびピロロベンゾジアゼピン(ＰＢＤ）ダイマーからなる群より選択された１種以上である、請求項７に記載の組成物。
  9. 癌幹細胞は、血液悪性腫瘍または固形癌の癌幹細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０のＣＤＲ１Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３のＣＤＲ２Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８のＣＤＲ３Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９のＣＤＲ１Ｌ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４のＣＤＲ２Ｌ、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５のＣＤＲ３Ｌを含む、抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片。
  11. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１または１１２のＣＤＲ１Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４、１１５、１１６、または１１７のＣＤＲ２Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８のＣＤＲ３Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９のＣＤＲ１Ｌ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４のＣＤＲ２Ｌ、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５のＣＤＲ３Ｌを含む、請求項１０に記載の抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片。
  12. 前記抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１のＣＤＲ１Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４のＣＤＲ２Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８のＣＤＲ３Ｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９のＣＤＲ１Ｌ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４のＣＤＲ２Ｌ、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５のＣＤＲ３Ｌを含む、請求項１０又は１１に記載の抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片。
  13. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の重鎖可変領域；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９の軽鎖可変領域を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片。
  14. 請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片；および
    細胞毒性物質および標識物質からなる群より選択された１種以上を含む接合体。
  15. 前記細胞毒性物質は、リシン、サポリン、ゲロニン、モモルジン、デボウガニン、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、放射線同位元素、デュオカルマイシン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、Ｎ２’−ジアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）マイタンシン（ＤＭ１）、およびピロロベンゾジアゼピン(ＰＢＤ）ダイマーからなる群より選択された１種以上である、請求項１４に記載の接合体。
  16. 請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片、又は請求項１４又は１５に記載の接合体、および薬学的に許容可能な担体を含む、癌を治療又は予防するための薬学組成物。
  17. 癌が、血液悪性腫瘍である、請求項１６に記載の薬学組成物。
  18. 血液悪性腫瘍は、急性骨髄球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性単球性白血病、ホジキンリンパ腫、又は非ホジキンリンパ腫である、請求項１７に記載の組成物。
  19. 請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子。
  20. 請求項１９に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
  21. 請求項２０に記載の組換えベクターを含む組換え細胞。
  22. 請求項２１に記載の組換え細胞を培養する段階を含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４３抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
JP2018538512A 2015-10-12 2016-10-12 抗−ｃｄ４３抗体およびその癌治療用途 Active JP6758388B2 (ja)

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