RU2694903C1 - Антитела к CD43 и их применение для лечения рака - Google Patents
Антитела к CD43 и их применение для лечения рака Download PDFInfo
- Publication number
- RU2694903C1 RU2694903C1 RU2018115692A RU2018115692A RU2694903C1 RU 2694903 C1 RU2694903 C1 RU 2694903C1 RU 2018115692 A RU2018115692 A RU 2018115692A RU 2018115692 A RU2018115692 A RU 2018115692A RU 2694903 C1 RU2694903 C1 RU 2694903C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- cancer
- seq
- antigen
- cells
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 381
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 358
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 426
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 213
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 206
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 206
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 206
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 183
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 159
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 127
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 122
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 104
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 67
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 60
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 45
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 29
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 3
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 claims abstract 8
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 claims abstract 8
- 102100035359 Cerebellar degeneration-related protein 2-like Human genes 0.000 claims abstract 5
- 101000737792 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2-like Proteins 0.000 claims abstract 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 66
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 65
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims description 53
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 claims description 52
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 36
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 35
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 35
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 34
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 34
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 25
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 claims description 25
- 108010084592 Saporins Proteins 0.000 claims description 25
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 21
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 20
- 229960005501 duocarmycin Drugs 0.000 claims description 15
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 15
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 14
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 14
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 11
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 11
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 11
- -1 debuganin Proteins 0.000 claims description 11
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 10
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 10
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 9
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N [4-[[(2S)-5-(carbamoylamino)-2-[[(2S)-2-[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)hexanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]pentanoyl]amino]phenyl]methyl N-[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1S,2R)-1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl]amino]-1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl]pyrrolidin-1-yl]-3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl]-methylamino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]-N-methylcarbamate Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H]([C@@H](CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)c1ccccc1)OC)N(C)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)OCc1ccc(NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCCN2C(=O)CCC2=O)C(C)C)cc1)C(C)C IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N 0.000 claims description 9
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 8
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims description 7
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 claims description 7
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 7
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims description 7
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 108010093470 monomethyl auristatin E Proteins 0.000 claims description 7
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 7
- MFRNYXJJRJQHNW-DEMKXPNLSA-N (2s)-2-[[(2r,3r)-3-methoxy-3-[(2s)-1-[(3r,4s,5s)-3-methoxy-5-methyl-4-[methyl-[(2s)-3-methyl-2-[[(2s)-3-methyl-2-(methylamino)butanoyl]amino]butanoyl]amino]heptanoyl]pyrrolidin-2-yl]-2-methylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CN[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N(C)[C@@H]([C@@H](C)CC)[C@H](OC)CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MFRNYXJJRJQHNW-DEMKXPNLSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- VQNATVDKACXKTF-XELLLNAOSA-N duocarmycin Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=C2NC(C(=O)N3C4=CC(=O)C5=C([C@@]64C[C@@H]6C3)C=C(N5)C(=O)OC)=CC2=C1 VQNATVDKACXKTF-XELLLNAOSA-N 0.000 claims description 6
- 229930184221 duocarmycin Natural products 0.000 claims description 6
- 108010059074 monomethylauristatin F Proteins 0.000 claims description 6
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 claims description 4
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 claims description 4
- 108700004714 Gelonium multiflorum GEL Proteins 0.000 claims description 4
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 claims description 4
- 239000009562 momordin Substances 0.000 claims description 4
- YUOCYTRGANSSRY-UHFFFAOYSA-N pyrrolo[2,3-i][1,2]benzodiazepine Chemical class C1=CN=NC2=C3C=CN=C3C=CC2=C1 YUOCYTRGANSSRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 206010000871 Acute monocytic leukaemia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000035489 Monocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 3
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 229930126263 Maytansine Natural products 0.000 claims description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 claims description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 29
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 26
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 76
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 52
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 51
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 51
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 51
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 48
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 48
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 43
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 40
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 40
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 37
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 37
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 37
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 34
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 34
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 31
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 26
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 25
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 25
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 25
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 22
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 21
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 19
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 17
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 16
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 15
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 15
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 15
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 13
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 12
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 12
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 10
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 10
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 102000005931 Leukosialin Human genes 0.000 description 9
- 108010005832 Leukosialin Proteins 0.000 description 9
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 9
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 9
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 9
- 230000009471 action Effects 0.000 description 9
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 9
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 8
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 8
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 7
- 101000995200 Homo sapiens Neurabin-2 Proteins 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 102000050471 human SPN Human genes 0.000 description 7
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 7
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100025473 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 Human genes 0.000 description 5
- 101000914326 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 Proteins 0.000 description 5
- 101000610551 Homo sapiens Prominin-1 Proteins 0.000 description 5
- 241000521257 Hydrops Species 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 5
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 5
- 102100040120 Prominin-1 Human genes 0.000 description 5
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 5
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 5
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 5
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 5
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 5
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 5
- ANZJBCHSOXCCRQ-FKUXLPTCSA-N mertansine Chemical compound CO[C@@H]([C@@]1(O)C[C@H](OC(=O)N1)[C@@H](C)[C@@H]1O[C@@]1(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](C)N(C)C(=O)CCS)CC(=O)N1C)\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 ANZJBCHSOXCCRQ-FKUXLPTCSA-N 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 5
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 5
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 5
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012357 Gap analysis Methods 0.000 description 4
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 4
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 4
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 4
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 229940122803 Vinca alkaloid Drugs 0.000 description 4
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 4
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 4
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 4
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 4
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 4
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 4
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 4
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 4
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 3
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 3
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 3
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 3
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 3
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- SRBFGSGDNNQABI-FHWLQOOXSA-N Pro-Leu-Trp Chemical compound N([C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 SRBFGSGDNNQABI-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N Thr-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 3
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 3
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 3
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- OMRPLUKQNWNZAV-CONSDPRKSA-N (6as)-3-[3-[[(6as)-2-methoxy-8-(4-methoxyphenyl)-11-oxo-6a,7-dihydropyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-3-yl]oxy]propoxy]-8-(4-aminophenyl)-2-methoxy-6a,7-dihydropyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-11-one Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C1=CN2C(=O)C3=CC(OC)=C(OCCCOC=4C(=CC=5C(=O)N6C=C(C[C@H]6C=NC=5C=4)C=4C=CC(N)=CC=4)OC)C=C3N=C[C@@H]2C1 OMRPLUKQNWNZAV-CONSDPRKSA-N 0.000 description 2
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000025321 B-lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 208000001976 Endocrine Gland Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 description 2
- RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 102100038367 Gremlin-1 Human genes 0.000 description 2
- 101001032872 Homo sapiens Gremlin-1 Proteins 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 2
- 208000000821 Parathyroid Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 2
- 208000004337 Salivary Gland Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010061934 Salivary gland cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000021712 Soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 206010047741 Vulval cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000004354 Vulvar Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 201000005188 adrenal gland cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000024447 adrenal gland neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 102000012086 alpha-L-Fucosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010061314 alpha-L-Fucosidase Proteins 0.000 description 2
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 208000030381 cutaneous melanoma Diseases 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002700 inhibitory effect on cancer Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000029559 malignant endocrine neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000026045 malignant tumor of parathyroid gland Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000002628 peritoneum cancer Diseases 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 208000017426 precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 201000005102 vulva cancer Diseases 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LNRTZXJBLJXDSW-UHFFFAOYSA-N 2-(9h-carbazol-2-yl)ethanamine Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=C(CCN)C=C3NC2=C1 LNRTZXJBLJXDSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005465 AC133 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000005908 AC133 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 241000191291 Abies alba Species 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 101001074841 Allium cepa Bifunctional 6(G)-fructosyltransferase/2,1-fructan:2,1-fructan 1-fructosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 239000012583 B-27 Supplement Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000012492 Biacore method Methods 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008583 Chloroma Diseases 0.000 description 1
- 241000777300 Congiopodidae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000012804 EPCAM Human genes 0.000 description 1
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N Gly-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C(=O)O ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 206010066476 Haematological malignancy Diseases 0.000 description 1
- 239000007756 Ham's F12 Nutrient Mixture Substances 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- SUYRAPCRSCCPAK-VFAJRCTISA-N Leu-Trp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SUYRAPCRSCCPAK-VFAJRCTISA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Chemical group 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- FKYWFUYPVKLJLP-DCAQKATOSA-N Ser-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CO FKYWFUYPVKLJLP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 101150057140 TACSTD1 gene Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102220468073 Trafficking protein particle complex subunit 5_S52A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- VMXLNDRJXVAJFT-JYBASQMISA-N Trp-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N)O VMXLNDRJXVAJFT-JYBASQMISA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 208000036676 acute undifferentiated leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000009227 antibody-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001714 calcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 1
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003340 calcium silicate Drugs 0.000 description 1
- 235000012241 calcium silicate Nutrition 0.000 description 1
- OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N calcium;dioxido(oxo)silane Chemical compound [Ca+2].[O-][Si]([O-])=O OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004611 cancer cell death Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 101150106284 deoR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 210000000959 ear middle Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 201000011523 endocrine gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 230000009454 functional inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 208000001130 gallstones Diseases 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 208000017750 granulocytic sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 206010073095 invasive ductal breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000010985 invasive ductal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- WKPWGQKGSOKKOO-RSFHAFMBSA-N maytansine Chemical compound CO[C@@H]([C@@]1(O)C[C@](OC(=O)N1)([C@H]([C@@H]1O[C@@]1(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](C)N(C)C(C)=O)CC(=O)N1C)C)[H])\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 WKPWGQKGSOKKOO-RSFHAFMBSA-N 0.000 description 1
- 101150023497 mcrA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000000765 microspectrophotometry Methods 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 201000005987 myeloid sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 101150012154 nupG gene Proteins 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229940068918 polyethylene glycol 400 Drugs 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 201000001281 rectum adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 201000010174 renal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000002702 ribosome display Methods 0.000 description 1
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 201000003708 skin melanoma Diseases 0.000 description 1
- 201000002314 small intestine cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940036185 synagis Drugs 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6817—Toxins
- A61K47/6819—Plant toxins
- A61K47/6825—Ribosomal inhibitory proteins, i.e. RIP-I or RIP-II, e.g. Pap, gelonin or dianthin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Botany (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к медицине и касается фармацевтической композиции для лечения солидного рака или ингибирования раковой стволовой клетки, содержащей антитело к CD43 (кластер дифференцировки 43) или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1H с SEQ ID NO: 110, CDR2H с SEQ ID NO: 113, CDR3H с SEQ ID NO: 118, CDR1L с SEQ ID NO: 119, CDR2L с SEQ ID NO: 120 и CDR3L с SEQ ID NO: 125, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с эпитопом, состоящим из 6-9 следующих друг за другом аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134, и где указанные 6-9 следующих друг за другом аминокислот содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131. Группа изобретений также касается способа скрининга агента для лечения солидного рака или ингибирования раковой стволовой клетки; молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент; рекомбинантного вектора, содержащего указанную молекулу нуклеиновой кислоты. Группа изобретений обеспечивает лечение солидного рака или ингибирование раковой стволовой клетки. 9 н. и 15 з.п. ф-лы, 20 пр., 46 ил., 4 табл.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Предложены антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающиеся с внеклеточным доменом CD43, композиция для лечения рака, содержащая антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент в качестве активного ингредиента, композиция для ингибирования раковой стволовой клетки, содержащая антитело к CD43, связывающееся с внеклеточным доменом CD43, в качестве активного ингредиента, и способ скрининга агента ингибирования раковой стволовой клетки.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
CD43 представляет собой белок клеточной поверхности, экспрессируемый в различных гематобластах за исключением эритроцитов. В состав CD43 человека, известного как сиалофорин или лейкосиалин, входит муциноподобный внеклеточный домен, состоящий из 235 аминокислот, трансмембранный домен, состоящий из 23 аминокислот, и внутриклеточный домен, состоящий из 123 аминокислот, и релевантная генетическая информация закодирована в одном экзоне. Во внеклеточном домене CD43 человека содержится много аминокислотных остатков серина (46 остатков) и треонина (47 остатков), и большая часть из них имеет О-присоединенный гликан (О-гликан). Кроме того, N-гликан также присоединен к CD43. Известно, что структура О-гликана сильно варьирует в зависимости от типа клетки. Ген CD43 имеет интрон, состоящий из 378 пар оснований, который разделяет экзон на два участка, и полная информация о транскрибируемом материале закодирована во втором экзоне.
CD43 синтезируется в виде предшественника размером примерно 40 килодальтон (кДа), включая N-гликан, и превращается в продукт с молекулярной массой от 115 кДа до 200 кДа в ходе последовательно происходящих процессов гликозилирования. Благодаря строго контролируемому процессу гликозилирования, после транскрипции образуются изоформы белков с характерной молекулярной массой в зависимости от типа клетки, и они могут экспрессироваться по-разному в зависимости от типа клетки.
Гликозилированный эпитоп CD43 известен как специфический маркер, характерный для лейкоцитов, и выявлена его специфическая полезность в качестве маркера гематологического злокачественного заболевания. По этой причине во многих исследованиях была протестирована возможность использования связывания антител с гликозилированным эпитопом CD43 для диагностических или терапевтических целей. Известно, что моноклональное антитело грызунов, распознающее CD43, индуцирует апоптоз костномозговых гематопоэтических клеток-предшественников, негативных по соответствующему маркеру клеточной линии, которые сверхэкспрессируют CD34 (Bazil et al. (1996) Blood, 87(4): 1272-81), и Т-лимфобластоидных клеток человека (Brown et al. (1996) J. Biol. Chem., 271: 27686-95). Однако, эти антитела не представляются эффективными для обнаружения или обработки раковых клеток, поскольку большинство из них взаимодействует с гликозилированным эпитопом, расположенным во внеклеточном домене CD43, экспрессируемого в зрелых (нераковых) гематопоэтических клетках. Таким образом, существует необходимость в разработке улучшенного вещества, связывающегося с гликозилированным эпитопом CD43, для диагностики, отслеживания и лечения гематологического злокачественного заболевания.
С другой стороны, известна гипотеза раковых стволовых клеток, согласно которой аномальные стволовые клетки вовлечены в возникновение и рецидив ракового заболевания в иерархической модели.
Все ткани организма человека берут начало из органоспецифических стволовых клеток. Органоспецифические стволовые клетки обладают способностью к самообновлению и дифференцировке во все клетки, составляющие каждый орган. Эти органоспецифические стволовые клетки отличаются от эмбриональных стволовых клеток тем, что только они могут дифференцироваться в типичные для конкретного органа клетки.
Гипотеза раковых стволовых клеток состоит в основном из двух элементов. Во-первых, опухоль возникает из стволовой клетки в ткани и, во-вторых, опухоль, возникающая из стволовой клетки, обладает основными свойствами стволовых клеток.
Раковая стволовая клетка как раковая клетка, обладающая неограниченной способностью к регенерации, определяется как клетка, из которой в случае введения мышам с ослабленным иммунитетом фактически может образовываться опухоль и которая может проявлять свою уникальную гетерогенность, которой в образовавшейся опухоли в полной мере обладает первичная опухоль.
Гипотеза раковых стволовых клеток стала более реальным фактом в связи с недавно разработанной биологией стволовых клеток. Гипотеза раковых стволовых клеток сделала шаг вперед благодаря сообщению, что лейкоз человека передавался мыши с ослабленным иммунитетом, которой пересаживали возможные раковые стволовые клетки от пациента с острым миелоцитарным лейкозом в 1997 г. (Bonnet D, Dick JE, Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med., 1997, 3: 730-7).
Отличающаяся гетерогенность, которую демонстрирует злокачественная опухоль, согласуется с различной способностью к дифференцировке стволовых клеток и повторно возникающей лекарственной устойчивостью раковой клетки, и несмотря на целый ряд направленных схем лечения также согласуется с основным свойством стволовых клеток. Поскольку из раковой стволовой клетки путем самообновления может образовываться новая опухолевая масса, то даже если опухолевые клетки, отличающиеся от раковых стволовых клеток, полностью удалены хирургическим и химиотерапевтическим путем, то раковое заболевание возникает вновь в случае сохранения раковой стволовой клетки.
Таким образом, чтобы полностью излечиться от рака, необходимо разработать технологию ингибирования или удаления раковых стволовых клеток.
ОПИСАНИЕ
ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА
В другом воплощении предложена фармацевтическая композиция для лечения солидного рака, содержащая антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43.
В другом воплощении предложен способ лечения солидного рака, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, субъекту, нуждающемуся в лечении солидного рака.
В другом воплощении предложено применение антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, для лечения солидного рака.
Эпитопом может быть полипептид, содержащий 6-9 следующих друг за другом аминокислот во внеклеточном домене CD43, имеющий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 131. Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой вышеупомянутое антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент.
Фармацевтическая композиция, способ и применение для лечения солидного рака могут характеризоваться, например, проявлением ингибирующего эффекта в отношении раковых стволовых клеток при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке. В одном из воплощений солидный рак может представлять собой рак желудка, а гематологическое злокачественное заболевание может представлять собой лейкоз.
В другом воплощении предложена фармацевтическая композиция для ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, содержащая в качестве активного ингредиента антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43.
В другом воплощении предложен способ ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, субъекту, нуждающемуся в лечении гематологического злокачественного заболевания или солидного рака.
В другом воплощении предложено применение для ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43.
Эпитоп может представлять собой полипептид, содержащий 6-9 следующих друг за другом аминокислот во внеклеточном домене CD43, имеющий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 131. Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент могут представлять собой вышеупомянутое антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент. В одном из воплощений солидный рак может представлять собой рак желудка.
В другом воплощении предложен конъюгат между антителом к CD43 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, и раковой стволовой клеткой, например, раковой стволовой клеткой при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке. В другом воплощении предложен способ получения конъюгата между антителом к CD43 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, и раковой стволовой клеткой, например, раковой стволовой клеткой при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, причем данный способ может включать стадию введения антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, в образец раковой опухоли, например, образец солидной раковой опухоли, или раковому пациенту, такому как пациент с диагнозом солидного рака. Конъюгат или способ его получения можно использовать для различных клинических, диагностических и/или экспериментальных задач, а также для лечения рака.
В другом воплощении предложен агент для скрининга агента для лечения солидного рака, содержащий эпитоп, локализованный во внеклеточном домене CD43. В другом воплощении предложен способ скрининга агента для лечения солидного рака с использованием эпитопа, локализованного во внеклеточном домене CD43. В другом воплощении предложено применение эпитопа, локализованного во внеклеточном домене CD43, для скрининга агента для лечения солидного рака. Эпитоп может представлять собой полипептид, содержащий 6-9 следующих друг за другом аминокислот во внеклеточном домене CD43, имеющий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 131. Агент для лечения солидного рака, обнаруженный посредством описанного выше скрининга, может характеризоваться проявлением ингибирующего эффекта в отношении раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке. В одном из воплощений солидный рак может представлять собой рак желудка.
В другом воплощении предложен агент для скрининга агента для ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, содержащий эпитоп, локализованный во внеклеточном домене CD43. В другом воплощении предложен способ скрининга агента для ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, с использованием эпитопа, локализованного во внеклеточном домене CD43. В другом воплощении предложено применение эпитопа, локализованного во внеклеточном домене CD43, для скрининга агента для ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке. Эпитоп может представлять собой полипептид, содержащий 6-9 следующих друг за другом аминокислот во внеклеточном домене CD43, имеющий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 131. В одном из воплощений солидный рак может представлять собой рак желудка.
В другом воплощении предложены новое антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент может связываться с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43. Эпитоп может представлять собой полипептид, содержащий 6-9 следующих друг за другом аминокислот во внеклеточном домене CD43, имеющий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 131.
Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL).
Вариабельная область тяжелой цепи может содержать первый определяющий комплементарность участок (CDR) (CDR1H), второй CDR (CDR2H) и третий CDR (CDR3H) в порядке расположения от N-конца к С-концу.
В одном из воплощений существенным компонентом антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента является вариабельная область тяжелой цепи, и она может содержать CDR1H, включающий аминокислотную последовательность GYX1MN (SEQ ID NO: 110; X1 может быть выбран из всех аминокислот и, например, может представлять собой F или Y) (например, GYFMN (SEQ ID NO: 111) или GYYMN (SEQ ID NO: 112)), CDR2H, включающий аминокислотную последовательность RINPNX2GDSFYNQKFX3G (SEQ ID NO: 113; X2 и X3 могут быть выбраны из всех аминокислот, соответственно, и, например, Х2 может представлять собой N или S, а Х3 может представлять собой Q или K) (например, RINPNNGDSFYNQKFQG (SEQ ID NO: 114), RINPNSGDSFYNQKFQG (SEQ ID NO: 115), RINPNNGDSFYNQKFKG (SEQ ID NO: 116) или RINPNSGDSFYNQKFKG (SEQ ID NO: 117)), и CDR3H, включающий аминокислотную последовательность EGYYGGRGYALDY (SEQ ID NO: 118).
Вариабельная область легкой цепи может содержать первый CDR (CDR1L), второй CDR (CDR2L) и третий CDR (CDR3L) в порядке расположения от N-конца к С-концу.
В одном из воплощений существенным компонентом антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента является вариабельная область легкой цепи, и она может содержать CDR1L, включающий аминокислотную последовательность RTSQDISNYLN (SEQ ID NO: 119); CDR2L, включающий аминокислотную последовательность X4TX5RLHS (SEQ ID NO: 120; Х4 и Х5 могут быть выбраны из всех аминокислот, соответственно, и, например, Х4 может представлять собой N, Q или А, а Х5 может представлять собой S или А) (например, NTSRLHS (SEQ ID NO: 121, NTARLHS (SEQ ID NO: 122), QTSRLHS (SEQ ID NO: 123) или ATSRLHS (SEQ ID NO: 124)); и CDR3L, включающий аминокислотную последовательность QQSNMFPY (SEQ ID NO: 125).
В другом воплощении предложена фармацевтическая композиция для предупреждения и/или лечения рака, содержащая антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.
В другом воплощении предложен способ предупреждения и/или лечения рака, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента субъекту, нуждающемуся в предупреждении и/или лечении рака.
В другом воплощении предложено применение антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента для предупреждения и/или лечения рака либо для изготовления противораковых средств.
В одном конкретном воплощении, касающемся фармацевтической композиции, способа и применения для предупреждения и/или лечения рака, антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть предложены в качестве единственного активного ингредиента, совместно вводимого с цитотоксическим веществом, таким как противораковые средства, или могут быть предложены в форме конъюгата, объединенного с цитотоксическим веществом, таким как противораковые средства (конъюгат антитело-лекарственное средство; ADC).
В другом воплощении предложен способ детектирования раковой клетки в образце с использованием антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента. Способ детектирования может включать стадию приведения в контакт образца с антителом к CD43 или его антигенсвязывающим фрагментом и стадию детектирования взаимодействия антигена с антителом в образце.
В другом воплощении предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент.
В другом воплощении предложен рекомбинантный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты. Рекомбинантный вектор может быть использован в качестве экспрессирующего вектора для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине.
В другом воплощении предложена рекомбинантная клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты или рекомбинантный вектор. Рекомбинантная клетка может быть получена путем трансформации клетки-хозяина молекулой нуклеиновой кислоты или рекомбинантным вектором.
В другом воплощении предложен способ получения антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента. Способ получения может включать стадию экспрессирования молекулы нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Стадия экспрессирования может включать стадию культивирования рекомбинантной клетки и произвольным образом может дополнительно включать стадию выделения и/или очистки антитела из полученных клеточных культур.
В одном из конкретных воплощений способ получения может включать:
(а) стадию получения рекомбинантной клетки, трансформированной молекулой нуклеиновой кислоты или рекомбинантным вектором;
(б) стадию культивирования рекомбинантной клетки в условиях и/или в течение периода времени, достаточных для осуществления экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты; и
(в) стадию выделения и/или очистки антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента из культур, полученных на стадии (б).
ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ
Как описано выше, необходимо разработать технологию ингибирования или удаления раковой стволовой клетки, чтобы полностью вылечить рак, и для этого необходимо выбрать маркер раковой стволовой клетки, с помощью которого можно отделять раковые стволовые клетки от других клеток.
В данном описании впервые утверждается, что CD43 экспрессируется на поверхности раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке. CD43 известен как специфический маркер лейкоцитов, характерный для большинства лейкоцитов, гематопоэтических стволовых клеток и тромбоцитов, за исключением эритроцитов, но не было известно, что он экспрессируется на раковой стволовой клетке, например, раковой стволовой клетке при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке.
Помимо этого, утверждается, что антитело к CD43, которое специфично распознает конкретный участок и/или связывается с конкретным участком внеклеточного домена CD43, обладает эффективностью с точки зрения ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке.
CD43 (кластер дифференцировки 43) называют лейкосиалином или сиалофорином, и он представляет собой основной трансмембранный белок, экспрессируемый на поверхности большинства гематобластов, за исключением эритроцитов. Источником CD43 могут быть млекопитающие, в том числе приматы, такие как человек (Homo sapiens) и так далее, грызуны, такие как мышь (Mus. musculus) и так далее. Например, CD43 может представлять собой CD43 человека (например, с № доступа в NCBI (Национальный центр биотехнологической информации) ААА51949.1 (ген (матричная РНК (мРНК)): М61827.1), NP_001025459.1 (ген (мРНК): NM_001030288.1), NP_003114.1 (ген: NM_003123.3) и т.д.), CD43 мыши (например, с № доступа в NCBI NP_001032899.1 (ген: NM_001037810.1), NP 033285.1 (ген: NM_009259.4) и т.д.) и так далее. В этом воплощении CD43 может представлять собой CD43 человека (белок: № доступа в NCBI ААА51949.1 (SEQ ID NO: 130); ген (мРНК): М61827.1).
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения солидного рака, содержащая в качестве активного ингредиента антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43.
В другом воплощении предложен способ лечения солидного рака, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, субъекту, нуждающемуся в лечении солидного рака.
В другом воплощении предложено применение антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, для лечения солидного рака.
Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, характеризуется проявлением ингибирующей активности в отношении раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке.
Таким образом, согласно другому воплощению настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, содержащая в качестве активного ингредиента антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43.
В другом воплощении предложен способ ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, субъекту, нуждающемуся в лечении солидного рака.
В другом воплощении предложено применение для ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43.
В данном описании, если не указано иное, эпитоп, локализованный во внеклеточном домене CD43, может означать полипептид, содержащий 6-9 следующих друг за другом аминокислот во внеклеточном домене CD43, имеющий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 131:
SEQ ID NO: 131: Pro Leu Trp Thr Ser Ile.
Эпитоп может быть локализован во внеклеточном домене белка CD43, однако не может экспонироваться во внешнее окружение в нормальном состоянии и может экспонироваться наружу, если клетка становится раковой клеткой или раковой стволовой клеткой. В связи с этим, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфично распознающие такой эпитоп и/или специфично связывающиеся с ним, могут оказывать специфично направленное действие на раковую клетку и/или раковую стволовую клетку и/или ингибировать ее.
Внеклеточный домен CD43, в котором локализован эпитоп, может представлять собой участок, состоящий из аминокислот, начиная от 73-ей до 81-ой, в CD43 (ААА51949.1; SEQ ID NO: 130) (SEQ ID NO: 134). Так, эпитопом может быть участок из 6-9 следующих друг за другом аминокислот, содержащий SEQ ID NO: 131 в SEQ ID NO: 134 CD43(AAA51949.1).
Эпитоп может иметь аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 131-134, и, например, может иметь аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 134:
SEQ ID NO: 132: Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile;
SEQ ID NO: 133: Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile;
SEQ ID NO: 134: Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile.
Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент могут представлять собой одну или более разновидностей, выбранных из группы, состоящей из всех антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые распознают вышеупомянутый эпитоп или специфично связываются с ним.
В данном описании термин «JL-1» используется для обозначения CD43 или вышеупомянутого эпитопа CD43.
В данном изобретении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть выбраны из группы, состоящей из антитела, имеющего происхождение из животного, химерного антитела, гуманизированного антитела и их антигенсвязывающих фрагментов. Антитело может быть получено рекомбинантным или синтетическим путем.
В том случае, когда антитело, полученное путем иммунизации животного желаемым антигеном, вводят человеку с терапевтической целью, обычно может иметь место иммунное отторжение. Чтобы ингибировать иммунное отторжение, было разработано химерное антитело. В этом химерном антителе константная область антитела, имеющего происхождение из животного, которая вызывает антиизотипическую реакцию, заменена на константную область человеческого антитела методом генной инженерии. Такое химерное антитело значительное лучше с точки зрения антиизотипической реакции по сравнению с антителом, имеющим происхождение из животного, но оно все еще обладает возможными побочными эффектами антиидиотипической реакции вследствие присутствия в вариабельной области аминокислот антитела животного происхождения. Гуманизированное антитело разработано для улучшения этих побочных эффектов. Его конструируют путем привития CDR (определяющего комплементарность участка), играющего важную роль для связывания антигена, в вариабельной области химерного антитела в каркасе на основе человеческого антитела.
Самым важным моментом для технологии привития CDR с целью конструирования гуманизированного антитела является выбор оптимизированного человеческого антитела, которое по меньшей мере может приобрести CDR антитела, имеющего происхождение из животного, и для этого используют привлечение базы данных по антителам, анализ кристаллической структуры, технологию молекулярного моделирования и так далее. Однако, применение дополнительной технологии конструирования антител для сохранения антигенсвязывающей способности представляется существенным, поскольку аминокислоты, составляющие каркас антитела, имеющего происхождение из животного, могут воздействовать на связывание с антигеном, несмотря на привитие CDR антитела, имеющего происхождение из животного, к оптимизированному каркасу на основе человеческого антитела, и поэтому имеется много случаев, когда не удалось сохранить антигенсвязывающей способности.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут быть выделены из живого организма (до иммунизации не присутствуют в живом организме) или могут иметь неприродное происхождение, например, могут быть получены синтетическим или рекомбинантным путем.
Использованный в данном описании термин «антитело» означает вещество, продуцируемое в иммунной системе в ответ на действие антигена, его вид особо не ограничен, и оно может быть получено природным или неприродным (например, синтетическим или рекомбинантным) путем. Антитело имеет преимущества в случае масштабной экспрессии и продуцирования, поскольку оно очень стабильно in vitro и in vivo и обладает длительным полупериодом своего существования. Кроме того, антитело имеет димерную структуру, и поэтому его авидность очень высока.
Антитело целиком имеет структуру, составленную из двух полноразмерных легких цепей и двух полноразмерных тяжелых цепей, и каждый раз легкая цепь соединена с тяжелой цепью дисульфидными связями. Константная область антитела подразделяется на константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи, и константная область тяжелой цепи имеет цепи гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) и эпсилон (ε) типов и имеет цепи гамма1 (γ1), гамма2 (γ2), гамма3 (γ3), гамма4 (γ4), альфа1 (α1) и альфа2 (α2) в качестве подклассов. Константная область легкой цепи имеет цепи каппа (κ) и лямбда (λ) типов.
Термин «тяжелая цепь» интерпретируется как включающий в себя все полноразмерные тяжелые цепи, содержащие домен вариабельной области VH, включая аминокислотную последовательность, содержащую последовательность вариабельной области, достаточную для придания специфичности антигену, 3 домена константной области CH1, CH2 и CH3 и шарнирную область и их фрагменты. При этом, термин «легкая цепь» интерпретируется как включающий в себя все полноразмерные легкие цепи, содержащие домен вариабельной области VL, включая аминокислотную последовательность, содержащую последовательность вариабельной области, достаточную для придания специфичности антигену, и домен константной области CL и их фрагменты.
Термин «CDR (определяющий комплементарность участок)» означает аминокислотную последовательность гипервариабельного участка тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина. Тяжелая цепь и легкая цепь могут содержать по 3 CDR, соответственно (CDRH1, CDRH2, CDRH3 и CDRL1, CDRL2, CDRL3). В CDR может присутствовать остаток, обуславливающий основной контакт при связывании CDR с антигеном или эпитопом. С другой стороны, использованный в данном описании термин «специфическое связывание» или «специфическое распознавание» означает одно и тоже, что является общеизвестным фактом для специалиста в данной области техники и означает, что антиген и антитело взаимодействуют специфично, и осуществляется иммунологическая реакция.
Термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к фрагменту в полной структуре иммуноглобулина и означает часть полипептида, содержащего ту часть, с которой может связываться антиген. Например, он может представлять собой scFv (одноцепочечный Fv), (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' или F(ab')2, но этим не ограничиваться.
Fab или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой структуру, содержащую вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи, константную область легкой цепи и первую константную область тяжелой цепи (CH1), и имеет 1 антигенсвязывающий сайт. Fab' отличается от Fab тем, что он имеет шарнирную область, содержащую один или более остатков цистеина на С-конце CH1-домена тяжелой цепи. В результате образования связи между остатками цистеина в шарнирной области антигенсвязывающего фрагмента получается F(ab')2 фрагмент антитела. Fv представляет собой минимальный фрагмент антитела, имеющий только вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, и рекомбинантная технология получения Fv фрагмента широко известна специалистам в данной области техники. В двухцепочечном Fv вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи соединены нековалентными связями, а в одноцепочечном Fv вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область одной легкой цепи соединены ковалентными связями, обычно через пептидный линкер, или соединены непосредственно по С-концу, таким образом он может образовывать такую же структуру, что и двухцепочечный Fv. Линкером может быть пептидный линкер, состоящий из 1-100 или 2-50 любых аминокислот, и соответствующие последовательности известны в данной области техники. Антигенсвязывающий фрагмент может быть получен с использованием протеиназы (например, если целое антитело специфически расщепляется под действием папаина, то может быть получен Fab, а в случае расщепления под действием пепсина может быть получен F(ab')2 фрагмент) и может быть сконструирован с использованием технологии генетической рекомбинации.
Термин «шарнирная область» относится к участку тяжелой цепи антитела, который находится между СН1 и СН2 участками и обозначает участок, функция которого заключается в придании гибкости антигенсвязывающему фрагменту в антителе. Например, такой шарнир может иметь происхождение из человеческого антитела и, конкретно, может иметь происхождение из IgA, IgE или IgG, например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
Антитело к CD43 может представлять собой поликлональное антитело или моноклональное антитело и, например, может представлять собой моноклональное антитело. Моноклональное антитело может быть получено методом, широко известным в данной области техники. Например, оно может быть получено с использованием метода фагового дисплея.
С другой стороны, можно провести скрининг отдельных моноклональных антител, используя типичный формат ELISA (иммуноферментный твердофазный анализ), основанный на способности связываться с CD43. Ингибирующую активность можно протестировать с использованием функциональных анализов для определения молекулярного взаимодействия ансамбля, таких как конкурентный ELISA, клеточный анализ, анализ Скетчарда или поверхностный плазмонный резонанс и так далее. Затем, с учетом сильной ингибирующей активности, можно протестировать аффинность к CD43 (значения Kd (константа диссоциации)) для каждого из выбранных моноклональных антител.
Например, антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент может иметь аффинность связывания (Kd; например, измеренную в анализе Скетчарда) с CD43 (например, с CD43 человека, CD43 мыши и так далее) или эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, составляющую 1 мМ или меньше, 100 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 5 нМ или меньше либо 3 нМ или меньше, например, от 1 пМ до 1 мМ, от 1 пМ до 100 нМ, от 1 пМ до 10 нМ, от 1 пМ до 5 нМ, от 1 пМ до 3 нМ, от 10 пМ до 1 мМ, от 10 пМ до 100 нМ, от 10 пМ до 10 нМ, от 10 пМ до 5 нМ, от 10 пМ до 3 нМ, от 100 пМ до 1 мМ, от 100 пМ до 100 нМ, от 100 пМ до 10 нМ, от 100 пМ до 5 нМ, от 100 пМ до 3 нМ, от 1 нМ до 1 мМ, от 1 нМ до 100 нМ, от 1 нМ до 10 нМ, от 1 нМ до 5 нМ или от 1 нМ до 3 нМ.
В другом воплощении предложена гибридомная клеточная линия, продуцирующая моноклональное антитело к CD43. Гибридомной клеточной линией может быть клеточная линия H-JL1 с номером доступа KCLRF-BP-00010.
Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть применены вместе с одним или более выбранными из группы, состоящей из цитотоксических веществ и так далее.
Таким образом, фармацевтическая композиция может дополнительно содержать одно или более выбранных из группы, состоящей из цитотоксических веществ и так далее, в дополнение к антителу к CD43 или его антигенсвязывающему фрагменту. Кроме того, способ лечения и/или ингибирования может дополнительно включать стадию введения одного или более выбранных из группы, состоящей из цитотоксических веществ и так далее, в дополнение к стадии введения антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента.
Конкретно, согласно другому воплощению настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения солидного рака, содержащая (1) антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, и (2) одно или более выбранных из группы, состоящей из цитотоксических веществ и так далее, в качестве активного ингредиента.
В другом воплощении предложен способ лечения солидного рака, включающий (1) стадию введения фармацевтически эффективного количества антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, субъекту, нуждающемуся в лечении солидного рака, и (2) стадию введения фармацевтически эффективного количества одного или более выбранных из группы, состоящей из цитотоксических веществ и так далее, субъекту, нуждающемуся в лечении солидного рака.
В другом воплощении предложена фармацевтическая композиция для ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, содержащая (1) антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, и (2) одно или более выбранных из группы, состоящей из цитотоксических веществ и так далее, в качестве активного ингредиента.
В другом воплощении предложена фармацевтическая композиция для ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, включающего (1) стадию введения фармацевтически эффективного количества антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, раковому пациенту, например, пациенту с диагнозом солидного рака, и (2) стадию введения фармацевтически эффективного количества одного или более выбранных из группы, состоящей из цитотоксических веществ и так далее, раковому пациенту, например, пациенту с диагнозом солидного рака.
Что касается фармацевтической композиции, то на основе антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента и одного или более выбранных из группы, состоящей из цитотоксических веществ и так далее, может быть изготовлена единая композиция путем конъюгирования всех друг с другом или смешивания, либо могут быть изготовлены отдельные композиции, соответственно, и смешаны. Что касается способа, то стадии введения антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента и одного или более выбранных из группы, состоящей из цитотоксических веществ и так далее, могут быть выполнены одновременно или в любом порядке.
Цитотоксические вещества могут представлять собой все такие вещества, которые обладают токсичностью к раковой клетке, в особенности, клетке солидного рака, и могут представлять собой одно или более выбранных из группы, состоящей из радиоактивного изотопа, цитотоксического соединения (низкомолекулярного), цитотоксического белка, противоракового средства и так далее, но этим не ограничиваться. Цитотоксический белок может представлять собой один или более выбранных из группы, состоящей из рицина, сапорина, гелонина, момордина, дебуганина, дифтерийного токсина, псевдомонадного токсина и так далее, но этим не ограничиваться. Радиоактивный изотоп может представлять собой один или более выбранных из группы, состоящей из 131I, 188Rh, 90Y и так далее, но этим не ограничиваться. Цитотоксическое соединение может представлять собой одно или более, выбранных из группы, состоящей из дуокармицина, монометилауристатина Е (ММАЕ), монометилауристатина F (MMAF), N2'-дезацетил-N2'-(3-меркапто-1-оксопропил)майтанзина (DM1), димера PBD (пирролобензодиазепин) и так далее, но этим не ограничиваться.
Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент и одно или более выбранных из группы, состоящей из цитотоксических веществ и так далее, могут быть использованы в форме конъюгата или слитого белка (в случае, когда цитотоксическое вещество и/или маркерное вещество представляют собой белки), в соединенном друг с другом виде (например, посредством ковалентной связи, пептидной связи и так далее). Конъюгирование антитела (или антигенсвязывающего фрагмента) и цитотоксического вещества может быть осуществлено в соответствии с технологией, хорошо известной в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.
Активный ингредиент (антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, и/или цитотоксическое вещество, и/или маркерное вещество) можно применять (вводить) вместе с фармацевтически приемлемым носителем, и такой фармацевтически приемлемый носитель обычно используется для приготовления лекарственного средства и может представлять собой один или более выбранных из группы, состоящей из лактозы, декстрозы, сахарозы, сорбита, маннита, крахмала, гуммиарабика, фосфата кальция, альгината, желатина, силиката кальция, микрокристаллической целлюлозы, поливинилпирролидона, целлюлозы, воды, сиропа, метилцеллюлозы, метилгидроксибензоата, пропилгидроксибензоата, талька, стеарата магния, минерального масла и так далее, но этим не ограничиваться. Вместе с антителом к CD43 могут быть быть дополнительно включены один или более выбранных из группы, состоящей из разбавителя, эксципиента, смазывающего вещества, смачивающего агента, подсластителя, корригента, эмульгирующего агента, суспендирующего агента, консерванта и так далее, обычно используемых для приготовления фармацевтической композиции с другими, нежели эти, компонентами.
Активный ингредиент или фармацевтическую композицию можно вводить перорально или парентерально. В случае парентерального введения их можно вводить посредством внутривенной инъекции, подкожной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, эндодермального введения, местного введения, интраназального введения, внутрилегочного введения или интраректального введения и так далее. В случае перорального введения пероральные композиции должны иметь покрытие или должны быть приготовлены такими, чтобы активное лекарственное средство было защищено от деградации в желудке, поскольку белок или пептид подвержены расщеплению. Помимо этого, антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент можно вводить посредством любого устройства, с помощью которого активное вещество может быть доставлено к клетке-мишени.
Использованный в данном описании термин «фармацевтически эффективное количество» означает количество лекарственного средства, достаточное для проявления фармацевтически значимого эффекта. Фармацевтически эффективное количество активных ингредиентов для разовой дозы может быть различным в зависимости от таких факторов, как способ приготовления композиции, введение, возраст, масса тела, пол, заболеваемость пациента, питание, продолжительность введения, интервал введения, путь введения, скорость экскреции и восприимчивость. Например, фармацевтически эффективное количество активных ингредиентов (например, антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента) для разовой дозы может находиться в диапазоне 0,001-100 мг/кг или 0,02-10 мг/кг, но этим не ограничиваться. Фармацевтически эффективное количество как разовую дозу можно приготовить в виде одной композиции в стандартной лекарственной форме, приготовить в надлежащих количествах или приготовить путем внесения в многодозовый контейнер.
Солидный рак может означать любое негематологическое злокачественное заболевание, отличающееся от гематологического злокачественного заболевания. Например, солидный рак может представлять собой рак одного или более видов, выбранных из группы, состоящей из рака легкого (например, плоскоклеточной карциномы, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, аденокарциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого), перитонеального рака, рака кожи, меланомы кожи или глазного яблока, рака прямой кишки, раковой опухоли возле анального отверстия, рака пищевода, рака тонкой кишки, рака эндокринных желез, рака паращитовидной железы, рака надпочечников, саркомы мягких тканей, рака уретры, рака желудочно-кишечного тракта, рака желудка, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака шейки матки, рака яичника, рака печени, рака желчного пузыря, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака толстого кишечника, рака матки, рака эндометрия, рака шейки матки, рака слюнных желез, рака почки, рака предстательной железы, рака вульвы, рака щитовидной железы, рака головы и шеи, рака головного мозга, остеосаркомы и так далее, но этим не ограничиваться. Например, солидный рак может представлять собой рак желудка, рак молочной железы, рак легкого, рак толстого кишечника, рак печени, рак желчного пузыря, рак почки, рак поджелудочной железы, рак щитовидной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак предстательной железы или рак мочевого пузыря. Такой рак включает не только первичный рак, но также метастазирующий рак. Кроме того, солидный рак может представлять собой рак, обладающий устойчивостью к традиционным противораковым средствам (например, низкомолекулярному противораковому средству (противораковому химическому средству), антиметаболиту, алкилирующему агенту, антибиотикам, алкалоиду барвинка, ферменту, гормону, терапевтическому агенту с направленным действием и/или терапевтическому агенту на основе антител и так далее), и может представлять собой рак, рецидивирующий после лечения традиционными противораковыми средствами (например, низкомолекулярным противораковым средством (противораковым химическим средством), антиметаболитом, алкилирующим агентом, антибиотиком, алкалоидом барвинка, ферментом, гормоном, терапевтическим агентом с направленным действием и/или терапевтическим агентом на основе антител и так далее).
Лечебный эффект в отношении солидного рака включает не только ингибирование роста (уменьшение количества) и апоптоз раковых клеток (в частности, раковых стволовых клеток) или пораженной раком ткани, содержащей такие клетки, но также ингибирующий эффект в отношении ухудшения ракового заболевания путем ингибирования миграции, инвазии, метастазирования и так далее.
Использованный в данном описании термин «ингибирование раковой стволовой клетки» означает все варианты количественного и/или функционального ингибирования раковой стволовой клетки, такие как ингибирование роста (уменьшение количества), апоптоз и так далее, и/или излечение от рака и/или улучшение течения рака, в который вовлечены раковые стволовые клетки.
Использованный в данном описании термин «пациент» означает пациента, нуждающегося в лечении рака (например, солидного рака или гематологического злокачественного заболевания) и/или в ингибировании раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, и может относиться ко всем млекопитающим, например, человеку, и может относиться к пациенту, страдающему от рака, имеющему симптомы рака или с риском развития рака, либо к клеткам, тканям, жидкостям организма или выделенным из них культивируемым смесям.
В другом воплощении предложен конъюгат, в состав которого входят антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, и раковая стволовая клетка, например, раковая стволовая клетка при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, при этом антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с раковой стволовой клеткой. В другом воплощении предложен способ получения конъюгата, в состав которого входят антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, и раковая стволовая клетка, например, раковая стволовая клетка при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, при этом антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с раковой стволовой клеткой, включающий стадию приведения в контакт антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, с образцом раковой опухоли, например, образцом солидной раковой опухоли, или введения его раковому пациенту, такому как пациент с диагнозом солидного рака. Данный способ может быть осуществлен in vivo или in vitro. Конъюгат или способ его получения можно использовать для различных клинических, диагностических и/или экспериментальных задач, а также для лечения солидного рака. Например, его можно использовать для подтверждения присутствия раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, и/или для визуализации раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, путем детектирования того, образуется ли такой комплекс в случае, когда антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент контактируют с образцом раковой опухоли. Далее, антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент могут дополнительно содержать маркерное вещество. Это маркерное вещество может представлять собой одно или более выбранных из группы, состоящей из радиоактивного изотопа, флуоресцентного вещества, хромогена, красителя и так далее. Флуоресцентным веществом могут быть все наиболее распространенные флуоресцентные вещества и, например, могут быть одно или более выбранных из группы, состоящей из флуоресцеинизотиоцианата (FITC), фикоэритрина (РЕ), аллофикоцианина (АРС) или биотина, но этим не ограничиваются. Маркерное вещество может быть объединено (связано) с антителом или антигенсвязывающим фрагментом общепринятыми методами (например, посредством химических связей, таких как ковалентная связь, координационная связь, ионная связь и так далее). Объединение антитела (или антигенсвязывающего фрагмента) и маркерного вещества может быть осуществлено в соответствии с технологией, хорошо известной в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.
Образец раковой опухоли может представлять собой линию раковых клеток или раковую клетку, ткань, жидкость организма и так далее, выделенную из ракового пациента или культивируемую искусственным путем. Образец солидной раковой опухоли может представлять собой линию клеток или клетку солидного рака, ткань, жидкость организма и так далее, выделенную из пациента с диагнозом солидного рака или культивируемую искусственным путем.
В другом воплощении предложено применение в качестве маркера для обнаружения раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, CD43, конкретно эпитопа, локализованного во внеклеточном домене CD43. Конкретно, в одном из воплощений предложена композиция для обнаружения раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, содержащая вещество, взаимодействующее с CD43, конкретно с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43. В другом воплощении предложен способ обнаружения раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, включающий стадию приведения в контакт вещества, взаимодействующего с CD43, конкретно с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, и стадию определения факта взаимодействия CD43, конкретно эпитопа, локализованного во внеклеточном домене CD43, с данным веществом, или степени этого взаимодействия. В этом случае, когда имеет место взаимодействие между CD43, конкретно эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, и данным веществом или его уровень оказывается высоким, может быть вынесено решение (определено), что клеточный образец содержит раковую стволовую клетку, например, раковую стволовую клетку при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке. Взаимодействующее вещество может представлять собой одно или более выбранных из группы, состоящей из всех веществ, которые могут взаимодействовать с CD43, конкретно с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, например, представлять собой химическое вещество (низкомолекулярное химическое вещество), антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела, аптамер и так далее. Факт наличия взаимодействия может быть определен общими методами анализа белков с использованием взаимодействующего вещества, например, методом иммунохроматографии, иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA), радиоиммуноанализа (RIA), иммуноферментного анализа (EIA), иммунофлуоресцентного анализа (FIA), иммунолюминесцентного анализа (LIA), вестерн-блоттинга, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), проточной цитометрии, с применением микрочипов и так далее, но этим не ограничиваться. Образец клеток может представлять собой клетку, ткань или их культивируемую смесь, выделенную из млекопитающих, например, человека, и, например, может представлять собой раковую клетку, пораженную раком ткань или их культивируемую смесь, выделенную из ракового пациента, например, пациента с диагнозом солидного рака.
В другом воплощении предложено применение эпитопа, локализованного во внеклеточном домене CD43, для скрининга средств для лечения солидного рака.
В другом воплощении предложен агент для скрининга агентов для лечения солидного рака, содержащий эпитоп, локализованный во внеклеточном домене CD43.
В другом воплощении предложен способ скрининга агентов для лечения солидного рака, включающий стадию приведения в контакт соединения-кандидата с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, и стадию отбора соединения-кандидата, связывающегося с этим эпитопом, с целью определения его в качестве кандидата для лечения солидного рака.
Терапевтический агент для лечения солидного рака, обнаруженный в результате проведенного выше скрининга, может характеризоваться проявлением эффекта ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке.
Так, в другом воплощении предложено применение эпитопа, локализованного во внеклеточном домене CD43, для скрининга агента для ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке.
В другом воплощении в качестве агента для скрининга агента для ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, предложен эпитоп, локализованный во внеклеточном домене CD43.
В другом воплощении предложен способ скрининга агента для ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, включающий стадию приведения в контакт соединения-кандидата с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43, и стадию отбора соединения-кандидата, связывающегося с этим эпитопом, с целью определения его в качестве агента-кандидата для ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке.
Соединение-кандидат, связывающееся с эпитопом, может иметь аффинность связывания с эпитопом (Kd; например, измеренную в анализе Скетчарда), составляющую 1 мМ или меньше, 100 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 5 нМ или меньше либо 3 нМ или меньше, например, от 1 пМ до 1 мМ, от 1 пМ до 100 нМ, от 1 пМ до 10 нМ, от 1 пМ до 5 нМ, от 1 пМ до 3 нМ, от 10 пМ до 1 мМ, от 10 пМ до 100 нМ, от 10 пМ до 10 нМ, от 10 пМ до 5 нМ, от 10 пМ до 3 нМ, от 100 пМ до 1 мМ, от 100 пМ до 100 нМ, от 100 пМ до 10 нМ, от 100 пМ до 5 нМ, от 100 пМ до 3 нМ, от 1 нМ до 1 мМ, от 1 нМ до 100 нМ, от 1 нМ до 10 нМ, от 1 нМ до 5 нМ или от 1 нМ до 3 нМ.
Эпитоп является таким, как указано выше, и может иметь аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 131-134. Такой эпитоп может быть представлен в составе целого белка CD43 или части, содержащей эпитоп, или может быть синтезирован химическим путем или получен рекомбинантным путем.
Соединение-кандидат может быть искусственно синтезированным или может представлять собой одно или более выбранных из группы, состоящей из природных различных разновидностей соединений, полипептида, олигопептида, пептидной структуры или белковой структуры (например, антитела, антигенсвязывающего фрагмента антитела, пептид-ассоциированного антитела, нанотела и так далее), полинуклеотида, олигонуклеотида, антисмысловой рибонуклеиновой кислоты (РНК), мшРНК (малая шпилечная РНК), миРНК (малая интерферирующая РНК), аптамера, природного экстракта и так далее.
Сочетание соединения-кандидата и эпитопа может быть выполнено с подтверждением образования комплекса соединения-кандидата и эпитопа, и это может быть осуществлено различными методами, общепризнанными в данной области техники. Например, это можно оценить посредством детекции с использованием обычной ферментативной реакции, флуоресценции, люминесценции и/или излучения и, конкретно, можно оценить методом, выбранным из группы, состоящей из иммунохроматографии, иммуногистохимии, иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA), радиоиммуноанализа (RIA), иммуноферментного анализа (EIA), иммунофлуоресцентного анализа (FIA), иммунолюминесцентного анализа (LIA), вестерн-блоттинга и так далее, но этим не ограничиваться.
В одном из воплощений агент для лечения солидного рака или агент для ингибирования раковой стволовой клетки, обнаруженный в результате проведенного выше скрининга, может представлять собой один или более выбранных из группы, состоящей из антитела, антигенсвязывающего фрагмента антитела, антителоподобной белковой структуры (например, пептид-ассоциированного антитела, нанотела) и так далее.
В другом воплощении предложена фармацевтическая композиция для лечения солидного рака, содержащая агент для лечения солидного рака, обнаруженный в результате проведенного выше скрининга. В другом воплощении предложен способ лечения солидного рака, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества обнаруженного в результате скрининга агента для лечения солидного рака пациенту, нуждающемуся в лечении солидного рака. В одном из воплощений солидный рак может представлять собой рак желудка.
В другом воплощении предложена фармацевтическая композиция для ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, содержащая агент для ингибирования раковой стволовой клетки, обнаруженный в результате проведенного выше скрининга. В другом воплощении предложен способ ингибирования раковой стволовой клетки, например, раковой стволовой клетки при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества агента для ингибирования раковой стволовой клетки, указанного выше, раковому пациенту, например, пациенту с диагнозом солидного рака. В одном из воплощений солидный рак может представлять собой рак желудка.
В другом воплощении предложены новое антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент может связываться с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене CD43. Эпитоп может представлять собой полипептид, содержащий 6-9 следующих друг за другом аминокислот во внеклеточном домене CD43, имеющий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 131.
Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL). Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой антитело, имеющее происхождение из животного (например, мышиное антитело), химерное антитело или гуманизированное антитело, и может представлять собой моноклональное антитело или поликлональное антитело, и может быть получено неприродным путем (например, посредством химического или биологического синтеза, рекомбинантного метода и так далее).
Вариабельная область тяжелой цепи может содержать первый определяющий комплементарность участок (CDR) (CDR1H), второй CDR (CDR2H) и третий CDR (CDR3H) в порядке расположения от N-конца к С-концу.
В одном из воплощений антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать CDR1H, включающий аминокислотную последовательность GYX1MN (SEQ ID NO: 110; X1 может быть выбран из всех аминокислот и, например, может представлять собой F или Y) (например, GYFMN (SEQ ID NO: 111) или GYYMN (SEQ ID NO: 112)), CDR2H, включающий аминокислотную последовательность RINPNX2GDSFYNQKFX3G (SEQ ID NO: 113; Х2 и Х3 могут быть выбраны из всех аминокислот, соответственно, и, например, Х2 может представлять собой N или S, а Х3 может представлять собой Q или K) (например, RINPNNGDSFYNQKFQG (SEQ ID NO: 114), RINPNSGDSFYNQKFQG (SEQ ID NO: 115), RINPNNGDSFYNQKFKG (SEQ ID NO: 116) или RINPNSGDSFYNQKFKG (SEQ ID NO: 117)), и CDR3H, включающий аминокислотную последовательность EGYYGGRGYALDY (SEQ ID NO: 118), в качестве существенного компонента вариабельной области тяжелой цепи.
Вариабельная область тяжелой цепи может дополнительно содержать каркас иммуноглобулина на N-конце и/или С-конце вышеупомянутых определяющих комплементарность участков (CDR). Более конкретно, вариабельная область тяжелой цепи может содержать первый каркас (FR1H), первый определяющий комплементарность участок (CDR) (CDR1H), второй каркас (FR2H), второй CDR (CDR2H), третий каркас (FR3H), третий CDR (CDR3H) и четвертый каркас (FR4H) в порядке расположения от N-конца к С-концу.
В одном конкретном воплощении антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент является гуманизированным и
(1) FR1H может содержать последовательность аминокислот от №1 до №30 в одной из последовательностей с номерами от SEQ ID NO: 83 до SEQ ID NO: 94 или аминокислотную последовательность, имеющую 95% или больше, 96% или больше, 97% или больше, 98% или больше, 99% или больше, 99,1% или больше, 99,2% или больше, 99,3% или больше, 99,4% или больше, 99,5% или больше, 99,6% или больше, 99,7% или больше, 99,8% или больше, 99,9% или больше гомологии последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной выше;
(2) CDR1H может содержать аминокислотную последовательность GYX1MN (SEQ ID NO: 110; X1 может быть выбран из всех аминокислот и, например, может представлять собой F или Y) и, например, может содержать аминокислотную последовательность GYFMN (SEQ ID NO: 111) или GYYMN (SEQ ID NO: 112);
(3) FR2H может содержать последовательность аминокислот от №36 до №49 в одной из последовательностей с номерами от SEQ ID NO: 83 до SEQ ID NO: 94 или аминокислотную последовательность, имеющую 95% или больше, 96% или больше, 97% или больше, 98% или больше, 99% или больше, 99,1% или больше, 99,2% или больше, 99,3% или больше, 99,4% или больше, 99,5% или больше, 99,6% или больше, 99,7% или больше, 99,8% или больше, 99,9% или больше гомологии последовательности с указанной выше аминокислотной последовательностью;
(4) CDR2H может содержать аминокислотную последовательность RINPNX2GDSFYNQKFX3G (SEQ ID NO: 113; каждый из Х2 и Х3 может быть независимо выбран из всех аминокислот и, например, Х2 может представлять собой N или S, Х3 может представлять собой Q или K) и, например, может содержать аминокислотную последовательность RINPNNGDSFYNQKFQG (SEQ ID NO: 114), RINPNSGDSFYNQKFQG (SEQ ID NO: 115), RINPNNGDSFYNQKFKG (SEQ ID NO: 116) или RINPNSGDSFYNQKFKG (SEQ ID NO: 117);
(5) FR3H может содержать последовательность аминокислот от №67 до №98 в одной из последовательностей с номерами от SEQ ID NO: 83 до SEQ ID NO: 94 или аминокислотную последовательность, имеющую 95% или больше, 96% или больше, 97% или больше, 98% или больше, 99% или больше, 99,1% или больше, 99,2% или больше, 99,3% или больше, 99,4% или больше, 99,5% или больше, 99,6% или больше, 99,7% или больше, 99,8% или больше, 99,9% или больше гомологии последовательности с указанной выше аминокислотной последовательностью;
(6) CDR3H может содержать аминокислотную последовательность EGYYGGRGYALDY (SEQ ID NO: 118);
(7) FR4H может содержать последовательность аминокислот от №112 до №122 в одной из последовательностей с номерами от SEQ ID NO: 83 до SEQ ID NO: 94 или аминокислотную последовательность, имеющую 95% или больше, 96% или больше, 97% или больше, 98% или больше, 99% или больше, 99,1% или больше, 99,2% или больше, 99,3% или больше, 99,4% или больше, 99,5% или больше, 99,6% или больше, 99,7% или больше, 99,8% или больше, 99,9% или больше гомологии последовательности с указанной аминокислотной последовательностью.
Вариабельная область легкой цепи может содержать первый CDR (CDR1L), второй CDR (CDR2L) и третий CDR (CDR3L) в порядке расположения от N-конца к С-концу.
В одном из воплощений антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать CDR1L, включающий аминокислотную последовательность RTSQDISNYLN (SEQ ID NO: 119); CDR2L, включающий аминокислотную последовательность X4TX5RLHS (SEQ ID NO: 120; Х4 и Х5 может быть выбран из всех аминокислот, соответственно, и, например, Х4 может представлять собой N, Q или А, а Х5 может представлять собой S или А) (например, NTSRLHS (SEQ ID NO: 121, NTARLHS (SEQ ID NO: 122), QTSRLHS (SEQ ID NO: 123) или ATSRLHS (SEQ ID NO: 124)); и CDR3L, включающий аминокислотную последовательность QQSNMFPY (SEQ ID NO: 125), в качестве существенного компонента вариабельной области легкой цепи.
Вариабельная область легкой цепи может дополнительно содержать каркас иммуноглобулина на N-конце и/или С-конце вышеупомянутых определяющих комплементарность участков (CDR). Более конкретно, вариабельная область легкой цепи может содержать первый каркас (FR1L), первый определяющий комплементарность участок (CDR) (CDR1L), второй каркас (FR2L), второй CDR (CDR2L), третий каркас (FR3L), третий CDR (CDR3L) и четвертый каркас (FR4L) в порядке от N-конца к С-концу.
В одном конкретном воплощении
(8) FR1L может содержать последовательность аминокислот от №1 до №23 в одной из последовательностей с номерами от SEQ ID NO: 95 до SEQ ID NO: 109 или аминокислотную последовательность, имеющую 95% или больше, 96% или больше, 97% или больше, 98% или больше, 99% или больше, 99,1% или больше, 99,2% или больше, 99,3% или больше, 99,4% или больше, 99,5% или больше, 99,6% или больше, 99,7% или больше, 99,8% или больше, 99,9% или больше гомологии последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной выше;
(9) CDR1L может содержать аминокислотную последовательность RTSQDISNYLN (SEQ ID NO: 119);
(10) FR2L может содержать последовательность аминокислот от №35 до №49 в одной из последовательностей с номерами от SEQ ID NO: 95 до SEQ ID NO: 109 или аминокислотную последовательность, имеющую 95% или больше, 96% или больше, 97% или больше, 98% или больше, 99% или больше, 99,1% или больше, 99,2% или больше, 99,3% или больше, 99,4% или больше, 99,5% или больше, 99,6% или больше, 99,7% или больше, 99,8% или больше, 99,9% или больше гомологии последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной выше;
(11) CDR2L может содержать аминокислотную последовательность X4TX5RLHS (SEQ ID NO: 120; каждый из Х4 и Х5 может быть независимо выбран из всех аминокислот, и, например, Х4 может представлять собой N, Q или А, а Х5 может представлять собой S или А) и, например, может содержать NTSRLHS (SEQ ID NO: 121, NTARLHS (SEQ ID NO: 122), QTSRLHS (SEQ ID NO: 123) или ATSRLHS ((SEQ ID NO: 124);
(12) FR3L может содержать последовательность аминокислот от №57 до №88 в одной из последовательностей с номерами от SEQ ID NO: 95 до SEQ ID NO: 109 или аминокислотную последовательность, имеющую 95% или больше, 96% или больше, 97% или больше, 98% или больше, 99% или больше, 99,1% или больше, 99,2% или больше, 99,3% или больше, 99,4% или больше, 99,5% или больше, 99,6% или больше, 99,7% или больше, 99,8% или больше, 99,9% или больше гомологии последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной выше;
(13) CDR3L может содержать аминокислотную последовательность QQSNMFPY (SEQ ID NO: 125);
(14) FR4L может содержать последовательность аминокислот от №97 до №108 в одной из последовательностей с номерами от SEQ ID NO: 95 до SEQ ID NO: 109 или аминокислотную последовательность, имеющую 95% или больше, 96% или больше, 97% или больше, 98% или больше, 99% или больше, 99,1% или больше, 99,2% или больше, 99,3% или больше, 99,4% или больше, 99,5% или больше, 99,6% или больше, 99,7% или больше, 99,8% или больше, 99,9% или больше гомологии последовательности с указанной выше аминокислотной последовательностью.
В одном из воплощений антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. Вариабельная область тяжелой цепи может содержать аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 или 94. Вариабельная область легкой цепи может содержать аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 или 109.
Например, антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть гуманизированными и могут быть проиллюстрированы как содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, определенные как указано ниже:
(а) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 83, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 95;
(б) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 84, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 96;
(в) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 85, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 97;
(г) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 86, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 98;
(д) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 87, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 99;
(е) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 88, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 100;
(ж) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 89, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 101;
(з) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 90, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 102;
(и) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 91, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 103;
(к) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 93, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 103;
(л) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 94, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 106;
(м) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 91, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 97;
(н) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 85, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 103;
(о) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 93, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 107;
(п) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 93, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 108; или
(р) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 93, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 109.
В одном из конкретных воплощений аминокислотная последовательность каркаса, содержащегося в гуманизированном антителе к CD43 или его антигенсвязывающем фрагменте, может быть проиллюстрирована как показано ниже, но этим не ограничивается:
(1) FR1H может содержать аминокислотные остатки от №1 до №30 в одной из SEQ ID NO: 83-94;
(2) FR2H может содержать аминокислотные остатки от №36 до №49 в одной из SEQ ID NO: 83-94;
(3) FR3H может содержать аминокислотные остатки от №67 до №98 в одной из SEQ ID NO: 83-94;
(4) FR4H может содержать аминокислотные остатки от №112 до №122 в одной из SEQ ID NO: 83-94;
(5) FR1L может содержать аминокислотные остатки от №1 до №23 в одной из SEQ ID NO: 95-109;
(6) FR2L может содержать аминокислотные остатки от №35 до №49 в одной из SEQ ID NO: 95-109;
(7) FR3L может содержать аминокислотные остатки от №57 до №88 в одной из SEQ ID NO: 95-109;
(8) FR4L может содержать аминокислотные остатки от №97 до №108 в одной из SEQ ID NO: 95-109.
В другом примере антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент может дополнительно содержать константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека и/или константную область легкой цепи иммуноглобулина человека, происходящие из иммуноглобулина человека. Иммуноглобулин человека может быть выбран из группы, состоящей из IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM и так далее. Например, константная область тяжелой цепи иммуноглобулина человека может содержать аминокислотную последовательность с №№ остатков 123-452 в SEQ ID NO: 40 или аминокислотную последовательность, имеющую 95% или больше, 96% или больше, 97% или больше, 98% или больше, 99% или больше, 99,1% или больше, 99,2% или больше, 99,3% или больше, 99,4% или больше, 99,5% или больше, 99,6% или больше, 99,7% или больше, 99,8% или больше, 99,9% или больше гомологии последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной выше; и константная область легкой цепи иммуноглобулина человека может содержать аминокислотную последовательность с №№ остатков 108-214 в SEQ ID NO: 48 или аминокислотную последовательность, имеющую 95% или больше, 96% или больше, 97% или больше, 98% или больше, 99% или больше, 99,1% или больше, 99,2% или больше, 99,3% или больше, 99,4% или больше, 99,5% или больше, 99,6% или больше, 99,7% или больше, 99,8% или больше, 99,9% или больше гомологии последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной выше.
В другом воплощении антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент может характеризоваться тем, что входящие в его состав аминокислотные остатки не являются гликозилированными. Для этого случая, когда в антителе, в частности, вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи имеется мотив гликозилирования, например, мотив N-гликозилирования (например, «N-X-S/T» (X может представлять собой все аминокислотные остатки)), этот мотив может быть модифицирован. Например, когда мотив N-гликозилирования представляет собой «N-X-S/T» (X может представлять собой все аминокислотные остатки), «N», «S/Т» или оба из них в таком мотиве могут быть заменены на аминокислоту, отличающуюся от первоначальных, соответственно. В одном из воплощений негликозилированное антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать NTARLHS (SEQ ID NO: 122), QTSRLHS (SEQ ID NO: 123) или ATSRLHS (SEQ ID NO: 124) в качестве CDR2L. Что касается другого воплощения, то негликозилированное антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 107, 108 или 109 в качестве вариабельной области легкой цепи.
Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связываются с вышеупомянутым специфическим эпитопом CD43 и могут быть выбраны из группы, состоящей из антитела животного происхождения (например, мышиного антитела), химерного антитела, гуманизированного антитела и их антигенсвязывающих фрагментов. Антитело животного происхождения может иметь происхождение из вида животного, отличающегося от человека, и, например, может происходить из крысы, мыши, козы, морской свинки, осла, кролика, лошади, ламы, верблюда, птиц (например, цыпленка, утки и так далее) и других, но этим не ограничиваться. Метод конструирования химерного антитела и/или гуманизированного антитела из антитела животного происхождения хорошо известен в данной области техники. Гуманизированным антителом могут быть IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, IgE или антитело любого соответствующего изотипа, например, любого подкласса.
В данном описании специфичность связывания антитела с CD43 может означать то, что антитело обладает более высокой аффинностью в отношении CD43, нежели пептида, не являющегося CD43, или обладает более высокой аффинностью в отношении вышеупомянутого эпитопа CD43 по сравнению с другим участком CD43 или другим внеклеточным участком.
Связывание антитела с антигеном (более конкретно, эпитопом) (связывание антиген-антитело) можно оценить всеми методами, известными в данной области техники. Например, связывание антиген-антитело можно оценить с использованием одного или более методов, выбранных из группы, состоящей из ELISA, проточной цитометрии, иммунохимического окрашивания, метода BIAcore с применением оптического биосенсора и так далее, но этим не ограничиваются.
Термин «антигенсвязывающий фрагмент», использованный в данном описании, означает часть (фрагмент) антитела, обладающую способностью специфично распознавать антиген (CD43) или вышеупомянутый эпитоп CD43 и/или специфично связываться с ним. Например, антигенсвязывающий фрагмент может быть выбран из группы, состоящей из фрагментов Fab, F(ab)2, Fv, scFv, scFv-Fc и т.д.
В одном из воплощений эпитоп, распознаваемый антителом к CD43, может представлять собой эпитоп, распознаваемый scFv антитела к CD43. Фрагмент scFv антитела к CD43 может содержать вышеупомянутый CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 или содержать вышеупомянутые вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи.
Что касается scFv антитела к CD43, то вышеупомянутые вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи могут быть соединены посредством соответствующего линкера. Линкером может быть пептидный линкер, состоящий из 1-100 или 2-50 любых аминокислот, и соответствующие последовательности известны в данной области техники. В одном из воплощений пептидный линкер может быть представлен в виде GGGX6S (Х6 представляет собой G или A; SEQ ID NO: 126) или (GGGX6S)n (n представляет собой целое число от 1 до 5, и Х6 включенный в каждую повторяющуюся единицу независимо представляет собой G или А) и, например, может содержать аминокислотную последовательность GGGASGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 127) или GGGGSGGGGSGGGAS (SEQ ID NO: 128), но этим не ограничиваться.
В одном из воплощений scFv антитела к CD43 может содержать аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 50, 52, 54, 56 или 58, но этим не ограничиваться.
В одном из воплощений антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент могут проявлять цитотоксичность в отношении клетки-мишени в результате конъюгирования с цитотоксическим веществом, которое может вызывать гибель клеток (например, включая программируемую клеточную смерть, такую как апоптоз). Цитотоксическое вещество может представлять собой одно или более веществ, выбранных из группы, состоящей из всех соединений (низкомолекулярного соединения; противоракового средства и так далее), белка, пептида, олигонуклеотида, полинуклеотида и так далее, которые, как известно в данной области техники, проявляют токсичность в отношении клеток, в частности, раковых клеток, и, например, может представлять собой одно или более выбранных из группы, состоящей из радиоактивного изотопа, цитотоксического соединения (низкомолекулярного), цитотоксического белка, противоракового средства и так далее. Цитотоксический белок может представлять собой один или более выбранных из группы, состоящей из рицина, сапорина, гелонина, момордина, дебуганина, дифтерийного токсина, псевдомонадного токсина и так далее, но этим не ограничиваться. Радиоактивный изотоп может представлять собой один или более выбранных из группы, состоящей из 131I, 188Rh, 90Y и так далее, но этим не ограничиваться. Цитотоксическое соединение может представлять собой одно или более выбранных из группы, состоящей из дуокармицина, монометилауристатина Е (ММАЕ), монометилауристатина F (MMAF), N2'-дезацетил-N2'-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтанзина (DM1), димера PBD (пирролобензодиазепин) и так далее, но этим не ограничиваться.
В другом воплощении антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть представлены в форме конъюгата, причем в составе этого конъюгата находится детектируемый маркер. Такой конъюгат можно с пользой применять для обнаружения присутствия CD43 или вышеупомянутого эпитопа CD43 in vitro или in vivo. Детектируемый маркер может быть выбран из всех маркерных веществ, общеизвестных в данной области техники, и, например, может представлять собой один или более выбранных из группы, состоящей из радиоактивного маркера (например, 3Н, 14С, 35S, 90Y, 99Тс, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 153Sm и так далее), фермента, флуоресцентной метки, люминесцентной метки, биолюминесцентной метки, магнитной метки, химических веществ, таких как биотин, и так далее, но этим не ограничиваться. Выбор соответствующей метки для случая применения антитела или эпитопа очевиден специалисту в данной области техники.
В другом воплощении предложена фармацевтическая композиция для предупреждения и/или лечения рака, содержащая антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент в качестве активного ингредиента. В другом воплощении предложена фармацевтическая композиция для ингибирования раковой стволовой клетки, содержащая антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент в качестве активного ингредиента. В другом воплощении предложен способ предупреждения и/или лечения рака, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента субъекту, нуждающемуся в предупреждении и/или лечении рака. В другом воплощении предложен способ ингибирования раковой стволовой клетки, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента субъекту, нуждающемуся в предупреждении и/или лечении рака. Фармацевтически эффективное количество означает количество, эффективное для получения желаемого противоракового эффекта, например, терапевтического эффекта (например, усиления процесса гибели раковых клеток, уменьшения пораженных раком тканей в размере, ингибирования метастазирования рака и так далее) у субъекта, подлежащего введению. Что касается фармацевтической композиции и способа, то антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент можно использовать в том виде, как они есть, или в форме конъюгата с присоединенным цитотоксическим веществом. Цитотоксическим веществом является то же самое вещество, которое описано выше.
Рак может представлять собой конкретный тип среди всех типов рака, экспрессирующих вышеупомянутый эпитоп CD43. В одном из воплощений рак может представлять собой гематологическое злокачественное заболевание и, например, может представлять собой одно или более выбранных из группы, состоящей из острого миелоидного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, острого моноцитарного лейкоза, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы и так далее. В другом воплощении рак может представлять собой одну или более разновидностей, выбранных из упомянутых далее видов солидного рака.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент можно вводить в количестве, достаточном для связывания с CD43 на клеточной поверхности, в частности, с вышеупомянутым CD43 или эпитопом CD43 на опухолевой клетке, экспрессирующей CD43 эпитоп, и данное количество может быть легко определено специалистом в данной области техники.
Вышеупомянутое фармацевтически эффективное количество или достаточное количество означает количество, необходимое для получения ожидаемого эффекта у субъекта, которому оно должно быть введено. Ожидаемый эффект будет сопровождать связывание антитела с CD43 (или эпитопом CD43), экспрессированным на клеточной поверхности, и в результате такого связывания может проявляться цитотоксичность (например, антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) или комплементзависимая цитотоксичность (CDC)) благодаря присутствию антитела, антигенсвязывающего фрагмента или цитотоксического вещества, конъюгированного с антителом или фрагментом. В другом воплощении ожидаемый эффект вызывается связыванием антитела с CD43, экспрессированным на поверхности клетки, при незначительной или при отсутствии цитотоксичности, обусловленной другими антителами, и тем самым такое связывание может позволить специалисту в данной области техники обнаружить и избирательно удалить (например, посредством лейкафереза) CD43+ клетки и CD43+ клетки у пациента (например, когда антитело или фрагмент мечены детектируемым маркером). Количество необходимых молекул антитела может быть разным в зависимости от пациента, расы, возраста и общего состояния здоровья пациента, введения конкретного соединения, способа введения и так далее, применяемого для пациента. Поэтому определение «точного достаточного количества» может оказаться неосуществимым. Однако, в любом отдельном случае соответствующее количество может быть определено обычным методом с использованием систематического экспериментирования. Кроме того, доза может быть скорректирована с учетом экстренности ситуации и может быть скорректирована с целью расчета оптимальной дозировки. Например, несколько доз можно принимать один раз в сутки, один раз в неделю, один раз в месяц или с другим соответствующим временным интервалом.
Вышеупомянутое фармацевтически эффективное количество или достаточное количество может быть определено путем мониторинга связывания антитела с клеткой в биологическом образце (например, образце жидкости организма (например, образце крови и так далее), образце клетки/ткани (например, образце опухолевой клетки/ткани и так далее) и так далее, полученном от пациента, которому вводят или которому надлежит ввести антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Биологический образец может быть отобран у пациента в конкретный момент времени после введения антитела или фрагмента (например, примерно через 5, 10, 15 или 20 мин после введения). Присутствие антитела или фрагмента на клеточной поверхности в образце (то есть, антитела или антигенсвязывающего фрагмента, связавшегося с CD43 или его эпитопом на клеточной поверхности в результате взаимодействия антигена с антителом) может быть проанализировано с использованием хорошо известных в данной области техники методов. Кроме того, полученный биологический образец может быть использован для общего анализа для измерения жизнеспособности клеток или числа живых клеток в образце. Исходя из того факта, что число CD43-положительных клеток уменьшается после введения антитела или фрагмента (например, число живых клеток в образце, в который введено антитело или фрагмент, уменьшается по сравнению с контрольным образцом, подобным образцу, полученному до введения антитела или фрагмента, и так далее), можно определить антителоопосредуемую цитотоксичность. Цитотоксичность может опосредоваться антителом как таковым (например, неконъюгированным антителом, которое не связано с цитотоксическим веществом, или его антигенсвязывающим фрагментом) и/или может опосредоваться цитотоксическим веществом, конъюгированным с антителом или фрагментом.
Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связываются с эпитопом CD43, предложенные в данном изобретении, могут уменьшать на 10% или больше, 20% или больше, 30% или больше, 40% или больше, 50% или больше, 60% или больше, 70% или больше, 80% или больше либо 90% или больше уровень CD43-положительных клеток-мишеней в образце от пациента, которому вводили антитело или фрагмент, по сравнению с уровнем CD43-положительных клеток в контрольном образце (например, образце, полученном от пациента перед введением антитела или фрагмента). В одном из воплощений CD43-положительная клетка может представлять собой раковую клетку, например, злокачественную гематопоэтическую клетку (например, лейкозную клетку) и/или раковую стволовую клетку.
В другом воплощении дозировку (фармацевтически эффективное количество) антитела или антигенсвязывающего фрагмента можно оценить и определить в клеточном анализе in vitro. Например, чтобы определить концентрацию антитела или фрагмента, необходимую для снижения числа CD43-положительных клеток, которые представляют собой мишень для антитела или фрагмента, можно провести клеточный анализ in vitro с использованием CD43-положительной клетки (например, клеточной линии СЕМ7). Концентрацию антитела или фрагмента, определенную для случая уменьшения числа клеток in vitro (например, уменьшения по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению с числом клеток в отсутствие антитела или фрагмента), можно принять за основу при определении дозировки, достаточной для уменьшения числа CD43-положительных клеток, необходимого in vivo. Помимо этого, данная дозировка может быть определена с учетом таких факторов, как масса тела пациента, объем крови, скорость клиренса и так далее.
«Субъект или пациент», как использовано в данном описании, может быть выбран из животных, в том числе млекопитающих, подобным человеку, горилле, шимпанзе и так далее, или может представлять собой клетку, ткань, жидкость организма, выделенную из животных, или их культуры. Млекопитающие могут включать человека. Изобретение, изложенное в данном описании, может быть применено в области медицины или ветеринарии для специфичного направленного воздействия на CD43-положительные клетки, и оно имеет содержание, ясно понимаемое специалистом в данной области техники. Как правило, термин «животное» используют для совместного определения не только приматов, подобных человеку, обезьяне и так далее, но также домашних питомцев и домашних животных, подобных корове, лошади, овце, свинье, верблюду, козе, ослу, собаке, кошке и так далее, и лабораторных животных, подобных мыши, крысе и так далее. В отношении лошади, лошадь представляет собой используемую в отрасли разведения скаковых лошадей, а также в индустрии развлечений или разведения домашних животных.
В случае необходимости, способ, предложенный в данном изобретении, может дополнительно включать использование второго терапевтического средства (например, терапевтического агента). Например, при необходимости способ по настоящему изобретению может включать введение субъекту другого химиотерапевтического соединения (второго активного ингредиента). Введение второго активного ингредиента может быть осуществлено одновременно с введением антитела или антигенсвязывающего фрагмента, предложенного в данном изобретении, или может быть осуществлено в любом порядке (до или после введения антитела и так далее).
Согласно другому аспекту данного изобретения предложены: применение для лечения рака; получение противоракового средства; ингибирование раковой стволовой клетки; и/или получение агента для ингибирования раковой стволовой клетки на основе антитела к CD43 или антигенсвязывающего фрагмента.
В отношении фармацевтической композиции, способа и применения, описанных в данной заявке, рак может представлять собой солидный рак или гематопоэтический рак и может представлять собой первичный рак или метастазирующий рак. В одном из воплощений рак может представлять собой гематологическое злокачественное заболевание. Гематологическим злокачественным заболеванием может быть острый миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, острый моноцитарный лейкоз или лимфома Ходжкина, но этим не ограничиваться. Гематологическое злокачественное заболевание может представлять собой рак с включением раковых стволовых клеток.
В другом воплощении рак может представлять собой солидный рак. Солидный рак может представлять собой одну или более разновидностей, выбранных из группы, состоящей из рака легкого (например, плоскоклеточной карциномы, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, аденокарциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого), перитонеального рака, рака кожи, меланомы кожи или глазного яблока, рака прямой кишки, раковой опухоли возле анального отверстия, рака пищевода, рака тонкой кишки, рака эндокринных желез, рака паращитовидной железы, рака надпочечников, саркомы мягких тканей, рака уретры, рака желудочно-кишечного тракта, рака желудка, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака шейки матки, рака яичника, рака печени, рака желчного пузыря, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака толстого кишечника, рака матки, рака эндометрия, рака шейки матки, рака слюнных желез, рака почки, рака предстательной железы, рака вульвы, рака щитовидной железы, рака головы и шеи, рака головного мозга, остеосаркомы и так далее, но этим не ограничиваться. Например, солидный рак может представлять собой рак желудка, рак молочной железы, рак легкого, рак толстого кишечника, рак печени, рак желчного пузыря, рак почки, рак поджелудочной железы, рак щитовидной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак предстательной железы или рак мочевого пузыря. Такой рак включает не только первичный рак, но также метастазирующий рак. Кроме того, солидный рак может представлять собой рак, обладающий устойчивостью к традиционным противораковым средствам (например, низкомолекулярному противораковому средству (противораковому химическому средству), антиметаболиту, алкилирующему агенту, антибиотикам, алкалоиду барвинка, ферменту, гормону, терапевтическому агенту с направленным действием и/или терапевтическому агенту на основе антител и так далее), и может представлять собой рак, рецидивирующий после лечения традиционными противораковыми средствами (например, низкомолекулярным противораковым средством (противораковым химическим средством), антиметаболитом, алкилирующим агентом, антибиотиками, алкалоидом барвинка, ферментом, гормоном, терапевтическим агентом с направленным действием и/или терапевтическим агентом на основе антител и так далее). Солидный рак может представлять собой рак с включением раковых стволовых клеток.
Эффект лечения солидного рака включает не только ингибирование роста (уменьшение количества) и апоптоз раковых клеток (в частности, раковых стволовых клеток) или пораженной раком ткани, содержащей такие клетки, но также ингибирующий эффект в отношении ухудшения ракового заболевания путем ингибирования миграции, инвазии, метастазирования и так далее.
Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в данном изобретении, можно вводить различными путями и можно вводить перорально или парентерально. Например, в качестве надлежащих примеров путей введения представляются внутривенная инъекция, интраартериальная инъекция, внутримышечная инъекция или инфузия и так далее, и в одном из воплощений введение может быть осуществлено путем внутривенной инъекции, но этим не ограничиваться.
В одном из воплощений на основе антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента может быть приготовлена композиция в форме, подлежащей введению в том виде, как она есть, или вместе со вторым терапевтическим соединением (например, химиотерапевтическим соединением).
Согласно другому аспекту предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в данном изобретении, и одно или более вспомогательных веществ, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемого носителя, разбавителя и эксципиента. В одном из воплощений антитело, содержащееся в фармацевтической композиции, может иметь форму, в которой цитотоксическое вещество находится в связанном или конъюгированном состоянии. Соответствующие фармацевтически приемлемые носитель, разбавитель и эксципиент хорошо известны специалисту в данной области техники, и в качестве примеров рассматриваются физиологический раствор, растворитель (например растворитель для инъекций), диспергирующая среда, противогрибковый и/или антимикробный агент, поверхностно-активное вещество, изотонический агент, адсорбирующее вещество и так далее, но этим не ограничиваются.
В одном из воплощений фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде различных форм, присущих композициям, например, в различных стандартных лекарственных формах, присущих инъекционной композиции, и так далее.
Приготовление и последующее введение фармацевтической композиции может быть выполнено в соответствии с традиционными методами в данной области техники. Введение зависит от состояния субъекта до лечения, реакционной способности лекарственного средства и так далее, но его необходимо продолжать, если желаемый эффект прекратился. Дозировка, способ введения и частота повторного введения фармацевтической композиции могут быть определены с учетом возраста, пола, тяжести заболевания, реакционной способности лекарственного средства и так далее, и это считается очевидным для специалиста в данной области техники.
В другом воплощении предложен способ получения антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента. Способ получения может включать стадию экспрессирования молекулы нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Стадия экспрессирования может включать стадию культивирования рекомбинантной клетки и произвольным образом может дополнительно включать стадию выделения и/или очистки антитела из полученных клеточных культур.
В одном из конкретных воплощений способ получения может включать:
стадию культивирования рекомбинантной клетки, трансформированной нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, или рекомбинантным вектором, содержащим указанную нуклеиновую кислоту, в условиях и/или в течение периода времени, достаточных для осуществления экспрессии данной нуклеиновой кислоты; и
стадию выделения и/или очистки антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента из культивируемых клеток или полученных культивируемых смесей.
Рекомбинантная клетка может быть получена путем трансформации клетки-хозяина нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, или рекомбинантным вектором, содержащим указанную нуклеиновую кислоту.
В другом воплощении предложены очищенные антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные со стадии выделения и/или очистки. Полученные антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут представлять собой рекомбинантую молекулу, отделенную от других компонентов, с которыми она связана при экспрессии в клетке или секретируется во внеклеточное пространство. В одном из воплощений выделенные и/или очищенные антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут иметь чистоту 50% или больше, 60% или больше, 70% или больше, 75% или больше, 80% или больше, 85% или больше, 90% или больше, 95% или больше, 96% или больше, 97% или больше, 98% или больше либо 99% или больше. Специалист в данной области техники может четко понимать, что степень выделения и/или очистки зависит от цели применения и/или формы применения антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Например, когда предполагается введение животному, в частности, введение в организм человека, то может потребоваться относительно высокий уровень чистоты очищенного антитела или антигенсвязывающего фрагмента, а при использовании для экспериментов in vitro могут содержаться, в приемлемых количествах, примеси (например, компоненты, происходящие из клеток хозяина и/или культивируемых смесей (белок и так далее) и другие).
В другом воплощении предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент. В одном из конкретных воплощений нуклеиновая кислота может включать молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи (связывающий домен VH) антитела или антигенсвязывающего фрагмента, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи (связывающий домен VL) или их комбинации. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, может содержать нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25 и 29. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область легкой цепи, может содержать нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27 и 31.
Нуклеиновая кислота может содержаться в соответствующем экспрессирующем векторе. Экспрессирующим вектором могут быть все векторы, обычно используемые для экспрессии чужеродного гена в клетке-хозяине, и они могут быть проиллюстрированы, например, как рТТ5, рАРЕХ3р, pcDNA3.2(-) и так далее, но этим не ограничиваться.
В другом воплощении предложена рекомбинантная клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, или рекомбинантный вектор, содержащий указанную молекулу (или экспрессирующий вектор). Рекомбинантную клетку получают путем введения молекулы нуклеиновой кислоты или рекомбинантного вектора в клетку-хозяин и в клетку, которая может экспрессировать молекулу нуклеиновой кислоты. В качестве примера клетки-хозяина можно назвать прокариотическую клетку (например, Е. coli и так далее) или клетку простейших и эукариотическую клетку, такую как клетка животного происхождения (например, клетка яичника китайского хомячка (СНО), COS, почки человеческого эмбриона HEK-293Е, HEK-293Т, клетка с модификацией по конкретному гену (например, клетка с делецией гена и так далее), растительную клетку, клетку грибов (например, Saccharomyces cerevisiae и так далее), клетку насекомых (например, клетку Sf9 (линию, выделенную из клеток Spodoptera frugiperda) и так далее), но этим не ограничиваться, и она может быть выбрана среди всех клеток, которые могут экспрессировать чужеродный ген.
В другом воплощении предложен способ детектирования CD43 или способ детектирования CD43-положительной клетки, включающий стадию приведения в контакт антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента с клеточным образцом и стадию подтверждения того, имеет ли место в данном образце связывание антиген-антитело. С использованием этого способа может быть подтверждено, экспрессируется ли CD43 на клеточной поверхности в клеточном образце, и поэтому данный способ может быть применен для диагностики заболевания, обусловленного экспрессией CD43. Таким образом, в другом воплощении предложен способ диагностики CD43-ассоциированного заболевания или способ получения информации для диагностики CD43-ассоциированных заболеваний, включающий стадию приведения антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента в контакт с клеточным образцом и стадию подтверждения того, имеет ли место в данном образце связывание антиген-антитело. CD43-ассоциированным заболеванием считается заболевание, связанное с присутствием CD43 или возрастанием количества CD43, и им может быть рак, и этот рак может представлять собой солидный рак или гематологическое злокачественное заболевание и, в частности, может представлять собой гематологическое злокачественное заболевание, связанное с возрастанием количества CD43 (например, острый лимфобластный лейкоз, острый миелоидный лейкоз). В другом конкретном воплощении CD43-ассоциированным заболеванием может быть рак с включением раковых стволовых клеток.
В данном способе связывание антиген-антитело может быть подтверждено путем детектирования того, образуется ли комплекс между антителом (или его антигенсвязывающим фрагментом) и белком CD43 (то есть, когда детектируется образование комплекса антитело-белок CD43, это подтверждает, что имеет место связывание антиген-антитело). Затем, для относительного сравнения, можно выполнить сравнение с результатом, полученным для тестируемого клеточного образца, посредством проведения того же эксперимента для контрольного клеточного образца. Контрольный клеточный образец может быть выбран из хорошо известной CD43-негативной клетки или нормальной клетки (нераковых или неопухолевых клеток).
В одном из воплощений способ детектирования или способ диагностирования может включать:
(1) стадию приведения в контакт антитела или антигенсвязывающего фрагмента с тестируемым клеточным образцом и контрольным клеточным образцом; и
(2) стадию определения факта образования комплекса между антителом или антигенсвязывающим фрагментом и данной клеткой, или его уровня. Затем, когда определено наличие комплекса в тестируемом клеточном образце или относительно высокий уровень образования комплекса по сравнению с контрольным клеточным образцом, тогда может быть подтвержден факт присутствия CD43 в тестируемом клеточном образце или что такая клетка представляет собой клетку, экспрессирующую CD43 (то есть, CD43-положительную клетку). Клеточный образец может быть выделен из живого организма, а способ может быть осуществлен in vitro.
В другом воплощении предложена композиция для детектирования или визуализации (индикации) CD43, содержащая антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент. В другом воплощении предложен способ детектирования или визуализации (индикации) CD43 посредством использования антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента. Композицию и способ можно применять для детектирования и/или визуализации CD43 in vivo, а также in vitro. Что касается композиции и способа, то антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут быть в форме конъюгата с детектируемой меткой, и детектируемая метка может представлять собой, например, одну или более выбранных из группы, состоящей из радиоактивной метки (например, 3Н, 14С, 35S, 90Y, 99Тс, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Но, 153Sm и так далее), фермента, флуоресцентной метки, люминесцентной метки, биолюминесцентной метки, магнитной метки, химического вещества, подобного биотину, и так далее, но этим не ограничиваться, и может представлять собой все метки, детектируемые общепринятыми методами детектирования, хорошо известными в данной области техники. Как описано выше, детектирование и/или визуализацию CD43 in vitro и/или in vivo можно применять для диагностики заболеваний, связанных с возрастанием количества CD43-положительных клеток, например, раковых клеток, более конкретно, ракового или гематологического злокачественного заболевания с включением раковых стволовых клеток.
Способ детектирования и/или визуализации CD43 (in vivo) может включать следующее:
(1) стадию введения антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента тестируемому субъекту; и
(2) стадию оценки образования комплекса антитела или антигенсвязывающего фрагмента или измерения степени (уровня) образования комплекса.
Такой комплекс может представлять собой комплекс антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и CD43, экспрессируемого на поверхности клеток в организме тестируемого субъекта, или комплекс, образуемый в результате связывания антиген-антитело, осуществляемого между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и клетками, экспрессирующими CD43 (CD43-положительными клетками). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно использовать в форме конъюгата с вышеупомянутой детектируемой меткой. Для визуализации клетки, экспрессирующей CD43, например, раковой стволовой клетки, может быть применен конкретный метод визуализации.
Для факта образования комплекса на основе антитела или антигенсвязывающего фрагмента при введении субъекту или уровня образования можно провести относительную оценку путем сравнения, образуется ли такой комплекс у контрольного субъекта (например, субъекта, не имеющего CD43-ассоциированного заболевания, или субъекта, не содержащего клеток, (сверх)экспрессирующих CD43) или каков уровень его образования. Для проведения такого сравнения способ может включать
(1-1) стадию введения антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента тестируемому субъекту и контрольному субъекту, соответственно;
(2-1) стадию определения факта образования комплекса на основе антитела или антигенсвязывающего фрагмента, или степени (уровня) его образования у тестируемого субъекта и контрольного субъекта, соответственно; и
(3) стадию сравнения результата измерения для тестируемого субъекта с результатом для контрольного субъекта.
Данный способ может быть применен для диагностики CD43-ассоциированных заболеваний у тестируемого субъекта или для подтверждения наличия (для детектирования) раковых стволовых клеток, экспрессирующих CD43. В случае, когда оценивают образование комплекса или возрастание уровня образования комплекса по сравнению с контрольным субъектом на стадии (2) или (2-1), тестируемый субъект может быть определен как пациент, имеющий CD43-ассоциированное заболевание, или может быть определено, что у тестируемого субъекта имеются раковые стволовые клетки.
Образование in vivo или in vitro комплекса антигена (или клетки, экспрессирующей антиген на поверхности) и антитела может быть оценено с использованием средств, общепризнанных в данной области техники, и эти общепризнанные средства очевидны специалисту в данной области техники. Например, присутствие такого комплекса может быть подтверждено посредством использования мечения антитела или антигенсвязывающего фрагмента соответствующей детектируемой меткой и измерения сигнала от этой метки или посредством надлежащих методов детектирования. Надлежащими методами детектирования могут быть все общепризнанные в данной области техники методы, и ими могут быть, например, ELISA, система проточной цитометрии (FACS), иммуногистохимическое окрашивание и так далее, но этим не ограничиваться.
Специалисту в данной области техники будет четко понятно, что могут быть выполнены дополнительные изменения и/или модификации в отношении изложенного в данном описании изобретения, отличающиеся от описанных выше. Следует понимать, что изложенное в данном описании изобретение включает все изменения и/или модификации в пределах описанных сущности и/или объема. Помимо этого, изложенное в данном описании изобретение может соответственно или полностью включать все стадии, характеристики, композиции и/или соединения, четко описанные или упомянутые в данном описании.
Конкретные воплощения будут описаны со ссылкой на следующее далее воплощение, но эти примеры разработаны только в целях иллюстрации и не ограничивают вышеупомянутый объем изобретения.
Следует понимать, что, нуклеотидные последовательности, разработанные и описанные в данной заявке, модифицированы хорошо известными в данной области техники методами, например, методом созревания аффинности или методом, основанном на ослаблении иммуногенности и повышении связывающей способности посредством предсказания и удаления мотива для связывания с МНС (главный комплекс гистосовместимости) класса 2. Полезность терапевтического агента на основе нуклеотидных последовательностей, разработанных и описанных в данной заявке, можно повысить, регулируя функциональные свойства посредством изменения антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC), комплементзависимой цитотоксичности (CDC), полупериода существования в сыворотке крови, изотипа, связывания с Fc-рецептором или комбинации этих действий. Эти изменения могут быть выполнены методами белковой инженерии, конструирования гликан-содержащей части или химическими методами. В соответствии с необходимым применением терапевтического агента предпочтение может быть отдано повышению или снижению этих активностей.
В данной области техники известны многочисленные методы созревания аффинности антител. Большинство из них основаны на общей стратегии получения библиотеки панели мутантов или модифицированного белка и скрининга и отбора с целью повышения аффинности. Зачастую мутагенез осуществляется на уровне дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), например, с использованием допускающей ошибки ПЦР (полимеразная цепная реакция), с использованием перетасовки генов, с использованием мутагенных химических реагентов или облучения, с использованием штаммов-«мутаторов» с механизмом допускающей ошибки репликации или с использованием подходов, связанных с соматической гипермутацией, в которых задействован механизм природного созревания аффинности. Кроме того, мутагенез может быть осуществлен на уровне РНК, например, с применением репликазы. Методы с применением библиотек, позволяющие отобрать улучшенные варианты белков, могут быть основаны на различных технологиях с применением дисплея, таких как фаговый дисплей, дрожжевой дисплей, рибосомный дисплей, дисплей с использованием клеток бактерий или млекопитающих, и они хорошо известны в данной области техники. Созревания аффинности можно достичь посредством применения более направленных/прогностических методов, например, путем сайт-специфического мутагенеза или синтеза генов, основанного на данных трехмерной структуры белка. Способы повышения ADCC или CDC известны специалистам в данной области техники.
Целый ряд способов модулирования полупериода существования в сыворотке крови и распределения антитела в живом организме изменяет взаимодействие между антителом и неонатальными Fc-рецепторами (FcRn), что играет важную роль в отношении предупреждения катаболизма IgG и поддержания высокой концентрации антитела в сыворотке крови. Например, можно упомянуть патенты США №№6277375, 6821505, 7083784, патент США №7217797 и заявку WO 2000/4207. Другой пример замены аминокислот в константных областях, регулирующей способность связывания с Fc-рецептором и опосредуемую этим рецептором функцию, такую как способность связывания с FcRn и полупериод существования в сыворотке крови, описан в заявках на патент США №№2009/0142340, 2009/0068175 и 2009/0092599.
Гликан, присоединенный к молекуле антитела, влияет на активность антитела, в том числе на полупериод существования в сыворотке крови, затрагивая взаимодействие Fc-рецептора и гликанового рецептора. В связи с этим, тип гликана, регулирующего активность антитела, может предоставлять преимущества с точки зрения терапевтического агента. Способ получения гликана регулируемого типа хорошо известен в данной области техники, но не ограничивается описанными в патентах США №№6602684, 7326681, 7388081 и заявке WO 2008/006554.
Для увеличения полупериода существования белка в сыворотке крови используют метод увеличения полупериода существования посредством добавления полиэтиленгликоля (ПЭГ).
Термин «% идентичности» используется в данном описании для описания ряда последовательностей. Очевидно, что термин «% идентичности» означает, что при сравнении двух последовательностей в пределах конкретного участка эти две последовательности имеют конкретное число идентичных остатков в одном и том же положении.
% идентичности одного полипептида по отношению к другому полипептиду можно определить, используя анализ GAP со штрафом за открытие разрыва (гэпа), составляющим 5, и штрафом за удлинение разрыва, составляющим 0,3. Запрашиваемая последовательность составлена по меньшей мере из 50 аминокислот, и с использованием анализа GAP выполняют выравнивание участка двух последовательностей, составленного по меньшей мере из 50 аминокислот. Более предпочтительно, длина запрашиваемой последовательности составляет по меньшей мере 100 аминокислот, и с использованием анализа GAP выполняют выравнивание участка двух последовательностей, составленного по меньшей мере из 100 аминокислот. Еще более предпочтительно, длина запрашиваемой последовательности составляет по меньшей мере 250 аминокислот, и с использованием анализа GAP выполняют выстраивание двух последовательностей на участке, составленном по меньшей мере из 250 аминокислот. Наиболее предпочтительно, с использованием анализа GAP выполняют выстраивание аминокислотной последовательности полной длины для двух рассматриваемых полипептидов.
В отношении определенного полипептида будет очевидно, что количественные показатели % идентичности, превышающие представленные, будут соответствовать предпочтительным воплощениям. Поэтому, если это возможно, то предпочтительно, чтобы с учетом по меньшей мере % идентичности полипептид содержал аминокислотную последовательность, относящуюся к последовательности с SEQ ID NO, имеющей идентичность аминокислотной последовательности, составляющую предпочтительно по меньшей мере 95% или больше, более предпочтительно по меньшей мере 97% или больше, еще более предпочтительно по меньшей мере 98% или больше, и еще более предпочтительно по меньшей мере 99% или больше, более предпочтительно по меньшей мере 99,1% или больше, более предпочтительно по меньшей мере 99,2% или больше, более предпочтительно по меньшей мере 99,3% или больше, более предпочтительно по меньшей мере 99,4% или больше, более предпочтительно по меньшей мере 99,5% или больше, более предпочтительно по меньшей мере 99,6% или больше, более предпочтительно по меньшей мере 99,7% или больше, более предпочтительно по меньшей мере 99,8% или больше, еще более предпочтительно по меньшей мере 99,9% или больше.
Описанная в данной заявке вариация аминокислотной и нуклеотидной последовательности может быть введена и получена благодаря изменению нуклеотидов в результате мутации нуклеиновой кислоты in vivo посредством химической или радиоактивной обработки. Пример этой мутации включает делецию, вставку или замену остатков в аминокислотной последовательности. Полинуклеотиды по изобретению могут быть подвергнуты методам перетасовки ДНК, которые описаны Harayama в 1998 г., или другим методам in vitro с целью получения измененных полинуклеотидов, кодирующих варианты полипептидов. В этом методе перетасовки ДНК можно применять последовательность гена, относящуюся к настоящему изобретению, такую как Rht-B1 из вида растений, отличающегося от пшеницы. Продукты, полученные исходя из мутантной/модифицированной ДНК, можно подвергнуть скринингу с использованием метода, изложенного в данном описании, с целью определения, обладают ли они, например, фенотипом избыточного роста. Например, делеция аминокислотной последовательности может включать делецию, обычно составляющую примерно 1-15 аминокислотных остатков, например, 1-10 аминокислотных остатков или 1-5 следующих друг за другом аминокислотных остатков.
Например, замена в аминокислотной последовательности может включать ситуацию, когда один или несколько аминокислотных остатков в полипептиде делетированы и в это положение встроены один или несколько аминокислотных остатков, отличающихся от первоначальных аминокислотных остатков.
Использованный в данном описании термин «содержат (содержит или содержащий)» можно использовать в качестве «открытого» значения (open type meaning), содержащего описанные компоненты, стадии, численные значения и так далее, и это не следует интерпретировать как намерение исключить компоненты, стадии, численные значения и так далее, отличающиеся от них, и в зависимости от обстоятельств он не может быть исключен, чтобы означать «состоящий по существу из».
Все литературные источники, упомянутые в данном описании, включены в данное описание в качестве ссылки.
ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к антителу, которое способно лечить раковые стволовые клетки, а также гематологическое злокачественное заболевание или солидный рак, и эпитопу, который распознается этим антителом, и антителу, распознающему этот эпитоп, или его антигенсвязывающему фрагменту, тем самым к более интенсивному и радикальному лечению рака и содействию разработке эффективных противораковых терапевтических агентов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
ФИГ. 1 представляет результат подтверждения экспрессии CD43 в линии клеток рака желудка человека NCI-N87 (слева) и AGS (справа) методом иммуноокрашивания (ось X: уровень экспрессии CD43; ось Y: подсчет количества клеток).
ФИГ. 2а-2с представляет результат подтверждения экспрессии CD43 в различных линиях клеток солидного рака методом иммуноокрашивания (2а: линия клеток рака желудка; 2b: линия клеток ректального рака; 2с: линия клеток рака печени).
ФИГ. 3 представляет результат подтверждения цитотоксичности конъюгата (антитело к CD43)-MMAE в отношении линий клеток рака желудка человека NCI-N87, SNU-719 и AGS.
ФИГ. 4 представляет результат подтверждения цитотоксичности конъюгата (антитело к CD43)-DM1 в отношении линий клеток рака желудка человека NCI-N87, SNU-719 и AGS.
ФИГ. 5 представляет результат подтверждения цитотоксичности конъюгата (антитело к СВ43)-дуокармицин в отношении линий клеток рака желудка человека NCI-N87 и AGS.
ФИГ. 6 представляет результат подтверждения противоракового эффекта самого антитела к CD43 (DNP001) и конъюгата (антитело к CD43)-дуокармицин (D-Duo) в животной модели рака желудка, в которой использована трансплантированная линия клеток рака желудка человека.
ФИГ. 7 представляет результат подтверждения экспрессии CD43 эпитопа в различных пораженных солидным раком тканях, происходящих из человека, иммуногистохимическим методом (М: медуллярное вещество, С: корковое вещество).
ФИГ. 8 представляет результат подтверждения экспрессии CD43 эпитопа, связанной с заболеванием различными видами солидного рака, имеющимися у человека, иммуногистохимическим методом (А: перстневидноклеточный рак (перстневидноклеточный рак желудка), В: инфильтрирующая протоковая аденокарцинома молочной железы, С: аденокарцинома поджелудочной железы, D: почечноклеточная карцинома почки, Е: аденокарцинома легкого, F: плоскоклеточная карцинома гортани, G: рак желчного пузыря, Н: плоскоклеточная карцинома шейки матки, I: плоскоклеточная карцинома матки, J: рак мочевого пузыря, K: плоскоклеточная карцинома легкого, L: гранулоцитарная саркома среднего уха).
ФИГ. 9 представляет результат подтверждения экспрессии CD43, CD44 и CD133 в раковых стволовых клетках из линии клеток рака желудка человека NCI-N87 методом иммуноокрашивания.
ФИГ. 10 представляет результат иммуногистохимического окрашивания тимусной ткани с использованием моноклонального антитела к CD43 (YG5).
ФИГ. 11 представляет график, полученный с применением системы проточной цитометрии при измерении реакционной способности моноклонального антитела к CD43 (YG5) в отношении тимусной клетки.
ФИГ. 12 представляет фигуру, схематично показывающую 11 разновидностей мутантов CD43 с делецией.
ФИГ. 13 представляет результат вестерн-блоттинга, подтвержающий реакционную способность моноклонального антитела к CD43 (YG5) в отношении 11 разновидностей мутантов CD43 с делецией.
ФИГ. 14 представляет схематичную диаграмму, иллюстративно показывающую способ получения плазмид, экспрессирующих тяжелую цепь и легкую цепь антитела к CD43.
ФИГ. 15 представляет график, показывающий способность антитела к CD43 связываться с эпитопом CD43 после обработки нейраминидазой нормальных клеток крови.
ФИГ. 16 представляет график, показывающий результат измерения перекрестной реактивности антител к CD43 в отношении рекомбинантных СЕАСАМ5 (родственная канцероэмбриональному антигену молекула 5 клеточной адгезии) и СЕАСАМ6.
ФИГ. 17 представляет график, показывающий степень экспрессии CD43 эпитопа в опухолевых стволовых клетках (опухолевых сферах).
ФИГ. 18 представляет график, показывающий цитотоксичность антитела к CD43 по отношению к клеткам СЕМ7 или CCRF-CEM (с низкой степенью экспрессии CD43 эпитопа) и показывает, что антитело к CD43 напрямую не обладает цитотоксичностью.
ФИГ. 19 представляет график, показывающий жизнеспособность клетки-мишени, обработанной антителом к JL-1 с присоединенным к нему токсином (антителом к JL-1, конъюгированным с сапорином), и демонстрирует, что под действием конъюгированного с сапорином антитела к JL-1 наблюдается апоптоз.
ФИГ. 20 представляет график, показывающий явление интернализации антител к JL-1 (антител к CD43) (обоих антител, и грызунов, и человека) в тесте на апоптоз, описанном на ФИГ. 19, и результат, полученный в анализе с применением устройства для проточной цитометрии. Для этого мышиными антителами к JL-1 обрабатывают клетки в холодильнике в течение 30 мин и переносят в условия 37°С, затем отбирают по 106 клеток в каждый момент времени, отмеченный на оси X графика, проводят обработку вторичными конъюгированными с РЕ антителами к IgG мыши при температуре холодильника в течение 10 мин и клетки промывают и фиксируют.
На ФИГ. 21 представлено изображение, показывающее явление гомотипической агрегации, индуцированной антителами к JL-1 в клетках, экспрессирующих антиген CD43. Изображение получают, делая снимки с использованием микроскопа в установленный момент времени после обработки 300000 клеток антителами к JI-1, соответственно, в исходной концентрации 40 мкг/мл и культивирования их в условиях 37°С и 5% CO2, и на ФИГ. 21 представлено изображение, полученное через 2 часа после обработки антителами.
ФИГ. 22 представляет результат, показывающий низкий уровень гетерогенной экспрессии антигена JL-1 в нормальных клетках костного мозга. Моноциты из обычного костного мозга окрашивают с использованием мышиных антител к JL-1, затем окрашивают с использованием антител козы к F(ab)2 IgG мыши, конъюгированных с РЕ, и исследуют. Наложение гистограмм представляет собой ограниченное число лимфоцитов.
На ФИГ. 23 показан уровень экспрессии антигена JL-1 в клетках периферической крови. Два образца нормальных РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) человека окрашивали с использованием антитела мыши к JL-1 человека (голубая линия: (d)) и наблюдали низкий уровень экспрессии антигена JL-1.
ФИГ. 24 представляет график, показывающий результат измерения уровня образования колоний субпопуляций клеток костного мозга в случае предварительной обработки нормальных клеток костного мозга связанными с сапорином антителами к IL-1 (JL1+) и в случае без обработки. Получено подтверждение, что образования колоний субпопуляций клеток костного мозга не происходит в случае предварительной обработки нормальных клеток костного мозга конъюгированными с сапорином антителами к JL-1. Данный результат получен посредством измерения после выделения костного мозга и сбора лейкоцитов и выделения и сбора CD34+ клеток путем классификации их на JL1-положительные и JL1-отрицательные и помещения собранных клеток в среду MethoCult с цитокином.
ФИГ. 25 представляет график, показывающий терапевтический эффект самого антитела к JL1 и конъюгированного с токсином антитела к JL1 в модели гетеротрансплантатов острого лимфоцитарного лейкоза (ALL), на ФИГ. 25А показан результат в модели лейкоза с использованием клеток СЕМ7, а на ФИГ. 25В показан результат в модели с использованием NALM-6 (клеточная линия: NALM6 (В-ALL (В-клеточный ALL))), соответственно. Тестирование проводили в следующих условиях: мыши: NOD-SCID (с тяжелым комбинированным иммунодефицитом и диабетом без ожирения) (8/группа); инокуляция: в 0-е сутки 107 клеток; введение: 15 мкг/инъекция + 100 мкг суммарного IgG, внутривенно (в.в.), 1х/неделя, начиная с 8-х суток; конечная точка: состояние паралича.
На ФИГ. 26 показан уровень экспрессии JL-1 в бластных клетках и субпопуляциях при выраженном AML (острый миелоидный лейкоз).
ФИГ. 27 представляет график, показывающий апоптотический эффект под действием химерного гуманизированного JL-1 (ADCC и CDC), а ФИГ. 27А представляет результат оценки цитотоксичности с использованием CellTiterGlo. Клеточную линию СЕМ7 культивировали вместе с эффекторными клетками (РВМС) и затем добавляли химерные антитела к JL-1 или контрольные антитела. ФИГ. 27В представляет результат оценки цитотоксичности путем использования CellTiterGlo. Клеточную линию СЕМ7 культивировали в культуральной среде и добавляли химерные антитела к JL1 вместе с комплементом кролика. В контрольной группе используют антитела IgG1 изотипа, являющиеся нерелевантными для данного эксперимента.
ФИГ. 28 представляет результат, показывающий, что ADCC активность химерного антитела к JL-1 возрастает при дефукозилировании.
ФИГ. 29 представляет график, показывающий эффект, оказываемый неконъюгированным химерным антителом в клеточной линии СЕМ7 in vivo.
ФИГ. 30 представляет результат, показывающий экспрессию JL1 в субпопуляции лейкозных стволовых клеток (LSC).
ФИГ. 31 представляет график, показывающий результат анализа образования колоний in vitro (среднее число колоний) под действием антител к JL1, конъюгированных с токсином (сапорином: SAP) (ССС), и он демонстрирует усиление апоптотического эффекта в отношении антиген-положительных клеток в случае AML. Данные клетки помещали на панель колоний стволовых клеток вместе с конъюгатами JL1-сапорин или (IgG1 мыши)-сапорин и наблюдали образование колоний.
ФИГ. 32 представляет график, показывающий тот эффект, что антитело к JL1, конъюгированное с токсином (сапорином: SAP) (ССС), влияет на прогрессирование in vitro антиген-положительного выраженного AML.
ФИГ. 33 представляет график, показывающий ингибирующий эффект в отношении роста раковых клеток при выраженном AML под действием антитела, связанного с токсином, на мышах NSG (мышах NOD/SCID с дефицитом общей гамма-цепи) (in vitro). У пациента с JL-1+ AML отбирали 5×107 костномозговых клеток и вводили внутривенной инъекцией 30 облученным мышам NSG. Через 8 недель мышам каждую неделю вводили в дозе 45 мкг JL1-дебуганин (DB), hIgG1-DB или PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), извлекали костный мозг и селезенку, подвергали пересадке и наблюдали за образованием опухолей.
На ФИГ. 34 и ФИГ. 35 показаны результаты, подтверждающие, что различные гуманизированные/оптимизированные модифицированные антитела демонстрируют одинаковый профиль связывания по сравнению с исходным (мышиным) антителом к JL-1. Для наблюдения проводили окрашивание клеток СЕМ7 с использованием родительского исходного антитела к JL-1 или 3-х разновидностей антител, модифицированных посредством гуманизации. В результате ФИГ. 34 указывает на то, что модифицированный «Combo А» показал самый лучший профиль, а все другие тестируемые антитела показали значительный уровень цитотоксичности в клетках СЕМ7. На ФИГ. 35 показан результат анализа интернализации и цитотоксичности для 3-х конечных модифицированных антител, и цитотоксичность оценивали на 3-й сутки после смешивания с антителами или конъюгатами (антитело к IgG человека)-сапорин.
На ФИГ. 36 показаны результаты выстраивания аминокислотных последовательностей самых лучших клонов из 2 раунда и 3 раунда, которые представляют собой сравнение аминокислотных последовательностей родительского клона и более гуманизированного клона, соответственно. Среди них, 153-28 происходит из 36-10 Q6R, а 257-10 происходит из 45-37. CDR представлены жирным и подчеркнутым шрифтами.
ФИГ. 37а представляет график, показывающий с использованием проточной цитометрии уровень связывания основного кандидата ART140 с IgG в JL1-положительных СЕМ7 клетках, а ФИГ. 37b представляет график, показывающий результат в группе отрицательного контроля, в U937 клетках.
ФИГ. 38а представляет график, показывающий уровень связывания основного кандидата с IgG в JL1-положительных СЕМ7 клетках с использованием клеточного ELISA (живых клеток в суспензии), а ФИГ. 38b представляет график, показывающий результат в группе отрицательного контроля, в U937 клетках.
ФИГ. 39а представляет график, показывающий уровень связывания группы основных кандидатов и IgG, имеющих мутации, внесенные с применением набора QuikChange, с JL1-положительными СЕМ клетками с использованием проточной цитометрии, а ФИГ. 39b представляет график, показывающий результат в группе отрицательного контроля, в U937 клетках.
ФИГ. 40а-40с представляют графики, показывающие уровень связывания IgG, имеющего мутации, внесенные с применением набора QuikChange, с JL1-положительными СЕМ клетками с использованием проточной цитометрии.
ФИГ. 41а-41с представляют графики, показывающие результат подтверждения того, что IgG, имеющий мутации, внесенные с применением набора QuikChange, связывается с JL1 -положительными СЕМ7 клетками с использованием клеточного ELISA (живых клеток в суспензии).
ФИГ. 42 представляет график, показывающий активность химерного антитела DNP001 в отношении связывания с эпитопом.
На ФИГ. 43 иллюстративно показаны аминокислоты гликан-содержащего участка в вариабельной области легкой цепи, где должна быть произведена замена с целью получения антитела с вариацией, в котором аминокислотные остатки гликан-содержащего участка гуманизированного антитела делетированы.
На ФИГ. 44 показан результат вестерн-блоттинга вариантов с использованием связывания конъюгата (конкавалин A)-HRP (пероксидаза хрена) с гликан-содержащим участком для антитела с вариацией, в котором аминокислотные остатки гликан-содержащего участка гуманизированного антитела делетированы.
ФИГ. 45 представляет график, показывающий связывающую способность антитела с вариацией, в котором аминокислотные остатки гликан-содержащего участка гуманизированного антитела делетированы.
ФИГ. 46 представляет график, показывающий способность химерного антитела к CD43 и гуманизированного антитела к CD43, в которых аминокислотные остатки гликан-содержащего участка делетированы, связываться с антиген(CD43)-положительной клеткой, СЕМ7 клеткой.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВОПЛОЩЕНИЙ
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно на примерах, но эти примеры приводятся только для иллюстративной цели и не предназначены для ограничения объема данного изобретения. Специалисту в данной области техники очевидно, что описанные ниже примеры могут быть модифицированы без отклонения от сущности изобретения.
Пример 1. Получение антител к CD43
1-1. Получение мышиных антител
1-1-1. Получение клеток, продуцирующих моноклональные антитела
Данные клетки получали посредством слияния спленоцитов белой мыши Balb/c, в которую вводили тимоциты человека в качестве антигена, и клеточной линии миеломы SP2/0-Ag14 (АТСС (Американская коллекция типовых культур), CRL-1581) из устойчивой к 8-азагуанину мыши.
Тимоциты человека (госпиталь Сеульского Национального университета) в количестве 107 клеток вводили внутрибрюшинной инъекцией белой мыши Balb/c один раз в 2 недели в течение 6 недель для индуцирования иммунного ответа и через 3 суток после последнего дополнительного введения селезенку извлекали для приготовления клеточной суспензии. Слияние клеток в количестве 108 спленоцитов и 107 клеток миеломы проводили согласно методу Koeler & Milstein (1975), используя полиэтиленгликоль 400. После проведения слияния клетки промывали и затем суспендировали в культуральном растворе на основе DMEM (модифицированная по Дульбекко среда Игла), дополненном 100 мкМ гипоксантином, 0,44 мкМ аминоптерином и 16 мкМ тимидином (в культуральном растворе HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин)), в 96-луночный планшет вносили аликвоты суспензии клеток и культивировали в культуральной среде, в которой поддерживали 37°C, 5% CO2.
Когда через 2 недели наблюдали образование колоний, собирали супернатант и измеряли титр антител с использованием иммуногистохимического окрашивания и проточной цитометрии.
Положительная группа соответствовала случаю, когда в одной лунке образовывалось 105 или более клеток. Собирали клетки с высоким титром моноклональных антител, отбирая клетки из тех лунок, в которых образовывались колонии с высоким титром антител в супернатанте, и субклонировали в соответствии с методом предельного разведения. Для проведения последующих экспериментов отбирали и хранили супернатант из культивируемой суспензии клеток, продуцирующих моноклональные антитела.
1-1-2. Скрининг клеток, продуцирующих моноклональные антитела к белкам клеточной поверхности тимоцитов
Перед использованием готовили срезы замороженных образцов тканей тимуса (госпиталь Сеульского Национального университета) и залитых парафином образцов тканей (госпиталь Сеульского Национального университета) толщиной 4 микрометра.
После проведения процесса удаления парафина и последующего добавления нормальной сыворотки крови козы (продукта компании BioGenex) залитые парафином образцы тканей оставляли стоять в течение 1 ч при комнатной температуре. После добавления каждого из первичных антител (Dinona) к образцам тканей и последующего их выдерживания в холодной камере при 4°C в течение ночи для осуществления взаимодействия на следующий день их промывали 3 раза забуференным фосфатом физиологическим раствором. Их инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с биотинилированными антителами козы к иммуноглобулину мыши (2 капли, DAKO) в качестве вторичного антитела, затем промывали 3 раза забуференным фосфатом физиологическим раствором и обрабатывали конъюгатом стрептавидин-HRP. После добавления раствора Н2О2-аминоэтилкарбазола (20 мин) их промывали 3 раза забуференным фосфатом физиологическим раствором и развитие окраски наблюдали с использованием оптического микроскопа.
В результате этого оказалось возможным отобрать клеточную линию H-JL1, продуцирующую моноклональные антитела, которые специфически взаимодействуют только с тимоцитами человека. Полученная клеточная линия была передана в Корейский исследовательский фонд клеточных линий (KCLRF), расположенный по адресу Yeongeon-dong, Jongno-gu, Сеул, Корея, 13 января 1997 года, и ей присвоен номер доступа KCLRF-ВР-00010.
Проводили иммуногистохимическое окрашивание образцов тканей тимуса, используя супернатант отобранной клеточной линии, продуцирующей моноклональные антитела, и получили подтверждение тому, что тимоциты окрашивались положительно (ФИГ. 10). Помимо этого положительно окрашенные тимоциты демонстрировали свойство сильно окрашиваться на периферии клетки, и тем самым было продемонстрировано, что данная клеточная линия продуцировала моноклональные антитела к белку клеточной поверхности.
Чтобы подтвердить реакцию антитела на стадиях развития тимоцитов, применяли проточную цитометрию. Образец тимуса человека, извлеченный при операции на сердце, разрезали на небольшие фрагменты, растирали с использованием предметного стекла и собирали тимоциты. После взаимодействия антител (1*105 клеток/антитело в концентрации 10 мкг/мл) в течение 30 мин при 4°C с выделенными тимоцитами выполняли промывку холодным забуференным фосфатом физиологическим раствором и проводили взаимодействие с FITC (флуоресцеинизотиоцианат)-связанными антителами козы к иммуноглобулину мыши (Jackson ImmunoResearch) в течение 30 мин при 4°C.
Далее выполняли промывку холодным забуференным фосфатом физиологическим раствором, добавляли РЕ(фикоэритрин)-связанные антитела к CD8 (BD Bioscience) и АРС-связанные антитела к CD4 (BD Bioscience), и те и другие по 5 мкл, и проводили взаимодействие в течение 30 мин при 4°C. Выполняли промывку холодным забуференным фосфатом физиологическим раствором и проводили проточную цитометрию, используя FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Тимоциты классифицировали на CD4-CD8- тимоциты →CD4+CD8+тимоциты→CD4+CD8- или CD4-CD8+ тимоциты в зависимости от показателя экспрессии CD4 и CD8, и данные антитела взаимодействовали со всеми 4 разновидностями тимоцитов, но особенно сильно они взаимодействовали с CD4+CD8+ тимоцитами (см. ФИГ. 11). Серая область на ФИГ. 11 относится к группе с отрицательным контролем, а площадь, ограниченная сплошной линией, относится к графику, отражающему окрашивание с использованием отобранных антител.
1-1-3. Получение моноклональных антител из отобранной клеточной линии, продуцирующей моноклональные антитела
Мышам Balb/c заранее за 3 недели вводили внутрибрюшинной инъекцией 0,5 мл пристана; 107 клеток, продуцирующих моноклональные антитела культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, вводили этим мышам в брюшную полость, а затем через 2-3 недели проводили отбор мышей hydrops abdominis. Из hydrops abdominis получали антитела в высокой концентрации 5-10 мг/мл.
Для очистки антител из hydrops abdominis проводили хроматографию на Q-сефарозе (продукте Pharmacia) и гидроксиапатите (Bio-gel НТР Gel, продукте Pharmacia). Добавляли 3,14 г сульфата аммония ((NH4)2SO4) на 10 мл hydrops abdominis и медленно растворяли на льду (осаждение 50%-ным (NH4)2SO4). Эту смесь центрифугировали при 15000 об/мин в течение 30 мин, осадок растворяли в деионизованной воде и затем диализовали против 1 л буферного раствора (20 мМ фосфата, рН 7,4).
Этот раствор пропускали через колонку с Q-сефарозой, предварительно уравновешенной буферным раствором (20 мМ фосфатом, рН 7,4), выполняя адсорбцию, затем пропускали раствор NaCl с линейным градиентом концентрации от 0 М до 0,8 М, используя буферный раствор I (20 мМ фосфат, рН 7,4) и буферный раствор II (20 мМ фосфат; 0,5 М NaCl, рН 7,4), и получали элюаты. Каждая собранная фракция представляла собой фракцию, содержащую большое количество антител по данным 15% SDS-PAGE (электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия). Фракции диализовали против буферного раствора (20 мМ фосфата, рН 6,8), адсорбировали, пропуская через колонку с гидроксиапатитом, предварительно уравновешенным буферным раствором (20 мМ фосфатом, рН 6,8), и затем пропускали раствор фосфата с линейным градиентом концентрации от 0 М до 0,3 М, используя буферный раствор III (20 мМ фосфат, рН 6,8) и буферный раствор IV (300 мМ фосфат, рН 6,8), и получали элюаты. Собирали только фракции, содержащие антитела с чистотой 95% или больше по данным 15% SDS-PAGE. В результате данного эксперимента можно было собрать 5-10 мг моноклональных антител из расчета на 1 мл hydrops abdominis.
Полученное антитело обозначили как YG5.
1-1-4. Анализ эпитопа CD43
Конструирование структуры, содержащей частичный фрагмент CD43
Как показано на ФИГ. 12, конструировали каждый из делеционных мутантов CD43, тестировали реакционную способность антитела YG5 в отношении таких делеционных мутантов и проводили анализ в отношении эпитопа CD43. Белок CD43 (№ доступа в NCBI М61827.1) состоял в общей сложности из 400 аминокислот, и последовательность аминокислот от №1 до №19 представляла собой сигнальную последовательность, последовательность аминокислот от №20 до №254 представляла собой внеклеточный домен, последовательность аминокислот от №255 до №277 представляла собой трансмембранный домен, а последовательность аминокислот от №278 до №400 представляла собой внутриклеточный домен.
После конструирования структуры ДНК, в которой каждый делеционный мутант экспрессировался на С-конце глутатион-S-трансферазы (GST), ее встраивали в вектор pGEX-2T (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ). Далее, вектору, содержащему последовательность, соответствующую аминокислотам от №1 до №253 в белке CD43, дали название pGEX1-253, вектору, содержащему последовательность, соответствующую аминокислотам от №1 до №87, дали название pGEX1-87, вектору, содержащему последовательность, соответствующую аминокислотам от №1 до №81 в белке CD43, дали название pGEX1-81, вектору, содержащему последовательность, соответствующую аминокислотам от №11 до №75 в белке CD43, дали название GEX1-75, вектору, содержащему последовательность, соответствующую аминокислотам от №1 до №70 белка CD43, дали название pGEX1-70, вектору, содержащему последовательность, соответствующую аминокислотам от №70 до №98 в белке CD43, дали название pGEX70-98, и векторам pGEX71-81, pGEX76-81, pGEX73-81 и pGEX73-80 дали названия по тому же принципу, что и выше.
Последовательность, кодирующую делеционный мутант, амплифицировали на основе кДНК CD43 человека, ПЦР праймеры конструировали на основе последовательности из Genebank и вводили сайты для ферментов рестрикции BamHI/EcoRI или BamHI/BglII. Продукты ПЦР «разрезали», используя BamHI/EcoRI или BamHI/BglII, встраивали в pGEX-2T по тому же самому сайту для фермента рестрикции и затем осуществляли трансформацию компетентных клеток Е. coli TOP10F' (F' [lacIq, Tn10(TetR)], mcrA, D(mrr-hsdRMS-mcrBC), 80lacZDM15, lacX74, deoR, recA1, araD139 D(ara-leu)7697, galK, rpsL(StrR), endA1, nupG). Последовательность трансформантов анализировали, вновь подтверждая тем самым последовательность делеционных мутантов.
Экспрессия слитого белка GST-делеционный мутант CD43
Трансформированные клетки Е. coli ТОР10 культивировали при 37°C в лизогенной среде (LB), в которую добавляли ампициллин в концентрации 50 мкг/мл, в течение ночи, культивируемые клетки разбавляли в 20 раз средой LB и затем их культивировали в течение 3-4 часов до достижения OD (оптическая плотность) 0,6. В культивируемые смеси добавляли IPTG (изопропилтиогалактозид) (Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) в конечной концентрации 1 мМ, проводили их культивирование в течение еще 4 часов и затем центрифугирование при 6000 об/мин в течение 15 мин. После сбора клеток только в клетки, которые суспендировали с 3 мл буферного раствора для лизиса (50 мМ трис, рН 8,0; 1 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), 100 мМ NaCl) из расчета на 1 г клеток, добавляли фенилметилсульфонилфторид в конечной концентрации 0,2 мМ (Sigma Chemical Co.) и затем помещали на лед на 30 мин.
Анализ эпитопа CD43
После того как лизаты каждого из трансформантов, экспрессирующих в общей сложности 11 разновидностей делеционных мутантов, были подвергнуты 10% SDS-PAGE, проводили вестерн-блоттинг с использованием антитела YG5 и антитела к GST, соответственно.
ФИГ. 13 представляет результаты вестерн-блоттинга, подтверждающие реакционную способность антитела YG5 в отношении 11 разновидностей делеционных мутантов, где А относится к случаю использования антитела YG5, а В относится к случаю использования антитела к GST. Помимо этого, дорожка 1 соответствовала pGEX1-253, дорожка 2 соответствовала pGEX1-98, дорожка 3 соответствовала pGEX1-87, дорожка 4 соответствовала pGEX1-81, дорожка 5 соответствовала pGEX1-75, дорожка 6 соответствовала pGEX1-70, дорожка 7 соответствовала pGEX70-98, дорожка 8 соответствовала pGEX71-81, дорожка 9 соответствовала pGEX73-81, дорожка 10 соответствовала pGEX76-81, дорожка 11 соответствовала pGEX73-80, дорожка 12 соответствовала pGEX-2T, и дорожка 13 соответствовала тимоцитам человека. Как показано на ФИГ. 13, минимальной единицей делеционного мутанта, обладающего реакционной способностью в отношении антитела YG5, является pGEX73-81, и тем самым было продемонстрировано, что антигенная детерминанта CD43 представляла собой последовательность аминокислот от №73 до №81 (Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile; SEQ ID NO: 4).
В итоге, в данных примерах продемонстрировано, что YG5 непосредственно распознавало последовательность аминокислот от №73 до №81, но не углеводный компонент гликопротеина CD43, что отличается от других традиционных антител. Эта последовательность экспонирована главным образом в клетках-предшественниках лимфоцитов и в тимоцитах на стадиях развития гемобластов, и поэтому антитело YG5 распознавало ее, и она экранируется в результате гликозилирования или структурных изменений вблизи последовательности аминокислот от №73 до №81 в гематопоэтических стволовых клетках, но не в зрелых лейкоцитах и тромбоцитах, и поэтому в этих случаях антитело YG5 не могло распознавать ее.
1-2. Получение химерных антител
На основании аминокислотной последовательности сконструированного анти-CD43 мышиного антитела YG5 получали химерное антитело к CD43.
1-2-1. Получение плазмид
Чтобы осуществить экспрессию химерных антител к CD43, создавали плазмиду для экспрессии тяжелой цепи и экспрессии легкой цепи, соответственно. В качестве плазмиды для экспрессии тяжелой цепи использовали вектор pOptiVEC (компании Invitrogen), а в качестве плазмиды для экспрессии легкой цепи использовали вектор pcDNA3.3 (компании Invitrogen). Чтобы осуществить экспрессию антител, клонировали кДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, используя наборы Ig-Primer (компании Novagen), встраивали ее в вектор pGem-T (компании Promega) и затем подтверждали последовательность ДНК путем секвенирования, а последовательность гена мышиного антитела подтверждали, используя сайт IMGT (Иммуногенетика) (www.imgt.org).
Чтобы осуществить экспрессию кДНК, кодирующей вариабельную область, и кДНК, кодирующей константную область, для каждого антитела в виде последовательности следующих друг за другом аминокислот без вставки дополнительной аминокислоты, синтезировали (Bioneer Inc.) фрагменты гена, в которые входили последовательность, кодирующая клонированную вариабельную область, соединенную с известной константной областью (тяжелой цепи), и последовательность, кодирующая каппа-константную область (легкой цепи) IgG1 человека, соответственно. Затем гены, экспрессирующие тяжелую цепь и легкую цепь, синтезированные как указано выше, «разрезали», используя ферменты рестрикции Xho I и Sal I, фрагмент гена тяжелой цепи лигировали в вектор pOptiVec, а фрагмент гена легкой цепи лигировали в вектор pcDNA3.3, соответственно, конструируя тем самым полную плазмиду для экспрессии антитела (плазмиду pcDNA3.3 для экспрессии легкой цепи антитела к CD43 и плазмиду pOptiVEC для экспрессии тяжелой цепи антитела к CD43). Способ конструирования плазмид для экспрессии тяжелой цепи и легкой цепи схематично показан на ФИГ. 14.
2-1-2. Трансформация
Процесс трансформации осуществляли посредством трансфекции плазмиды pcDNA3.3, сконструированной для экспрессии легкой цепи антитела к CD43, и плазмиды pOptiVEC, сконструированной для экспрессии тяжелой цепи антитела к CD43, в клетки DG44 (Invitrogen), имеющие происхождение из СНО.
Сначала, за 3 суток до осуществления трансфекции, суспендированные клетки DG44 адаптировали к среде МЕМα (минимальная поддерживающая среда в альфа-модификации), содержащей 5% FBS (фетальная телячья сыворотка), тем самым превращая их в адсорбированные клетки, адаптированные для повышения эффективности трансфекции. Трансфекцию проводили в 6-луночном планшете, используя реагент для трансфекции Effectene (компании QIAGEN). Адаптированные клетки DG44 пересевали в количестве 1×105 клеток/лунка за одни сутки до проведения трансфекции и использовали одно и то же количество ДНК, составляющее 2 мкг, в случае как плазмиды pcDNA3.3 для экспрессии легкой цепи антитела к CD43, так и плазмиды pOptiVEC для экспрессии тяжелой цепи антитела к CD43. Трансфекцию проводили в течение 48 часов. Для отбора группы трансфицированных клеток использовали проточный цитометр и проводили иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA), в результате были отобраны два клона Е №4, Е №5. Отобранную группу клеток культивировали в селективной среде МЕМα, содержащей 5% диализованной фетальной телячьей сыворотки, 30 нМ метотрексат (МТХ) и G418 (генетицин) в концентрации 400 мкг/мл, и концентрацию МТХ и G418 постепенно повышали для отбора группы трансформированных клеток.
2-1-3. Культура трансформированных клеток и очистка антител
Отобранную выше группу трансфицированных клеток (24,0×105 клеток/мл или больше, жизнеспособность (%) 90% или больше) культивировали до достижения уровня экспрессии 600 мг/л (в соответствии со стандартом IPC (контроль в ходе технологического процесса)) в среде PowerCHO-2 CDM (Lonza; конечное количество среды 880 л) в условиях 37°C и 5% CO2.
По окончании процесса осветления суспензии клеток (с использованием POD фильтра (1,1/0,2 мкм)) после сбора 800 л культивируемого раствора, полученного как приведено выше, антитела очищали, применяя 3-стадийный процесс с использованием колонок (для аффинной хроматографии на иммобилизованном белке А (неподвижная фаза: белок А; уравновешивающий буферный раствор: 50 мМ фосфат натрия, 50 мМ хлорид натрия, рН 7,5, элюирующий буферный раствор: 20 мМ цитрат натрия, рН 3,0); для катионообменной хроматографии (неподвижная фаза: SP FF (сульфопропилсефароза быстрого протекания); уравновешивающий буферный раствор: 20 мМ цитрат натрия, рН 5,5; элюирующий буферный раствор: 20 мМ цитрат натрия, 150 мМ, хлорид натрия, рН 6,1); для анионообменной хроматографии (неподвижная фаза: Q FF (Q Сефароза FF), уравновешивающий буферный раствор: 20 мМ цитрат натрия, рН 6,5)).
Условия хроматографии приведены ниже:
Состав конечной неочищенной жидкости окончательно устанавливали, выполняя одновременного процессы смены буфера и концентрирования методом ультрафильтрации/диафильтрации (UF/DF), и конечную концентрацию белка доводили до 11,5 мг/мл.
Химерное антитело к CD43 получали описанным выше способом и обозначили его как DNP001.
2-1-4. Подтверждение способности химерного антитела связываться с эпитоп-содержащим участком
Для подтверждения того, что полученное химерное антитело DNP001 (имеющее тот же участок CDR, что и мышиное антитело) связывается с тем же эпитопом, что и мышиное антитело, синтезированный содержащий эпитоп пептид объединяли химическим путем с белком бычьим сывороточным альбумином (BSA) и затем проводили ELISA.
- последовательность содержащего эпитоп синтетического пептида (обозначенного как DN2):
EGSPLWTSIGASTGSC (SEQ ID NO: 129; эпитоп отмечен подчеркиванием).
Конъюгат (пептид DN2)-BSA получали путем конъюгирования синтезированного пептида DN2 с белком BSA через линкер EDC (N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид). При этом молярное соотношение пептид : белок BSA составляло 15:1.
После нанесения на поверхность лунок раствора полученного конъюгата (пептид DN2)-BSA из расчета 50 мкг/мл на одну лунку проводили инкубирование с ним химерного антитела DNP001 в различных градиентных концентрациях. Далее осуществляли детектирование антитела, связавшегося с конъюгатом, измеряя реакционную способность химерного антитела в отношении конъюгата (пептид DN2)-BSA. Связавшееся антитело детектировали с использованием конъюгированного с HRP антитела к Ig человека ((антитело к Ig человека)-HRP), измеряли значения OD при 450 нм, и эти значения представлены в приведенной далее Таблице и на ФИГ. 42.
Результаты, показанные в Таблице и на ФИГ. 42, продемонстрировали, что химерное антитело DNP001 связывалось с содержащим эпитоп пептидом зависимым от концентрации образом.
Пример 2. Исследование уровня экспрессии эпитопа CD43 в линиях клеток солидного рака человека
Чтобы исследовать уровень экспрессии CD43 в различных линиях клеток солидного рака, проводили иммуноокрашивание и проточную цитометрию.
Информация относительно клеточных линий, использованных для анализа, приведена ниже.
Конкретно, каждую из клеточных линий инокулировали и культивировали в 100 мм контейнере для клеточных культур, и когда культивируемые клетки занимали приблизительно 70-80% поверхности, эти культивируемые клетки промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором и затем обрабатывали раствором трипсина в EDTA (Invitrogen), отделяли и далее центрифугировали. Осажденные клетки снова суспендировали в буферном растворе, отбирали аликвоты по 1×105 каждая, добавляли по 1,5 мкл раствора конъюгированных с фикоэритрином (РЕ) антител к CD43 (YG5), полученных в примере 1-1, и проводили взаимодействие в холодильнике при 4°C в течение 20 мин. После проведения взаимодействия при 4°C в течение 20 мин клетки снова промывали, используя 4 мл буферного раствора (1× забуференного фосфатом физиологического раствора, PBS буфера), затем анализировали с применением проточного цитометра (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA). Для сравнения этот же тест проводили с использованием антитела DFT-1 (2 мкл, Ancell Corporation) вместо антитела к CD43.
Полученные результаты показаны на ФИГ. 1 и ФИГ. 2а-2с. На ФИГ. 1 по оси X показан уровень экспресии антигена CD43, который взаимодействует с антителом YG5 в анализируемой клеточной линии, а по оси Y указаны подсчитанные количества клеток (количества). Как показано на ФИГ. 1 и ФИГ. 2а-2с, в случае аденокарциномы прямой кишки по Дуке, типа В (LS174T) был продемонстрирован уровень экспрессии приблизительно 60%, в случае НСТ116, НТ29 был продемонстрирован уровень экспрессии приблизительно 50, 37%, и факт экспрессии CD43 (эпитопа) подтверждали в случае других разновидностей линий клеток солидного рака.
Пример 3. Тестирование цитотоксичности антитела к CD43 в отношении раковых клеток (in vitro)
3-1. Получение конъюгата антитело-токсин
Конъюгирование сапорина (Sigma, St. Louis, МО) с моноклональным антителом проводили в соответствии с традиционным способом (Polito et al., 2004). После растворения антитела (DNP001; полученного в примере 1-2) и сапорина в концентрации 2 мг/мл (концентрация антитела) и 8 мг/мл (концентрация сапорина), соответственно, в 50 мМ натрийборатном буфере (рН 9,0) проводили обработку 2-иминотиоланом (Sigma) в концентрации 0,4 мМ и 1,0 мМ, соответственно. Потом антитела и сапорин смешивали в соотношении 10:1, проводили взаимодействие при комнатной температуре в течение 16 часов и конъюгат антитело-сапорин очищали гельфильтрацией. Далее, полученный конъюгат описывали как конъюгат (антитело к CD43)-сапорин.
Руководствуясь описанным выше способом, получали конъюгат (антитело к CD43)-MMAE, который готовили конъюгированием антитела к CD43 (DNP001; полученное в примере 1-2) и монометилауристатина Е (ММАЕ; Creative Biolabs), конъюгат (антитело к CD43)-DM1, который готовили конъюгированием антитела к CD43 (DNP001) и N2'-диацетил-N2'-(3-меркапто-1-оксопропил)майтанзина (DM1; The Chemistry Research Solution LLC), и конъюгат (антитело к CD43)-дуокармицин, который готовили конъюгированием антитела к CD43 (DNP001) и дуокармицина (The Chemistry Research Solution LLC), и конъюгат (антитело к CD43 (DNP001))-DM1, соответственно.
3-2. Цитотоксичность конъюгатов (антитело к CD43)-токсин в отношении клеток рака желудка
Тестировали цитотоксичность конъюгатов антитело-токсин, полученных в примере 3-1 (конъюгата (антитело к CD43)-сапорин, конъюгата (антитело к CD43)-DM1, конъюгата (антитело к CD43)-MMAE и конъюгата (антитело к CD43)-дуокармицин), в отношении клеток рака желудка.
За сутки до проведения тестирования линии клеток рака желудка NCI-N87, AGS и SNU719, соответственно, высевали в количестве 4×103 из расчета на одну лунку. Каждым конъюгатом антитело-токсин в концентрации 10000 нг/мл (в случае конъюгата (антитело к CD43)-MMAE и конъюгата (антитело к CD43)-DM1) или 1000 нг/мл (в случае конъюгата (антитело к CD43)-дуокармицин) обрабатывали каждую клеточную линию рака желудка. После этого, через 24 часа, 48 часов и 72 часа в каждую лунку добавляли по 10 мкл EzCytox (Daeil lab, Korea), клетки культивировали в контейнере с CO2 при 37°C и затем измеряли их жизнеспособность с использованием микроспектрофотометрии.
Цитотоксичность каждого полученного конъюгата показана на ФИГ. 3 (конъюгата (антитело к CD43)-MMAE), на ФИГ. 4 (конъюгата (антитело к CD43)-DM1) и на ФИГ. 5 (конъюгата (антитело к CD43)-дуокармицин). Цитотоксичность рассчитывали в соответствии со следующим уравнением:
цитотоксичность (%)=[1 - (число выживших клеток/исходное число клеток)] × 100.
Показаные на ФИГ. 3, 4 и 5 результаты подтвердили, что конъюгат (антитело к CD43)-DM1 и конъюгат (антитело к CD43)-MMAE продемонстрировали цитотоксичность в отношении всех 3 разновидностей клеточных линий, а конъюгат (антитело к CD43)-дуокармицин продемонстрировал цитотоксичность в линиях NCI-N87 и AGS.
Пример 4. Тестирование противоракового эффекта антител к CD43 в животной модели (in vivo)
4-1. Подготовка животной модели рака желудка (онкогенеза)
Модель рака желудка готовили, используя клеточные линии, осуществление экспрессии CD43 в которых было подтверждено данными из примера 2 (NCI-N87; АТСС, CRL-5822). Сначала получали 2,8×107 клеток NCI-N87. Полученные клетки подкожно инокулировали в количестве 5×106 клеток/100 мкл (среды от Мемориального института Розуэлла Парка (RPMI)) в правый бок бестимусных мышей. Подвергнутых инокуляции бестимусных мышей распределяли в контрольную группу (с введением PBS) и тестируемую группу и, через 3 суток после инокулирования раковых клеток, вводили 2 раза в неделю в течение 3 недель в хвостовую вену антитела к CD43 (DNP001), полученные в примере 1-2, в количестве 12 мг/кг, или внутрибрюшинной инъекцией один раз в неделю в течение 3 недель вводили конъюгат (антитело к CD43)-дуокармицин (DNP001-дуокармицин), полученный в примере 3-1, в количестве 0,2 мг/кг. Размер опухоли измеряли перед введением терапевтического агента 2 раза в неделю и размер опухоли рассчитывали в соответствии со следующим уравнением:
размер опухоли (мм3)=(основная ось×минорная ось2)/2.
Полученный результат показан на ФИГ. 6. Как показано на ФИГ. 6, было подтверждено, что рост опухоли начинал подвергаться ингибированию в группе с введением конъюгата DNP001-дуокармицин (D-Duo) по сравнению с контрольной группой на 7-е сутки после начала тестирования. Через 26 суток после начала тестирования средние размеры опухолей у мышей, которым вводили конъюгат DNP001-дуокармицин, только антитело DNP001 и только PBS, составляли 447,2 мм3, 510,9 мм3 и 784,6 мм3, соответственно. В случае групп, которым вводили конъюгат (антитело к CD43)-дуокармицин и антитело к CD43, рост опухоли подавлялся приблизительно на 43% и 34%, соответственно, по сравнению с контрольной группой. Этот результат демонстрировал значительный ингибирующий эффект, оказываемый на развитие рака желудка антителом к CD43 как таковым и конъюгатом (антитело к CD43)-дуокармицин.
Пример 5. Исследование распределения CD43 в пораженных солидным раком тканях человека
Помимо рака желудка, для подтверждения экспрессии CD43 и возможности тестирования терапевтической эффективности в случае различных видов солидного рака (рака желудка, перстневидноклеточного рака желудка, рака молочной железы, инфильтрующей протоковой аденокарциномы среди других видов рака молочной железы, рака почки, рака поджелудочной железы, рака желчного пузыря, рака шейки матки, рака мочевого пузыря, гранулоцитарной саркомы) с направленным воздействием на CD43 проводили иммуногистохимическое исследование на различных опухолевых тканях человека.
Иммуногистохимическое окрашивание проводили в следующем порядке. В качестве пораженной солидным раком ткани использовали образец залитой парафином пораженной солидным раком ткани (госпиталь Национального университета Чхунбук). Сначала срезы залитой парафином пораженной солидным раком ткани подвергали процессу депарафинизации, обрабатывая 3 раза ксилолом, каждый раз в течение 10 мин, два раза 100%-ным спиртом, каждый раз в течение 5 мин, 80%-ным спиртом в течение 3 мин, 50%-ным спиртом в течение 1 мин, 20%-ным спиртом в течение 1 мин и затем дважды промывали водопроводной водой. Затем их вымачивали в 1×TBS (забуференный трисом физиологический раствор) в течение 10 мин. Чтобы регенерировать антиген в ткани, добавляли буфер на основе 10 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота, рН 8,0), выдерживали в микроволновой печи в течение 15 мин, быстро охлаждали в водопроводной воде и затем срезы вымачивали в 1×TBS в течение 20 мин. Эндогенную пероксидазу удаляли, используя смесь 0,1% Н2О2+100% метанола в течение 10 мин и дважды промывая водопроводной водой. Далее, чтобы исключить неспецифическое взаимодействие биотина и комплекса антиген-антитело, осуществляли процесс блокирования. Процесс блокирования проводили, добавляя 4 капли раствора биотина и проводя взаимодействие при комнатной температуре в течение 15 мин. После добавления к образцу ткани 4 капель раствора авидина (VECTOR Laboratories) проводили взаимодействие при комнатной температуре в течение 15 мин и затем выполняли промывку, используя 1×PBS.
Антитела к CD43 (YG5) (10 мкг/мл) и антитела DFT-1 (5 мкг/мл; контрольная группа; Ancell Corporation), полученные в примере 1-1, суспендировали в 150 мкл 1×TBS, чтобы затем нанести на образцы ткани, и проводили взаимодействие при комнатной температуре в течение 30 мин. После промывки с использованием 1×TBST (1×TBS+0,1% твина 20) 3 раза, каждый раз в течение 15 мин, на образцы ткани наносили каждый раз по 2 капли раствора вторичных антител (конъюгированных с HRP антител кролика к иммуноглобулину мыши; DAKO) и проводили взаимодействие при комнатной температуре в течение 30 мин. Далее, после промывки с использованием 1×TBST (1×TBS+0,1% твина 20) 3 раза, каждый раз в течение 15 мин, проводили реакцию с развитием окраски, используя DAB (диаминобензидин). После промывки с использованием 1×TBS два раза в течение 5 мин и контрастирующего окрашивания проводили промывку водопроводной водой. Затем, после проведения процесса дегидратации ткань закрепляли.
Полученный результат показан на ФИГ. 7 и ФИГ. 8 и в Таблице 1. Критерии определения положительного взаимодействия с CD43 в каждой ткани приведены ниже: отрицательный результат: 0; положительный результат: классифицированный в диапазоне от 1 до 3 баллов в соответствии с уровнем окрашивания YG5 в области опухоли.
(В Таблице 1:
«доля положительных результатов» означает численное значение, полученное путем деления числа тканей с положительным взаимодействием, без учета тканей с отрицательным взаимодействием, в которых не наблюдали окрашивания под действием YG5, на общее число тканей, пораженных соответствующим раком;
«всего» означает общее число тканей, использованных для окрашивания;
«число положительных результатов» означает число тканей, демонстрирующих положительное взаимодействие с YG5 среди использованных тканей, соответственно).
Как подтверждено в Таблице 1, на ФИГ. 7 и ФИГ. 8, было продемонстрировано, что CD43 экспрессировались в опухолях, которые встречаются главным образом в эпителиальных клетках, таких как рак желудка, перстневидноклеточный рак желудка, рак молочной железы, инфильтрующая протоковая аденокарцинома среди других видов рака молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак желчного пузыря, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, гранулоцитарная саркома и так далее.
Пример 6. Экспрессия CD43 в раковых стволовых клетках при раке желудка
Тестировали уровень экспрессии CD43 в раковых стволовых клетках различных опухолей. CD44 и CD133 (проминин-1) представляли собой общеизвестные маркеры раковых стволовых клеток. Для подтверждения экспрессии CD43 проводили трехкратное окрашивание на маркеры раковых стволовых клеток CD44 и CD 133, демонстрируя тем самым, что CD43 экспрессировался в положительной по CD44 или CD44+CD133+ группе. Вносили клетки NCI-N87 и культивировали в 100 мм контейнере для клеточных культур, и когда культивируемые клетки занимали приблизительно 70-80% поверхности, эти культивируемые клетки промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором и затем обрабатывали раствором трипсина в EDTA (Invitrogen), отделяли и далее центрифугировали. Осажденные клетки снова суспендировали в буферном растворе. После их взаимодействия с конъюгатом (антитело к CD44)-аллофикоцианин (АРС) (10 мкл, Miltenyi Biotec), конъюгатом (антитело к CD133)-флуоресцеинизотиоцианат (FITC) (10 мкл, Miltenyi Biotec) и конъюгатом антитела к CD43 (полученного в примере 1; YG5) и фикоэритрина (РЕ; 1,5 мкл, Dinona) в холодильнике при 4°C в течение 20 мин непрореагировавшие антитела отмывали и фиксировали 1%-ным параформальдегидом. Затем клетки анализировали с применением проточного цитометра (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA). Этот же тест проводили с использованием в качестве группы отрицательного контроля мышиного IgG1 вместо антитела к CD44 и антитела к CD133.
Полученный результат показан на ФИГ. 9.
Показанные на ФИГ. 9 данные, как результат подтверждения экспрессии CD43 в раковых стволовых клетках при раке желудка, свидетельствовали о том, что CD43 был положительным в тех клетках, в которых оказались положительными маркеры для различения раковых стволовых клеток при раке желудка (CD44 или CD133). Этот результат показал, что антитело к CD43 по настоящему изобретению может специфически связываться с CD43, экспрессируемым на поверхности раковых стволовых клеток при раке желудка.
Пример 7. Исследование экспрессии CD43 в стволовых клетках, пораженных солидным раком различного вида
Факт экспрессии CD43 в раковых стволовых клетках при CD43-положительном солидном раке, анализируемых в примере 5, подтверждали способом, аналогичным приведенному в примере 6.
Использовали клетки, имеющие происхождение из каждой CD43-положительной ткани, описанной в примере 5 (клеточные линии, происходящие из рака молочной железы, рака легкого, рака прямой кишки, рака печени и рака желчного пузыря, рака почки, рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, рака предстательной железы, рака шейки матки, рака мочевого пузыря). Каждую из клеточных линий инокулировали и культивировали в 100 мм контейнере для клеточных культур, и когда культивируемые клетки занимали приблизительно 70-80% поверхности, эти культивируемые клетки промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором и затем обрабатывали раствором трипсина в EDTA (Invitrogen), отделяли и далее центрифугировали. Осажденную клеточную массу снова суспендировали в буферном растворе и приводили во взаимодействие с разбавленными в 100 раз растворами конъюгатов (антитело к CD44)-аллофикоцианин (АРС), (антитело к CD44)-аллофикоцианин (АРС), (антитело к CD326 (ЕрСАМ (молекула адгезии эпителиальных клеток)))-аллофикоцианин (АРС), (антитело к CD133)-флуоресцеинизотиоцианат (FITC), (антитело к CD43)-фикоэритрин (РЕ) в холодильнике при 4°C в течение 20 мин. Непрореагировавшие антитела отмывали и фиксировали 1%-ным параформальдегидом и после этого клетки анализировали с применением проточного цитометра (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA).
Таким образом, результат подтверждения экспрессии CD43 в раковых стволовых клетках CD43-положительных тканей, происхождение которых указано в примере 5, свидетельствовал о том, что те клетки, которые были положительными по маркерам для различения каждой из раковых стволовых клеток (CD44, CD133 или ЕрСАМ), оказались положительными по CD43.
Пример 8. Тестирование экспрессии CD43 в раковых стволовых клетках из свежевыделенной пораженной раком ткани пациента
Основываясь на результате примера 5, тестировали экспрессию CD43 после классификации с использованием маркеров раковых стволовых клеток в пораженных раком тканях пациента.
Свежевыделенную пораженную раком ткань пациента микронизировали. Опухолевые клетки из микронизированной ткани центрифугировали при 1700 об/мин в течение 3 мин, затем супернатант удаляли, клетки ресуспендировали в 10 мл среды, содержащей 10% FBS, и затем центрифугировали при 1700 об./мин в течение 3 мин. Супернатант удаляли и клетки ресуспендировали, используя 10 мл 1×PBS, и затем подсчитывали. Клетки распределяли в пробирки для FACS, затем, после их взаимодействия с конъюгатами (антитело к CD44)-аллофикоцианин (АРС), (антитело к CD44)-аллофикоцианин (АРС), (антитело к CD326(ЕрСАМ))-аллофикоцианин (АРС), (антитело к CD133)-флуоресцеинизотиоцианат (FITC), (антитело к CD43)-фикоэритрин (РЕ) в холодильнике при 4°C в течение 20 мин, непрореагировавшие антитела отмывали и фиксировали 1%-ным параформальдегидом и после этого клетки анализировали с применением проточного цитометра (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA).
Так же как и выше, результат тестирования экспрессии CD43 в раковых стволовых клетках при раке желудка, в раковых стволовых клетках из пораженных раком тканей пациента, подтверждал, что раковые стволовые клетки, имеющие происхождение из пораженных раком тканей пациента, оказались положительными по CD43.
Пример 9. Ингибирование образования колоний раковых стволовых клеток под действием антитела к CD43 (in vitro)
В примере 6 было подтверждено, что образование колоний CD43-положительных стволовых клеток в CD43-положительной солидной опухоли, представленное в примере 5, ингибировалось антителами к CD43. Использовали клетки, имеющие происхождение из каждой CD43-положительной ткани, описанной в примере 5 (клеточные линии, происходящие из рака молочной железы, рака легкого, рака прямой кишки, рака печени и рака желчного пузыря, рака почки, рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, рака предстательной железы, рака шейки матки, рака мочевого пузыря). Вносили каждую из клеточных линий и культивировали в 100 мм контейнере для клеточных культур, и когда культивируемые клетки занимали приблизительно 70-80% поверхности, эти культивируемые клетки промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором и затем обрабатывали раствором трипсина в EDTA (Invitrogen), отделяли и далее центрифугировали. Осажденную клеточную массу снова суспендировали в буферном растворе, добавляли антитело к CD43 в концентрации 20 мкг/мл из расчета на 107 опухолевых клеток, взаимодействие проводили в холодильнике при 4°C в течение 20 мин и затем непрореагировавшее антитело отмывали 1×PBS. После добавления 20 мкл связанного с магнитными гранулами IgG проводили взаимодействие в холодильнике при 4°C в течение 15 мин, затем промывали 1×PBS и CD43-положительные клетки классифицировали с использованием системы разделения методом MACS (сортировка магнитно-активированных клеток).
После взаимодействия клеток, классифицированных как CD43-положительные клетки или CD43-отрицательные клетки, с конъюгатами (антитело к CD44)-аллофикоцианин (АРС), (антитело к CD326(ЕрСАМ))-аллофикоцианин (АРС), (антитело к CD133)-флуоресцеинизотиоцианат (FITC), (связанное с магнитными гранулами антитело)-фикоэритрин (РЕ, 20 мкл, Miltenyi Biotec) в холодильнике при 4°С в течение 15 мин осуществляли промывку и фиксацию 1%-ым параформальдегидом и затем проводили анализ с применением проточного цитометра (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA).
CD43-положительные клетки или CD43-отрицательные клетки, полученные в примерах, добавляли в количестве 5000 на одну лунку в лунки 6-луночных планшетов с сверхнизким прикреплением (Corning Inc., Corning, NY, USA), содержащие бессывороточные среды (с пенициллином G - 100 международных единиц (IU)/мл; стрептомицином - 100 мкг/мл, рекомбинантным эпидермальным ростовым фактором человека (hrEGF) - 20 нг/мл, рекомбинантным основным фактором роста фибробластов человека (hrbFGF) - 10 нг/мл, 2% добавки В27 без витамина А, 1% добавки N2 (Invitrogen, Carlsbad, СА, USA)). Затем добавляли антитела к CD43 и контрольные антитела в концентрации 100 мкг/мл для тех и других и осуществляли культивирование. Потом наблюдали за опухолевыми сферами. Такой же эксперимент проводили, классифицируя CD43-положительные клетки в свежевыделенных пораженных раком тканях пациента.
Таким образом, было подтверждено, что в результате введения антител к CD43 в CD43-положительные раковые стволовые клетки из различных опухолей и пораженных раком тканей пациента онкогенез раковых стволовых клеток ингибировался по сравнению с контрольной группой. Этот результат показал наличие значительного ингибирующего воздействия антител к CD43 на онкогенез раковых стволовых клеток.
Пример 10. Тестирование противоракового эффекта антител к CD43 в различных животных моделях рака (in vivo)
Животную модель создавали, используя клеточные линии, в которых экспрессия CD43 была подтверждена результатами примеров 7 и 8, и свежевыделенные пораженные раком ткани и способ были такими как в примере 4. Мышей случайным образом распределяли на контрольную группу (с введением PBS) и тестируемую группу и, через 3 суток после инокулирования раковых клеток, вводили 2 раза в неделю в течение 3 недель в хвостовую вену антитела к CD43 (mAb (моноклональные антитела) DNP001), полученные в примере 2, в количестве 8 мг/кг, или внутрибрюшинной инъекцией один раз в неделю в течение 3 недель вводили конъюгаты антитела к CD43 с сапорином, DM1, ММАЕ, дуокармицином, полученные в примере 3-1, в количестве 0,2 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 5 мг/кг.
Пример 11. Тестирование изменения способности связываться с нормальными клетками крови после обработки нейраминидазой
Проверяли, происходило ли изменение способности связываться с нормальными лимфоцитами в том случае, когда антитело (DFT-1), распознающее CD43, экспрессируемый в нормальной крови, и антитело к CD43 (YG5), распознающее опухолеспецифичный CD43, обрабатывали нейраминидазой.
У здоровых людей отбирали по 10 мл крови, в эти образцы крови добавляли по 40 мл раствора для лизиса эритроцитов (раствора для лизиса RBC; NH4Cl, NaHCO3, EDTA, рН 8,0) и осуществляли лизис при комнатной температуре в течение 10 мин. Кровь с лизированными эритроцитами центрифугировали при 1700 об/мин в течение 5 мин, затем супернатант удаляли и дважды промывали 10 мл PBS. Лимфоциты в количестве 3*106 суспендировали в 130 мкл полученного выше раствора для лизиса эритроцитов и добавляли 50 мкл раствора нейраминидазы (ELPIS, Korea) и 20 мкл буфера. И далее осуществляли взаимодействие с клетками при 37°C в течение 50 мин и проводили промывку, используя PBS. Чтобы удостовериться, что под действием нейраминидазы происходило изменение эпитопа CD43, распознаваемого антителом, к клеткам добавляли связанные с FITC и РЕ антитела DFT-1 и YG5 и после взаимодействия при 4°C в течение 15 мин клетки далее промывали 4 мл PBS. Затем проводили анализ клеток с применением проточной цитометрии и определяли титр нормальных лимфоцитов.
Результат, подтверждающий значения титров для двух полученных выше антител к CD43 (DFT-1 и YG5), показан на ФИГ. 15. Как показано на ФИГ. 15, было подтверждено, что DFT-1 демонстрировало высокое значение титра до обработки нейраминидазой, но не после обработки нейраминидазой, в то время как YG5 не демонстрировало никакого титра до обработки нейраминидазой, но показало титр 16,16% после обработки нейраминидазой. Таким образом, было подтверждено, что антитело к CD43 (YG5) по настоящему изобретению не распознавало сиалированный эпитоп белка CD43, и это означало, что антитело к CD43 по настоящему изобретению не связывалось с нормальными клетками и специфически связывалось с раковыми клетками, в частности, раковыми стволовыми клетками.
Пример 12. Тестирование перекрестной реактивности в отношении СЕАСАМ5 и СЕАСАМ6
Известно, что клон 5F1, распознающий белок CD43, распознает одновременно и CD43, и CEACAM6 и связывается с фукозилированным сайтом этих двух белков. Было установлено, что данное антитело к CD43 демонстрировало перекрестную реактивность по отношению к СЕАСАМ5 и CEACAM6, а также обнаружено изменение связывающей способности антитела к CD43 в результате изменения характера гликозилирования эпитопа CD43 под действием кифунензина и фукозидазы.
В планшет MaxiSorp для ELISA добавляли рекомбинантные белки rCEACAM5-hFC (Sinobiologics, № по каталогу: 11077-Н03Н-50) и rCEACAM6-hFC (Dinona Inc.) по 200 мкл на одну лунку и проводили взаимодействие при 37°C в течение 1 часа, тем самым осуществляя блокирование. В лунки, покрытые белками rCEACAM5-hFC и rCEACAM6-hFC, добавляли IgG1 и моноклональные антитела YG5, DFT-1, 9А6 или 8F5 (8F5: Biomaterials, 2015 Oct, 67, 32-41, 9А6: SantaCruz Biotechnology, № по каталогу: SC-59899) в количестве 100 нг на одну лунку, соответственно, проводили взаимодействие при 37°C в течение 1 часа и затем промывали PBS для удаления несвязавшихся антител. После этого добавляли разбавленные конъюгированные с HRP антитела козы к IgG мыши (Jackson) и проводили взаимодействие в течение 30 мин, затем промывали PBS, добавляли раствор ТМВ (тетраметилбензидин) в объеме 50 мкл на одну лунку и проводили взаимодействие в течение 10 мин, затем добавляли 50 мкл серной кислоты для остановки реакции и измеряли поглощение при 450 нм.
Полученный результат показан на ФИГ. 16. Как показано на ФИГ. 16, было продемонстрировано, что антитело к CD43 (YG5) обладало слабой реакционной способностью в отношении рекомбинантных белков СЕАСАМ5 и CEACAM6.
Кроме того, не было обнаружено никакого изменения в отношении способности антитела к CD43 связываться с обработанными фукозидазой и кифунензином клетками СЕМ7 (клетками, отобранными как имеющие более высокий, на 50% или больше, уровень экспрессии CD43 на поверхности клеток по сравнению с исходными клетками посредством культивирования клеток CCRF-CEM методом культирования из одной клетки, полученных из АТСС (CCL-119); такие же будут упомянуты далее). Данный результат показал, что антитело, предложенное в настоящем изобретении (например, антитело к CD43 (YG5)), сохраняло способность связываться с CD43 даже в условиях изменения вида сахара в CD43, и это означает, что связывание антитела с эпитопом не было зависимым от сахара. С другой стороны, известно, что традиционное антитело к CD43, 5F1, демонстрирует зависимую от сахара способность связываться с эпитопом, и тем самым было продемонстрировано, что антитело, предложенное в настоящем изобретении, отличалось от традиционного антитела.
Пример 13. Эксперимент с объемным (3D) культивированием клеток рака желудка (анализ опухолевых сфер)
Готовили линию клеток NCI-N87 рака желудка, так чтобы клетки перед проведением эксперимента занимали 80-90% поверхности чашки диаметром 150 мм. Клетки NCI-N87 суспендировали, обрабатывая смесью 1×трипсин⋅EDTA (ТЕ), и затем промывали. Подготовленные клетки NCI-N87 ресуспендировали в среде (DMEM/F12 (DMEM с питательной смесью Хэма F12) (GIBCO), В27 (Invitrogen), EGF и bFGF (Invitrogen)), затем в 6-луночный планшет (планшет со сверхнизким прикреплением) вносили аликвоты по 1*105/2 мл и далее культивировали в инкубаторе с CO2 при 37°C в течение 5 суток. После фотографирования клеток в каждой лунке с применением оптического микроскопа клетки разделяли на отдельные клетки, используя 200 мкл 1×ТЕ, и затем промывали PBS. К клеткам добавляли разведенную 1/50 нормальную сыворотку крови мыши и осуществляли блокирование при 4°C в течение 10 мин. После этого в пробирки для проточной цитометрии вносили аликвоты клеток по 100 мкл каждая, добавляли по 10 мкл раствора антитела к CD44 (eBioscience, № по каталогу: 17-0441-82) и по 1 мкл раствора антитела к CD43 (YG5, DFT-1), соответственно, и проводили взаимодействие при 4°C в течение 25 мин. После промывки с использованием того же способа, как указано выше, в каждый образец добавляли параформальдегид в количестве 1% (масс./об.) для фиксации клеток и затем проводили проточную цитометрию.
Полученный результат показан на ФИГ. 17а (результат до культивирования) и 17b (результат после культивирования в течение 5 суток). В верхней части каждой фигуры приведено полученное с помощью микроскопа изображение, а в нижней части приведен график, показывающий результат проточной цитометрии. Как показано на ФИГ. 17а и 17b, факт увеличения числа клеток, положительных по обоим CD44 и CD43, проверяли на опухолевых сферах NCI-N87, культивированных в течение 5 суток, с использованием проточной цитометрии, и было подтверждено, что за этот период времени образовывались колонии опухолевых клеток. Помимо этого было подтверждено, что экспрессия CD43 возрастала благодаря образованию опухолевых сфер. Этот результат показал, что экспрессия CD43 возрастала специфически в опухолевых стволовых клетках.
Пример 14. Протокол ELISA для измерения связывающей способности модифицированных клеток с использованием суспендированных клеток в суспензии
Этот анализ был разработан как пилотное исследование для подтверждения способности scFv или IgG связываться с суспендированными клетками в суспензии с использованием эксперимента с ELISA со сниженным фоновым сигналом в покрытом поли-D-лизином планшете.
Методика:
1. Стадия сбора клеток:
а) клетки собирали центрифугированием, помещая клетки в пробирку фирмы Falcon емкостью 50 мл и центрифугируя при 500×g в течение 5 мин (осаждение центрифугированием);
б) клетки собирали центрифугированием с однократной промывкой полученных клеточных осадков с использованием 10 мл PBS и центрифугированием при 500×g в течение 5 мин (осаждение центрифугированием);
в) клетки подсчитывали после ресуспендирования клеток с использованием 1 мл PBS (подсчет клеток);
г) клетки разбавляли блокирующим буфером (PBS+3% FCS (фетальная телячья сыворотка)) (концентрация разбавленных клеток): 5×105 клеток/лунка (10×106 клеток/мл));
д) полученную суспензию клеток из расчета по 50 мкл на одну лунку добавляли в лунки с V-образным дном 96-луночного планшета.
2. Добавляли цитоплазматический экстракт (scFv антитела к CD43) или IgG1 из расчета по 50 мкл на одну лунку (используя для получения желаемой конечной концентрации 2-кратный концентрированный раствор; например, если была необходима конечная концентрация 25 мкг/мл, то готовили концентрированный раствор 50 мкг/мл) (в соответствии со схемой анализа готовили в двух повторах или трех повторах). Образцы перемешивали 4 раза путем осторожного пипетирования.
3. Культивирование проводили при комнатной температуре в течение 1 часа.
4. Центрифугирование осуществляли при 500×g в течение 5 мин для осаждения клеток.
5. Супернатант удаляли, переворачивая планшет, или посредством аспирации.
6. Клетки промывали, используя по 200 мкл блокирующего буфера, и образцы перемешивали 4 раза посредством пипетирования.
7. Клетки собирали центрифугированием, проводя центрифугирование при 500×g в течение 5 мин.
8. Супернатант удаляли, осторожно переворачивая планшет, или посредством аспирации.
9. По 100 мкл раствора конъюгированного с HRP антитела к Flag, разбавленного 1:1500 в блокирующем буфере, добавляли к клеточным осадкам после центрифугирования, осторожно ресуспендировали и культивировали при комнатной температуре в течение 30 мин.
10. Клетки собирали центрифугированием, проводя центрифугирование при 500×g в течение 5 мин.
11. Супернатант удаляли, осторожно переворачивая планшет, или посредством аспирации.
12. Клетки осторожно промывали, добавляя по 200 мкл блокирующего буфера, и полученные образцы перемешивали 4 раза посредством пипетирования.
13. Клетки собирали центрифугированием, проводя центрифугирование при 500×g в течение 5 мин.
14. Супернатант удаляли, осторожно переворачивая планшет, или посредством аспирации.
15. Клетки осторожно промывали, добавляя по 200 мкл блокирующего буфера, и полученные образцы перемешивали 4 раза посредством пипетирования.
16. Клетки собирали центрифугированием, проводя центрифугирование при 500×g в течение 5 мин.
17. Клетки осторожно ресуспендировали в 80 мкл раствора субстрата пероксидазы для микролунок SureBlue™ ТМВ, культивировали при комнатной температуре в течение 5 мин и затем реакцию останавливали 1 М раствором HCl.
18. Образцы по 100 мкл каждый переносили в стандартный 96-луночный планшет.
19. Считывали планшет (поглощение) при 450 нм.
Пример 15. Протокол FACS для измерения способности связываться с модифицированными клетками с использованием суспендированных клеток в суспензии
Этот анализ был разработан как еще один способ проведения FACS-эксперимента с целью снижения фонового сигнала на покрытом поли-D-лизином планшете и оценки связывающей способности scFv или IgG.
Методика:
1. Проточная цитометрия
а) Стадия сбора клеток:
1) клетки собирали центрифугированием в пробирку фирмы Falcon емкостью 50 мл, центрифугируя при 500×g в течение 5 мин (осаждение центрифугированием);
2) клетки собирали центрифугированием с однократной промывкой полученных клеточных осадков с использованием 10 мл PBS и центрифугированием при 500×g в течение 5 мин (осаждение центрифугированием);
3) клетки подсчитывали после ресуспендирования клеток с использованием 1 мл PBS (подсчет клеток);
4) клетки разбавляли блокирующим буфером (PBS+3% FCS) (концентрация разбавленных клеток): 5×105 клеток/лунка (10×106 клеток/мл));
д) полученную суспензию клеток из расчета по 50 мкл на одну лунку добавляли в лунки с V-образным дном 96-луночных планшетов.
2. В соответствии со схемой анализа к клеткам добавляли IgG из расчета по 50 мкл на одну лунку двух повторах или трех повторах (используя для получения желаемой конечной концентрации 2-кратный концентрированный раствор; например, если была необходима конечная концентрация 25 мкг/мл, то готовили концентрированный раствор 50 мкг/мл), полученные образцы перемешивали 4 раза посредством пипетирования.
3. Проводили инкубирование при комнатной температуре в течение 30 мин.
4. Добавляли по 200 мкл блокирующего буфера.
5. Клетки собирали центрифугированием, проводя центрифугирование при 500×g в течение 5 мин.
6. Супернатант удаляли, осторожно переворачивая планшет, или посредством аспирации.
7. Добавляли по 200 мкл блокирующего буфера, клетки осторожно промывали и затем равномерно перемешивали примерно 4 раза с использованием пипетки.
8. Клетки собирали центрифугированием, проводя центрифугирование при 500×g в течение 5 мин.
9. Среду удаляли.
10. К клеточным осадкам после центрифугирования добавляли по 200 мкл раствора конъюгированных с Alexa Fluor 488 антител козы к IgG человека, разбавленных 1:20 в блокирующем буфере, их осторожно ресуспендировали и оставляли на льду в течение 1 часа с защитой от света.
11. Клетки собирали центрифугированием, проводя центрифугирование при 500×g в течение 5 мин.
12. Среду удаляли.
13. Добавляли по 200 мкл блокирующего буфера, клетки осторожно промывали и затем равномерно перемешивали с использованием пипетки примерно 4 раза.
14. Клетки собирали центрифугированием, проводя центрифугирование при 500×g в течение 5 мин.
15. Добавляли по 200 мкл блокирующего буфера и клетки осторожно ресуспендировали.
16. Планшет считывали, используя проточный цитометр.
Пример 16. Проточная цитометрии с использованием растворимых препаратов scFv
В настоящем примере тестировали уровень связывания scFv с клетками СЕМ7 и U937 (АТСС® CRL1593.2™), при этом использовали растворимые scFv, экспрессированные в периплазму Е. coli, и предназначенные для анализа связывания scFv с клетками посредством проточной цитометрии.
Методика:
1-е сутки: инокуляция клонов
1. Планшет со стартовыми культурами:
а) по 200 мкл 2YT (2×дрожжевой экстракт) + 5% (масс./об.) глюкозы + ампициллин (Amp) вносили в 96-луночный культуральный планшет;
б) scFv, которые могут быть группой сравнения, вместе с желаемыми клонами (ДНК, кодирующая scFv антитела к CD43 (mJL1): SEQ ID NO: 49; ДНК, кодирующая scFv Sh741-112: SEQ ID NO: 51; ДНК, кодирующая scFv Sh145-112: SEQ ID NO: 53; ДНК, кодирующая scFv Sh146-112: SEQ ID NO: 55; или ДНК, кодирующая scFv Sh434-112: SEQ ID NO: 57), вносили в лунки.
2. Проводили культивирование в течение ночи со встряхиванием в условиях 650 об./мин, 37°C.
2-е сутки: экспрессия scFv
Культивирование периплазматических экстрактов
3. В соответствии с конечным применением планшетов для экспрессии с использованием инокулятов: периплазматический экстракт, один образец может быть внесен в одну или более лунок:
а) 96-луночный планшет с глубокими лунками заполняли смесью 2YT + Amp (без глюкозы) в количестве 1,0 мл/лунка;
б) После разбавления стартовых культур до значения OD600, равного 0,1, их вносили в 96-луночный планшет. Культивирование проводили со встряхиванием в условиях 650 об/мин, 30°C в течение 2-4 часов. Периодически определяли мутность посредством отбора образцов и измерения OD600. Клетки промывали до получения значения OD600 от 0,7 до 1,0.
4. Индуцирование экспрессии scFv в планшетах для экспрессии:
а) чтобы индуцировать экспрессию в культуре периплазматического экстракта, в каждый планшет для экспрессии добавляли по 100 мкл смеси 2YT + Amp, в которую был добавлен IPTG (с разбавлением концентрированного раствора IPTG в соотношении 1:100);
б) культивирование проводили в течение ночи со встряхиванием в условиях 650 об/мин и 22°C.
3-и сутки: подготовка периплазматического экстракта и проточная цитометрия
Периплазматические экстракты:
5. Подготовка периплазматического экстракта:
а) клетки собирали центрифугированием, проводя центрифугирование при 2000×g в течение 10 мин;
б) супернатант из планшета для экспрессии вытряхивали в контейнер, содержащий отбеливающий агент, и оставшуюся в планшете среду удаляли, помещая планшет на бумажное полотенце;
в) по 75 мкл холодного РРВ (буфер на основе фосфата калия) + ингибиторов протеаз (1 таблетка на 50 мл; полный набор; Roche, № по каталогу: 04693116001) вносили в каждую лунку, ресуспендировали 4 раза посредством пипетирования и затем культивировали в условиях 1000 об./мин и 4°C в течение 10 мин;
г) вносили в каждую лунку, ресуспендировали 4 раза посредством пипетирования и затем культивировали в условиях 1000 об./мин и 4°C в течение 1 часа при встряхивании;
д) планшет центрифугировали при 3000×g в течение 10 мин;
е) переносили периплазматические экстракты (приблизительно по 270 мкл) и помещали фильтр в стопку (соблюдая ориентацию, соответствующую А1):
1) верхняя часть: 96-луночный фильтровальный планшет с размером пор 1,2 мкм;
2) средняя часть: 96-луночный фильтровальный планшет (100 K);
3) нижняя часть: 96-луночный стандартный планшет с плоским основанием;
ж) планшет центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 мин.
з) (при необходимости) для проведения анализа с использованием проточной цитометрии собирали образцы для каждого клона.
6. Проточная цитометрия:
а) образцы scFv: применение периплазматических экстрактов;
б) сбор клеток:
1) клетки собирали центрифугированием, помещая клетки в пробирку фирмы Falcon емкостью 50 мл и центрифугируя при 500×g в течение 5 мин (осаждение центрифугированием);
2) клетки собирали центрифугированием с однократной промывкой полученных клеточных осадков с использованием 10 мл PBS и центрифугированием при 500×g в течение 5 мин (осаждение центрифугированием);
3) клетки подсчитывали после ресуспендирования клеток с использованием 1 мл PBS (подсчет клеток);
4) клетки разбавляли до 0,5×105 клеток/лунка (2,5×106 клеток/мл);
5) по 20 мкл полученной суспензии клеток из расчета на одну лунку добавляли в лунки с V-образным дном 96-луночных планшетов;
в) добавляли периплазматический экстракт из расчета 20 мкл на одну лунку в двух повторах (scFv). Затем образцы осторожно смешивали посредством пипетирования примерно 4 раза;
г) образцы оставляли при комнатной температуре на 30 мин;
д) добавляли по 180 мкл блокирующего буфера;
е) клетки собирали центрифугированием, проводя центрифугирование при 500×g в течение 5 мин;
ж) супернатант удаляли, переворачивая планшет, или посредством аспирации;
з) обавляли по 200 мкл блокирующего буфера, клетки осторожно промывали и затем равномерно смешивали посредством пипетирования примерно 4 раза;
и) клетки собирали центрифугированием, проводя центрифугирование при 500×g в течение 5 мин;
к) среду удаляли;
л) клетки осторожно ресуспендировали, добавляя 50 мкл раствора конъюгированного с РЕ антитела к Flag в концентрации 5 мкг/мл (BioLegend, № по каталогу: 637310) к свежеприготовленному буферу для связывания. Планшеты должны быть максимально защищены от света, поскольку антитело чувствительно к свету. Их оставляли на льду на 30 мин в условиях защищенности от света;
м) клетки собирали центрифугированием, проводя центрифугирование при 500×g в течение 5 мин;
н) среду удаляли;
о) добавляли по 200 мкл блокирующего буфера, клетки осторожно промывали и затем равномерно смешивали посредством пипетирования примерно 4 раза;
п) клетки собирали центрифугированием, проводя центрифугирование при 500×g в течение 5 мин;
р) добавляли по 200 мкл блокирующего буфера и клетки осторожно ресуспендировали;
с) планшет считывали, используя проточный цитометр Guava (Merckmillipore). Проточный цитометр должен быть подготовлен заранее для регистрации желтой флуоресценции.
Пример 17. Функциональные свойства мышиного антитела к CD43, служащего в качестве основы
Настоящий эксперимент проводили с целью демонстрации того, что данный целевой эпитоп (JL-1) подходит для обработки антителами. В настоящем эксперименте использовали мышиное моноклональное антитело к CD43, связывающееся с данным эпитопом (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 34; ДНК, кодирующая тяжелую цепь: SEQ ID NO: 33; экспрессирующий вектор для тяжелой цепи (на основе рТТ5): SEQ ID NO: 35; легкая цепь: SEQ ID NO: 37; ДНК, кодирующая легкую цепь: SEQ ID NO: 36; экспрессирующий вектор для легкой цепи (на основе рТТ5): SEQ ID NO: 37).
Было подтверждено, что значительное количество антигена не выбрасывалось из клеток, когда клетки, положительные по антигену JL-1 (CD43), культивировали при 37°C в течение 4 часов. Было продемонстрировано отсутствие большой разницы в плане размера, когда антитело к CD43 в смеси с буфером и антитело к CD43 в составе супернатанта фактических клеток Molt-4 (линия CD43+ клеток острого лимфоцитарного лейкоза; АТСС, CRL-1582) или HL-60 (АТСС) сравнивали в анализе с использованием вестерн-блоттинга.
В дополнение к этому было подтверждено, что количество антигена JL-1 (CD43), циркулирующего в сыворотке крови здорового человека, было недостаточным для того, чтобы существенно помешать связыванию антитела к CD43 с данной мишенью. Влияние 50%-ной сыворотки крови человека на связывание антитела к CD43 с лейкозной клеткой оценивали in vitro (путем измерения реакционной способности по IF (иммунофлуоресценция)). Полученные результаты показаны в Таблице 2.
Результаты, показанные в Таблице 2, подтверждали, что сыворотка крови не мешала связыванию антител к CD43 с клетками Molt-4 или клетками HL-60.
Помимо этого было проверено, что «свободные» антитела к CD43, которые были неконъюгированными, не оказывали никакого непосредственного цитотоксического эффекта на выделенные клетки-мишени. Для этого, CD43+ СЕМ7 клетки (представляющие собой клетки СЕМ7 с высоким уровнем антигена) и CCRP-CEM клетки (исходные клетки СЕМ (АТСС), представляющие собой клетки СЕМ7 со средним уровнем) добавляли в 96-луночный планшет в количестве 40000 клеток/лунка, соответственно, обрабатывали мышиными антителами к CD43 (полученными заранее мышиными моноклональными антителами к CD43) в серийных разведениях и на третьи сутки культивирования определяли цитотоксичность, применяя CellTiterGlo (PromegaTM). Для сравнения проводили такой же эксперимент с клетками H9K (клетками H9K с низким уровнем антигена), экспрессирующими CD43 в низкой концентрации.
Полученный результат показан на ФИГ. 18. Как показано на ФИГ. 18, было продемонстрировано, что мышиные антитела к CD43 не проявляли цитотоксичности к CD43+ СЕМ7 клеткам (клеткам СЕМ7 с высоким уровнем антигена) или CCRF-CEM клеткам (клеткам СЕМ7 со средним уровнем антигена; при этом CD43 экспрессировались в меньшей степени по сравнению с клетками СЕМ7).
Клеточные линии, такие как СЕМ7, CCRRF-CEM, Nalm6 (АТСС, CRL-3273) и HL-60 (АТСС, CCL-240) и так далее, демонстрировали в индивидуальном порядке разный уровень экспрессии антигена JL-1 (CD43) (от сильной экспрессии до слабой экспрессии в приведенном порядке). Все эти клеточные линии (по 20000 клеток) обрабатывали конъюгированными с сапорином антителами к CD43 (для конструирования конъюгатов см. пример 3-1; антитела к CD43 представляли собой полученные заранее мышиные моноклональные антитела к CD43) или изотипическим контролем в виде разбавленных растворов, начиная от раствора с концентрацией 20 мкг/мл, и жизнеспособность клеток измеряли с использованием CellTiterGlo на третьи сутки культивирования. Мышиный IgG1 использовали в качестве изотипического контроля для сравнения.
Полученный результат показан на ФИГ. 19. Как показано на ФИГ. 19, было обнаружено, что после обработки конъюгированными с сапорином антителами к CD43 (представленными как mJL-1 на ФИГ. 19) в наибольшей степени жизнеспособность снижалась у клеток СЕМ7 и за ними следовали клетки СЕМ и NALM6. Самую низкую цитотоксичность (наименьшее снижение жизнеспособности клеток) наблюдали в случае клеток HL-60, которые не экспрессировали данной мишени. Как показано на ФИГ. 19, соединенное с токсином антитело к CD43 индуцировало гибель клеток-мишеней. Эффективность гибели обработанных антителами к CD43 клеток СЕМ7, CCRF-CEM, NALM6 и HL-60 соответствовала уровню экспрессии присутствующего в клетках антигена. Сапорин проявлял цитотоксический эффект только в случае индуцирования внутри клетки.
Тестировали интернализацию антител к CD43. Мышиными антителами к CD43 (полученными заранее мышиными моноклональными антителами к CD43) обрабатывали клетки (СЕМ7) при охлаждении в условиях холодильника в течение 30 мин, переносили в условия 37°C, затем отбирали по 106 клеток в соответствующие моменты времени, представленные на оси X на ФИГ. 20, обрабатывали вторичными конъюгированными с РЕ антителами к IgG мыши (Santa Cruz Biotechnology, № по каталогу: SC3738) при температуре холодильника в течение 10 мин, клетки промывали и фиксировали и затем анализировали с применением проточной цитометрии (см. пример 15).
Полученный результат показан на ФИГ. 20. Как показано на ФИГ. 20, антитело к CD43 проникало в клетку после связывания с антигеном, и соответствующие данные показали уровень, при котором антитело на поверхности клетки проникало в клетку и со временем исчезало. Эти данные демонстрировали факт интернализации антитела к CD43 (как мышиного антитела, так и гуманизированного антитела) в случае анализа апоптоза, как указано на ФИГ. 19.
С другой стороны, тестировали явление гомотипической агрегации, индуцированной антителами к CD43 в клетках, экспрессирующих антиген. Для этого антителами к CD43 (мышиными моноклональными антителами к CD43, полученными заранее) в исходной концентрации 40 мкг/мл обрабатывали по 300000 клеток (СЕМ7, CCRRF-CEM или HL-60), культивировали в условиях 37°C, 5% CO2 и затем получали изображения, делая снимки с использованием микроскопа в установленный момент времени (через 2 часа после обработки антителами). Полученное изображение показано на ФИГ. 21. На ФИГ. 21 представлено изображение, показывающее явление гомотипической агрегации, индуцированной антителом к CD43 (представленным как антитело к JL-1), указывающее на то, что антитело к CD43 индуцировало гомотопическую агрегацию клеток, и уровень гомотипической агрегации соотносился с уровнем экспрессии антигена (CD43).
Помимо этого проверяли осуществление экспрессии CD43 в нормальных клетках костного мозга человека. Моноциты из нормального костного мозга окрашивали с использованием мышиных антител к CD43 (полученных заранее мышиных моноклональных антител к CD43), затем окрашивали с использованием конъюгированных с РЕ антител козы к F(ab)2 IgG мыши (Jackson, № по каталогу: 115-035-072) и наблюдение осуществляли методом, изложенным в примере 15.
Полученный результат показан на ФИГ. 22. Наложение гистограмм на ФИГ. 22 представляло ограниченное число лимфоцитов. Как показано на ФИГ. 22, факт низкого уровня гетерогенной экспрессии CD43 подтверждали на различных образцах нормального костного мозга путем окрашивания с использованием антител к CD43 (представленных как JL-1) и также подтверждали на различных клетках периферической крови. Другими словами, данный результат показывает низкий уровень гетерогенной экспрессии CD43 в нормальных клетках костного мозга.
С другой стороны, уровень экспрессии CD43 измеряли в CD34+CD38- клетках (гематопоэтических клетках, отобранных путем тестирования с использованием FACS как клетки, экспрессирующие CD43 и не экспрессирующие CD38; такие же будут упомянуты далее) из различных образцов нормального костного мозга человека (госпиталь Сеульского Национального университета) с применением проточной цитометрии, и было подтверждено, что экспрессия белка CD43 отсутствовала в гематопоэтических стволовых клетках и клетках-предшественниках, которые образовывали колонии в костном мозге. Данный способ подтверждения доступно описан ниже. Гематопоэтические стволовые клетки из пуповины инокулировали 30 мышам NSG (NOD/SID с дефицитом общей гамма-цепи) в 0-е сутки. Через 12 недель у всех мышей с окончательно дифференцированными иммунными клетками проводили анализ на PBL (лимфоциты периферической крови). У всех использованных в этом тестировании мышей иммунные клетки оказались привитыми, и в течение 4 недель мышам вводили конъюгированные с токсином (сапорином) антитела к CD43 (полученные заранее мышиные моноклональные антитела к CD43) или разбавитель (PBS). Через 4 недели после обработки проводили анализ присутствия иммунных клеток человека в иммунизированных животных. Для сравнения такой же тест проводили с использованием конъюгата (мышиный IgG1)-токсин (сапорин) вместо антитела к CD43.
Полученный результат показан в приведенной ниже Таблице 3.
(В этой таблице JL1 представляетсобой CD43; PMN: полиморфноядерный лейкоцит; LN: лимфатический узел)
Как показано в Таблице 3, когда мышам NSG прививали нормальные гематопоэтические стволовые клетки (HSC) человека, полученные из стволовых клеток пуповинной крови, и обработку конъюгатом (антитело к CD43)-токсин (сапорин) проводили в течение 4 недель, то не наблюдали никакой потери в гематопоэтической фракции. Этот результат показал, что конъюгат (антитело к CD43)-токсин (сапорин) не вызывал гибели гематопоэтических стволовых клеток или промежуточных клеток-предшественников.
Используя мышиные антитела к CD43, проводили иммуногистохимическое (IHC) окрашивание в различных нормальных тканях человека, и полученный результат показан в приведенной ниже Таблице 4.
Как показано в Таблице 4, CD43-специфичное окрашивание не обнаруживали ни в каких других тканях, кроме тимуса.
Уровень экспрессии антигена CD43 измеряли, применяя окрашивание двух типов нормальных РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) человека с использованием мышиных антител к CD43 человека (представленных как JL-1: (d)) (см. пример 15 (FACS)), и результат показан на ФИГ. 23. Показанный на ФИГ. 23 результат подтвердил низкий уровень экспрессии CD43.
Конъюгироваными с сапорином мышиными антителами к CD43 (10 мкл/мл) заранее обрабатывали (JL1+) и не обрабатывали (JL1-) нормальные клетки костного мозга и измеряли уровень образования колоний в таких субпопуляциях клеток костного мозга. Клетки костного мозга отделяли от человеческих лейкоцитов и выделяли и собирали CD34+ клетки, разделяя их на положительные и отрицательные по JL-1 (CD43). Затем собранные клетки помещали в среду MethoCult, содержащую цитокины, и измеряли образование колоний. Полученный результат показан на ФИГ. 24. Показанный на ФИГ. 24 результат подтвердил, что колонии в субпопуляциях клеток костного мозга не образовывались в случае предварительной обработки конъюгироваными с сапорином мышиными антителами к CD43 (10 мкл/мл) (JL1+).
С другой стороны, терапевтический эффект антитела к CD43 самого по себе (неконъюгированного) и конъюгата (антитело к CD43)-токсин (дебуганин) тестировали в мышиной модели ксенотрансплантатов ALL, созданной с использованием клеточной линии (в мышиной модели острого лейкоза, созданной путем привития мышам клеток СЕМ7). В качестве антитела к CD43 использовали мышиное моноклональное антитело к CD43, полученное заранее. Полученный результат показан на ФИГ. 25. Антитело к CD43 на ФИГ. 25 представлено как JL1. На ФИГ. 25 (А) показан результат в модели лейкоза с клетками СЕМ7, а на (В) показан результат в модели с NALM-6 (клеточная линия: NALM6 (В-ALL)), соответственно, и тестирование проводили в следующих условиях: мыши: NOD-SCID (8/группа); инокуляция: в 0-е сутки 107 клеток; введение: 15 мкг/инъекция + 100 мкг суммарного IgG, в.в., , начиная с 8-х суток; конечная точка: состояние паралича. Как показано на ФИГ. 25, когда мышей в модели ксенотрансплантатов ALL с использованием инокулирования клетками СЕМ7 или NALM-6 обрабатывали «свободными» (неконъюгированным) антителами к CD43, заболевания не возникало или его начало отсрочивалось.
С другой стороны, измеряли уровень экспрессии CD43 в бластных клетках и субпопуляциях при выраженном AML (острый миелоидный лейкоз). Результат показан на ФИГ. 26. Как показано на ФИГ. 26, проводили анализ экспрессии белка CD43 (представленного как JL-1) в бластных клетках при первичном AML и ее распространенность в конкретных субпопуляциях. CD43 экспрессировался приблизительно в 60% случаев в группе с AML.
Пример 18. Конструирование гуманизированного моноклональноого антитела к CD43
На основании последовательности белка гремлин (gremlin), поддерживающего структуру мышиного антитела к CD43 (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 34; ДНК, кодирующая тяжелую цепь: SEQ ID NO: 33; экспрессирующий вектор для тяжелой цепи: SEQ ID NO: 35, легкая цепь: SEQ ID NO: 37; ДНК, кодирующая легкую цепь: SEQ ID NO: 36; экспрессирующий вектор для легкой цепи (на основе рТТ5): каждая из последовательностей участка CDR тяжелой цепи и легкой цепи SEQ ID NO: 38) (CDRH1: SEQ ID NO: 111 (GYFMN); CDRH2: SEQ ID NO: 114 (RINPNNGDSFYNQKFQG); CDRH3: SEQ ID NO: 118 (EGYYGGRGYALDY); CDRL1: SEQ ID NO: 119 (RTSQDISNYLN); CDRL2: SEQ ID NO: 121 (NTSRLHS); CDRL3: SEQ ID NO: 125 (QQSNMFPY)), и последовательности гена человеческого антитела конструировали библиотеку рекомбинантных гуманизированных антител по типу scFv, в которых были подвергнуты рекомбинации последовательности участка, относящегося к каркасной области.
Конструированную библиотеку антител на основе scFv экспрессировали и подвергали скринигу, используя общепризнанный метод фагового дисплея, и положительные клоны конструировали как подбиблиотеку, экспрессирующую варианты с заменами в областях за исключением CDR или частично в последовательностях участка CDR, повторяя при этом скрининг.
Путем повторения различных циклов получения таких конструкций библиотеки и применения метода дисплея, обеспечивали получение вариантов последовательности гуманизированного антитела, демонстрирующих аффинность к антигену, очень близкую к таковой для родительского клона.
Последовательности тяжелой цепи полученного гуманизированного антитела к CD43 показаны в SEQ ID NO: 40, 42, 44 и 46, последовательность легкой цепи показана в SEQ ID NO: 48, вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи показаны в SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30 и 83 (вариабельная область тяжелой цепи) и SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32 и 83 (вариабельная область легкой цепи), соответственно.
Помимо этого вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи мутантного гуманизированного антитела к CD43 из модифицированной SEQ ID NO: 83 (вариабельная область тяжелой цепи) и SEQ ID NO: 95 (вариабельная область легкой цепи) показаны в SEQ ID NO: 84-94 (вариабельная область тяжелой цепи) и SEQ ID NO: 96-106 (вариабельная область легкой цепи), соответственно.
Антитело по типу scFv создавали посредством соединения полученных вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи с использованием GGGASGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 127) или GGGGSGGGGSGGGAS (SEQ ID NO: 128).
Пример 19. Антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и комплементзависимая цитотоксичность (CDC), обусловленные гуманизированным или химерным моноклональным антителом к CD43
Тестировали апоптотический эффект (ADCC и CDC), обусловленный полученным химерным антителом к CD43 (DNP001; пример 2-1-3). Сначала клеточную линию СЕМ7 вместе с эффекторными клетками (РВМС; мононуклеарные клетки периферической крови) совместно культивировали с добавлением химерных антител к CD43 или контрольных антител (IgG1 человека) в течение 4 часов и затем измеряли цитотоксичность с использованием CellTiterGlo, и результат показан на ФИГ. 27А. Клеточную линию СЕМ7 культивировали в культуральной среде с химерными антителами к CD43 вместе с комплементом кролика (Cedarlane, № по каталогу: CL3051) и затем измеряли цитотоксичность с использованием CellTiterGlo, и результат показан на ФИГ. 27В. Химерное антитело к CD43 было представлено как JL-1 на ФИГ. 27. Показанный на ФИГ. 27 результат подтвердил, что химерное антитело к CD43 индуцировало эффектор-опосредуемый цитолиз (ADCC и CDC) на уровне in vitro по сравнению с контрольным антителом, IgG1 человека.
На ФИГ. 28 показано, что дефукозилированное (дефукозилированное посредством обработки антитела кифунензином) химерное антитело к CD43 (представленное как JL-1) повышает ADCC активность по отношению к СЕМ7 на уровне in vitro.
ФИГ. 29 представляет график, показывающий эффект, оказываемый неконъюгированным химерным антителом, которое само по себе не связывалось ни с чем, в клеточной линии СЕМ7 in vivo. Показанный на ФИГ. 29 результат подтвердил, что «свободные» (неконъюгированные) и конъюгированные с дебуганином химерные антитела к CD43 повышали выживаемость иннокулированного клетками СЕМ7 животного (в модели лейкоза ALL (острый лимфоцитарный лейкоз)).
Экспрессию CD43 тестировали в субпопуляциях лейкозных стволовых клеток (LSC). Костный мозг пациента с AML (острый миелоидный лейкоз) окрашивали с использованием антител к CD45 (BD), антител к CD34 (BD), антител к CD38 (BD), антител к CD43 (DNP001) или mIgG1 (контроль) с Alexa488 и уровень экспрессии CD43 оценивали, отбирая CD34+CD38- лейкозные стволовые клетки, и проводили сравнение с контрольной группой. Результат показан на ФИГ. 30 (JL1: CD43). Как показано на ФИГ. 30, антиген CD43 экспрессировался в субпопуляциях инициирующих лейкоз клеток (LSC) (CD34+/CD38-).
Измеряли среднее число колоний после обработки in vitro химерными антителами к CD43, конъюгированными с токсином (сапорином: SAP) (ССС), и результат показан на ФИГ. 31. Данный результат продемонстрировал апоптотический эффект, оказываемый на антиген-положительные клетки в случае AML, которые добавляли вместе с конъюгатами (антитело к CD43)-сапорин или конъюгатами (мышиный IgG1)-сапорин на панель колоний стволовых клеток.
Помимо этого измеряли in vitro влияние химерного конъюгированного с токсином (сапорином: SAP) антитела к CD43 (ССС) на прогрессирование антиген-положительного выраженного AML, и результат показан на ФИГ. 32. Данный результат показал, что антитела ССС ослабляли прогрессирование выраженного AML. Данный результат получали путем помещения бластных клеток в случае выраженного AML в культуральную среду, содержащую конъюгат (антитело к CD43)-сапорин или конъюгат (мышиный IgG1)-сапорин, и измерения уровня пролиферации клеток через 3 суток, и на основании этого результата было подтверждено, что рост клеток замедлялся при культивировании в среде, содержащей конъюгат JL1-сапорин (А), а доля погибших клеток увеличивалось (В).
Как показано на ФИГ. 31 и 32 и подтверждено результатами анализа образования колоний (ФИГ. 31) и анализа пролиферации (ФИГ. 32) in vitro, конъюгированное с токсином гуманизированное химерное антитело обладало цитотоксичностью по отношению к CD43-положительному первичному AML.
Тестировали ингибирующий эффект, оказываемый конъюгированным с токсином антителом, на рост раковых клеток в случае выраженного AML у NSG мышей (in vivo). У пациента с CD43+ AML отбирали 5×107 костномозговых клеток, вводили внутривенной инъекцией 30 облученным NSG мышам и через 8 недель этим мышам каждую неделю в течение 4 недель вводили в дозе 45 мкг конъюгат (химерное антитело к CD43)-дебуганин (DB) (представленный как JL1-DB), конъюгат hIgG1-DB (представленный как изотип-DB) или PBS (разбавитель). Затем у этих мышей отбирали образцы крови, костного мозга и селезенки и наблюдали за приживлением трансплантата и образованием опухолей. Полученный результат показан на ФИГ. 33. Как показано на ФИГ. 33, рост раковых клеток в случае первичного AML ингибировался конъюгированными с токсином гуманизированными химерными антителами к CD43 у мышей NSG на уровне in vivo.
Результаты, показанные на ФИГ. 34 и ФИГ. 35, подтверждали, что различные гуманизированные/оптимизированные модифицированные антитела демонстрировали одинаковый профиль связывания по сравнению с взятым в качестве основы (мышиным) антителом к CD43. Окрашивание СЕМ7 клеток проводили с использованием родительского взятого в качестве основы антитела к CD43 (ART140, JL1; мышиного антитела к CD43; тяжелая цепь: SEQ ID NO: 34; легкая цепь: SEQ ID NO: 37) и 3-х разновидностей гуманизированных антител (257-10 (SEQ ID NO: 93 & 105); 456-D10 (SEQ ID NO: 94 & 106); ComboA (SEQ ID NO: 2 & 4)) и измерения интенсивности флуоресценции, и результат показан на ФИГ. 34. Показанный на ФИГ. 43 результат подтвердил, что модифицированный вариант «Combo A» показал самый лучший профиль, а все другие тестируемые антитела показали значительный уровень цитотоксичности в клетках СЕМ7. Чтобы протестировать интернализацию антител, конъюгированных с цитотоксическими веществами, в клетках, проводили обработку СЕМ7 клеток 3-мя разновидностями гуманизированных антител, предварительно объединенными в комплекс с конъюгатом (антитело к IgG человека)-сапорин, через 3 суток оценивали цитотоксичность, и результаты показаны на ФИГ. 35. Как показано на ФИГ. 35, когда использовали конъюгат на основе 3-х разновидностей модифицированных антител и сапорина, цитотоксичность была значительно высокой.
Как показано на ФИГ. 34 и 35, уровень связывания и уровень цитотоксичности in vitro различных вариантов гуманизированных антител к CD43 были одинаковыми по сравнению с мышиным антителом к CD43 (ART140, JL1). В качестве контрольной группы использовали синагис (Medimmune Company), представляющий собой гуманизированное моноклональное антитело (IgG) к антигенной детерминанте на антигенном сайте A F-белка RSV (респираторно-синцитиальный вирус).
На ФИГ. 37а и 37b с использованием проточной цитометрии показан ряд вариантов гуманизированных антител к CD43 (см. ФИГ. 36), связанных с антигеном CD43 на клеточной поверхности, по сравнению с мышиным антителом к CD43 (ART140, JL1). В качестве отрицательного контроля использовали клетки U937, дефицитные по экспрессии антигена CD43 на поверхности.
На ФИГ. 38а и 38b с использованием иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA) показано, что ряд вариантов гуманизированного антитела к CD43 (см. ФИГ. 36), связывался с антигеном CD43 на клеточной поверхности по сравнению с мышиным антителом к CD43 (ART140, JL1). В качестве отрицательного контроля использовали клетки U937, дефицитные по экспрессии антигена CD43 на поверхности.
На ФИГ. 39а и 39b с использованием проточной цитометрии показано, что варианты гуманизированного антитела к CD43, имеющие мутации, внесенные с применением набора QuikChange (Combo A (SEQ ID NO: 91 (вариабельная область тяжелой цепи); SEQ ID NO: 103 (вариабельная область легкой цепи)), Combo В (SEQ ID NO: 91 (вариабельная область тяжелой цепи); SEQ ID NO: 103 (вариабельная область легкой цепи)), Combo С (SEQ ID NO: 85 (вариабельная область тяжелой цепи); SEQ ID NO: 97 (вариабельная область легкой цепи))), связывались с CD43 на клеточной поверхности по сравнению с мышиным антителом к CD43 (ART 140, JL1) и антителом с родительской каркасной областью из раунда 3.
На ФИГ. 41а-41с показано, что варианты гуманизированного антитела к CD43, имеющие мутации, внесенные с применением набора QuikChange (Combo A, Combo В, Combo С), связывались с антигеном JL1 на клеточной поверхности по сравнению с мышиным антителом к CD43 (ART 140, JL1) и антителом с родительской каркасной областью из раунда 3.
Пример 20. Получение модифицированного антитела посредством удаления аминокислотного остатка в участке гликозилирования гуманизированного антитела
Было обнаружено присутствие аминокислотной последовательности, обладающей способностью к гликозилированию, в вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 105) гуманизированного антитела к CD43, полученного в примере 18 (257-10, содержащего SEQ ID NO: 93 (вариабельную область тяжелой цепи) + SEQ ID NO: 105 (вариабельную область легкой цепи)) и с целью ее удаления получали мутантное антитело.
Поскольку гликозилирование связывающегося с эпитопом участка легкой цепи (вариабельной области легкой цепи), весьма вероятно окажет отрицательное влияние на антигенсвязывающую способность и физические свойства антитела и может привести к ухудшению продуктивности при последующем массовом производстве, вероятность разработки антитела как терапевтического агента повышали путем замены аминокислоты, которая может быть гликозилирована, на другие аминокислоты.
Остаток аминокислоты аспарагин (Asn, N) в положении 50 и остаток аминокислоты серии (Ser, S) в положении 52 были выбраны как аминокислоты, которые могут быть гликозилированы в вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 105) гуманизированного антитела к CD43 (см. ФИГ. 43). Мутантное антитело получали путем замены в положении 50 остатка аминокислоты аспарагин (Asn, N) в SEQ ID NO: 8 на глутамин (Gln, Q) или аланин (Ala, А) и/или замены в положении 52 остатка аминокислоты серии (Ser, S) на аланин (Ala, А), и вариабельные области легкой цепи мутантного антитела, полученные как описано выше, показаны в SEQ ID NO: 107 (S52A), 108 (N50Q) и 109 (N50A).
Получали антитело IgG1 типа, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 93) и вариабельную область легкой цепи полученного модифицированного антитела 55, и проводили вестерн-блоттинг, используя конъюгат (конкавалин A)-HRP (Sigma-Aldrich), связывающийся с участком гликозилирования.
Полученный результат показан на ФИГ. 44. Показанный на ФИГ. 44 результат подтвердил, что конкавалин А связывался и с участком легкой цепи, и с участком тяжелой цепи в антителе, у которого аминокислоты в участке гликозилирования не были модифицированы (содержащем SEQ ID NO: 93 и SEQ ID NO: 105; дикий тип), но связывания с участком легкой цепи не происходило в случае трех разновидностей модифицированных антител (scFv). Этот результат означает, что участок гликозилирования легкой цепи антитела был удален.
Помимо этого анализировали антигенсвязывающую способность посредством измерения способности антител связываться с CD43-положительными клетками, клетками СЕМ7. Полученный результат показан на ФИГ. 45. Как показано на ФИГ. 45, модифицированное антитело демонстрировало антигенсвязывающую способность, аналогичную таковой для антитела дикого типа.
Химерное антитело (DNP001) и модифицированное гуманизированное антитело с удаленным участком гликозилирования (вариабельная область тяжелой цепи; SEQ ID NO: 93; вариабельная область легкой цепи: SEQ ID NO: 109) связывали с антиген(CD43)-положительными клетками, клетками СЕМ7, и их анализ проводили с применением проточной цитометрии. Полученный результат показан на ФИГ. 46. Как показано на ФИГ. 46, было подтверждено, что модифицированное гуманизированное антитело проявляло более выраженную способность к связыванию с CD43-экспрессирующими клетками, чем химерное антитело.
Claims (24)
1. Фармацевтическая композиция для лечения солидного рака или ингибирования раковой стволовой клетки, содержащая антитело к CD43 (кластер дифференцировки 43) или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1H (первый определяющий комплементарность участок тяжелой цепи) с SEQ ID NO: 110, CDR2H с SEQ ID NO: 113, CDR3H с SEQ ID NO: 118, CDR1L (первый CDR легкой цепи) с SEQ ID NO: 119, CDR2L с SEQ ID NO: 120 и CDR3L с SEQ ID NO: 125, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с эпитопом, состоящим из 6-9 следующих друг за другом аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134, и где указанные 6-9 следующих друг за другом аминокислот содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131.
2. Композиция по п. 1, где антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с эпитопом, состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 131, 132, 133 и 134.
3. Композиция по п. 1, где антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1H с SEQ ID NO: 111 или 112, CDR2H с SEQ ID NO: 114, 115, 116 или 117, CDR3H с SEQ ID NO: 118, CDR1L с SEQ ID NO: 119, CDR2L с SEQ ID NO: 121, 122, 123 или 124 и CDR3L с SEQ ID NO: 125.
4. Композиция по п. 1, где антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент имеет модификацию в мотиве гликозилирования в вариабельной области.
5. Композиция по любому из пп. 1-4, где солидный рак представляет собой рак желудка, рак молочной железы, рак легкого, рак толстой кишки, рак печени, рак желчного пузыря, рак почки, рак поджелудочной железы, рак щитовидной железы, рак предстательной железы, рак яичника, рак шейки матки или рак мочевого пузыря.
6. Композиция по любому из пп. 1-4, дополнительно содержащая по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из цитотоксического вещества и вещества для мечения.
7. Композиция по п. 6, где цитотоксическое вещество представляет собой по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из рицина, сапорина, гелонина, момордина, дебуганина, дифтерийного токсина, псевдомонадного токсина, радиоактивных изотопов, дуокармицина, монометилауристатина E (MMAE), монометилауристатина F (MMAF), N2'-дезацетил-N2'-(3-меркапто-1-оксопропил)- майтанзина (DM1) и димера пирролобензодиазепина (PBD).
8. Композиция по любому из пп. 1-4, где раковая стволовая клетка представляет собой раковую стволовую клетку при гематологическом злокачественном заболевании или солидном раке.
9. Способ скрининга агента для лечения солидного рака или ингибирования раковой стволовой клетки, включающий приведение в контакт соединения-кандидата с эпитопом, состоящим из 6-9 следующих друг за другом аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134, где указанные 6-9 следующих друг за другом аминокислот содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131; и отбор соединения-кандидата, которое связывается с этим эпитопом, и определение отобранного соединения-кандидата в качестве агента-кандидата для лечения солидного рака или ингибирования раковой стволовой клетки.
10. Способ по п. 9, где эпитоп состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 131, 132, 133 и 134.
11. Способ по п. 9 или 10, где раковая стволовая клетка представляет собой раковую стволовую клетку при солидном раке.
12. Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфично связываться с внеклеточным доменом CD43, содержащие CDR1H с SEQ ID NO: 110, CDR2H с SEQ ID NO: 113, CDR3H с SEQ ID NO: 118, CDR1L с SEQ ID NO: 119, CDR2L с SEQ ID NO: 120 и CDR3L с SEQ ID NO: 125, где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с эпитопом, состоящим из 6-9 следующих друг за другом аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134, и где указанные 6-9 следующих друг за другом аминокислот содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131.
13. Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 12, содержащие: CDR1H с SEQ ID NO: 111 или 112, CDR2H с SEQ ID NO: 114, 115, 116 или 117, CDR3H с SEQ ID NO: 118, CDR1L с SEQ ID NO: 119, CDR2L с SEQ ID NO: 121, 122, 123 или 124 и CDR3L с SEQ ID NO: 125.
14. Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 12, модифицированные посредством замены аминокислоты, способной гликозилироваться, в вариабельной области легкой цепи, на другую аминокислоту, не способную гликозилироваться.
15. Антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 12, содержащие вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2, 6, 14, 18, 26, 30, 83, 84, 86, 91, 92 или 93 и вариабельную область легкой цепи с SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 95, 96, 97, 99, 100, 103, 107, 108 или 109.
16. Конъюгат для специфичного направленного воздействия на CD43-положительную клетку, содержащий антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 12-15 и по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из цитотоксического вещества и вещества для мечения.
17. Конъюгат по п. 16, где цитотоксическое вещество представляет собой по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из рицина, сапорина, гелонина, момордина, дебуганина, дифтерийного токсина, псевдомонадного токсина, радиоактивных изотопов, дуокармицина, монометилауристатина E (MMAE), монометилауристатина F (MMAF), N2'-дезацетил-N2'-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтанзина (DM1) и димера пирролобензодиазепина (PBD).
18. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения рака, содержащая антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.12-15 или конъюгат по п. 17 и фармацевтически приемлемый носитель.
19. Композиция по п. 18, где рак представляет собой гематологическое злокачественное заболевание.
20. Композиция по п. 19, где гематологическое злокачественное заболевание представляет собой острый миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, острый моноцитарный лейкоз, лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому.
21. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело к CD43 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 12-15.
22. Рекомбинантный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 21.
23. Рекомбинантная клетка, содержащая рекомбинантный вектор по п. 22.
24. Способ получения антитела к CD43 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 12-15, включающий культивирование рекомбинантной клетки по п. 23.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562240276P | 2015-10-12 | 2015-10-12 | |
US62/240,276 | 2015-10-12 | ||
AU2016901555 | 2016-04-28 | ||
AU2016901555A AU2016901555A0 (en) | 2016-04-28 | CD43 binding proteins and uses thereof | |
PCT/KR2016/011428 WO2017065493A1 (ko) | 2015-10-12 | 2016-10-12 | 항-cd43 항체 및 이의 암 치료 용도 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2694903C1 true RU2694903C1 (ru) | 2019-07-18 |
Family
ID=66636483
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018115692A RU2694903C1 (ru) | 2015-10-12 | 2016-10-12 | Антитела к CD43 и их применение для лечения рака |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10676531B2 (ru) |
EP (1) | EP3363461A4 (ru) |
JP (2) | JP6758388B2 (ru) |
KR (1) | KR101981943B1 (ru) |
CN (1) | CN108472364B (ru) |
AU (1) | AU2016339513B2 (ru) |
BR (2) | BR112018007334A8 (ru) |
CA (1) | CA3001676C (ru) |
IL (1) | IL258642B (ru) |
MX (1) | MX2018004474A (ru) |
NZ (1) | NZ741573A (ru) |
RU (1) | RU2694903C1 (ru) |
SG (1) | SG11201803008RA (ru) |
WO (1) | WO2017065493A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201802618B (ru) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020506716A (ja) | 2016-12-22 | 2020-03-05 | ウニヴェルシタ・デリ・ストゥディ・マニャ・グレチア・カタンツァーロ | Cd43の固有のシアログリコシル化がん関連エピトープを標的化するモノクローナル抗体 |
CA3136618A1 (en) | 2019-04-10 | 2020-10-15 | Elevatebio Technologies, Inc. | Flt3-specific chimeric antigen receptors and methods of using the same |
CN114127110B (zh) * | 2019-05-30 | 2022-07-01 | 山东博安生物技术股份有限公司 | 抗cgrp抗体及其应用 |
WO2020254670A1 (en) * | 2019-06-21 | 2020-12-24 | Università Degli Studi Magna Graecia Catanzaro | Monoclonal antibody targeting a unique cancer-associated epitope of cd43 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20100107300A (ko) * | 2009-03-25 | 2010-10-05 | 다이노나(주) | siRNA 전달용 복합체 |
EP1879916B1 (en) * | 2005-05-11 | 2014-04-23 | Dinona Inc. | Acute leukemia and lymphoblastic lymphoma-specific cd43 epitope and use thereof |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR0149048B1 (ko) * | 1993-05-21 | 1998-08-17 | 박성희 | 인체의 피질흉선세포에 표현되는 단백질 |
US6277375B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobulin-like domains with increased half-lives |
PT2180007E (pt) | 1998-04-20 | 2013-11-25 | Roche Glycart Ag | Engenharia de glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos |
ID23055A (id) | 1998-07-16 | 2000-01-20 | Nihon Parkerizing | Komposisi cairan untuk menghilangkan minyak dan perlakuan pengubahan kimia seng fosfat pada baja dengan minyak padanya |
US6998267B1 (en) | 1998-12-09 | 2006-02-14 | The Dow Chemical Company | Method for manufacturing glycoproteins having human-type glycosylation |
EP2322644A1 (en) | 2000-06-28 | 2011-05-18 | GlycoFi, Inc. | Methods for producing modified glycoproteins |
PT1355919E (pt) | 2000-12-12 | 2011-03-02 | Medimmune Llc | Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações |
US7754208B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
US7317091B2 (en) | 2002-03-01 | 2008-01-08 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
US20040132101A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-07-08 | Xencor | Optimized Fc variants and methods for their generation |
US20070207142A1 (en) * | 2002-05-08 | 2007-09-06 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin |
US7217797B2 (en) | 2002-10-15 | 2007-05-15 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
US7622560B2 (en) * | 2005-05-11 | 2009-11-24 | Dinona Inc. | Monoclonal antibody specific for CD43 epitope |
KR100738401B1 (ko) * | 2005-05-11 | 2007-07-11 | 다이노나(주) | 급성백혈병- 및 림프모구 림프종 특이 cd43의항원결정부위 및 이의 용도 |
JP5313886B2 (ja) | 2006-06-07 | 2013-10-09 | バイオアライアンス セー.フェー. | 癌細胞で発現するcd−43およびceaの炭水化物含有エピトープを認識する抗体およびそれを使用する方法 |
EP1878747A1 (en) | 2006-07-11 | 2008-01-16 | greenovation Biotech GmbH | Glyco-engineered antibodies |
US8748113B2 (en) | 2007-11-15 | 2014-06-10 | The Johns Hopkins University | Methods for detecting and monitoring circulating cancer stem cells |
NZ585959A (en) | 2007-12-18 | 2012-09-28 | Bioalliance Cv | Antibodies recognizing a carbohydrate containing epitope on cd-43 and cea expressed on cancer cells and methods using same |
KR101364172B1 (ko) | 2011-01-12 | 2014-02-17 | 서울대학교산학협력단 | 원숭이 cd43에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 융합세포주 |
-
2016
- 2016-10-12 KR KR1020187011372A patent/KR101981943B1/ko active IP Right Grant
- 2016-10-12 MX MX2018004474A patent/MX2018004474A/es unknown
- 2016-10-12 BR BR112018007334A patent/BR112018007334A8/pt active Search and Examination
- 2016-10-12 CA CA3001676A patent/CA3001676C/en active Active
- 2016-10-12 SG SG11201803008RA patent/SG11201803008RA/en unknown
- 2016-10-12 NZ NZ74157316A patent/NZ741573A/en unknown
- 2016-10-12 JP JP2018538512A patent/JP6758388B2/ja active Active
- 2016-10-12 EP EP16855710.6A patent/EP3363461A4/en active Pending
- 2016-10-12 AU AU2016339513A patent/AU2016339513B2/en active Active
- 2016-10-12 CN CN201680072698.5A patent/CN108472364B/zh active Active
- 2016-10-12 BR BR122021000898A patent/BR122021000898A8/pt unknown
- 2016-10-12 RU RU2018115692A patent/RU2694903C1/ru active
- 2016-10-12 WO PCT/KR2016/011428 patent/WO2017065493A1/ko active Application Filing
- 2016-10-12 US US15/767,179 patent/US10676531B2/en active Active
-
2018
- 2018-04-11 IL IL258642A patent/IL258642B/en unknown
- 2018-04-19 ZA ZA2018/02618A patent/ZA201802618B/en unknown
-
2020
- 2020-05-01 JP JP2020081490A patent/JP2020125352A/ja not_active Withdrawn
- 2020-05-11 US US16/871,280 patent/US11542339B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1879916B1 (en) * | 2005-05-11 | 2014-04-23 | Dinona Inc. | Acute leukemia and lymphoblastic lymphoma-specific cd43 epitope and use thereof |
KR20100107300A (ko) * | 2009-03-25 | 2010-10-05 | 다이노나(주) | siRNA 전달용 복합체 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JEON YK., et al., Targeting of a developmentally regulated epitope of CD43 for the treatment of acute leukemia. Cancer Immunol Immunother. 2011 Dec; 60(12):1697-706. doi: 10.1007/s00262-011-1066-7. Epub 2011 Jun 28. * |
JEON YK., et al., Targeting of a developmentally regulated epitope of CD43 for the treatment of acute leukemia. Cancer Immunol Immunother. 2011 Dec; 60(12):1697-706. doi: 10.1007/s00262-011-1066-7. Epub 2011 Jun 28. KIM HJ., et al., CD43 cross-linking increases the Fas-induced apoptosis through induction of Fas aggregation in Jurkat T-cells. Exp Mol Med. 2006 Aug 31; 38(4):357-63. KIM S., et al., Characterization of Two Novel mAbs Recognizing Different Epitopes on CD43. Immune Netw. 2014 Jun; 14(3):164-70. doi: 10.4110/in.2014.14.3.164. Epub 2014 Jun 19. * |
KIM HJ., et al., CD43 cross-linking increases the Fas-induced apoptosis through induction of Fas aggregation in Jurkat T-cells. Exp Mol Med. 2006 Aug 31; 38(4):357-63. * |
KIM S., et al., Characterization of Two Novel mAbs Recognizing Different Epitopes on CD43. Immune Netw. 2014 Jun; 14(3):164-70. doi: 10.4110/in.2014.14.3.164. Epub 2014 Jun 19. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL258642A (en) | 2018-06-28 |
CN108472364A (zh) | 2018-08-31 |
US20200392240A1 (en) | 2020-12-17 |
MX2018004474A (es) | 2018-11-09 |
JP6758388B2 (ja) | 2020-09-23 |
BR112018007334A8 (pt) | 2023-02-07 |
ZA201802618B (en) | 2019-09-25 |
IL258642B (en) | 2022-04-01 |
CA3001676A1 (en) | 2017-04-20 |
NZ741573A (en) | 2019-11-29 |
CN108472364B (zh) | 2022-03-04 |
BR122021000898A8 (pt) | 2023-02-07 |
WO2017065493A1 (ko) | 2017-04-20 |
AU2016339513A1 (en) | 2018-05-10 |
US20190016813A1 (en) | 2019-01-17 |
AU2016339513B2 (en) | 2019-11-28 |
BR112018007334A2 (pt) | 2018-10-23 |
CA3001676C (en) | 2022-12-06 |
EP3363461A1 (en) | 2018-08-22 |
EP3363461A4 (en) | 2019-05-15 |
KR101981943B1 (ko) | 2019-05-24 |
JP2020125352A (ja) | 2020-08-20 |
JP2018534360A (ja) | 2018-11-22 |
BR122021000898A2 (ru) | 2018-10-23 |
US11542339B2 (en) | 2023-01-03 |
SG11201803008RA (en) | 2018-05-30 |
KR20180083315A (ko) | 2018-07-20 |
WO2017065493A8 (ko) | 2018-04-26 |
US10676531B2 (en) | 2020-06-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9388248B2 (en) | Anti-CXCR4 antibodies and their use for the treatment of cancer | |
KR20190112040A (ko) | Cd47 항원 결합 유닛 및 그것의 사용 | |
US9249223B2 (en) | Humanized anti CXCR4 antibodies for the treatment of cancer | |
US11542339B2 (en) | Anti-CD43 antibody and use thereof for cancer treatment | |
CA3043691C (en) | Antibody binding specifically to cd66c and use thereof | |
JP6138780B2 (ja) | 癌の検出および診断のための抗体i−3859の使用 | |
EP3543259A2 (en) | Antibody binding to carbonic anhydrase and use thereof | |
CN113993899A (zh) | 抗cd47抗体及其应用 | |
AU2019268959B2 (en) | Use for preventing and treating myeloid-derived suppressor cell-related diseases |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner |