CN108472364B - 抗cd43抗体及其在癌症治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于癌症治疗的抗体，并且提供了与CD43的胞外结构域结合的抗CD43抗体，用于抑制癌症干细胞的包括该抗体作为活性成分的抗癌组合物和组合物；以及用于筛选癌症干细胞抑制剂的方法。

Description

抗CD43抗体及其在癌症治疗中的应用
技术领域
本发明提供了一种与CD43的胞外结构域结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段，一种包括抗CD43抗体或其抗原结合片段作为活性成分来用于治疗癌症的组合物，一种包括与CD43的胞外结构域结合的抗CD43抗体作为活性成分来用于抑制癌症干细胞的组合物，以及一种用于筛选抑制癌症干细胞的药剂的方法。
背景技术
CD43是在除红细胞以外的各种血细胞中表达的细胞表面蛋白。人CD43(称为涎福林或白细胞唾液酸蛋白)由235个氨基酸组成的粘液蛋白样(mucine-like)的胞外结构域、23个氨基酸组成的跨膜结构域和123个氨基酸组成的胞内结构域构成，并且相关遗传信息被编码在一个外显子中。在人胞外CD43结构域中有许多丝氨酸(46个残基)和苏氨酸(47个残基)氨基酸，并且它们中的大多数具有O-连接的聚糖(O-聚糖)。另外，N-聚糖也与CD43连接。已知O-聚糖的结构根据细胞类型变化很大。CD43具有由378个碱基对组成的内含子，它将外显子分成两个，并且整个转录材料信息被编码在第二外显子中。
CD43被合成为包括N-聚糖的约40kDa的前体，并且通过连续的成熟糖基化过程而被转化为115kDa～200kDa的材料。转录后的严格受控的糖基化过程根据类型而形成特征分子量异构体蛋白，并且这些能够根据细胞类型而不同地表达。
已知CD43的糖基化表位是限于白血细胞的特异性标记物，并且已经揭示了其作为血液系统恶性肿瘤标记物的特定用途。由于这个原因，在许多研究中，已经探索将与CD43的糖基化表位结合的抗体用于诊断或治疗目的的可能性。已知识别CD43的啮齿动物单克隆抗体在过度表达CD34(Bazil et al.(1996)Blood,87(4):1272-81)和人T-类淋巴母细胞(Bazil et al.(1996)Blood,87(4):1272-81)的谱系标记物阴性骨髓造血祖细胞中诱导细胞凋亡。然而，这些抗体对于检测或治疗癌细胞无效，因为它们中的大多数与位于成熟(非癌性)造血细胞中表达的CD43胞外结构域中的糖基化表位反应。因此，需要开发一种与CD43的糖基化表位结合的更好的物质来诊断、追踪和治疗血液系统恶性肿瘤。
另一方面，已经知道表明干细胞异常的癌症干细胞假说涉及在分层模型中的癌症的发生和复发。
人体的所有组织均来源于器官特异性干细胞。器官特异性干细胞具有自我更新和分化成组成各器官的所有细胞的能力。这些器官特异性干细胞与胚胎干细胞的区别在于：它们只能在特定器官中分化成细胞类型。
癌症干细胞假说主要由两个要素组成。首先，肿瘤发生在组织的干细胞中；其次，干细胞产生的肿瘤具有干细胞的基本特性。
癌症干细胞，作为具有无限再生能力的癌细胞，被定义为这样的细胞：当注入免疫抑制小鼠时能够有效产生肿瘤，并且在形成的肿瘤中表达其独特的异质性(原发性肿瘤异质性良好)。
随着干细胞生物学最近的发展，癌症干细胞假说已经变得更加实体化。癌症干细胞假说通过于1997年报道的在移植了来自急性髓细胞性白血病患者的可能癌症干细胞的免疫抑制小鼠中，再次产生人白血病(Bonnet D,Dick JE；Human acute myeloid leukemiais organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoieticcell.Nat Med 1997；3:730-7)而向前迈进了一步。
恶性肿瘤表现出的各种异质性对应于干细胞的各种分化潜能，以及癌细胞的反复发生的耐药性，尽管有许多靶标治疗也对应于干细胞的基本特性。由于癌症干细胞可以通过自我复制而形成新的肿瘤块，即使通过手术和化学疗法完全移除癌症干细胞以外的肿瘤细胞，但是如果癌症干细胞仍然存在，癌症会再次复发。
因此，为了完全治愈癌症，需要开发抑制或移除癌症干细胞的技术。
发明内容
【技术问题】
其他实施方式提供了一种用于治疗实体癌的药物组合物，包括与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段。
其他实施方式提供了一种用于治疗实体癌的方法，包括向需要治疗实体癌的受试者施用药学有效量的与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段的步骤。
其他实施方式提供了与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段在治疗实体癌中的应用。
该表位可以是包括CD43的胞外结构域中的含6～9个连续氨基酸的多肽，所述CD43的胞外结构域包括SEQ ID NO:131的氨基酸序列。该抗CD43抗体或其抗原结合片段可以包括上述抗CD43抗体或其抗原结合片段。
用于治疗实体癌的药物组合物、方法和应用可以例如通过对血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞的抑制效果来表征。在一个实施方式中，实体癌可以是胃癌，而血液系统恶性肿瘤可以是白血病。
其他实施方式提供了一种用于抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)的药物组合物，包括与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
其他实施方式提供一种用于抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)的方法，包括向需要治疗实体癌的血液系统恶性肿瘤的受试者施用药学有效量的与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段的步骤。
其他实施方式提供了与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段在抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)中的应用。
该表位可以是包括CD43的胞外结构域中的含6～9个连续氨基酸的多肽，所述CD43的胞外结构域包括SEQ ID NO:131的氨基酸序列。该抗CD43抗体或其抗原结合片段可包括上述抗CD43抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，该实体癌可以是胃癌。
其他实施方式提供了一种偶联物，所述偶联物在与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段和癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)之间。其他实施方式提供了一种用于生产在与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段和癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)之间的偶联物的方法，其中，该方法可包括将与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段施用至癌症试样(例如，实体癌试样)或癌症患者(诸如实体癌患者)的步骤。该偶联物或生产该偶联物的方法可以用于各种临床、诊断和/或实验目的，以及癌症治疗。
其他实施方式提供了一种用于筛选治疗实体癌的药剂的药剂，包括位于CD43的胞外结构域中的表位。其他实施方式提供了一种通过位于CD43的胞外结构域中的表位来筛选治疗实体癌的药剂的方法。其他实施方式提供位于CD43的胞外结构域中的表位在筛选治疗实体癌的药剂中的应用。该表位可以是包括CD43的胞外结构域中的含6～9个连续氨基酸的多肽，其中，所述6～9个连续氨基酸包括SEQ ID NO:131的氨基酸序列。如上所述的筛选治疗实体癌的药剂的特征可在于具有对癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)的抑制效果。在一个实施方式中，该实体癌可以是胃癌。
其他实施方式提供了一种用于筛选抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)的药剂的药剂，包括位于CD43的胞外结构域中的表位。其他实施方式提供了一种通过位于CD43的胞外结构域中的表位来筛选抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)的药剂的方法。其他实施方式提供了位于CD43的胞外结构域中的表位在筛选抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)的药剂中的应用。该表位可以是包括CD43的胞外结构域中的含6～9个连续氨基酸的多肽，其中，所述6～9个连续氨基酸包括SEQ ID NO:131的氨基酸序列。在一个实施方式中，该实体癌可以是胃癌。
其他实施方式提供了一种新的抗CD43抗体或其抗原结合片段。该抗CD43抗体或其抗原结合片段可以与位于CD43的胞外结构域中的表位结合。该表位可以是包括CD43的胞外结构域中的含6～9个连续氨基酸的多肽，其中，所述6～9个连续氨基酸包括SEQ ID NO:131的氨基酸序列。
抗CD43抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
重链可变区按从N端到C端的顺序可包括第一互补决定区(CDR)(CDR1H)、第二CDR(CDR2H)和第三CDR(CDR3H)。
在一个实施方式中，抗CD43抗体或其抗原结合片段是重链可变区的必需组分，并且可以包括：CDR1H，包括GYX1MN(SEQ ID NO:110；X1可以选自所有氨基酸，例如可以是F或Y)(例如，GYFMN(SEQ ID NO:111)或GYYMN(SEQ ID NO:112))的氨基酸序列；CDR2H，包括RINPNX2GDSFYNQKFX3G(SEQ ID NO:113；X2和X3可以分别选自所有氨基酸，例如，X2可以是N或S，而X3可以是Q或K)(例如，RINPNNGDSFYNQKFQG(SEQ ID NO:114)、RINPNSGDSFYNQKFQG(SEQID NO:115)、RINPNNGDSFYNQKFKG(SEQ ID NO:116)或RINPNSGDSFYNQKFKG(SEQ ID NO:117))的氨基酸序列；和CDR3H，包括EGYYGGRGYALDY(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列。
轻链可变区按从N端到C端的顺序可包括第一CDR(CDR1L)、第二CDR(CDR2L)和第三CDR(CDR3L)。
在一个实施方式中，抗CD43抗体或其抗原结合片段是轻链可变区的必需组分，并且可以包括：CDR1L，包括RTSQDISNYLN(EQ ID NO:119)的氨基酸序列；CDR2L，包括X4TX5RLHS(SEQ ID NO:120；X4和X5可以分别选自所有氨基酸，例如，X4可以是N、Q或A，而X5可以是S或A)(例如，NTSRLHS(SEQ ID NO:121)、NTARLHS(SEQ ID NO:122)、QTSRLHS(SEQ ID NO:123)或ATSRLHS(SEQ ID NO:124))的氨基酸序列；以及，CDR3L，包括QQSNMFPY(SEQ ID NO:125)的氨基酸序列。
其他实施方式提供了一种用于预防和/或治疗癌症的药物组合物，包括抗CD43抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。
其他实施方式提供了一种用于预防和/或治疗癌症的方法，包括向需要预防和/或治疗癌症的受试者施用药学有效量的抗CD43抗体或其抗原结合片段的步骤。
其他实施方式提供了抗CD43抗体或其抗原结合片段在预防和/或治疗的应用，或在制备抗癌剂中的应用。
在一个具体实施方式中，对于用于预防和/或治疗癌症的药物组合物、方法和应用，抗CD43抗体或其抗原结合片段可以作为与细胞毒性物质(诸如抗癌剂)一起施用的单一活性成分提供，或者以与细胞毒性物质(诸如抗癌剂)组合的偶联物(抗体-药物偶联物；ADC)的形式提供。
其他实施方式提供了一种通过抗CD43抗体或其抗原结合片段来检测试样中癌细胞的方法。该检测方法可以包括使试样与抗CD43抗体或其抗原结合片段接触的步骤，和检测试样中的抗原-抗体反应的步骤。
其他实施方式提供了一种编码抗CD43抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
其他实施方式提供了一种包括该核酸分子的重组载体。该重组载体可用作在宿主细胞中表达核酸分子的表达载体。
其他实施方式提供了一种包括该核酸分子或重组载体的重组细胞。所述重组细胞可通过将核酸分子或重组载体转化到宿主细胞中来获得。
其他实施方式提供了一种用于制备抗CD43抗体或其抗原结合片段的方法。该制备方法可以包括在宿主细胞中表达核酸分子的步骤。该表达步骤可以包括培养重组细胞的步骤，并且可选地，可进一步包括从获得的细胞培养物中分离和/或纯化抗体的步骤。
在一个具体实施方式中，该制备方法可以包括：
(a)制备用核酸分子或重组载体转化的重组细胞的步骤；
(b)在足以表达核酸分子的条件和/或周期下培养重组细胞的步骤；以及
(c)从步骤(b)中获得的培养物中分离和/或纯化抗CD43抗体或其抗原结合片段的步骤。
【技术解决方案】
如上所述，为了完全治疗癌症，需要开发抑制或移除癌症干细胞的技术，并且，为此，需要选择能够使癌症干细胞与其他细胞中分离的癌症干细胞标记物。
在本文中，首次提出了：CD43在癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)的表面上表达。已知CD43是限于除红细胞之外的大多数白细胞、造血干细胞和血小板的特异性白细胞标记物，但是不知道它是否在癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)上表达。
另外，提出了特异性识别和/或结合CD43的胞外结构域的特定区域的抗CD43抗体具有抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)的效力。
CD43(分化簇43)被称为白细胞唾液酸蛋白或涎福林，并且是在除红血细胞之外的大多数血细胞的表面上表达的主要跨膜蛋白。CD43可以来源于哺乳动物，包括：灵长类动物，诸如人(Homo sapiens)等；啮齿动物，诸如小鼠(Mus musculus)等。例如，CD43可以是人CD43(例如，NCBI登录号AAA51949.1(基因(mRNA)：M61827.1)、NP_001025459.1(基因(mRNA)：NM_001030288.1)、NP_003114.1(基因：NM_003123.3)等)、小鼠CD43(例如，NCBI登录号NP_001032899.1(基因：NM_001037810.1)、NP_033285.1(基因：NM_009259.4)等)等。在该实施方式中，CD43可以是人CD43(蛋白质：NCBI登录号AAA51949.1(SEQ ID NO:130)；基因(mRNA)：M61827.1)。
本发明的一个实施方式提供了一种用于治疗实体癌的药物组合物，包括与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
其他实施方式提供了一种用于治疗实体癌的方法，包括向需要治疗实体癌的受试者施用药学有效量的与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段的步骤。
其他实施方式提供了与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段在治疗实体癌中的应用。
与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段的特征在于对癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)具有抑制活性。
因此，本发明的其他实施方式提供了一种用于抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)的药物组合物，包括与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
其他实施方式提供一种用于抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)的方法，包括向需要治疗实体癌的受试者施用药学有效量的与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段的步骤。
其他实施方式提供了与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段在抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)中的应用。
在本文中，除非另有限定，否则位于CD43的胞外结构域中的表位可以是指包括在CD43的胞外结构域中的含6～9个连续氨基酸的多肽，包括SEQ ID NO:131的氨基酸序列：
SEQ ID NO:131：Pro Leu Trp Thr Ser Ile。
该表位可以位于CD43蛋白的胞外结构域中，但是在正常情况下可能不暴露于外部环境，而如果细胞变成癌细胞或癌症干细胞，则会暴露于外部。因此，特异性识别该表位和/或与该表位特异性结合的抗体或其抗原结合片段可以可特异性靶向和/或抑制癌细胞和/或癌症干细胞。
表位所在的CD43的胞外结构域可以是CD43第73位～第81位的氨基酸区域(AAA51949.1；SEQ ID NO:130)(SEQ ID NO:134)。因此，该表位可以是在CD43(AAA51949.1)的SEQ ID NO:134中包括SEQ ID NO:131的6～9个连续的氨基酸区域。
该表位可以具有选自由SEQ ID NO:131～134组成的组中的氨基酸序列，并且例如可以具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列：
SEQ ID NO:132：Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile；
SEQ ID NO:133：Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile；
SEQ ID NO:134：Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile。
抗CD43抗体或其抗原结合片段可以是选自由识别上述表位或与上述表位特异性结合的所有抗体或抗原结合片段组成的组中的一种或多种。
在本文中，术语“JL-1”用于表示CD43或CD43的上述表位。
在本文中，抗体或其抗原结合片段可以选自由动物来源抗体、嵌合抗体、人源化抗体及其抗原结合片段组成的组。该抗体可以重组产生或合成产生。
当以治疗目的向人施用通过向动物免疫期望的抗原而产生的抗体时，通常可能发生免疫排斥。为了抑制免疫排斥，已开发出嵌合抗体。在嵌合抗体中，通过基因工程将引起抗同种型反应的动物来源抗体的恒定区置换为人抗体的恒定区。与动物来源抗体相比，嵌合抗体在抗同种型反应方面已经显著改善，但是由于动物来源的氨基酸存在于可变区中，它仍具有抗独特型反应的潜在副作用。开发人源化抗体以改善这些副作用。这是通过将在嵌合抗体的可变区中与抗原结合起重要作用的CDR(互补决定区)移植到人抗体框架中而构建的。
对构建人源化抗体的CDR移植技术最重要的事情是选择优化后的人抗体(最好能够接受动物源抗体的CDR)，为此，利用了抗体数据库应用、晶体结构分析、分子建模技术等。然而，用于恢复抗原结合能力的另外抗体工程技术的应用是至关重要的，因为尽管将动物来源抗体的CDR移植到优化的人抗体框架中，但位于动物来源抗体框架上的氨基酸可能影响抗原结合，并且因此很多情况下不能保持抗原结合能力。
抗体或抗原结合片段可以从活体(不存在于活体中)中分离出或者可以是非天然存在的，例如，可以合成产生或重组产生。
在本文中，“抗体”是指免疫系统中的抗原刺激所产生的物质，并且其种类没有特别限制，并可以是天然或非天然(例如合成或重组)获得的。该抗体对于大量表达和生产是有利的，因为它在体外和体内非常稳定并且其半衰期很长。另外，该抗体具有二聚体结构，因此其亲合力非常高。
完整的抗体具有由两条全长轻链和两条全长重链构成的结构，并且每条轻链通过二硫键连接到重链。抗体的恒定区被分为重链恒定区和轻链不变区，并且重链不变区具有伽玛(γ)型、缪(μ)型、阿尔法(α)型、得尔塔(δ)型和艾普西隆(ε)型，并且具有伽玛1(γ1)、伽玛2(γ2)、伽玛3(γ3)、伽玛4(γ4)、阿尔法1(α1)和阿尔法2(α2)作为亚类。轻链的恒定区具有卡帕(κ)型和拉姆达(λ)型。
术语“重链”被解释为涵盖所有包含可变区结构域VH以及3个恒定区结构域CH1、CH2和CH3和铰链的全长重链及其片段，该可变区结构域VH包括含有足以赋予抗原以特异性的可变区序列的氨基酸序列。此外，术语“轻链”被解释为涵盖所有包含可变区结构域VL和恒定区结构域CL的全长轻链及其片段，该可变区结构域VL包括含有足以赋予抗原以特异性的可变区序列的氨基酸序列。
术语“CDR(互补决定区)”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高变区的氨基酸序列。重链和轻链可以分别包含3个CDR(CDRH1、CDRH2、CDRH3，和CDRL1、CDRL2、CDRL3)。CDR可以提供用于使CDR与抗原或表位结合的主要接触残基。另一方面，在本文中，术语“特异性结合”或“特异性识别”是指本领域技术人员公知的含义，并且是指抗原与抗体特异性相互作用并且发生免疫反应。
术语“抗原结合片段”是免疫球蛋白的整个结构中的片段，并且是指包含抗原能结合的部分的多肽的一部分。例如，它可以是scFv、(scFv)2、scFv-Fc、Fab、Fab'或F(ab')2，但不限于此。
抗原结合片段的Fab是含有轻链和重链的可变区、轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)的结构，并且具有1个抗原结合片段。Fab'与Fab不同之处在于：它具有铰链区，所述铰链区包括在重链CH1结构域的C端处的一个或多个半胱氨酸残基。F(ab')2抗体通过在铰链区的半胱氨酸残基之间形成抗原结合片段而产生。Fv是仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段，并且产生Fv片段的重组技术是本领域技术人员来说是众所周知的。在双链Fv中，重链可变区和轻链可变区通过非共价键连接；并且，在单链Fv中，重链可变区和单链可变区通常经由肽连接子通过共价键连接或在C端直接连接，因此它可以形成与双链Fv相同的结构。连接子可以是由1～100个或2～50个任何氨基酸组成的肽连接子，并且合适的序列是本领域已知的。抗原结合片段可以通过使用蛋白酶来获得(例如，当用木瓜蛋白酶限制性消化完整抗体时，可以获得Fab；并且当用胃蛋白酶裂解时，可以获得F(ab')2片段)，并且可以通过基因重组技术来构建。
术语“铰链区”是抗体的重链中的区，并且存在于CH1区和CH2区之间，是指在抗体中起到提供抗原结合片段的灵活性作用的区。例如，铰链可以来自人抗体，并且具体而言，可以来自IgA、IgE或IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
抗CD43抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，并且例如可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以通过本领域众所周知的方法制备。例如，它可以通过使用噬菌体展示技术来制备。
另一方面，通过使用基于对CD43的结合能力的典型ELISA(酶联免疫吸附测定)方式可筛选独特的单克隆抗体。抑制活性可以通过用于测试组装的分子相互作用的功能分析(诸如竞争性ELISA、基于细胞的分析、斯卡查德分析或表面等离子共振等)来测试。然后，可测试基于强抑制活性选择的每种单克隆抗体对CD43的亲和力(Kd值)。
例如，抗CD43或其抗原结合片段可以对CD43(例如，人CD43、小鼠CD43等)或位于CD43的胞外结构域中的表位具有1mM或更少、100nM或更少、10nM或更少、5nM或更少、或者3nM或更少，例如1pM～1mM、1pM～100nM、1pM～10nM、1pM～5nM、1pM～3nM、10pM～1mM、10pM～100nM、10pM～10nM、10pM～5nM、10pM～3nM、100pM～1mM、100pM～100nM、100pM～10nM、100pM～5nM、100pM～3nM、1nM～1mM、1nM～100nM、1nM～10nM、1nM～5nM或1nM～3nM的结合亲和力(Kd；例如，通过斯卡查德分析测得)。
其他实施方式提供了生产单克隆抗CD43抗体的杂交瘤细胞系。杂交瘤细胞系可以是登记号为KCLRF-BP-00010的H-JL1细胞系。
抗CD43或其抗原结合片段可以与选自由细胞毒性物质等组成的组中的一种或多种一起应用。
因此，除了抗CD43或其抗原结合片段之外，药物组合物可进一步包括选自由细胞毒性物质等组成的组中的一种或多种。此外，除了施用抗CD43或其抗原结合片段的步骤之外，治疗和/或抑制的方法可进一步包括施用选自由细胞毒性物质等组成的组中的一种或多种的步骤。
具体而言，本发明的其他实施方式提供了一种用于治疗实体癌的药物组合物，所述药物组合物包括以下作为活性成分：(1)与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段，和(2)选自由细胞毒性物质等组成的组中的一种或多种。
其他实施方式提供了一种用于治疗实体癌的方法，包括：(1)向需要治疗实体癌的受试者施用药学有效量的与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段的步骤，和(2)向需要治疗实体癌的受试者施用药物有效量的选自由细胞毒性物质等组成的组中的一种或多种的步骤。
其他实施方式提供了一种用于抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌中的癌症干细胞)的药物组合物，所述药物组合物包括以下作为活性成分：(i)与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段，和(ii)选自由细胞毒性物质等组成的组中的一种或多种。
其他实施方式提供了一种用于抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌中的癌症干细胞)的药物组合物，包括：(i)向癌症患者(例如实体癌患者)施用药学有效量的与位于CD43的胞外结构域的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段的步骤，和(ii)向癌症患者(例如实体癌患者)施用药物有效量的选自由细胞毒性物质等组成的组中的一种或多种的步骤。
对于药物组合物，抗CD43抗体或其抗原结合片段和选自由细胞毒性物质等组成的组中的一种或多种可以通过彼此偶联或混合而配制成一种制剂，或者分别配制成单独配制，然后混合。对于该方法，施用抗CD43抗体或其抗原结合片段和选自由细胞毒性物质等组成的组中的一种或多种的步骤可以同时进行或按不考虑次序的顺序进行。
细胞毒性物质可以是对癌细胞(特别是实体癌细胞)具有毒性的所有物质，并且可以是选自由放射性同位素、细胞毒性化合物(小分子)、细胞毒性蛋白、抗癌剂等组成的组中的一种或多种，但不限于此。细胞毒性蛋白可以是选自蓖麻毒蛋白、皂草素、白树毒素、苦瓜毒蛋白、三角梅核糖体失活蛋白(debouganin)、白喉毒素、假单胞菌毒素等组成的组中的一种或多种，但不限于此。放射性同位素可以是选自由131I、188Rh、90Y等组成的组中的一种或多种，但不限于此。细胞毒性化合物可以是选自由倍癌霉素、单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)、单甲基奥瑞他汀F(MMAF)、N2'-去乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)美登素(DM1)、PBD(吡咯并苯二氮杂)二聚体等组成的组中的一种或多种，但不限于此。
抗CD43抗体或其抗原结合片段和选自由细胞毒性物质等组成的组中的一种或多种可以以彼此连接的(例如，通过共价键、肽键等)偶联物或融合蛋白(在细胞毒性物质和/或标记物材料是蛋白质的情况下)的形式使用。抗体(或抗原结合片段)与细胞毒性物质之间的偶联可遵循本发明所属领域中的公知技术。
活性成分(抗CD43抗体或其抗原结合片段和/或细胞毒性物质和/或标记物质)可以与药学上可接受的载体一起应用(施用)，并且药学上可接受的载体通常用于药物的配制，并且可以是选自由乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、钙磷酸盐、海藻酸盐、明胶、钙硅酸盐、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等组成的组中的一种或多种，但不限于此。抗CD43抗体可进一步包括选自由稀释剂、赋形剂、润滑剂、湿润剂、甜味剂、矫味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等通常用于制备除药物组合物的其它组分组成的组中的一种或多种。
活性成分或药物组合物可以口服或胃肠外给药。在胃肠外给药的情况下，它可以通过静脉注射、皮下注射、肌内注射、腹腔内注射、内胚层给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药或直肠给药等进行施用。在口服给药的情况下，口服组合物应该被包衣或配制以防止活性药物在胃中由于蛋白质或肽被消化而降解。另外，抗CD43抗体或其抗原结合片段可以通过可将活性物质递送至靶细胞的任何装置进行施用。
在本文中，“药学有效量”是指示出药学上有意义药物效果的量。对于单剂量，活性成分的药学有效量可以根据诸如配制方法，给药方式，患者的年龄、体重、性别、病情，食物，给药时间，给药间隔，给药途径，排泄速率和易感性的因素开不同的药方。例如，单剂量的活性成分(例如抗CD43抗体或其抗原结合片段)的药物有效量可以在0.001～100mg/kg或0.02～10mg/kg的范围内，但不限于此。单剂量的药学有效量可以配制成单位容量形式的一种制剂，以适量配制，或通过填充多容量容器来制备。
实体癌可以是指除血液系统恶性肿瘤之外的所有非血液系统恶性肿瘤。例如，实体癌可以是选自由肺癌(例如，鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼球中的黑色素瘤、直肠癌、肛门附近的癌症、食管癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、胃肠癌、胃癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、胆囊癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫癌、子宫内膜癌、宫颈癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、头颈癌、脑癌、骨肉瘤等组成的组中一种或多种，但不限于此。例如，实体癌可以是胃癌、乳腺癌、肺癌、大肠癌、肝癌、胆囊癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌或膀胱癌。癌症不仅包括原发性癌症，还包括转移性癌症。此外，实体癌可以是对常规抗癌剂(例如，小分子抗癌剂(抗癌化学剂)、抗代谢剂、烷化剂、抗生素、长春花生物碱、酶、激素、靶向治疗剂和/或抗体治疗剂等)有耐药性的癌症，并且可以是在常规抗癌剂(例如，小分子抗癌剂(抗癌化学剂)、抗代谢剂、烷化剂、抗生素、长春花生物碱、酶、激素、靶向治疗剂和/或抗体治疗剂等)的治疗之后复发的癌症。
对实体癌的治疗效果不仅包括癌细胞(特别是癌症干细胞)或包含癌细胞的癌组织的生长抑制(定量减少)和凋亡，而且还包括通过抑制迁移、侵入，转移对癌症恶化的抑制效果等。
在本文中，“癌症干细胞的抑制”是指对癌症干细胞的所有定量和/或功能抑制，诸如生长抑制(定量减少)、凋亡等；和/或涉及癌症干细胞细胞的癌症的治疗和/或改善。
在本文中，“患者”是指需要治疗癌症(例如，实体癌或血液系统恶性肿瘤)和/或抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌中的癌症干细胞)的患者，并且可以是所有的哺乳动物(例如人)，并且可以是患有癌症、具有癌症症状或处于发展成癌症危险的患者，或者从其中分离的细胞、组织、体液或其培养物。
其他实施方式提供一种偶联物，在所述偶联物中有与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段和癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌中的癌症干细胞)，其中，抗体或抗原结合片段与癌症干细胞结合。其他实施方式提供了一种用于制备与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段和癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌中的癌症干细胞)的偶联物的方法，其中，抗体或抗原结合片段与癌症干细胞结合，该方法包括使与位于CD43的胞外结构域中的表位结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段与癌症试样(例如实体癌试样)接触或者将它施用于癌症患者(例如实体癌患者)的步骤。该方法可以在体内或体外进行。该偶联物或其生产方法可以用于各种临床、诊断和/或实验目的，以及实体癌的治疗。例如，通过检测当抗CD43抗体或其抗原结合片段与癌症试样接触时是否产生复合物，可用于确认癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌中的癌症干细胞)的存在，和/或使癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌中的癌症干细胞)可视化。然后，抗CD43抗体或其抗原结合片段可以另外包括标记物质。该标记物质可以是选自由放射性同位素、荧光材料、色原、染料等组成的组中的一种或多种。该荧光材料可以是通常可用的所有荧光材料，并且例如可以是选自由异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)或生物素组成的中的一种或多种，但不限于此。该标记物质可以通过常规方法(例如，化学键，诸如共价键、配位键、离子键等)与抗体或抗原结合片段组合(连接)。根据本发明所属领域的公知技术来使抗体(或抗原结合片段)与标记物质组合。
癌症试样可以是从癌症患者中分离出的或人工培养的癌细胞系或细胞、组织、体液等。实体癌试样可以是从实体癌患者中分离出的或人工培养的实体癌细胞系或细胞、组织、体液等。
其他实施方式提供了CD43(特别是位于CD43的胞外结构域中的表位)在检测癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)中作为标记物的应用。具体而言，一个实施方式提供了一种用于检测癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌中的癌症干细胞)的组合物，包括与CD43(特别是位于CD43的胞外结构域中的表位)相互作用的材料。其他实施方式提供了一种用于检测癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌中的癌症干细胞)的方法，包括接触CD43(特别是位于CD43的胞外结构域中的表位)相互作用的材料的步骤，以及测量CD34(特别是位于CD43的胞外结构域中的表位)是否与该材料相互作用或相互作用程度的步骤。在这种情况下，当CD43(特别是位于CD43的胞外结构域中的表位)与材料之间存在相互作用存在或相互作用程度较高时，可以判定(确定)细胞试样包括癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌中的癌症干细胞)。相互作用材料可以是选自由能与CD43(特别是位于CD43胞外结构域中的表位)相互作用的所有材料，例如化学材料(小分子化学剂)、抗体、抗体的抗原结合片段、适体等组成的组中的一种或多种。是否存在相互作用可通过使用相互作用物质的常规蛋白质分析方法来测量，例如，免疫色谱法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA)、免疫测定法(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、发光免疫分析(LIA)、蛋白质印迹、荧光原位杂交(FISH)、流式细胞仪、微阵列法等，但不限于此。细胞试样可以是从哺乳动物(例如人)中分离出的细胞、组织或其培养物，并且例如可以是从癌症患者(例如实体癌患者)中分离出的癌细胞、癌组织或其培养物。
其他实施方式提供了位于CD43的胞外结构域中的表位在筛选实体癌治疗剂中的应用。
其他实施方式提供了一种用于筛选抗实体癌剂的药剂，包括位于CD43的胞外结构域中的表位。
其他实施方式提供了一种用于筛选抗实体癌剂的方法，包括使候选化合物与位于CD43胞外结构域中的表位接触的步骤，以及选择与表位结合的候选化合物以将其确定为实体癌治疗候选物的步骤。
如上所述筛选的实体癌治疗剂的特征可以在于具有抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌中的癌症干细胞)的效果。
因此，其他实施方式提供了位于CD43的胞外结构域中的表位在筛选抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)的药剂中的应用。
其他实施方式提供了一种用于抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌的癌症干细胞)的药剂筛选的药剂，该药剂为位于CD43的胞外结构域中的表位。
其他实施方式提供了一种用于筛选抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌中的癌症干细胞)的药剂的方法，包括使候选化合物与位于CD43的胞外结构域中的表位接触的步骤，以及选择与表位结合的候选化合物以将其确定为抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌中的癌症干细胞)的药剂的候选物质。
与表位结合的候选化合物对于该表位可具有1mM或更少，100nM或更少，10nM或更少，5nM或更少，或者3nM或更少，例如1pM～1mM、1pM～100nM、1pM～10nM、1pM～5nM、1pM～3nM、10pM～1mM、10pM～100nM、10pM～10nM、10pM～5nM、10pM～3nM、100pM～1mM、100pM～100nM、100pM～10nM、100pM～5nM、100pM～3nM、1nM～1mM、1nM～100nM、1nM～10nM、1nM～5nM或1nM～3nM的结合亲和力(Kd；例如，通过斯卡查德分析测得)。
该表位如前所述并且可以具有选自SEQ ID NO:131～134的氨基酸序列。该表位可以作为整个CD43蛋白提供或作为包含表位的部分提供，或者化学合成或重组产生。
候选化合物可以是人工合成的，或者可以是选自由天然的各种化合物、多肽、寡肽、肽结构或蛋白质结构(例如抗体、抗体的抗原结合片段、肽体、纳米抗体等)、多核苷酸、寡核苷酸、反义RNA、shRNA(短发夹RNA)、siRNA(小干扰RNA)、适体、天然提取物等组成的组中的一种或多种。
候选化合物和表位的组合可以通过确认候选化合物和表位的复合形成来进行，并且它可以通过本领域公知的各种方法来进行。例如，它可以通过普通的酶促反应，荧光、发光和/或放射线检测来测量，并且具体而言，可以通过选自由免疫层析法、免疫组织化学法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、发光免疫分析(LIA)、蛋白质印迹等组成的组中的方法来测量，但不限于此。
在一个实施方式中，如上所述筛选的治疗实体癌的药剂或抑制癌症干细胞的药剂可以是选自由抗体、抗体的抗原结合片段、抗体样蛋白质结构(例如，肽体、纳米抗体)等组成的组的一种或多种。
在其他实施方式中，提供了一种用于治疗实体癌的药物组合物，包括如上筛选的治疗实体癌的药剂。其他实施方式提供了一种用于治疗实体癌的方法，包括向需要治疗实体癌的患者施用药学有效量的治疗实体癌的筛选药剂的步骤。在一个实施方式中，该实体癌可以是胃癌。
其他实施方式提供了用于抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌中的癌症干细胞)的药物组合物，包括如上筛选的抑制癌症干细胞的药剂。其他实施方式提供了一种用于抑制癌症干细胞(例如血液系统恶性肿瘤或实体癌中的癌症干细胞)的方法，包括向癌症患者(例如实体癌患者)施用药学有效量的上述抑制癌症干细胞的药剂的步骤。在一个实施方式中，该实体癌可以是胃癌。
其他实施方式提供了一种新的抗CD43抗体或其抗原结合片段。该抗CD43抗体或其抗原结合片段可以与位于CD43的胞外结构域中的表位结合。该表位可以是包括CD43的胞外结构域中的含6～9个连续氨基酸的多肽，包括SEQ ID NO:131的氨基酸序列。
抗CD43抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。抗CD43抗体或其抗原结合片段可以是动物来源抗体(例如小鼠抗体)、嵌合抗体或人源化抗体，并且可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且它可以是非天然(例如，化学或生物合成、重组方法等)产生的。
重链可变区可以按从N端到C端依次包括第一互补决定区(CDR)(CDR1H)、第二CDR(CDR2H)和第三CDR(CDR3H)。
在一个实施方式中，抗CD43抗体或其抗原结合片段可以包括以下作为重链可变区的必需组分：CDR1H，包括GYX1MN(SEQ ID NO:110；X1可以选自所有氨基酸，例如可以是F或Y)(例如，GYFMN(SEQ ID NO:111)或GYYMN(SEQ ID NO:112))的氨基酸序列；CDR2H，包括RINPNX2GDSFYNQKFX3G(SEQ ID NO:113；X2和X3可以分别选自所有氨基酸，例如，X2可以是N或S，而X3可以是Q或K)(例如，RINPNNGDSFYNQKFQG(SEQ ID NO:114)、RINPNSGDSFYNQKFQG(SEQID NO:115)、RINPNNGDSFYNQKFKG(SEQ ID NO:116)或RINPNSGDSFYNQKFKG(SEQ ID NO:117))的氨基酸序列；和CDR3H，包括EGYYGGRGYALDY(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列。
重链可变区可进一步包括在前述互补决定区(CDR)的N端和/或C端处的免疫球蛋白的框架。更具体而言，重链可变区从N端到C端依次可包括第一框架(FR1H)、第一互补决定区(CDR)(CDR1H)、第二框架(FR2H)、第二CDR(CDR2H)、第三框架(FR3H)、第三CDR(CDR3H)和第四框架(FR4H)。
在一个具体的实施方式中，抗CD43抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且
(i)FR1H可以包括SEQ ID NO:83至SEQ ID NO:94之一的第1位至第30位的氨基酸序列，或者与上述氨基酸序列具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、99.1％或更多、99.2％或更多、99.3％或更多、99.4％或更多、99.5％或更多、99.6％或更多、99.7％或更多、99.8％或更多、99.9％或更多序列同源性的氨基酸序列；
(ii)CDR1H可以包括GYX1MN(SEQ ID NO:110；X1可以选自所有氨基酸，并且例如可以是F或Y)的氨基酸序列，并且例如可以包括GYFMN(SEQ ID NO:111)或GYYMN(SEQ ID NO:112)的氨基酸序列；
(iii)FR2H可以包括SEQ ID NO:83至SEQ ID NO:94之一的第36位至第49位的氨基酸序列，或者与上述氨基酸序列具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、99.1％或更多、99.2％或更多、99.3％或更多、99.4％或更多、99.5％或更多、99.6％或更多、99.7％或更多、99.8％或更多、99.9％或更多序列同源性的氨基酸序列；
(iv)CDR2H可以包括RINPNX2GDSFYNQKFX3G(SEQ ID NO:113；X2和X3中的每一个可以独立地选自所有氨基酸，并且例如X2可以是N或S，X3可以是Q或K)的氨基酸序列，并且例如可以包括RINPNNGDSFYNQKFQG(SEQ ID NO:114)、RINPNSGDSFYNQKFQG(SEQ ID NO:115)、RINPNNGDSFYNQKFKG(SEQ ID NO:116)或RINPNSGDSFYNQKFKG(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列；
(v)FR3H可以包括SEQ ID NO:83至SEQ ID NO:94之一的第67位至第98位的氨基酸序列，或者与上述氨基酸序列具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、99.1％或更多、99.2％或更多、99.3％或更多、99.4％或更多、99.5％或更多、99.6％或更多、99.7％或更多、99.8％或更多、99.9％或更多序列同源性的氨基酸序列；
(vi)CDR3H可以包括EGYYGGRGYALDY(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列；
(vii)FR4H可以包括SEQ ID NO:83至SEQ ID NO:94之一的第112位至第122位的氨基酸序列，或者与上述氨基酸序列具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、99.1％或更多、99.2％或更多、99.3％或更多、99.4％或更多、99.5％或更多、99.6％或更多、99.7％或更多、99.8％或更多、99.9％或更多序列同源性的氨基酸序列。
轻链可变区从N端到C端依次可包括第一CDR(CDR1L)、第二CDR(CDR2L)和第三CDR(CDR3L)。
在一个实施方式中，抗CD43抗体或其抗原结合片段可以包括以下作为轻链可变区的必需组分：CDR1L，包括RTSQDISNYLN(SEQ ID NO:119)的氨基酸序列；CDR2L，包括X4TX5RLHS(SEQ ID NO:120；X4和X5可以分别选自所有氨基酸，例如，X4可以是N、Q或A，而X5可以是S或A)(例如，NTSRLHS(SEQ ID NO:121)、NTARLHS(SEQ ID NO:122)、QTSRLHS(SEQ IDNO:123)或ATSRLHS(SEQ ID NO:124))的氨基酸序列；和CDR3L，包括QQSNMFPY(SEQ ID NO:125)的氨基酸序列。
轻链可变区可进一步包括在前述互补决定区(CDR)的N端和/或C端处的免疫球蛋白的框架。更具体而言，轻链可变区可从N端到C端的顺序依次可包括第一框架(FR1L)、第一互补决定区(CDR)(CDR1 L)、第二框架(FR2 L)、第二CDR(CDR2 L)、第三框架(FR3 L)、第三CDR(CDR3 L)和第四框架(FR4 L)。
在一个具体实施方式中，
(viii)FR1L可包括SEQ ID NO:95至SEQ ID NO:109之一的第1位至第23位的氨基酸序列，或者与上述氨基酸序列具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、99.1％或更多、99.2％或更多、99.3％或更多、99.4％或更多、99.5％或更多、99.6％或更多、99.7％或更多、99.8％或更多、99.9％或更多序列同源性的氨基酸序列；
(ix)CDR1L可包括RTSQDISNYLN(SEQ ID NO:119)的氨基酸序列；
(x)FR2L可包括SEQ ID NO:95至SEQ ID NO:109之一的第35位至第49位的氨基酸序列，或者与上述氨基酸序列具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、99.1％或更多、99.2％或更多、99.3％或更多、99.4％或更多、99.5％或更多、99.6％或更多、99.7％或更多、99.8％或更多、99.9％或更多序列同源性的氨基酸序列；
(xi)CDR2L可包括X4TX5RLHS(SEQ ID NO:120；X4和X5中的每一个可以独立地选自所有氨基酸，并且例如X4可以是N、Q或A，并且X5可以是S或A)的氨基酸序列，并且例如可以包括NTSRLHS(SEQ ID NO:121)、NTARLHS(SEQ ID NO:122)、QTSRLHS(SEQ ID NO:123)或ATSRLHS(SEQ ID NO:124)。
(xii)FR3L可包括SEQ ID NO:95至SEQ ID NO:109之一的57位至第88位的氨基酸序列，或者与上述氨基酸序列具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、99.1％或更多、99.2％或更多、99.3％或更多、99.4％或更多、99.5％或更多、99.6％或更多、99.7％或更多、99.8％或更多、99.9％或更多序列同源性的氨基酸序列。
(xiii)CDR3L可包括QQSNMFPY(SEQ ID NO:125)的氨基酸序列；
(xiv)FR4L可包括SEQ ID NO:95至SEQ ID NO:109之一的第97位至第108位的氨基酸序列，或者与上述氨基酸序列具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、99.1％或更多、99.2％或更多、99.3％或更多、99.4％或更多、99.5％或更多、99.6％或更多、99.7％或更多、99.8％或更多、99.9％或更多序列同源性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗CD43抗体或其抗原结合片段可以包括重链可变区和轻链可变区。重链可变区可以包括SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26、30、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93或94的氨基酸序列。轻链可变区可以包括SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108或109的氨基酸序列。
例如，抗CD43抗体或其抗原结合片段可以是人源化的，并且可以被解释为包括如下限定的重链可变区和轻链可变区：
(a)包括SEQ ID NO:83的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包括SEQ ID NO:84的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包括SEQ ID NO:85的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:97的氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包括SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:98的氨基酸序列的轻链可变区；
(e)包括SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:99的氨基酸序列的轻链可变区；
(f)包括SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:100的氨基酸序列的轻链可变区；
(g)包括SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:101的氨基酸序列的轻链可变区；
(h)包括SEQ ID NO:90的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:102的氨基酸序列的轻链可变区；
(i)包括SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:103的氨基酸序列的轻链可变区；
(j)包括SEQ ID NO:93的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:103的氨基酸序列的轻链可变区；
(k)包括SEQ ID NO:94的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:106的氨基酸序列的轻链可变区；
(1)包括SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:97的氨基酸序列的轻链可变区；
(m)包括SEQ ID NO:85的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:103的氨基酸序列的轻链可变区；
(n)包括SEQ ID NO:93的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:107的氨基酸序列的轻链可变区；
(o)包括SEQ ID NO:93的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:108的氨基酸序列的轻链可变区；或者
(p)包括SEQ ID NO:93的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:109的氨基酸序列的轻链可变区。
一个具体实施方式，在人源化抗CD43抗体或其抗原结合片段中构成的框架的氨基酸序列可以如下说明，但不限于此：
(i)FR1H可以包括来自SEQ ID NO:83～94之一的第1位至第30位的氨基酸残基；
(ii)FR2H可以包括来自SEQ ID NO:83～94之一的第36位至第49位的氨基酸残基；
(iii)FR3H可以包括来自SEQ ID NO:83～94之一的第67位至第98位的氨基酸残基；
(iv)FR4H可以包括来自SEQ ID NO:83～94之一的第112位至第122位的氨基酸残基；
(v)FR1L可以包括来自SEQ ID NO:95～109之一的第1位至第23位的氨基酸残基；
(vi)FR2L可以包括来自SEQ ID NO:95～109之一的第35位至第49位的氨基酸残基；
(vii)FR3L可以包括来自SEQ ID NO:95～109之一的第57位至第88位的氨基酸残基；
(viii)FR4L可以包括来自SEQ ID NO:95～109之一的第97位至第108位的氨基酸残基；
在其他实例中，CD43抗体或其抗原结合片段还可以包括由人免疫球蛋白诱导的人重链恒定区和/或人轻链恒定区。人免疫球蛋白可以选自由IgA、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM等组成的组。例如，人重链恒定区可以包括SEQ ID NO:40的第123位～第452位的氨基酸序列，或者与上述氨基酸序列具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、99.1％或更多、99.2％或更多、99.3％或更多、99.4％或更多、99.5％或更多、99.6％或更多、99.7％或更多、99.8％或更多、99.9％或更多序列同源性的氨基酸序列；并且人轻链恒定区可以包括SEQ ID NO:48的第108位～第214位的氨基酸序列，或者与上述氨基酸序列具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、99.1％或更多、99.2％或更多、99.3％或更多、99.4％或更多、99.5％或更多、99.6％或更多、99.7％或更多、99.8％或更多、99.9％或更多序列同源性的氨基酸序列。
在其他实施方式中，抗CD43抗体或其抗原结合片段的特征可以在于氨基酸残基未被糖基化。为此，当糖基化基序，例如N-糖基化基序(例如“NXS/T”(X可以是所有氨基酸残基))存在于抗体中，特别是存在于重链可变区和/或轻链可变区中时，基序可能会被修饰。例如，当N-糖基化基序是“N-X-S/T”(X可以是所有氨基酸残基)时，基序中的“N”、“S/T”或它们两者可以分别被不同于原来的氨基酸替换。在一个实施方式中，未糖基化的抗CD43抗体或其抗原结合片段可以包括NTARLHS(SEQ ID NO:122)、QTSRLHS(SEQ ID NO:123)或ATSRLHS(SEQ ID NO:124)作为CDR2L。作为其他实施方式，非糖基化的抗CD43抗体或其抗原结合片段可以包括SEQ ID NO:107、108或109的氨基酸序列作为轻链可变区。
抗CD43抗体或其抗原结合片段特异性结合到前述CD43的特异性表位，并且可以选自由动物抗体(例如小鼠抗体)、嵌合抗体、人源化抗体及其抗原结合片段组成的组。动物抗体可以来源于除人以外的动物物种，并且例如可以来源于大鼠、小鼠、山羊、天竺鼠、驴、兔、马、美洲驼、骆驼、鸟类(例如鸡，鸭等)等，但不限于此。由动物抗体构建嵌合抗体和/或人源化抗体的技术已为本领域所熟知。人源化抗体可以是IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD、IgE或任何适当的同种型(isotype)，诸如任何亚类。
在本文中，对CD43的抗体的结合特异性可以是指该抗体对CD43的亲和力比对非CD43肽的亲和力更高，或者该抗体对CD43的上述表位的亲和力比对CD43的其他区或其他胞外区的亲和力更高。
抗体与抗原(更具体而言，表位)的结合(抗原-抗体结合)可以通过本领域已知的所有方法来测量。例如，抗原-抗体结合可以通过选自由ELISA、流式细胞术、免疫化学染色、BIAcore光学生物传感器等组成的组中的一种或多种方法，但不限于此。
本文中使用的术语“抗原结合片段”是指抗体具有特异性识别抗原(CD43)或CD43的前述表位和/或与其特异性结合的能力的部分(片段)。例如，抗原结合片段可以选自由Fab、F(ab)2、Fv、scFv、scFv-Fc片段等组成的组。
在一个实施方式中，抗CD43的表位可以是抗CD43 scFv。抗CD43 scFv可以包括前述的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，或者包括前述的重链可变区和轻链可变区。
对于抗CD43 scFv，上述重链可变区和轻链可变区可以通过适当的连接子连接。连接子可以是由1～100个或2～50个任何氨基酸组成的肽连接子，并且合适的序列是本领域已知的。在一个实施方式中，肽连接子可以表示为GGGX6S(X6是G或A；SEQ ID NO:126)或(GGGX6S)n(n是1～5的整数，并且每个重复单元中包含的X6独立地是G或A)，并且例如可以包括GGGASGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:127)或GGGGSGGGGSGGGAS(SEQ ID NO:128)的氨基酸序列，但不限于此。
在一个实施方式中，抗CD43 scFv可以包括SEQ ID NO:50、52、54、56或58的氨基酸序列，但不限于此。
在一个实施方式中，抗CD43抗体或其抗原结合片段可以通过与能诱导细胞死亡(例如，包括程序性细胞死亡，诸如凋亡)的细胞毒性物质偶联而显现出对靶细胞的细胞毒性。细胞毒性物质可以是选自由已知对细胞(特别是本领域中的癌细胞)显现出毒性的所有化合物(小分子化合物；抗癌剂等)、蛋白质、肽、寡核苷酸、多核苷酸等组成的组中的一种或多种，并且例如可以是选自由放射性同位素、细胞毒性化合物(小分子)、细胞毒性蛋白、抗癌剂等组成的组中的一种或多种。细胞毒性蛋白可以是选自由蓖麻毒蛋白、皂草素、白树毒素、苦瓜毒蛋白、三角梅核糖体失活蛋白、白喉毒素、假单胞菌毒素等组成的组中的一种或多种，但不限于此。放射性同位素可以是选自由131I、188Rh、90Y等组成的组中的一种或多种，但不限于此。细胞毒性化合物可以是选自倍癌霉素、单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)、单甲基奥瑞他汀F(MMAF)、N2'-去乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)美登素(DM1)、PBD(吡咯并苯二氮杂)二聚体等组成的组中的一种或多种，但不限于此。
在其他实施方式中，抗CD43抗体或其抗原结合片段可作为偶联有可检测标记物的偶联物形式提供。偶联物可以有效地用于在体外或体内检测CD43或上述CD43表位的存在。可检测标记物可以选自本领域公知的所有标记物材料，并且例如可以是选自由放射性标记物(例如3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、153Sm等)、酶、荧光标签、发光标签、生物发光标签、磁性标签、诸如生物素的化学材料等组成的组中的一种或多种，但不限于此。根据抗体或表位的应用来选择合适的标签对于本领域技术人员而言是显而易见的。
其他实施方式提供了一种用于预防和/或治疗癌症的药物组合物，包括抗CD43抗体或其抗原结合片段作为活性成分。其他实施方式提供了一种用于抑制癌症干细胞的药物组合物，包括抗CD43抗体或其抗原结合片段作为活性成分。其他实施方式提供了一种用于预防和/或治疗癌症的方法，包括向需要预防和/或治疗癌症的受试者施用药学有效量的抗CD43抗体或其抗原结合片段的步骤。其他实施方式提供了一种用于抑制癌症干细胞的方法，包括向需要预防和/或治疗癌症的受试者施用药学有效量的抗CD43抗体或其抗原结合片段的步骤。药学有效量是指在待给药的受试者中获得期望的抗癌效果例如治疗效果(例如，癌细胞的细胞死亡增加、癌症组织减少、抑制癌症转移等)有效的量。对于药物组合物和方法，抗CD43抗体或其抗原结合片段可以单独使用或以与细胞毒性物质连接的偶联物的形式使用。细胞毒性物质与上述相同。
癌症可以特指表达CD43的上述表位的所有癌症。在一个实施方式中，癌症可以是血液系统恶性肿瘤，并且例如可以是选自由急性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性单核细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等组成的组中的一种或多种。在其他实施方式中，癌症可以是选自下述的实体癌中的一种或多种。
抗体或抗原结合片段可以以对与细胞表面上的CD43(特别是表达CD43表位的肿瘤细胞上的上述CD43或CD43表位)结合而言足量施用，并且本领域技术人员可以确定该量而没有任何困难。
上述药学有效量或足量是指在待给药的对象中产生期望效果的量。期望效果将伴随着抗体与细胞表面上表达的CD43(或CD43的表位)的结合，并且该结合可以通过抗体、抗原结合片段或者与抗体或片段偶联的细胞毒性物质表现出细胞毒性(例如，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC))。在其他实施方式中，期望效果诱导抗体与细胞表面上表达的CD43的结合，而其他抗体很少或没有细胞毒性，并且因此该结合可以使本领域技术人员检测并选择性除去(例如白细胞分离术)CD43+细胞和患者中的CD43+细胞(例如，用检测标记物标记的抗体或片段)。所需的抗体分子的量可以根据患者，患者的种族、年龄和一般状况，特定化合物的施用，施用方法等而在患者中有所不同。因此，可能无法指定“准确的足量”。然而，在任何个别情况下，可以使用常规实验通过常规技术来确定适当的量。此外，可以根据情况的紧急程度来调整剂量，并可以调整剂量以推断出最佳剂量。例如，可以每天、每周、每月或以其他适当的时间间隔提供多次剂量。
上述药学有效量或足量可以通过监测与从施用或待施用抗体或其抗原结合片段的患者获得的生物试样(例如，体液试样(例如血液试样等)、细胞/组织试样(例如，肿瘤细胞/组织试样等)等中的细胞结合的抗体进行确定。可以在施用抗体或片段之后的特定时间(例如，施用后约5、10、15或20分钟)从患者中收集生物试样。试样中的细胞表面上存在抗体或片段(即，通过抗原-抗体反应而与细胞表面上的CD43或其表位结合的抗体或抗原结合片段)可以通过使用本领域公知的方法进行分析。另外，所获得的生物试样可以用于测量试样中细胞存活率或活细胞数量的一般分析。基于在施用抗体或片段后CD43阳性细胞的数量减少(例如，施用抗体或片段的试样中活细胞数量与对照试样，如在施用抗体或片段之前获得的试样等相比减少)的这一事实，可以测量抗体介导的细胞毒性。细胞毒性可以单独由抗体(例如，未与细胞毒性物质或抗原结合片段连接的非偶联抗体)介导和/或可以由与抗体或片段偶联的细胞毒性物质介导。
本文提供的与CD43表位特异性结合的抗CD43抗体或其抗原结合片段可以使已施用的患者试样中CD43阳性靶细胞的水平与对照试样(例如，在施用抗体或片段之前从患者中获得的试样)中CD43阳性细胞的水平相比减少10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多或90％或更多。在一个实施方式中，CD43阳性细胞可以是癌细胞，例如，恶性造血细胞(例如白血病细胞)和/或癌症干细胞。
在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段的剂量(药学有效量)可以通过基于体外细胞的分析来估计和确定。例如，为了确定为减少作为抗体或片段的靶标的CD43阳性细胞数量所用的抗体或片段的浓度，可以进行使用CD43阳性细胞(例如CEM7细胞系)的基于体外细胞的分析。减少体外细胞数量(例如，与当抗体或片段不存在时的细胞数量相比，减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)所确定的抗体或片段的浓度可以用作确定足以减少体内所需的CD43阳性细胞数量的剂量的基础。另外，考虑患者的体重、血量、清除率等因素来确定剂量。
本文中使用的术语“受试者或患者”可以选自哺乳动物(如人、大猩猩、黑猩猩等)的动物，或者可以是从动物或其培养物中分离出的细胞、组织、体液。哺乳动物可以包括人。本文中提供的发明可以用于在人或兽医领域中特异性靶向CD43阳性细胞，并且这具有本领域技术人员清楚可理解的内容。通常，“动物”不仅用于统称灵长类动物(如人、猴子等)，而且还用于统称家畜和伴生动物(如牛、马、绵羊、猪、骆驼、山羊、驴、狗、猫等)，以及实验室动物(如小鼠、大鼠等)。在马的情况下，马用于赛马行业以及娱乐业或家畜业。
根据需要，本文中提供的方法还可以包括进行第二治疗手段(例如，治疗剂)。例如，本发明的方法可以包括向有需要的受试者施用其他化疗化合物(第二活性成分)。第二活性成分的施用可以与本文中提供的抗体或抗原结合片段的施用同时进行，或者可以以任何顺序(在施用抗体之前或之后等)进行。
另一方面，本文中提供了癌症治疗的应用；抗癌剂的制备；癌症干细胞的抑制；和/或抑制抗CD43抗体或抗原结合片段的癌症干细胞的药剂的制备。
对于本文中公开的药物组合物、方法和应用，癌症可以是实体癌或造血系统癌，并且可以是原发性癌症或转移性癌症。在一个实施方式中，癌症可以是血液系统恶性肿瘤。血液系统恶性肿瘤可以是急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性单核细胞白血病或霍奇金淋巴瘤，但不限于此。血液系统恶性肿瘤可以是包括癌症干细胞的癌症。
在其他实施方式中，癌症可以是实体癌。实体癌可以是选自由肺癌(例如，鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼球中的黑色素瘤、直肠癌、肛门附近的癌症、食管癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、胃肠癌、胃癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、胆囊癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫癌、子宫内膜癌、宫颈癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、头颈癌、脑癌、骨肉瘤等组成的组中一种或多种，但不限于此。例如，实体癌可以是胃癌、乳腺癌、肺癌、大肠癌、肝癌、胆囊癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌或膀胱癌。癌症不仅包括原发性癌症，还包括转移性癌症。此外，实体癌可以是对常规抗癌剂(例如，小分子抗癌剂(抗癌化学剂)、抗代谢剂、烷化剂、抗生素、长春花生物碱、酶、激素、靶向治疗剂和/或抗体治疗剂等)有耐药性的癌症，并且可以是在常规抗癌剂(例如，小分子抗癌剂(抗癌化学剂)、抗代谢剂、烷化剂、抗生素、长春花生物碱、酶、激素、靶向治疗剂和/或抗体治疗剂等)的治疗之后复发的癌症。实体癌可以是包括癌症干细胞的癌症。
对实体癌的治疗效果不仅包括癌细胞(特别是癌症干细胞)或其包含的癌组织的生长抑制(定量减少)和凋亡，而且还包括通过抑制迁移、侵入，转移对癌症恶化的抑制效果等。
本文中提供的抗CD43抗体或其抗原结合片段可以以各种途径给药，并且可以口服或胃肠外给药。例如，作为给药途径的合适实例，有静脉内注射、动脉内注射、肌内注射或输注等；并且在一个实施方式中，它可以通过静脉内注射进行给药，但不限于此。
在一个实施方式中，抗CD43抗体或其抗原结合片段可以配制成单独施用或与第二治疗化合物(例如化疗化合物)一起施用的形式。
另一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：本文提供的抗CD43抗体或其抗原结合片段，以及选自由药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂组成的组中的一种或多种添加剂。在一个实施方式中，药物组合物中包含的抗体可以包括细胞毒性物质连接或偶联的形式。合适的药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂是本领域技术人员熟知的，并且作为实例的有盐溶液、溶剂(例如注射溶剂)、分散介质、抗真菌剂和/或抗微生物剂、表面活性剂、等渗剂、吸附剂等，但不限于此。
在一个实施方式中，药物组合物可以配制成各种形式的制剂，诸如各种剂量单位形式的注射制剂等。
药物组合物的制剂和后续给药可以根据本领域的常规技术。给药取决于治疗对象的病症、药物反应性等，但如果期望效果持续，则继续给药是理想的。考虑到年龄、性别、发病率、药物反应性等，可以确定药物组合物的剂量、给药方法和重复频率，这对于本领域技术人员是显而易见的。
另一个实施方式提供了一种用于抗CD43抗体或其抗原结合片段的制备方法。该制备方法可以包括在宿主细胞中表达核酸分子的步骤。该表达步骤可以包括培养重组细胞的步骤，并且可选地，可进一步包括从获得的细胞培养物中分离和/或纯化抗体的步骤。
在一个具体实施方式中，该制备方法可包括：
在充分表达核酸的条件和/或时段下培养用编码抗CD43抗体或其抗原结合片段的核酸或包含该核酸的重组载体转化的重组细胞的步骤；以及
从培养的细胞或获得的培养物中分离和/或纯化抗CD43抗体或其抗原结合片段的步骤。
重组细胞可以通过用编码抗CD43抗体或其抗原结合片段的核酸或包含该核酸的重组载体转化宿主细胞来获得。
其他实施方式提供了由分离和/或纯化的步骤获得的经纯化的抗CD43抗体或其抗原结合片段。获得的抗体或抗原结合片段可以是从在细胞中表达或在胞外分泌时连接的其他组分中分离出的重组分子。在一个实施方式中，分离和/或纯化的抗体或抗原结合片段可以具有50％或更多、60％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的纯度。本领域技术人员可以清楚地理解：分离和/或纯化的程度取决于抗体或抗原结合片段的使用目的和/或使用形式。例如，当打算给药至动物，特别是在人体中时，抗体或抗原结合片段的纯化纯度可能需要较高的水平；并且当用于体外实验时，可以包含可接受的杂质(例如，可以包含来自宿主细胞和/或培养物的组分(蛋白质等)等)。
其他实施方式提供了一种编码抗CD43抗体或其抗原结合片段的核酸分子。在一个具体实施方式中，核酸可以包括编码抗体或抗原结合片段的重链可变区(VH结合结构域)的核酸分子、编码轻链可变区(VL结合结构域)的核酸分子，或其组合。编码重链可变区的核酸分子可以包括选自由SEQ ID NO:1、5、9、13、17、21、25和29组成的组中的核苷酸序列。编码轻链可变区的核酸分子可以包括选自由SEQ ID NO:3、7、11、15、19、23、27和31组成的组中的核苷酸序列。
核酸可以包含在合适的表达载体中。表达载体可以是通常用于在宿主细胞中表达外源基因的所有载体，并且例如可以例举为pTT5、pAPEX3p、pcDNA3.2(-)等，但不限于此。
其他实施方式提供了一种重组细胞，所述重组细胞包括编码抗CD43抗体或其抗原结合片段的核酸分子或包含该核酸分子的重组载体(或表达载体)。重组细胞通过将核酸分子或重组载体导入宿主细胞和可表达核酸分子的细胞而获得。作为宿主细胞的实例的有：原核细胞(例如大肠杆菌E.Coli等)或原生动物细胞，以及真核细胞，诸如动物细胞(例如CHO、COS、HEK-293E、HEK-293T细胞、修饰的特定基因(例如其缺失细胞等)、植物细胞、真菌细胞(例如酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae等)、昆虫细胞(例如Sf9细胞等)，但不限于此；并且可以选自能表达外源基因的所有细胞。
其他实施方式提供了一种检测CD43的方法或检测CD43阳性细胞的方法，包括使抗CD43抗体或其抗原结合片段与细胞试样接触的步骤，以及确认试样中是否存在抗原-抗体结合的步骤。通过该方法，可以确认CD43是否在细胞试样的细胞表面上表达，因此该方法可以应用于与CD43的表达有关的疾病的诊断。因此，其他实施方式提供了一种用于诊断CD43相关疾病的方法或一种用于提供CD43相关疾病的诊断信息的方法，包括使抗CD43抗体或其抗原结合片段与细胞试样接触的步骤，和确认试样中是否存在抗原-抗体结合的步骤。CD43相关疾病是与CD43的存在或CD43的增加有关的疾病，并且可以是癌症；并且癌症可能是实体癌或血液系统恶性肿瘤，并且特别可以是与CD43增加有关的血液系统恶性肿瘤(例如，急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病)。在其他具体实施方式中，CD43相关疾病可以是包括癌症干细胞的癌症。
在该方法中，可通过检测在抗体(或其抗原结合片段)与CD43蛋白之间是否形成复合物来确认抗原-抗体结合(即，当检测到抗体-CD43蛋白复合物的形成时，确认存在抗原-抗体结合)。然后，可将其与在对照细胞试样进行相同实验测试细胞试样中获得的结果进行比较，来用于相对比较。对照细胞试样可以选自熟知的CD43阴性细胞或正常细胞(非癌或非肿瘤细胞)。
在一个实施方式中，检测方法或诊断方法可包括：
(1)使抗体或抗原结合片段与测试细胞试样和对照细胞试样接触的步骤；以及
(2)测量在抗体或抗原结合片段与细胞之间是否形成复合物或其水平的步骤。然后，当测量到测试细胞试样中存在复合物或者与对照细胞试样相比复合物的水平较高时，可以证实测试细胞试样中存在CD43或者该细胞是表达CD43的细胞(即CD43阳性细胞)。细胞试样可以是从活体中分离出的，并且该方法可以在体外进行。
其他实施方式提供了一种检测或可视化(成像)包括抗CD43抗体或其抗原结合片段的CD43的组合物。另一个实施方式提供了一种使用抗CD43抗体或其抗原结合片段来检测或可视化(成像)CD43的方法。该组合物和方法可以应用于体内以及体外的CD43的检测和/或可视化。对于该组合物和方法，抗体或抗原结合片段可以是与可检测标签结合的形式，并且例如，可检测标签可以选自由放射性标签(例如3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、153Sm等)、酶、荧光标签、发光标签、生物发光标签、磁性标签、生物素等组成的组中的一种或多种，但不限于此；并且可以是通过本领域中已知的普通检测方法可检测的所有标签。如上所述，体外和/或体内的CD43的检测和/或可视化可以用于诊断与CD43阳性细胞的数量增加有关的疾病，例如癌症，更具体而言，包括癌症干细胞的癌症或血液系统恶性肿瘤。
检测和/或可视化CD43(体内)的方法可以包括以下步骤：
(i)向测试受试者施用抗CD43抗体或其抗原结合片段的步骤；和
(ii)测量抗体或抗原结合片段的复合物形成或者复合物形成的程度(水平)的步骤。
该复合物可以是抗体或其抗原结合片段与在测试受试者体内细胞表面上表达的CD43的复合物，或者是由抗体或其抗原结合片段与表达CD43的细胞(CD43阳性细胞)之间的抗原-抗体结合所形成的复合物。抗体或其抗原结合片段可以以与上述可检测标签偶联的形式使用。可视化方法可以应用于可视化表达CD43的细胞，例如癌症干细胞。
通过比较在对照受试者(例如，不具有CD43相关疾病的受试者或没有(过度)表达CD43的细胞的受试者)中是否形成复合物或者其形成水平，可以相对估计在给药受试者中是否形成抗体或抗原结合片段的复合物或者形成的水平。为了该比较，该方法可以包括：
(i-1)分别向测试受试者和对照受试者施用抗CD43抗体或其抗原结合片段的步骤；
(ii-1)分别测量在测试受试者和对照受试者中是否形成抗体或抗原结合片段的复合物或形成的程度(水平)的步骤；以及
(iii)将测试受试者中测量的结果与对照受试者中的结果进行比较的步骤。
该方法可以应用于诊断测试受试者的CD43相关疾病或者证实(检测)表达CD43的癌症干细胞。在这种情况下，当在步骤(ii)或(ii-1)中测得复合物形成或者与对照受试者相比复合物形成的水平增加时，测试受试者可以被确定为CD43相关疾病的患者，或者确定受试者具有癌症干细胞。
体内或体外抗原(或在表面上表达抗原的细胞)-抗体复合物的形成可以通过本领域常用的手段来测量，并且这些常用手段对于本领域技术人员是显而易见的。例如，复合物可以通过用合适的可检测标签来标记抗体或抗原结合片段并测量标签的信号或者通过适当的检测方法来证实。合适的检测方法可以是本领域中所有常用方法，并且例如可以是ELISA、流式活化细胞计量系统(FACS)、免疫组织化学染色等，但不限于此。
本领域技术人员将清楚地理解：可以对本文中提供的发明进行进一步的非如上所述的变化和/或修改。应将本文中提供的发明理解为包括在所公开的精神和/或范围内的所有变化和/或修改。另外，本文中提供的发明可以分别或完全包括本文清楚描述或提及的所有步骤、特征、组合物和/或化合物。
将通过参考以下实施方式来描述具体实施方式，但是这些实施例仅设计用于说明性目的，并且不限制本发明的前述范围。
如所理解的，本文中开发并描述的核苷酸序列通过本领域中熟知方法进行修饰，例如，亲和力成熟或者通过预测并除去与MHC2类结合的基序来降低免疫原性并增加结合能力的方法。本文中开发并描述的核苷酸序列的治疗剂的有用性可以通过用抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、血清半衰期、同种型、Fc受体结合或这些活动的组合来控制功能特性进行增强。这些变化可以通过蛋白质工程、聚糖工程或化学方法来进行。根据治疗剂的所需应用，这些活动的增加或减少可能是有利的。
本领域已知许多抗体亲和力成熟的方法。这些中的大多数是基于生产突变体组或修饰蛋白质的库以及筛选和选择以增加亲和力的一般策略。突变常常在DNA水平上进行，例如通过易错PCR、通过基因改组、通过使用突变化学物质或辐射、通过使用具有易错复制机制的“突变”菌株，或通过利用天然亲和力成熟机制的体细胞超突变方法。突变也可以在RNA水平上进行，例如通过使用复制酶。筛选改进的变体蛋白质的基于库的方法能够基于各种示出技术，诸如噬菌体、酵母、核糖体、细菌或哺乳动物细胞，并且是本领域熟知的。亲和力成熟能够通过更直接/预测的方法来实现，例如通过定点突变或由3D蛋白的研究结果指导的基因合成。增加ADCC或CDC的方法将为本领域技术人员所知。
许多调节血清半衰期和活体内抗体分布的方法改变了在抗体与新生Fc受体之间的相互作用，这对防止IgG分解代谢和维持高血清抗体浓度而言起着重要作用。例如，可以参考US6277375、US6821505、US708378、US7217797和WO2000/4207的专利。US20090142340、US20090068175和US20090092599的专利申请描述了在调节Fc受体的结合能力和这种受体介导功能(诸如与FcRn的结合能力和血清半衰期)的恒定区中的氨基酸替换的其他实例。
与抗体分子连接的聚糖通过影响Fc受体与聚糖受体的相互作用来影响抗体的活性(包括血清半衰期)。因此，控制抗体活性的聚糖类型可以有利于治疗剂。产生可控的聚糖类型的方法是本领域中熟知的，但是它不限于US6602684、US7326681、US7388081和WO2008/006554中公开的方法。
通过添加聚乙二醇(PEG)来延长半衰期的方法用于延长蛋白质的血清半衰期。
本文中所使用的术语“％同一性”用于描述许多序列。如将理解的，术语“％同一性”是指：在比较两个序列的指定区时，两个序列在相同位置上具有指定数目的相同残基。
一个多肽与其他多肽的％同一性可以通过空位产生罚分＝5且空位延伸罚分＝0.3的GAP分析来确定。查询序列是至少50个氨基酸，并且GAP分析调节了至少50个氨基酸中两个序列的区。更优选地，查询的长度是至少100个氨基酸，并且GAP分析调节了两个序列中至少100个氨基酸中的区。甚至更优选地，查询的长度是至少250个氨基酸，并且GAP分析在至少250个氨基酸的区上排列两个序列。最优选地，GAP分析排列了讨论的两个多肽的总长度的氨基酸序列。
关于限定的多肽，应该理解比所提供的数字高的％同一性数字将涵盖优选的实施方式。因此，如果可能的话，鉴于至少％同一性，多肽优选包括具有优选至少95％或更多、更优选至少97％或更多、甚至更优选至少98％或更多、进一步更优选至少99％或更多、更优选至少99.1％或更多、更优选至少99.2％或更多、更优选至少99.3％或更多、更优选至少99.4％或更多、更优选至少99.5％或更多、更优选至少99.6％或更多、更优选至少99.7％或更多、更优选至少99.8％或更多、甚至更优选至少99.9％或更多的氨基酸同一性的SEQ IDNO相关的氨基酸序列。
在本文中，氨基酸和核苷酸序列变异可以通过核酸在体内经由化学或放射性处理的突变来改变核苷酸而被引入和产生。这种突变的实例包括氨基酸序列残基的缺失、插入或替换。本发明的多核苷酸可以经受Harayama(1998)描述的DNA改组技术或者其他体外方法，以产生编码多肽变体的改变的多核苷酸。这种DNA改组技术可以使用与本发明相关的基因序列，诸如来自除小麦以外的植物物种的Rht-B1。从突变/修饰的DNA获得的产物可以通过使用本文公开的技术进行筛选，以确定它们是否具有例如过度生长表型。例如，氨基酸序列的缺失可以包括通常约1～15个氨基酸残基(例如1～10个氨基酸残基)或者连续的1～5个氨基酸残基的缺失。
例如，氨基酸序列的替换可以包括：多肽中缺失一个或多个氨基酸残基，并且在该位置插入与原始氨基酸残基不同的一个或多个氨基酸残基。
如本文中使用的，“包括(或包含)”可被用作包括公开的组分、步骤数值等的开放类型含义，并且不被解释为排除与它们不同的组分、步骤、数值等的意图，并且根据具体情况，不能排除是指“基本上由……组成”。
本文中提及的所有文献都作为参考文件而被包含在本文中。
【本发明的效果】
本发明提供了能够治疗癌症干细胞以及血液系统恶性肿瘤或实体癌的抗体，和该抗体识别的表位以及识别表位的抗体或其抗原结合片段，从而更坚决彻底地治疗癌症并且有助于上开发有效的癌症治疗剂。
附图说明
图1是通过免疫染色法证实人胃癌细胞系NCI-N87(左)和AGS(右)中表达CD43的结果(X轴：CD43表达率，Y轴：读数细胞数)。
图2a～图2c是通过免疫染色法证实各种实体癌细胞系中表达CD43的结果(2a：胃癌细胞系；2b：直肠癌细胞系；2c：肝癌细胞系)。
图3是证实(抗CD43抗体)-MMAE偶联物对人胃细胞系NCI-N87、SNU-719和AGS的细胞毒性的结果。
图4是证实(抗CD43抗体)-DM1偶联物对人胃细胞系NCI-N87、SNU-719和AGS的细胞毒性的结果。
图5是证实(抗CD43抗体)-倍癌霉素偶联物对人胃细胞系NCI-N87和AGS的细胞毒性的结果。
图6是证实在移植人胃癌细胞系的胃癌动物模型中抗CD43抗体(DNP001)单独的抗癌效果的结果以及抗CD43抗体-倍癌霉素偶联物(D-Duo)的抗癌效果的结果。
图7是通过免疫组织化学方法证实源自人的各种实体癌组织中表达CD43表位的结果(M：髓质；C：皮质)。
图8是通过免疫组织化学方法证实根据源自人的各种实体癌的疾病表达CD43表位的结果(A：印戒细胞(胃印戒细胞癌)；B：乳腺浸润性导管腺癌；C：胰腺癌；D：肾脏肾细胞癌；E：肺腺癌；F：喉鳞状细胞癌；G：胆囊癌；H：宫颈鳞状细胞癌；I：子宫鳞状细胞癌；J：膀胱癌；K：肺鳞状细胞癌；L：耳粒细胞肉瘤)。
图9是通过免疫染色法证实人胃癌细胞系NCI-N87的癌症干细胞中表达CD43、CD44和CD133的结果。
图10是用抗CD43单克隆抗体(YG5)对胸腺组织进行免疫组织化学染色的结果。
图11是测量抗CD43单克隆抗体(YG5)对胸腺细胞的反应性的流式活化细胞计量系统的曲线图。
图12是示意性示出11种CD43缺失突变体的图。
图13是证实抗CD43(YG5)单克隆抗体对11种CD43缺失突变体的反应性的蛋白质印迹结果。
图14是示意性示出制备抗CD43抗体的重链和轻链表达质粒的方法的示意图。
图15是示出在将神经氨酸苷酶处理成正常血细胞后抗CD43抗体对CD43表位的结合能力的图。
图16是示出测量抗CD43抗体对重组CEACAM5和CEACAM6的交叉反应性的结果的图。
图17是示出肿瘤干细胞(肿瘤球)中CD43表位的表达程度的图。
图18是示出抗CD43抗体对CEM7或CCRF-CEM细胞(低CD43表位表达)的细胞毒性的曲线图，并且表明了抗CD43抗体没有直接的细胞毒性。
图19是示出用毒素附着的抗JL-1抗体(皂草素偶联的抗JL-1抗体)处理的靶细胞的存活率的曲线图，并且表明了皂草素偶联的抗JL-1抗体引起凋亡。
图20是示出图19中描述的凋亡测试中抗JL-1抗体(抗CD43抗体)(啮齿动物抗体、人抗体二者)的内化现象以及通过流式细胞仪分析得到的结果的曲线图。为此，用小鼠JL-1抗体对冷藏的细胞处理30分钟，并且在37℃条件下移动，然后在曲线图的X轴中表示的每个时间点收集106个细胞，并且抗小鼠IgG-PE第二抗体在冷藏温度下处理10分钟，并且将细胞洗涤并固定。
图21是示出表达CD43抗原的细胞中由抗JL-1抗体诱导的同型聚集现象的图像。该图像通过在用抗JI-1抗体以40μg/mL的起始浓度分别对300000个细胞处理并且在37℃和5％CO2条件下培养之后根据安排时间拍摄显微照片而获得，并且图21是抗体处理后2小时获得的图像。
图22是示出在正常骨髓细胞中表达的低且异源JL-1抗原的结果。正常骨髓的单核细胞用小鼠抗JL-1抗体染色，然后用山羊抗小鼠IgG F(ab)2-PE染色，并进行观察。直方图叠加表示为限制淋巴细胞。
图23示出了外周血细胞中JL-1抗原的表达率。两个正常人PBMC试样用小鼠抗人JL-1(蓝线：(d))染色，并且观察到JL1抗原的低表达。
图24是示出测量在用与皂草素连接的抗JL-1抗体处理经预处理(JL1+)和未处理的正常骨髓细胞的情况下骨髓亚群的集落形成水平的结果的图。证实了：在用与皂草素偶联的抗JL-1抗体预先处理正常骨髓细胞的情况下没有形成骨髓亚群的集落。该结果通过以下操作后来测得：分离骨髓和收获白细胞，通过将CD34+细胞分类为JL-1阳性和阴性来分离并收集CD34+细胞，并且将收集的细胞放入具有细胞因子的MethoCult中。
图25是示出抗JL1抗体本身以及与毒素偶联的抗JL1抗体在白血病ALL异种移植模型中的治疗效果的曲线图，图25A示出了CEM7白血病模型中的结果，并且图25B分别示出了NALM-6模型(细胞系：NALM6(B-ALL))中的结果。测试在以下条件下进行：小鼠：NOD-SCID(8/组)；接种：0日107个细胞；给药：从第8天开始，15μg/注射+100μg散装(bulk)IgG i.v.1x/周；终点：瘫痪状态。
图26示出了主要AML母细胞(blast)和亚群中JL-1的表达水平。
图27是示出嵌合人源化JL-1(ADCC和CDC)的凋亡作用的曲线图，图27A是用效应细胞(PBMC)培养的Cell Titer Glo.CEM7细胞系然后加入JL-1嵌合抗体或对照抗体来测量细胞毒性的结果。图27B是用培养基培养Cell Titer Glo.CEM7细胞系并且一起加入JL1嵌合抗体与兔补体来测量细胞毒性的结果。作为对照组，使用与实验无关的IgG1同种型抗体。
图28是示出当去岩藻糖基化时JL-1嵌合抗体的ADCC活性增加的结果。
图29是示出体内CEM7细胞系中的裸-嵌合抗体的效果的曲线图。
图30是示出白血病干细胞(LSC)亚群中JL1的表达的结果。
图31是示出通过体外与毒素(皂草素：SAP)偶联的抗JL1抗体(CCC)进行的集落形成分析(集落平均数)的结果的曲线图，并且表明抗原阳性AML的凋亡效果增加。将细胞放入具有JL1-皂草素或小鼠IgG1-皂草素的干细胞集落基质中，并且观察到集落形成。
图32是示出体外与毒素(皂草素：SAP)偶联的抗JL1抗体(CCC)影响抗原阳性主要AML增殖的效果的曲线图。
图33是示出在NSG小鼠(体外)中与毒素偶联的抗体对主要AML癌细胞生长的抑制效果的曲线图。从JL-1+AML患者中收获5×107骨髓细胞，并将其静脉内注射到经辐射的30只NSG小鼠。在8周之后,每周向小鼠施用45μg剂量的JL1-脱氧甘油(DB)、hIgG1-DB或PBS，并收获骨髓和脾脏并进行植入，观察到肿瘤产生。
图34和图35是证实各种人源化/优化的修饰抗体与原始(小鼠)JL-1抗体相比示出相等的结合特征的结果。CEM7细胞用亲本原JL-1抗体或3种人源化修饰的抗体进行染色，以备观察。作为结果，图34表明了修饰的“联合体A”示出最好的轮廓，但是所有其他测试抗体示出了在CEM7细胞中显著水平的细胞毒性。图35示出了最终3种修饰抗体的内化细胞毒性分析结果，并且在混合抗体或抗人IgG-皂草素之后3天测量细胞毒性。
图36示出了最好的2轮和3轮克隆的氨基酸序列排列结果，它们分别是亲本克隆与更多人源化克隆的氨基酸序列的比较。其中，153-28来自36-10Q6R，而257-10来自45-37。CDR以粗体和下划线字体表示。
图37a是通过流式细胞术示出ART140先导候选物与JL-1阳性CEM7细胞中IgG的结合水平的曲线图，并且图37b是示出阴性对照组U937细胞中的结果的曲线图。
图38a是通过基于细胞的ELISA(悬浮的活细胞)示出ART140先导候选物与JL-1阳性CEM7细胞中IgG的结合水平的曲线图，并且图38b是示出阴性对照组U937细胞中的结果的曲线图。
图39a是通过流式细胞术示出先导候选物与JL-1阳性CEM的Quikchange突变体的IgG的结合水平的曲线图，并且图39b是示出阴性对照组U937细胞中的结果的曲线图。
图40a～图40c是通过流式细胞术示出JL-1阳性CEM的Quikchange突变体的IgG的结合水平的曲线图。
图41a～图41c是通过基于细胞的ELISA(悬浮的活细胞)示出证实与JL-1阳性CEM7结合的Quikchange突变体的IgG的结果的曲线图。
图42是示出嵌合抗体DNP001的表位结合活性的曲线图。
图43示意性示出了用于替换轻链可变区中的聚糖区的氨基酸，以制备具有人源化抗体的聚糖区的氨基酸残基缺失的变种。
图44是通过使用与具有人源化抗体的聚糖区的氨基酸残基缺失的变种的抗体的聚糖区结合的刀豆蛋白A-HRP的蛋白质印迹的结果。
图45是示出抗体与人源化抗体的聚糖区的氨基酸残基缺失的变种的结合能力的曲线图。
图46是示出嵌合抗CD43抗体与抗原(CD43)阳性细胞CEM7细胞的聚糖区的氨基酸残基缺失的人源化抗CD43抗体的结合能力的曲线图。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明，但是这些实施例仅用于说明性目的，而意图限制本发明的范围。在不脱离本发明的精神的情况下对下面描述的实施例的改动对于本领域技术人员而言是显而易见的。
实施例1.抗CD43抗体的制备
1-1.小鼠抗体的制备
1-1-1.产生单克隆抗体的细胞的制备
其通过使已将人胸腺细胞作为抗原注入其内的Balb/c白鼠的脾细胞与8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠的骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag14(ATCC，CRL-1581)的融合来制备。
每2周(持续6周)将107个人胸腺细胞(首尔国立大学医院)腹膜内注射到Balb/c白色小鼠中以诱导免疫应答，并且在最后一次附加接种后3天提取脾脏，以制备细胞悬液。根据Koeler&Milstein(1975)的方法，通过使用400聚乙二醇使108个脾细胞和107个骨髓瘤细胞进行细胞融合。洗涤融合的细胞，然后将其悬浮于补充有100uM次黄嘌呤、0.44uM鸟嘌呤核苷和16uM胸苷的DMEM培养液(HAT培养液)中，将细胞等分到96孔板中，并使其在37℃、供有5％CO2下于培养基中进行培养。
在2周后观察到集落形成时，收集上清液，并且通过使用免疫组织化学法和流式细胞术测量抗体滴度。
阳性组意味着每孔形成了105或更多个细胞的情况。通过收集孔中的细胞来收获具有高抗体滴度的单克隆细胞，在孔中形成了上清液的具有高抗体滴度的集落，并且根据有限稀释测定法进行亚克隆。通过收集上清用于后面的实验来储存单克隆细胞的培养液。
1-1-2.产生抗胸腺细胞表面蛋白的抗体的单克隆细胞的筛选
将胸腺的冷冻组织(首尔国立大学医院)和石蜡包埋组织(首尔国立大学医院)切成4微米厚度，以备使用。在通过除去石蜡并然后加入正常山羊血清(BioGenex公司产品)的过程之后，将石蜡包埋组织在室温下放置1小时。在向组织施用各种初级抗体(Dinona)并然后它们置于4℃冷藏室中过夜以备反应之后，次日用磷酸盐缓冲液洗涤3次。用生物素化的山羊抗小鼠免疫球蛋白(2滴，DAKO)作为第二抗体在室温下孵育1小时，然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤3次，并且处理链霉亲和素-HRP偶联物。在施用H2O2-氨基乙基咔唑溶液20分钟后，用磷酸盐缓冲盐水洗涤3次，并且在光学显微镜下观察显色。
因此，可以分选产生仅与人胸腺细胞特异性反应的抗体的单克隆细胞系H-JL1。所得的细胞系于1997年1月13日捐献给位于韩国首尔钟路区莲贞洞的韩国细胞系研究基金会(KCLRF)，并且登记号为KCLRF-BP-00010。
用选择的单克隆细胞系的上清液对胸腺组织进行免疫组织化学染色，并且证实了胸腺细胞染色为阳性(图10)。另外，染色为阳性的胸腺细胞表现出细胞周围强烈染色的形貌，由此证明了单克隆细胞系产生了针对细胞表面蛋白的抗体。
为了证实胸腺细胞发育阶段的抗体反应，进行流式细胞术。将提取用于心脏手术的人胸腺切成小碎片并用载玻片研磨，收集胸腺细胞。在分离的胸腺细胞中使抗体(1*10^5细胞/抗体10μg/mL)在4℃下反应30分钟后，用冷的磷酸盐缓冲盐水进行洗涤，并且使FITC(异硫氰酸荧光素)连接的山羊抗人IgG抗体(Jackson ImmunoResearch)在4℃下反应30分钟。然后，它用冷磷酸盐缓冲盐水进行洗涤，并加入5μL的每种PE(藻红蛋白)连接的抗CD8抗体(BD Bioscience)和APC连接的抗CD4抗体(BD Bioscience)，并使其在4℃下反应30分钟。它用冷磷酸盐缓冲盐水进行洗涤，并且通过使用FACSCalibur(Becton Dickinson，Mountain View，CA)进行流式细胞术。根据CD4和CD8的表达形貌，将胸腺细胞分类为CD4-CD8-胸腺细胞→CD4+CD8+胸腺细胞→CD4+CD8-或CD4-CD8+胸腺细胞，并且该抗体与所有4种胸腺细胞反应，但是特别地，它与CD4+CD8+胸腺细胞反应性高(参见图11)。图11中的灰色区是阴性对照组，并且实线是用分选的抗体染色的曲线图。
1-1-3.从分选的单克隆细胞系中产生单克隆抗体
在对Balb/c小鼠腹腔内注射0.5mL的姥鲛烷3周前，在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养107个单克隆细胞并且将其注射到这些小鼠的腹腔中，然后在2～3周后收集小鼠的腹水。从腹水积水中获得5～10mg/mL的高浓度抗体。
为了纯化来自腹水积水的抗体，进行Q-琼脂糖凝胶(Pharmacia产品)层析和羟基磷灰石(Bio-gel HTP Gel,Pharmacia产品)层析。每10mL腹水积水加入3.14g硫酸铵((NH4)2SO4)，并且使其在冰上缓慢溶解(50％(NH4)2SO4沉淀)。将该混合物以15000rpm离心30分钟，并且使沉淀物溶解于去离子水中，然后在1L缓冲溶液(20mM磷酸盐，pH7.4)中透析。
使溶液通过预先用缓冲溶液(20mM磷酸盐，pH7.4)平衡的Q-琼脂糖凝胶柱并被吸附，然后用缓冲溶液I(20mM磷酸盐，pH7.4)和缓冲溶液II(20mM磷酸盐，0.5M NaCl，pH7.4)使NaCl浓度梯度流动到0M至0.8M的线性梯度，以获得洗脱液。通过15％SDS-PAGE收集含有大量抗体的级分的各个级分。该级分用缓冲液(20mM磷酸盐，pH6.8)进行透析，并且通过预先用缓冲液(20mM磷酸盐，pH6.8)平衡的羟基磷灰石柱进行吸附，然后通过使用缓冲溶液III(20mM磷酸盐，pH6.8)和缓冲溶液IV(300mM磷酸盐，pH6.8)使磷酸盐的浓度梯度流动到0M至0.3M的线性梯度，以获得洗脱液。通过15％SDS-PAGE对级分仅收集具有95％或更高抗体纯度的级分。通过实验，对于每1ml积水腹水可以收集5～10mg的单克隆抗体。
所得的抗体被称为YG5。
1-1-4.CD43表位的分析
<构建包括CD43部分片段的结构>
如图12所示，构建每个CD43缺失突变体，并且测试YG5抗体对缺失突变体的反应性，并分析CD43的表位。CD43蛋白(NCBI登录号M61827.1)由总共400个氨基酸组成，并且第1位至第19位的氨基酸序列是信号序列，第20位至第254位的氨基酸序列是胞外结构域，并且第255位至第277位的氨基酸序列是跨膜结构域，并且第278位至第400位的氨基酸序列是胞内结构域。
在构建DNA结构以使在谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的C端上表达每个缺失突变体后，将它插入到pGEX-2T(Pharmacia Biotech Inc.,Piscataway,NJ)载体中。在下文中，包含CD43蛋白的第1位至第253位的氨基酸序列的载体被称为pGEX1-253，并且包含第1位至第87位的氨基酸序列的载体被称为pGEX1-87，并且包含CD43蛋白的第1位至第87位的氨基酸序列的载体被称为pGEX1-81，并且包含CD43蛋白的第1位至第75位的氨基酸序列的载体被称为pGEX1-75，并且包含CD43蛋白的第1位至第70位的氨基酸序列的载体被称为pGEX1-70，并且包含CD43蛋白的第70位至第98位的氨基酸序列的载体被称为pGEX70-98，并且pGEX71-81、pGEX76-81、pGEX73-81和pGEX73-80以与上述相同的原则命名。
从人CD43 cDNA扩增编码缺失突变体的序列，并且从Genebank上的序列构建PCR引物，并且包含BamHI/EcoRI或BamHI/BglII限制酶位点。PCR产物用BamHI/EcoRI或BamHI/BglII进行切割，并连接到相同限制酶位点的pGEX-2T，然后转化到大肠杆菌感受态TOP10F'细胞[F'[lacIq,Tn10(TetR)]、mcrA、D(mrr-hsdRMS-mcrBC)、80lacZDM15、lacX74、deoR、recA1、araD139 D(ara-leu)7697、galK、rpsL(StrR)、endA1、nupG]。分析转化体的序列，从而再次证实缺失突变体的序列。
<GST-CD43缺失突变体融合蛋白的表达>
在37℃下在LB培养基(其中加入50μg/mL氨苄青霉素)中培养过夜转化的大肠杆菌TOP10细胞，并且将培养的细胞用LB培养基稀释20倍，然后将将它培养3～4小时至OD为0.6。将IPTG(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)加入到最终浓度为1mM的培养物中并且使它再培养4小时，并且以6000g离心15分钟。在收集每1g细胞用3ml的细胞裂解缓冲溶液(50mMTris,pH 8.0,1mM EDTA,100mM NaCl)使其悬浮的细胞后，添加最终浓度为0.2mM的苯甲基磺酰氟(Sigma Chemical Co.)，然后将其置于冰上30分钟。
<CD43表位分析>
在使表达总共11种缺失突变体的每种转化体的裂解物经受10％SDS-PAGE后，分别用YG5抗体和抗GST抗体进行蛋白质印迹。
图13是证实YG5抗体对11种缺失突变体的反应性的蛋白质印迹，其中，A是使用YG5抗体的情况，而B是使用GST抗体的情况。另外，泳道1是pGEX1-253，泳道2是pGEX1-98，泳道3是pGEX1-87，泳道4是pGEX1-81，泳道5是pGEX1-75，泳道6是pGEX1-70，泳道7是pGEX70-98，泳道8是pGEX71-81，泳道9是pGEX73-81，泳道10是pGEX76-81，泳道11是pGEX73-80，泳道12是pGEX-2T，并且泳道13是人胸腺细胞。如图13所示，证实了对YG5抗体具有反应性的缺失突变体的最小单位是pGEX73-81，由此证明CD43的抗原决定簇是第73位至第81位的氨基酸序列(Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile；SEQ ID NO:4)。
总结这些实例证实了YG5直接识别第73位至第81位的氨基酸序列，而不是CD43糖蛋白的糖组分，这与传统的其他抗体不同。该序列主要暴露于造血细胞发育阶段的淋巴细胞祖细胞和胸腺细胞中，由此YG5抗体识别它，并且它被造血干细胞(而不是成熟的白细胞和血小板)中第73位至第81位的氨基酸序列周围的糖基化或结构变化所覆盖，因此YG5抗体不能识别它。
1-2.嵌合抗体制备
基于构建的抗CD43小鼠抗体YG5的氨基酸序列，制备抗CD43嵌合抗体。
1-2-1.质粒制备
为了表达抗CD43嵌合抗体，分别制备用于重链表达和轻链表达的质粒。pOptiVEC(Invitrogen Company)载体用于重链表达质粒，并且pcDNA3.3(Invitrogen Company)载体用于轻链表达质粒。通过使用Ig引物组(Novagen Company)克隆用于抗体表达的重链和轻链的cDNA编码可变区，并且将其插入到pGem-T载体(Promega Company)中，然后通过测序来确定DNA序列，并且通过IMGT网站(www.imgt.org)来证实小鼠抗体基因。
为了将每个抗体的cDNA编码可变区和cDNA编码不变区表达成没有额外氨基酸插入的连续氨基酸序列，分别合成这样的基因片段(Bioneer Inc)：其中，克隆的可变区的编码序列与已知的人IgG1不变区(重链)和卡帕不变区(轻链)编码序列连接。在用限制性酶Xho I和Sal I切割如上合成的表达基因的重链和轻链后，分别将重链基因片段连接到pOptiVec载体中，并将轻链基因片段连接到pcDNA3.3载体中，从而构建用于抗体表达的完整质粒(pcDNA3.3-抗CD43轻链表达质粒和pOptiVEC-抗CD43重链表达质粒)。图14示意性地示出重链和轻链表达质粒的构建过程。
2-1-2.转化
通过将构建的pcDNA3.3-抗CD43轻链表达质粒和pOptiVEC-抗CD43重链表达质粒转染到来自CHO的DG44细胞(Invitrogen)中来进行转化过程。
首先，在转染前3天使悬浮的DG44细胞适应于含有5％FBS的MEMα培养基，从而将它转变为适应提高转染效率的吸附细胞。使用Effectene转染试剂(QIAGEN公司)在6孔板中进行转染。在转染前一天制备以1×105个细胞/孔的浓度继代培养的适合的DG44细胞，并且转染所用的DNA量分别以2μg的pcDNA3.3-抗CD43轻链表达质粒和pOptiVEC-抗CD43重链表达质粒的相同量使用。转染进行48小时。为了分选转染的细胞群，进行流式细胞仪和酶联免疫吸附测定(ELIA)，由此选择了两个克隆E#4、E#5。在包含含有30nM甲氨蝶呤(MTX)的5％透析胎牛血清以及400μg/mL的G418(遗传霉素)的MEMα选择培养基中培养选择的细胞群，并且逐渐增加MTX和G418的浓度以选择转化的细胞群。
2-1-3.转化的细胞培养和抗体纯化
在37℃和5％的CO2的条件下，培养上述选择的转染细胞群(24.0×105个细胞/mL或更多，90％或更多的存活率(％))，直至表达量在功效CHO2 CDM(Lonza；最终培养基量880L)中达到600mg/L(根据IPC(过程中对照)标准)。
在收集800L如上获得的培养液进行细胞澄清(使用POD过滤器(1.1/0.2μm))处理之后，通过3段柱法(蛋白A亲和层析(固定相：蛋白A；平衡缓冲溶液：50mM磷酸钠、50mM氯化钠，pH7.5；洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠，pH3.0)、阳离子交换层析(固定相：SP FF；平衡缓冲液：20mM柠檬酸钠，pH5.5；洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠，150mM，氯化钠，pH 6.1)；阴离子交换层析(固定相：QFF；平衡缓冲液：20mM柠檬酸钠，pH6.5))对抗体进行纯化。
层析条件如下：
蛋白质A 阳离子交换 阴离子交换
柱类型 层析介质(Mabselect sure) SP FF Q FF
柱控制器 6mm生物处理(CL-3271) 10mm生物处理(CL-3201) 10mm生物处理(CL-3201)
柱尺寸 BPG 200 BPG 300 BPG 300
柱体积 6.5L 14.0L 14.0L
柱高度 20cm 20cm 20cm
流率 62.8L/hr 141L/hr 141L/hr
通过超滤/渗滤(UF/DF)方法同时进行缓冲液更换和浓缩过程来完成最终粗液的配制，并且将最终蛋白质的浓度调节至11.5mg/mL。
按照上述方法获得了抗CD43嵌合抗体，并将其命名为DNP001。
2-1-4.确认嵌合抗体的表位区的结合能力
为了确认所制备的嵌合抗体DNP001(与小鼠抗体具有相同的CDR区)结合到与小鼠抗体相同的表位，将合成的表位肽化学结合到牛血清白蛋白(BSA)蛋白，然后进行ELISA。
表位肽合成序列(命名为DN2)
EGSPLWTSIGASTGSC(SEQ ID NO:129；表位以下划线表示)
通过经由EDC连接子将合成的DN2肽偶联到BSA蛋白来制备DN2肽-BSA偶联物。然后，肽:BSA蛋白质的摩尔比为15:1。
在用50μg/mL制备的DN2肽-BSA偶联物覆盖每孔后，以各种浓度梯度孵育嵌合抗体DNP001。接下来，通过测量嵌合抗体对DN2肽-BSA偶联物的反应性来检测与偶联物连接的抗体。用抗人抗体-HRP(抗人Ig-HRP)检测连接的抗体，并且测量450nm处的OD值并且将其示于下表和图42。
Chi.Ab(ug/ml) OD值
100 1.878
50 1.398
25 0.803
12.5 0.5
6.25 0.327
3.13 0.204
1.56 0.137
0 0.007
如该表和图42的结果所示，证明了嵌合抗体DNP001以浓度依赖性方式结合到表位肽。
实施例2：对人实体癌细胞系中CD43表位的表达水平的研究
为了研究各种实体癌细胞系中CD43的表达水平，进行免疫染色和流式细胞术。
用于分析的细胞系的信息如下：
名称 来源 组织病理学 登记号
SNU-1 胃、胃的 腺癌 ATCC,CRL-5971
SNU-719 胃 腺癌，原发性 KCLB,No.00719
NCI-N87 胃 癌；转移到肝脏 ATCC,CRL-5822
AGS 胃 腺癌 ATCC,CRL-1739
HT29 结肠 腺癌 ATCC,HTB-38
LS174T 结肠 Dukes'B型，结直肠腺癌 ATCC,CL-188
HCT116 结肠 结直肠癌 ATCC,CCL-247
C3A 肝 肝细胞癌 ATCC,CRL-10741
HepG2 肝 肝母细胞瘤 ATCC,HB-8065
PLC/PRF/5 肝 肝癌 ATCC,CRL-8024
具体而言，在100mm的细胞培养容器中接种并培养各细胞系，并且当70～80％的表面密集有培养细胞时，用磷酸缓冲液洗涤培养细胞，然后用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)处理并离解，并且随后进行离心。使沉淀的细胞再悬浮于缓冲溶液中并且以1×105每份等分，并且加入1.5μL的实施例1-1中制备抗CD43抗体(YG5)-藻红蛋白(PE)并使其在4℃冰箱中反应20分钟。在4℃下反应20分钟后，再次用4ml缓冲溶液(1×磷酸盐缓冲盐水，PBS缓冲液)洗涤细胞，然后用流式细胞仪(Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,NJ,USA)对它进行分析。为了比较，使用DFT-1抗体(2μL，Ancell公司)替换抗CD43抗体进行相同的测试。
所得结果示于图1和图2a～图2c。在图1中，X轴示出了与引用的细胞系中的抗体YG5反应的抗原CD43的表达水平，而Y轴表示读取细胞数量(计数)。如图1和图2a～图2c所示，在直肠癌中的Duke型B腺癌(LS174T)中显示出了60％的表达水平，在HCT116和HT29中显示出了约50％和37％的表达水平，并且证实了在其他各种实体癌细胞系中CD43(表位)的表达。
实施例3：抗CD43抗体对癌细胞的细胞毒性的测试(体外)
3-1.抗体-毒素偶联物的制备
根据常规方法(Polito等人，2004)进行单克隆抗体的皂草素(Sigma,St.Louis,MO)偶联。在将浓度分别为2mg/mL(抗体浓度)和8mg/mL(皂草素浓度)的抗体(DNP001；实施例1-2中制备的)和皂草素溶解于50mM硼酸钠缓冲液(pH9.0)中之后，分别用浓度为0.4mM和1.0mM的2-亚氨基四氢噻吩(Sigma)进行处理。之后，使抗体和皂草素以10:1的比率混合并且在室温下反应16小时，并且通过凝胶过滤来纯化抗体-皂草素结合物。在下文中，将制备的偶联物描述为抗CD43-皂草素偶联物。
参照上述方法，分别制备抗CD43抗体(DNP001；实施例1～2中制备的)与单甲基奥瑞他汀E(MMAE；Creative Biolabs)偶联的抗CD43-MMAE偶联物、抗CD43抗体(DNP001)与N2'-去乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)美登素(DM1；The Chemistry ResearchSolution LLC)偶联的抗CD43-DM1偶联物，以及抗CD43抗体(DNP001)与倍癌霉素(TheChemistry Research Solution LLC)偶联的抗CD43-倍癌霉素偶联物，和抗CD43抗体(DNP001)-DM1偶联物。
3-2.抗CD43抗体-毒素偶联物对胃癌细胞的细胞毒性
对实施例3-1中制备的抗体-毒素偶联物(抗CD43-皂草素偶联物、抗CD43-DM1偶联物、抗CD43-MMAE偶联物和抗CD43-倍癌霉素偶联物)对胃癌细胞的细胞毒性进行测试。
在测试前一天，以每孔4×103分别铺板胃癌细胞系NCI-N87、AGS和SNU719。每种抗体-毒素偶联物以10000ng/mL(在(抗CD43抗体)-MMAE偶联物和(抗CD43)-DM1偶联物的情况下)或1000ng/mL(在(抗CD43)-倍癌霉素偶联物的情况下)的浓度处理各个胃癌细胞系。之后，在24小时、48小时和72小时后将10μL的EzCytox(韩国Daeil实验室)加入每个孔中，在37℃的CO2容器中培养细胞，然后通过显微分光光度法测量它们的存活率。
所获得的每种偶联物的细胞毒性示出于图3((抗CD43抗体)-MMAE偶联物)、图4((抗CD43)-DM1偶联物)和图5((抗CD43)-倍癌霉素偶联物)中。用以下式计算细胞毒性：
细胞毒性(％)＝[1-(存活细胞数/初始细胞数)]×100
如图3、图4和图5所示，证实了抗CD43-DM1偶联物和抗CD43-MMAE偶联物在所有3种细胞系中显示出细胞毒性，并且抗CD43-倍癌霉素偶联物在NCI-N87和AGS中显示出细胞毒性。
实施例4：在动物模型中抗CD43抗体的抗癌效果的测试(体内)
4-1.胃癌动物模型的制备(肿瘤发生)
通过使用在实施例2的结果中证实CD43表达的细胞系(NCI-N87；ATCC，CRL-5822)来制备胃癌模型。首先，制备2.8×107的NCI-N87细胞。将制备的细胞以5×106个细胞/100μL(RPMI)皮下接种到裸鼠的右侧。将接种的裸鼠放入到对照组(PBS给药)和测试组，并且在第3天将实施例1-2中制备的抗CD43抗体(DNP001)以12mg/kg的量注射到尾静脉每周2次持续3周，或者在接种癌细胞后3周将0.2mg/kg的实施例3-1中制备的抗CD43-倍癌霉素偶联物(DNP001-倍癌霉素)腹膜内注射每周一次持续3周。在施用治疗剂之前测量肿瘤的尺寸每周2次，并且通过以下式计算肿瘤的尺寸：
肿瘤尺寸(mm3)＝(长轴×短轴2)/2
所得结果示于图6。如图6所示，证实了：从开始测试后的第7天起，在DNP001-倍癌霉素给药组(D-Duo)中肿瘤的生长与对照组相比开始受到抑制。在开始测试后的26天，施用DNP001-倍癌霉素、仅DNP001和PBS的小鼠的平均肿瘤尺寸分别为447.2mm3、510.9mm3和784.6mm3。在施用抗CD43-倍癌霉素偶联物和抗CD43抗体的组的情况下，与对照组相比，肿瘤的生长分别被抑制了约43％和34％。这个结果表明仅抗CD43抗体和抗CD43-倍癌霉素偶联物的胃癌生长的抑制效果显著。
实施例5：对人实体癌组织中CD43的分布的研究
除胃癌之外，为了证实在各种实体癌(胃癌、印戒细胞胃癌、乳腺癌、乳腺癌中的导管浸润性腺癌、肾癌、胰腺癌、胆囊癌、宫颈癌、子宫颈癌、膀胱癌、粒细胞肉瘤)中CD43的表达以及测试靶向CD43治疗功效的可能性，在各种人源肿瘤组织中进行免疫组织化学。
按以下顺序进行免疫组织化学染色。使用石蜡包埋实体癌组织(韩国国立忠北大学医院)作为实体癌组织。首先，石蜡实体癌载玻片在去石蜡过程中经二甲苯洗涤3次(每次10分钟)、经100％酒精洗涤两次(每次5分钟)，经80％酒精洗涤两次(每次3分钟)，经50％酒精洗涤两次(每次1分钟)，经20％酒精洗涤两次(每次1分钟)，然后用流水洗涤两次。然后，将其浸泡在1×TBS(Tris-缓冲盐水)中10分钟。为了在组织中再生抗原，加入10mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，pH8.0)缓冲液并且使其在微波中进行15分钟并且在流水中迅速冷却，然后将载玻片浸泡在1×TBS中20分钟。用0.1％H2O+100％甲醇在10分钟去除内源性过氧化物酶，并且经流水洗涤两次。然后，为了除去生物素和抗原-抗体的非特异性反应，进行阻断处理。该阻断处理通过滴加4滴生物素溶液，并使其在室温下反应15分钟来进行。在将4滴亲和素溶液(VECTOR实验室)滴入组织后，使其在室温下反应15分钟，然后用1×PBS洗涤。
将10μg/mL，5μg/mL在实施例1-1中制备的抗CD43(YG5)抗体和DFT-1抗体(对照组；Ancell公司)悬浮在150μL的1×TBS中以覆盖组织，并使其在室温下反应30分钟。在用1×TBST(1×TBS+0.1％吐温20)洗涤3次(每次15分钟)后，使第二抗体(抗小鼠/兔子HRP；DAKO)覆盖组织(每个2滴)，并在室温下反应30分钟。然后，在用1×TBST(1×TBS+0.1％吐温20)洗涤3次(每次15分钟)之后，用DAB(二氨基联苯胺)进行显色反应。在用1×TBS洗涤5分钟两次并复染色后，用流水洗涤。然后，在进行脱水过程之后，将它安装。
所得结果示于图7和图8和表1。确定每个组织中CD43阳性的标准如下：阴性：0；阳性：根据肿瘤区域中YG5的染色水平分为1至3个等级。
[表1]
表1：CD43在各种癌组织切片中的表达
Figure GDA0003474968730000261
(在表1中，
阳性是指除了YG5未染色的阴性组织以外的阳性组织数量除以相应癌症的总组织数目得到的数值；
总计是指用于染色的组织总数；
阳性是指示出所用组织中YG5呈阳性反应的组织数量)
如表1、图7和图8中所证实的，证明了：CD43在主要出现于上皮细胞中的肿瘤中表达，诸如胃癌、印戒细胞胃癌、乳腺癌、乳腺癌中的导管浸润性腺癌、肾癌、胰腺癌、胆囊癌、宫颈癌、子宫颈癌、膀胱癌、粒细胞肉瘤等。
实施例6：胃癌的癌症干细胞中CD43的表达
测试了各种肿瘤的癌症干细胞中CD43的表达水平。CD44和CD133(Prominin-1)是公知的癌症干细胞标记物。对癌症干细胞标记物CD44和CD133三重染色以证实CD43表达，从而证明CD43在CD44或CD44+CD133+阳性组中表达。在100mm的细胞培养容器中接种并培养NCI-N87细胞，并且当70～80％的表面密集有培养细胞时，用磷酸缓冲液洗涤培养细胞，然后用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)处理并离解，然后进行离心。使沉淀的细胞再次悬浮于缓冲溶液中。在使它们与抗CD44-别藻蓝蛋白(APC)(10μL，Miltenyi Biotec)、抗CD133-异硫氰酸荧光素(FITC)(10μL，Miltenyi Biotec)和抗CD43抗体(实施例1中制备；YG5)-藻红蛋白(PE；1.5μL，Dinona)在4℃的冰箱中反应20分钟之后，洗涤未反应的抗体并且用1％多聚甲醛进行固定。然后通过流式细胞仪(Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,NJ,USA)分析细胞。使用小鼠IgG1替换抗CD44抗体和抗CD133抗体作为阴性对照组进行相同测试。
所得结果示于图9。
如图9所示，作为证实胃癌的癌症干细胞中CD43的表达的结果，证实了CD43在鉴别胃癌的癌症干细胞的标记物(CD44或CD133)为阳性的细胞中，CD43为阳性。这个结果表明根据本发明的抗CD43抗体能特异性结合到在胃癌的癌症干细胞表面上表达的CD43。
实施例7：对在各种实体癌症干细胞中CD43表达的研究
通过实施例6中所用的相同方法来证实实施例5中所用的CD43阳性实体癌的癌症干细胞中CD43的表达。
使用了来源于实施例5中公开的各CD43阳性组织的细胞(乳腺癌、肺癌、直肠癌、肝癌和胆囊癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫颈癌、膀胱癌-来源的细胞系)。在100mm的细胞培养容器中接种并培养各细胞，并且当70～80％的表面密集有培养细胞时，用磷酸缓冲液洗涤培养细胞，然后用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)处理并离解，然后进行离心。使沉淀的细胞块再次悬浮于缓冲溶液中并且与100倍稀释的抗CD44-别藻蓝蛋白(APC)、抗CD44-别藻蓝蛋白(APC)、抗CD326(EpCAM)-别藻蓝蛋白(APC)、抗CD133-异硫氰酸荧光素(FITC)、抗CD43抗体-藻红蛋白(PE)在4℃的冰箱中反应20分钟。洗涤未反应的抗体并用1％多聚甲醛进行固定，然后通过流式细胞仪(Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,NJ,USA)分析细胞。
由此，依据确认实施例5中的CD43阳性组织来源细胞的癌症干细胞中的CD43表达的结果，证实了在鉴定各癌症干细胞的标记物(CD44、CD133或EpCAM)是阳性的细胞中，CD43是阳性的。
实施例8：测试患者的新鲜癌组织的癌症干细胞中CD43的表达
基于实施例5的结果，在使用癌症干细胞标记物在患者的癌症组织中进行分类之后，测试CD43的表达。
患者的新鲜癌症组织进行精细地单克隆化。将单克隆化的肿瘤细胞以1700rpm离心3分钟，然后除去上清液，并且使它再悬浮于10％FBS的10mL培养基中，然后在1700rpm下离心3分钟。除去上清液并且使它经10mL的1×PBS再悬浮，然后进行计数。将细胞放入到FACS试管中，然后在与100倍稀释的抗CD44-别藻蓝蛋白(APC)、抗CD44-别藻蓝蛋白(APC)、抗CD326(EpCAM)-别藻蓝蛋白(APC)、抗CD133-异硫氰酸荧光素(FITC)、抗CD43抗体-藻红蛋白(PE)在4℃的冰箱中反应20分钟之后，洗涤未反应的抗体并用1％多聚甲醛进行固定，然后通过流式细胞仪(Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,NJ,USA)分析细胞。
如上所述，依据检测患者的癌组织中的癌症干细胞中的胃癌的癌症干细胞中的CD43表达的结果，证实了CD43在源自患者的癌组织的癌症干细胞中是阳性的。
实施例9：抗CD43抗体对癌症干细胞的集落形成的抑制(体外)
证实了：实施例6中证实的抗CD43抗体抑制了实施例5中存在的CD43阳性干细胞的集落形成。使用了来源于实施例5中公开的各CD43阳性组织的细胞(乳腺癌、肺癌、直肠癌、肝癌和胆囊癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫颈癌、膀胱癌-来源的细胞系)。在100mm的细胞培养容器中接种并培养各细胞系，并且当70～80％的表面密集有培养细胞时，用磷酸缓冲液洗涤培养细胞，然后用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)处理并离解，然后进行离心。将沉淀的细胞块再次悬浮于缓冲溶液中，并且以每107个肿瘤细胞加入浓度为20μg/mL抗CD43抗体，并且使它在4℃冰箱中反应20分钟，然后用1×PBS洗涤未反应的抗体。在加入20μL的磁珠结合的IgG后，它在4℃冰箱中反应15分钟，然后用1×PBS洗涤，并且用MACS分离系统对CD43阳性细胞进行分类。
在使分类的CD43阳性细胞或阴性细胞与抗CD44-别藻蓝蛋白(APC)、抗CD326(EpCAM)-别藻蓝蛋白(APC)、抗CD133-异硫氰酸荧光素(FITC)、抗磁珠抗体-藻红蛋白(PE，20ul，Miltenyi Biotec)在4℃冰箱中反应15分钟之后，进行洗涤并用1％多聚甲醛继续固定，然后通过流式细胞仪(Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,NJ,USA)进行分析。
将从实施例获得的CD43阳性细胞或阴性细胞以每孔5000个的数量加入到超低附着6孔板(Corning Inc.，Corning，NY，USA)中，该孔含有包括以下的无血清培养基：100IU/ml青霉素G、100μg/mL链霉素、20ng/mL人重组表皮生长因子(hrEGF)、10ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子、2％不含维生素A的B27补充物、1％N2补充剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。然后，每孔添加100μg/mL抗CD43抗体和对照抗体并随后进行培养。之后，观察到球体。通过在患者的新鲜癌症组织中分类CD43阳性细胞来进行相同的实验。
由此，证实了：依据向患者的各种肿瘤和癌组织的CD43阳性癌症干细胞施用抗CD43抗体的结果，癌症干细胞的肿瘤发生与对照组相比被抑制。这个结果表明抗CD43抗体对癌症干细胞的癌形成显著的抑制效果。
实施例10：在多种癌症动物模型中测试抗CD43抗体的抗癌效果(体内)
使用实施例7和8的结果证实的CD43表达的细胞系和新鲜的癌组织来制备动物模型，并且其方法与实施例4相同。将小鼠随机分入对照组(PBS给药)和测试组，并且在接种癌细胞后3天将实施例2中制备的抗CD43抗体(DNP001mAb)以8mg/kg的量注射到尾静脉，每周2次持续3周；或者将0.2mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、5mg/kg的实施例3-1中制备的抗CD43-皂草素、DM1、MMAE、倍癌霉素偶联物腹膜内注射，每周一次持续3周。
实施例11：神经氨酸酶处理后正常血细胞的结合能力变化的测试
证实了与正常淋巴细胞的结合能力是否发生了变化，其中，识别正常血液中表达的CD43的抗体(DFT-1)和识别肿瘤特异性CD43的抗CD43抗体(YG5)经神经氨酸酶处理。
从健康人身上采集10mL血液，向该血液中加入40mL红细胞裂解液(RBC裂解液；NH4Cl，NaHCO3，EDTA pH8.0)，并且在室温下裂解10分钟。将其中红细胞被裂解的血液以1700rpm离心5分钟，然后除去上清液，并用10mL的PBS洗涤2次。使3×106个淋巴细胞悬浮于130μL上述得到的红血细胞裂解液中，并且加入50μL神经氨酸酶(ELPIS，韩国)和20μL缓冲液。然后，细胞在37℃下反应50分钟，并经PBS洗涤。为了证实神经氨酸酶对抗体识别CD43的表位是否发生了变化，将FITC和PE结合的DFT-1和YG5抗体加入到细胞中，并在4℃下反应15分钟后，然后用4ml的PBS洗涤细胞。然后用流式细胞术测量细胞，并测量与正常淋巴细胞的滴度。
结果示于图15中，证实了上述获得的两种针对CD43的抗体(DFT-1和YG5)的滴度。如图15所示，证实了DFT-1在处理神经氨酸苷酶前显示出高滴度，但是在处理神经氨酸酶之后未显示滴度；然而，YG5在处理神经氨酸酶之前未显示滴度，但在处理神经氨酸酶之后显示出16.16％的滴度。由此，证实了根据本发明的抗CD43抗体(YG5)不识别CD43蛋白的唾液酸化表位，并且这表明根据本发明的抗CD43抗体不结合正常细胞，而特异性结合癌细胞，特别是癌症干细胞。
实施例12：CEACAM5和CEACAM6的交叉反应性的测试
已知的是，识别CD43蛋白的已知5F1克隆同时识别CD43和CEACAM6，并结合两种蛋白的岩藻糖基化位置。经测试，抗CD43抗体显示出与CEACAM5和CEACAM6的交叉反应性，并且测试了几夫碱(kifunensine)和岩藻糖苷酶糖基化改变CD43表位而使抗CD43抗体的结合能力改变。
在将rCEACAM5-hFC(Sinobiologics，Cat.No:11077-H03H-50)和rCEACAM6-hFC(DinonA公司)重组蛋白以每孔200μL的量添加到maxisorp ELISA板中并在37℃下反应1小时之后，由此产生阻断。将IgG1、YG5、DFT-1、9A6或8F5单克隆抗体(8F5:Biomaterials,2015Oct,67,32-41,9A6:SantaCruz Biotechnology,Cat.No:sc-59899)以每孔100ng的量分别添加到经rCEACAM5-hFC和rCEACAM6-hFC蛋白覆盖的孔中并在37℃下反应1小时，然后用PBS洗涤以除去未结合的抗体。然后，稀释并加入山羊抗小鼠IgG-HRP(Jackson)，并使其反应30分钟，然后用PBS洗涤，并且以每孔50μL的量加入TMB溶液并使其反应10分钟，然后加入50μL硫酸以停止反应，并且测量450nm处的吸光度。
所得结果示于图16。如图16所示，证明了抗CD43抗体(YG5)对重组蛋白CEACAM5和CEACAM6具有很小的反应性。
另外，抗CD43抗体对岩藻糖苷酶和几夫碱处理的CEM7细胞(根据与单细胞培养从ATCC(CCL-119)获得的CCRF-CEM细胞的原始细胞相比，CD43的细胞表面表达水平增加了50％或更多来分选出的细胞；下文相同)的结合能力没有变化。结果表明，即使在CD43的糖条件改变的条件下，本发明提供的抗体(例如(抗CD43抗体(YG5))也保持与CD43的结合能力，这意味着抗体的表位不独立于糖。另一方面，已知常规CD43抗体5F1显示出糖依赖性表位结合能力，由此证明本发明提供的抗体与常规抗体具有区别。
实施例13：胃癌细胞的三维培养实验(肿瘤球分析)
在实验前，将胃癌细胞系NCI-N87细胞制备到80～90％的150mm培养皿。通过1×胰蛋白酶·EDTA处理使NCI-N87细胞悬浮，然后进行洗涤。使制备的NCI-N87细胞再悬浮在培养基(DMEM/F12(GIBCO)、B27(Invitrogen)、EGF&bFGF(Invitrogen))中，然后以1×105/2ml等分在6孔(超低附着板)中，然后在37℃的CO2培养箱中培养5天。在用光学显微镜拍摄各孔的细胞后，通过1×TE200μL将细胞分离成单细胞，然后用PBS进行洗涤。将1/50的正常小鼠血清添加到细胞中，并它在4℃下阻断10分钟。随后，将细胞以100μL每份等分至流式细胞计数管中，并且分别以10μL和1μL的量加入抗CD44抗体(eBioscience，目录号17-0441-82)和抗CD43抗体(YG5，DFT-1)，并且在4℃下反应25分钟。在通过与上述相同的方法洗涤后，每个试样加入1％(w/v)的多聚甲醛以固定细胞，然后进行流式细胞术。
所得结果示于图17a(培养时的结果)和图17b(培养5天后的结果)。每个图的顶部是显微图像，而底部是示出流式细胞术结果的曲线图。如图17a和图17b所示，通过使用流式细胞术在培养5天的NCI-B87肿瘤球中证实了CD44和CD43双阳性细胞的增加，并且证实了随时间推移而形成肿瘤集落。另外，确认了通过形成肿瘤球体而使CD43的表达增加。这个结果表明CD43表达在肿瘤干细胞中特异性增加。
实施例14：使用悬浮液中的悬浮细胞测量修饰的细胞结合能力的ELISA方案
这种分析被设计成初步(pilot)研究，以通过在聚-D-赖氨酸板中使用具有降低的背景信号的ELISA实验来验证scFv或IgG对悬浮液中悬浮细胞的结合能力。
方法：
1、收集细胞的步骤。
a.将细胞放入50mL Falcon管中并且以500×g离心5分钟(丸化)，来使细胞丸化；
b.用10ml的PBS洗涤获得的细胞丸一次并且以500×g离心5分钟(丸化)，来使细胞丸化；
c.用1mL的PBS使细胞再悬浮后，对细胞进行计数(计数细胞)；
d.用阻断缓冲液(PBS+3％FCS)稀释细胞(细胞稀释液浓度：5×105细胞/孔(10×106细胞/mL))；
e.将50μL/孔的细胞储液加入到V型底96孔板中。
2、加入50μL/孔的细胞质提取物(抗CD43 scFv)或IgG1(所需终浓度×2倍浓缩的储液；例如，当需要25μg/mL的最终浓度时，制备50μg/mL储液)(根据布局(Layout)分析，制备成一式两份或一式三份)。通过小心移液4次使试样混合。
3、在室温下培养1小时。
4、以500×g离心5分钟，以使细胞丸化。
5、通过抽吸或将板内翻，来除去上清液。
6、用200μL阻断缓冲液洗涤细胞，并且通过移液4次使试样混合。
7、以500×g离心5分钟，以使细胞丸化。
8、小心地将板内翻或抽吸，来除去上清液。
9、将100μL的在阻断缓冲液中以1:1,500稀释的抗标签的HRP偶联抗体加入到细胞丸，并小心使其再悬浮，并且在室温下培养30分钟。
10、以500×g离心5分钟，使细胞丸化。
11、小心地将板内翻或抽吸，来除去上清液。
12、加入200μL阻断缓冲液来小心洗涤细胞，并且通过移液4次使所得试样混合。
13、以500×g离心5分钟，使细胞丸化。
14、小心地将板内翻或抽吸，来除去上清液。
15、加入200μL阻断缓冲液来小心洗涤细胞，并且通过移液4次使所得试样混合。
16、以500×g离心5分钟，使细胞丸化。
17、小心使细胞再悬浮于80μL的SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase底物，并在室温下培养5分钟，然后用1M HCl终止反应。
18、将100μL的各个试样转移到标准96孔板。
19、在450nm处对板进行读取(吸光度)。
实施例15：使用悬浮液中的悬浮细胞来测量修饰的细胞结合能力的FACS方案
该分析被设计成FCAS实验的另一种方法，以降低聚-D-赖氨酸板中的背景信号并且评价scFv或IgG的结合能力。
方法：
1、流式细胞术：
a.收集细胞的步骤：
i.以500×g离心5分钟(丸化)，在50mL的falcon管中使细胞丸化；
ii.用10ml的PBS洗涤获得的细胞丸一次并且以500×g离心5分钟(丸化)，来使细胞丸化；
iii.用1mL的PBS使细胞再悬浮后，对细胞进行计数(计数细胞)；
iv.用阻断缓冲液(PBS+3％FCS)稀释细胞(细胞稀释液浓度：5×105细胞/孔(10×106细胞/mL))；
v.将50μL/孔的细胞储液加入到V型底96孔板中。
2、根据布局(Layout)分析，细胞添加50μL/孔的IgG(所需最终浓度×2倍浓缩的储液；例如，当需要25μg/mL最终浓度时，制备50μg/ml储液)，一式两份或一式三份，通过移液4次使试样混合。
3、在室温下孵育30分钟。
4、加入200μL阻断缓冲液。
5、以500×g离心5分钟，以使细胞丸化。
6、小心地将板内翻或抽吸，来除去上清液。
7、加入200μL阻断缓冲液并轻轻洗涤细胞，然后通过使用移液管约4次来使混合均匀。
8、以500×g离心5分钟，以使细胞丸化。
9、除去介质。
10、将200μL的在阻断缓冲液中以1:20稀释的山羊抗人IgG Alexa Fluor488加入到细胞丸中，并小心地使其再悬浮，并在光被阻挡的地方于冰上放置1小时。
11、以500×g离心5分钟，以使细胞丸化。
12、除去介质。
13、加入200μL阻断缓冲液并轻轻洗涤细胞，然后通过使用移液管约4次来使混合均匀。
14、以500×g离心5分钟，以使细胞丸化。
15、加入200μL阻断缓冲液并使细胞轻轻再悬浮。
16、通过使用流式细胞仪对板进行读取。
实施例16：使用可溶性scFv制剂的scFv流式细胞术
本实施例测试scFv与CEM7和U937细胞(
Figure GDA0003474968730000301
CRL1593.2TM)的结合水平，并且使用在大肠杆菌周质中表达的可溶性scFv，并且设计用于通过流式细胞术进行scFv细胞结合分析。
方法：
第1天：克隆接种
1、起动培养板：
a.200μL的2YT(2×酵母提取物)+5％(w/v)葡萄糖+氨苄青霉素填充到96孔培养板中。
b.将可作为比较组的scFv与所需克隆(抗CD43(mJL1)scFv编码DNA：SEQ ID NO:49；Sh741-112scFv编码DNA：SEQ ID NO:51；Sh145-112 scFv编码DNA：SEQ ID NO:SEQ IDNO:53；Sh146-112：SEQ ID NO:55；或Sh434-112 scFv编码DNA：SEQ ID NO:57)接种到孔中。
2、在650rpm和37℃的条件下摇动，培养过夜。
第2天：scFvs的表达
周质提取物培养物：
3、根据接种表达板的最终用途：周质提取物，每个试样可以接种一个或多个孔。
a.将1.0mL/孔的2YT+Amp(无葡萄糖)填充到96深孔板中。
b.在将起动培养物稀释至在OD600下具有0.1值之后，将它们接种到96孔板中。在30℃和650rpm的条件下摇动，将它们培养2～4小时。定期地，通过收集试样来测量在OD600下的浊度。将细胞培养至具有0.7～1.0的OD600值。
4、在表达板中诱导scFv表达：
a.为了诱导周质提取培养物的表达，将100μL的2YT+Amp(其中IPTG(以1:100稀释储液IPTG))加入到各表达板中。
b.在650rpm和22℃的条件下摇动，培养过夜。
第3天：周质提取物的制备和流式细胞术
周质提取物：
5、周质提取物的制备：
a.以2000×g离心10分钟，使细胞丸化。
b.将表达板中的上清液撒到装有漂白剂的容器，并且通过放在纸巾上来去除留在板中的培养基。
c.将75μL的冷PPB(磷酸钾缓冲液)+蛋白酶抑制剂(每50mL 1片；完全；Roche，目录号：04693116001)加入到每个孔中，并通过移液4次而使其再悬浮，然后在1000rpm和4℃的条件下培养10分钟。
d.置于每个孔中，并通过移液4次来再悬浮，然后在1000rpm和4℃的条件下于振荡下培养1小时。
e.使板在3000×g下离心10分钟。
f.转移周质提取物(约270μL)并将滤器放入堆叠中(确保对应A1取向)。
i.顶部：1.2μm的96孔滤板
ii.中部：100K的96孔滤板
iii.底部：96孔平底标准板。
g.以4000rpm离心该板20分钟。
h.(如果必要的话)收集每个克隆的试样来用于准备流式细胞术分析。
6、流式细胞术：
a.scFv试样：使用周质提取物
b.细胞的收集：
i.将细胞放入50mL Falcon管中并且以500×g离心5分钟(丸化)，来使细胞丸化。
ii.用10mL的PBS洗涤细胞丸一次并以500×g离心5分钟，来使细胞丸化。
iii.在使细胞再悬浮于1mL的PBS中后，对细胞进行计数(计数细胞)。
iv.以0.5×105个细胞/孔(2.5×106个细胞/mL)对细胞进行稀释。
v.将20μL/孔的细胞储液加入到V型底96孔板中。
c.加入20μL/孔的周质提取物一式两份(scFv)。
并且通过移液约4次来使试样轻轻混合。
d.将它们在室温下放置30分钟。
e.加入180μL阻断缓冲液。
f.以500×g离心5分钟，来使细胞丸化。
g.通过将板内翻或进行抽吸，来除去上清液。
h.加入200μL阻断缓冲液并轻轻洗涤细胞，然后通过移液约4次进行均匀混合。
i.以500×g离心5分钟，来使细胞丸化。
j.除去介质。
k.通过向容易制备的结合缓冲液中加入50μL的5μg/mL抗标签PE-偶联抗体(BioLegend，目录号：637310)，使细胞轻轻再悬浮。由于抗体对光敏感，因此应尽量避免光照。在避光条件下，使它们在冰上静置30分钟。
l.以500×g离心5分钟，来使细胞丸化。
m.除去介质。
n.加入200μL阻断缓冲液并轻轻洗涤细胞，然后通过移液约4次进行均匀混合。
o.以500×g离心5分钟，来使细胞丸化。
p.加入200μL阻断缓冲液并使细胞轻轻再悬浮。
q.通过使用Guava流式细胞仪(Merckmillipore)读取板。应预先准备流式细胞术以识别黄色荧光。
实施例17：鼠抗CD43抗体作为模板的功能特性
进行本实验以证明适用于抗体处理(JL-1)的靶表位。在本实验中，使用结合表位(重链：SEQ ID NO:34；重链编码DNA：SEQ ID NO:33；重链表达载体(基于pTT5)：SEQ ID NO:35；轻链：SEQ ID NO:37，轻链编码DNA：SEQ ID NO:36；轻链表达载体(基于pTT5)：SEQ IDNO:37)的小鼠抗CD43单克隆抗体。
证实了：当JL-1抗原(CD43)在37℃下培养4小时时，没有从细胞中分离出显著量的抗原。证明了：当通过蛋白质印迹分析对混合到缓冲液的抗CD43抗体与混合到实际Molt-4(CD43+急性淋巴细胞性白血病细胞系；ATCC，CRL-1582)或HL-60(ATCC)上清液的抗CD43抗体进行比较时，在尺寸方面没有很大差异。
另外，证实了在正常人血清中循环的JL-1抗原(CD43)的量不足以显著干扰抗CD43抗体与靶标的结合。在体外评估50％人血清对结合白血病细胞的抗CD43抗体的影响(测量IF(免疫荧光)反应性)。所得结果示于表2。
[表2]
Figure GDA0003474968730000321
*ND：未测定
如表2所示，证实了血清并不干扰抗CD43抗体与Molt-4细胞或HL-60细胞的结合。
另外，经测试，未偶联的裸抗CD43抗体对分离的靶细胞没有直接细胞毒性效果。为此，分别以40000个细胞/孔的量将CD43+CEM7细胞(以CEM7-高抗原表示)和CCRF-CEM细胞(原始CEM细胞(ATCC)；以CEM7-中抗原表示)加入到96-孔板中，并连续稀释并处理小鼠CD43抗体(预先制备的小鼠抗CD43单克隆抗体)，并且在培养第3天通过使用Cell Titer Glo(PromegaTM)测定细胞毒性。为了比较，对低浓度的表达CD43的H9K细胞(H9K-低抗原)进行相同实验。
所得结果示于图18。如图18所示，证实了小鼠CD43抗体对CD43+CEM7(CEM7-高抗原)或CCRF-CEM细胞(CEM-中等抗原；与CEM7细胞相比CD43表达较少)没有表现出细胞毒性。
诸如CEM7、CCRRF-CEM、Nalm6(ATCC，CRL-3273)和HL-60(ATCC，CCL-240)等细胞系表现出独立地不同的JL-1抗原(CD43)表达水平(按描述顺序从高表达到低表达)。以20μg/ml至每个细胞(20000个细胞)的稀释浓度来处理皂草素结合的抗CD43抗体(参照实施例3-1的偶联物的构建；抗CD43抗体是预先制备的小鼠抗CD43单克隆抗体)或同种型对照，并且在培养的第3天时使用Cell Titer Glom测量细胞存活率。使用小鼠IgG1作为用于比较的同种型对照。
所得结果示于图19。如图19所示，观察到当处理皂草素偶联物抗CD43抗体(图19中表示为mJL-1)时，CEM7的细胞存活率降低最大，随后是CEM和NALM6细胞。观察到最低细胞毒性出现在不表达靶标的HL-60中(最小的细胞存活率降低)。如图19所示，毒素连接的抗CD43抗体诱导了靶细胞的死亡。与细胞中存在的抗原的表达水平相比，抗CD43抗体处理的CEM7、CCRF-CEM、NALM6和HL-60细胞显示出有效杀死细胞的活性。皂草素仅在胞内诱导的情况下显示出细胞毒性效果。
测试了抗CD43抗体的内化。将小鼠抗CD43抗体(预先制备的小鼠抗CD43单克隆抗体)在冷藏条件下处理细胞(CEM7)30分钟，并转移至37℃的条件下，然后在图20的X轴中表示的各个时间点收集106个细胞，并且抗小鼠IgG-PE第二抗体(Santa cruz生物技术，目录号：SC3738)在冷藏温度下处理10分钟，并且洗涤并固定细胞，然后通过流式细胞仪进行分析(参照实施例15)。
所得结果示于图20。如图20所示，抗CD43抗体在与抗原结合时进入细胞，并且相应数据表明细胞表面上的抗体进入细胞并随时间流逝而消失的水平。如图19所示，该数据证明了用于凋亡分析的抗CD43抗体(小鼠抗体和人源化抗体二者)的内化。
另一方面，测试了表达抗原的细胞中由抗CD43抗体诱导的同型聚集现象。为此，抗CD43抗体(预先制备的小鼠抗CD43单克隆抗体)以40μg/mL的起始浓度处理300000个细胞(CEM7、CCRRF-CEM或HL-60)并在37℃和5％CO2的条件下培养，然后通过在设定的时间点(抗体处理后2小时)拍摄显微照片来获得图像。所得图像示于图21。图21是示出由抗CD43抗体(表示为抗JL-1抗体)诱导的同型聚集现象的图像，这表明抗CD43抗体在体外诱导了表达CD43的细胞的同型聚集，并且同型聚集的水平与抗原(CD43)的表达水平有关。
另外，测试了人正常骨髓细胞中的CD43表达。正常骨髓的单核细胞用鼠抗CD43抗体(预先制备的鼠抗CD43单克隆抗体)对进行染色，然后用山羊抗鼠IgG F(ab)2-PE(Jackson，目录号：115-035-072)进行染色，并且通过实施例15中公开的方法进行观察。
所得结果示于图22。在图22中，直方图叠加表示有限的淋巴细胞。如图22所示，通过抗CD43抗体(表示为JL1)染色在各种正常骨髓试样中证实了异源CD43表达的低水平，并且在几种外周血细胞中也得到证实。换言之，该结果示出了正常骨髓细胞中异源CD43表达水平低。
另一方面，通过流式细胞术在来自各种人正常骨髓试样(首尔国立大学医院)的CD34+CD38-细胞(造血细胞通过FACS检测分选为CD43表达和CD38非表达细胞；下文相同)中测量CD43表达，并且证实了在造血干细胞和骨髓中形成集落的前体细胞中缺乏CD43蛋白表达。证实方法简单描述如下：在第0天，将脐带造血干细胞接种到30只NSG小鼠(NOD/SCID×普通g链缺陷)。在12周后，用最终分化的免疫细胞分析所有小鼠的PBL(外周血淋巴细胞)。对测试中使用的所有小鼠的免疫系统进行移植(ingraft)，并且施用抗CD43抗体(预先制备的小鼠抗CD43单克隆抗体)-毒素(皂草素)偶联物或载体(PBS)，持续4周。在处理4周后，在免疫动物中分析人免疫细胞的存在。为了比较，使用小鼠IgG1-毒素(皂草素)偶联物替换抗CD43抗体进行相同的测试。
所得结果示于下面的表3。
[表3]
Figure GDA0003474968730000331
Figure GDA0003474968730000341
Figure GDA0003474968730000342
(在该表中，JL1代表CD43；PMN：多形核白细胞；LN：淋巴结)
如表3所示，当NSG小鼠移植有从脐血干细胞获得的正常人造血干细胞(HSC)并且抗CD43抗体-毒素(皂草素)偶联物处理4周时，没有观察到任何造血细胞部分的缺失。该结果表明抗CD43抗体-毒素(皂草素)偶联物不杀死造血干细胞或中间祖细胞。
在各种人正常组织中使用小鼠抗CD43抗体进行免疫组织化学染色(IHC)，并且所得结果示于下面的表4。
[表4]
组织 #阳性 强度
小脑 0/3
肾上腺 0/3
卵巢 0/3
胰腺 0/3
甲状旁腺 0/3
睾丸 0/3
甲状腺 0/3
乳腺 0/3
扁桃体 0/3
胸腺 3/3 +++
骨髓 0/3
肺 0/3
心 0/3
食管 0/3
胃 0/3
小肠* 0/3
结肠* 0/3
肝 0/3
涎腺 0/3
肾 0/3
前列腺 0/3
*粘蛋白染色
如表4所示，在胸腺以外的其他组织中未发现CD43特异性染色。
通过用小鼠抗人CD43(表示为JL-1:(d))对两种正常人PBMC(外周血单核细胞)进行染色来测量CD43抗原的表达率(参见实施例15(FACS)，并且结果示于图23。如图23所示，证实了CD43的低表达率。
用皂草素偶联的小鼠抗CD43抗体(10μL/mL)预先处理正常骨髓细胞(JL1+)，以及未处理(JL1-)的情况，并且测量这些骨髓亚群的集落形成水平。从人白血细胞中分离出骨髓，并且通过分成JL-1(CD43)阳性和阴性来分离并收获CD34+细胞。然后将收获的细胞与细胞因子一起放入Methocult中，并且测量集落的形成。所得结果示于图24。如图24所示，证实了在预先处理皂草素偶联的小鼠抗CD43抗体(10μL/mL)(JL1+)的情况下，未形成骨髓亚群的集落。
另一方面，在使用细胞系的白血病ALL异种移植物小鼠模型(通过将CEM7细胞移植到小鼠而获得的急性白血病小鼠模型)中测试了抗CD43抗体本身(裸抗)和毒素结合的抗CD43抗体-毒素(debouganin)偶联物的治疗效果。使用预先制备的小鼠抗CD43单克隆抗体作为抗CD43抗体。所得结果示于图25。在图25中，抗CD43抗体表示为JL1。在图25中，(A)示出了CEM7白血病模型中的结果，(b)示出了NALM-6模型(细胞系：NALM6(B-ALL))中的结果，并且测试在以下条件下进行：小鼠：NOD-SCID(8/组)；接种：在第0天时为107个细胞；给药：从第8天开始15μg/注射+100μg散装的IgG i.v.1×/周；终点：瘫痪状态。如图25所示，当用裸(非偶联)抗CD43抗体处理CEM7或NALM-6细胞接种的ALL异种移植物模型小鼠时，该疾病未发生或延迟。
另一方面，测量了主要AML(急性骨髓性白血病)母细胞和亚群中的CD43表达水平。结果示于图26。如图26所示，在原发性AML母细胞和普遍存在特定亚群中分析CD43蛋白(表示为JL-1)表达。AML群中约60％表达了CD43。
实施例18：人源化抗CD43单克隆抗体的构建
基于维持小鼠CD43抗体并编码人抗体基因的Gremlin序列(重链：SEQ ID NO:34；重链编码DNA：SEQ ID NO:33；重链表达载体：SEQ ID NO:35，轻链：SEQ ID NO:37；轻链编码DNA：SEQ ID NO:36；轻链表达载体(基于pTT5)：各自为SEQ ID NO:38的重链和轻链的CDR区序列)(CDRH1：SEQ ID NO:111(GYFMN)；CDRH2：SEQ ID NO:114(RINPNNGDSFYNQKFQG)；CDRH3：SEQ ID NO:118(EGYYGGRGYALDY)；CDRL1：SEQ ID NO:119(RTSQDISNYLN)；CDRL2：SEQID NO:121(NTSRLHS)；CDRL3：SEQ ID NO：125(QQSNMFPY))，构建了scFv型的重组人源化抗体库，其中将框架区的序列区域重组。
通过常规噬菌体展示方法表达并筛选构建的scFv抗体库，并将构建的阳性克隆作为表达在除CDR之外的区或CDR中的部分区序列被替换的变体的子库，由此重复筛选。
通过重复这些库构建的各种循环和展示方法，确保了抗原亲和力与亲本克隆非常相似的人源化抗体变体序列。
确保的人源化抗CD43抗体的重链序列示于SEQ ID NO:40、42、44和46，轻链序列示于SEQ ID NO:48，并且重链可变区和轻链可变区分别示于SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26、30和83(重链可变区)，以及SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32和83(轻链可变区)。
另外，来自修饰的SEQ ID NO:83(重链可变区)和SEQ ID NO:95(轻链可变区)的突变型人源化抗CD43抗体的重链可变区和轻链可变区分别示于SEQ ID NO:84至94(重链可变区)和SEQ ID NO:96至106(轻链可变区)。
通过将所获得的重链可变区和轻链可变区与GGGASGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:127)或GGGGSGGGGSGGGAS(SEQ ID NO:128)连接来制备scFv型抗体。
实施例19：人源化或嵌合抗CD43单克隆抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。
测试了制备的嵌合抗CD43抗体(DNP001；实施例2-1-3)的凋亡效应(ADCC和CDC)。首先，使CEM7细胞系效应细胞(PBMC；外周血单核细胞)与抗CD43嵌合体或对照抗体(人IgG1)共培养4小时，然后通过使用Cell Titer Glo来测量细胞毒性，并且结果示于图27A。使CEM7细胞系与培养基和抗CD43嵌合抗体一同与兔补体(cedarlane，目录号：CL3051)一起培养，然后使用Cell Titer Glo来测量细胞毒性，并且结果示于图27B。抗CD43嵌合抗体在图27中表示为JL-1。如图27所示，与人IgG1对照抗体相比，证实了嵌合抗CD43抗体诱导了在体外水平上的效应子介导杀死(ADCC和CDC)。
图28示出了去糖基化(通过用几夫碱处理抗体进行去糖基化)的嵌合抗CD43抗体(表示为JL-1)增强了在体外水平上对CEM7的ADCC活性。
图29是示出体内CEM7细胞系中的不与任何物质结合的裸-嵌合抗体的效果的曲线图。如图29所示，证实了裸(非偶联的)和去色素偶联的嵌合抗CD43抗体增强了CEM7细胞接种的动物(ALL(急性淋巴细胞性白血病)白血病模型)的存活。
测试了白血病干细胞(LSC)亚群中的CD43表达。用CD45抗体(BD)、CD34抗体(BD)、CD38抗体(BD)、CD43抗体(DNP001)或具有Alexa488的mIgG1(对照)对AML(急性骨髓性白血病)患者骨髓进行染色，并且通过分选CD34+CD38-白血病干细胞来评估CD43的表达水平，并将它们与对照组进行比较。结果示于图30(JL1：CD43)。如图30所示，CD43抗原在白血病起始细胞(LSC)亚群(CD34+/CD38-)中表达。
体外测量用与毒素(皂草素：SAP)偶联的嵌合抗CD43抗体(CCC)处理的集落的平均数量，并且将其示于图31。该结果表明了抗原阳性AML的凋亡效应，其中抗原阳性AML与CD43抗体-皂草素偶联物或小鼠IgG1-皂草素偶联物一起添加到干细胞集落基质。
此外，体外测量了与毒素(皂草素：SAP)(CCC)偶联的嵌合抗CD43抗体对抗原阳性主要AML增殖的影响，并且将其示于图32。该结果表明CCC降低了主要AML的增殖。通过将主要AML母细胞放入含有CD43抗体-皂草素偶联物或小鼠IgG1-皂草素偶联物的培养基中并在3天后测量细胞增殖水平来获得结果，并且由结果证实了在包含JL1-皂草素的培养基中培养时细胞生长减慢(A)，并且死细胞的比例(B)增加。
如图31和图32所示，当通过体外集落分析(图31)和增殖分析(图32)进行确认时，毒素偶联的人源化嵌合抗体对CD43阳性原发性AML具有细胞毒性。
测试了在NSG小鼠(体内)中毒素偶联的抗体对主要AML癌细胞生长的抑制效果。从CD43+AML患者中收获5×107骨髓细胞，并且将它们静脉注射到30只经辐射的NSG小鼠，并且在8周后，将嵌合CD43抗体-三角梅核糖体失活蛋白(DB)偶联物(表示为JL1-DB)、hIgG1-DB偶联物(表示为Isotype-DB)或PBS(载体)以每周45μg的剂量施用给这些小鼠，持续4周。然后从那些小鼠中收集血液、骨髓和脾脏，并且观察植入和肿瘤生成。所得结果示于图33。如图33所示，毒素偶联抗CD43人源化嵌合抗体在体内水平上抑制了NSG小鼠的原发性AML癌细胞的生长。
图34和图35证实了：各种人源化/优化的修饰抗体显示出与模板(小鼠)CD43抗体相比等同的结合特征。CEM7细胞用亲本模板CD43抗体(ART140 JL1；小鼠抗CD43抗体；重链：SEQ ID NO:34；轻链：SEQ ID NO:37)和3种人源化抗体(257-10(SEQ ID NO:(SEQ ID NO:6和105)；456-D10(SEQ ID NO:94和106)；联合体A(SEQ ID NO:2和4))进行染色，由此测量荧光强度，并且结果示于图34。如图34所示，证实了修饰的“联合体A”显示出最好的轮廓，但是所有其他测试抗体显示出了在CEM7细胞中显著水平的细胞毒性。为了测试与细胞毒性物质偶联的抗体的细胞内化，用3种与抗人IgG-皂草素预复合的人源化抗体处理CEM7细胞，并且在3天后测量细胞毒性，并将其示于图35。如图35所示，当使用3种修饰抗体与皂草素的偶联物时，细胞毒性显著高。
如图34和图35所示，各种人源化抗CD43抗体变体的结合水平和细胞毒性水平与体外鼠类CD43抗体(ART140 JL1)相比是相当的。对照组使用了Synagis(Medimmune公司)，即，RSV F蛋白的抗原性位点上的抗原决定簇的人源化单克隆抗体(IgG)。
图37a和图37b示出了通过流式细胞术对许多与细胞表面上的CD43抗原结合的人源化抗CD43抗体变体(参见图36)与鼠CD43抗体(ART140 JL1)的比较。使用U937细胞(CD43抗原在表面上的表达缺乏)来作为阴性对照。
图38a和图38b示出了通过酶联免疫吸附测定(ELISA)对许多与细胞表面上的CD43抗原结合的人源化抗J CD43抗体变体(参见图36)与鼠CD43抗体(ART140JL1)的比较。使用U937细胞(CD43抗原在表面上的表达缺乏)来作为阴性对照。
图39a和图39b示出了通过流式细胞术对与细胞表面上的CD43结合的Quikchange突变人源化抗CD43抗体变体(联合体A(SEQ ID NO:91(重链可变区)；SEQ ID NO:103(轻链可变区))、联合体B(SEQ ID NO:91(重链可变区)；SEQ ID NO:103(轻链可变区))、联合体C(SEQ ID NO:85(重链可变区)；SEQ ID NO:97(轻链可变区)))与鼠CD43抗体(ART140 JL1)和第3轮亲本框架的比较。
图41a至图41c示出了与细胞表面上的JL1抗原结合的Quikchange突变人源化抗CD43抗体变体(联合体A、联合体B、联合体C)与鼠CD43抗体(ART140 JL1)和第3轮亲本框架的比较。
实施例20：移除人源化抗体的糖基化区的氨基酸残基的修饰抗体的制备
据发现，从实施例18中获得的人源化抗CD43抗体(257-10；包含SEQ ID NO:6(重链可变区)+SEQ ID NO:105(轻链可变区)+轻链可变区(SEQ ID NO:105))的轻链可变区(SEQID NO:105)存在可能糖基化的氨基酸序列，并且通过制备突变抗体来移除该氨基酸序列。
由于轻链可变区的糖基化很可能对抗体的抗原结合能力和物理性质造成负面影响并且可能影响随后大量生产中的产率降低，所以通过将具有糖基化潜能的氨基酸替换为其他氨基酸来提高抗体发展成治疗剂的可能性。
选择第50位的氨基酸残基天冬酰胺(Asn，N)和第52位的氨基酸残基丝氨酸(Ser，S)作为人源化抗CD43抗体的轻链可变区(SEQ ID NO:105)能糖基化的氨基酸(参见图43)。通过将SEQ ID NO:8的第50位氨基酸残基天冬酰胺(Asn，N)替换为谷氨酰胺(Gln，Q)或丙氨酸(Ala，A)，和/或将第52位氨基酸残基丝氨酸(Ser，S)替换为丙氨酸(Ala，A)，来制备突变体抗体；并且上述获得的突变抗体的轻链可变区示于SEQ ID NO:107(S52A)、108(N50Q)和109(N50A)。
[SEQ ID NO 107(S52A)]
Figure GDA0003474968730000371
[SEQ ID NO 108(N50Q)]
Figure GDA0003474968730000372
[SEQ ID NO 109(N50A)]
Figure GDA0003474968730000373
制备了包含所得的修饰抗体55的重链可变区(SEQ ID NO:6)和轻链可变区的IgG1型抗体，并且使用与糖基化区结合的伴刀豆球蛋白A-HRP(Sigma-Aldrich)来进行蛋白质印迹。
所得结果示于图44。如图44所示，证实了伴刀豆球蛋白A结合到糖基化区的氨基酸未被修饰的抗体中全部轻链区和重链区(包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:105；野生型)，但在3种修饰的抗体(scFv)中未发生轻链区的结合。这个结果意味着除去了抗体轻链区的糖基化。
另外，通过测量抗体与CD43阳性细胞CEM7细胞的结合能力，分析了抗原结合能力。所得结果示于图45。如图45所示，修饰的抗体示出了与野生型等同的抗原结合能力。
将嵌合抗体(DNP001)和移除糖基化的修饰人源化抗体(重链可变区；SEQ ID NO:6；轻链可变区：SEQ ID NO:109)结合到抗原(CD43)阳性细胞CEM7细胞，并且通过流式细胞术对它们进行分析。所得结果示于图46。如图46所示，证实了修饰的人源化抗体示出了比嵌合抗体增强的CD43表达细胞结合能力。
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<223> Quickchange突变组合体 A重链可变区（VH）核苷酸序列
<400> 1
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaaac ctggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cagcatcggc ggctactaca tgaactgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gcctggaatg gatgggccgg atcaacccca acagcggcga cagcttctac 180
aaccagaaat tcaagggcag ggtgaccacg acccgcgaca ccagcaccag caccatgtac 240
atggaactga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagagggc 300
tattacggcg gcagaggcta cgccctggat tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360
tcctcc 366
<210> 2
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Quickchange突变组合体 A VH 氨基酸序列
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Thr Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Met Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Quickchange突变组合体 A 轻链可变区（VL）核苷酸序列
<400> 3
gacatccaga tgacccggag ccctagcagc gtgtccgcca gcgtgggcgg cagagtgccc 60
atcacctgtc ggaccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctacaac accagccggc tgcacagcgg cgtgccaagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agcaacatgt tcccctacac cttcggccag 300
ggtatcaagc tggagatcaa gcgt 324
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Quickchange突变组合体 A VL氨基酸序列
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Arg Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Gly Arg Val Pro Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 5
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 257-10 (第2轮变体) VH 核苷酸序列
<400> 5
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtcaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcaac ggctacttca tgaactgggt gaggcaggcc 120
cctgggcagg gactggagcg gatgggccgc atcaacccca acaacggcga cagcttctac 180
aaccagaagt tccagggccg cgtcaccatg acccgcgaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctgc ccagcctgcg cagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggagggc 300
tactacggcg gcagaggcta cgccctggac tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360
tcctcc 366
<210> 6
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 257-10 (第2轮变体) VH 氨基酸序列
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Arg Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Pro Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 325
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 257-10 (第2轮变体) VL核苷酸序列
<400> 7
gacacccaga tgacccagag cccttcttct gtctccgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgcc gcaccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaac accagcaggc tccactctgg agtccccagc 180
cgcttctccg gctccgggtc tggaaccgac ttcaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agcaacatgt tcccctacac cttcgggcag 300
gggaccaagc tggagatcaa gcgta 325
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 257-10 (第2轮变体) VL氨基酸序列
<400> 8
Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 9
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 456-D10 VH 核苷酸序列
<400> 9
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtcaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcaac ggctacttca tgaactgggt gaggcaggcc 120
cctgggcagg gactggagcg gatgggccgc atcaacccca acaacggcga cagcttctac 180
aaccagaagt tccagggccg cgtcaccatg acccgcgaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctgc ccagcctgcg cagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggagggc 300
tactacggcg gcagaggcta cgccctggac tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360
tcctcc 366
<210> 10
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 456-D10 VH 氨基酸
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Arg Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Pro Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 456-D10 VL 核苷酸序列
<400> 11
gacacccaga tgacccagag cccttcttct gtctccgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgcc gcaccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcaggagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaac accagcaggc tccactctgg agtccccagc 180
cgcttctccg gctccgggtc tggaaccgac ttcaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agcaacatgt tcccctacac cttcgggcag 300
gggaccaagc tggagatcaa gcgg 324
<210> 12
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 456-D10 VL 氨基酸序列
<400> 12
Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 13
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 324-B10 VH核苷酸序列
<400> 13
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaaac ctggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cagcatcggc ggctactaca tgaactgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gcctggaatg gatgggccgg atcaacccca acagcggcga cagcttctac 180
aaccagaaat tcaagggcag ggtgaccatg acccgcgaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggaactga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagagggc 300
tattacggcg gcagaggcta cgccctggat tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360
tcctcc 366
<210> 14
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 324-B10 VH 氨基酸序列
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 324-B10 VL 核苷酸序列
<400> 15
gacattcaga tgacccggag ccctagcagc gtgtccgcca gcgtgggcga cagagtgtcc 60
atcacctgtc ggaccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctacaac accagccggc tgcacagcgg cgtgccaagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agcaacatgt tcccctacac cttcggccag 300
ggtatcaagc tggagatcaa gcgg 324
<210> 16
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 324-B10 VL 氨基酸序列
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Arg Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 17
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 361-C11 VH 核苷酸序列
<400> 17
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaaac ctggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cagcatcggc ggctacttca tgaactgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gcctggaatg gatgggccgg atcaacccca acaacggcga cagcttctac 180
aaccagaaat tcaagggcag ggtgaccatg acccgcgaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggaactga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagagggc 300
tattacggcg gcagaggcta cgccctggat tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360
tcctcc 366
<210> 18
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 361-C11 VH 氨基酸序列
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 19
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 361-C11 VL 核苷酸序列
<400> 19
gacattcaga tgacccggag ccctagcagc gtgtccgcca gcgtgggcgg cagagtgtcc 60
atcacctgtc ggaccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctacaac accagccggc tgcacagcgg cgtgccaagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agcaacatgt tcccctacac cttcggccag 300
ggtatcaagc tggagatcaa gcgg 324
<210> 20
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 361-C11 VL 氨基酸序列
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Arg Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Gly Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 21
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 368-G07 VH 核苷酸序列
<400> 21
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaaac ctggcgccag cgtgaaggtg 60
tcntgcaagg ccagcggcta cagcatcggc ggctacttca tgaactgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gcctggaatg gatgggccgg atcaacccca acaacggcga cagcttctac 180
aaccagaaat tcaagggcag ggtgaccatg acccgcgaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggaactga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagagggc 300
tattacggcg gcagaggcta cgccctggat tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360
tcctcc 366
<210> 22
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 368-G07 VH 氨基酸序列
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 368-G07 VL 核苷酸序列
<400> 23
gacattcaga tgacccggag ccctagcagc gtgtccgcca gcgtgggcga cagagtgccc 60
atcacctgtc ggaccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctacaac accagccggc tgcacagcgg cgtgccaagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agcaacatgt tcccctacac cttcggccag 300
ggtatcaagc tggagatcaa gcgg 324
<210> 24
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 368-G07 VL 氨基酸序列
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Arg Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Pro Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 25
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 369-F05 VH 核苷酸序列
<400> 25
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaaac ctggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cagcatcggc ggctacttca tgaactgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gcctggaatg gatgggccgg atcaacccca acaacggcga cagcttctac 180
aaccagaaat tcaagggcag ggtgaccatg acccgcgaca ccagcaccag caccatgtac 240
atggaactga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagagggc 300
tattacggcg gcagaggcta cgccctggat tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360
tcctcc 366
<210> 26
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 369-F05 VH 氨基酸序列
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Met Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 369-F05 VL 核苷酸序列
<400> 27
gacattcaga tgacccggag ccctagcagc gtgtccgcca gcgtgggcga cagagtgtcc 60
atcacctgtc ggaccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctacaac accagccggc tgcacagcgg cgtgccaagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agcaacatgt tcccctacac cttcggccag 300
ggtatcaagc tggagatcaa gcgg 324
<210> 28
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 369-F05 VL 氨基酸序列
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Arg Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 29
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 361-H05 VH 核苷酸序列
<400> 29
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaaac ctggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cagcatcggc ggctacttca tgaactgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gcctggaatg gatgggccgg atcaacccca acaacggcga cagcttctac 180
aaccagaaat tcaagggcag ggtgaccacg acccgcgaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggaactga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagagggc 300
tattacggcg gcagaggcta cgccctggat tactggggcc agggcaccct ggtgactgtg 360
tcctcc 366
<210> 30
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 361-H05 VH 氨基酸序列
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Thr Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 361-H05 VL 核苷酸序列
<400> 31
gacattcaga tgacccggag ccctagcagc gtgtccgcca gcgtgggcga cagagtatcc 60
atcacctgtc ggaccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctacaac accagccggc tgcacagcgg cgtgccaagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agcaacatgt tcccctacac cttcggccag 300
ggtatcaagc tggagatcaa gcgg 324
<210> 32
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 361-H05 VL 氨基酸序列
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Arg Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 33
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠抗-CD43 (mJL-1) IgG重链 (HC) DNA 序列
<400> 33
gaggttcagc tgcagcagtc tggtcctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatt 60
tcctgcaagg cctctggtta ctcaattggt ggctacttta tgaactgggt gaagcagagc 120
cacggcaaga gccctgagtg gattgggcgt attaatccta acaatggtga ttctttctac 180
aaccagaaat tcaagggcac ggccacattg actgttgacc gctcttctga cacagtccac 240
atggaggtcc tgagcctgac atctgaggac tctgcagtct attattgtgg ccgcgaaggt 300
tactacggtg ggcgaggcta tgctttggac tactggggtc aaggcacctc ggtcaccgtc 360
tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356
<210> 34
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠抗-CD43 (mJL-1) IgG HC 氨基酸序列
<400> 34
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Thr Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Asp Thr Val His
65 70 75 80
Met Glu Val Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 35
<211> 5734
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于表达的鼠抗-CD43 (mJL-1) IgG HC 完全载体(基于pTT5 )
<400> 35
gtacatttat attggctcat gtccaatatg accgccatgt tgacattgat tattgactag 60
ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 120
tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 180
gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 240
ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 300
tccgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 360
gaccttacgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 420
ggtgatgcgg ttttggcagt acaccaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 480
tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga 540
ctttccaaaa tgtcgtaata accccgcccc gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg 600
gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcctca ctctcttccg 660
catcgctgtc tgcgagggcc agctgttggg ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc 720
tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa cggtactccg ccaccgaggg 780
acctgagcga gtccgcatcg accggatcgg aaaacctctc gagaaaggcg tctaaccagt 840
cacagtcgca aggtaggctg agcaccgtgg cgggcggcag cgggtggcgg tcggggttgt 900
ttctggcgga ggtgctgctg atgatgtaat taaagtaggc ggtcttgaga cggcggatgg 960
tcgaggtgag gtgtggcagg cttgagatcc agctgttggg gtgagtactc cctctcaaaa 1020
gcgggcatta cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa acgaggagga tttgatattc 1080
acctggcccg atctggccat acacttgagt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc 1140
acaggtgtcc actcccaggt ccaagtttgc cgccaccatg gcttggatga tgcttctcct 1200
cggactcctt gcgtacggat caggagaggt tcagctgcag cagtctggtc ctgagctggt 1260
gaagcctggg gcttcagtga agatttcctg caaggcctct ggttactcaa ttggtggcta 1320
ctttatgaac tgggtgaagc agagccacgg caagagccct gagtggattg ggcgtattaa 1380
tcctaacaat ggtgattctt tctacaacca gaaattcaag ggcacggcca cattgactgt 1440
tgaccgctct tctgacacag tccacatgga ggtcctgagc ctgacatctg aggactctgc 1500
agtctattat tgtggccgcg aaggttacta cggtgggcga ggctatgctt tggactactg 1560
gggtcaaggc acctcggtca ccgtctcctc agctagcacc aagggcccat cggtcttccc 1620
cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa 1680
ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt 1740
gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac 1800
cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag 1860
caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc 1920
accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc 1980
caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag 2040
ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc 2100
caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac 2160
cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc 2220
cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca 2280
ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg 2340
cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc 2400
ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta 2460
cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt 2520
gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa 2580
ataggatccc ccgacctcga cctctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt 2640
gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttggt 2700
cgagatccct cggagatctc tagctagagg atcgatcccc gccccggacg aactaaacct 2760
gactacgaca tctctgcccc ttcttcgcgg ggcagtgcat gtaatccctt cagttggttg 2820
gtacaacttg ccaactgaac cctaaacggg tagcatatgc ttcccgggta gtagtatata 2880
ctatccagac taaccctaat tcaatagcat atgttaccca acgggaagca tatgctatcg 2940
aattagggtt agtaaaaggg tcctaaggaa cagcgatgta ggtgggcggg ccaagatagg 3000
ggcgcgattg ctgcgatctg gaggacaaat tacacacact tgcgcctgag cgccaagcac 3060
agggttgttg gtcctcatat tcacgaggtc gctgagagca cggtgggcta atgttgccat 3120
gggtagcata tactacccaa atatctggat agcatatgct atcctaatct atatctgggt 3180
agcataggct atcctaatct atatctgggt agcatatgct atcctaatct atatctgggt 3240
agtatatgct atcctaattt atatctgggt agcataggct atcctaatct atatctgggt 3300
agcatatgct atcctaatct atatctgggt agtatatgct atcctaatct gtatccgggt 3360
agcatatgct atcctaatag agattagggt agtatatgct atcctaattt atatctgggt 3420
agcatatact acccaaatat ctggatagca tatgctatcc taatctatat ctgggtagca 3480
tatgctatcc taatctatat ctgggtagca taggctatcc taatctatat ctgggtagca 3540
tatgctatcc taatctatat ctgggtagta tatgctatcc taatttatat ctgggtagca 3600
taggctatcc taatctatat ctgggtagca tatgctatcc taatctatat ctgggtagta 3660
tatgctatcc taatctgtat ccgggtagca tatgctatcc tcatgataag ctgtcaaaca 3720
tgagaattaa ttcttgaaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg 3780
tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 3840
cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 3900
cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 3960
tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 4020
tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 4080
atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 4140
gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc 4200
aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 4260
aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 4320
gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 4380
cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 4440
atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgcagcaatg gcaacaacgt 4500
tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 4560
ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 4620
ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 4680
ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 4740
tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 4800
tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 4860
aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 4920
tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 4980
tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 5040
gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 5100
agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 5160
tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 5220
ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 5280
cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 5340
tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 5400
acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 5460
gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 5520
ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 5580
tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 5640
attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 5700
cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagc 5734
<210> 36
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠抗-CD43 (mJL-1) IgG 轻链(LC) DNA 序列
<400> 36
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggcga ccgcgtcacc 60
atcagctgcc ggacaagtca ggacattagc aattatttga actggtatca gcagaaacca 120
gatggtactg ttaaactcct gatctataac acatcacgct tgcactcagg cgtcccatca 180
cggttcagtg gcagcgggtc tggtacagat tattccctca ccattcgcaa cctggaacaa 240
aaagatattg ccacttactt ttgccaacag agcaatatgt ttccgtacac gttcgggggg 300
gggaccaagc tggaaatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagttcac cggtgacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 37
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠抗-CD43 (mJL-1) IgG LC 氨基酸序列
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Arg Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Lys Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 38
<211> 5038
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于表达的鼠抗-CD43 (mJL-1) IgG LC 完全载体(基于pTT5 )
<400> 38
gtacatttat attggctcat gtccaatatg accgccatgt tgacattgat tattgactag 60
ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 120
tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 180
gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 240
ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 300
tccgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 360
gaccttacgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 420
ggtgatgcgg ttttggcagt acaccaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 480
tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga 540
ctttccaaaa tgtcgtaata accccgcccc gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg 600
gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcctca ctctcttccg 660
catcgctgtc tgcgagggcc agctgttggg ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc 720
tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa cggtactccg ccaccgaggg 780
acctgagcga gtccgcatcg accggatcgg aaaacctctc gagaaaggcg tctaaccagt 840
cacagtcgca aggtaggctg agcaccgtgg cgggcggcag cgggtggcgg tcggggttgt 900
ttctggcgga ggtgctgctg atgatgtaat taaagtaggc ggtcttgaga cggcggatgg 960
tcgaggtgag gtgtggcagg cttgagatcc agctgttggg gtgagtactc cctctcaaaa 1020
gcgggcatta cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa acgaggagga tttgatattc 1080
acctggcccg atctggccat acacttgagt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc 1140
acaggtgtcc actcccaggt ccaagtttgc cgccaccatg gatatgaggg taccagcaca 1200
acttctcgga ttactattgt tatggctgcg aggtgcgcgc tgtgatatcc agatgacaca 1260
gactacatcc tccctgtctg cctctctggg cgaccgcgtc accatcagct gccggacaag 1320
tcaggacatt agcaattatt tgaactggta tcagcagaaa ccagatggta ctgttaaact 1380
cctgatctat aacacatcac gcttgcactc aggcgtccca tcacggttca gtggcagcgg 1440
gtctggtaca gattattccc tcaccattcg caacctggaa caaaaagata ttgccactta 1500
cttttgccaa cagagcaata tgtttccgta cacgttcggg ggggggacca agctggaaat 1560
caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa 1620
atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt 1680
acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg tcacagagca 1740
ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg acgctgagca aagcagacta 1800
cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagtt caccggtgac 1860
aaagagcttc aacaggggag agtgttagga tcccccgacc tcgacctctg gctaataaag 1920
gaaatttatt ttcattgcaa tagtgtgttg gaattttttg tgtctctcac tcggaaggac 1980
atatgggagg gcaaatcatt tggtcgagat ccctcggaga tctctagcta gaggatcgat 2040
ccccgccccg gacgaactaa acctgactac gacatctctg ccccttcttc gcggggcagt 2100
gcatgtaatc ccttcagttg gttggtacaa cttgccaact gaaccctaaa cgggtagcat 2160
atgcttcccg ggtagtagta tatactatcc agactaaccc taattcaata gcatatgtta 2220
cccaacggga agcatatgct atcgaattag ggttagtaaa agggtcctaa ggaacagcga 2280
tgtaggtggg cgggccaaga taggggcgcg attgctgcga tctggaggac aaattacaca 2340
cacttgcgcc tgagcgccaa gcacagggtt gttggtcctc atattcacga ggtcgctgag 2400
agcacggtgg gctaatgttg ccatgggtag catatactac ccaaatatct ggatagcata 2460
tgctatccta atctatatct gggtagcata ggctatccta atctatatct gggtagcata 2520
tgctatccta atctatatct gggtagtata tgctatccta atttatatct gggtagcata 2580
ggctatccta atctatatct gggtagcata tgctatccta atctatatct gggtagtata 2640
tgctatccta atctgtatcc gggtagcata tgctatccta atagagatta gggtagtata 2700
tgctatccta atttatatct gggtagcata tactacccaa atatctggat agcatatgct 2760
atcctaatct atatctgggt agcatatgct atcctaatct atatctgggt agcataggct 2820
atcctaatct atatctgggt agcatatgct atcctaatct atatctgggt agtatatgct 2880
atcctaattt atatctgggt agcataggct atcctaatct atatctgggt agcatatgct 2940
atcctaatct atatctgggt agtatatgct atcctaatct gtatccgggt agcatatgct 3000
atcctcatga taagctgtca aacatgagaa ttaattcttg aagacgaaag ggcctcgtga 3060
tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca 3120
cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata 3180
tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga 3240
gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc 3300
ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg 3360
cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc 3420
ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat 3480
cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact 3540
tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat 3600
tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga 3660
tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc 3720
ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga 3780
tgcctgcagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag 3840
cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc 3900
gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt 3960
ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct 4020
acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg 4080
cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg 4140
atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca 4200
tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 4260
tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 4320
aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 4380
aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt 4440
taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 4500
taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 4560
agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 4620
tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 4680
cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 4740
agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 4800
gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 4860
aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 4920
tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 4980
ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagc 5038
<210> 39
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh741JLH IgG HC DNA 序列
<400> 39
caggtgcagc tggtgcagag cggcagcgag ctgaagaagc ccggcgccag cgtcaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacttca tgaactgggt gcggcaggcc 120
cctgggcagg gactggagtg gatgggccgc atcaacccca acaacggcga cagcttctac 180
aaccagggct tcaccggccg cttcgtgttc agcctggaca ccagcgtgtc caccgcctac 240
ctgcagatca gcagcctgaa ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggagggc 300
tactacggcg gcagaggcta cgccctggac tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360
tccagcgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356
<210> 40
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh741JLH IgG HC 氨基酸序列
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 41
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh145JLH IgG HC DNA 序列
<400> 41
cagatgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaaaa ccggcagcag cgtcaaggtg 60
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tccagcgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
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aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
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tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356
<210> 42
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh145JLH IgG HC 氨基酸序列
<400> 42
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Arg Ser Met Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 43
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh146JLH IgG HC DNA 序列
<400> 43
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtcaaggtg 60
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cctgggcagg gactggagtg gatgggccgc atcaacccca acaacggcga cagcttctac 180
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aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
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tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356
<210> 44
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh146JLH IgG HC 氨基酸序列
<400> 44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 45
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh434JLH IgG HC DNA 序列
<400> 45
caggtgcagc tgcaggagag cggccccggc ctggtgaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgcgccg tctacggagg aagcttcagc ggctacttca tgaactggat caggcagccc 120
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tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356
<210> 46
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh434JLH IgG HC 氨基酸序列
<400> 46
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Phe Ser Tyr Asn Gln Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 47
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh112JLL IgG LC DNA 序列
<400> 47
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc gtgtccgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgcc gcaccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaac accagccgcc tgcacagcgg cgtgccctcc 180
agattctccg gcagcggatc tggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agcaacatgt tcccctacac cttcggccag 300
ggcaccaagc tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagttcac cggtgacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 48
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh112JLL IgG LC 氨基酸序列
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 49
<211> 751
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠抗-CD43 (mJL1) scFv DNA 序列
<400> 49
ccatggccga ggttcagctg cagcagtctg gtcctgagct ggtgaagcct ggggcttcag 60
tgaagatttc ctgcaaggcc tctggttact caattggtgg ctactttatg aactgggtga 120
agcagagcca cggcaagagc cctgagtgga ttgggcgtat taatcctaac aatggtgatt 180
ctttctacaa ccagaaattc aagggcacgg ccacattgac tgttgaccgc tcttctgaca 240
cagtccacat ggaggtcctg agcctgacat ctgaggactc tgcagtctat tattgtggcc 300
gcgaaggtta ctacggtggg cgagggtatg ctttggacta ctggggtcaa ggcacctcgg 360
tcaccgtctc ctcaggcggc ggagctagcg ggggaggagg atccggaggc gggggatctg 420
atatccagat gacacagact acatcctccc tgtctgcctc tctgggcgac cgcgtcacca 480
tcagctgccg gacaagtcag gacattagca attatttgaa ctggtatcag cagaaaccag 540
atggtactgt taaactcctg atctataaca catcacgctt gcactcaggc gtcccatcac 600
ggttcagtgg cagcgggtct ggtacagatt attccctcac cattcgcaac ctggaacaaa 660
aagatattgc cacttacttt tgccaacaga gcaatatgtt tccgtacacg ttcggggggg 720
ggaccaagct ggaaatcaag cgggcggccg c 751
<210> 50
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠抗-CD43 (mJL1) scFv 氨基酸序列
<400> 50
Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly
20 25 30
Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Pro Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln
50 55 60
Lys Phe Lys Gly Thr Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Asp Thr
65 70 75 80
Val His Met Glu Val Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Gly Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ala
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Thr Ser Arg
180 185 190
Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Arg Asn Leu Glu Gln Lys Asp Ile Ala Thr
210 215 220
Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 51
<211> 751
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh741-112 scFv DNA 序列
<400> 51
ccatggccca ggtgcagctg gtgcagagcg gcagcgagct gaagaagccc ggcgccagcg 60
tcaaggtgtc ctgcaaggcc agcggctaca ccttcaccgg ctacttcatg aactgggtgc 120
gccaggcccc tgggcaggga ctggagtgga tgggccgcat caaccccaac aacggcgaca 180
gcttctacaa ccagggcttc accggccgct tcgtgttcag cctggacacc agcgtgtcca 240
ccgcctacct gcagatcagc agcctgaagg ccgaggacac cgccgtgtac tactgcgcca 300
gggagggcta ctacggaggg agagggtacg ccctggacta ctggggccag ggcaccctgg 360
tgaccgtgtc ctccggcggc ggaggatccg gaggcggggg atctggggga ggagctagcg 420
acatccagat gacccagagc ccttcttctg tctccgccag cgtgggcgac cgcgtgacca 480
tcacctgccg caccagccag gacatcagca actacctgaa ctggtatcag cagaagcccg 540
gcaaggcccc caagctgctg atctacaaca ccagcaggct ccactctgga gtccccagcc 600
gcttctccgg ctccgggtct ggaaccgact tcaccctgac catcagctcc ctgcagcccg 660
aggacttcgc cacctactac tgccagcaga gcaacatgtt cccctacacc ttcgggcagg 720
ggaccaagct ggagatcaag cgggcggccg c 751
<210> 52
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh741-112 scFv 氨基酸序列
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
145 150 155 160
Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His
180 185 190
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 53
<211> 751
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh145-112 scFv DNA 序列
<400> 53
ccatggccca gatgcagctg gtgcagagcg gcgccgaggt gaagaaaacc ggcagcagcg 60
tcaaggtgtc ctgcaaggcc agcggctaca ccttcaccgg ctacttcatg aactgggtgc 120
gccaggcccc cggccaggcc ctggagtgga tgggccgcat caaccccaac aacggcgaca 180
gcttctacaa ccagaagttc caggaccgcg tcaccatcac ccgcgaccgc agcatgagca 240
ccgcctacat ggagctgtcc agcctgcgca gcgaggacac cgccatgtac tactgcgcca 300
gggagggcta ctacggcggc agaggctacg ccctggacta ctggggccag ggcaccctgg 360
tgaccgtgtc ctccggcggc ggaggatccg gaggcggggg atctggggga ggagctagcg 420
acatccagat gacccagagc ccttcttctg tctccgccag cgtgggcgac cgcgtgacca 480
tcacctgccg caccagccag gacatcagca actacctgaa ctggtatcag cagaagcccg 540
gcaaggcccc caagctgctg atctacaaca ccagcaggct ccactctgga gtccccagcc 600
gcttctccgg ctccgggtct ggaaccgact tcaccctgac catcagctcc ctgcagcccg 660
aggacttcgc cacctactac tgccagcaga gcaacatgtt cccctacacc ttcgggcagg 720
ggaccaagct ggagatcaag cgggcggccg c 751
<210> 54
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh145-112 scFv 氨基酸序列
<400> 54
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Arg Ser Met Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
145 150 155 160
Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His
180 185 190
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 55
<211> 751
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh146-112 scFv DNA 序列
<400> 55
ccatggccca ggtgcagctg gtgcagagcg gcgccgaggt gaagaagccc ggcgccagcg 60
tcaaggtgtc ctgcaaggcc agcggctaca ccttcaacgg ctacttcatg aactgggtga 120
ggcaggcccc tgggcaggga ctggagtgga tgggccgcat caaccccaac aacggcgaca 180
gcttctacaa ccagaagttc cagggccgcg tcaccatgac ccgcgacacc agcaccagca 240
ccgtgtacat ggagctgtcc agcctgcgca gcgaggacac cgccgtgtac tactgcgcca 300
gggagggcta ctacggcggc agaggctacg ccctggacta ctggggtcaa ggcaccctgg 360
tgaccgtgtc cagcggcggc ggaggatccg gaggcggggg atctggggga ggagctagcg 420
acatccagat gacccagagc ccttcttctg tctccgccag cgtgggcgac cgcgtgacca 480
tcacctgccg caccagccag gacatcagca actacctgaa ctggtatcag cagaagcccg 540
gcaaggcccc caagctgctg atctacaaca ccagcaggct ccactctgga gtccccagcc 600
gcttctccgg ctccgggtct ggaaccgact tcaccctgac catcagctcc ctgcagcccg 660
aggacttcgc cacctactac tgccagcaga gcaacatgtt cccctacacc ttcgggcagg 720
gtacaaagct ggagatcaag cgggcggccg c 751
<210> 56
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh146-112 scFv 氨基酸序列
<400> 56
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn
20 25 30
Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Met Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln
50 55 60
Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr
65 70 75 80
Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Thr Ser Arg
180 185 190
Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 57
<211> 751
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh434-112 scFv DNA 序列
<400> 57
ccatggccca ggtgcagctg caggagagcg gccccggcct ggtgaagccc agccagaccc 60
tgagcctgac ctgcgccgtc tacggaggaa gcttcagcgg ctacttcatg aactggatca 120
ggcagccccc cggcaagggc ctggagtgga tcggccgcat caaccccaac aacggcgact 180
tcagctacaa ccagagcctg aagagccgcg tgaccatcag cgtggacacc agcaagaacc 240
agttcagcct gaagctgtcc agcgtgaccg ccgccgacac cgccgtgtac tactgcgcca 300
gggagggcta ctacggcggc agaggctacg ccctggacta ctggggccag ggcaccctgg 360
tgaccgtgtc cagcggcggc ggaggatccg gaggcggggg atctggggga ggagctagcg 420
acatccagat gacccagagc ccttcttctg tctccgccag cgtgggcgac cgcgtgacca 480
tcacctgccg caccagccag gacatcagca actacctgaa ctggtatcag cagaagcccg 540
gcaaggcccc caagctgctg atctacaaca ccagcaggct ccactctgga gtccccagcc 600
gcttctccgg ctccgggtct ggaaccgact tcaccctgac catcagctcc ctgcagcccg 660
aggacttcgc cacctactac tgccagcaga gcaacatgtt cccctacacc ttcgggcagg 720
gtacaaagct ggagatcaag cgggcggccg c 751
<210> 58
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh434-112 scFv 氨基酸序列
<400> 58
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Phe Ser Tyr Asn Gln Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
145 150 155 160
Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His
180 185 190
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 59
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh741JLHP45 IgG HC DNA 序列
<400> 59
caggtgcagc tggtgcagag cggcagcgag ctgaagaagc ccggcgccag cgtcaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacttca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cccggacagg ggcccgagtg gatgggccgc atcaacccca acaacggcga cagcttctac 180
aaccagggct tcaccggccg cttcgtgttc agcctggaca ccagcgtgtc caccgcctac 240
ctgcagatca gcagcctgaa ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggagggc 300
tactacggcg gcagaggcta cgccctggac tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360
tccagcgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356
<210> 60
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh741JLHP45 IgG HC 氨基酸序列, 其中第45个氨基酸残基被P代替
<400> 60
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 61
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh145JLHP45 IgG HC DNA 序列
<400> 61
cagatgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaaaa ccggcagcag cgtcaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacttca tgaactgggt gaggcaggcc 120
cctggacagg cccccgagtg gatgggccgc atcaacccca acaacggcga cagcttctac 180
aaccagaagt tccaggaccg cgtcaccatc acccgcgacc gcagcatgag caccgcctac 240
atggagctgt ccagcctgcg cagcgaggac accgccatgt actactgcgc cagggagggc 300
tactacggcg gcagaggcta cgccctggac tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360
tccagcgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356
<210> 62
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh145JLHP45 IgG HC 变体 (残基 45被P代替 )
氨基酸序列
<400> 62
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Arg Ser Met Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 63
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh112JLV44 IgG LC 变体 DNA 序列
<400> 63
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc gtgtccgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgcc gcaccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccg tgaagctgct gatctacaac accagccgcc tgcacagcgg cgtgccctcc 180
agattctccg gcagcggatc tggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agcaacatgt tcccctacac cttcggccag 300
ggcaccaagc tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagttcac cggtgacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 64
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sh112JLV44 IgG LC 变体(残基44被V代替)
氨基酸序列
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 65
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA 序列 CDhRZ7VHKb (Conv.人源化突变体 IgG)
<400> 65
gaggtgcagc tggtccagag cggcgccgag gtcaagaagc ctggcgccac cgtcaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcagc ggctacttca tgaactgggt ccgccaggcc 120
ccaggcaagg gactggagtg gatgggccgc atcaacccca acaacggcga cagcttctac 180
aaccagaagt tcaagggccg cgtcaccatc accgccgaca ccagcaccga caccggctac 240
ctggagctgt ccagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cgccgagggc 300
tactacggcg gcagaggcta cgccctggac tactggggcc agggcaccct ggtgtccgtg 360
agcagcgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356
<210> 66
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列 CDhRZ7VHKb (Conv. 人源化变体 IgG)
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 67
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA 序列 CDhRZ7VH_KbR73 (Conv. 人源化变体 IgG)
<400> 67
gaggtgcagc tggtccagag cggcgccgag gtcaagaagc ctggcgccac cgtcaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcagc ggctacttca tgaactgggt ccgccaggcc 120
ccaggcaagg gactggagtg gatgggccgc atcaacccca acaacggcga cagcttctac 180
aaccagaagt tcaagggccg cgtcaccatc accgccgacc gcagcaccga caccggctac 240
ctggagctgt ccagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cgccgagggc 300
tactacggcg gcagaggcta cgccctggac tactggggcc agggcaccct ggtgtccgtg 360
agcagcgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356
<210> 68
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列 CDhRZ7VH_KbR73 (Conv. 人源化变体 IgG)
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Thr Asp Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 69
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA 序列 CDhL7IVHKb (Conv. 人源化变体 IgG)
<400> 69
gaggtgcagc tggtcgagag cggcgggggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcacc ggctacttca tgaactgggt ccgccaggcc 120
ccagggaaag gcctggagtg ggtggcccgc atcaacccca acaacggcga cagcttctac 180
aaccagaagt tcaagggccg cttcaccctg agcgtggacc gcagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagagggc 300
tactacggcg gcagaggcta cgccctggac tactggggcc agggcaccct ggtcaccgtg 360
tccagcgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356
<210> 70
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列 CDhL7IVHKb (Conv. 人源化变体 IgG)
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
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290 295 300
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
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355 360 365
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370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 71
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA 序列 CDhRZ7VHAM (Conv. 人源化变体 IgG)
<400> 71
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gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780
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aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080
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gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
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tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356
<210> 72
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列 CDhRZ7VHAM (Conv. 人源化变体 IgG)
<400> 72
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
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Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
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195 200 205
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
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340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 73
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA 序列 CDhRZ7VHAMR73 (Conv. 人源化变体 IgG)
<400> 73
gaggtgcagc tggtccagag cggcgccgag gtcaagaagc ctggcgccac cgtcaagatc 60
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tactacggcg gcagaggcta cgccctggac tactggggcc agggcaccct ggtgtccgtg 360
agcagcgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356
<210> 74
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列 CDhRZ7VHAMR73 (Conv. 人源化变体 IgG)
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Tyr
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Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
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Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Thr Asp Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
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Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
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Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
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Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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260 265 270
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275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
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355 360 365
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Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 75
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA 序列 CDhL7IVHAM (Conv. 人源化变体 IgG)
<400> 75
gaggtgcagc tggtcgagag cggcgggggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgcgcctg 60
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tactacggcg gcagaggcta cgccctggac tactggggcc agggcaccct ggtcaccgtg 360
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tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356
<210> 76
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列 CDhL7IVHAM (Conv. 人源化变体 IgG)
<400> 76
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Tyr
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
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Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
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<210> 77
<211> 642
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<210> 78
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列 CDhRZ7Vk (轻链变体)
<400> 78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 79
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA 序列 CDhRZ7VkFS (轻链变体)
<400> 79
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc gtgtccgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgcc gcaccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaac accagccgcc tgcacagcgg cgtgccctcc 180
agattctccg gcagcggatc tggcaccgac ttcagcctga ccatccgcag cctgcagccc 240
aaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agcaacatgt tcccctacac cttcggcggc 300
ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagttcac cggtgacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 80
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列 CDhRZ7VkFS (轻链变体)
<400> 80
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Lys Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 81
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA 序列 CDhL7IVk (轻链变体)
<400> 81
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtccgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgcc gcaccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaac accagccgcc tgcacagcgg cgtgccctcc 180
agattctccg gcagcggatc tggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agcaacatgt tcccctacac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagttcac cggtgacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 82
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列 CDhL7IVk (轻链变体)
<400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 83
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> sh146-112重链可变区 (VH)
<400> 83
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 84
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 36-10 Q6R重链可变区(VH)
<400> 84
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Arg Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 85
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 153-28重链可变区(VH)
<400> 85
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 86
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 324-B10重链可变区(VH)
<400> 86
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Arg Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 87
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 361-C11重链可变区 (VH)
<400> 87
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 88
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 368-G07重链可变区(VH)
<400> 88
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 89
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 369-F05重链可变区(VH)
<400> 89
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Met Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 90
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 361-H05重链可变区(VH)
<400> 90
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Thr Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 91
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Quikchange 突变重链可变区(VH)
<400> 91
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Thr Thr Arg Asp Arg Ser Thr Ser Thr Met Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 92
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 45-37 VH重链 可变区(VH)
<400> 92
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Arg Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 93
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 257-10重链可变区(VH)
<400> 93
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Arg Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Pro Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 94
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 456-D10重链可变区(VH)
<400> 94
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Arg Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Pro Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 95
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> sh146-112 轻链可变区(VL)
<400> 95
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 96
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 36-10 Q6R 轻链可变区(VL)
<400> 96
Asp Ile Gln Met Thr Arg Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 97
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 153-28 轻链可变区(VL)
<400> 97
Asp Ile Gln Met Thr Arg Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 98
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 324-B10 轻链v可变区(VL)
<400> 98
Asp Ile Gln Met Thr Arg Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 99
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 361-C11 轻链可变区(VL)
<400> 99
Asp Ile Gln Met Thr Arg Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Gly Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 100
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 368-G07 轻链可变区(VL)
<400> 100
Asp Ile Gln Met Thr Arg Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Pro Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 101
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 369-F05 轻链可变区(VL)
<400> 101
Asp Ile Gln Met Thr Arg Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 102
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 361-H05 轻链可变区(VL)
<400> 102
Asp Ile Gln Met Thr Arg Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 103
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Quikchange 突变轻链可变区(VL)
<400> 103
Asp Ile Gln Met Thr Arg Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Gly Arg Val Pro Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 104
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 45-37 轻链可变区(VL)
<400> 104
Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 105
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 257-10 轻链可变区 (VL)
<400> 105
Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 106
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 456-D10 轻链可变区 (VL)
<400> 106
Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 107
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链v可变区 (VL)变体 (去糖基化)
<400> 107
Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ala Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 108
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区(VL)变体(去糖基化)
<400> 108
Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 109
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区(VL) 变体(去糖基化)
<400> 109
Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 110
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)
<223> Xaa 为Phe (F)或Tyr (Y)
<220>
<223> 抗CD43抗体或其抗原结合片段的CDRH1
<400> 110
Gly Tyr Xaa Met Asn
1 5
<210> 111
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD43抗体或其抗原结合片段的CDRH1
<400> 111
Gly Tyr Phe Met Asn
1 5
<210> 112
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD43抗体或其抗原结合片段的CDRH1
<400> 112
Gly Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210> 113
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)
<223> Xaa为 Asn (N) 或Ser (S)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)
<223> Xaa 为Gln (Q) 或Lys (K)
<220>
<223> 抗CD43抗体或其抗原结合片段的CDRH2
<400> 113
Arg Ile Asn Pro Asn Xaa Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Xaa
1 5 10 15
Gly
<210> 114
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD43抗体或其抗原结合片段的CDRH2
<400> 114
Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 115
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD43抗体或其抗原结合片段的CDRH2
<400> 115
Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 116
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD43抗体或其抗原结合片段的CDRH2
<400> 116
Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 117
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD43抗体或其抗原结合片段的CDRH2
<400> 117
Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 118
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD43抗体或其抗原结合片段的CDRH3
<400> 118
Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 119
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD43抗体或其抗原结合片段的CDRL1
<400> 119
Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 120
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)
<223> Xaa 为Asn(N)或Gln (Q)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)
<223> Xaa为 Ser (S)或Ala (A)
<220>
<223> 抗CD43抗体或其抗原结合片段的CDRL2
<400> 120
Xaa Thr Xaa Arg Leu His Ser
1 5
<210> 121
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD43抗体或其抗原结合片段的CDRL2
<400> 121
Asn Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 122
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD43抗体或其抗原结合片段的CDRL2
<400> 122
Asn Thr Ala Arg Leu His Ser
1 5
<210> 123
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD43抗体或其抗原结合片段的CDRL2
<400> 123
Gln Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD43抗体或其抗原结合片段的CDRL2
<400> 124
Ala Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 125
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD43抗体或其抗原结合片段的CDRL3
<400> 125
Gln Gln Ser Asn Met Phe Pro Tyr
1 5
<210> 126
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)
<223> Xaa为Gly (G)或Ala (A)
<220>
<223> 连接子
<400> 126
Gly Gly Gly Xaa Ser
1 5
<210> 127
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子
<400> 127
Gly Gly Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 128
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子
<400> 128
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser
1 5 10 15
<210> 129
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含表位的肽, DN2
<400> 129
Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile Gly Ala Ser Thr Gly Ser Cys
1 5 10 15
<210> 130
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD43
<400> 130
Met Ala Thr Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Val Val Ser Pro Asp
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ser Thr Thr Ala Val Gln Thr Pro Thr Ser Gly Glu Pro
20 25 30
Leu Val Ser Thr Ser Glu Pro Leu Ser Ser Lys Met Tyr Thr Thr Ser
35 40 45
Ile Thr Ser Asp Pro Lys Ala Asp Ser Thr Gly Asp Gln Thr Ser Ala
50 55 60
Leu Pro Pro Ser Thr Ser Ile Asn Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser
65 70 75 80
Ile Gly Ala Ser Thr Gly Ser Pro Leu Pro Glu Pro Thr Thr Tyr Gln
85 90 95
Glu Val Ser Ile Lys Met Ser Ser Val Pro Gln Glu Thr Pro His Ala
100 105 110
Thr Ser His Pro Ala Val Pro Ile Thr Ala Asn Ser Leu Gly Ser His
115 120 125
Thr Val Thr Gly Gly Thr Ile Thr Thr Asn Ser Pro Glu Thr Ser Ser
130 135 140
Arg Thr Ser Gly Ala Pro Val Thr Thr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Thr
145 150 155 160
Ser Arg Gly Thr Ser Gly Pro Pro Leu Thr Met Ala Thr Val Ser Leu
165 170 175
Glu Thr Ser Lys Gly Thr Ser Gly Pro Pro Val Thr Met Ala Thr Asp
180 185 190
Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Thr Thr Gly Pro Pro Val Thr Met Thr
195 200 205
Thr Gly Ser Leu Glu Pro Ser Ser Gly Ala Ser Gly Pro Gln Val Ser
210 215 220
Ser Val Lys Leu Ser Thr Met Met Ser Pro Thr Thr Ser Thr Asn Ala
225 230 235 240
Ser Thr Val Pro Phe Arg Asn Pro Asp Glu Asn Ser Arg Gly Met Leu
245 250 255
Pro Val Ala Val Leu Val Ala Leu Leu Ala Val Ile Val Leu Val Ala
260 265 270
Leu Leu Leu Leu Trp Arg Arg Arg Gln Lys Arg Arg Thr Gly Ala Leu
275 280 285
Val Leu Ser Arg Gly Gly Lys Arg Asn Gly Val Val Asp Ala Trp Ala
290 295 300
Gly Pro Ala Gln Val Pro Glu Glu Gly Ala Val Thr Val Thr Val Gly
305 310 315 320
Gly Ser Gly Gly Asp Lys Gly Ser Gly Phe Pro Asp Gly Glu Gly Ser
325 330 335
Ser Arg Arg Pro Thr Leu Thr Thr Phe Phe Gly Arg Arg Lys Ser Arg
340 345 350
Gln Gly Ser Leu Ala Met Glu Glu Leu Lys Ser Gly Ser Gly Pro Ser
355 360 365
Leu Lys Gly Glu Glu Glu Pro Leu Val Ala Ser Glu Asp Gly Ala Val
370 375 380
Asp Ala Pro Ala Pro Asp Glu Pro Glu Gly Gly Asp Gly Ala Ala Pro
385 390 395 400
<210> 131
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位
<400> 131
Pro Leu Trp Thr Ser Ile
1 5
<210> 132
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位
<400> 132
Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile
1 5
<210> 133
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位
<400> 133
Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile
1 5
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位
<400> 134
Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile
1 5

Claims (19)

1.一种用于治疗实体癌或抑制癌症干细胞的药物组合物，所述组合物包括抗CD43抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗CD43抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:111所示的CDR1H，如SEQ ID NO:114所示的CDR2H，如SEQ ID NO:118所示的CDR3H，如SEQ ID NO:119所示的CDR1L，如SEQ ID NO:121、122、123或124所示的CDR2L，以及如SEQ ID NO:125所示的CDR3L。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述抗CD43抗体或其抗原结合片段包括如SEQID NO:111所示的CDR1H、如SEQ ID NO:114所示的CDR2H、如SEQ ID NO:118所示的CDR3H、如SEQ ID NO:119所示的CDR1L、如SEQ ID NO:124所示的CDR2L，以及如SEQ ID NO:125所示的CDR3L。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述抗CD43抗体或其抗原结合片段包括如SEQID NO:6所示的重链可变区；和如SEQ ID NO:107、108或109所示的轻链可变区。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，所述实体癌是胃癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌、胆囊癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌或膀胱癌。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括选自由细胞毒性物质和标记物质组成的组中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述细胞毒性物质是选自由蓖麻毒蛋白、皂草素、白树毒素、苦瓜毒蛋白、三角梅核糖体失活蛋白、白喉毒素、假单胞菌毒素、放射性同位素、倍癌霉素、单甲基奥瑞他汀E(MMAE)、单甲基奥瑞他汀F(MMAF)、N2'-去乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)美登素，以及吡咯并苯并二氮杂(PBD)二聚体组成的组中的至少一种。
7.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，所述癌症干细胞是血液系统恶性肿瘤或实体癌中的癌症干细胞。
8.一种抗CD43抗体或其抗原结合片段，包括：
如SEQ ID NO:111所示的CDR1H，
如SEQ ID NO:114所示的CDR2H，
如SEQ ID NO:118所示的CDR3H，
如SEQ ID NO:119所示的CDR1L，
如SEQ ID NO:122、123或124所示的CDR2L，以及
如SEQ ID NO:125所示的CDR3L。
9.根据权利要求8所述的抗CD43抗体或其抗原结合片段，包括：
如SEQ ID NO:111所示的CDR1H，
如SEQ ID NO:114所示的CDR2H，
如SEQ ID NO:118所示的CDR3H，
如SEQ ID NO:119所示的CDR1L，
如SEQ ID NO:124所示的CDR2L，和
如SEQ ID NO:125所示的CDR3L。
10.根据权利要求8所述的抗CD43抗体或其抗原结合片段，包括：
如SEQ ID NO:6所示的重链可变区；以及
如SEQ ID NO:107、108或109所示的轻链可变区。
11.一种偶联物，包括：
根据权利要求8～10中任一项所述的抗CD43抗体或其抗原结合片段；以及
选自由细胞毒性物质和标记物质组成的组中的至少一种。
12.根据权利要求11所述的偶联物，其中，所述细胞毒性物质是选自由蓖麻毒蛋白、皂草素、白树毒素、苦瓜毒蛋白、三角梅核糖体失活蛋白、白喉毒素、假单胞菌毒素、放射性同位素、倍癌霉素、单甲基奥瑞他汀E(MMAE)、单甲基奥瑞他汀F(MMAF)、N2'-去乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)美登素，以及吡咯并苯并二氮杂(PBD)二聚体组成的组中的至少一种。
13.一种用于治疗或预防癌症的药物组合物，包括：
根据权利要求8～10中任一项所述的抗CD43抗体或其抗原结合片段，或者根据权利要求11所述的偶联物；以及
药学上可接受的载体。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中，所述癌症是血液系统恶性肿瘤。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中，所述血液系统恶性肿瘤是急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、急性单核细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
16.一种编码根据权利要求8～10中任一项所述的抗CD43抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
17.一种重组载体，包括根据权利要求16所述的核酸分子。
18.一种重组细胞，包括根据权利要求17所述的重组载体。
19.一种用于制备根据权利要求8～10中任一项所述的抗CD43抗体或其抗原结合片段的方法，包括培养根据权利要求18所述的重组细胞。
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