JP2023537114A - ヒトｃｄ３８と結合する抗体、その製造方法と使用 - Google Patents

Abstract

ヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片であって、有効にヒトＣＤ３８と結合することができ、ＣＤ３８強発現の疾患（たとえば、多発性骨髄腫）を治療する薬物の製造に使用され、良い臨床応用の将来性がある。

Description

本発明は、腫瘍治療の分野に属し、ヒトＣＤ３８と結合する抗体、その製造方法と用途に関する。

多発性骨髄腫（ＭＭ）は形質細胞の悪性腫瘍で、すべての癌の約１％を占め、骨格および腎臓に及びやすく、病理性骨折、骨痛、脊髄圧迫および腎不全につながることが多い。

多発性骨髄腫の治療について、従来の化学治療、放射線治療などの治療法では、満足できる治療効果を得ることが困難である。これまでの十年では、骨髄腫生物学に対する深い研究によって新たな潜在的な治療の標的が多く発見された。

ＣＤ３８は４６ｋＤａのＩＩ型膜貫通糖タンパク質で、細胞外酵素活性ならびに受
容体を介する細胞粘着およびシグナル伝達の調節を含む、多くの機能を有することが見出されている。ＣＤ３の酵素活性は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）の環状アデノシン二リン酸リボース（ＣＡＤＰＲ）、ＡＤＰＲおよびニコチン酸アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＡＤＰ）への転換に関わり、これは細胞内のカルシウムシグナルの調節に必要な基質である。ＣＤ３８受容体の機能に対する初歩的な研究では、ＣＤ３８が細胞と内皮細胞の結合を仲介し、リンパ細胞の遷移において役割を果たし、そしてＴ、Ｂおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面分子と機能的に関連することが見出された。ＣＤ３８は、骨髄の前駆細胞、胚中心のＢ細胞、終末分化の形質細胞および活性化した扁桃体のみで高度に発現されるが、成熟およびメモリーＢ細胞では低レベルのＣ３８が発現される。ＣＤ３８は多発性骨髄腫の細胞において強く発現されるため、多発性骨髄腫の治療の理想の標的になる。現在、市販されているＤａｒａｔｕｍｕｍａｂ、Ｉｓａｔｕｘｉｍａｂが多発性骨髄腫の治療において良い働きを見せている。国内では、未だに関連製品がなく、抗体療法の需要に追いついていない。

上記技術課題を解決するために、本発明の発明者らは大量の試験を行い、抗原免疫から、ハイブリドーマの製造およびスクリーニング、抗体の発現・精製、生物活性の同定まで、スクリーニングして特異的にヒトＣＤ３８と結合するネズミ由来抗体を得たが、それに基づき、さらにそのキメラ抗体およびヒト化抗体を構築して獲得した。

そのため、本発明の目的は、ヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片を提供すること、前記ヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド分子を提供すること、前記ヌクレオチド分子を含む発現ベクターを提供すること、前記発現ベクターの宿主細胞を提供すること、前記ヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供すること、前記ＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片を含む薬物組成物を提供すること、薬物の製造における前記ヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片の使用を提供することにある。

上記目的を実現するために、本発明は以下の技術方案を使用する。

本発明の一つの側面では、ヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）重鎖相補性決定領域である、アミノ酸配列が配列番号１で示されるＨ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号２で示されるＨ－ＣＤＲ２、アミノ酸配列が配列番号３で示されるＨ－ＣＤＲ３、ならびに
（ｂ）軽鎖相補性決定領域である、アミノ酸配列が配列番号４で示されるＬ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号５で示されるＬ－ＣＤＲ２、アミノ酸配列が配列番号６で示されるＬ－ＣＤＲ３
を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。

本発明の「抗体（Ａｂ）」は約１５００００ダルトンのヘテロテトラマーの糖タンパク質で、２つの同様の軽鎖（Ｌ）と２つの同様の重鎖（Ｈ）からなるものである。各軽鎖は、重鎖に１つの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプによるものである。各重鎖および軽鎖も、それぞれ一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、１の末端に可変領域（ＶＨ）を有し、その先が定常領域である。各軽鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＬ）を有し、他方の末端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の一つ目の定常領域と、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対向している。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２種類の抗体からなる多重特異性抗体（たとえば二重特異性抗体）などを含む。

本発明において、「モノクローナル抗体」とは、１種類のほぼ均一なコロニーから得られた抗体のことで、すなわち、少数のあり得る自然発生の突然変異以外、このコロニーに含まれる単独の抗体が同様である。モノクローナル抗体は、高度特異的に単一の抗原部位に対するものである。そして、通常のポリクローナル抗体製剤（通常は異なる抗原決定基に対する異なる抗体である）と違い、各モノクローナル抗体は、抗原における単一の抗原決定基にたいするものである。それらの特異性以外、モノクローナル抗体の利点は、ハイブリドーマの培養によって合成されるので、他の免疫グロブリンに汚染される恐れがないことにある。修飾語の「モノクローナル」は、抗体の特性を表し、ほぼ均一な抗体コロニーから得られることで、何らかの特殊な方法で抗体を生産する必要があると理解されるべきではない。

本発明の「抗原結合断片」とは、ヒトＣＤ３８と特異的に結合できる抗体の断片のことである。本発明の抗原結合断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片などを含む。Ｆａｂ断片はパパインで抗体を消化することによって生じる断片である。Ｆ（ａｂ’）２断片はペプシンで抗体を消化することによって生じる断片である。Ｆｖ断片は抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が密接に非共有的にカップリングした二量体からなる。

好適な方案として、前記の抗体はネズミ由来抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。

本発明の「ネズミ由来抗体」とは、ラットまたはマウス由来抗体のことで、マウスが好ましい。本発明のネズミ由来抗体は、ヒトＣＤ３８を抗原として使用してマウスを免疫させ、そしてハイブリドーマ細胞のスクリーニングを行って得られるものである。

本発明の「キメラ抗体」とは、一つの種由来の重鎖と軽鎖の可変領域の配列および別の種由来の定常領域の配列を含む抗体のことで、たとえば、ヒトの定常領域と連結したネズミの重鎖と軽鎖の可変領域を有する抗体が挙げられる。好ましくは、本発明のキメラ抗体はネズミ由来抗体５０Ｂ１２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列とヒトの定常領域が連結してなる。より好ましくは、本発明のキメラ抗体は５０Ｇ１２－Ｃｈｉｍｅｒｉｃから選ばれる。

本発明の「ヒト化抗体」とは、そのＣＤＲが非ヒト種（好ましくはマウス）由来で、抗体分子における残りの部分（フレームワーク領域および定常領域を含む）がヒト由来の抗体のことである。また、フレームワーク領域の残基は結合親和性が維持するように変えられてもよい。好ましくは、本発明のヒト化抗体はネズミ由来抗体５０Ｇ１２のＣＤＲ領域およびヒト由来抗体の非ＣＤＲ領域で組み換え、４つ目のフレームワーク領域を増やして一部の大きく影響する残基を突然変異させて得られる。より好ましくは、本発明のヒト化抗体は５０Ｇ１２－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄから選ばれる。

好適な方案として、前記の抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片を含む。

好適な方案として、前記のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７で示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８で示される。

好適な方案として、前記のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９で示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０で示される。

好適な方案として、前記のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖のアミノ酸配列は配列番号１１で示され、軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１２で示される。

本発明のもう一つの側面では、上記ヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド分子を提供する。

好適な方案として、前記ヌクレオチド分子の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１３で示され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１４で示される。

好適な方案として、前記ヌクレオチド分子の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１５で示され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１６で示される。

好適な方案として、前記ヌクレオチド分子の重鎖をコードするヌクレオチド配列は配列番号１５で示され、軽鎖をコードするヌクレオチド配列は配列番号１６で示される。

本発明の前記ヌクレオチド分子の製造方法は本分野の通常の製造方法で、好ましくは、遺伝子クローニング技術、たとえば、ＰＣＲ方法などによって上記モノクローナル抗体をコードするヌクレオチド分子を得るか、あるいは全配列を人工的に合成する方法によって上記モノクローナル抗体をコードするヌクレオチド分子を得る製造方法を含む。

当業者には、上記ヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に適当に置換、欠失、変更、挿入または添加を導入することによって一つのポリヌクレオチドのホモログを提供することができることがわかる。本発明において、ポリヌクレオチドのホモログは当該ヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする遺伝子の一つまたは複数の塩基に対して抗体の活性を保つ範囲で置換、欠失または添加を行うことによって調製することができる。

本発明のもう一つの側面では、上記のヌクレオチド分子を含有する発現ベクターを提供する。

ここで、前記発現ベクターは本分野の通常の発現ベクターで、適切な調節配列、たとえば、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および／または配列、ならびにほかの適切な配列を含む発現ベクターのことである。前記発現ベクターは、ウイルスまたはプラスミド、たとえば、適切なファージまたはファージミドでもよいが、さらなる技術の詳細は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照する。多くの核酸操作の既知の技術およびプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第二版，Ａｕｓｕｂｅｌら 編著を参照する。本発明の前記発現ベクターは、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）、ｐＤＨＦＲ、ｐｃＤＮＡ４、ｐＤＨＦＦ、ｐＧＭ－ＣＳＦまたはｐＣＨＯ １．０が好ましい。

また、本発明は、上記の発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。

本発明に係る宿主細胞は本発明の通常の様々な宿主細胞で、上記組み換え発現形質転換体が安定して自己複製し、かつ担持される前記のヌクレオチドがが有効に発現されるようにさせることができればよい。ここで、前記宿主細胞は原核発現細胞および真核発現細胞を含み、好ましくはＣＯＳ、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）、ＮＳ０、ｓｆ９、ｓｆ２１、ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）まｈたＴＧ１を含み、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（一本鎖抗体またはＦａｂ抗体を発現する）またはＣＨＯ－Ｋ１細胞（全長ＩｇＧ抗体を発現する）である。前記発現ベクターを宿主細胞に形質転換させれば、本発明の好適な組み換え発現形質転換体を得ることができる。ここで、前記形質転換方法は本発明の通常の形質転換方法、好ましくは化学的形質転換法、ヒートショック法または電気的形質転換法である。

本発明のもう一つの側面では、上記のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片の方法であって、
ａ） 発現の条件において、上記の宿主細胞を培養することにより、前記のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片を発現させる工程、
ｂ） 工程ａ）における前記のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片を分離して精製する工程
を含む方法を提供する。

本発明に係る宿主細胞の培養方法、前記抗体の分離および精製方法は本分野の通常の方法で、具体的な操作方法は相応する細胞培養技術マニュアルおよび抗体分離精製技術マニュアルを参照する。本発明で公開されるヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片の製造方法は、発現の条件において、上記の宿主細胞を培養することにより、前記のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片を発現させること、前記のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片を分離して精製することを含む。上記方法を利用すれば、組み換えタンパク質をほぼ均一な物質になるように、たとえば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動において単一のバンドになるように精製することができる。

アフィニティクロマトグラフィーの方法によって本発明で公開されるヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片を精製することができるが、使用されるアフィニティカラムの特性により、通常の方法、たとえば、高塩濃度緩衝液、ｐＨ変化などの方法でアフィニティカラムに結合した前記のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片を溶離させることができる。本発明者らは、得られた前記のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片に対して検出実験を行った結果、前記のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片が好適に抗原と結合することができ、高い親和力を有することが明らかになった。

本発明のもう一つの側面では、上記のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。

本発明によって提供されるヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片は、薬学的に許容される担体と共に薬物製剤組成物を構成することによってより安定して治療効果を発揮することができ、これらの製剤は本発明で公開されるヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片の配座の完全性を保つと同時に、タンパク質の多くの官能基の分解（凝集、脱アミノまたは酸化を含むが、これらに限定されない）を防ぐことができる。通常の場合、液体製剤では、通常、２℃－８℃の条件において少なくとも１年安定して保存することができ、凍結乾燥製剤では、３０℃で少なくとも６か月安定する。前記二重特異性抗体製剤は、製薬分野でよく使用される懸濁、ハイドロ鍼、凍結乾燥などの製剤でもよい。

本発明で公開されるヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片のハイドロ鍼または凍結乾燥製剤では、薬学的に許容される担体は、好ましくは、界面活性剤、溶液安定化剤、等張化調節剤および緩衝液のうちの一つまたはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。中では、界面活性剤は、好ましくは、非イオン性界面活性剤、たとえば、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル（ツイン２０または８０）、ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（たとえば、ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８）、Ｔｒｉｔｏｎ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、テトラデシル、リノレイルまたはオクタデシルサルコシン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＭＯＮＡＱＵＡＴＴＭなどを含むが、これらに限定されず、その添加量はヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片の顆粒化の傾向が最小限になるような量である。溶液安定化剤は、好ましくは、糖類、たとえば、還元糖や非還元糖；アミノ酸類、たとえば、グルタミン酸一ナトリウムやヒスチジン；アルコール類、たとえば、３価アルコール、高級糖アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどの一つまたはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されず、溶液安定化剤の添加量は最後に形成する製剤が当業者の認める安定化に達する時間内で安定状態を維持するような量である。等張化調節剤は、好ましくは、塩化ナトリウム、マンニトールの一つまたはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。緩衝液は、好ましくは、Ｔｒｉｓ、ヒスチジン緩衝液、リン酸塩緩衝液の一つまたはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

本発明のもう一つの側面では、多発性骨髄腫、白血病、Ｂ細胞腫、自己免疫疾患を治療する薬物の製造における上記のヒトＣＤ３８と結合する抗体または薬物組成物の使用を提供する。

好適な方案として、前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、免疫性血小板減少性紫斑病および重症筋無力症から選ばれる。

本発明のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片およびその組成物は、ヒトを含む動物に投与する場合、投与量は患者の年齢と体重、疾患の特徴と重篤度、および投与経路によって異なるが、動物実験の結果および様々な事情を考慮し、合計投与量は所定の範囲を超えてはならない。具体的に、静脈注射の投与量は１－１８００ ｍｇ／日である。

本発明のもう一つの側面では、ＣＡＲ構築物であって、前記ＣＡＲ構築物のモノクローナル抗体の抗原結合領域のｓｃＦｖ断片はＣＤ３８と特異的に結合する結合領域で、かつ前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域は、
重鎖相補性決定領域である、アミノ酸配列が配列番号１で示されるＨ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号２で示されるＨ－ＣＤＲ２、アミノ酸配列が配列番号３で示されるＨ－ＣＤＲ３を含み、かつ
前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は、
軽鎖相補性決定領域である、アミノ酸配列が配列番号４で示されるＬ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号５で示されるＬ－ＣＤＲ２、アミノ酸配列が配列番号６で示されるＬ－ＣＤＲ３を含むものを提供する。

本発明のもう一つの側面では、外来の上記のようなＣＡＲ構築物を発現する組み換え免疫細胞を提供する。

本発明のもう一つの側面では、
（ａ） 上記のような抗体またはその抗原結合断片を含む抗体部分、ならびに
（ｂ） 検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分とカップリングするカップリング部分
を含有する抗体薬物複合体を提供する。

本発明のもう一つの側面では、非診断的に体外でサンプルにおけるＣＤ３８タンパク質を検出する方法であって、
（１） 前記サンプルを上記のような抗体またはその抗原結合断片あるいは抗体薬物複合体と接触させる工程、
（２） 抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルにＣＤ３８タンパク質が存在することを意味する工程
を含む方法を提供する。

本発明のもう一つの側面では、ＣＤ３８関連疾患を予防および／または治療する方法であって、必要な対象に上記のようなヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片、組成物、抗体－薬物複合体、組み換え免疫細胞、またはこれらの組み合わせを施用する工程を含む方法を提供する。

もう一つの好適な例において、前記ＣＤ３８関連疾患は、多発性骨髄腫、白血病、Ｂ細胞腫、自己免疫疾患、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

本分野の常識に合うことを前提に、上記各好適な条件を任意に組み合わせれば、本発明の各好適な実例が得られる。

本発明で用いられる試薬および原料はいずれも市販品として得られる。

本発明の積極的な進歩効果は以下の通りである。

現在、臨床において、特異的で効率的なＣＤ３８強発現疾患の新規な治療薬の開発が期待されているが、それでこのような疾患を罹患した人々の生活品質が改善され、患者により多く、より有効な治療方案を提供する。本発明の５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄはヒトＣＤ３８に対して高い親和力を有し、有効にヒトＣＤ３８を調和し、細胞膜表面の相応する抗原と結合すると、アポトーシスを誘導し、被験動物の生存時間が延び、良い臨床応用の将来性がある。

マウス由来抗体の標的抗原ヒトＣＤ３８－Ｆｃのに対する結合活性 マウス由来抗体のＣＤ３８シクラーゼ遮断活性 マウス由来抗体の組み換え高度発現細胞系ＣＨＯＳ－ＣＤ３８細胞に対する結合活性 マウス由来抗体の腫瘍細胞系ＤＮＤ－４１細胞に対する結合活性 マウス由来抗体のＣＨＯＳ－ＣＤ３８細胞におけるＣＤＣ活性 マウス由来抗体のＲａｊｉ細胞におけるＣＤＣ活性 マウス由来抗体のＤＮＤ－４１細胞におけるＣＤＣ活性 マウス由来抗体のＲａｍｏｓ細胞におけるＣＤＣ活性 マウス由来抗体のＤａｕｄｉ細胞におけるＣＤＣ活性 ヒト化抗体５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄのＤａｕｄｉ細胞に対する結合活性 ヒト化抗体５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄのヒトＣＤ３８シクラーゼ抑制活性 ヒト化抗体５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄのＡＤＣＣ活性 ヒト化抗体５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄのＤａｕｄｉ細胞におけるＣＤＣ活性 ヒト化抗体５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄのＤＮＤ－４１細胞に対するＣＤＣ活性 ヒト化抗体５０Ｇ１２－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄのアポトーシス誘導能力 ヒト化抗体５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄのＲａｍｏｓリンパ腫動物モデルにおける抗腫瘍活性

具体的な実施形態
本発明者は、幅広く深く研究し、大量のスクリーニングにより、高い親和力および良い生物活性、特に、優れたＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性を有するＣＤ３８抗体を得られた。本発明のヒト化ＣＤ３８抗体は、市販のＣＤ３８抗体よりも、相当するか、より優れた活性を持つ。特に、マウスリンパ腫モデルにおいて、本発明のヒト化ＣＤ３８抗体は顕著に被験動物の生存時間を延ばすことができる。そのため、本発明のＣＤ３８抗体は治療効果が優れた抗腫瘍薬として開発することができる。これに基づき、本発明者が本発明を完成した。

用語
本発明において、用語「抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ、略称Ａｂ）」と「免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、略称ＩｇＧ）」は同様な構造上の特徴のヘテロテトラマーの糖タンパク質で、２本の同様の軽鎖（Ｌ）と２本の同様の重鎖（Ｈ）からなるものである。各軽鎖は、重鎖に１つの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）によるものである。各重鎖および軽鎖も、それぞれ一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＨ）を有し、その先が定常領域で、重鎖の定常領域は三つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＬ）を有し、他方の末端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域は一つのドメインＣＬを含む。軽鎖の定常領域は重鎖定常領域のＣＨ１ドメインと、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対応している。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、たとえば、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ、ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）などに関与し、異なるエフェクター機能を示す。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４といったサブタイプを含み、軽鎖定常領域は、κ（Ｋａｐｐａ）またはλ（Ｌａｍｂｄａ）を含む。抗体の重鎖と軽鎖は、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣＬドメインの間のジスルフィドを介して共有結合し、抗体の二つの重鎖は、ヒンジ領域の間で形成したポリペプチド間ジスルフィドを介して共有結合する。

本発明において、用語「Ｆａｂ」および「Ｆｃ」とは、パパインで抗体を二つの完全に同様のＦａｂ断片および一つのＦｃ断片に分解することである。Ｆａｂ断片は、抗体の重鎖のＶＨとＣＨ１および軽鎖のＶＬとＣＬドメインからなるものである。Ｆｃ断片、すなわち、フラグメント結晶化可能（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、Ｆｃ）断片は、抗体のＣＨ２とＣＨ３ドメインからなるものである。Ｆｃ断片は、抗原結合活性がなく、抗体がエフェクター分子または細胞と相互作用する部位である。

本発明において、用語「ｓｃＦｖ」は一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）で、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が、通常、１５～２５のアミノ酸からなる連結する連結短鎖ペプチド（リンカー）を介して連結してなる。

本発明において、「可変」とは、抗体において可変領域のある部分が配列で異なっており、これによって各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性が構成されることを指す。しかし、可変性は、均一に抗体の可変領域全体に分布しているわけではない。重鎖可変領域と軽鎖可変領域における相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つの断片に集中している。可変領域において、比較的に保存的な部分は、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域に、それぞれ、基本的にβシート構造となっており、連結ループを形成する３つのＣＤＲで連結され、場合によって部分βシート構造となる４つのＦＲ領域が含まれる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域で密接し、かつ他方の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２、卷Ｉ、６４７－６６９頁（１９９１））参照する）を形成している。

本明細書で用いられるように、用語「フレームワーク領域」（ＦＲ）とはＣＤＲ間に挿入されるアミノ酸配列で、すなわち、単一の種において異なるグロブリンの間で比較的に保守的なグロブリンの軽鎖と重鎖可変領域のそれらの部分である。グロブリンの軽鎖と重鎖は、それぞれ４つのＦＲを有し、それぞれＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－ＬおよびＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈと呼ばれる。相応的に、軽鎖可変ドメインは（ＦＲ１－Ｌ）－（ＣＤＲ１－Ｌ）－（ＦＲ２－Ｌ）－（ＣＤＲ２－Ｌ）－（ＦＲ３－Ｌ）－（ＣＤＲ３－Ｌ）－（ＦＲ４－Ｌ）と、かつ重鎖可変ドメインは（ＦＲ１－Ｈ）－（ＣＤＲ１－Ｈ）－（ＦＲ２－Ｈ）－（ＣＤＲ２－Ｈ）－（ＦＲ３－Ｈ）－（ＣＤＲ３－Ｈ）－（ＦＲ４－Ｈ）と表示される。好適に、本発明のＦＲはヒト抗体ＦＲまたはその誘導体で、前記ヒト抗体ＦＲの誘導体は天然に存在するヒト抗体ＦＲとほぼ同様で、すなわち、配列同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％に達する。

ＣＤＲのアミノ酸配列が既知で、当業者は簡単にフレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌおよび／またはＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈを確定することができる。

本明細書で用いられるように、用語「ヒトフレームワーク領域」は天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域とほぼ同様（約８５％またはそれ以上、具体的に、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％）のフレームワーク領域である。

本明細書で用いられるように、用語「リンカー」とは、グロブリンのドメインに挿入され、二重可変領域交換グロブリンにフォールディングできるように軽鎖と重鎖のドメインに十分な可動性を提供する一つまたは複数のアミノ酸残基である。本発明において、好適なリンカーはリンカー１とリンカー２で、中では、リンカー１は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のＶＨとＶＬを、リンカー２はｓｃＦｖを別の抗体の重鎖と連結するためのものである。

適切なリンカーの実例は、単一のグリシン（Ｇｌｙ）、またはセリン（Ｓｅｒ）残基を含むが、リンカーにおけるアミノ酸残基の標識および配列はリンカーにおける実現しようとする二次構造要素のタイプによって変わる。

本発明において、本発明の抗体は、さらにその保存的変異体を含み、本発明の二重特異性抗体のアミノ酸配列と比較すると、１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは５個以下、最も好ましくは３個以下のアミノ酸が類似または近い性質を持つアミノ酸で置換されてなるポリペプチドをいう。これらの保存的突然変異のポリペプチドは、表Ａのようにアミノ酸の置換を行って生成することが好ましい。

本発明において、用語「抗」、「結合」、「特異的結合」とは、二つの分子の間の非ランダムの結合反応のことで、たとえば、抗体とその対する抗原の間の反応が挙げられる。

通常、抗体は約１０－７Ｍ未満、たとえば、約１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ未満またはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）で抗原に結合する。本発明において、用語「ＫＤ」とは特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数で、抗体と抗原の間の結合親和力を表すためのものである。解離平衡定数が小さいほど、抗体－抗原の結合が緊密で、抗体と抗原の間の親和力が高い。たとえば、表面プラスモン共鳴技術（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、略称ＳＰＲ）によってＢＩＡＣＯＲＥ装置で抗体と抗原の結合親和力を、あるいはＥＬＩＳＡ測定によって抗体と抗原の結合の相対的親和力を測定する。

本発明において、用語「エピトープ」とは、抗体と特異的に結合するポリペプチドの抗原決定基のことである。本発明のエピトープは、抗原における抗体と結合する領域である。

さらに、本発明は、上記抗体またはその断片またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態でもＲＮＡ形態でもよい。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人工合成のＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。ＤＮＡは、コード鎖でも非コード鎖でもよい。

関連の配列を獲得すれば、組み換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。

さらに、本発明は、上記の適当なＤＮＡ配列および適当なプロモーターあるいは制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するように、適当な宿主細胞の形質転換に用いることができる。

薬物組成物及び使用
さらに、本発明は組成物を提供する。好ましくは、前記の組成物は薬物組成物で、上記の抗体またはその活性断片あるいはその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ｐＨ値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、ｐＨ値は通常５～８程度、好ましくは６～８程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で給与することができ、静脈注射、静脈点滴、皮下注射、局部注射、筋肉注射、腫瘍内注射、腹腔内注射注射（たとえば、腹膜内）、頭蓋内注射、または腔内注射を含むが、これらに限定されない。本発明において、用語「薬物組成物」とは、本発明の二重特異性抗体が薬学的に許容される担体と共に薬物製剤組成物を構成することによってより安定して治療効果を発揮することができ、これらの製剤は本発明で公開される二重特異性抗体のアミノ酸コア配列の配座の完全性を保つと同時に、タンパク質の多くの官能基の分解（凝集、脱アミノまたは酸化を含むが、これらに限定されない）を防ぐことができる。本発明の薬物組成物は、安全有効量（たとえば０．００１～９９ｗｔ％，、好ましくは０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記の二重特異性抗体（またはその複合体）と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含有する。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合せを含むが、これらに限定されない。薬物の製剤は投与形態に相応する。本発明の薬物組成物は、注射剤としてもよく、たとえば生理食塩水またはブドウ糖およびほかの助剤を含有する水溶液で通常の方法によって製造することができる。薬物組成物は、注射剤、溶液の場合、無菌条件で製造する。活性成分の投与量は治療有効量、たとえば毎日約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。また、本発明の二重特異性抗体はほかの治療剤と併用することもできる。

薬物組成物の使用時、安全有効量の二重特異性抗体またはその免疫複合体を哺乳動物に施用するが、その安全有効量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重で、かつ多くの場合、約５０ ｍｇ／ｋｇ体重以下で、好ましくは当該投与量が約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０ ｍｇ／ｋｇ体重である。勿論、具体的な投与量は、さらに投与の様態、患者の健康状況などの要素を考えるべきで、すべて熟練の医者の技能範囲以内である。

抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）
また、本発明は本発明の抗体に基づいた抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）を提供する。

典型的に、前記抗体薬物複合体は前記抗体、およびエフェクター分子を含み、前記抗体と前記エフェクター分子がカップリング、好ましくは化学的にカップリングしている。ここで、前記エフェクター分子は治療活性を有する薬物が好ましい。また、前記エフェクター分子は毒素タンパク質、化学治療薬、小分子薬物または放射性核種のうちの一つまたは複数でもよい。

本発明の抗体と前記エフェクター分子の間はカップリング剤によってカップリングしてもよい。前記のカップリング剤の例は、非選択性カップリング剤、カルボキシ基を利用するカップリング剤、ペプチド鎖、ジスルフィド結合を利用するカップリング剤のうちの任意の一つまたは複数でもよい。前記非選択性カップリング剤とは、エフェクター分子と抗体を共役結合させて連結する化合物、たとえばグルタルアルデヒドなどである。前記カルボキシ基を利用するカップリング剤は、シスアコニット酸無水物系カップリング剤（たとえばシスアコニット酸無水物）、アシルヒドラゾン系カップリング剤（カップリング部位はアシルヒドラゾンである）のうちの任意の一つまたは複数でもよい。

抗体における一部の残基（たとえばＣｙｓやＬｙｓなど）は多くの機能基との連結に使用され、イメージング試薬（たとえば発色基や蛍光基）、診断試薬（たとえばＭＲＩ造影剤や放射性同位元素）、安定剤（たとえばエチレングリコール重合体）および治療剤を含む。抗体は機能剤にカップリングして抗体－機能剤の複合体を形成してもよい。機能剤（たとえば薬物、検出試薬、安定剤）は抗体にカップリング（共役結合）されている。機能剤は直接、またはリンカーを介して間接に抗体に連結してもよい。

抗体は薬物がカップリングすることによって抗体薬物複合体（ＡＤＣ）になってもよい。典型的に、ＡＤＣは薬物と抗体の間に位置するリンカーを含む。リンカーは分解できるリンカーでもよく、分解できないリンカーでもよい。分解できるリンカーは、典型的に、細胞内の環境において分解しやすく、たとえば目的の部位で分解することにより、薬物が抗体から放出される。適切な分解できるリンカーは、たとえば、細胞内におけるプロテアーゼ（たとえばリソソームプロテアーゼやエンドソームプロテアーゼ）によって分解できるペプチジル含有リンカーを含む酵素によって分解されるリンカー、あるいはグルクロニダーゼによって分解できるグルクロン酸含有リンカーのような糖リンカーを含む。ペプチジルリンカーは、たとえばジペプチド、たとえばバリン－シトルリン、フェニルアラニン－リシンやバリン－アラニンを含んでもよい。ほかの適切な分解できるリンカーは、たとえば、ｐＨ感受性リンカー（たとえばｐＨが５．５未満になると加水分解するリンカー、たとえばヒドラゾンリンカー）および還元条件において分解できるリンカー（ジスルフィド結合リンカー）を含む。分解できないリンカーは典型的に抗体がプロテアーゼによって加水分解される条件において薬物を放出する。

抗体に連結する前、リンカーはあるアミノ酸残基と反応できる活性反応基を有し、連結は活性反応基を介して実現する。チオール基に特異的な活性反応基が好ましく、たとえばマレイミド系化合物、ハロゲン化アミド（たとえばヨウ化、臭化または塩化のもの）、ハロゲン化エステル（たとえばヨウ化、臭化または塩化のもの）、ハロゲン化メチルケトン（たとえばヨウ化、臭化または塩化のもの）、ハロゲン化ベンジル（たとえばヨウ化、臭化または塩化のもの）、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、水銀誘導体、たとえば３，６－ジ（水銀メチル）ジオキサン（対イオンは酢酸イオン、塩素イオンまたは硝酸イオンである）、およびポリメチレンジメチルスルフィドチオスルホネートを含む。リンカーは、たとえば、チオスクシンイミドを介して抗体に連結したマレイミドを含んでもよい。

薬物は任意の細胞毒性薬物、細胞生長を抑制する薬物または免疫抑制薬物でもよい。実施形態において、リンカーは抗体と薬物を連結し、薬物はリンカーと結合できる機能性基を有する。たとえば、薬物はリンカーと結合できるアミノ基、カルボキシ基、チオール基、ヒドロキシ基、またはケトン基を有してもよい。薬物が直接リンカーに連結する場合、薬物は抗体に連結する前、反応する活性基を有する。

有用な薬物の種類は、たとえば、抗チューブリン薬、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化試薬、抗生物質、葉酸拮抗薬、抗代謝薬、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどを含む。本発明において、薬物－リンカーは一つの簡単な工程でＡＤＣの形成に使用することができる。別の実施形態において、二機能性リンカー化合物は二工程または多工程の方法でＡＤＣの形成に使用することができる。

たとえば、システイン残基が第一の工程でリンカーの反応活性部分と反応し、そして後の工程で、リンカーにおける機能性基が薬物と反応することで、ＡＤＣになる。

通常、特異的に薬物部分における適切な反応活性基と反応しやすいように、リンカーにおける機能性基を選択する。非限定的な例として、アジ化合物に基づいた部分は特異的な薬物部分における反応性アルキニル基との反応に使用することができる。薬物はアジ基とアルキニル基の間の１，３－双極子を介して付加することで、リンカーに共役結合する。

ほかの有用な機能性基は、たとえばケトン類およびアルデヒド類（ヒドラジド類およびアルコキシアミンとの反応に適する）、ホスフィン（アジ基との反応に適する）、イソシアネートおよびイソチオシアネート（アミン類およびアルコール類との反応に適する）、および活性化したエステル類、たとえばＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（アミン類およびアルコール類との反応に適する）を含む。これらおよびほかの連結手段は、たとえば「生物カップリング技術」、第二版（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）に記載されるように、当業者に熟知されている。当業者には、薬物部分およびリンカーの選択性反応について、相補対の反応活性機能基を選択する場合、当該相補対のいずれでも、リンカーにも薬物にも使用することができる。

また、本発明は、ＡＤＣを製造する方法であって、さらに、抗体を薬物－リンカー化合物と、抗体複合体（ＡＤＣ）の形成に足りる条件において結合させる工程を含んでもよい方法を提供する。

一部の実施形態において、本発明の方法は、抗体－リンカー複合体の形成に足りる条件において、抗体を二機能性リンカー化合物と結合させる工程を含む。これらの実施形態において、本発明の方法は、さらに、薬物部分がリンカーを介して抗体に共役結合するのに足りる条件において、抗体リンカー複合体を薬物部分と結合させる工程を含む。

一部の実施形態において、抗体薬物複合体ＡＤＣは以下の分子式で表される。

（ただし、
Ａｂは抗体である。
ＬＵはリンカーである。
Ｄは薬物である。

そして、下付き文字ｐは１～８から選ばれる値である。）
以下の実施例は、本発明をさらに説明するためのもので、本発明の制限にはならないと理解される。実施例には、伝統的な方法、例えば、ベクターやプラスミドを構築する方法、コードタンパク質の遺伝子をこのようなベクターやプラスミドに挿入する方法、或いはプラスミドを宿主細胞に導入する方法が含まれていない。このような方法は、本分野における普通の技術者には周知で、且つＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｉｓ，Ｔ．（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを含む多くの出版物に記述されたている。特に断らない限り、％と部は、重量で計算された。

以下の実施例で使用された実験材料および由来ならびに実験試薬の調製方法の詳細は、以下の通りである。

実験材料：
ＣＨＯ－Ｓ細胞：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入されたもの。

組み換え細胞系ＣＨＯＳ－ＣＤ３８：ヒト全長ＣＤ３８をＣＨＯ－Ｓ細胞に安定して形質導入し、クローニング・スクリーニングによって得られたＣＤ３８を安定して発現するモノクローナル細胞株。

Ｒａｊｉ細胞：ＡＴＣＣから購入されたもの、ＣＣＬ－８６。

マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０：ＡＴＣＣから購入されたもの、カタログ番号ＣＲＬ－１５８１。

Ｂａｌｂ／ｃマウス：上海霊暢生物科技有限公司から購入されたもの。

ＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウス：上海霊暢生物科技有限公司から購入されたもの。

Ｒａｍｏｓ細胞：ＡＴＣＣから購入されたもの、カタログ番号ＣＲＬ－１５９６。

Ｄａｕｄｉ細胞：ＡＴＣＣから購入されたもの、カタログ番号ＣＣＬ－２１３。

ＤＮＤ－４１細胞：豊暉生物から購入されたもの。

ヒト末梢血単核球ＰＢＭＣ：Ａｌｌｃｅｌｌｓ生物技術（上海）有限公司から購入されたもの。

逆転写キット：Ｔａｋａｒａから購入されたもの。

ヒツジ抗マウス二次抗体：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入されたもの、カタログ番号ＡＰ１８１Ｐ。

ロバ抗マウスＰＥ蛍光二次抗体：Ｊａｃｋｓｏｎから購入されたもの、カタログ番号７１５－１１６－１５０。

ヒツジ抗ヒトＰＥ蛍光二次抗体：Ｊａｃｋｓｏｎから購入されたもの、カタログ番号１０９－１１５－０９８。

Ｆ１６ Ｂｌａｃｋ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｐｌａｔｅ：Ｎｕｎｃから購入されたもの、カタログ番号４７５５１５。

実験試薬：
ＰＢＳ緩衝液：上海生工生物工程株式有限公司、カタログ番号Ｂ５４８１１７－０５００。

ＳＦＭ培地：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入されたもの、カタログ番号１２０４５－０７６。

ＴＭＢ：ＢＤから購入されたもの、カタログ番号５５５２１４。

ＮＧＤ：ｓｉｇｍａから購入されたもの、カタログ番号Ｎ５１３１－２５ＭＧ。

ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）：Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍから購入されたもの。

β－メルカプトエタノール、ウシ胎児血清、グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ＭＥＭ－ＮＥＡＡ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ：いずれもＧｉｂｃｏ社から購入されたもの。

フェノールレッド無しＲＰＭＩ－１６４０：Ｇｉｂｃｏから購入されたもの、カタログ番号１１８３５０５５。

ＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ反応液：Ｐｒｏｍｅｇａから購入されたもの、カタログ番号Ｇ１７８０。

ＨＡＴ：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｈｒｉｃｈから購入されたもの、カタログ番号Ｈ０２６２－１０ＶＬ。

ＣＣＫ－８：同仁化学から購入されたもの、カタログ番号ＣＫ０４。

Ｔｒｉｚｏｌ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入されたもの、カタログ番号１５５９６０１８。

実験装置：
電気融合装置：ＢＴＸから購入されたもの。

フローサイトメーター（ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ）：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒから購入されたもの。

本発明の抗体の配列は以下の通りである。

実施例１ 陽性対照抗体の製造
本発明の実施例に記載のＤａｒａｔｕｍｕｍａｂの重鎖と軽鎖可変領域のアミノ酸配列は『ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｖｏｌ． ２４， Ｎｏ． １， ２０１０』から入手されたもので、すなわち、本発明の配列番号１９と２０である。

本発明の実施例に記載のＩｓａｔｕｘｉｍａｂの重鎖と軽鎖可変領域のアミノ酸配列は『ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｖｏｌ． ２９， Ｎｏ． ３， ２０１５』から入手されたもので、すなわち、本発明の配列番号２１と２２である。

上記重鎖可変領域と軽鎖可変領域のＤＮＡは上海生工生物工程有限公司によって合成されたものである。合成されたＤａｒａｔｕｍｕｍａｂの重鎖可変領域の遺伝子をヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域の遺伝子と連結し、全長の重鎖の遺伝子を得たが、Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ＨＣ－ＩｇＧ１と名付けた。Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂの軽鎖可変領域の遺伝子をヒトκ鎖定常領域の遺伝子と連結し、全長の軽鎖の遺伝子を得たが、Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ＬＣと名付けた。Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ＨＣ－ＩｇＧ１とＤａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ＬＣ遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、ＰＥＩ形質導入法によって得られた重鎖と軽鎖の発現ベクターを共にＨＥＫ２９３Ｆ細胞に導入して抗体を発現させ、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＦｒｅｅ Ｓｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍで培養した。形質導入後のＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＣＯ２振とうインキュベーターにおいて５日培養し、遠心して細胞上清を収集し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティクロマトグラフィーによって上清における抗体を精製し、得られた抗体をＤａｒａｔｕｍｕｍａｂと名付けた。また、同じような実験方法によって抗体Ｉｓａｔｕｘｉｍａｂを得た。

ヒトＣＤ３８細胞外領域配列の情報はｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ２８９０７からのものである。ＣＤ３８細胞外領域のＤＮＡは上海生工生物工程有限公司によって合成され、組み換え遺伝子をｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築した。Ｈｉｓタグと融合して発現された組み換えタンパク質は、金属キレートアフィニティクロマトグラフィーカラムで培養上清における組み換えタンパク質をさらに精製した。Ｆｃタグと融合して発現された組み換えタンパク質はＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇアフィニティクロマトグラフィーカラムでさらに精製した。最終的に得られたタンパク質をＣＤ３８－Ｈｉｓ／ＣＤ３８－Ｆｃと名付けた。

実施例２ 抗原免疫動物およびハイブリドーマの製造とスクリーニング
工程１：抗原によるマウスの免疫
組み換え過剰発現細胞系ＣＨＯＳ－ＣＤ３８または腫瘍細胞系Ｒａｊｉ細胞を通常のように腹腔からＢａｌｂ／ｃマウスを免疫させた。１日目に、フロイント完全アジュバント１００ｌでＢａｌｂ／ｃマウスに対して腹腔注射を行った。２日目に、組み換え細胞系ＣＨＯＳ－ＣＤ３８またはＲａｊｉ細胞で腹腔からＢａｌｂ／ｃマウスを、５×１０６細胞／匹マウスで免疫させた。１４日目に、組み換え細胞系ＣＨＯＳ－ＣＤ３８またはＲａｊｉ細胞で腹腔からＢａｌｂ／ｃマウスを、５×１０６細胞／匹マウスで強化免疫した。３６日目に、組み換え細胞系ＣＨＯＳ－ＣＤ３８まはＲａｊｉ細胞で前回と同様にマウスを強化免疫した。３週間後、ＣＤ３８－Ｈｉｓ抗原タンパク質を腹腔内注射して活性化させ、３－４日後、マウスの脾臓を取り出して細胞融合実験を行った。

工程２：ハイブリドーマの製造とスクリーニング
マウスの最後の免疫から３－４日で、通常のハイブリドーマのプロトコールを使用し、マウスの脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０と電気融合装置によって電気融合した。

融合後の細胞を完全培地に均一に懸濁させ、完全培地は、ＲＰＭＩ１６４０とＤＭＥＭ Ｆ１２培地を１：１で均一に混合した後、１％のＧｌｕｔｍｉｎｅ（グルタミン）、１％ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ（ピルビン酸ナトリウム）、１％ＭＥＭ－ＮＥＡＡ（最小必須培地－非必須アミノ酸溶液），１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ペニシリン－ストレプトマイシン）、５０μＭのβ－メルカプトエタノールおよび２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）からなる培地を入れたものである。融合後の細胞を１０５細胞／１００μｌ／ウェルで、計３６枚の９６ウェル培養プレートに分けて一晩培養し、次の日に、各ウェルに１００μｌ／ウェルで２×ＨＡＴ含有完全培地を入れ、９６ウェルプレートにおける培養液を２００μｌ／ウェル（１×ＨＡＴ含有）にした。７－１２日後、上清液を回収し、Ｃｅｌｌ ｂａｓｅｄ ＥＬＩＳＡ方法によってヒトＣＤ３８結合活性が陽性のハイブリドーマウェルをスクリーニングした。

ここで、Ｃｅｌｌ ｂａｓｅｄ ＥＬＩＳＡ方法によってヒトＣＤ３８結合活性が陽性のハイブリドーマウェルをスクリーニングする方法は以下の通りである：組み換え細胞系ＣＨＯＳ－ＣＤ３８をＰＢＳ緩衝液で２×１０６細胞／ｍｌになるように希釈し、１００μｌ／ウェルで細胞培養プレートに入れ、３７℃で一晩培養した。次の日に、上清を捨て、１００μｌ／ウェルの細胞固定液を入れて室温で１時間固定させた後、上清を捨てて５％脱脂粉乳を入れて３７℃で２時間ブロッキングし、ＰＢＳＴでプレートを１回洗浄して使用に備えた。回収されたハイブリドーマ上清液を順にブロッキングされたプレートに１００μｌ／ウェルで入れ、３７℃で１ｈ置いた。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＨＲＰで標識されたヒツジ抗マウスＩｇＧ二次抗体を入れ、３７℃で３０ ｍｉｎ置いた。ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄した後、吸水紙においてなるべく残留液滴をなくし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを入れ、室温（２０±５℃）で光を避けて５ｍｉｎ置いた。各ウェルに５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止液を入れて基質の反応を停止させ、プレートリーダーによって４５０ｎｍでＯＤ値を読み取り、被験抗体の標的抗原ＣＤ３８との結合能力を分析した。スクリーニングによって計３０株のハイブリドーマ細胞株を得た。血清含有完全培地においてスクリーニングによって得られた３０株のハイブリドーマ細胞株を増幅させ、遠心して無血清培養液ＳＦＭ培地に交換し、細胞密度が１～２×１０７／ｍｌになるようにし、８％ ＣＯ２、３７℃の条件において１週間培養し、遠心して培養上清を得、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、３株の抗ヒトＣＤ３８モノクローナル抗体タンパク質を得たが、それぞれ５０Ｇ１２、２７９Ｄ１１、１５３Ｆ１１と名付け、中でも、５０Ｇ１２が最も優れた活性の抗体である。

実施例３ ネズミ由来抗体５０Ｇ１２のヒトＣＤ３８－Ｆｃタンパク質に対する結合能力
間接酵素結合免疫吸着測（ＥＬＩＳＡ）によってネズミ由来抗体のヒトＣＤ３８－Ｆｃタンパク質に対する結合能力を測定した。具体的な方法は以下の通りである。

ＣＤ３８－Ｆｃタンパク質をコーティング液（５０ｍＭの炭酸塩コーティング緩衝液、ｐＨ ９．６）で１μｇ／ｍｌに希釈してプレートを４℃で一晩コーティングした。さらに、５％の脱脂粉乳でブロッキングし、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、実験室で調製された抗ヒトＣＤ３８抗体５０Ｇ１２タンパク質を１％ＢＳＡ緩衝液で勾配希釈し、１００μｌ／ウェルでコーティングしておいたＣＤ３８－Ｆｃのプレートに入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＨＲＰで標識されたヒツジ抗マウスＩｇＧ二次抗体を入れ、３７℃で３０ ｍｉｎ置いた。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、吸水紙においてなるべく残留液滴をなくし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを入れ、室温（２０±５℃）で光を避けて５ｍｉｎ置き、各ウェルに５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止液を入れて基質の反応を停止させ、プレートリーダーによって４５０ ｎｍでＯＤ値を読み取り、被験抗体の標的抗原ヒトＣＤ３８－Ｆｃとの結合能力を分析し、結果を図１に示す。

図１から、ネズミ由来抗体５０Ｇ１２、２７９Ｄ１１、１５３Ｆ１１はいずれも標的抗原ＣＤ３８－Ｆｃと良い結合活性を有し、５０Ｇ１２の結合活性が最も優れ、ＥＣ５０が０．１７２７ ｎＭであったことがわかる。

実施例４ ネズミ由来抗体のＣＤ３８酵素活性を抑制する能力
ＣＤ３８は、ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド（ＮＧＤ）が環状ＧＤＰリボース（ｃｙｃｌｉｃ ＧＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ）に転換するように触媒できる酵素で、後者は励起させると蛍光を放出する。ここで、蛍光法によってネズミ由来抗体５０Ｇ１２、２７９Ｄ１１、１５３Ｆ１１および対照抗体Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ、Ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ、ＩｇＧ対照のＣＤ３８酵素活性に対する抑制作用を測定した。具体的な方法は以下の通りである。

被験ネズミ由来抗体５０Ｇ１２、２７９Ｄ１１、１５３Ｆ１１および対照抗体Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ、Ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ、ＩｇＧ対照をＴｒｉｓ－Ｈｃｌで６００ｇ／ｍｌに希釈し、そして３倍で勾配希釈し、計１０ウェルであった。ＣＤ３８－Ｈｉｓ抗原をＴｒｉｓ－Ｈｃｌで５ｇ／ｍｌに希釈し、抗原とサンプル抗体を等体積で反応プレートに５０ｌずつ入れ、１０ｍｉｎ振とうし、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした。バックグラウンドウェルを設けた：（１）希釈液ウェル：２００ｌ希釈液；（２）ＮＧＤウェ
ル：１００ｌ希釈液；（３）抗原ウェル：５０ｌ抗原、１５０ｌ希釈液。インキュベート終了後、ＮＧＤをＴｒｉｓ－Ｈｃｌで２５０ｇ／ｍｌに希釈し、希釈液ウェルと抗原ウェル以外、各ウェルに１００ｌずつ入れ、５ｍｉｎ振とうし、３７℃で９０ｍｉｎインキュベートした。多機能プレートリーダーによってＥｘ：３００、ＥＭ：４１０でプレートを読み取り、収集してデータを処理し、結果を図２に示す。

図２から、ネズミ由来抗体５０Ｇ１２およびＩｓａｔｕｘｉｍａｂのみが有効にＣＤ３８シクラーゼ活性を遮断できたことがわかる。

実施例５ ネズミ由来抗体の組み換え高度発現細胞系ＣＨＯＳ－ＣＤ３８細胞および腫瘍細胞系ＤＮＤ－４１細胞に対する結合能力
フローサイトメトリーによってネズミ由来抗体の組み換え高度発現細胞系ＣＨＯＳ－ＣＤ３８細胞および腫瘍細胞系ＤＮＤ－４１細胞に対する結合活性を検出したが、具体的な方法は以下の通りである：
それぞれＣＨＯＳ－ＣＤ３８細胞およびＤＮＤ－４１細胞を収集し、遠心して細胞培養液を除去し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。計数して１％ＢＳＡ ＦＡＣＳ緩衝液で２×１０６細胞／ｍｌになるように希釈し、細胞を９６ウェル丸底プレートに敷いて使用に備えた。被験抗体を１％ＢＳＡ緩衝液で８段の勾配で希釈して上記細胞丸底プレートに入れ、４℃で１時間インキュベートした。遠心後、上清を捨て、１％ ＢＳＡ ＦＡＣＳ 緩衝液で３回洗浄し、１：３００の比率で（詳細は蛍光二次抗体の説明書を参照する）各ウェルに１００μｌのロバ抗マウスＰＥ蛍光二次抗体またはヒツジ抗ヒトＰＥ蛍光二次抗体を入れ、４℃で１時間インキュベートした。１％ ＢＳＡ ＦＡＣＳ 緩衝液で３回洗浄し、さらに１％ ＢＳＡ ＦＡＣＳ 緩衝液で再懸濁させ、２００μｌ／ウェルにし、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ ＢＤによってサンプルを測定して分析し、前記抗体の細胞結合の結果は図３Ａ、図３Ｂを参照する。

図３Ａ、図３Ｂから、ネズミ由来抗体５０Ｇ１２、２７９Ｄ１１、１５３Ｆ１１はいずれもＣＨＯＳ－ＣＤ３８およびＤＮＤ－４１細胞において良い結合活性を有することがわかる。ＣＨＯＳ－ＣＤ３８細胞では、ＥＣ５０がそれぞれ６８６．９ｎｇ／ｍｌ、８４．９ｎｇ／ｍｌ、４８８．９ｎｇ／ｍｌで、ＤＮＤ－４１細胞では、それぞれ１３３．８ｎｇ／ｍｌ、８４．４４ｎｇ／ｍｌ、９６．８９ｎｇ／ｍｌであった。

実施例６ ネズミ由来抗体のＣＤＣ活性の測定
特異性抗体が細胞膜の表面の相応する抗原と結合すると、補体の古典経路を活性化させ、これによって形成する膜攻撃複合体が標的細胞を分解させるが、これはＣＤＣ作用と呼ばれる。それぞれＣＨＯＳ－ＣＤ３８、Ｒａｊｉ、ＤＮＤ－４１、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ細胞においてＣＤＣ活性を測定したが、具体的な方法は以下の通りである：
細胞培地を緩衝液として抗ヒトＣＤ３８モノクローナル抗体を開始濃度の２０μｇ／ｍｌになるように希釈した後、３倍濃度勾配で希釈し、計８つの濃度の希釈液を得た。ＣＤ３８を発現する標的細胞（Ｄａｕｄｉ細胞など）を計数した後、３×１０５細胞／ｍｌになるように再懸濁させた。１００μｌの抗ヒトＣＤ３８モノクローナル抗体の各濃度の希釈液と８０μｌのＣＤ３８を高度発現する標的細胞を予め１５ ｍｉｎインキュベートした後、２０μｌの５０％の新鮮なヒト血清（ボランティアから献血）を入れて均一に混合した。陽性対照ウェルは単独の標的細胞＋血清で、陰性対照ウェルは無細胞の培地である。インキュベーターにおいて１２－１８ ｈインキュベートし、２０μｌのＣＣＫ－８を入れ、４ｈ後、プレートリーダーによって４５０ ｎｍで吸光値を測定し、４５０ｎｍにおける読み取り値から殺傷率を計算した。殺傷率の計算式は以下の通りである。

殺傷率（ｋｉｌｌｉｎｇ％）＝（陽性対照吸光値－実験群吸光値）／（陽性対照吸光値－陰性対照吸光値）×１００
結果は図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、図に示すように、異なる細胞モデルにおいて、ネズミ由来抗体５０Ｇ１２および２７９Ｄ１１はいずれも強いＣＤＣ活性を有し、１５３Ｆ１１は比較的に弱かった。

実施例７ ネズミ由来抗ヒトＣＤ３８モノクローナル抗体のヒト化
工程１：ネズミ由来抗ヒトＣＤ３８モノクローナル抗体の可変領域の配列の決定
Ｔｒｉｚｏｌで５０Ｇ１２ハイブリドーマモノクローナル細胞株から全ＲＮＡを抽出し、逆転写キットでｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、文献で報告された組み合わせプライマー（組み合わせプライマーは『Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ』、１巻、Ｒｏｌａｎｄ ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＳｔｅｆａｎ Ｄｕｂｅｌ編、第３２３頁からのものである）でＰＣＲによって５０Ｇ１２の軽鎖可変領域と重鎖可変領域の遺伝子を増幅させた後、ＰＣＲ産物をｐＭＤ１８－Ｔベクターにクローニングし、シークエンシングして可変領域の遺伝子配列を分析した。ネズミ由来抗体５０Ｇ１２の可変領域の配列の情報は以下の通りである：重鎖可変領域の遺伝子配列は、全長３５７ ｂｐで、１１９のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列が配列番号１３で示され、アミノ酸配列が配列番号７で示され、軽鎖可変領域の遺伝子配列は、全長３２１ ｂｐで、１０７のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列が配列番号１４で示され、アミノ酸配列が配列番号８で示される。

工程２：ネズミ由来抗ヒトＣＤ３８モノクローナル抗体のヒト化
ネズミ由来抗体５０Ｇ１２抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列を分析し、Ｋａｂａｔ番号付けでそれぞれネズミ由来抗体５０Ｇ１２モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）を決定した。ネズミ由来抗体５０Ｇ１２抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列はＨ－ＣＤＲ１：配列番号１、Ｈ－ＣＤＲ２：配列番号２およびＨ－ＣＤＲ３：配列番号３で、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列はＬ－ＣＤＲ１：配列番号４、Ｌ－ＣＤＲ２：配列番号５およびＬ－ＣＤＲ３：配列番号６である。

ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／において、ネズミ由来５０Ｇ１２モノクローナル抗体の重鎖可変領域とヒトＩｇＧ胚胎系配列に対して相同性の比較を行い、ＩＧＨＶ１－４６＊０１を重鎖ＣＤＲ移植鋳型として選択し、ネズミ由来抗体５０Ｇ１２の重鎖ＣＤＲをＩＧＨＶ１－４６＊０１骨格領域に移植し、そしてＨ－ＣＤＲ３の後にＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳを第四のフレームワーク領域として入れ、ＣＤＲ移植重鎖可変領域の配列を得た。同様に、ネズミ由来抗体５０Ｇ１２の軽鎖可変領域とヒトＩｇＧ胚胎系配列に対して相同性の比較を行い、ＩＧＫＶ１－３９＊０１を軽鎖ＣＤＲ移植鋳型として選択し、ネズミ由来抗体５０Ｇ１２の軽鎖ＣＤＲをＩＧＫＶ１－３９＊０１の骨格領域に移植し、そしてＬ－ＣＤＲ３の後にＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫを第四のフレームワーク領域として入れ、ＣＤＲ移植軽鎖可変領域の配列を得た。ＣＤＲ移植可変領域に基づき、一部のフレームワーク領域のアミノ酸部位を復帰突然変異させた。

復帰突然変異とは、ＣＤＲ移植可変領域のフレームワーク領域におけるあるアミノ酸（抗体の構造および親和力の維持に比較的に重要なアミノ酸）をネズミ由来フレームワーク領域の相応する位置におけるアミノ酸に突然変異させた。

の突然変異の場合、アミノ酸配列に対してＫａｂａｔ番号付けを行い、部位の位置はＫａｂａｔ番号で示す。好適に、ＣＤＲ移植重鎖可変領域では、Ｋａｂａｔ番号で、３０番目のＴをＮに、６９番目のＭをＬに、７１番目のＲをＡに、７３番目のＴをＫに突然変異させた。ＣＤＲ移植軽鎖可変領域では、４７番目のＬをＷに、４８番目のＩをＭに、７１番目のＦをＹに突然変異させた。上記突然変異部位を持つ重鎖可変領域と軽鎖可変領域をそれぞれヒト化した重鎖可変領域と軽鎖可変領域と定義し、それぞれ５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＶＨと５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＶＬと名付け、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＶＨのアミノ酸配列は配列番号９で、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１０である。

上記ヒト化した重鎖と軽鎖可変領域をコードするＤＮＡは上海生工生物工程有限公司によって合成されたものである。合成されたヒト化重鎖可変領域のＤＮＡとヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のＤＮＡを連結し、全長のヒト化重鎖ＤＮＡを得たが、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＨＣと名付け、ヒト化重鎖可変領域のＤＮＡ配列は配列番号１５で示され、全長のヒト化重鎖のＤＮＡ配列は配列番号１７で示され、ヒト化軽鎖可変領域のＤＮＡとヒトκ鎖定常領域のＤＮＡを連結し、全長のヒト化軽鎖ＤＮＡを得たが、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＬＣと名付け、ヒト化軽鎖可変領域のＤＮＡ配列番号１６で示され、全長のヒト化軽鎖のＤＮＡ配列は配列番号１８で示される。５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＨＣと５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＬＣの遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、上記実施例に記載の方法によって発現させて抗体を精製したが、その重鎖のアミノ酸配列は配列番号１１で示され、軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１２で示され、得られた抗体を５０Ｇ１２－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄと名付けた。

また、ネズミ由来抗体５０Ｇ１２の重鎖可変領域をヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域と連結し、キメラ重鎖遺伝子を得たが、５０Ｇ１２－Ｃｈｉ－ＨＣと名付けた。ネズミ由来５０Ｇ１２の軽鎖可変領域をヒトκ鎖定常領域と連結し、キメラ軽鎖遺伝子を得たが、５０Ｇ１２－Ｃｈｉ－ＬＣと名付けた。５０Ｇ１２－Ｃｈｉ－ＨＣと５０Ｇ１２－Ｃｈｉ－ＬＣの遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、上記実施例に記載の方法によって発現させて抗体を精製したが、得られた抗体を５０Ｇ１２－Ｃｈｉｍｅｒｉｃと名付けた。

実施例８ ５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄのＣＤ３８に対する結合能力
フローサイトメトリー法によって５０Ｇ１２－Ｃｈｉｍｅｒｉｃおよび５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄのＤａｕｄｉ細胞表面ＣＤ３８に対する結合能力を検出した。具体的な方法は以下の通りである。

Ｄａｕｄｉ細胞を計数した後、１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を９６ウェル丸底培養プレートに２×１０５細胞／ウェルで接種した。上記９６ウェルプレートに５０μｌのＰＢＳ溶液で勾配希釈された抗ＣＤ３８抗体を入れた。室温で１時間インキュベートした後、遠心して上清を捨て、さらにＰＢＳで細胞を２回洗浄した。ＦＩＴＣで標識されたヒツジ抗ヒト（Ｆｃ－Ｓｐｅｉｃｉｆｉｃ）抗体（１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳで１：１０００で希釈されたもの）を入れ、室温で半時間インキュベートした。遠心して細胞を洗浄した後、フローサイトメーターにおいてＦＩＴＣチャネルの平均蛍光強度（Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＭＦＩ）を検出した。フローサイトメーターに付いたソフトによって実験データを処理して平均蛍光強度を計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６によってデータ分析およびブロッティングを行い、ＥＣ５０を計算した。

結果は図５に示すように、５０Ｇ１２－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ、５０Ｇ１２－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ、ＤａｒａｔｕｍｕｍａｂおよびＩｓａｔｕｘｉｍａｂはいずれも有効にＤａｕｄｉ細胞と結合でき、それらのＥＣ５０がそれぞれ０．５２８５ｎＭ、０．６０４７ｎＭ、０．４５９６ｎＭおよび０．３２３４ｎＭであった。上記結果から、５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄのＤａｕｄｉ細胞と結合する能力がほぼ相当することが示された。ここで、アイソタイプ対照はＤａｕｄｉ細胞と結合しないヒトＩｇＧ１抗体である。

実施例９ ５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄのＣＤ３８シクラーゼ抑制活性
蛍光法によって５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄのＣＤ３８シクラーゼ活性に対する抑制作用を測定した。具体的な方法は以下の通りである。

ｐＨ６．５の５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液を調製し、ＭＥＳ緩衝液で２００μＭのニコチンアミドグアニンジヌクレオチド（ＮＧＤ）溶液を調製した。ＭＥＳ緩衝液でＣＤ３８－Ｈｉｓを２μｇ／ｍｌに希釈した後、さらに最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように抗ＣＤ３８抗体を入れた。Ｆ１６ Ｂｌａｃｋ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｐｌａｔｅに５０μＬのＮＧＤ溶液を入れた後、さらに５０μＬのＣＤ３８－Ｈｉｓおよび抗ＣＤ３８抗体を含有する溶液を入れた。多機能プレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５を使用して動態モード（ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｏｄｅ）で蛍光値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ、ＲＦＵ）を読み取り、励起と発光の波長をそれぞれ３００ ｎｍと４１０ ｎｍに設定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６によってデータ分析およびブロッティングを行った。

結果は図６に示すように、５０Ｇ１２－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ、ＤａｒａｔｕｍｕｍａｂおよびＩｓａｔｕｘｉｍａｂはいずれも有効にＣＤ３８－Ｈｉｓの酵素活性を抑制することができ、その傾きがそれぞれ１５５９３１、３３１０４６および９３３１６で、傾きが小さいほど、抑制作用が強いことを示すため、三者のＣＤ３８シクラーゼの抑制活性が強い順でＩｓａｔｕｘｉｍａｂ、５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄおよびＤａｒａｔｕｍｕｍａｂであった。

実施例１０ ５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄのＡＤＣＣ活性の測定
抗体のＦａｂ断片が細胞表面の抗原エピトープと結合し、そのＦｃ断片がエフェクター細胞（ＮＫ細胞、マクロファージなど）表面のＦｃ受容体と結合し、エフェクター細胞の標的細胞への直接殺傷を仲介し、これはＡＤＣＣ作用である。ここで、抗ＣＤ３８抗体のＡＤＣＣ活性を測定した。具体的な方法は以下の通りである。

フェノールレッド無しＲＰＭＩ－１６４０に２％のウシ胎児血清を入れた。当該培地で標的細胞であるＤａｕｄｉ細胞およびヒト末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）を１：２５の比率で均一に混合し、丸底９６ウェルプレートに、最終的に各ウェルに２×１０４個のＤａｕｄｉ細胞および５×１０５個のＰＢＭＣが含まれるように、１５０μＬ／ウェルで接種した。５０μＬの勾配希釈された抗ＣＤ３８抗体を入れた。３７℃、５％ ＣＯ２細胞インキュベーターにおいて一晩インキュベートした。５０μＬの細胞培養上清を取り、５０μＬのＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ反応液を入れ、３０ ｍｉｎ後、停止液を入れて反応を停止させ、プレートリーダーでＯＤ４９０を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６によってデータ分析およびブロッティングを行い、ＥＣ５０を計算した。

結果は図７に示すように、５０Ｇ１２－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ、ＤａｒａｔｕｍｕｍａｂおよびＩｓａｔｕｘｉｍａｂはいずれも有効に標的細胞を殺傷することができ、それらのＥＣ５０がそれぞれ０．１０５８ ｎＭ、０．０８８７６ ｎＭおよび０．０６９４ ｎＭで、三者のＡＤＣＣ活性がほぼ相当する。

実施例１１ ５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄのＣＤＣ活性の測定
Ｄａｕｄｉ、ＤＮＤ－４１細胞モデルにおいてヒト化抗体５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄのＣＤＣ活性を測定した。実験方法の詳細は以下の通りである：細胞培地を緩衝液として抗ヒトＣＤ３８モノクローナル抗体を開始濃度の２０μｇ／ｍｌになるように希釈した後、３倍濃度勾配で希釈し、計８つの濃度の希釈液を得た。ＣＤ３８を発現する標的細胞（Ｄａｕｄｉ細胞など）を計数した後、３×１０５細胞／ｍｌになるように再懸濁させた。１００μｌの抗ヒトＣＤ３８モノクローナル抗体の各濃度の希釈液と８０μｌのＣＤ３８を高度発現する標的細胞を予め１５ ｍｉｎインキュベートした後、２０μｌの５０％の新鮮なヒト血清（ボランティアから献血）を入れて均一に混合した。陽性対照ウェルは単独の標的細胞＋血清で、陰性対照ウェルは無細胞の培地である。インキュベーターにおいて１２－１８ｈインキュベートし、２０μｌのＣＣＫ－８を入れ、４ｈ後、プレートリーダーによって４５０ｎｍで吸光値を測定し、４５０ｎｍにおける読み取り値から殺傷率を計算した。殺傷率の計算式は以下の通りである。

殺傷率（ｋｉｌｌｉｎｇ％）＝（陽性対照吸光値－実験群吸光値）／（陽性対照吸光値－陰性対照吸光値）×１００
実験結果は図８Ａ、８Ｂに示すように、Ｄａｕｄｉ細胞モデルにおいて、ヒト化抗体５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄはＣＤＣ活性がＤａｒａｔｕｍｕｍａｂおよびＩｓａｔｕｘｉｍａｂに相当する。ＤＮＤ－４１細胞モデルにおいて、ヒト化抗体５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄはＣＤＣ活性がＤａｒａｔｕｍｕｍａｂおよびＩｓａｔｕｘｉｍａｂよりも良い。

実施例１２ ５０Ｇ１２－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄのアポトーシス誘導能力
抗ＣＤ３８抗体は、細胞膜表面の相応する抗原と結合すると、アポトーシスを誘導することができる（Ｄｅｃｋｅｒｔ Ｊ， Ｗｅｔｚｅｌ Ｍ， Ｂａｒｔｌｅ Ｌ Ｍら、ＳＡＲ６５０９８４， Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＣＤ３８－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ， Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ ＣＤ３８＋ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ［Ｊ］． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０１４， ２０（１７）： ４５７４－４５８３．）。アポトーシスの細胞において、膜リン脂質のホスファチジルセリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、ＰＳ）が細胞膜の内側から外側に移動することで、ＰＳが外部の細胞環境に露出するようになる。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖは３５－３６ｋＤａのカルシウムイオン依存性リン脂質結合タンパク質で、ＰＳに高い親和力を有し、露出したＰＳと結合することができる。ここで、ＦＩＴＣで標識されたＡｎｎｅｘｉｎ Ｖアポトーシス検出キットによって抗ＣＤ３８抗体のアポトーシス誘導活性を測定した。具体的な方法は以下の通りである。

ＲＰＭＩ－１６４０に２％のウシ胎児血清を入れた。当該培地でＤａｕｄｉ細胞を９６ウェルプレートに、１×１０５細胞／１５０μＬ／ウェルで接種した。５０μＬの勾配希釈された抗ＣＤ３８抗体を入れた。３７℃、５％ ＣＯ２細胞インキュベーターにおいて２４ｈインキュベートした。ＦＩＴＣで標識されたＡｎｎｅｘｉｎ Ｖアポトーシス検出キットによってアポトーシス細胞を染色した。遠心して細胞を洗浄した後、フローサイトメーターにおいてＦＩＴＣチャネルの平均蛍光強度を検出した。フローサイトメーターに付いたソフトによって実験データを処理して全細胞における染色細胞が占める比率を計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６によってデータ分析およびブロッティングを行い、ＥＣ５０を計算した。

結果は図９に示すように、５０Ｇ１２－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ、ＤａｒａｔｕｍｕｍａｂおよびＩｓａｔｕｘｉｍａｂはいずれも有効にアポトーシスを誘導することができ、それらのＥＣ５０がそれぞれ０．５６７５ ｎＭ、０．３０５９ ｎＭおよび０．３０２ ｎＭである。三者のＥＣ５０がほぼ相当するが、５０Ｇ１２－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ、ＤａｒａｔｕｍｕｍａｂおよびＩｓａｔｕｘｉｍａｂのアポトーシスを誘導できる最高の細胞比率がそれぞれ２８．４％、１３．４％および４９．０％である。そのため、三者のアポトーシス誘導能力は強い順でＩｓａｔｕｘｉｍａｂ、５０Ｇ１２－ＨｕｍａｎｉｚｅｄおよびＤａｒａｔｕｍｕｍａｂである。

実施例１３ ５０Ｇ１２－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄの体内における薬物効果の評価
ヒトＲａｍｏｓリンパ腫細胞系ＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウス移植腫瘍モデルにおいて抗ＣＤ３８ヒト化抗体５０Ｇ１２－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄの体内抗腫瘍活性を検証した。具体的な方法は以下の通りである。

体外でＲａｍｏｓ細胞を培養し、回収後、細胞濃度が５×１０７個／ｍｌになるように調整し、尾静脈注射の方法により、２００μｌ／匹で細胞懸濁液を雌ＣＢ－１７ＳＣＩＤマウスの体内に接種し、移植腫瘍モデルを構築した。接種から７日目に、マウスをランダムに対照群、Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ治療群、Ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ治療群および５０Ｇ１２－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ治療群に１０匹／群で分けた。抗体の４０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与治療を開始し、週に２回、連続して３週間投与した。腫瘍担持マウスの生存時間を観察した。腫瘍担持マウスの片側後肢または両側後肢の完全麻痺、または体重の２０％超の減少、または重度の体調不良による自由な摂食・飲水不能を動物の人道主義的な終点とし、被験動物を安楽死させ、生存時間を記録した。

結果は図１０に示すように、対照群では、中位生存時間が２５日で、対照群と比べ、５０Ｇ１２－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄおよび陽性対照の抗体Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ、Ｉｓａｔｕｘｉｍａｂはいずれも顕著に被験動物の生存時間を延ばすことができ、中位生存時間がそれぞれ３８日、３５．５日および３８．５日であった。

Claims (22)

1. ヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
   （ａ）重鎖相補性決定領域である、アミノ酸配列が配列番号１で示されるＨ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号２で示されるＨ－ＣＤＲ２、アミノ酸配列が配列番号３で示されるＨ－ＣＤＲ３、ならびに
   （ｂ）軽鎖相補性決定領域である、アミノ酸配列が配列番号４で示されるＬ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号５で示されるＬ－ＣＤＲ２、アミノ酸配列が配列番号６で示されるＬ－ＣＤＲ３
   を含むことを特徴とする抗体またはその抗原結合断片。
2. 前記の抗体は、ネズミ由来抗体、キメラ抗体あるいはヒト化抗体であることを特徴とする請求項１に記載のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片。
3. 前記の抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片を含むことを特徴とする請求項１に記載のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片。
4. 前記のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７で示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８で示されることを特徴とする請求項１に記載のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片。
5. 前記のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９で示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０で示されることを特徴とする請求項１に記載のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片。
6. 前記のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖のアミノ酸配列は配列番号１１で示され、軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１２で示されることを特徴とする請求項１に記載のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片。
7. 請求項１－６のいずれかに記載のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片をコードすることを特徴とするヌクレオチド分子。
8. 重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１３で示され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１４で示されることを特徴とする請求項７に記載のヌクレオチド分子。
9. 重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１５で示され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１６で示されることを特徴とする請求項７に記載のヌクレオチド分子。
10. 重鎖をコードするヌクレオチド配列は配列番号１５で示され、軽鎖をコードするヌクレオチド配列は配列番号１６で示されることを特徴とする請求項７に記載のヌクレオチド分子。
11. 請求項７－１０のいずれかに記載のポリヌクレオチド分子を含有することを特徴とする発現ベクター。
12. 請求項１１に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
13. 請求項１－６のいずれかに記載のヒトＣＤ３８の抗体またはその抗原結合断片を製造する方法であって、
    ａ） 発現の条件において、請求項１２に記載の宿主細胞を培養することにより、前記のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片を発現させる工程、
    ｂ） 工程ａ）における前記のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片を分離して精製する工程
    を含むことを特徴とする方法。
14. 請求項１－６のいずれかに記載のヒトＣＤ３８と結合の抗体またはその抗原結合断片と薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする組成物。
15. 多発性骨髄腫、白血病、Ｂ細胞腫、自己免疫疾患を治療する薬物の製造における請求項１－６のいずれかに記載のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片あるいは請求項１４に記載の薬物組成物の使用。
16. 前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、免疫性血小板減少性紫斑病および重症筋無力症から選ばれる請求項１５に記載の使用。
17. ＣＡＲ構築物であって、前記ＣＡＲ構築物のモノクローナル抗体抗原結合領域のｓｃＦｖ断片はＣＤ３８と特異的に結合する結合領域で、かつ、
    前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域は、
    重鎖相補性決定領域である、アミノ酸配列が配列番号１で示されるＨ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号２で示されるＨ－ＣＤＲ２、アミノ酸配列が配列番号３で示されるＨ－ＣＤＲ３を含み、かつ
    前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は、
    軽鎖相補性決定領域である、アミノ酸配列が配列番号４で示されるＬ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号５で示されるＬ－ＣＤＲ２、アミノ酸配列が配列番号６で示されるＬ－ＣＤＲ３を含む
    ことを特徴とするＣＡＲ構築物。
18. 外来の請求項１７に記載のＣＡＲ構築物を発現することを特徴とする組み換え免疫細胞。
19. 以下の部分を含むことを特徴とする抗体薬物複合体：
    （ａ） 請求項１－６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含む抗体部分；ならびに
    （ｂ） 検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分とカップリングするカップリング部分。
20. 体外でサンプルにおけるＣＤ３８タンパク質を検出する方法であって、 （１） 前記サンプルを請求項１－６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片あるいは請求項１９に記載の抗体薬物複合体と接触させる工程、
    （２） 抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルにＣＤ３８タンパク質が存在することを意味する工程
    を含むことを特徴とする方法。
21. ＣＤ３８関連疾患を予防および／または治療する方法であって、必要な対象に請求項１－６のいずれかに記載のヒトＣＤ３８と結合する抗体またはその抗原結合断片、請求項１４に記載の組成物、請求項１９に記載の抗体－薬物複合体、または請求項１８に記載組み換え免疫細胞、あるいはこれらの組み合わせを施用する工程を含む方法。
22. 前記ＣＤ３８関連疾患は、多発性骨髄腫、白血病、Ｂ細胞腫、自己免疫疾患、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項２１に記載の方法。

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