JPWO2018212136A1 - 抗ｃｄｈ６抗体及び抗ｃｄｈ６抗体−薬物コンジュゲート - Google Patents

抗ｃｄｈ６抗体及び抗ｃｄｈ６抗体−薬物コンジュゲート Download PDF

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Abstract

本発明の課題は、ＣＤＨ６に結合する内在化活性を有する抗体、該抗体と抗腫瘍活性を有する薬物との抗体−薬物コンジュゲート、該抗体−薬物コンジュゲートを用いた腫瘍に対する治療効果を有する医薬品、及び、該抗体、該抗体−薬物コンジュゲート又は該医薬品を用いた腫瘍の治療方法等を提供することである。本発明により、内在化活性を有する抗ＣＤＨ６抗体、該抗体と抗腫瘍活性を有する薬物との抗体−薬物コンジュゲート、これらを用いる医薬品および腫瘍の治療方法が提供される。

Description

本発明は、ＣＤＨ６に結合し、内在化作用を有する抗ＣＤＨ６抗体、該抗ＣＤＨ６抗体の製造方法、ならびに該抗体を含む抗体−薬物コンジュゲート、該抗体−薬物コンジュゲートを含む抗腫瘍剤等に関する。
カドヘリン（Ｃａｄｈｅｒｉｎ）は、細胞膜表面に存在する糖タンパク質で、カルシウムイオン依存的にＮ末端側の細胞外ドメイン同士が結合することで、細胞間接着分子として、また細胞間相互作用を担うシグナル分子として機能する。カドヘリンスーパーファミリーの内、クラシックカドヘリンに分類される分子群は、５個の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ、ＥＣドメイン）と１個の膜貫通領域、及び細胞内ドメインから構成される１回膜貫通タンパク質である。クラシックカドヘリンはアミノ酸配列の相同性から、Ｅ−カドヘリンやＮ−カドヘリンに代表されるタイプＩファミリーと、タイプＩＩファミリーに分類される。
カドヘリン６（Ｃａｄｈｅｒｉｎ−６、ＣＤＨ６）は、タイプＩＩカドヘリンファミリーに分類される、７９０アミノ酸からなる１回膜貫通タンパク質であり、Ｎ末端側を細胞外、Ｃ末端側を細胞内に持つ。ヒトＣＤＨ６遺伝子は１９９５年に初めてクローニングされ（非特許文献１）、ＮＭ＿００４９３２、ＮＰ＿００４９２３（ＮＣＢＩ）等のアクセッション番号により参照可能である。
ＣＤＨ６は発生期において脳や腎臓で特異的に発現しており、中枢神経系の回路形成（非特許文献２、非特許文献３）や腎臓のネフロン発生時（非特許文献４、非特許文献５）に重要な役割を担うことが報告されている。成人の正常組織では、ＣＤＨ６の発現は腎尿細管や胆管上皮細胞などに限局されている。
一方で、成人のいくつかの癌種において、腫瘍部で特異的にＣＤＨ６の発現が亢進することが知られており、ヒト腎細胞癌、特に腎淡明細胞癌では、ＣＤＨ６発現と予後不良との相関や、腫瘍マーカーとしての利用可能性が報告されている（非特許文献６、非特許文献７）。ヒト卵巣癌でもＣＤＨ６の高発現が報告されている（非特許文献８）、ヒト甲状腺癌の上皮間葉変換と転移にＣＤＨ６が関与するとの報告もある（非特許文献９）。また、ＣＤＨ６は、ヒト胆管癌およびヒト小細胞肺癌でも発現していることが報告されている（非特許文献１２、１３）。
がんは死亡原因の上位を占め、その罹患数は人口の高齢化と共に増加することが予想されているが、未だ治療ニーズは充分に満たされていない。従来の化学療法剤は、その選択性の低さから腫瘍細胞だけでなく正常細胞に対しても傷害性を持つことによる副作用や、充分な薬剤量を投与できないことで薬剤の効果を充分に得ることが出来ないことが問題となっている。このため近年では、がん細胞に特徴的な変異や高発現を示す分子、細胞のがん化に関与する特定の分子を標的としたより選択性の高い分子標的薬や抗体医薬の開発が行われている。
抗体は血中安定性が高く、標的抗原に特異的に結合することから副作用の軽減が期待されており、がん細胞表面に高発現している分子に対する抗体医薬が多数開発されている。抗体の抗原特異的な結合能を利用した技術の一つとして、抗体−薬物コンジュゲート（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；ＡＤＣ）が挙げられる。ＡＤＣは、がん細胞表面に発現している抗原に結合し、その結合によって抗原を細胞内に内在化できる抗体に、細胞傷害活性を有する薬物を結合させたものである。ＡＤＣは、がん細胞に効率的に薬物を送達できることによって、がん細胞内に薬物を蓄積させ、がん細胞を死滅させることが期待できる（非特許文献１０、特許文献１及び２）。ＡＤＣとして例えば、抗ＣＤ３０モノクローナル抗体にモノメチルアウリスタチンＥを結合させたアドセトリス（商標）（ブレンツキシマブ ベドチン）がホジキンリンパ腫と未分化大細胞リンパ腫の治療薬として認可されている。また、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体にエムタンシンを結合させたカドサイラ（商標）（トラスツズマブ エムタンシン）がＨＥＲ２陽性の進行、再発乳癌の治療に用いられている。
抗腫瘍薬としてのＡＤＣに適した標的抗原の特徴としては、がん細胞表面で特異的に高発現し、正常細胞では低発現又は発現していないこと、細胞内に内在化できること、抗原が細胞表面から分泌されないことなどが挙げられる。また、ＡＤＣに適した抗体の重要な特徴としては、標的となる抗原に特異的に結合することに加えて、高い内在化能を有することが挙げられる。抗体の内在化能は標的抗原と抗体の両方の性質に依存するものであり、標的の分子構造から内在化に適した抗原結合部位を推定したり、抗体の結合強度や物性等から容易に内在化能の高い抗体を推測したりすることは困難である。このため、標的抗原に対して高い内在化能を有する抗体を取得することは、有効性の高いＡＤＣを開発する上で重要な課題となっている（非特許文献１１）。
ＣＤＨ６を標的としたＡＤＣとしては、ＣＤＨ６のＥＣドメイン５（ＥＣ５）に特異的に結合する抗ＣＤＨ６抗体にＤＭ４を結合させたＡＤＣが知られている（特許文献３）。
ＷＯ２０１４／０５７６８７ ＵＳ２０１６／０２９７８９０ ＷＯ２０１６／０２４１９５
Ｓｈｉｍｏｙａｍａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２０６−２２１１，５５，Ｍａｙ １５，１９９５ Ｉｎｏｕｅ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１８３−１９４，１９９７ Ｏｓｔｅｒｈｏｕｔ Ｊ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，６３２−６３９，７１，Ａｕｇ ２５，２０１１ Ｃｈｏ Ｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８０３−８１２，１２５，１９９８ Ｍａｈ Ｓ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３８−５３，２２３，２０００ Ｐａｕｌ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７４１−２７４８，Ｊｕｌｙ １，５７，１９９７ Ｓｈｉｍａｚｕｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，９６３−９６８，１０１（５），Ｓｅｐ．１，２００４ Ｋｏｅｂｅｌ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１７４９−１７６０，５（１２），ｅ２３２，Ｄｅｃ．２００８ Ｇｕｇｎｏｎｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，６６７−６７７，３６，２０１７ Ｐｏｌａｋｉｓ Ｐ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，３−１９，６８，２０１６ Ｐｅｔｅｒｓ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１−２０，３５，２０１５ Ｇｏｅｐｐｅｒｔ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，７８０−７９０，１１（１１），２０１６ Ｙｏｋｏｉ Ｓ, ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０７−２１６，１６１，１，２００２
本発明の課題は、ＣＤＨ６に対して特異的に結合する高い内在化活性を有する抗体、該抗体を含む高い抗腫瘍活性を有する抗体−薬物コンジュゲート、該抗体−薬物コンジュゲートを用いた腫瘍に対する治療効果を有する医薬品、及び、当該抗体、抗体−薬物コンジュゲート又は医薬品を用いた腫瘍の治療方法等を提供することである。
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討したところ、驚くべきことにＣＤＨ６の細胞外ドメイン３（本明細書中、ＥＣ３とも称する）に特異的に結合する抗体が、ＣＤＨ６を発現する細胞において極めて高い内在化活性を有しＡＤＣ抗体として有用であることを見出した。更に、当該抗ＣＤＨ６抗体に、細胞内で毒性を発揮する薬剤を特定の構造のリンカーを介して結合させた抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートは、従来のＣＤＨ６薬物複合体よりも強い抗腫瘍活性を示すことを見出した。
本願発明は以下の発明を包含する；
［１］配列番号４に記載のアミノ酸配列に特異的に結合し、細胞内に取り込まれる内在化能を有する、抗体又は当該抗体の機能性断片；
［２］配列番号４に記載のアミノ酸配列への結合に対して、以下の（１）〜（５）：
（１）配列番号５３の２１〜２３３番目に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号５６の２０〜４７１番目に記載のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
（２）配列番号６１の２１〜２３３番目に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号６９の２０〜４７１番目に記載のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
（３）配列番号６１の２１〜２３３番目に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３の２０〜４７１番目に記載のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
（４）配列番号６５の２１〜２３３番目に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３の２０〜４７１番目に記載のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、及び
（５）配列番号６１の２１〜２３３番目に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７７の２０〜４７１番目に記載のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
からなる群から選択される抗体のうち少なくともいずれか１つと競合阻害活性を有する［１］に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片；
［３］以下の（１）〜（４）：
（１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、
（２）配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、
（３）配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、及び
（４）配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号４３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、
からなる群から選択されるいずれか１つに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３、並びに、
以下の（５）〜（９）：
（５）配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
（６）配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
（７）配列番号３７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号３９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
（８）配列番号４７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号４８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、及び
（９）配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
からなる群から選択されるいずれか１つに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む、
［１］又は［２］のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片；
［４］以下の（１）〜（５）：
（１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、及び、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
（２）配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、及び、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
（３）配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、及び、配列番号３７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号３９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
（４）配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号４３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、及び、配列番号４７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号４８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、及び
（５）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、及び、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
からなる群から選択されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３、並びに、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む、
［１］〜［３］のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片；
［５］ヒト化されている［１］〜［４］のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片；
［６］以下の（１）〜（４）：
（１）配列番号６３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（２）配列番号６７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（３）（１）〜（２）のアミノ酸配列において各ＣＤＲ配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
（４）（１）〜（３）のアミノ酸配列において各ＣＤＲ配列以外のフレームワーク領域の配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
からなる群から選択されるいずれか１つに記載の軽鎖可変領域、並びに、
以下の（５）〜（９）：
（５）配列番号７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
（６）配列番号７５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
（７）配列番号７９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
（８）（５）〜（７）のアミノ酸配列において各ＣＤＲ配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、及び
（９）（５）〜（８）のアミノ酸配列において各ＣＤＲ配列以外のフレームワーク領域の配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
からなる群から選択されるいずれか１つに記載の重鎖可変領域、
を有する［１］〜［５］のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片；
［７］以下の（１）〜（４）：
（１）配列番号６３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
（２）配列番号６３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号７５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
（３）配列番号６７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号７５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、又は
（４）配列番号６３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号７９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
のいずれかの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域、
を含む［１］〜［６］のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片；
［８］以下の（１）〜（４）：
（１）配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号６９の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
（２）配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
（３）配列番号６５の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖、又は
（４）配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７７の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
のいずれかを有する［１］〜［７］のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片；
［９］配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号６９の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する［８］に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片；
［１０］配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する［８］に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片；
［１１］配列番号６５の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する［８］に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片；
［１２］配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７７の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する［８］に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片；
［１３］機能性断片がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びＦｖからなる群から選択される［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の抗体の機能性断片；
［１４］［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片をコードするポリヌクレオチド；
［１５］以下の（１）〜（５）：
（１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、及び、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、及び、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、
（３）配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、及び、配列番号３７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号３９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、
（４）配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号４３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、及び、配列番号４７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号４８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、並びに
（５）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、及び、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む［１４］に記載のポリヌクレオチド；
［１６］配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードするポリヌクレオチド及び配列番号６９の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む［１４］又は［１５］に記載のポリヌクレオチド；
［１７］配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードするポリヌクレオチド及び配列番号７３の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む［１４］又は［１５］に記載のポリヌクレオチド；
［１８］配列番号６５の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードするポリヌクレオチド及び配列番号７３の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む［１４］又は［１５］に記載のポリヌクレオチド；
［１９］配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードするポリヌクレオチド及び配列番号７７の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む［１４］又は［１５］に記載のポリヌクレオチド；
［２０］［１４］〜［１９］のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター；
［２１］［２０］に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞；
［２２］宿主細胞が真核細胞である［２１］に記載の宿主細胞；
［２３］［２１］又は［２２］に記載の宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体又は当該抗体の機能性断片を採取する工程を含むことを特徴とする当該抗体又は当該抗体の機能性断片の製造方法；
［２４］重鎖又は軽鎖が、Ｎ−結合への糖鎖付加、Ｏ−結合への糖鎖付加、Ｎ末のプロセッシング、Ｃ末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、Ｎ末にメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、Ｎ末グルタミンもしくはＮ末グルタミン酸のピログルタミン酸化、及びカルボキシル末端における１つ又は２つのアミノ酸欠失からなる群より選択される１又は２以上の修飾をうけた、［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片；
［２５］重鎖のカルボキシル末端において１つ又は２つのアミノ酸が欠失している［２４］に記載の抗体；
［２６］２本の重鎖の双方でカルボキシル末端において１つのアミノ酸が欠失している［２５］に記載の抗体；
［２７］重鎖のカルボキシル末端のプロリン残基が更にアミド化されている［２４］〜［２６］のいずれか１項に記載の抗体；
［２８］抗体依存性細胞傷害活性を増強させるために糖鎖修飾が調節されている［１］〜［１３］及び［２４］〜［２７］からなる群から選択されるいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片；
［２９］［１］〜［１３］及び［２４］〜［２８］からなる群から選択されるいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片に薬物が結合している抗体−薬物コンジュゲート；
［３０］薬物が抗腫瘍性化合物である、［２９］に記載の抗体−薬物コンジュゲート；
［３１］抗腫瘍性化合物が次式：
で示される抗腫瘍性化合物である［３０］に記載の抗体−薬物コンジュゲート；
［３２］抗体と薬物が、次式（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
（ｂ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
（ｃ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
（ｄ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
（ｅ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、及び
（ｆ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
からなる群から選択されるいずれかの構造のリンカーを介して結合している、［２９］〜［３１］のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
（ここで、抗体は、−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）の末端において結合する。抗腫瘍性化合物は、１位のアミノ基の窒素原子を結合部位として、（ａ）、（ｂ）、（ｅ）又は（ｆ）の−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−部分、（ｃ）のＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−部分又は（ｄ）のＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−部分のカルボニル基に結合する。上記式中ＧＧＦＧは、グリシン−グリシン−フェニルアラニン−グリシンからなるペプチド結合でつながっているアミノ酸配列を示す。
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−は次式：
で示される構造であり、このものの３位で抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含むリンカー構造内のメチレン基と結合する。）；
［３３］リンカーが以下の（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）からなる群から選択されるいずれかの式で示される［２９］〜［３２］のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート：
（ｃ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
（ｄ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
（ｅ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−；
［３４］リンカーが以下の（ｃ）又は（ｅ）の式で示される［２９］〜［３３］のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート：
（ｃ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
（ｅ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−；
［３５］
以下の式：
で示される構造を有する、［２９］〜［３４］のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート：
ここで、ＡＢは抗体又は該抗体の機能性断片を示す。ｎは抗体と結合している薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数を示す。抗体とリンカーは抗体由来のスルフヒドリル基を介して結合している；
［３６］以下の式：
で示される構造を有する、［２９］〜［３４］のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート：
ここで、ＡＢは抗体又は該抗体の機能性断片を示す。ｎは抗体と結合している薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数を示す。抗体とリンカーは抗体由来のスルフヒドリル基を介して結合している；
［３７］抗体が以下の（１）〜（４）：
（１）配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号６９の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
（２）配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
（３）配列番号６５の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖、又は
（４）配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７７の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
からなる群から選択されるいずれか１つに記載の軽鎖及び重鎖を含む抗体又は当該抗体の機能性断片である、［２９］〜［３６］のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート；
［３８］抗体が、配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号６９の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖を含む抗体又は当該抗体の機能性断片である、［３７］に記載の抗体−薬物コンジュゲート；
［３９］抗体が、配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７７の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖を含む抗体又は当該抗体の機能性断片である、［３７］に記載の抗体−薬物コンジュゲート；
［４０］重鎖又は軽鎖が、Ｎ−結合への糖鎖付加、Ｏ−結合への糖鎖付加、Ｎ末のプロセッシング、Ｃ末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、Ｎ末にメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、Ｎ末グルタミンもしくはＮ末グルタミン酸のピログルタミン酸化及びカルボキシル末端における１つ又は２つのアミノ酸欠失からなる群から選択される１又は２以上の修飾をうけた、［２９］〜［３９］のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート；
［４１］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が１〜１０個の範囲である［２９］〜［４０］のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート；
［４２］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が２〜８個の範囲である［４１］に記載の抗体−薬物コンジュゲート；
［４３］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が５〜８個の範囲である［４２］に記載の抗体−薬物コンジュゲート；
［４４］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が７〜８個である［４３］に記載の抗体−薬物コンジュゲート；
［４５］［２９］〜［４４］のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を含むことを特徴とする医薬組成物；
［４６］抗腫瘍薬であることを特徴とする、［４５］に記載の医薬組成物；
［４７］腫瘍がＣＤＨ６を発現する腫瘍であることを特徴とする、［４６］に記載の医薬組成物；
［４８］腫瘍が、腎細胞癌、腎淡明細胞癌、乳頭状腎細胞癌、卵巣癌、卵巣漿液性腺癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌、小細胞肺癌、神経膠芽腫、中皮腫、子宮癌、膵臓癌、ウィルムス腫瘍又は神経芽腫であることを特徴とする、［４６］又は［４７］に記載の医薬組成物；
［４９］［２９］〜［４４］のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物から選択されるいずれかを個体に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法；
［５０］腫瘍がＣＤＨ６が発現している腫瘍であることを特徴とする、［４９］に記載の治療方法；
［５１］腫瘍が、腎細胞癌、腎淡明細胞癌、乳頭状腎細胞癌、卵巣癌、卵巣漿液性腺癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌、小細胞肺癌、神経膠芽腫、中皮腫、子宮癌、膵臓癌、ウィルムス腫瘍又は神経芽腫であることを特徴とする、［４９］又は［５０］に記載の治療方法；
［５２］［２９］〜［４４］のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物から選択される少なくとも一つを含む医薬組成物及び少なくとも一つの抗腫瘍薬を、同時に、別々に又は連続して個体に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法；
［５３］［１］〜［１３］及び［２４］〜［２８］からなる群から選択されるいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片或いは［２３］に記載の製造方法で得られる抗体又は当該抗体の機能性断片と、薬物−リンカー中間化合物を反応させる工程を含むことを特徴とする、抗体−薬物コンジュゲートの製造方法；又は
［５４］［２１］又は［２２］に記載の宿主細胞を培養する工程、当該工程で得られた培養物から目的の抗体又は当該抗体の機能性断片を採取する工程、及び当該工程で得られた抗体又は当該抗体の機能性断片と薬物−リンカー中間化合物を反応させる工程を含むことを特徴とする、抗体−薬物コンジュゲートの製造方法。
本発明の抗ＣＤＨ６抗体は、ＣＤＨ６のＥＣドメイン３（ＥＣ３）を特異的に認識し、高い内在化活性を有することを特徴とする。本発明の抗ＣＤＨ６抗体に、細胞内で毒性を発揮する薬剤を特定の構造のリンカーを介して結合させた抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートは、ＣＤＨ６を発現するがん細胞を有する患者に投与することによって、優れた抗腫瘍効果及び安全性を達成することが期待できる。即ち、本発明の抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートは、抗腫瘍剤として有用である。
図１は、ラット抗ＣＤＨ６モノクローナル抗体４種（クローン番号は、ｒＧ０１９、ｒＧ０５５、ｒＧ０５６及びｒＧ０６１）又はラットＩｇＧコントロールの、コントロール細胞又はｈＣＤＨ６導入２９３Ｔ細胞に対する結合を調べたフローサイトメトリーの結果を示す。横軸は抗体結合量を表すＦＩＴＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。 図２−１は、ラット抗ＣＤＨ６モノクローナル抗体４種（ｒＧ０１９、ｒＧ０５５、ｒＧ０５６及びｒＧ０６１）又は陰性コントロール抗体ＲａｔＩｇＧ２ｂの、コントロール細胞又は全長ｈＣＤＨ６導入２９３細胞に対する結合性を示す。横軸は抗体結合量を表すＦＩＴＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。 図２−２は、ラット抗ＣＤＨ６モノクローナル抗体４種（ｒＧ０１９、ｒＧ０５５、ｒＧ０５６及びｒＧ０６１）又はラットＩｇＧコントロールの、コントロール細胞又はＥＣ１欠失ｈＣＤＨ６導入２９３細胞に対する結合性を示す。横軸は抗体結合量を表すＦＩＴＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。 図２−３は、ラット抗ＣＤＨ６モノクローナル抗体４種（ｒＧ０１９、ｒＧ０５５、ｒＧ０５６及びｒＧ０６１）又はラットＩｇＧコントロールの、コントロール細胞又はＥＣ２欠失ｈＣＤＨ６導入２９３細胞に対する結合性を示す。横軸は抗体結合量を表すＦＩＴＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。 図２−４は、ラット抗ＣＤＨ６モノクローナル抗体４種（ｒＧ０１９、ｒＧ０５５、ｒＧ０５６及びｒＧ０６１）又はラットＩｇＧコントロールの、コントロール細胞又はＥＣ３欠失ｈＣＤＨ６導入２９３細胞に対する結合性を示す。横軸は抗体結合量を表すＦＩＴＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。 図２−５は、ラット抗ＣＤＨ６モノクローナル抗体４種（ｒＧ０１９、ｒＧ０５５、ｒＧ０５６及びｒＧ０６１）又はラットＩｇＧコントロールの、コントロール細胞又はＥＣ４欠失ｈＣＤＨ６導入２９３細胞に対する結合性を示す。横軸は抗体結合量を表すＦＩＴＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。 図２−６は、ラット抗ＣＤＨ６モノクローナル抗体４種（ｒＧ０１９、ｒＧ０５５、ｒＧ０５６及びｒＧ０６１）又はラットＩｇＧコントロールの、コントロール細胞又はＥＣ５欠失ｈＣＤＨ６導入２９３細胞に対する結合性を示す。横軸は抗体結合量を表すＦＩＴＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。 図３は、４種類のヒト腫瘍細胞株（ヒト卵巣腫瘍細胞株ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３，ＰＡ−１，ＥＳ−２及びヒト腎細胞腫瘍細胞株７８６−Ｏ）の細胞膜表面でのＣＤＨ６の発現を評価したフローサイトメトリーの結果を示す。横軸は抗体結合量を表すＦＩＴＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。 図４は、４種類のラット抗ＣＤＨ６抗体（ｒＧ０１９、ｒＧ０５５、ｒＧ０５６及びｒＧ０６１）又はラットＩｇＧコントロールの内在化活性を、タンパク質合成を阻害する毒素（サポリン）を結合させた抗ラットＩｇＧ試薬Ｒａｔ−ＺＡＰ又は陰性コントロールとして毒素を結合していないＧｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｒａｔ ＩｇＧ，Ｆｃ（ｇａｍｍａ） Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃを用いて、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３細胞及び７８６−Ｏ細胞において評価したグラフを示す。グラフの縦軸は、ＡＴＰ活性（ＲＬＵ）を示す。各グラフの下に、Ｒａｔ−ＺＡＰの代わりに陰性コントロールを添加したウェルの生存細胞数を１００％とした相対生存率として算出された細胞生存率（％）を示す。 図５は、ヒトキメラ抗ＣＤＨ６抗体ｃｈＧ０１９のヒトＣＤＨ６及びサルＣＤＨ６に対する結合を示す。横軸は抗体濃度を示し、縦軸は結合量をＭｅａｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（平均蛍光強度）で示す。 図６−１及び図６−２は、ヒト化ｈＧ０１９抗体４種（Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３及びＨ０４Ｌ０２）又は陰性コントロール抗体ヒトＩｇＧ１の、ヒトＣＤＨ６、サルＣＤＨ６、マウスＣＤＨ６、ラットＣＤＨ６に対する結合性を示す。横軸は抗体濃度を示し、縦軸は結合量をＭｅａｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（平均蛍光強度）で示す。 図６−１及び図６−２は、ヒト化ｈＧ０１９抗体４種（Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３及びＨ０４Ｌ０２）又は陰性コントロール抗体ヒトＩｇＧ１の、ヒトＣＤＨ６、サルＣＤＨ６、マウスＣＤＨ６、ラットＣＤＨ６に対する結合性を示す。横軸は抗体濃度を示し、縦軸は結合量をＭｅａｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（平均蛍光強度）で示す。 図７−１は、ヒト化ｈＧ０１９抗体４種（Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３及びＨ０４Ｌ０２）、抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２又は陰性コントロール抗体ｈＩｇＧ１の、コントロール細胞又は全長ｈＣＤＨ６導入２９３α細胞に対する結合性を示す。横軸は抗体結合量を表すＡＰＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。 図７−２は、ヒト化ｈＧ０１９抗体４種（Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３及びＨ０４Ｌ０２）、抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２又は陰性コントロール抗体ｈＩｇＧ１の、コントロール細胞又はＥＣ１欠失ｈＣＤＨ６導入２９３α細胞に対する結合性を示す。横軸は抗体結合量を表すＡＰＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。 図７−３は、ヒト化ｈＧ０１９抗体４種（Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３及びＨ０４Ｌ０２）、抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２又は陰性コントロール抗体ｈＩｇＧ１の、コントロール細胞又はＥＣ２欠失ｈＣＤＨ６導入２９３α細胞に対する結合性を示す。横軸は抗体結合量を表すＡＰＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。 図７−４は、ヒト化ｈＧ０１９抗体４種（Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３及びＨ０４Ｌ０２）、抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２又は陰性コントロール抗体ｈＩｇＧ１の、コントロール細胞又はＥＣ３欠失ｈＣＤＨ６導入２９３α細胞に対する結合性を示す。横軸は抗体結合量を表すＡＰＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。 図７−５は、ヒト化ｈＧ０１９抗体４種（Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３及びＨ０４Ｌ０２）、抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２又は陰性コントロールのｈＩｇＧ１の、コントロール細胞又はＥＣ４欠失ｈＣＤＨ６導入２９３α細胞に対する結合性を示す。横軸は抗体結合量を表すＡＰＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。 図７−６は、ヒト化ｈＧ０１９抗体４種（Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３及びＨ０４Ｌ０２）、抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２又は陰性コントロールのｈＩｇＧ１の、コントロール細胞又はＥＣ５欠失ｈＣＤＨ６導入２９３α細胞に対する結合性を示す。横軸は抗体結合量を表すＡＰＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。 図８は、７８６−Ｏ／ｈＣＤＨ６安定発現細胞株及び親細胞株７８６−ＯにおけるヒトＣＤＨ６の発現を調べたフローサイトメトリーの結果を示す。横軸は抗体結合量を表すＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７の蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。 図９は、（ａ）ラベル化ＮＯＶ０７１２又は（ｂ）ラベル化Ｈ０１Ｌ０２を用いた、ラベル化していないヒト化ｈＧ０１９抗体４種（Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３及びＨ０４Ｌ０２）、抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２又は陰性コントロールのｈＩｇＧ１との結合競合アッセイを示す。横軸はラベル化していない抗体の添加時の終濃度を示し、縦軸は結合量をＭｅａｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（平均蛍光強度）で示す。 図１０−１は、ヒト化ｈＧ０１９抗体４種（Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３及びＨ０４Ｌ０２）、抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２及び陰性コントロール抗体の内在化活性を、タンパク質合成を阻害する毒素（サポリン）を結合させた抗ヒトＩｇＧ試薬Ｈｕｍ−ＺＡＰ又は陰性コントロールとして毒素を結合していないＦ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃ（ｇａｍｍａ） Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃを用いて、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３細胞において評価したグラフを示す。グラフの縦軸は、ＡＴＰ活性（ＲＬＵ）を示す。各グラフの下に、Ｈｕｍ−ＺＡＰの代わりに陰性コントロールを添加したウェルの生存細胞数を１００％とした相対生存率として算出された細胞生存率（％）を示す。 図１０−２は、ヒト化ｈＧ０１９抗体４種（Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３及びＨ０４Ｌ０２）、抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２及び陰性コントロール抗体の内在化活性を、タンパク質合成を阻害する毒素（サポリン）を結合させた抗ヒトＩｇＧ試薬Ｈｕｍ−ＺＡＰ又は陰性コントロールとして毒素を結合していないＦ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃ（ｇａｍｍａ） Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃを用いて、７８６−Ｏ細胞において評価したグラフを示す。グラフの縦軸は、ＡＴＰ活性（ＲＬＵ）を示す。各グラフの下に、Ｈｕｍ−ＺＡＰの代わりに陰性コントロールを添加したウェルの生存細胞数を１００％とした相対生存率として算出された細胞生存率（％）を示す。 図１０−３は、ヒト化ｈＧ０１９抗体４種（Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３及びＨ０４Ｌ０２）、抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２及び陰性コントロール抗体の内在化活性を、タンパク質合成を阻害する毒素（サポリン）を結合させた抗ヒトＩｇＧ試薬Ｈｕｍ−ＺＡＰ又は陰性コントロールとして毒素を結合していないＦ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃ（ｇａｍｍａ） Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃを用いて、ＰＡ−１細胞において評価したグラフを示す。グラフの縦軸は、ＡＴＰ活性（ＲＬＵ）を示す。各グラフの下に、Ｈｕｍ−ＺＡＰの代わりに陰性コントロールを添加したウェルの生存細胞数を１００％とした相対生存率として算出された細胞生存率（％）を示す。 図１１は、ヒト化ｈＧ０１９−薬物コンジュゲート４種（Ｈ０１Ｌ０２−ＤＸｄ、Ｈ０２Ｌ０２−ＤＸｄ、Ｈ０２Ｌ０３−ＤＸｄ及びＨ０４Ｌ０２−ＤＸｄ）、又はＮＯＶ０７１２−ＤＭ４のＰＡ−１細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制活性評価を示す。横軸は抗体−薬物コンジュゲートの濃度を示し、縦軸は細胞生存率（％）を示す。 図１２は、ヒト化ｈＧ０１９−薬物コンジュゲート４種（Ｈ０１Ｌ０２−ＤＸｄ、Ｈ０２Ｌ０２−ＤＸｄ、Ｈ０２Ｌ０３−ＤＸｄ及びＨ０４Ｌ０２−ＤＸｄ）、又はＮＯＶ０７１２−ＤＭ４のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。ＣＤＨ６陽性ヒト腎細胞腫瘍細胞株７８６−Ｏを免疫不全マウスに移植した動物モデルを用いて評価した。横軸は日数、縦軸は腫瘍体積、誤差範囲は標準誤差（ＳＥ）値を示す。 図１３は、ヒト化ｈＧ０１９−薬物コンジュゲートＨ０１Ｌ０２−ＤＸｄ又はＮＯＶ０７１２−ＤＭ４又はＮＯＶ０７１２−ＤＸｄのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。ＣＤＨ６陽性ヒト卵巣腫瘍細胞株ＰＡ−１を免疫不全マウスに移植した動物モデルを用いて評価した。横軸は日数、縦軸は腫瘍体積、誤差範囲はＳＥ値を示す。 図１４は、ヒト化ｈＧ０１９−薬物コンジュゲートＨ０１Ｌ０２−ＤＸｄ又はＮＯＶ０７１２−ＤＭ４のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。ＣＤＨ６陽性ヒト卵巣腫瘍細胞株ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３を免疫不全マウスに移植した動物モデルを用いて評価した。横軸は日数、縦軸は腫瘍体積、誤差範囲はＳＥ値を示す。 図１５は、ヒト化ｈＧ０１９−薬物コンジュゲートＨ０１Ｌ０２−ＤＸｄ又はＮＯＶ０７１２−ＤＭ４のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。ＣＤＨ６陽性ヒト腎細胞腫瘍細胞株７８６−Ｏを免疫不全マウスに移植した動物モデルを用いて評価した。横軸は日数、縦軸は腫瘍体積、誤差範囲はＳＥ値を示す。 図１６は、ヒト化ｈＧ０１９−薬物コンジュゲートＨ０１Ｌ０２−ＤＸｄ又はＮＯＶ０７１２−ＤＭ４のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。ＣＤＨ６陰性ヒト卵巣腫瘍細胞株ＥＳ−２を免疫不全マウスに移植した動物モデルを用いて評価した。横軸は日数、縦軸は腫瘍体積、誤差範囲はＳＥ値を示す。
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
本明細書中、「がん」と「腫瘍」は同じ意味に用いられる。
本明細書中、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びそのｃＲＮＡも含まれる。
本明細書中、「ポリヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」は、核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれる。本明細書中、「ポリヌクレオチド」と「ヌクレオチド」は、特に指定されない限り、交換可能に使用され得る。
本明細書中、「ポリペプチド」と「タンパク質」は交換可能に使用され得る。
本明細書中、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含む。
本明細書中、「ＣＤＨ６」は、ＣＤＨ６タンパク質と同じ意味で使用され得る。本明細書中、ヒトＣＤＨ６を「ｈＣＤＨ６」と記載する場合がある。
本明細書中、「細胞傷害活性」とは、何らかの形で、細胞に病理的な変化を引き起こすことをいい、直接的な外傷にとどまらず、ＤＮＡの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置の損傷、各種酵素活性の低下などあらゆる細胞の構造や機能上の損傷を引き起こすことをいう。
本明細書中、「細胞内で毒性を発揮する」とは、何らかの形で、細胞内で毒性を示すことをいい、直接的な外傷にとどまらず、ＤＮＡの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置の損傷、各種酵素活性の低下、細胞増殖因子の作用の抑制などあらゆる細胞の構造や機能、代謝に影響をもたらすことをいう。
本明細書中、「抗体の機能性断片」とは、「抗体の抗原結合断片」とも呼ばれ、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、線状抗体及び抗体断片より形成された多特異性抗体等を含む。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の抗原結合断片に含まれる。但し、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また、これらの抗原結合断片には、抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。
本明細書中、「エピトープ」とは、特定の抗ＣＤＨ６抗体の結合するＣＤＨ６の部分ペプチド又は部分立体構造を意味する。前記のＣＤＨ６の部分ペプチドであるエピトープは免疫アッセイ法等当業者にはよく知られている方法によって、決定することができる。まず、抗原の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴヌクレオチド合成技術を用いることができる。例えば、ＣＤＨ６のＣ末端又はＮ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組み換え技術を用いて作製した後、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、更に短いペプチドを合成してそれらのペプチドとの反応性を検討することによって、エピトープを決定することができる。また、複数の細胞外ドメインからなる膜タンパク質に結合する抗体が、複数のドメインからなる立体構造をエピトープとしている場合は、特定の細胞外ドメインのアミノ酸配列を改変することによって、立体構造を改変することによってどのドメインと結合するかを決定することができる。特定の抗体の結合する抗原の部分立体構造であるエピトープは、Ｘ線構造解析によって抗体と隣接する抗原のアミノ酸残基を特定することによっても決定することができる。
本明細書中、「同一のエピトープに結合する」とは、共通のエピトープに結合する抗体を意味している。第一の抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に第二の抗体が結合すれば、第一の抗体と第二の抗体が同一のエピトープに結合すると判定することができる。あるいは、第一の抗体の抗原に対する結合に第二の抗体が競合する（即ち、第二の抗体が第一の抗体と抗原の結合を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、第一の抗体と第二の抗体の同一のエピトープに結合すると判定することができる。本明細書中、「同一のエピトープに結合する」とは、第一の抗体と第二の抗体が、当該判定方法のいずれか一方又は両方により、共通のエピトープに結合すると判定された場合をいう。第一の抗体と第二の抗体が同一のエピトープに結合し、かつ第一の抗体が抗腫瘍活性や内在化活性等の特殊な効果を有する場合、第二の抗体も同様の活性を有することが期待できる。
本明細書中、「ＣＤＲ」とは、相補性決定領域（ＣＤＲ；Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ）を意味する。抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所のＣＤＲがあることが知られている。ＣＤＲは、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、それぞれ３ヶ所に分離している。本明細書中においては、抗体のＣＤＲについて、重鎖のＣＤＲを重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖のＣＤＲを軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社）中、６８℃でハイブリダイズすること、又はＤＮＡを固定したフィルターを用いて０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することによって同定することができる条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
本明細書中、「１〜数個」とは、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個又は１〜２個を意味する。
１．ＣＤＨ６
カドヘリンは、細胞膜表面に存在する糖タンパク質で、カルシウムイオン依存的にＮ末端側の細胞外ドメイン同士が結合することで、細胞間接着分子として、また細胞間相互作用を担うシグナル分子として機能する。カドヘリンスーパーファミリーの内、クラシックカドヘリンに分類される分子群は、細胞外に５個の細胞外ドメイン（ＥＣドメイン）と１個の膜貫通領域、及び細胞内ドメインから構成される１回膜貫通タンパク質である。
ＣＤＨ６（Ｃａｄｈｅｒｉｎ−６） は、タイプIIカドヘリンファミリーに分類される、７９０アミノ酸からなる１回膜貫通タンパク質であり、Ｎ末端側を細胞外、Ｃ末端側を細胞内に持つ。ヒトＣＤＨ６遺伝子は１９９５年に初めてクローニングされ（非特許文献１）、ＮＭ＿００４９３２、ＮＰ＿００４９２３（ＮＣＢＩ）等のアクセッション番号により参照可能である。
本発明で用いるＣＤＨ６タンパク質は、ヒト、非ヒト哺乳動物（ラット、マウス、サル等）のＣＤＨ６発現細胞から直接精製して使用するか、あるいは当該細胞の細胞膜画分を調製して使用することができ、また、ＣＤＨ６をｉｎ ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作によって宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、ＣＤＨ６ ｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＣＤＨ６を発現させることによって、該タンパク質を得ることが出来る。また、前記の遺伝子操作によるＣＤＨ６発現細胞、あるいはＣＤＨ６を発現している細胞株をＣＤＨ６タンパク質として使用することも可能である。また、ＣＤＨ６のｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを直接被免疫動物に投与し被免疫動物の体内でＣＤＨ６を発現させることもできる。
また、上記ＣＤＨ６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、当該タンパク質と同等の生物活性を有するタンパク質もＣＤＨ６に含まれる。
ヒトＣＤＨ６タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。ヒトＣＤＨ６タンパク質の細胞外領域は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の５４〜１５９番目のアミノ酸配列を有する細胞外ドメイン１（本明細書中、ＥＣ１とも称する）、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１６０〜２６８番目のアミノ酸配列を有する細胞外ドメイン２（本明細書中、ＥＣ２とも称する。）、配列番号１に記載のアミノ酸配列の２６９〜３８３番目のアミノ酸配列を有する細胞外ドメイン３（本明細書中、ＥＣ３とも称する。）、配列番号１に記載のアミノ酸配列の３８４〜４８６番目のアミノ酸配列を有する細胞外ドメイン４（本明細書中、ＥＣ４とも称する。）、及び配列番号１に記載のアミノ酸配列の４８７〜６０８番目のアミノ酸配列を有する細胞外ドメイン５（本明細書中、ＥＣ５とも称する。）から構成される。ＥＣ１〜ＥＣ５のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２〜６とする（表１）。
２．抗ＣＤＨ６抗体の製造
本発明の抗ＣＤＨ６抗体の一例として、配列番号４に示すアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を認識し、かつ内在化活性を有する抗ＣＤＨ６抗体を挙げることができる。本発明の抗ＣＤＨ６抗体の一例として、配列番号４に示すアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を特異的に認識し、かつ内在化活性を有する抗ＣＤＨ６抗体を挙げることができる。本発明の抗ＣＤＨ６抗体の一例として、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を認識し、かつ内在化活性を有する抗ＣＤＨ６抗体を挙げることができる。本発明の抗ＣＤＨ６抗体の一例として、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を特異的に認識し、かつ内在化活性を有する抗ＣＤＨ６抗体を挙げることができる。抗体が「配列番号４に示すアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を特異的に認識」する又は「ＥＣ３ドメインを特異的に認識」するとは、抗体が、ＣＤＨ６のＥＣ３ドメインをＣＤＨ６の他の細胞外ドメインと比較して強く認識する又は強く結合することをいう。
本発明の抗ＣＤＨ６抗体は、いずれの種に由来してもよいが、好ましくは、ヒト、サル、ラット、マウス又はウサギを例示できる。ヒト以外の種に由来する場合は、周知の技術を用いて、キメラ化又はヒト化することが好ましい。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
本発明の抗ＣＤＨ６抗体は腫瘍細胞を標的にできる抗体であり、すなわち腫瘍細胞を認識できる特性、腫瘍細胞に結合できる特性、及び／又は腫瘍細胞内に取り込まれて内在化する特性等を備えている。したがって、本発明の抗ＣＤＨ６抗体と抗腫瘍活性を有する化合物を、リンカーを介して結合させて抗体−薬物コンジュゲートとすることができる。
抗体の腫瘍細胞への結合性は、フローサイトメトリーを用いて確認できる。腫瘍細胞内への抗体の取り込みは、（１）治療抗体に結合する二次抗体（蛍光標識）を用いて細胞内に取り込まれた抗体を蛍光顕微鏡で可視化するアッセイ（Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２００８，１５，７５１−７６１）、（２）治療抗体に結合する二次抗体（蛍光標識）を用いて細胞内に取り込まれた蛍光量を測定するアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｖｏｌ．１５，５２６８−５２８２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００４）又は（３）治療抗体に結合するイムノトキシンを用いて、細胞内に取り込まれると毒素が放出されて細胞増殖が抑制されるというＭａｂ−ＺＡＰアッセイ（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２８：１６２−１６５，Ｊａｎｕａｒｙ ２０００）を用いて確認できる。イムノトキシンとしては、ジフテテリア毒素の触媒領域とプロテインＧとのリコンビナント複合タンパク質タンパク質も使用可能である。
本明細書で言う「高い内在化能」とは、当該抗体とサポリン標識抗ラットＩｇＧ抗体を投与したＣＤＨ６発現細胞の生存率（抗体未添加時の細胞生存率を１００％とした相対率で表したもの）が、好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下であることを意味する。
抗体−薬物コンジュゲートは抗腫瘍効果を発揮する化合物を結合させてあるので、抗体自体が抗腫瘍効果を有することは、好ましいが、必須ではない。抗腫瘍性化合物の細胞傷害性を腫瘍細胞において特異的及び／又は選択的に発揮させる目的からは、抗体が内在化して腫瘍細胞内に移行する性質のあることが重要であり、好ましい。
抗ＣＤＨ６抗体は、この分野で通常実施される方法を用いて、抗原となるポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができるが、好ましくは、立体構造を保持したＣＤＨ６を抗原として用いることが好ましい。そのような方法として、ＤＮＡ免疫法を挙げることができる。
抗原の由来はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来する抗原を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種抗原に結合する抗体とヒト抗原との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，４９５−４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，３６５−３６７，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによってハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
以下、具体的にＣＤＨ６に対する抗体の取得方法を説明する。
（１）抗原の調製
抗原は抗原タンパク質をコードする遺伝子を遺伝子操作によって宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、抗原遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現した抗原を精製すればよい。上記の遺伝子操作による抗原発現細胞、あるいは抗原を発現している細胞株を動物に免疫する方法を用いることによっても抗体を取得できる。
また、抗原タンパク質を用いずに、抗原タンパク質のｃＤＮＡを発現ベクターに組み込んで被免疫動物に投与し、被免疫動物の体内で抗原タンパク質を発現させ、抗原タンパク質に対する抗体を産生させることによっても抗体を取得することができる。
（２）抗ＣＤＨ６モノクローナル抗体の製造
本発明で使用される抗ＣＤＨ６抗体は、特に制限はないが、例えば、本願の配列表で示されたアミノ酸配列で特定される抗体を好適に使用することができる。本発明において使用される抗ＣＤＨ６抗体としては、以下の特性を有するものが望ましい。
（１）以下の特性を有することを特徴とする抗体；
（ａ）ＣＤＨ６に特異的に結合する
（ｂ）ＣＤＨ６と結合することによってＣＤＨ６発現細胞に内在化する活性を有する
（２）ＣＤＨ６がヒトＣＤＨ６である上記（１）に記載の抗体又は当該抗体。
（３）ヒトＣＤＨ６のＥＣ３を特異的に認識し、かつ内在化活性を有する
本発明のＣＤＨ６に対する抗体の取得方法は、抗ＣＤＨ６抗体を取得できる限りにおいて、特に制限されないが、高次構造を保持したＣＤＨ６を抗原として用いることが好ましい。
好ましい抗体の取得方法の一例としてＤＮＡ免疫法を挙げることができる。ＤＮＡ免疫法とは、抗原発現プラスミドをマウスやラットなどの動物個体に遺伝子導入し、抗原を個体内で発現させることによって、抗原に対する免疫を誘導する手法である。遺伝子導入の手法には、直接プラスミドを筋肉に注射する方法や、リポソームやポリエチレンイミンなどの導入試薬を静脈注射する方法、ウイルスベクターを用いる手法、プラスミドを付着させた金粒子をＧｅｎｅ Ｇｕｎにより射ち込む手法、急速に大量のプラスミド溶液を静脈注射するＨｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ法などが存在する。発現プラスミドの筋注による遺伝子導入法に関して、発現量を向上させる手法として、プラスミドを筋注後、同部位にエレクトロポレーションを加えるｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎという技術が知られている（Ａｉｈａｒａ Ｈ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｊ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８ Ｓｅｐ；１６（９）：８６７−７０又はＭｉｒ ＬＭ，Ｂｕｒｅａｕ ＭＦ，Ｇｅｈｌ Ｊ，Ｒａｎｇａｒａ Ｒ，Ｒｏｕｙ Ｄ，Ｃａｉｌｌａｕｄ ＪＭ，Ｄｅｌａｅｒｅ Ｐ，Ｂｒａｎｅｌｌｅｃ Ｄ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｂ，Ｓｃｈｅｒｍａｎ Ｄ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９９ Ａｐｒ １３；９６（８）：４２６２−７．）。本手法はプラスミドの筋注前にヒアルロニダーゼで筋肉を処理することにより、さらに発現量が向上する（ＭｃＭａｈｏｎ ＪＭ１， Ｓｉｇｎｏｒｉ Ｅ，Ｗｅｌｌｓ ＫＥ，Ｆａｚｉｏ ＶＭ，Ｗｅｌｌｓ ＤＪ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００１ Ａｕｇ；８（１６）：１２６４−７０）。また、ハイブリドーマの作製は公知の方法によって行うことができ、例えば、Ｈｙｂｒｉｍｕｎｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて行うこともできる。
具体的なモノクローナル抗体取得の例としては、以下を挙げることができる。
（ａ）ＣＤＨ６のｃＤＮＡを発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に組み込み、エレクトロポレーションや遺伝子銃等の方法によって、そのベクターを直接被免疫動物（例えば、ラットやマウス）に投与することによって、動物体内においてＣＤＨ６を発現させることによって、免疫反応を誘起させることができる。エレクトロポレーション等によるベクターの投与は抗体価を上げるために必要であれば、１回でも複数回でもよく、好ましくは複数回である；
（ｂ）免疫反応を誘起された上述の動物より、抗体産生細胞を含む組織（例えばリンパ節）を採取する；
（ｃ）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）（例えば、マウスミエローマＳＰ２／０−ａｇ１４細胞）の調製；
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合；
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別；
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）；
（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育；及び／又は
（ｈ）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性（内在化活性）、及びその結合特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定。
ここで用いられる抗体価の測定法としては、例えば、フローサイトメトリー又はＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法を挙げることができるがこれらの方法に制限されない。
このようにして樹立されたハイブリドーマ株の例としては、抗ＣＤＨ６抗体産生ハイブリドーマｒＧ０１９、ｒＧ０５５、ｒＧ０５６及びｒＧ０６１を挙げることができる。なお、本明細書中においては、抗ＣＤＨ６抗体産生ハイブリドーマｒＧ０１９が産生する抗体を、「ｒＧ０１９抗体」又は単に「ｒＧ０１９」と記載し、ハイブリドーマｒＧ０５５が産生する抗体を、「ｒＧ０５５抗体」又は単に「ｒＧ０５５」と記載し、ハイブリドーマｒＧ０５６が産生する抗体を、「ｒＧ０５６抗体」又は単に「ｒＧ０５６」と記載し、ハイブリドーマｒＧ０６１が産生する抗体を、「ｒＧ０６１抗体」又は単に「ｒＧ０６１」とする。
ｒＧ０１９抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる。該ｒＧ０１９抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列でコードされる。ｒＧ０１９抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する。ｒＧ０１９抗体の重鎖可変領域は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる。該ｒＧ０１９抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１６に示されるヌクレオチド配列でコードされる。ｒＧ０１９抗体の重鎖可変領域は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する。ｒＧ０１９抗体の配列を表１に示す。
ｒＧ０５５抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなる。該ｒＧ０５５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２１に示されるヌクレオチド配列でコードされる。ｒＧ０５５抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する。ｒＧ０５５抗体の重鎖可変領域は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる。該ｒＧ０５５抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２６に示されるヌクレオチド配列でコードされる。ｒＧ０５５抗体の重鎖可変領域は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号２９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する。ｒＧ０５５抗体の配列を表１に示す。
ｒＧ０５６抗体の軽鎖可変領域は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなる。該ｒＧ０５６抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３１に示されるヌクレオチド配列でコードされる。ｒＧ０５６抗体の軽鎖可変領域は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する。ｒＧ０５６抗体の重鎖可変領域は、配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなる。該ｒＧ０５６抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列でコードされる。ｒＧ０５６抗体の重鎖可変領域は、配列番号３７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する。ｒＧ０５６抗体の配列を表１に示す。
ｒＧ０６１抗体の軽鎖可変領域は、配列番号４０に示されるアミノ酸配列からなる。該ｒＧ０６１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４１に示されるヌクレオチド配列でコードされる。ｒＧ０６１抗体の軽鎖可変領域は、配列番号４２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号４３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号４４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する。ｒＧ０６１抗体の重鎖可変領域は、配列番号４５に示されるアミノ酸配列からなる。該ｒＧ０６１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４６に示されるヌクレオチド配列でコードされる。ｒＧ０６１抗体の重鎖可変領域は、配列番号４７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する。ｒＧ０６１抗体の配列を表１に示す。
さらに、「２．抗ＣＤＨ６抗体の製造」（ａ）乃至（ｈ）の工程を再度実施して別途に独立してモノクローナル抗体を取得した場合や他の方法によって別途にモノクローナル抗体を取得した場合においても、ｒＧ０１９抗体、ｒＧ０５５抗体、ｒＧ０５６抗体又はｒＧ０６１抗体と同等の内在化活性を有する抗体を取得することが可能である。このような抗体の一例として、ｒＧ０１９抗体、ｒＧ０５５抗体、ｒＧ０５６抗体又はｒＧ０６１抗体と同一のエピトープに結合する抗体を挙げることができる。新たに作製されたモノクローナル抗体が、ｒＧ０１９抗体、ｒＧ０５５抗体、ｒＧ０５６抗体又はｒＧ０６１抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に結合すれば、該モノクローナル抗体がｒＧ０１９抗体、ｒＧ０５５抗体、ｒＧ０５６抗体又はｒＧ０６１抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。また、ｒＧ０１９抗体、ｒＧ０５５抗体、ｒＧ０５６抗体又はｒＧ０６１抗体のＣＤＨ６に対する結合に対して該モノクローナル抗体が競合する（即ち、該モノクローナル抗体が、ｒＧ０１９抗体、ｒＧ０５５抗体、ｒＧ０５６抗体又はｒＧ０６１抗体とＣＤＨ６の結合を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、該モノクローナル抗体が抗ＣＤＨ６抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。エピトープが同一であることが確認された場合、該モノクローナル抗体がｒＧ０１９抗体、ｒＧ０５５抗体、ｒＧ０５６抗体又はｒＧ０６１抗体と同等の抗原結合能、生物活性及び／又は内在化活性を有していることが強く期待される。
（３）その他の抗体
本発明の抗体には、上記ＣＤＨ６に対するモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体又はヒト抗体等も含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１−６８５５，（１９８４）参照）。
ラット抗ヒトＣＤＨ６抗体由来のキメラ抗体の例としては、例えば、本明細書に記載のラット抗ヒトＣＤＨ６抗体（例えば、ｒＧ０１９抗体、ｒＧ０５５抗体、ｒＧ０５６抗体又はｒＧ０６１抗体）の各軽鎖可変領域とヒト由来の定常領域を含む軽鎖、及び、各重鎖可変領域とヒト由来の定常領域を含む重鎖からなる抗体が挙げられる。
ラット抗ヒトＣＤＨ６抗体由来のキメラ抗体の別の例としては、例えば、本明細書に記載のラット抗ヒトＣＤＨ６抗体（例えば、ｒＧ０１９抗体、ｒＧ０５５抗体、ｒＧ０５６抗体又はｒＧ０６１抗体）の各軽鎖可変領域中の１〜数残基、１〜３残基、１〜２残基、好ましくは１残基のアミノ酸を別のアミノ酸残基に置換した軽鎖可変領域を含む軽鎖、及び、各重鎖可変領域中の１〜数残基、１〜３残基、１〜２残基、好ましくは１残基のアミノ酸を別のアミノ酸残基に置換した重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体が挙げられ、当該抗体は任意のヒト由来の定常領域を有していてよい。
ラット抗ヒトＣＤＨ６抗体由来のキメラ抗体の別の例としては、例えば、本明細書に記載のラット抗ヒトＣＤＨ６抗体（例えば、ｒＧ０１９抗体、ｒＧ０５５抗体、ｒＧ０５６抗体又はｒＧ０６１抗体）の各軽鎖可変領域中のいずれか１〜３個のＣＤＲ中の１〜２残基、好ましくは１残基のアミノ酸を別のアミノ酸残基に置換した軽鎖可変領域を含む軽鎖、及び、各重鎖可変領域中のいずれか１〜３個のＣＤＲ中の１〜２残基、好ましくは１残基のアミノ酸を別のアミノ酸残基に置換した重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体が挙げられ、当該抗体は任意のヒト由来の定常領域を有していてよい。
ｒＧ０１９抗体由来のキメラ抗体としては、例えば、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、及び、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体が挙げられ、当該抗体は任意のヒト由来の定常領域を有していてよい。
ｒＧ０１９抗体由来のキメラ抗体の別の例としては、例えば、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域中の１〜数残基、１〜３残基、１〜２残基、好ましくは１残基のアミノ酸を別のアミノ酸残基に置換した軽鎖可変領域を含む軽鎖、及び、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域中の１〜数残基、１〜３残基、１〜２残基、好ましくは１残基のアミノ酸を別のアミノ酸残基に置換した重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体が挙げられ、当該抗体は任意のヒト由来の定常領域を有していてよい。
ｒＧ０１９抗体由来のキメラ抗体の別の例としては、例えば、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域中のいずれか１〜３個のＣＤＲ中の１又は２残基（好ましくは１残基）のアミノ酸を別のアミノ酸残基に置換した軽鎖可変領域を含む軽鎖、及び、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域中のいずれか１〜３個のＣＤＲ中の１又は２残基（好ましくは１残基）のアミノ酸を別のアミノ酸残基に置換した重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体が挙げられ、当該抗体は任意のヒト由来の定常領域を有していてよい。
ｒＧ０１９抗体由来のキメラ抗体の別の例としては、例えば、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、及び、配列番号５８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体が挙げられ、当該抗体は任意のヒト由来の定常領域を有していてよい。配列番号５８に示されるアミノ酸配列は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列中のＣＤＲＨ２中のシステイン残基をプロリン残基に置換した配列である。
ｒＧ０１９抗体由来のキメラ抗体の具体例としては、配列番号５３に示される軽鎖全長アミノ酸配列からなる軽鎖、及び、配列番号５６に示される重鎖全長アミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体が挙げられ、当該キメラ抗ヒトＣＤＨ６抗体を本明細書中、「キメラＧ０１９抗体」、「ｃｈＧ０１９抗体」又は「ｃｈＧ０１９」と称する。ｃｈＧ０１９抗体の軽鎖全長アミノ酸配列は配列番号５４に示されるヌクレオチド配列でコードされ、ｃｈＧ０１９抗体の重鎖全長アミノ酸配列は配列番号５７に示されるヌクレオチド配列でコードされる。
ｃｈＧ０１９抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、ｒＧ０１９抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列と同一であり、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる。ｃｈＧ０１９抗体の軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有し、それぞれ、ｒＧ０１９の軽鎖のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３と同一である。ｃｈＧ０１９抗体の軽鎖可変領域アミノ酸は、配列番号５５に示されるヌクレオチド配列でコードされる。
ｃｈＧ０１９抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号５８に示されるアミノ酸配列からなる。ｃｈＧ０１９抗体の重鎖は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する。配列番号５８に示されるアミノ酸配列は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列中のＣＤＲＨ２中のシステイン残基をプロリン残基に置換した配列である。配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２は、配列番号１８に示されるｒＧ０１９ ＣＤＲＨ２中のシステイン残基をプロリン残基に置換した配列である。ｃｈＧ０１９抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号５９に示されるヌクレオチド配列でコードされる。
ｃｈＧ０１９抗体の配列を表１に示す。
ラット抗ヒトＣＤＨ６抗体ｒＧ０５５抗体由来のキメラ抗体としては、例えば、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、及び、配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなるキメラ抗体が挙げられ、当該抗体は任意のヒト由来の定常領域を有していてよい。
ラット抗ヒトＣＤＨ６抗体ｒＧ０５６抗体由来のキメラ抗体としては、例えば、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、及び、配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなるキメラ抗体が挙げられ、当該抗体は任意のヒト由来の定常領域を有していてよい。
ラット抗ヒトＣＤＨ６抗体ｒＧ０６１抗体由来のキメラ抗体としては、例えば、配列番号４０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、及び、配列番号４５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなるキメラ抗体が挙げられ、当該抗体は任意のヒト由来の定常領域を有していてよい。
ヒト化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ；Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２−５２５参照）、ＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際公開第９０／０７８６１号）、更に、抗原に対する結合能を維持しつつ、一部のＣＤＲのアミノ酸配列を改変した抗体を挙げることができる。
本明細書において、ｒＧ０１９抗体、ｒＧ０５５抗体、ｒＧ０５６抗体、ｒＧ０６１抗体又はｃｈＧ０１９抗体由来のヒト化抗体とは、ｒＧ０１９抗体、ｒＧ０５５抗体、ｒＧ０５６抗体、ｒＧ０６１抗体又はｃｈＧ０１９抗体のいずれかについて、各々に固有の６つのＣＤＲ配列を全て保持し、かつ、内在化活性を有するヒト化抗体であればよく、特定のヒト化抗体に限定されない。当該ヒト化抗体は、内在化活性を有する限り、更に一部のＣＤＲの一部のアミノ酸配列が改変されていてもよい。
ｃｈＧ０１９抗体のヒト化抗体の実例としては、（１）配列番号６３又は６７に記載のアミノ酸配列、（２）上記（１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列（好ましくは、各ＣＤＲ配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列）、及び（３）上記（１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか１つに記載の軽鎖可変領域を含む軽鎖、並びに（４）配列番号７１、７５又は７９に記載のアミノ酸配列、（５）上記（４）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列（好ましくは、各ＣＤＲ配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列）、及び（６）上記（４）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか１つに記載の重鎖可変領域を含む重鎖の任意の組合せを挙げることができる。
また、重鎖又は軽鎖の一方をヒト化し、他方をラット抗体やキメラ抗体の軽鎖又は重鎖とした抗体も用いることができる。そのような抗体の例としては、（１）配列番号６３又は６７に記載のアミノ酸配列、（２）上記（１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列（好ましくは、各ＣＤＲ配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列）、及び（３）上記（１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか１つに記載の軽鎖可変領域を含む軽鎖、並びに（４）配列番号１５、２５、３５、４５又は５８に記載のアミノ酸配列、（５）上記（４）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列（好ましくは、各ＣＤＲ配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列）、及び（６）上記（４）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか１つに記載の重鎖可変領域を含む重鎖の任意の組合せを挙げることができる。他の例としては、（１）配列番号１０、２０、３０又は４０に記載のアミノ酸配列、（２）上記（１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列（好ましくは、各ＣＤＲ配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列）、及び（３）上記（１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか１つに記載の軽鎖可変領域を含む軽鎖、並びに（４）配列番号７１、７５又は７９に記載のアミノ酸配列、（５）上記（４）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列（好ましくは、各ＣＤＲ配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列）、及び（６）上記（４）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか１つに記載の重鎖可変領域を含む重鎖の任意の組合せを挙げることができる。
また、本明細書中におけるアミノ酸の置換としては保存的アミノ酸置換が好ましい。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸側鎖に関連のあるアミノ酸グループ内で生じる置換である。好適なアミノ酸グループは、以下のとおりである：酸性グループ＝アスパギン酸、グルタミン酸；塩基性グループ＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；非極性グループ＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び非帯電極性ファミリー＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。他の好適なアミノ酸グループは次のとおりである：脂肪族ヒドロキシグループ＝セリン及びスレオニン；アミド含有グループ＝アスパラギン及びグルタミン；脂肪族グループ＝アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；並びに芳香族グループ＝フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン。かかるアミノ酸置換は元のアミノ酸配列を有する物質の特性を低下させない範囲で行うのが好ましい。
上記軽鎖及び重鎖の好適な組合せの抗体としては、配列番号６３に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列（本明細書中、ｈＬ０２軽鎖可変領域アミノ酸配列とも称する）を有する軽鎖又は配列番号６７に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列（本明細書中、ｈＬ０３軽鎖可変領域アミノ酸配列とも称する）を有する軽鎖、及び、配列番号７１に示される重鎖可変領域アミノ酸配列（本明細書中、ｈＨ０１重鎖可変領域アミノ酸配列とも称する）を有する重鎖、配列番号７５に示される重鎖可変領域アミノ酸配列（本明細書中、ｈＨ０２重鎖可変領域アミノ酸配列とも称する）を有する重鎖又は配列番号７９に示される重鎖可変領域アミノ酸配列（本明細書中、ｈＨ０４重鎖可変領域アミノ酸配列とも称する）を有する重鎖からなる抗体が挙げられる。好ましい例としては、配列番号６３に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号７１に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体；配列番号６３に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号７５に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体；配列番号６３に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号７９に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体；配列番号６７に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号７１に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体；配列番号６７に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号７５に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体；又は、配列番号６７に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号７９に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体が挙げられる。より好ましい例としては、配列番号６３に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号７１に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体；配列番号６３に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号７５に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体；配列番号６３に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号７９に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体；又は、配列番号６７に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号７５に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体が挙げられる。
上記軽鎖及び重鎖の好適な組合せの抗体の別の例としては、配列番号６１に示される軽鎖全長アミノ酸配列（本明細書中、ｈＬ０２軽鎖全長アミノ酸配列とも称する）の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖又は配列番号６５に示される軽鎖全長アミノ酸配列（本明細書中、ｈＬ０３軽鎖全長アミノ酸配列とも称する）の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び、配列番号６９に示される重鎖全長アミノ酸配列（本明細書中、ｈＨ０１重鎖全長アミノ酸配列とも称する）の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖、配列番号７３に示される重鎖全長アミノ酸配列（本明細書中、ｈＨ０２重鎖全長アミノ酸配列とも称する）の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖又は配列番号７７に示される重鎖全長アミノ酸配列（本明細書中、ｈＨ０４重鎖全長アミノ酸配列とも称する）の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体が挙げられる。好ましい例としては、配列番号６１に示される軽鎖全長アミノ酸配列の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号６９に示される重鎖全長アミノ酸配列の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体；配列番号６１に示される軽鎖全長アミノ酸配列の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３に示される重鎖全長アミノ酸配列の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体；配列番号６１に示される軽鎖全長アミノ酸配列の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７７に示される重鎖全長アミノ酸配列の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体；配列番号６５に示される軽鎖全長アミノ酸配列の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号６９に示される重鎖全長アミノ酸配列の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体；配列番号６５に示される軽鎖全長アミノ酸配列の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３に示される重鎖全長アミノ酸配列の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体；又は、配列番号６５に示される軽鎖全長アミノ酸配列の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７７に示される重鎖全長アミノ酸配列の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体が挙げられる。より好ましい例としては、配列番号６１に示される軽鎖全長アミノ酸配列の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号６９に示される重鎖全長アミノ酸配列の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体（本明細書中、「Ｈ０１Ｌ０２抗体」又は「Ｈ０１Ｌ０２」とも称する）；配列番号６１に示される軽鎖全長アミノ酸配列の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３に示される重鎖全長アミノ酸配列の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体（本明細書中、「Ｈ０２Ｌ０２抗体」又は「Ｈ０２Ｌ０２」とも称する）；配列番号６１に示される軽鎖全長アミノ酸配列の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７７に示される重鎖全長アミノ酸配列の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体（本明細書中、「Ｈ０４Ｌ０２抗体」又は「Ｈ０４Ｌ０２」とも称する）；又は、配列番号６５に示される軽鎖全長アミノ酸配列の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３に示される重鎖全長アミノ酸配列の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体（本明細書中、「Ｈ０２Ｌ０３抗体」又は「Ｈ０２Ｌ０３」とも称する）が挙げられる。Ｈ０１Ｌ０２抗体、Ｈ０２Ｌ０２抗体、Ｈ０２Ｌ０３抗体又はＨ０４Ｌ０２抗体の配列を表１に示す。
上記の重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列と高い同一性を示す配列を組み合わせることによって、上記の各抗体と同等の生物活性を有する抗体を選択することが可能である。このような同一性は、一般的には８０％以上の同一性であり、好ましくは９０％以上の同一性であり、より好ましくは９５％以上の同一性であり、最も好ましくは９９％以上の同一性である。また、重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を組み合わせることによっても、上記の各抗体と同等の生物活性を有する抗体を選択することが可能である。
二種類のアミノ酸配列間の同一性は、ＣｌｕｓｔａｌＷ ｖｅｒｓｉｏｎ２ （Ｌａｒｋｉｎ ＭＡ， Ｂｌａｃｋｓｈｉｅｌｄｓ Ｇ， Ｂｒｏｗｎ ＮＰ， Ｃｈｅｎｎａ Ｒ， ＭｃＧｅｔｔｉｇａｎ ＰＡ， ＭｃＷｉｌｌｉａｍ Ｈ， Ｖａｌｅｎｔｉｎ Ｆ， Ｗａｌｌａｃｅ ＩＭ， Ｗｉｌｍ Ａ， Ｌｏｐｅｚ Ｒ， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＤ， Ｇｉｂｓｏｎ ＴＪ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ（２００７），「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ ａｎｄ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０」， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２３（２１）：２９４７−２９４８）のデフォルトパラメーターを使用して配列を整列させることによって決定することができる。
なお、配列番号６１に示されるｈＬ０２軽鎖全長アミノ酸配列中、１〜２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２１〜１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１２９〜２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。配列番号６２に示されるｈＬ０２軽鎖全長ヌクレオチド配列中、１〜６０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列をコードし、６１〜３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域をコードし、３８５〜６９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。
配列番号６５に示されるｈＬ０３軽鎖全長アミノ酸配列中、１〜２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２１〜１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１２９〜２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。配列番号６６に示されるｈＬ０３軽鎖全長ヌクレオチド配列中、１〜６０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列をコードし、６１〜３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域をコードし、３８５〜６９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。
配列番号６９に示されるｈＨ０１重鎖全長アミノ酸配列中、１〜１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２０〜１４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１４２〜４７１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。配列番号７０に示されるｈＨ０１重鎖全長ヌクレオチド配列中、１〜５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列をコードし、５８〜４２３番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域をコードし、４２４〜１４１３番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。
配列番号７３に示されるｈＨ０２重鎖全長アミノ酸配列中、１〜１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２０〜１４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１４２〜４７１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。配列番号７４に示されるｈＨ０２重鎖全長ヌクレオチド配列中、１〜５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列をコードし、５８〜４２３番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域をコードし、４２４〜１４１３番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。
配列番号７７に示されるｈＨ０４重鎖全長アミノ酸配列中、１〜１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２０〜１４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１４２〜４７１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。配列番号７８に示されるｈＬ０４重鎖全長ヌクレオチド配列で、１〜５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列であり、５８〜４２３番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域をコードしており、４２４〜１４１３番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。
（本明細書中、表１−１〜表１−１５を表１と総称する場合がある。）
本発明の抗体としては、さらに、ＣＤＨ６に結合する、ヒト抗体を挙げることができる。抗ＣＤＨ６ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。抗ＣＤＨ６ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ．１３３−１４３，；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９８）２６，ｐ．３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｓｐｅｃｔｓ ｖｏｌ．１０，ｐ．６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，ｐ．７２２−７２７等を参照。）によって取得することができる。
このようなヒト抗体産生マウスは、具体的には、内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりに酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）ベクター等を介してヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が導入された遺伝子組み換え動物として、ノックアウト動物及びトランスジェニック動物の作製及びこれらの動物同士を掛け合わせることによって作り出すことができる。
また、遺伝子組換え技術によって、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターによって真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することによって、この抗体を培養上清中から得ることもできる。
ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞を用いることができる。
また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２００２）４３（７），ｐ．２３０１−２３０８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００２），１（２），ｐ．１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２００２）１０９（３），ｐ．４２７−４３１等参照。）も知られている。
例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５−１１１６）を用いることができる。
抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。
抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによってヒト抗体を取得することができる（国際公開第９２／０１０４７号、同９２／２０７９１号、同９３／０６２１３号、同９３／１１２３６号、同９３／１９１７２号、同９５／０１４３８号、同９５／１５３８８号、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，ｐ．４３３−４５５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５−１１１６）。
新たに作製されたヒト抗体が、本明細書に記載のラット抗ヒトＣＤＨ６抗体、キメラ抗ヒトＣＤＨ６抗体又はヒト化抗ヒトＣＤＨ６抗体（例えば、ｒＧ０１９抗体、ｒＧ０５５抗体、ｒＧ０５６抗体、ｒＧ０６１抗体、ｃｈＧ０１９抗体、Ｈ０１Ｌ０２抗体、Ｈ０２Ｌ０２抗体、Ｈ０２Ｌ０３抗体又はＨ０４Ｌ０２抗体）のいずれか１つが結合する部分ペプチド又は部分立体構造に結合すれば、該ヒト抗体が当該ラット抗ヒトＣＤＨ６抗体、キメラ抗ヒトＣＤＨ６抗体又はヒト化抗ヒトＣＤＨ６抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。あるいは、本明細書に記載のラット抗ヒトＣＤＨ６抗体、キメラ抗ヒトＣＤＨ６抗体又はヒト化抗ヒトＣＤＨ６抗体（例えば、ｒＧ０１９抗体、ｒＧ０５５抗体、ｒＧ０５６抗体、ｒＧ０６１抗体、ｃｈＧ０１９抗体、Ｈ０１Ｌ０２抗体、Ｈ０２Ｌ０２抗体、Ｈ０２Ｌ０３抗体又はＨ０４Ｌ０２抗体）のＣＤＨ６に対する結合に対して該ヒト抗体が競合する（例えば、該ヒト抗体が、ｒＧ０１９抗体、ｒＧ０５５抗体、ｒＧ０５６抗体、ｒＧ０６１抗体、ｃｈＧ０１９抗体、Ｈ０１Ｌ０２抗体、Ｈ０２Ｌ０２抗体、Ｈ０２Ｌ０３抗体又はＨ０４Ｌ０２抗体とＣＤＨ６、好ましくは、ＣＤＨ６のＥＣ３への結合を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、該ヒト抗体が本明細書に記載のラット抗ヒトＣＤＨ６抗体、キメラ抗ヒトＣＤＨ６抗体又はヒト化抗ヒトＣＤＨ６抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。本明細書において、当該判定方法の少なくともいずれか一方の方法により「同一のエピトープに結合する」と判定された場合、新たに作製されたヒト抗体が、本明細書に記載のラット抗ヒトＣＤＨ６抗体、キメラ抗ヒトＣＤＨ６抗体又はヒト化抗ヒトＣＤＨ６抗体と「同一のエピトープに結合する」といえる。エピトープが同一であることが確認された場合、該ヒト抗体がラット抗ヒトＣＤＨ６抗体、キメラ抗ヒトＣＤＨ６抗体又はヒト化抗ヒトＣＤＨ６抗体（例えば、ｒＧ０１９抗体、ｒＧ０５５抗体、ｒＧ０５６抗体、ｒＧ０６１抗体、ｃｈＧ０１９抗体、Ｈ０１Ｌ０２抗体、Ｈ０２Ｌ０２抗体、Ｈ０２Ｌ０３抗体又はＨ０４Ｌ０２抗体）と同等の生物活性を有していることが期待される。
以上の方法によって得られたキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体は、公知の方法等によって抗原に対する結合性を評価し、好適な抗体を選抜することができる。
抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）は、蛋白の相対的構造安定性のよい指標となる熱変性中点（Ｔｍ）を素早く、また正確に測定することができる装置である。ＤＳＣを用いてＴｍ値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することができる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており（Ｌｏｒｉ Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７）１２，ｐ．２６５−２７３）、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、及び水溶液中での凝集性が低いことを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限らないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、ヒトへの投与に最も適した抗体を選抜する必要がある。
本発明の抗体には抗体の修飾体も含まれる。当該修飾体とは、本発明の抗体に化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ−結合又はＯ−結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾（例えば、Ｎ−結合又はＯ−結合への糖鎖付加、Ｎ末又はＣ末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、又はＮ末グルタミンもしくはＮ末グルタミン酸のピログルタミン酸化）されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによってＮ末にメチオニン残基が付加したもの等が含まれる。また、本発明の抗体又は抗原の検出又は単離を可能にするために標識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティ標識体もかかる修飾物の意味に含まれる。このような本発明の抗体の修飾物は、抗体の安定性及び血中滞留性の改善、抗原性の低減、抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。
また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節すること（グリコシル化、脱フコース化等）によって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、国際公開第１９９９／５４３４２号、同２０００／６１７３９号、同２００２／３１１４０号等が知られているが、これらに限定されるものではない。本発明の抗体には当該糖鎖修飾を調節された抗体も含まれる。
抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。抗体遺伝子の具体例としては、本明細書に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子、及び軽鎖配列をコードする遺伝子を組み合わせたものを挙げることができる。宿主細胞を形質転換する際には、重鎖配列遺伝子と軽鎖配列遺伝子は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。
真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。特に動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５−１８２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６−４２２０）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を挙げることができる。
原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。
これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換によって導入し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することによって抗体が得られる。当該培養においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。よって、本発明の抗体には、上記形質転換された宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体又は当該抗体の機能性断片を採取する工程を含むことを特徴とする当該抗体の製造方法によって得られる抗体も含まれる。
なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリシン残基が欠失することが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，７０５：１２９−１３４（１９９５））、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リシンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５−８３（２００７））。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞傷害作用等）には影響を及ぼさない。従って、本発明に係る抗体には、当該修飾を受けた抗体及び当該抗体の機能性断片も含まれ、重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）等も包含される。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体を構成する２本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であってもよいし、いずれか二種を組み合わせたものであってもよい。各欠失体の量比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては２本の重鎖の双方でカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
本発明の抗体のアイソタイプとしては、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）等を挙げることができるが、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ４を挙げることができる。
抗体の生物活性としては、一般的には抗原結合活性、抗原と結合することによって該抗原を発現する細胞に内在化する活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活性を増強する活性、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性及び抗体依存性細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）を挙げることができるが、本発明に係る抗体が有する機能は、ＣＤＨ６に対する結合活性であり、好ましくはＣＤＨ６と結合することによってＣＤＨ６発現細胞に内在化する活性である。さらに、本発明の抗体は、細胞内在化活性に加えて、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＰ活性を併せ持っていても良い。
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））が、これらに限定されるものではない。
クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。
これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（ファルマシア）等を挙げることができる。
また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
３．抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲート
（１）薬物
上記「２．抗ＣＤＨ６抗体の製造」にて取得された抗ＣＤＨ６抗体はリンカー構造部分を介して薬物を結合させることによって、抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートとすることができる。薬物としては、リンカー構造に結合できる置換基、部分構造を有するものであれば特に制限はない。抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートは結合する薬物に応じて種々の用途に用いることができる。そのような薬物の例としては、抗腫瘍活性を有する物質、血液疾患に対する効果を有する物質、自己免疫疾患に対する効果を有する物質、抗炎症物質、抗菌物質、抗真菌物質、抗寄生虫物質、抗ウイルス物質、抗麻酔物質等を挙げることができる。
（１）−１ 抗腫瘍化合物
本発明の抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートに結合される化合物として抗腫瘍性化合物を用いる例について以下に述べる。抗腫瘍性化合物としては、抗腫瘍効果を有する化合物であって、リンカー構造に結合できる置換基、部分構造を有するものであれば特に制限はない。抗腫瘍性化合物は、リンカーの一部又は全部が腫瘍細胞内で切断されて抗腫瘍性化合物部分が遊離されて抗腫瘍効果が発現される。リンカーが薬物との結合部分で切断されれば抗腫瘍性化合物が本来の構造で遊離され、その本来の抗腫瘍効果が発揮される。
上記「２．抗ＣＤＨ６抗体の製造」にて取得された抗ＣＤＨ６抗体はリンカー構造部分を介して抗腫瘍性化合物を結合させることによって、抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートとすることができる。
本発明で使用される抗腫瘍性化合物の一つの例として、カンプトテシン誘導体であるエキサテカン（（１Ｓ，９Ｓ）−１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）−ジオン；次式：）
を好適に使用することができる。同化合物は、例えば、米国特許公開公報ＵＳ２０１６／０２９７８９０号に記載の方法やその他の公知の方法で容易に取得でき、１位のアミノ基をリンカー構造への結合部位として好適に使用することができる。また、エキサテカンはリンカーの一部が結合した状態で腫瘍細胞内で遊離される場合もあるが、この様な状態でも優れた抗腫瘍効果が発揮される化合物である。
エキサテカンはカンプトテシン構造を有するので、酸性水性媒体中（例えばｐＨ３程度）ではラクトン環が形成された構造（閉環体）に平衡が偏り、一方、塩基性水性媒体中（例えばｐＨ１０程度）ではラクトン環が開環した構造（開環体）に平衡が偏ることが知られている。このような閉環構造及び開環構造に対応するエキサテカン残基を導入した薬物コンジュゲートであっても同等の抗腫瘍効果が期待され、いずれのものも本発明の範囲に包含されることはいうまでもない。
他の抗腫瘍性化合物として例えば、文献（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ６８，ｐ３−１９，２０１６）記載の抗腫瘍化合物を挙げることができ、その一例として、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、カルケマイシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎｅ）、ドラスタチン（Ｄｏｒａｓｔａｔｉｎ）１０、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）等のアウリスタチン類（Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）、ＤＭ１、ＤＭ４等のメイタンシノイド類（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、ピロロベンゾジアゼピン（Ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）二量体のＳＧ２０００（ＳＪＧ−１３６）、カンプトテシンの誘導体であるＳＮ−３８、ＣＣ−１０６５等のデュオカルマイシン類（Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎｓ）、アマニチン（Ａｍａｎｉｔｉｎ）、ダウノルビシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、シクロシチジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、白金系抗腫瘍剤（シスプラチン若しくはその誘導体）、タキソール若しくはその誘導体等を挙げることができる。
抗体−薬物コンジュゲートにおいて、抗体１分子への薬物の結合数は、その有効性、安全性に影響する重要因子である。抗体−薬物コンジュゲートの製造は、薬物の結合数が一定の数となるよう、反応させる原料・試薬の使用量等の反応条件を規定して実施されるが、低分子化合物の化学反応とは異なり、異なる数の薬物が結合した混合物として得られるのが通常である。抗体１分子への薬物の結合数は平均値、すなわち、平均薬物結合数として特定され、表記される。本発明でも原則として断りのない限り、すなわち、異なる薬物結合数をもつ抗体−薬物コンジュゲート混合物に含まれる特定の薬物結合数をもつ抗体−薬物コンジュゲートを示す場合を除き、薬物の結合数は平均値を意味する。抗体分子へのエキサテカンの結合数はコントロール可能であり、１抗体あたりの薬物平均結合数として、１〜１０個程度のエキサテカンを結合させることができるが、好ましくは２〜８個、３〜８個、４〜８個、５〜８個、６〜８個、７〜８個であり、より好ましくは５〜８個であり、更に好ましくは７〜８個であり、更により好ましくは８個である。なお、当業者であれば本願の実施例の記載から抗体に必要な数の薬物を結合させる反応を設計することができ、エキサテカンの結合数をコントロールした抗体−薬物コンジュゲートを取得することができる。
（２）リンカー構造
本発明の抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートにおいて薬物を抗ＣＤＨ６抗体に結合させるリンカー構造について述べる。
本願の抗体−薬物コンジュゲートにおいて、抗ＣＤＨ６抗体と薬物とを結合するリンカー構造は、抗体−薬物コンジュゲートとして用いることができる限りにおいて特に制限されず、使用目的に応じて適宜選択して用いることもできる。リンカー構造の一例としては、公知文献（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ ６８：３-１９， Ｊａｎｕａｒｙ ２０１６、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ＤＯＩ １０．１００７／ｓ１３２３８−０１６−０３２３−０等）に記載のリンカーを挙げることができ、更に具体的な例としては、ＶＣ（バリン−シトルリン：ｖａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）、ＭＣ（マレインアミドカプロイル：ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）、ＳＭＣＣ（スクシニミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート：ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ） ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、ＳＰＰ（Ｎ−スクシニミジル ４−（２−ピリジルジチオ）ペンタン酸：Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｅｎｔａｎｏａｔｅ、ＳＳ（ジスルフィド：ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシミジル ４−（２−ピリジルジチオ）ブチラート）Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｂｕｔｙｒａｔｅ、ＳＳ／ヒドラゾン、ヒドラゾン、カルボネートを挙げることができる。
他の一例としては、例えば、米国特許公開公報ＵＳ２０１６／０２９７８９０に記載のリンカー構造（一例として、段落［０２６０］〜［０２８９］に記載のもの）を挙げることができ、以下の構造のものを好適に使用することができる。なお以下に示す構造の左端が抗体との結合部位であり、右端が薬物との結合部位である。また、下記のリンカー構造中のＧＧＦＧは、グリシン−グリシン−フェニルアラニン−グリシン（ＧＧＦＧ）からなるペプチド結合でつながっているアミノ酸配列を示す。
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−。
より好ましくは、次のものを挙げることができる。
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−。
さらにより好ましくは、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−。
を挙げることができる。
抗体は−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）の末端、（例えば、『−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−』においては、（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）が結合するのとは反対側の末端（左末端））で結合し、抗腫瘍性化合物は−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）とは反対側の末端（上記例では右末端の、ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−のカルボニル基で結合する。『−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−』は、次式：
で示される構造を有する。この部分構造における３位が抗ＣＤＨ６抗体への結合部位である。この３位での該抗体との結合は、チオエーテルを形成して結合することが特徴である。この構造部分の１位の窒素原子は、この構造が含まれるリンカー内に存在するメチレンの炭素原子と結合する。
薬物をエキサテカンとする本発明の抗体−薬物コンジュゲートにおいては、下記の構造の薬物−リンカー構造部分を抗体に結合させたものが好ましい。これらの薬物−リンカー構造部分は、１抗体あたりの平均結合数として、１から１０を結合させればよいが、好ましくは２から８であり、より好ましくは５から８であり、更に好ましくは７から８であり、更により好ましくは８である。
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−（ＮＨ−ＤＸ）、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−（ＮＨ−ＤＸ）、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−（ＮＨ−ＤＸ）、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−（ＮＨ−ＤＸ）、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−（ＮＨ−ＤＸ）、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−（ＮＨ−ＤＸ）。
より、好ましくは、次のものである。
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−（ＮＨ−ＤＸ）、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−（ＮＨ−ＤＸ）、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−（ＮＨ−ＤＸ）。
さらに、より好ましくは、次のものを挙げることができる。
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−（ＮＨ−ＤＸ）
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−（ＮＨ−ＤＸ）。
また、−（ＮＨ−ＤＸ）は次式：
で示される構造であり、エキサテカンの１位のアミノ基の水素原子１個が除かれて生成する基を示す。
（３）抗体−薬物コンジュゲートの製造方法
本発明の抗体ー薬物コンジュゲートに用いることができる抗体は、上記「２．抗ＣＤＨ６抗体の製造」の項及び実施例に記載の内在化活性を有する抗ＣＤＨ６抗体及び該抗体の機能性断片であれば特に制限がない。
次に、本発明の抗体−薬物コンジュゲートの代表的な製造方法について説明する。なお、以下において、化合物を示すために、各反応式中に示される化合物の番号を用いる。すなわち、『式（１）の化合物』、『化合物（１）』等と称する。また、これ以外の番号の化合物についても同様に記載する。
（３）−１ 製造方法１
下記式（１）で示される抗体−薬物コンジュゲートのうち、チオエーテルを介して抗ＣＤＨ６抗体とリンカー構造が結合しているものは抗ＣＤＨ６抗体を還元してジスルフィド結合をスルヒドリル基に変換した抗体に対して、既知の方法によって入手しうる化合物（２）（例えば、ＵＳ２０１６／２９７８９０号公開特許公報に記載の方法（例えば段落［０３３６］〜［０３７４］に記載の方法）で入手可能）を反応させることによって製造することができる。例えば下記の方法によって製造することができる。

［式中、ＡＢは、スルフヒドリル基を有する抗体を示す。
ここで、Ｌ１は、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−の構造で示される。
Ｌ１’は次式で示される、マレイミジル基を示す。］
−Ｌ１−ＬＸは、以下の式で示されるいずれかの構造を有する。
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−。
これらのうちでより好ましくは、次のものである。
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−。
さらに、好ましくは、次のものを挙げることができる。
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−。
また、上記の反応式において抗体−薬物コンジュゲート（１）では、薬物からリンカー末端までの構造部分１個が１個の抗体に対して結合した構造として記載されているが、これは説明のための便宜的な記載であって、実際には当該構造部分が１個の抗体分子に対して複数個が結合している場合が多い。この状況は以下の製造方法の説明においても同様である。
すなわち、既知の方法によって入手しうる化合物（２）（例えば、ＵＳ２０１６／２９７８９０号公開特許公報に記載の方法（例えば段落［０３３６］〜［０３７４］に記載の方法）で入手可能）で入手可能）と、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）を反応させることによって、抗体−薬物コンジュゲート（１）を製造することができる。
スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）は、当業者周知の方法で得ることができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ｐｐ．５６−１３６、ｐｐ．４５６−４９３、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６））。例えば、Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬を抗体のアミノ基に作用させる；Ｎ−サクシンイミジルＳ−アセチルチオアルカノエート類を抗体のアミノ基に作用させた後、ヒドロキシルアミンを作用させる；Ｎ−サクシンイミジル３−（ピリジルジチオ）プロピオネートを作用させた後、還元剤を作用させる；ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）等の還元剤を抗体に作用させて抗体内鎖間部のジスルフィド結合を還元しスルフヒドリル基を生成させる；等の方法を挙げることができるがこれらに限定されることはない。
具体的には、還元剤としてＴＣＥＰを、抗体内鎖間部ジスルフィド一個当たりに対して０．３乃至３モル当量用い、キレート剤を含む緩衝液中で、抗体と反応させることで、抗体内鎖間部ジスルフィドが部分的もしくは完全に還元された抗体を得ることができる。キレート剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）等を挙げることができる。これ等を１ｍＭ乃至２０ｍＭの濃度で用いればよい。緩衝液としては、リン酸ナトリウムやホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム溶液等を用いることができる。具体的な例において、抗体は４℃乃至３７℃にて１乃至４時間ＴＣＥＰと反応させることで部分的もしくは完全に還元されたスルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）を得ることが出来る。
なお、ここでスルフヒドリル基を薬物−リンカー部分に付加させる反応を実施させることでチオエーテル結合によって薬物−リンカー部分を結合させることができる。
次に、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）一個あたり、２乃至２０モル当量の化合物（２）を使用して、抗体１個当たり２個乃至８個の薬物が結合した抗体―薬物コンジュゲート（１）を製造することができる。具体的には、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）を含む緩衝液に、化合物（２）を溶解させた溶液を加えて反応させればよい。ここで、緩衝液としては、酢酸ナトリウム溶液、リン酸ナトリウムやホウ酸ナトリウム、等を用いればよい。反応時のｐＨは５乃至９であり、より好適にはｐＨ７付近で反応させればよい。化合物（２）を溶解させる溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピリドン（ＮＭＰ）等の有機溶媒を用いることができる。化合物（２）を溶解させた有機溶媒溶液を、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）を含む緩衝液に１乃至２０％ｖ／ｖを加えて反応させればよい。反応温度は、０乃至３７℃、より好適には１０乃至２５℃であり、反応時間は、０．５乃至２時間である。反応は、未反応の化合物（２）の反応性をチオール含有試薬によって失活させることによって終了できる。チオール含有試薬は例えば、システイン又はＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）である。より具体的には、ＮＡＣを、用いた化合物（２）に対して、１乃至２モル当量加え、室温で１０乃至３０分インキュベートすることにより反応を終了できる。
（４）抗体―薬物コンジュゲートの同定
製造した抗体−薬物コンジュゲート（１）は、以下の共通操作によって濃縮、バッファー交換、精製、抗体濃度及び抗体一分子あたりの薬物平均結合数の測定を行い、抗体−薬物コンジュゲート（１）の同定を行うことができる。
（４）−１ 共通操作Ａ：抗体もしくは抗体−薬物コンジュゲート水溶液の濃縮
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（５０，０００ ＭＷＣＯ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の容器内に抗体もしくは抗体−薬物コンジュゲート溶液を入れ、遠心機（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ−１５Ｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いた遠心操作（２０００Ｇ乃至３８００Ｇにて５乃至２０分間遠心）にて、抗体もしくは抗体−薬物コンジュゲート溶液を濃縮した。
（４）−２ 共通操作Ｂ：抗体の濃度測定
ＵＶ測定器（Ｎａｎｏｄｒｏｐ １０００，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を用いて、メーカー規定の方法に従い、抗体濃度の測定を行った。その際に、抗体ごとに異なる２８０ｎｍ吸光係数（１．３ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１乃至１．８ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１）を用いた。
（４）−３ 共通操作Ｃ：抗体のバッファー交換
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５担体を使用したＮＡＰ−２５カラム（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０８５２−０２，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｊａｐａｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、メーカー規定の方法に従い、塩化ナトリウム（５０ｍＭ）及びＥＤＴＡ（２ｍＭ）を含むリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）（本明細書でＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡと称する。）にて平衡化させた。このＮＡＰ−２５カラム一本につき、抗体水溶液２．５ｍＬをのせたのち、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡ３．５ｍＬで溶出させた画分（３．５ｍＬ）を分取した。この画分を共通操作Ａによって濃縮し、共通操作Ｂを用いて抗体濃度の測定を行ったのちに、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡを用いて２０ｍｇ／ｍＬに抗体濃度を調整した。
（４）−４ 共通操作Ｄ：抗体−薬物コンジュゲートの精製
市販のＳｏｒｂｉｔｏｌ（５％）を含む酢酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ５．５；本明細書でＡＢＳと称する。）のいずれかの緩衝液でＮＡＰ−２５カラムを平衡化させた。このＮＡＰ−２５カラムに、抗体−薬物コンジュゲート反応水溶液（約２．５ｍＬ）をのせ、メーカー規定の量の緩衝液で溶出させることで、抗体画分を分取した。この分取画分を再びＮＡＰ−２５カラムにのせ緩衝液で溶出させるゲルろ過精製操作を計２乃至３回繰り返すことで、未結合の薬物リンカーや低分子化合物（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ），Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ），ジメチルスルホキシド）を除いた抗体−薬物コンジュゲートを得た。
（４）−５ 共通操作Ｅ：抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体濃度及び抗体一分子あたりの薬物平均結合数の測定
抗体−薬物コンジュゲートにおける結合薬物濃度は、抗体−薬物コンジュゲート水溶液の２８０ｎｍ及び３７０ｎｍの二波長におけるＵＶ吸光度を測定したのちに下記の計算を行うことで、算出することができる。
ある波長における全吸光度は系内に存在する全ての吸収化学種の吸光度の和に等しい［吸光度の加成性］ことから、抗体と薬物のコンジュゲーション前後において、抗体及び薬物のモル吸光係数に変化がないと仮定すると、抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体濃度及び薬物濃度は、下記の関係式で示される。
Ａ２８０＝ＡＤ，２８０＋ＡＡ，２８０＝εＤ，２８０ＣＤ＋εＡ，２８０ＣＡ 式（１）
Ａ３７０＝ＡＤ，３７０＋ＡＡ，３７０＝εＤ，３７０ＣＤ＋εＡ，３７０ＣＡ 式（２）
ここで、Ａ２８０は２８０ｎｍにおける抗体−薬物コンジュゲート水溶液の吸光度を示し、Ａ３７０は３７０ｎｍにおける抗体−薬物コンジュゲート水溶液の吸光度を示し、ＡＡ，２８０は２８０ｎｍにおける抗体の吸光度を示し、ＡＡ，３７０は３７０ｎｍにおける抗体の吸光度を示し、ＡＤ，２８０は２８０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体の吸光度を示し、ＡＤ，３７０は３７０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体の吸光度を示し、εＡ，２８０は２８０ｎｍにおける抗体のモル吸光係数を示し、εＡ，３７０は３７０ｎｍにおける抗体のモル吸光係数を示し、εＤ，２８０は２８０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体のモル吸光係数を示し、εＤ，３７０は３７０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体のモル吸光係数を示し、ＣＡは抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体濃度を示し、ＣＤは抗体−薬物コンジュゲートにおける薬物濃度を示す。
ここで、εＡ，２８０、εＡ，３７０、εＤ，２８０、εＤ，３７０は、事前に用意した値（計算推定値もしくは化合物のＵＶ測定から得られた実測値）が用いられる。例えば、εＡ，２８０は、抗体のアミノ酸配列から、既知の計算方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，ｖｏｌ．４，２４１１−２４２３）によって推定することが出来る。εＡ，３７０は、通常、ゼロである。εＤ，２８０及びεＤ，３７０は、用いるコンジュゲート前駆体をあるモル濃度に溶解させた溶液の吸光度を測定することで、ランベルト・ベールの法則（吸光度＝モル濃度×モル吸光係数×セル光路長）によって、得ることができる。抗体−薬物コンジュゲート水溶液のＡ２８０及びＡ３７０を測定し、これらの値を式（１）及び（２）に代入して連立方程式を解くことによって、ＣＡ及びＣＤを求めることができる。さらにＣＤをＣＡで除することで１抗体あたりの薬物平均結合数が求めることができる。
（４）−６ 共通操作Ｆ：抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数の測定（２）
抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数は、前述の「（４）−５ 共通操作Ｅ」に加え、以下の方法を用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によっても求めることができる。以下に、抗体と薬物リンカーがジスルフィド結合している場合のＨＰＬＣによる薬物平均結合数の測定方法を記載する。当業者は、この方法を参照して、抗体と薬物リンカーとの結合様式に依存して適宜、ＨＰＬＣにより薬物平均結合数を測定し得る。
Ｆ−１．ＨＰＬＣ分析用サンプルの調製（抗体−薬物コンジュゲートの還元）
抗体−薬物コンジュゲート溶液（約１ｍｇ／ｍＬ、６０μＬ）をジチオトレイトール（ＤＴＴ）水溶液（１００ｍＭ、１５μＬ）と混合する。混合物を３７℃で３０分インキュベートすることで、抗体−薬物コンジュゲートの軽鎖及び重鎖間のジスルフィド結合を切断したサンプルを、ＨＰＬＣ分析に用いる。
Ｆ−２．ＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ分析を、下記の測定条件にて行う。
ＨＰＬＣシステム：Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
検出器：紫外吸光度計（測定波長：２８０ｎｍ）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｐｈｅｎｙｌ（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ、１３０Å；Ｗａｔｅｒｓ、Ｐ／Ｎ １８６００２８８４）
カラム温度：８０℃
移動相Ａ：０．１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１５％２−プロパノールを含む水溶液
移動相Ｂ：０．０７５％ＴＦＡ、１５％２−プロパノールを含むアセトニトリル溶液
グラジエントプログラム：１４％−３６％（０分−１５分）、３６％−８０％（１５分−１７分）、８０％−１４％（１７分―１７．０１分）、１４％（１７．０１分―２５分）
サンプル注入量：１０μＬ
Ｆ−３．データ解析
Ｆ−３−１ 薬物の結合していない抗体の軽鎖（Ｌ０）及び重鎖（Ｈ０）に対して、薬物の結合した軽鎖（薬物がi個結合した軽鎖：Ｌｉ）及び重鎖（薬物がi個結合した重鎖：Ｈｉ）は、結合した薬物の数に比例して疎水性が増し保持時間が大きくなることから、例えば、Ｌ０、Ｌ１、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３の順に溶出される。Ｌ０及びＨ０との保持時間比較により検出ピークをＬ０、Ｌ１、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３のいずれかに割り当てることができる。薬物結合数は、当業者によって定義され得るが、好ましくは、Ｌ０、Ｌ１、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３である。
Ｆ−３−２ 薬物リンカーにＵＶ吸収があるため、薬物リンカーの結合数に応じて、軽鎖、重鎖及び薬物リンカーのモル吸光係数を用いて下式に従ってピーク面積値の補正を行う。
ここで、各抗体における軽鎖及び重鎖のモル吸光係数（２８０ｎｍ）は、既知の計算方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９５， ｖｏｌ．４， ２４１１−２４２３）によって、各抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列から推定される値を用いることができる。Ｈ０１Ｌ０２の場合、そのアミノ酸配列に従って、軽鎖のモル吸光係数として３１７１０を、重鎖のモル吸光係数として７９９９０を推定値として用いた。また、薬物リンカーのモル吸光係数（２８０ｎｍ）は、各薬物リンカーをメルカプトエタノール又はＮ−アセチルシステインで反応させ、マレイミド基をサクシニイミドチオエーテルに変換した化合物の実測のモル吸光係数（２８０ｎｍ）を用いた。吸光度を測定する波長は、当業者によって適宜設定され得るが、好ましくは、抗体のピークが測定され得る波長であり、より好ましくは２８０ｎｍである。
Ｆ−３−３ ピーク面積補正値合計に対する各鎖ピーク面積比（％）を下式に従って計算する。
Ｆ−３−４ 抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数を、下式に従って計算する。
薬物平均結合数＝（Ｌ０ピーク面積比ｘ０＋Ｌ１ピーク面積比ｘ１＋Ｈ０ピーク面積比ｘ０＋Ｈ１ピーク面積比ｘ１＋Ｈ２ピーク面積比ｘ２＋Ｈ３ピーク面積比ｘ３）／１００ｘ２
なお、抗体−薬物コンジュゲートの量を確保するために、同様な条件で作製して得られた平均薬物数が同程度の複数の抗体−薬物コンジュゲート（例えば±１程度）を混合して新たなロットにすることができる。その場合、平均薬物数は混合前の平均薬物数の間に収まる。
本発明の抗体−薬物コンジュゲートの一つの具体例としては次式：
又は次式：
で示される構造を有するものを挙げることができる。
ここで、ＡＢは本明細書で開示される抗ＣＤＨ６抗体を示し、抗体由来のスルフヒドリル基を介して結合リンカーと結合している。ここで、ｎはいわゆるＤＡＲ（Ｄｒｕｇ−ｔｏ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏ）と同義であり、１抗体あたりの薬物抗体比を示す。すなわち、抗体１分子への薬物の結合数を示すが、これは平均値、すなわち、平均薬物結合数として特定され、表記される数値である。本発明の[化９]及び[化１０]で示される抗体−薬物コンジュゲートの場合、共通操作Ｆによる測定で、ｎは、２から８であればよく、好ましくは５から８であり、更に好ましくは７から８であり、更により好ましく８である。
本発明の抗体薬物−コンジュゲートの一例として、上記式［化９］又は［化１０］に示される構造において、ＡＢで示される抗体が、以下の（ａ）乃至（ｇ）からなる群から選択されるいずれか１項に記載の重鎖及び軽鎖の抗体又はその機能性断片を含む、抗体−薬物コンジュゲート又はその薬理学上許容される塩を挙げることができる：
（ａ）配列番号６１に示される軽鎖全長アミノ酸配列の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号６９に示される重鎖全長アミノ酸配列の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体；
（ｂ）配列番号６１に示される軽鎖全長アミノ酸配列の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３に示される重鎖全長アミノ酸配列の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体；
（ｃ）配列番号６１に示される軽鎖全長アミノ酸配列の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７７に示される重鎖全長アミノ酸配列の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体；
（ｄ）配列番号６５に示される軽鎖全長アミノ酸配列の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号６９に示される重鎖全長アミノ酸配列の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体；
（ｅ）配列番号６５に示される軽鎖全長アミノ酸配列の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３に示される重鎖全長アミノ酸配列の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体；
（ｆ）配列番号６５に示される軽鎖全長アミノ酸配列の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７７に示される重鎖全長アミノ酸配列の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体；又は
（ｇ）重鎖又は軽鎖がＮ−結合への糖鎖付加、Ｏ−結合への糖鎖付加、Ｎ末のプロセッシング、Ｃ末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、Ｎ末にメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、Ｎ末グルタミンやＮ末グルタミン酸のピログルタミン酸化などに代表される翻訳後修飾、及びカルボキシル末端における１つ又は２つのアミノ酸欠失からなる群より選択される１又は２以上の修飾を含む、（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択されるいずれか１つに記載の抗体。
４．医薬
上記、「２．抗ＣＤＨ６抗体の製造」の項及び実施例に記載された本発明の抗ＣＤＨ６抗体及び当該抗体の機能性断片は、腫瘍細胞表面のＣＤＨ６に結合し、内在化活性を有することから、単独であるいは他の薬剤と組み合わせて、医薬として、腎細胞腫瘍及び卵巣腫瘍等のがん、例えば、腎細胞癌、腎淡明細胞癌、乳頭状腎細胞癌、卵巣癌、卵巣漿液性腺癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌又は非小細胞肺癌）、神経膠芽腫、中皮腫、子宮癌、膵臓癌、ウィルムス腫瘍又は神経芽腫の治療剤として用いることができる。
また、ＣＤＨ６を発現している細胞の検出に用いることができる。
更に、本発明の抗ＣＤＨ６抗体及び当該抗体の機能性断片は、内在化活性を有することから、抗体−薬物コンジュゲートに用いる抗体として供することができる。
上記「３．抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲート」の項及び実施例に記載の本発明の抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートのうちで薬物として細胞傷害活性等の抗腫瘍活性を有する薬物が用いられているものは、内在化活性を有する抗ＣＤＨ６抗体及び／又は当該抗体の機能性断片と細胞傷害活性等の抗腫瘍活性を有する薬物のコンジュゲートであり、ＣＤＨ６を発現しているがん細胞に対して抗腫瘍活性を示すことから、医薬として、特にがんに対する治療剤及び／又は予防剤として使用することができる。
本発明の抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートは、大気中に放置したり、又は再結晶や精製操作をしたりすることにより、水分を吸収し、あるいは吸着水が付着するなどして、水和物になる場合があり、そのような水を含む化合物又は薬理学的に許容され得る塩も本発明に包含される。
本発明の抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートが、アミノ基などの塩基性基を有する場合、所望により薬理学的に許容され得る酸付加塩を形成することができる。そのような酸付加塩としては、例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩などのハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩などの無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩などの低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などのアリ−ルスルホン酸塩；蟻酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、りんご酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩；又はオルニチン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩などのアミノ酸塩などを挙げることができる。
本発明の抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートが、カルボキシ基などの酸性基を有する場合、所望により薬理学的に許容され得る塩基付加塩を形成することができる。そのような塩基付加塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩などの無機塩；ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−Ｎ−（２−フェニルエトキシ）アミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。
本発明はまた、抗体−薬物コンジュゲートを構成する原子の１以上が、その原子の同位体で置換された抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートを包含し得る。同位体には放射性同位体及び安定同位体の２種類が存在し、同位体の例としては、例えば、水素の同位体（２Ｈ及び３Ｈ）、炭素の同位体（１１Ｃ、１３Ｃ及び１４Ｃ）、窒素の同位体（１３Ｎ及び１５Ｎ）、酸素の同位体（１５Ｏ、１７Ｏ及び１８Ｏ）、フッ素の同位体（１８Ｆ）などを挙げることができる。同位体で標識された抗体−薬物コンジュゲートを含む組成物は、例えば、治療剤、予防剤、研究試薬、アッセイ試薬、診断剤、インビボ画像診断剤などとして有用である。同位体で標識された抗体−薬物コンジュゲート、及び、同位体で標識された抗体−薬物コンジュゲートの任意の割合の混合物もすべて本発明に包含される。同位体で標識された抗体−薬物コンジュゲートは、当該分野で公知の方法により、例えば、後述する本発明の製造方法における原料の代わりに同位体で標識された原料を用いることにより、製造することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの殺細胞活性は例えば、細胞の増殖抑制活性で測定することができる。例えば、ＣＤＨ６を過剰発現している癌細胞株を培養し、培養系に種々の濃度で抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートを添加し、フォーカス活性、コロニー形成及びスフェロイド増殖に対する抑制活性を測定することができる。ここで、例えば、腎細胞腫瘍及び卵巣腫瘍由来がん細胞株等を用いることで、腎細胞腫瘍及び卵巣腫瘍に対する細胞増殖抑制活性を調べることができる。
ｉｎ ｖｉｖｏでの実験動物を用いたがんに対する治療効果は、例えば、ＣＤＨ６を高発現している腫瘍細胞株を移植したヌードマウスに抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートを投与し、がん細胞の変化を測定することができる。ここで、例えば、腎細胞癌、腎淡明細胞癌、乳頭状腎細胞癌、卵巣癌、卵巣漿液性腺癌又は甲状腺癌由来の細胞を免疫不全マウスに移植した動物モデルを用いることで、腎細胞癌、腎淡明細胞癌、乳頭状腎細胞癌、卵巣癌、卵巣漿液性腺癌又は甲状腺癌に対する治療効果を測定することができる。
本発明の抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートが適用されるがんの種類としては、治療対象となるがん細胞においてＣＤＨ６を発現しているがんであれば特に制限されないが、例えば、腎細胞癌（例えば、腎淡明細胞癌又は乳頭状腎細胞癌）、卵巣癌、卵巣漿液性腺癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌又は非小細胞肺癌）、神経膠芽腫、中皮腫、子宮癌、膵臓癌、ウィルムス腫瘍又は神経芽腫を挙げることができるが、ＣＤＨ６を発現している限りこれらに制限されない。より好ましいがんの例としては、腎細胞癌（例えば、腎淡明細胞癌、乳頭状腎細胞癌）又は卵巣癌を挙げることができる。
本発明の抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートは、哺乳動物に対して好適に投与することができるが、より好ましくはヒトである。
本発明の抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートが含まれる医薬組成物において使用される物質としては、投与量や投与濃度において、この分野において通常使用される製剤添加物その他から適宜選択して適用することができる。
本発明の抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートは、１種以上の薬学的に適合性の成分を含む薬学的組成物として投与され得る。例えば、上記薬学的組成物は、代表的には、１種以上の薬学的キャリア（例えば、滅菌した液体（例えば、水及び油（石油、動物、植物、又は合成起源の油（例えば、ラッカセイ油、大豆油、鉱油、ごま油など）を含む））を含む。水は、上記薬学的組成物が静脈内投与される場合に、より代表的なキャリアである。食塩水溶液、ならびにデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液もまた、液体キャリアとして、特に、注射用溶液のために使用され得る。適切な薬学的賦形剤は、当該分野で公知である。上記組成物はまた、所望であれば、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、又はｐＨ緩衝化剤を含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。その処方は、投与の態様に対応する。
種々の送達システムが公知であり、本発明の抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートを投与するために使用され得る。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び皮下の経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与は、例えば、注入又はボーラス注射によるものであり得る。特定の好ましい実施形態において、上記抗体−薬物コンジュゲートの投与は、注入によるものである。非経口的投与は、好ましい投与経路である。
代表的実施形態において、上記薬学的組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した薬学的組成物として、常習的手順に従って処方される。代表的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌の等張性の水性緩衝液中の溶液である。必要である場合、上記医薬はまた、可溶化剤及び注射部位での疼痛を和らげるための局所麻酔剤（例えば、リグノカイン）を含み得る。一般に、上記成分は、（例えば、活性剤の量を示すアンプル又はサシェなどに密封してシールされた容器中の乾燥凍結乾燥粉末又は無水の濃縮物として、別個に、又は単位剤形中で一緒に混合して、のいずれかで供給される。上記医薬が注入によって投与される予定である場合、それは、例えば、滅菌の製薬グレードの水又は食塩水を含む注入ボトルで投薬され得る。上記医薬が注射によって投与される場合、注射用滅菌水又は食塩水のアンプルは、例えば、上記成分が投与前に混合され得るように、提供され得る。
本発明の医薬組成物には本願の抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートのみを含む医薬組成物であってもよいし、抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲート及び少なくとも一つのこれ以外のがん治療剤を含む医薬組成物であってもよい。本発明の抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートは、他のがん治療剤と共に投与することもでき、これによって抗がん効果を増強させることができる。このような目的で使用される他の抗がん剤は、抗体−薬物コンジュゲートと同時に、別々に、あるいは連続して個体に投与されてもよいし、それぞれの投与間隔を変えて投与してもよい。このようながん治療剤として、Ｉｍａｔｉｎｉｂ、Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ、Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂなどを含むチロシンキナーゼ阻害剤、Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂなどを含むＣＤＫ４／６阻害剤、ＴＡＳ−１１６などを含むＨＳＰ９０阻害剤、ＭＥＫ１６２などを含むＭＥＫ阻害剤、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブなどを含む免疫チェックポイント阻害剤等を挙げることができるが、抗腫瘍活性を有する薬剤であれば限定されることはない。
このような医薬組成物は、選択された組成と必要な純度を持つ製剤として、凍結乾燥製剤あるいは液状製剤として製剤化すればよい。凍結乾燥製剤として製剤化する際には、この分野において使用される適当な製剤添加物が含まれる製剤であってもよい。また液剤においても同様にして、この分野において使用される各種の製剤添加物を含む液状製剤として製剤化することができる。
医薬組成物の組成及び濃度は投与方法によっても変化するが、本発明の医薬組成物に含まれる抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲートの抗原に対する親和性、すなわち、抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）の点において、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、少量の投与量であっても薬効を発揮させことができる。したがって、抗体−薬物コンジュゲートの投与量の決定に当たっては、抗体−薬物コンジュゲートと抗原との親和性の状況に基づいて投与量を設定することもできる。本発明の抗体−薬物コンジュゲートをヒトに対して投与する際には、例えば、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇを１回あるいは１〜１８０日間に１回の間隔で複数回投与すればよい。好適には、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇを、さらに好適には、１〜５０ｍｇ／ｋｇ、１〜３０ｍｇ／ｋｇ、１〜２０ｍｇ／ｋｇ、１〜１５ｍｇ／ｋｇ、２〜５０ｍｇ／ｋｇ、２〜３０ｍｇ／ｋｇ、２〜２０ｍｇ／ｋｇ又は２〜１５ｍｇ／ｋｇを１〜４週間に１回、好ましくは２〜３週間に１回の間隔で複数回投与すればよい。
以下に示す実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、これらはいかなる意味においても限定的に解釈されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年発刊）に記載の方法及びその他の当業者が使用する実験書に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って行った。また、本明細書において、特に記載のない試薬、溶媒及び出発材料は、市販の供給源から容易に入手可能である。
［実施例１：内在化活性を有するラット抗ヒトＣＤＨ６抗体の取得］
１）−１ ヒト、マウス、ラットおよびカニクイザルＣＤＨ６発現ベクターの構築
ヒトＣＤＨ６タンパク質（ＮＰ＿００４９２３）をコードするｃＤＮＡ発現ベクター（ＯｒｉＧｅｎｅ社、ＲＣ２１７８８９）を用いて、当業者に公知な方法に従い哺乳動物発現用ベクターに組み込むことによってヒトＣＤＨ６発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｈＣＤＨ６が作製された。ヒトＣＤＨ６ ＯＲＦ（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
マウスＣＤＨ６タンパク質（ＮＰ＿０３１６９２）をコードするｃＤＮＡ発現ベクター（ＯｒｉＧｅｎｅ社、ＭＣ２２１６１９）を用いて、当業者に公知な方法に従い哺乳動物発現用ベクターに組み込むことによってマウスＣＤＨ６発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｍＣＤＨ６、及びｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−９−ｍＣＤＨ６が作製された。マウスＣＤＨ６ ＯＲＦのアミノ酸配列を配列番号７に示す。
ラットＣＤＨ６タンパク質（ＮＰ＿０３７０５９）をコードするｃＤＮＡ発現ベクター（ＯｒｉＧｅｎｅ社、ＲＮ２１１８５０）の各ｃＤＮＡ部分を用いて、当業者に公知な方法に従い哺乳動物発現用ベクターに組み込むことによってヒトＣＤＨ６発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｒＣＤＨ６、及びｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−９−ｒＣＤＨ６が作製された。ラットＣＤＨ６ ＯＲＦのアミノ酸配列を配列番号８に示す。
カニクイザルＣＤＨ６タンパク質をコードするｃＤＮＡは、カニクイザル腎臓のｔｏｔａｌ ＲＮＡより合成したｃＤＮＡを鋳型にｐｒｉｍｅｒ １ （５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＡＣＴＴＡＣＣＧＣＴＡＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣ−３’）（配列番号８５）及びｐｒｉｍｅｒ ２ （５’−ＴＴＡＧＧＡＧＴＣＴＴＴＧＴＣＡＣＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＴＣＣ−３’）（配列番号８６）を用いてクローニングを行った。得られた配列が、カニクイザルＣＤＨ６（ＮＣＢＩ，ＸＰ＿００５５５６６９１．１）の細胞外領域と一致することを確認した。また、ＥＭＢＬで登録されたカニクイザルＣＤＨ６（ＥＨＨ５４１８０．１）と全長配列が一致することを確認した。当業者に公知な方法に従い哺乳動物発現用ベクターに組み込むことによってカニクイザルＣＤＨ６発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｃｙｎｏＣＤＨ６が作製された。カニクイザルＣＤＨ６ ＯＲＦのアミノ酸配列を配列番号９に示す。
作製したプラスミドＤＮＡの大量調製は、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。
１）−２ 免疫
免疫にはＷＫＹ／Ｉｚｍラットの雌（日本エスエルシー社）を使用した。まずラット両足下腿部をＨｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）にて前処理後、同部位に実施例１）− １で作製したヒトＣＤＨ６発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｈＣＤＨ６を筋肉内注射した。続けて、ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ社）を使用し、２ニードル電極を用いて、同部位にインビボエレクトロポレーションを実施した。約二週間に一度、同様のインビボエレクトロポーレーションを繰り返した後、ラットのリンパ節又は脾臓を採取しハイブリドーマ作製に用いた。
１）−３ ハイブリドーマ作製
リンパ節細胞あるいは脾臓細胞とマウスミエローマＳＰ２／０−ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ， Ｎｏ．ＣＲＬ−１ ５８１）とをＬＦ３０１ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｕｎｉｔ（ＢＥＸ社）を用いて電気細胞融合した後、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に懸濁し、希釈して３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で培養した。出現した各々のハイブリドーマコロニーは、モノクローンとして回収され、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に懸濁して３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で培養した。適度に細胞が増殖した後、各々のハイブリドーマ細胞の凍結ストックを作製すると共に、得られたハイブリドーマ培養上清を抗ヒトＣＤＨ６抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングに用いた。
１）−４ Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法による抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
１）−４−１ Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ用抗原遺伝子発現細胞の調製
２９３α細胞（インテグリンαｖ及びインテグリンβ３を発現するＨＥＫ２９３由来の安定発現細胞株）を１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中５ｘ１０５細胞／ｍＬになるよう調製した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｆｔｉｆｉｃ社）を用いた形質移入手順に従って、この２９３α細胞に対して、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＣＤＨ６もしくはｐｃＤＮＡ３．１−ｃｙｎｏＣＤＨ６または、陰性コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１のＤＮＡを導入し、９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１００μＬずつ分注後、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で２４から２７時間培養した。得られた形質移入細胞を接着状態のまま、Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡに使用した。
１）−４−２ Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ
実施例１）−４−１で調製した発現ベクター導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＣＤＨ６もしくはｐｃＤＮＡ３．１−ｃｙｎｏＣＤＨ６またはｐｃＤＮＡ３．１導入２９３α細胞の各々に対しハイブリドーマ培養上清を添加し、４℃で１時間静置した。ｗｅｌｌ中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳ（＋）で１回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳ（＋）で５００倍に希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｔ ＩｇＧ−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ（ＳＩＧＭＡ社）を加えて、４℃で１時間静置した。ｗｅｌｌ中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳ（＋）で３回洗浄した後、ＯＰＤ発色液（ＯＰＤ溶解液（０．０５ Ｍ クエン酸３ナトリウム、０．１Ｍ リン酸水素２ナトリウム・１２水 ｐＨ４．５）にｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（和光純薬社）、Ｈ２Ｏ２をそれぞれ０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６％（ｖ／ｖ）になるように溶解）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、１Ｍ ＨＣｌを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。コントロールのｐｃＤＮＡ３．１導入２９３α細胞と比較し、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＣＤＨ６ならびにｐｃＤＮＡ３．１−ｃｙｎｏＣＤＨ６発現ベクター導入２９３α細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマをヒト、かつ、カニクイサルＣＤＨ６に結合する抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
１）−５ フローサイトメトリーによるカニクイサルＣＤＨ６への選択的結合抗体のスクリーニング
１）−５−１ フローサイトメトリー解析用抗原遺伝子発現細胞の調製
２９３Ｔ細胞を５×１０４細胞／ｃｍ２になるよう２２５ｃｍ２フラスコ（住友ベークライト社）に播種し、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。この２９３Ｔ細胞に、ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｙｎｏＣＤＨ６または、陰性コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて導入し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下でさらに一晩培養した。各ベクターを導入した２９３Ｔ細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｆｔｉｆｉｃ社）で処理し、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
１）−５−２ フローサイトメトリー解析
実施例１）−４のＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡで選択されたヒト、かつ、カニクイサルＣＤＨ６に結合する抗体産生ハイブリドーマが産生する抗体のカニクイサルＣＤＨ６に対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。実施例１）−５−１で調製した一過性発現２９３Ｔ細胞の懸濁液を遠心し、上清を除去した後、各々に対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｔ ＩｇＧ ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＳＩＧＭＡ社）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、２μｇ／ｍＬ ７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を含む５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＣ５００：ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社）で検出した。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社）で行った。７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のＦＩＴＣ蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるｐｃＤＮＡ３．１導入２９３Ｔ細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しｐｃＤＮＡ３．１−ｃｙｎｏＣＤＨ６導入２９３Ｔ細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしている抗体を産生するハイブリドーマを細胞膜表面上に発現するカニクイサルＣＤＨ６に特異的に結合する抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
１）−６ ラットモノクローナル抗体のアイソタイプの決定
実施例１）− ５で選択したラット抗ＣＤＨ６抗体産生ハイブリドーマの中から、ヒトならびにサルＣＤＨ６に強く特異的に結合することが示唆されたクローンｒＧ０１９、ｒＧ０５５、ｒＧ０５６、ｒＧ０６１を選抜し、各抗体のアイソタイプを同定した。抗体の重鎖のサブクラス、軽鎖のタイプは、ＲＡＴ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＩＳＯＴＹＰＩＮＧ ＴＥＳＴ ＫＩＴ（ＤＳファーマバイオメディカル社）により決定された。その結果、ｒＧ０１９、ｒＧ０５５、ｒＧ０５６、ｒＧ０６１の４クローンともサブクラスは、ＩｇＧ２ｂ、タイプはκ鎖であることが確認された。
１）−７ ラット抗ＣＤＨ６抗体の調製
１）−７−１ 培養上清作製
ラット抗ヒトＣＤＨ６モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清から精製した。まず、ラット抗ＣＤＨ６モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で充分量まで増殖させた後、Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ ＩｇＧ ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｆｔｉｆｉｃ社）を２０％添加したＨｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｆｔｉｆｉｃ社）に培地交換し、４−５日間培養した。本培養上清を回収し、０．８μｍのフィルターに通した後、さらに０．２μｍのフィルターに通して不溶物を除去した。
１）−７−２ ラット抗ＣＤＨ６抗体の精製
実施例１）−７−１で作製したハイブリドーマの培養上清から抗体（ラット抗ＣＤＨ６抗体（ｒＧ０１９，ｒＧ０５５，ｒＧ０５６，ｒＧ０６１））をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティークロマトグラフィーで精製した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に抗体を吸着させ、ＰＢＳでカラムを洗浄後に０．１Ｍ グリシン／塩酸水溶液（ｐＨ２．７）で溶出した。溶出液に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を加えてｐＨ７．０〜７．５に調整した後に、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ＵＦ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ３０Ｋ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）にてＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ ヒスチジン／５％ ソルビトール、ｐＨ６．０）へのバッファー置換を行うとともに抗体の濃縮を行い、抗体濃度を１ｍｇ／ｍＬに調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ−Ｐｌｕｓ ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。

［実施例２：ラット抗ＣＤＨ６抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価］
２）−１ フローサイトメトリーによるラット抗ＣＤＨ６抗体の結合能評価
実施例１）−７で作製したラット抗ＣＤＨ６抗体のヒトＣＤＨ６結合性をフローサイトメトリー法により評価した。実施例１）−１で作製したｐｃＤＮＡ３．１−ｈＣＤＨ６を２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて一過性に導入し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した後、細胞懸濁液を調製した。遺伝子導入した２９３Ｔ細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、実施例１）−７で調製したラット抗ＣＤＨ６モノクローナル抗体４種（クローン番号は、ｒＧ０１９、ｒＧ０５５、ｒＧ０５６及びｒＧ０６１）又はラットＩｇＧコントロール（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を終濃度１０ｎｇ／ｍＬ加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５０倍に希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｔ ＩｇＧ（ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）−ＦＩＴＣ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ（ＳＩＧＭＡ）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメーター（ＦＣ５００：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で行った。その結果を図１に示す。図１のヒストグラムにおいて、横軸は抗体結合量を表すＦＩＴＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。網掛けで示すヒストグラムはｈＣＤＨ６を導入していない陰性コントロール２９３Ｔ細胞を用いた場合を示し、白抜き実線で示すヒストグラムは、ｈＣＤＨ６導入２９３Ｔ細胞を用いた場合を示す。細胞表面のｈＣＤＨ６に抗体が結合したことによって蛍光強度が増強したことを示す。ラットＩｇＧコントロールはいずれの細胞にも結合しない。この結果、作製したラット抗ＣＤＨ６モノクローナル抗体４種はｐｃＤＮＡ３．１−ｈＣＤＨ６導入２９３Ｔ細胞に結合することを確認した。
２）−２ フローサイトメトリーによるラット抗ＣＤＨ６抗体のＣＤＨ６結合部位の解析
２）−２−１ ヒトＣＤＨ６各ドメイン欠失体発現ベクターの構築
ヒトＣＤＨ６の細胞外全長には５つの細胞外ドメイン、ＥＣ１（配列番号２）、ＥＣ２（配列番号３）、ＥＣ３（配列番号４）、ＥＣ４（配列番号５）、ＥＣ５（配列番号６）が存在する。ヒトＣＤＨ６全長から、５つのＥＣドメインを各一箇所ずつ欠失発現した遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔ社で合成し、当業者に公知な方法に従い哺乳動物発現用ベクターｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−９ベクター（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）へ組み込み、ＥＣ１からＥＣ５をそれぞれ欠失した、各ドメイン欠失体発現ベクターを作製した。
２）−２−２ フローサイトメトリーによるドメイン欠失体を用いたラット抗ＣＤＨ６抗体のエピトープ解析
各ＥＣドメイン欠失ベクターを導入した２９３α細胞株を用いたフローサイトメトリー解析により、ラット抗ヒトＣＤＨ６抗体の結合エピトープを同定した。インテグリンαｖおよびインテグリンβ３発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞内に安定形質移入した細胞株２９３α細胞株に対して、実施例２）−２−１で作成した各ドメイン欠失体発現ベクター、及び全長ヒトＣＤＨ６を発現するｐｃＤＮＡ３．１−ｈＣＤＨ６をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて一過性に導入し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した後、細胞懸濁液を調製した。導入２９３α細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、実施例１）−７で調製したラット抗ＣＤＨ６モノクローナル抗体４種（クローン番号は、ｒＧ０１９、ｒＧ０５５、ｒＧ０５６及びｒＧ０６１）又はラットＩｇＧコントロール（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を終濃度２０ｎＭで加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５０倍に希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｔ ＩｇＧ（ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）−ＦＩＴＣ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ（ＳＩＧＭＡ）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメーター（ＣａｎｔｏII：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で行った。その結果を図２−１〜図２−６に示す。図２−１〜図２−６のヒストグラムにおいて、横軸は抗体結合量を表すＦＩＴＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。網掛けで示すヒストグラムは遺伝子を導入していない陰性コントロール２９３α細胞を用いた場合を示し、白抜き実線で示すヒストグラムは、全長ｈＣＤＨ６又は各ＥＣドメイン欠失２９３細胞を用いた場合を示す。細胞表面の全長ｈＣＤＨ６又は各ＥＣドメイン欠失体に抗体が結合した場合は、蛍光強度が増強する。ラットＩｇＧコントロールはいずれの導入細胞にも結合しない。作製したラット抗ＣＤＨ６モノクローナル抗体４種は、全長ｈＣＤＨ６、ＥＣ１欠失体、ＥＣ２欠失体、ＥＣ４欠失体、及びＥＣ５欠失体には結合するが、ＥＣ３欠失体には結合しない。この結果から、ラット抗ＣＤＨ６モノクローナル抗体４種はｈＣＤＨ６のＥＣ３をエピトープとして特異的に結合することが示された。
２）−３ ラット抗ＣＤＨ６抗体の内在化活性
２）−３−１ ヒト腫瘍細胞株におけるＣＤＨ６の発現確認
取得抗体の評価に用いるＣＤＨ６陽性ヒト腫瘍細胞株を選抜するため、公知データベースからＣＤＨ６発現情報を検索し、フローサイトメトリー法により細胞膜表面でのＣＤＨ６の発現を評価した。ヒト卵巣腫瘍細胞株ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３，ＰＡ−１，ＥＳ−２及びヒト腎細胞腫瘍細胞株７８６−Ｏ（全てＡＴＣＣから入手）を３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で培養した後、細胞懸濁液を調製した。細胞を遠心し、上清を除去した後、市販抗ヒトＣＤＨ６抗体（ＭＡＢＵ２７１５，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又は陰性コントロールとしてマウスＩｇＧ１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を終濃度５０ｕｇ／ｍＬ加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５０倍に希釈したＦ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ（Ｄａｋｏ）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメーター（ＣａｎｔｏII：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で行った。その結果を図３に示す。図３のヒストグラムにおいて、横軸は抗体結合量を表すＦＩＴＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。網掛けで示すヒストグラムは陰性コントロールｍＩｇＧ１で染色した場合を示し、白抜き実線で示すヒストグラムは抗ヒトＣＤＨ６抗体で染色した場合を示す。細胞表面のｈＣＤＨ６に抗体が結合したことによって蛍光強度が増強したことを示す。ｍＩｇＧ１コントロールはいずれの細胞にも結合しない。この結果、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３，ＰＡ−１及び７８６−Ｏ細胞株は、内在的にＣＤＨ６を細胞表面上に発現することが示された。一方、ＥＳ−２細胞株はＣＤＨ６を全く発現しないことが示された。
２）−３−２ ラット抗ＣＤＨ６抗体の内在化活性評価
ラット抗ＣＤＨ６抗体の内在化活性は、タンパク質合成を阻害する毒素（サポリン）を結合させた抗ラットＩｇＧ試薬Ｒａｔ−ＺＡＰ（ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて評価した。すなわち、ヒトＣＤＨ６陽性卵巣腫瘍細胞株ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３（ＡＴＣＣ）を４ｘ１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌプレートに播種して３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。ヒトＣＤＨ６陽性腎細胞腫瘍細胞株７８６−Ｏ（ＡＴＣＣ）は１ｘ１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌプレートに播種して一晩培養した。翌日、ラット抗ＣＤＨ６抗体（終濃度：１ｎＭ）又は、陰性コントロール抗体としてラットＩｇＧ２ｂ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。さらに、Ｒａｔ−ＺＡＰ（終濃度：０．５ｎＭ）または、陰性コントロールとして毒素を結合していないＧｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｒａｔ ＩｇＧ， Ｆｃ（ｇａｍｍａ） Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＪＡＣＫＳＯＮ ＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣＨ）（終濃度：０．５ｎＭ）を添加し、３日間３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。生存細胞数は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によるＡＴＰ活性（ＲＬＵ）の定量で測定した。この評価では、ラット抗ＣＤＨ６抗体の内在化活性に依存してＲａｔ−ＺＡＰが細胞内に取り込まれ、タンパク合成を阻害するサポリンが細胞内に放出されることで、細胞増殖が抑制される。抗ＣＤＨ６抗体添加による細胞増殖抑制作用は、Ｒａｔ−ＺＡＰの代わりに陰性コントロールを添加したウェルの生存細胞数を１００％とした相対生存率で表記した。図４にグラフおよび細胞生存率の表を示す。この結果、ラット抗ＣＤＨ６抗体はＣＤＨ６に結合して内在化を引き起こすことが示された。

［実施例３：ラット抗ＣＤＨ６抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定］
３）−１ ｒＧ０１９重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の遺伝子断片の増幅および配列決定
３）−１−１ Ｇ０１９からのｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製
ｒＧ０１９の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅するためＧ０１９よりＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。
３）−１−２ ５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによるｒＧ０１９の重鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅とヌクレオチド配列の決定
重鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅は、実施例３）−１−１で調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡの約１μｇとＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて実施した。ｒＧ０１９の重鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ （Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔに付属）、及び公知のラット重鎖の定常領域の配列から設計したプライマーを用いた。
５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲで増幅した重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをプラスミドにクローニングし、次に重鎖の可変領域のｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
決定されたｒＧ０１９の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１６に示し、アミノ酸配列を配列番号１５に示した。
３）−１−３ ５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによるｒＧ０１９の軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅とヌクレオチド配列の決定
実施例３）−１−２と同様の方法で実施した。ただし、ｒＧ０１９の軽鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ （Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔに付属）、及び公知のラット軽鎖の定常領域の配列から設計したプライマーを用いた。
決定されたｒＧ０１９の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１１に示し、アミノ酸配列を配列番号１０に示した。
３）−２ ｒＧ０５５重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の遺伝子断片の増幅および配列決定
実施例３）−１と同様の方法で配列を決定した。
決定されたｒＧ０５５の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号２６に示し、アミノ酸配列を配列番号２５に示した。軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号２１に示し、アミノ酸配列を配列番号２０に示した。
３）−３ ｒＧ０５６重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の遺伝子断片の増幅および配列決定
実施例３）−１と同様の方法で配列を決定した。
決定されたｒＧ０５６の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号３６に示し、アミノ酸配列を配列番号３５に示した。軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号３１に示し、アミノ酸配列を配列番号３０に示した。
３）−４ ｒＧ０６１重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の遺伝子断片の増幅および配列決定
実施例３）−１と同様の方法で配列を決定した。
決定されたｒＧ０６１の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号４６に示し、アミノ酸配列を配列番号４５に示した。軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号４１に示し、アミノ酸配列を配列番号４０に示した。

［実施例４：ヒトキメラ化抗ＣＤＨ６抗体ｃｈＧ０１９の作製］
４）−１ ヒトキメラ化抗ＣＤＨ６抗体ｃｈＧ０１９の発現ベクターの構築
４）−１−１ キメラ及びヒト化軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ−ＬＫの構築
プラスミドｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して得られる約５．４ｋｂのフラグメントと、配列番号５０に示すヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを作製した。
ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫからネオマイシン発現ユニットを除去することによりｐＣＭＡ−ＬＫを構築した。
４）−１−２ キメラ及びヒト化ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ−Ｇ１の構築
ｐＣＭＡ−ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたＤＮＡ断片と、配列番号５１で示されるヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ１定常領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ｐＣＭＡ−Ｇ１を構築した。
４）−１−３ ｃｈＧ０１９重鎖発現ベクターの構築
配列番号５７に示すｃｈＧ０１９重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４４０に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ｐＣＭＡ−Ｇ１を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所に合成したＤＮＡ断片を挿入することによりｃｈＧ０１９重鎖発現ベクターを構築した。なお、ｃｈＧ０１９重鎖は予期せぬジスルフィド結合を防ぐため、ＣＤＲ中のシステインをプロリンに置換した配列を用いた。
４）−１−４ ｃｈＧ０１９軽鎖発現ベクターの構築
配列番号５２に示すｃｈＧ０１９軽鎖をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、合成したＤＮＡ断片とｐＣＭＡ−ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたＤＮＡ断片を結合することにより、ｃｈＧ０１９軽鎖発現ベクターを構築した。
４）−２ ヒトキメラ化抗ＣＤＨ６抗体ｃｈＧ０１９の生産及び精製
４）−２−１ ｃｈＧ０１９の生産
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の１．２×１０９個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３Ｌ Ｆｅｒｎｂａｃｈ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ Ｆｌａｓｋ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈して２．０×１０６細胞／ｍｌに調製した。４０ｍｌのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に０．２４ｍｇの重鎖発現ベクターと０．３６ｍｇの軽鎖発現ベクターと１．８ｍｇのＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ ＃２４７６５）を加えて穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで４時間、９０ｒｐｍで振とう培養後に６００ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ ＶＰＲＯ培地（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１８ｍｌのＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（ＧＩＢＣＯ社）、及び３０ｍｌのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社）を添加し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｃａｐｓｕｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ （Ａｄｖａｎｔｅｃ ＃ＣＣＳ−０４５−Ｅ１Ｈ）でろ過した。
４）−２−２ ｃｈＧ０１９の精製
実施例４）−２−１で得られた培養上清をｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの１段階工程で精製した。培養上清をＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅが充填されたカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にアプライしたのちに、カラム容量の２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ ヒスチジン／５％ ソルビトール、ｐＨ６．０）へのバッファー置換を行った。Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ＵＦ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）で抗体を濃縮し、ＩｇＧ濃度を５ｍｇ／ｍｌ以上に調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ−Ｐｌｕｓ ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。
４）−３ ヒトキメラ化抗ＣＤＨ６抗体ｃｈＧ０１９の結合性評価
４）−２で精製したヒトキメラ化抗ＣＤＨ６抗体ｃｈＧ０１９のＣＤＨ６結合性をフローサイトメトリー法により確認した。実施例１）−１で作製したｐｃＤＮＡ３．１−ｈＣＤＨ６、又はｐｃＤＮＡ３．１−ｃｙｎｏＣＤＨ６、又はｐｃＤＮＡ３．１をそれぞれ２９３α細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて一過性に導入し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した後、細胞懸濁液を調製した。これらの細胞懸濁液にｃｈＧ０１９を加えて４℃で１時間静置した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄し、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＰＥ標識Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ抗ヒトＩｇＧ，Ｆｃγ抗体（ＪＡＣＫＳＯＮ ＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣＨ）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＣａｎｔｏII：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で行った。図５に示すとおり、ｃｈＧ０１９は陰性コントロールであるｐｃＤＮＡ３．１導入２９３Ｔ細胞には結合せず、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＣＤＨ６及びｐｃＤＮＡ３．１−ｃｙｎｏＣＤＨ６導入２９３Ｔ細胞に抗体濃度依存的に結合した。図５において横軸は抗体濃度を示し、縦軸は結合量をＭｅａｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（平均蛍光強度）で示す。この結果から、ｃｈＧ０１９が、ヒトおよびカニクイザルＣＤＨ６に対して特異的に結合し、結合活性はほぼ同等であることがわかる。

［実施例５：ヒト化抗ＣＤＨ６抗体の作製］
５）−１ 抗ＣＤＨ６抗体のヒト化体デザイン
５）−１−１ ｃｈＧ０１９の可変領域の分子モデリング
ｃｈＧ０１９の可変領域の分子モデリングは、ホモロジーモデリングとして公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１−１５３，（１９９１））を利用した。ｃｈＧ０１９の重鎖と軽鎖の可変領域に対して高い配列同一性を有するＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３５，Ｄ３０１−Ｄ３０３（２００７））に登録されている構造（ＰＤＢ ＩＤ：２Ｉ９Ｌ）を鋳型に、市販のタンパク質立体構造解析プログラムＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社製）を用いて行った。
５）−１−２ ヒト化ｈＧ０１９に対するアミノ酸配列の設計
ｃｈＧ０１９は、ＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９−１００３３（１９８９））によりヒト化した。ＫＡＢＡＴ ｅｔ ａｌ．（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））において既定されるヒトのｇａｍｍａ鎖サブグループ１およびｋａｐｐａ鎖サブグループ１のコンセンサス配列が、ｃｈＧ０１９のフレームワーク領域に対して高い同一性を有することから、それぞれ、重鎖と軽鎖のアクセプターとして選択された。アクセプター上に移入すべきドナー残基は、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９−１００３３（１９８９））によって与えられる基準などを参考に三次元モデルを分析することで選択された。
５）−２ ｃｈＧ０１９重鎖のヒト化
設計された３種の重鎖をｈＨ０１、ｈＨ０２及びｈＨ０４と命名した。ｈＨ０１の重鎖全長アミノ酸配列を、配列番号６９に記載する。配列番号６９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号７０に記載する。ｈＨ０２の重鎖全長アミノ酸配列を、配列番号７３に記載する。配列番号７３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号７４に記載する。ｈＨ０４の重鎖全長アミノ酸配列を、配列番号７７に記載する。配列番号７７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号７８に記載する。
５）−３ ｃｈＧ０１９軽鎖のヒト化
設計された２種の軽鎖をｈＬ０２およびｈＬ０３と命名した。ｈＬ０２の軽鎖全長アミノ酸配列を、配列番号６１に記載する。配列番号６１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号６２に記載する。ｈＬ０３の軽鎖全長アミノ酸配列を、配列番号６５に記載する。配列番号６５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６６に記載する。
５）−４ 重鎖及び軽鎖の組み合わせによるヒト化ｈＧ０１９の設計
ｈＨ０１及びｈＬ０２からなる抗体を「Ｈ０１Ｌ０２抗体」又は「Ｈ０１Ｌ０２」と称する。ｈＨ０２及びｈＬ０２からなる抗体を「Ｈ０２Ｌ０２抗体」又は「Ｈ０２Ｌ０２」と称する。ｈＨ０２及びｈＬ０３からなる抗体を「Ｈ０２Ｌ０３抗体」又は「Ｈ０２Ｌ０３」と称する。ｈＨ０４及びｈＬ０２からなる抗体を「Ｈ０４Ｌ０２抗体」又は「Ｈ０４Ｌ０２」と称する。
５）−５ ヒト化抗ＣＤＨ６抗体の発現
５）−５−１ ヒト化ｈＧ０１９の重鎖発現ベクターの構築
５）−５−１−１ ヒト化ｈＧ０１９−Ｈ０１タイプ重鎖発現ベクターの構築
配列番号７０に示すヒト化ｈＧ０１９−Ｈ０１タイプ重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４４０に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例４）−１−３と同様の方法でヒト化ｈＧ０１９−Ｈ０１タイプ重鎖発現ベクターを構築した。
５）−５−１−２ ヒト化ｈＧ０１９−Ｈ０２タイプ重鎖発現ベクターの構築
配列番号７４に示すヒト化ｈＧ０１９−Ｈ０２タイプ重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４４０に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例４）−１−３と同様の方法でヒト化ｈＧ０１９−Ｈ０２タイプ重鎖発現ベクターを構築した。
５）−５−１−３ ヒト化ｈＧ０１９−Ｈ０４タイプ重鎖発現ベクターの構築
配列番号７８に示すヒト化ｈＧ０１９−Ｈ０４タイプ重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４４０に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例４）−１−３と同様の方法でヒト化ｈＧ０１９−Ｈ０４タイプ重鎖発現ベクターを構築した。
５）−５−２ ヒト化ｈＧ０１９の軽鎖発現ベクターの構築
５）−５−２−１ ヒト化ｈＧ０１９−Ｌ０２タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列番号６２に示すヒト化ｈＧ０１９−Ｌ０２タイプ軽鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至３９９に示されるヒト化ｈＧ０１９−Ｌ０２タイプ軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ｐＣＭＡ−ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所に合成したＤＮＡ断片を挿入することによりヒト化ｈＧ０１９−Ｌ０２タイプ軽鎖発現ベクターを構築した。
５）−５−２−２ ヒト化ｈＧ０１９−Ｌ０３タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列番号６６に示すヒト化ｈＧ０１９−Ｌ０３タイプ軽鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至３９９に示されるヒト化ｈＧ０１９−Ｌ０３タイプ軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例５）−５−２−１と同様の方法でヒト化ｈＧ０１９−Ｌ０３タイプ軽鎖発現ベクターを構築した。
５）−５−３ ヒト化ｈＧ０１９の調製
５）−５−３−１ Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３、Ｈ０４Ｌ０２の生産
実施例４）−２−１と同様の方法で生産した。実施例５）−４に示した重鎖と軽鎖の組み合わせにより、Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３、Ｈ０４Ｌ０２を生産した。
５）−５−３−２ Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３、Ｈ０４Ｌ０２の２ｓｔｅｐ精製
実施例５）−５−３−１で得られた培養上清をｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーとセラミックハイドロキシアパタイトの２段階工程で精製した。培養上清をＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅが充填されたカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にアプライした後に、カラム容量の２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で抗体を溶出した。抗体の含まれる画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＰＢＳへのバッファー置換を行い、５ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭ ＭＥＳ／ｐＨ７．０のバッファーで５倍希釈した後に、５ｍＭ ＮａＰｉ／５０ｍＭ ＭＥＳ／３０ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ７．０のバッファーで平衡化したセラミックハイドロキシアパタイトカラム（日本バイオラッド、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ Ｔｙｐｅ―１ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｃｏｌｕｍｎ）にアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ ヒスチジン／５％ ソルビトール、ｐＨ６．０）へのバッファー置換を行った。Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ＵＦ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）にて抗体を濃縮し、ＩｇＧ濃度を２０ｍｇ／ｍｌに調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ−Ｐｌｕｓ ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。

［参考例１：抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２の作製］
実施例で用いた抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２は、国際公開第２０１６／０２４１９５号に記載のＮＯＶ０７１２の軽鎖全長、及び重鎖全長のアミノ酸配列（それぞれ、国際公開第２０１６／０２４１９５の配列番号２３５及び配列番号２３４）を参照して作製した。
参考例１）−１抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２
参考例１）−１−１ 抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２の重鎖発現ベクターの構築
配列番号８４に示すＮＯＶ０７１２の重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４２８に示されるＮＯＶ０７１２の重鎖の可変領域を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例４）−１−３と同様の方法でＮＯＶ０７１２の重鎖発現ベクターを構築した。当該ＮＯＶ０７１２の重鎖発現ベクターにより発現するＮＯＶ０７１２の重鎖のアミノ酸配列を、配列番号８３に示す。配列番号８３に示されるアミノ酸配列中、１〜１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列である。
参考例１）−１−２ 抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２の軽鎖発現ベクターの構築
配列番号８２に示すＮＯＶ０７１２の軽鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０５に示されるＮＯＶ０７１２の軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例５）−５−２−１と同様の方法でＮＯＶ０７１２の軽鎖発現ベクターを構築した。当該ＮＯＶ０７１２の軽鎖発現ベクターにより発現するＮＯＶ０７１２の軽鎖のアミノ酸配列を、配列番号８１に示す。配列番号８１に示されるアミノ酸配列中、１〜２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列である。
参考例１）−２ 抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２の調製
参考例１）−２−１ 抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２の生産
実施例４）−２−１と同様の方法でＮＯＶ０７１２を生産した。
参考例１）−２−２ 抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２の１ｓｔｅｐ精製
参考例１）−２−１で得られた培養上清から実施例４）−２−２と同様の方法で抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２を精製した（抗体濃度ＨＢＳｏｒで５ｍｇ／ｌ）。

［実施例６：ヒト化ｈＧ０１９およびＮＯＶ０７１２のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価］
６）−１ ヒト化ｈＧ０１９の結合性評価
６）−１−１ ヒト化ｈＧ０１９のヒトＣＤＨ６抗原結合能
抗体と抗原（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＣＤＨ６ Ｆｃ Ｈｉｓ ｃｈｉｍｅｒａ， Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）との解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を使用し、固定化した抗Ｈｉｓ抗体に抗原をリガンドとして捕捉（キャプチャー）し、抗体をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。抗ヒスチジン抗体（Ｈｉｓ ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）は、センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）へ、アミンカップリング法にて約１０００ＲＵ共有結合させた。リファレンスセルにも同様に固定化した。ランニングバッファーとして１ｍＭ ＣａＣｌ２を添加したＨＢＳ−Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）を用いた。抗ヒスチジン抗体を固定化したチップ上に、抗原を６０秒間添加した後、抗体の希釈系列溶液（０．３９１−１００ｎＭ）を流速３０μｌ／分で３００秒間添加し、引き続き６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、５Ｍ ＭｇＣｌ２を添加したＧｌｙｃｉｎｅ溶液ｐＨ１．５を流速１０μｌ／分で３０秒間、２回添加した。データの解析は、分析ソフトウェア（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ， ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１）のＳｔｅａｄｙ Ｓｔａｔｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙモデルを用いて、解離定数（ＫＤ）を算出した。結果を表２に示す。
６）−１−２ ヒト、サル、マウス、ラットＣＤＨ６に対する結合性
実施例１）−１で作製したｐｃＤＮＡ３．１−ｈＣＤＨ６、ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｙｎｏＣＤＨ６、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−９−ｍＣＤＨ６、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−９−ｒＣＤＨ６を、２９３α細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて一過性に導入し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した後、細胞懸濁液を調製した。陰性コントロールとして、遺伝子導入していない２９３α細胞を用いた。上記にて作製した２９３α細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、実施例５）−５−３で調製したヒト化ｈＧ０１９抗体４種（クローン番号は、Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３およびＨ０４Ｌ０２）、又は、ヒトＩｇＧ１コントロール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｆｃｇ ＰＥ ｇｏａｔ Ｆ（ａｂ’）（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメーター（ＣａｎｔｏII：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で行った。図６−１及び図６−２において横軸は抗体濃度を示し、縦軸は結合量をＭｅａｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（平均蛍光強度）で示す。図６−１及び図６−２に示すとおり、陰性コントロールであるヒトＩｇＧ１コントロールは、いずれのＣＤＨ６遺伝子導入細胞に対しても結合しない。ヒト化ｈＧ０１９抗体４種（クローン番号は、Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３およびＨ０４Ｌ０２）はヒト及びカニクイザルＣＤＨ６に結合するが、マウス及びラットＣＤＨ６には結合しない。いずれの抗体も、陰性コントロールである空ベクターｐｃＤＮＡ３．１導入細胞には結合しない。一方、ＮＯＶ０７１２抗体はヒト、カニクイザル、マウス、及びラットＣＤＨ６全てに結合活性を示すことが国際公開第２０１６／０２４１９５号に示されている。この結果、本明細書で取得したヒト化ｈＧ０１９抗体４種は、ＮＯＶ０７１２抗体と異なる結合性質を示す抗ＣＤＨ６抗体であることが示された。
６）−２ ヒト化ｈＧ０１９およびＮＯＶ０７１２のＣＤＨ６結合部位の解析
６）−２−１ ドメイン欠失体を用いたエピトープ解析
実施例２）−２−１で作成した各ドメイン欠失体発現ベクター、及び全長ｈＣＤＨ６を発現するｐｃＤＮＡ３．１−ｈＣＤＨ６をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて一過性に導入し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した後、細胞懸濁液を調製した。遺伝子導入した２９３α細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、実施例５）−５−３で調製したヒト化ｈＧ０１９抗体４種（クローン番号は、Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３およびＨ０４Ｌ０２）、又は、参考例１で調製した抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２、又は、陰性コントロールとしてヒトＩｇＧ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＡＰＣ−ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｇｏａｔ Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメーター（ＣａｎｔｏII：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で行った。その結果を図７−１〜図７−６に示す。図７−１〜図７−６のヒストグラムにおいて、横軸は抗体結合量を表すＡＰＣの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。網掛けで示すヒストグラムは遺伝子を導入していない陰性コントロール２９３α細胞を用いた場合を示し、白抜き実線で示すヒストグラムは、全長ｈＣＤＨ６又は各ＥＣドメイン欠失２９３α細胞を用いた場合を示す。細胞表面の全長ｈＣＤＨ６又は各ＥＣドメイン欠失体に抗体が結合した場合は、蛍光強度が増強する。ヒトＩｇＧ１コントロールはいずれの導入細胞にも結合しない。ヒト化ｈＧ０１９抗体４種（クローン番号は、Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３およびＨ０４Ｌ０２）は、全長ｈＣＤＨ６、ＥＣ１欠失体、ＥＣ２欠失体、ＥＣ４欠失体、及びＥＣ５欠失体には結合するが、ＥＣ３欠失体には結合しない。すなわち、ヒト化ｈＧ０１９抗体４種はｈＣＤＨ６のＥＣ３をエピトープとして特異的に結合することが示された。一方、抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２は、全長ｈＣＤＨ６、ＥＣ１欠失体、ＥＣ２欠失体、ＥＣ３欠失体、及びＥＣ４欠失体には結合するが、ＥＣ５欠失体には結合しない。すなわち、抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２抗体はｈＣＤＨ６のＥＣ５をエピトープとして特異的に結合することが示され、国際公開第２０１６／０２４１９５号に記載されているＮＯＶ０７１２のエピトープ情報と一致する。この結果から、ＮＯＶ０７１２と本明細書で取得したヒト化ｈＧ０１９抗体４種は、異なる性質を示す抗ＣＤＨ６抗体であることが示された。
６）−２−２ 抗体の結合競合アッセイ
６）−２−２−１ ７８６−Ｏ／ｈＣＤＨ６安定発現細胞株の作製
７８６−Ｏ／ｈＣＤＨ６安定発現細胞株は、７８６−Ｏ細胞（ＡＴＣＣ）にヒトＣＤＨ６全長発現用組換えレトロウイルスを感染させることにより作製した。ヒトＣＤＨ６発現レトロウイルスベクター（ｐＱＣＸＩＮ−ｈＣＤＨ６）は、ヒトＣＤＨ６タンパク質（ＮＰ＿００４９２３）をコードするｃＤＮＡ発現ベクター（ＯｒｉＧｅｎｅ社ＲＣ２１７８８９）を用いて、当業者に公知な方法に従いレトロウイルスベクターｐＱＣＸＩＮ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に組み込むことにより作製された。ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてレトロウイルスパッケージング細胞ＲｅｔｒｏＰａｃｋ ＰＴ６７（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）にｐＱＣＸＩＮ−ｈＣＤＨ６を一過性に導入し、４８時間後に組換えレトロウイルスを含む培養上清を回収し、７８６−Ｏ細胞培養系に添加することで同細胞に感染させた。感染３日後から、Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を終濃度５０ｍｇ／ｍＬで添加した培地で３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で培養を行い感染細胞の薬剤選抜を行うことで、ヒトＣＤＨ６を安定的に発現する細胞株７８６−Ｏ／ｈＣＤＨ６を樹立した。実施例２）−３−１と同様にフローサイトメトリーにて安定発現株でのヒトＣＤＨ６の高発現を確認した（図８）。検出用抗体には５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＧｏａｔ ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。その結果を図８に示す。図８のヒストグラムにおいて、横軸は抗体結合量を表すＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７の蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。網掛けで示すヒストグラムは陰性コントロールｍＩｇＧ１で染色した場合を示し、白抜き実線で示すヒストグラムは抗ヒトＣＤＨ６抗体で染色した場合を示す。細胞表面のｈＣＤＨ６に抗体が結合したことによって蛍光強度が増強したことを示す。ｍＩｇＧ１コントロールはいずれの細胞にも結合しない。この結果、７８６−Ｏ／ｈＣＤＨ６安定発現細胞株では親株７８６−Ｏ細胞と比較して、ヒトＣＤＨ６を高発現することが示された。
６）−２−２−２ ラベル化Ｈ０１Ｌ０２及びラベル化ＮＯＶ０７１２を用いた結合競合アッセイ
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、ラベル化Ｈ０１Ｌ０２及びラベル化ＮＯＶ０７１２を作製した。７）−２−２−１で作製した７８６−Ｏ／ｈＣＤＨ６安定発現細胞株の細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、ラベル化ＮＯＶ０７１２又はラベル化Ｈ０１Ｌ０２を終濃度５ｎＭで添加し、さらに実施例５）−５−３で調製したヒト化ｈＧ０１９抗体４種（クローン番号は、Ｈ０１Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０２、Ｈ０２Ｌ０３およびＨ０４Ｌ０２）、又は、参考例１で調製した抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２、又は、陰性コントロールとしてヒトＩｇＧ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を図９の横軸で示す終濃度で添加して懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメーター（ＣａｎｔｏＩＩ：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で行った。その結果を図９に示す。横軸はラベル化していない抗体の添加時の終濃度を示し、縦軸は結合量をＭｅａｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（平均蛍光強度）で示す。ラベル化ＮＯＶ０７１２を添加した細胞にラベル化していないＮＯＶ０７１２を添加した場合は、同じエピトープを持ち結合が競合するため、添加濃度依存的にラベル化していない抗体に置き換わりラベル化抗体の結合量が減少する。一方、ラベル化ＮＯＶ０７１２を添加した細胞にヒト化ｈＧ０１９抗体４種、又は陰性コントロールとしてヒトＩｇＧ１を添加しても、ラベル化抗体の結合量に変化は無いことから、これらの抗体はエピトープが異なり結合が競合しないことが示される。同様に、ラベル化Ｈ０１Ｌ０２を添加した細胞にラベル化していないヒト化ｈＧ０１９抗体４種を添加した場合は、同じエピトープを持ち結合が競合するため、添加濃度依存的にラベル化していない抗体に置き換わりラベル化抗体の結合量が減少する。一方、ラベル化Ｈ０１Ｌ０２を添加した細胞にＮＯＶ０７１２、又は陰性コントロールとしてヒトＩｇＧ１を添加しても、ラベル化抗体の結合量に変化は無いことから、これらの抗体はエピトープが異なり結合が競合しないことが示される。
６）−３ ヒト化ｈＧ０１９およびＮＯＶ０７１２の内在化活性評価
ヒト化ｈＧ０１９およびＮＯＶ０７１２の内在化活性は、タンパク質合成を阻害する毒素（サポリン）を結合させた抗ヒトＩｇＧ試薬Ｈｕｍ−ＺＡＰ（ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて評価した。すなわち、ヒトＣＤＨ６陽性卵巣腫瘍細胞株ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３（ＡＴＣＣ）を４ｘ１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌプレートに播種して３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。ヒトＣＤＨ６陽性腎細胞腫瘍細胞株７８６−Ｏ（ＡＴＣＣ）は１ｘ１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌプレートに播種して一晩培養した。ヒトＣＤＨ６陽性卵巣腫瘍細胞株ＰＡ−１（ＡＴＣＣ）を１ｘ１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌプレートに播種して３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、抗ＣＤＨ６抗体（終濃度：１ｎＭ）、又は、陰性コントロール抗体としてヒトＩｇＧ１抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加した。さらにＨｕｍ−ＺＡＰ（終濃度：０．５ｎＭ）または、陰性コントロールとして毒素を結合していないＦ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃ（ｇａｍｍａ） Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＪＡＣＫＳＯＮ ＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣＨ）（終濃度：０．５ｎＭ）を添加し、３日間３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。生存細胞数は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ＡｓｓａｙによるＡＴＰ活性（ＲＬＵ）の定量で測定した。この評価では、ヒト化抗ＣＤＨ６抗体の内在化活性に依存してＨｕｍ−ＺＡＰが細胞内に取り込まれ、タンパク合成を阻害するサポリンが細胞内に放出されることで、細胞増殖が抑制される。抗ＣＤＨ６抗体添加による細胞増殖抑制作用は、Ｈｕｍ−ＺＡＰの代わりに陰性コントロールを添加したウェルの生存細胞数を１００％とした相対生存率で表記した。図１０−1〜図１０−３にグラフおよび細胞生存率の表を示す。本実験において内在化活性が強い抗体は低い細胞生存率を示すと考えられる。この結果、ＮＯＶ０７１２はヒト化ｈＧ０１９抗体４種は３種の細胞株いずれにおいても細胞生存率から予測される内在化率は約５０〜７５％であり、非常に高い内在化活性を示し、ＮＯＶ０７１２と比較して、さらに高い内在活性を示す。ＡＤＣの薬効メカニズムから、高い内在化活性を有する抗体は、ＡＤＣ化抗体をして、より適していると考えられる。

［実施例７：ヒト化ｈＧ０１９−薬物コンジュゲートの作製］
７）−１ 抗体−薬物コンジュゲートの作製 Ｈ０１Ｌ０２−ＤＸｄ
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（１）
抗体の還元：実施例５にて作製したＨ０１Ｌ０２を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５３ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて９．８５ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（５．７ｍＬ）に１０ｍＭ ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．２３１ｍＬ；抗体一分子に対して６．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０８５５ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認した後に、３７℃で２時間インキュベートすることによって、抗体内鎖間部のジスルフィド結合を還元した。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃で１０分間インキュベートした。次いでＮ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［（２−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−２−オキソエトキシ）メチル］グリシンアミドの１０ｍＭ ジメチルスルホキシド溶液（０．３８６ｍＬ；抗体一分子に対して１０当量）を加え、１５℃で１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０３４７ｍＬ；抗体一分子に対して９当量）を加え、さらに室温にて２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲート「Ｈ０１Ｌ０２−ＡＤＣ」を含有する溶液を１９ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（εＤ，２８０＝５４４０、εＤ，３７０＝２１２４０を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：２．２６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：４２．９ｍｇ（７６％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．９；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．７。
７）−２ 抗体−薬物コンジュゲートの作製 Ｈ０２Ｌ０２−ＤＸｄ
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（２）
抗体の還元：実施例５にて作製したＨ０２Ｌ０２を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて９．９５ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（５．７ｍＬ）に１０ｍＭ ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．２３４ｍＬ；抗体一分子に対して６．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０８５５ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認した後に、３７℃で２時間インキュベートすることによって、抗体内鎖間部のジスルフィド結合を還元した。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃で１０分間インキュベートした。次いでＮ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［（２−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−２−オキソエトキシ）メチル］グリシンアミドの１０ｍＭ ジメチルスルホキシド溶液（０．３８９ｍＬ；抗体一分子に対して１０当量）を加え、１５℃で１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０３５０ｍＬ；抗体一分子に対して９当量）を加え、さらに室温にて２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲート「Ｈ０２Ｌ０２−ＡＤＣ」を含有する溶液を１９ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（εＤ，２８０＝５４４０、εＤ，３７０＝２１２４０を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：２．６１ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：４９．６ｍｇ（８７％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．９；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．６。
７）−３ 抗体−薬物コンジュゲートの作製 Ｈ０２Ｌ０３−ＤＸｄ
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（３）
抗体の還元：実施例５にて作製したＨ０２Ｌ０３を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５３ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて９．８６ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（５．７ｍＬ）に１０ｍＭ ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．２７０ｍＬ；抗体一分子に対して７．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０８５５ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認した後に、３７℃で２時間インキュベートすることによって、抗体内鎖間部のジスルフィド結合を還元した。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃で１０分間インキュベートした。次いでＮ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［（２−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−２−オキソエトキシ）メチル］グリシンアミドの１０ｍＭ ジメチルスルホキシド溶液（０．３８６ｍＬ；抗体一分子に対して１０当量）を加え、１５℃で１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０３４７ｍＬ；抗体一分子に対して９当量）を加え、さらに室温にて２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲート「Ｈ０１Ｌ０２−ＡＤＣ」を含有する溶液を１９ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（εＤ，２８０＝５４４０、εＤ，３７０＝２１２４０を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：２．７１ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：５１．４ｍｇ（９１％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．７；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．６。
７）−４ 抗体−薬物コンジュゲートの作製 Ｈ０４Ｌ０２−ＤＸｄ
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（４）
抗体の還元：実施例５にて作製したＨ０４Ｌ０２を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５３ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて９．８６ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（５．７ｍＬ）に１０ｍＭ ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．２３２ｍＬ；抗体一分子に対して６．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０８５５ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認した後に、３７℃で２時間インキュベートすることによって、抗体内鎖間部のジスルフィド結合を還元した。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃で１０分間インキュベートした。次いでＮ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［（２−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−２−オキソエトキシ）メチル］グリシンアミドの１０ｍＭ ジメチルスルホキシド溶液（０．３８６ｍＬ；抗体一分子に対して１０当量）を加え、１５℃で１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０３４７ｍＬ；抗体一分子に対して９当量）を加え、さらに室温にて２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲート「Ｈ０４Ｌ０２−ＡＤＣ」を含有する溶液を１９ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（εＤ，２８０＝５４４０、εＤ，３７０＝２１２４０を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：２．５６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：４８．７ｍｇ（８７％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．８；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．６。

［参考例２：ＮＯＶ０７１２−薬物コンジュゲートの作製］
参考例２）−１ 抗体−薬物コンジュゲートの作製 ＮＯＶ０７１２−ＤＭ４
抗体−薬物コンジュゲート（５）
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：参考例1にて作製したＮＯＶ０７１２を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣを用いて、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ８．１（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製 ＨＥＰＥＳ， １Ｍ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２０ｍＬ）を１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ８．１とした後、蒸留水にて１Ｌとした）にて９．７ｍｇ／ｍＬに調製し、２０℃で１０分間インキュベートした。次いでＷＯ２０１６／０２４１９５号公開特許公報に記載の１０ｍＭ １−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−１−オキソ−４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタン−２−スルフォン酸のＤＭＡ溶液（０．３６６ｍＬ；抗体一分子に対して５．２当量）、１０ｍＭ Ｎ２−デアセチル−デアセチル−Ｎ２−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）のＤＭＡ溶液（０．３６６ｍＬ；抗体一分子に対して６．８当量）、及び０．２４３ｍＬのＤＭＡを加え、２０℃で１６時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１Ｍ 酢酸水溶液を加えｐＨ５．０とし、さらに室温にて２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲート「ＮＯＶ０７１２−ＤＭ４」を含有する溶液を２８ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（εＡ，２８０＝２００５００、εＡ，２５２＝７６２９５、εＤ，２８０＝４３１７０、及びεＤ，２５２＝２３２２４を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：２．５８ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：７２．２ｍｇ（９３％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：３．０。
参考例２）−２ 抗体−薬物コンジュゲートの作製 ＮＯＶ０７１２−ＤＸｄ
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（６）
抗体の還元：参考例１にて作製したＮＯＶ０７１２を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて９．２６ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（６．６ｍＬ）に１０ｍＭ ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．２５４ｍＬ；抗体一分子に対して６．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０９９０ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認した後に、３７℃で２時間インキュベートすることによって、抗体内鎖間部のジスルフィド結合を還元した。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃で１０分間インキュベートした。次いでＮ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［（２−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−２−オキソエトキシ）メチル］グリシンアミドの１０ｍＭ ジメチルスルホキシド溶液（０．３８１ｍＬ；抗体一分子に対して９当量）を加え、１５℃で１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０３８１ｍＬ；抗体一分子に対して９当量）を加え、さらに室温にて２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲート「ＮＯＶ０７１２−ＡＤＣ」を含有する溶液を２３．５ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（εＤ，２８０＝５４４０、εＤ，３７０＝２１２４０を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：２．２６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：５６．４ｍｇ（９２％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：６．４；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．８。

［参考例３：Ｈ０１Ｌ０２−ＤＭ４の作製］
参考例３）−１ 抗体−薬物コンジュゲートの作製 Ｈ０１Ｌ０２−ＤＭ４
抗体−薬物コンジュゲート（７）
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：実施例５にて作製したＨ０１Ｌ０２を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．５３ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣを用いて、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ８．１（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製 ＨＥＰＥＳ， １Ｍ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２０ｍＬ）を１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ８．１とした後、蒸留水にて１Ｌとした）にて９．８ｍｇ／ｍＬに調製し、２０℃で１０分間インキュベートした。次いでＷＯ２０１６／０２４１９５号公開特許公報に記載の１０ｍＭ １−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−１−オキソ−４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタン−２−スルフォン酸のＤＭＡ溶液（０．０６２ｍＬ；抗体一分子に対して１１．５当量）、１０ｍＭ Ｎ２−デアセチル−Ｎ２−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）のＤＭＡ溶液（０．０８２ｍＬ；抗体一分子に対して１５．１当量）を加え、２０℃で１８時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１Ｍ 酢酸水溶液を加えｐＨ５．０とし、さらに室温にて２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲート「Ｈ０１Ｌ０２−ＤＭ４」を含有する溶液を３．５ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（εＡ，２８０＝２２３４００、εＡ，２５２＝８５６４６、εＤ，２８０＝４３１７、及びεＤ，２５２＝２３２２４を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：１．９７ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：６．９０ｍｇ（８８％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：３．６。

［実施例８：抗体−薬物コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性評価］
８）−１ ＣＤＨ６陽性ヒト腫瘍細胞株に対する抗体−薬物コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制活性評価
ＣＤＨ６陽性ヒト卵巣腫瘍細胞株ＰＡ−１を１０％ ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地中２ｘ１０３細胞／１００μＬ／ｗｅｌｌになるよう９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、実施例７で作製したヒト化ｈＧ０１９−薬物コンジュゲート４種（クローン名は、Ｈ０１Ｌ０２−ＤＸｄ、Ｈ０２Ｌ０２−ＤＸｄ、Ｈ０２Ｌ０３−ＤＸｄ及びＨ０４Ｌ０２−ＤＸｄ）、又は参考例２で作製したＮＯＶ０７１２−薬物コンジュゲート（ＮＯＶ０７１２−ＤＭ４）を終濃度０．０００１（ｎＭ）から１００（ｎＭ）となるように添加した。４日間培養後に生存細胞数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によるＡＴＰの定量で測定した。図１１に抗体−薬物コンジュゲートを各々添加した際の濃度依存的な細胞増殖抑制活性を示す。この結果、ヒト化ｈＧ０１９−薬物コンジュゲート４種は、ＮＯＶ０７１２−薬物コンジュゲートと比較して、より低い添加濃度から腫瘍細胞の増殖抑制活性を示し、抗腫瘍活性が高いことが示される。

［実施例９：抗体−薬物コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果］
抗体−薬物コンジュゲートの抗腫瘍効果は、ＣＤＨ６陽性ヒト腫瘍細胞株の細胞を免疫不全マウスに移植した動物モデルを用いて評価した。４−５週齢のＢＡＬＢ／ｃ ヌードマウス（ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎｌ［ｎｕ］／ＣｒｌＣｒｌｊ［Ｆｏｘｎｌｎｕ／Ｆｏｘｎｌｎｕ］、日本チャールス・リバー）及び、ＳＣＩＤマウス（ＣＢ１７／Ｉｃｒ−Ｐｒｋｄｃ［ｓｃｉｄ］／ＣｒｌＣｒｌｊ、日本チャールス・リバー）を実験使用前にＳＰＦ条件化で３日間以上馴化した。マウスには滅菌した固形飼料（ＦＲ−２，Ｆｕｎａｂａｓｈｉ Ｆａｒｍｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を給餌し、滅菌した水道水（５−１５ｐｐｍ次亜塩素酸ナトリウム溶液を添加して調製）を与えた。移植した腫瘍の長径及び短径を電子式デジタルノギス（ＣＤ−１５ＣＸ，Ｍｉｔｕｔｏｙｏ Ｃｏｒｐ．）で１週間に２回測定し、以下に示す計算式により腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝１／２×長径（ｍｍ）×［短径（ｍｍ）］２
抗体−薬物コンジュゲートは全てＡＢＳ緩衝液（１０ｍＭ−Ａｃｅｔａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ， ５％ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ， ｐＨ５．５）（ＮＡＣＡＬＡＩ）で希釈し、各実施例に示す用量にて尾静脈内投与した。また、コントロール群（Ｖｅｈｉｃｌｅ群）としてＡＢＳ緩衝液を同様に投与した。１群あたり６匹のマウスを実験に用いた。
９）−１ 抗腫瘍効果（１）
実施例２）−３−１にてＣＤＨ６発現を確認した、ＣＤＨ６陽性ヒト腎細胞腫瘍細胞株７８６−Ｏ（ＡＴＣＣ）をマトリゲル（コーニング社）に懸濁し、５×１０６ｃｅｌｌｓを雄ＳＣＩＤマウスの右側腹部に皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ１８に無作為に群分けを実施した。群分け実施日に、実施例７で作製した抗体−薬物コンジュゲート４種（クローン名は、Ｈ０１Ｌ０２−ＤＸｄ、Ｈ０２Ｌ０２−ＤＸｄ、Ｈ０２Ｌ０３−ＤＸｄ及びＨ０４Ｌ０２−ＤＸｄ）、又は参考例２で作製したＮＯＶ０７１２−ＤＭ４を３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。結果を図１２に示す。横軸は日数、縦軸は腫瘍体積、誤差範囲はＳＥ値を示す。
ＮＯＶ０７１２−ＤＭ４は本腫瘍モデルにおいて顕著な抗腫瘍効果を示さなかった。実施例７で作成した抗体−薬物コンジュゲート４種はいずれも投与後腫瘍体積が減少し、顕著な腫瘍の退縮が認められ、投与後２４日の間、腫瘍退縮効果が持続した（図１２）。
９）−２ 抗腫瘍効果（２）
実施例２）−３−１にてＣＤＨ６発現を確認した、ＣＤＨ６陽性ヒト卵巣腫瘍細胞株ＰＡ−１（ＡＴＣＣ）をマトリゲル（コーニング社）に懸濁し、８．５×１０６ｃｅｌｌｓを雌ヌードマウスの右側腹部に皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ１１に無作為に群分けを実施した。群分け実施日に、実施例７で作製した抗体−薬物コンジュゲートＨ０１Ｌ０２−ＤＸｄ又は参考例２で作製したＮＯＶ０７１２−ＤＭ４もしくはＮＯＶ０７１２−ＤＸｄを、１及び３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。結果を図１３に示す。横軸は日数、縦軸は腫瘍体積、誤差範囲はＳＥ値を示す。
ＮＯＶ０７１２−ＤＭ４は本腫瘍モデルにおいて１及び３ｍｇ／ｋｇいずれの用量でも抗腫瘍効果を示さなかった。一方、Ｈ０１Ｌ０２−ＤＸｄは１及び３ｍｇ／ｋｇいずれの用量でも投与後腫瘍体積が著しく減少し、腫瘍を縮退させる効果を発揮した（図１３）。また、本明細書で取得したＨ０１Ｌ０２抗体もしくはＮＯＶ０７１２抗体に同じ薬物ＤＸｄをコンジュゲートした検体の薬効を比較したところ、Ｈ０１Ｌ０２−ＤＸｄは、１及び３ｍｇ／ｋｇいずれの用量でもＮＯＶ０７１２−ＤＸｄに比べて強い抗腫瘍効果を発揮した。すなわち、本発明のＨ０１Ｌ０２抗体は、ＮＯＶ０７１２抗体に比べて、抗腫瘍剤としての抗体−薬物コンジュゲートの抗体としてより優れた抗体であることが示された（図１３）。
９）−３ 抗腫瘍効果（３）
実施例２）−３−１にてＣＤＨ６発現を確認した、ＣＤＨ６陽性ヒト卵巣腫瘍細胞株ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３（ＡＴＣＣ）をマトリゲル（コーニング社）に懸濁し、１×１０７ｃｅｌｌｓを雌ヌードマウスの右側腹部に皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ２２に無作為に群分けを実施した。群分け実施日に、実施例７で作製した抗体−薬物コンジュゲートＨ０１Ｌ０２−ＤＸｄ又は参考例２で作製したＮＯＶ０７１２−ＤＭ４を、１及び３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。結果を図１４に示す。横軸は日数、縦軸は腫瘍体積、誤差範囲はＳＥ値を示す。
ＮＯＶ０７１２−ＤＭ４は、１ｍｇ／ｋｇでは全く抗腫瘍効果を示さず、３ｍｇ／ｋｇでは抗腫瘍効果を示すものの、投与２週間後から腫瘍の再増殖が認められた。一方、Ｈ０１Ｌ０２−ＤＸｄは１及び３ｍｇ／ｋｇいずれの用量でも、投与後腫瘍体積の増加を著しく抑制し、特に３ｍｇ／ｋｇでは投与後３１日間の長期にわたって腫瘍増殖抑制効果が持続した。（図１４）。
また、ＰＡ−１細胞を用いて同様に、参考例２で作製したＮＯＶ０７１２−ＤＭ４もしくは参考例３で作成したＨ０１Ｌ０２−ＤＭ４の腫瘍増殖抑制効果を評価した。Ｈ０１Ｌ０２−ＤＭ４はＮＯＶ０７１２−ＤＭ４よりも腫瘍体積を縮退させ、本発明のＨ０１Ｌ０２抗体は、ＮＯＶ０７１２抗体に比べて、抗腫瘍剤としての抗体−薬物コンジュゲートの抗体としてより優れた抗体であった。
９）−４ 抗腫瘍効果（４）
実施例２）−３−１にてＣＤＨ６発現を確認した、ＣＤＨ６陽性ヒト腎細胞腫瘍細胞株７８６−Ｏ（ＡＴＣＣ）をマトリゲル（コーニング社）に懸濁し、５×１０６ｃｅｌｌｓを雄ＳＣＩＤマウスの右側腹部に皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ２０に無作為に群分けを実施した。群分け実施日に、実施例７で作製した抗体−薬物コンジュゲートＨ０１Ｌ０２−ＤＸｄ又は参考例２で作製したＮＯＶ０７１２−ＤＭ４を、１及び３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。結果を図１５に示す。横軸は日数、縦軸は腫瘍体積、誤差範囲はＳＥ値を示す。
ＮＯＶ０７１２−ＤＭ４は本腫瘍モデルにおいて１及び３ｍｇ／ｋｇいずれの用量でも顕著な抗腫瘍効果を示さなかった。一方、Ｈ０１Ｌ０２−ＤＸｄは１及び３ｍｇ／ｋｇいずれの用量でも投与後腫瘍体積が減少し、特に３ｍｇ／ｋｇでは顕著な腫瘍の退縮が認められ、投与後２０日の間、腫瘍退縮効果が持続した（図１５）。
９）−５ 抗腫瘍効果（５）
実施例２）−３−１にてＣＤＨ６を発現しないことを確認した、ＣＤＨ６陰性ヒト卵巣腫瘍細胞株ＥＳ−２（ＡＴＣＣ）を生理食塩水に懸濁し、１×１０６ｃｅｌｌｓを雌ヌードマウスの右側腹部に皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ７に無作為に群分けを実施した。群分け実施日に、実施例７で作成した抗体−薬物コンジュゲートＨ０１Ｌ０２−ＤＸｄ又は参考例２で作製したＮＯＶ０７１２−ＤＭ４を、１及び３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。結果を図１６に示す。横軸は日数、縦軸は腫瘍体積、誤差範囲はＳＥ値を示す。
ＣＤＨ６を発現しない本腫瘍モデルでは、Ｈ０１Ｌ０２−ＤＸｄ及びＮＯＶ０７１２−ＤＭ４はいずれの用量でも抗腫瘍効果を全く示さなかった。この結果から、実施例９）−１、９）−２、９）−３、９）−４で示されたＣＤＨ６陽性腫瘍モデルでの抗体−薬物コンジュゲートの抗腫瘍効果は、腫瘍細胞のＣＤＨ６発現に依存して起こる効果であり、ＣＤＨ６陽性の腫瘍に特異的に抗腫瘍効果を示し、ＣＤＨ６陰性の正常組織には細胞障害を起こさない選択的で安全な抗腫瘍薬剤と考えられる（図１６）。
本発明により、内在化活性を有する抗ＣＤＨ６抗体及び該抗体を含む抗体−薬物コンジュゲートが提供された。該抗体−薬物コンジュゲートは癌に対する治療薬等として用いることができる。

Claims (53)

  1. 配列番号４に記載のアミノ酸配列に特異的に結合し、細胞内に取り込まれる内在化能を有する、抗体又は当該抗体の機能性断片。
  2. 配列番号４に記載のアミノ酸配列への結合に対して、以下の（１）〜（５）：
    （１）配列番号５３の２１〜２３３番目に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号５６の２０〜４７１番目に記載のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
    （２）配列番号６１の２１〜２３３番目に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号６９の２０〜４７１番目に記載のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
    （３）配列番号６１の２１〜２３３番目に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３の２０〜４７１番目に記載のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
    （４）配列番号６５の２１〜２３３番目に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３の２０〜４７１番目に記載のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、及び
    （５）配列番号６１の２１〜２３３番目に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７７の２０〜４７１番目に記載のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
    からなる群から選択される抗体のうち少なくともいずれか１つと競合阻害活性を有する請求項１に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片。
  3. 以下の（１）〜（４）：
    （１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、
    （２）配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、
    （３）配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、及び
    （４）配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号４３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、
    からなる群から選択されるいずれか１つに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３、並びに、
    以下の（５）〜（９）：
    （５）配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
    （６）配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
    （７）配列番号３７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号３９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
    （８）配列番号４７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号４８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、及び
    （９）配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
    からなる群から選択されるいずれか１つに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む、
    請求項１又２のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片。
  4. 以下の（１）〜（５）：
    （１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、及び、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
    （２）配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、及び、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
    （３）配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、及び、配列番号３７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号３９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
    （４）配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号４３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、及び、配列番号４７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号４８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、及び
    （５）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、及び、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
    からなる群から選択されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３、並びに、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む、
    請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片。
  5. ヒト化されている請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片。
  6. 以下の（１）〜（４）：
    （１）配列番号６３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
    （２）配列番号６７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
    （３）（１）〜（２）のアミノ酸配列において各ＣＤＲ配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
    （４）（１）〜（３）のアミノ酸配列において各ＣＤＲ配列以外のフレームワーク領域の配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
    からなる群から選択されるいずれか１つに記載の軽鎖可変領域、並びに、
    以下の（５）〜（９）：
    （５）配列番号７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
    （６）配列番号７５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
    （７）配列番号７９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
    （８）（５）〜（７）のアミノ酸配列において各ＣＤＲ配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、及び
    （９）（５）〜（８）のアミノ酸配列において各ＣＤＲ配列以外のフレームワーク領域の配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
    からなる群から選択されるいずれか１つに記載の重鎖可変領域、
    を有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片。
  7. 以下の（１）〜（４）：
    （１）配列番号６３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
    （２）配列番号６３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号７５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
    （３）配列番号６７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号７５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、又は
    （４）配列番号６３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号７９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
    のいずれかの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域、
    を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片。
  8. 以下の（１）〜（４）：
    （１）配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号６９の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
    （２）配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
    （３）配列番号６５の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖、又は
    （４）配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７７の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
    のいずれかを有する請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片。
  9. 配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号６９の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する請求項８に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片。
  10. 配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する請求項８に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片。
  11. 配列番号６５の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する請求項８に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片。
  12. 配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７７の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する請求項８に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片。
  13. 機能性断片がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びＦｖからなる群から選択される請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体の機能性断片。
  14. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片をコードするポリヌクレオチド。
  15. 以下の（１）〜（５）：
    （１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、及び、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、
    （２）配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、及び、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、
    （３）配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、及び、配列番号３７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号３９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、
    （４）配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号４３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、及び、配列番号４７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号４８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、並びに
    （５）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、及び、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、
    からなる群から選択されるいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
  16. 配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードするポリヌクレオチド及び配列番号６９の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む請求項１４又は１５に記載のポリヌクレオチド。
  17. 配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードするポリヌクレオチド及び配列番号７３の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む請求項１４又は１５に記載のポリヌクレオチド。
  18. 配列番号６５の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードするポリヌクレオチド及び配列番号７３の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む請求項１４又は１５に記載のポリヌクレオチド。
  19. 配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードするポリヌクレオチド及び配列番号７７の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む請求項１４又は１５に記載のポリヌクレオチド。
  20. 請求項１４〜１９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
  21. 請求項２０に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
  22. 宿主細胞が真核細胞である請求項２１に記載の宿主細胞。
  23. 請求項２１又は２２に記載の宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体又は当該抗体の機能性断片を採取する工程を含むことを特徴とする当該抗体又は当該抗体の機能性断片の製造方法。
  24. 重鎖又は軽鎖が、Ｎ−結合への糖鎖付加、Ｏ−結合への糖鎖付加、Ｎ末のプロセッシング、Ｃ末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、Ｎ末にメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、Ｎ末グルタミンもしくはＮ末グルタミン酸のピログルタミン酸化、及びカルボキシル末端における１つ又は２つのアミノ酸欠失からなる群より選択される１又は２以上の修飾をうけた、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片。
  25. 重鎖のカルボキシル末端において１つ又は２つのアミノ酸が欠失している請求項２４に記載の抗体。
  26. ２本の重鎖の双方でカルボキシル末端において１つのアミノ酸が欠失している請求項２５に記載の抗体。
  27. 重鎖のカルボキシル末端のプロリン残基が更にアミド化されている請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の抗体。
  28. 抗体依存性細胞傷害活性を増強させるために糖鎖修飾が調節されている請求項１〜１３及び請求項２４〜２７からなる群から選択されるいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片。
  29. 請求項１〜１３及び請求項２４〜２８からなる群から選択されるいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片に薬物が結合している抗体−薬物コンジュゲート。
  30. 薬物が抗腫瘍性化合物である、請求項２９に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  31. 抗腫瘍性化合物が次式：
    で示される抗腫瘍性化合物である請求項３０に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  32. 抗体と薬物が、次式（ａ）〜（ｆ）：
    （ａ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
    （ｂ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
    （ｃ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
    （ｄ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
    （ｅ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、及び
    （ｆ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
    からなる群から選択されるいずれかの構造のリンカーを介して結合している、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
    （ここで、抗体は、−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）の末端において結合する。抗腫瘍性化合物は、１位のアミノ基の窒素原子を結合部位として、（ａ）、（ｂ）、（ｅ）又は（ｆ）の−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−部分、（ｃ）のＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−部分又は（ｄ）のＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−部分のカルボニル基に結合する。上記式中ＧＧＦＧは、グリシン−グリシン−フェニルアラニン−グリシンからなるペプチド結合でつながっているアミノ酸配列を示す。
    −（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−は次式：
    で示される構造であり、このものの３位で抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含むリンカー構造内のメチレン基と結合する。）。
  33. リンカーが以下の（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）からなる群から選択されるいずれかの式で示される請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート：
    （ｃ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
    （ｄ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
    （ｅ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−。
  34. リンカーが以下の（ｃ）又は（ｅ）の式で示される請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート：
    （ｃ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、
    （ｅ）−（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ−３−ｙｌ−Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＧＧＦＧ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−。
  35. 以下の式：
    で示される構造を有する、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート：
    ここで、ＡＢは抗体又は該抗体の機能性断片を示す。ｎは抗体と結合している薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数を示す。抗体とリンカーは抗体由来のスルフヒドリル基を介して結合している。
  36. 以下の式：
    で示される構造を有する、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート：
    ここで、ＡＢは抗体又は該抗体の機能性断片を示す。ｎは抗体と結合している薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数を示す。抗体とリンカーは抗体由来のスルフヒドリル基を介して結合している。
  37. 抗体が以下の（１）〜（４）：
    （１）配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号６９の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
    （２）配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
    （３）配列番号６５の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７３の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖、又は
    （４）配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７７の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
    からなる群から選択されるいずれか１つに記載の軽鎖及び重鎖を含む抗体又は当該抗体の機能性断片である、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  38. 抗体が、配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号６９の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖を含む抗体又は当該抗体の機能性断片である、請求項３７に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  39. 抗体が、配列番号６１の２１〜２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号７７の２０〜４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖を含む抗体又は当該抗体の機能性断片である、請求項３７に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  40. 重鎖又は軽鎖が、Ｎ−結合への糖鎖付加、Ｏ−結合への糖鎖付加、Ｎ末のプロセッシング、Ｃ末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、Ｎ末にメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、Ｎ末グルタミンもしくはＮ末グルタミン酸のピログルタミン酸化及びカルボキシル末端における１つ又は２つのアミノ酸欠失からなる群から選択される１又は２以上の修飾をうけた、請求項２９〜３９のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  41. 選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が１〜１０個の範囲である請求項２９〜４０のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  42. 選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が２〜８個の範囲である請求項４１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  43. 選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が５〜８個の範囲である請求項４２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  44. 選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が７〜８個である請求項４３に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  45. 請求項２９〜４４のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を含むことを特徴とする医薬組成物。
  46. 抗腫瘍薬であることを特徴とする、請求項４５に記載の医薬組成物。
  47. 腫瘍がＣＤＨ６を発現する腫瘍であることを特徴とする、請求項４６に記載の医薬組成物。
  48. 腫瘍が、腎細胞癌、腎淡明細胞癌、乳頭状腎細胞癌、卵巣癌、卵巣漿液性腺癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌、小細胞肺癌、神経膠芽腫、中皮腫、子宮癌、膵臓癌、ウィルムス腫瘍又は神経芽腫であることを特徴とする、請求項４６又は４７に記載の医薬組成物。
  49. 請求項２９〜４４のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物から選択されるいずれかを個体に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法。
  50. 腫瘍がＣＤＨ６が発現している腫瘍であることを特徴とする、請求項４９に記載の治療方法。
  51. 腫瘍が、腎細胞癌、腎淡明細胞癌、乳頭状腎細胞癌、卵巣癌、卵巣漿液性腺癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌、小細胞肺癌、神経膠芽腫、中皮腫、子宮癌、膵臓癌、ウィルムス腫瘍又は神経芽腫であることを特徴とする、請求項４９又は５０に記載の治療方法。
  52. 請求項２９〜４４のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物から選択される少なくとも一つを含む医薬組成物及び少なくとも一つの抗腫瘍薬を、同時に、別々に又は連続して個体に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法。
  53. 請求項１〜１３及び請求項２４〜２８からなる群から選択されるいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片或いは請求項２３に記載の製造方法で得られる抗体又は当該抗体の機能性断片と、薬物−リンカー中間化合物を反応させる工程を含むことを特徴とする、抗体−薬物コンジュゲートの製造方法。
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