CN1661044A - Dds化合物及其测定方法 - Google Patents
Dds化合物及其测定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1661044A CN1661044A CN2004100115162A CN200410011516A CN1661044A CN 1661044 A CN1661044 A CN 1661044A CN 2004100115162 A CN2004100115162 A CN 2004100115162A CN 200410011516 A CN200410011516 A CN 200410011516A CN 1661044 A CN1661044 A CN 1661044A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gly
- compound
- carboxyl
- transcribed spacer
- residue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
- A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
- A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
- C08B37/0021—Dextran, i.e. (alpha-1,4)-D-glucan; Derivatives thereof, e.g. Sephadex, i.e. crosslinked dextran
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及包括糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇以及该羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇上结合的药物化合物残基的DDS化合物,以及高分子载体和药物化合物残基通过包含肽键结合的2至8个氨基酸的间隔区结合的DDS化合物的测定方法,包括用肽酶处理该DDS化合物,测定所得水解产物的步骤。
Description
本申请是申请日为1999年10月29日,申请号为99815288.9,发明名称为“DDS化合物及其测定方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇与抗肿瘤药等药物化合物结合的DDS化合物(DDS:药物释放系统)。另外,本发明还涉及高分子载体与抗肿瘤药等药物化合物结合的DDS化合物的测定方法。
背景技术
肺癌和消化器官癌等实体瘤或白血病等血液癌的治疗时使用的抗肿瘤药通过静脉给药或口服给药等给药途径全身给药后,向特定的肿瘤部位移行,阻碍或抑制癌细胞的增殖,发挥治疗效果。但是,有时全身给药的抗肿瘤药迅速被肝脏、网膜内脏器从血中摄取,或迅速从尿中排泄,导致血中浓度下降,不能充分向肿瘤部位移行。另外,由于通常的抗肿瘤药自身向肿瘤部位的移行选择性(肿瘤选择性)低,导致抗肿瘤药没有遗漏地分布到全身的各种细胞或组织中,对正常的细胞或组织也产生细胞毒作用,因此存在非常高频率地发生呕吐、发热或脱毛等副作用的问题。因此,需要开发使抗肿瘤药有效地而且选择性地向肿瘤部位移行的手段。
作为这种手段之一,提出了使用具有羧基的多糖化合物为高分子载体,使抗肿瘤药与该高分子载体结合,延迟抗肿瘤药在血中的消失,同时提高对癌组织的靶向性的方法。例如,国际公开WO94/19376号中公开了肽链(氨基酸数为1~8)结合在具有羧基的多糖的羧基上,进一步通过该肽链结合多柔比星、柔红霉素、丝裂霉素C或博莱霉素等的DDS化合物。另外,特公平7-84481号公报中公开了通过希夫碱或酰胺键将上述抗肿瘤药引入羧甲基化的甘露葡聚糖衍生物的DDS化合物。
这些DDS化合物(有时也称为“药物复合体”)的特征在于,与单独使用结合在高分子载体上的抗肿瘤药的场合相比,具有优良的抗肿瘤效果,同时也减轻了毒性、副作用。本发明人提供了多糖化合物等高分子载体和抗肿瘤药等药物化合物通过1至8个氨基酸构成的间隔区(spacer)结合,可以使抗肿瘤药等药物化合物部位选择性地向目的组织移行的DDS化合物(国际公开WO97/46260号)。另外,还发现羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇作为高分子载体具有非常优良的性质,提供了含有羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇作为高分子载体的DDS化合物(上述国际公开)。
此外,关于使用多元醇化多糖化合物作为高分子载体的DDS化合物的有关技术,已有“有关多糖-肽-多柔比星复合体的研究·多糖化合物在血液中的稳定性与抗肿瘤效果的关系”(第10回日本DDS学会讲演要旨集,279,1994);“有关多糖-肽-多柔比星复合体的研究·体内动态与抗肿瘤效果”(第9回日本药物动态学会年会讲演要旨集,292,1994);第19回研究开发动向学术讨论会(药品机构主办)要旨集,D-9,1995;以及“有关通过多糖载体将药物送达肿瘤的研究”(第12回胶体·界面技术专题论文集,日本化学会,讲演要旨集,51,1995)等报道。
作为提高多糖化合物等高分子载体的脏器靶向性的方法,已知糖修饰聚谷氨酸衍生物(特开平5-178986号)、糖修饰聚赖氨酸衍生物(特开平5-222187号公报)、聚-ε-取代-L-赖氨酸的D吡喃半乳糖基-葡萄糖酸衍生物(特开平7-70311号公报)、糖修饰聚-ε-取代-L-谷氨酸衍生物(特开平7-228688号公报)、通过连结物(linker)使糖化合物结合的多糖化合物(特开平8-85703号公报)以及葡萄糖基-蛋白衍生物(特开平9-118699号公报)等。但是,目前尚未报道提高利用羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇作为高分子载体的DDS化合物的脏器靶向性的方法。
另一方面,在临床上使用高分子载体和药物化合物的残基通过包含低聚肽的间隔区结合的DDS化合物时,必须准确测定DDS化合物自身的血药浓度,另外为了确定适当的给药量或检测产品的批量差,必须准确测定DDS化合物中引入的抗肿瘤药等药物化合物残基的含量。以前,DDS化合物的血药浓度测定或DDS化合物的药物化合物残基的含量测定是以药物化合物发出的荧光或UV吸收为指标,不从DDS化合物上分离出药物化合物或该药物化合物上结合一部分间隔区的化合物,直接测定DDS化合物自身。另外,也提出了测定DDS化合物自身的NMR的方法,以及用酸处理DDS化合物测定生成的分解物的方法。
但是,药物化合物对酸不稳定时,不能利用通过酸处理等对分解物进行定量的方法,而且采用NMR测定的定量存在准确度低的问题。另外,DDS化合物中存在的药物化合物残基的UV吸收受高分子载体或肽间隔区的影响,与药物化合物自身相比,有时最大波长会发生位移或摩尔吸光系数会发生改变,因此准确测定DDS化合物中引入的药物化合物残基的含量一般是很困难的。而且,用NMR测定的方法或通过UV吸收对投给生物体的组织中的DDS化合物进行定量也是非常困难的。
发明公开
本发明的课题在于提供一种提高含有羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇作为高分子载体的DDS化合物的脏器靶向性(例如对肝脏的靶向性等)的手段,提供一种具有上述特征的DDS化合物。
本发明的另一课题在于提供一种作为具有上述特征的DDS化合物的制备用原料有用的多糖化合物。
本发明的另一课题在于提供一种高分子载体与药物化合物的残基通过包含低聚肽的间隔区结合的DDS化合物的测定方法。更具体地说,本发明的课题在于提供准确测定DDS化合物自身或DDS化合物中引入的抗肿瘤药等药物化合物残基的含量的方法。进一步具体地说,本发明的课题在于提供一种可以准确地定量给药的DDS化合物的血药浓度或组织内浓度,或者可以准确地定量DDS化合物中引入的药物化合物残基的含量的测定方法。
本发明人为了解决上述课题进行了悉心地研究,发现如果使用经糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇作为高分子载体,可以制备脏器靶向性非常高的DDS化合物,特别是含有结合了半乳糖的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的DDS化合物具有优良的肝脏靶向性。
另外,本发明人还发现用肽酶处理高分子载体与药物化合物残基通过包含低聚肽的间隔区结合的DDS化合物,测定所得的水解产物,可以准确而且简便的定量DDS化合物的血药浓度和DDS化合物中引入的药物化合物残基的含量。基于上述发现完成了本发明。
也就是说,本发明提供一种DDS化合物,其包括糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇以及该羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇上结合的药物化合物残基。
按照本发明的优选方式,能够提供糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇与药物化合物残基通过间隔区结合的上述DDS化合物;间隔区为1个氨基酸或通过肽键结合的2至8个氨基酸的上述DDS化合物;糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇为糖化合物和羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇通过连结物结合的物质的上述DDS化合物;以及糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇是通过连结物用糖化合物进行簇形(cluster)修饰的物质的上述DDS化合物。
另外,本发明还提供一种可以通过使药物化合物残基结合在羧基C1-4烷基部分的一部分羧基被糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇上而制备的DDS化合物。
按照本发明的优选方式,能够提供使该羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇与药物化合物残基通过间隔区结合可以制备的上述DDS化合物;以及通过使药物化合物残基结合在使糖化合物或糖化合物结合的连结物与羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的羧基C1-4烷基部分的一部分羧基结合制得的该羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇上可以制备的上述DDS化合物。
而且,本发明还提供通过用糖化合物修饰药物化合物残基通过间隔区结合在羧基C1-4烷基部分的一部分羧基上的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇可以制备的DDS化合物。
按照本发明的优选方式,能够提供使该羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇与糖化合物通过连结物结合可以制备的上述DDS化合物;以及通过用糖化合物修饰药物化合物残基通过1个氨基酸构成的间隔区或肽键结合的2至8个氨基酸构成的间隔区结合在羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的羧基C1-4烷基部分的一部分羧基上制得的该羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇可以制备的上述DDS化合物。
按照本发明进一步优选的方式,能够提供糖化合物为半乳糖或半乳糖胺或它们的衍生物的上述DDS化合物;构成羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的葡聚糖多元醇是在实质上可以完全多元醇化的条件下处理葡聚糖得到的葡聚糖多元醇的上述DDS化合物;羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇是羧甲基葡聚糖多元醇的上述DDS化合物;半乳糖或半乳糖胺或它们的衍生物、或者簇形化的半乳糖或半乳糖胺或它们的衍生物的取代度是每个羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的糖残基为0.01~1.0的上述DDS化合物;药物化合物为抗肿瘤药或抗炎药的上述DDS化合物;药物化合物为(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并〔de〕吡喃并〔3’,4’:6,7〕中氮茚并〔1,2-b〕喹啉-10,13(9H,15H)-二酮的上述DDS化合物;以及是肝癌治疗药的上述DDS化合物。
从另一观点来看,本发明提供糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇;糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇构成的高分子载体;以及用于制备上述DDS化合物的糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇。另外,从另一观点来看,还提供糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇在制备上述DDS化合物中的用途。
从另一观点来看,本发明还提供高分子载体和药物化合物残基通过包含肽键结合的2至8个氨基酸的间隔区结合的DDS化合物的测定方法,包括用肽酶处理该DDS化合物,测定所得水解产物的步骤。
按照本发明的优选方式,能够提供用于测定生物体试样中含有的该DDS化合物的浓度的上述方法;用于测定该DDS化合物中引入的药物化合物残基的含量的上述方法;该水解产物为药物化合物的上述方法;该水解产物为药物化合物残基上结合有一部分间隔区的化合物的上述方法;以及间隔区的一部分为来源于间隔区的1个氨基酸的上述方法。
按照本发明进一步优选的方式,能够提供该高分子载体为具有羧基的高分子载体,优选多糖衍生物的上述方法;该高分子载体为羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇,优选羧甲基葡聚糖多元醇的上述方法;构成羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的葡聚糖多元醇是在实质上可以完全多元醇化的条件下处理葡聚糖得到的葡聚糖多元醇的上述方法;该高分子载体为糖化合物修饰的物质的上述方法;该DDS化合物中引入的药物化合物为抗肿瘤药或抗炎药的上述方法;间隔区为从N末端侧开始用-Gly-Gly-Phe-Gly-表示的四肽或者从N末端开始用-Gly-Gly-Gly-Phe-表示的四肽的上述方法;间隔区为从N末端开始用-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-Y’-CH2-O-CO-表示的基团或从N末端开始用-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-Y’-CH2-O-CO-表示的基团(式中,Y’表示对亚苯基)的上述方法;肽酶为α-糜蛋白酶或木瓜蛋白酶;以及药物化合物为(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并〔de〕吡喃并〔3’,4’:6,7〕中氮茚并〔1,2-b〕喹啉-10,13(9H,15H)-二酮的上述方法。
按照上述发明特别优选的方式,上述方法可以用于测定羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇与(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并〔de〕吡喃并〔3’,4’:6,7〕中氮茚并〔1,2-b〕喹啉-10,13(9H,15H)-二酮通过包含从N末端侧开始用-Gly-Gly-Phe-Gly-表示的四肽或者从N末端开始用-Gly-Gly-Gly-Phe-表示的四肽的间隔区结合的DDS化合物,可以通过使用α-糜蛋白酶作为肽酶,测定水解产物(1S,9S)-9-乙基-5-氟-1-甘氨酰氨基-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并〔de〕吡喃并〔3’,4’:6,7〕中氮茚并〔1,2-b〕喹啉-10,13(9H,15H)-二酮,定量上述DDS化合物或上述DDS化合物中引入的上述抗肿瘤药的含量。
图面的简单说明
图1表示采用本发明方法(例4)测定的DDS化合物的血中和腹水中浓度。
图2表示采用本发明方法(例5)测定的DDS化合物的血中和腹水中浓度。
图3表示具有糖化合物修饰的高分子载体的本发明DDS化合物(例6)的紫外吸收光谱。
图4表示具有糖化合物修饰的高分子载体的本发明DDS化合物(例6)的GPC图。
图5表示例6制备的DDS化合物((C)和(D))在肝脏中的蓄积性。
图6表示本发明DDS化合物(例6(D))的紫外吸收光谱。
图7表示本发明DDS化合物(例7)的紫外吸收光谱。
图8表示本发明DDS化合物(例9)的紫外吸收光谱。
图9表示本发明DDS化合物(例6(D))的GPC图。
图10表示本发明DDS化合物(例7)的GPC图。
图11表示本发明DDS化合物(例9)的GPC图。
发明的最佳实施方式
本发明的DDS化合物特征在于含有糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇以及结合在该羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇上药物化合物残基。更具体地说,本发明的DDS化合物包括以下任意一种情况:(1)糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇与药物化合物残基不通过间隔区结合;以及(2)糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇与药物化合物残基通过间隔区结合。
以糖化合物修饰的羧基C1-4烷基萄聚糖多元醇与药物化合物残基通过间隔区结合的情况为例,可以列举出以下几种情况:例如羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇与药物化合物残基通过1个氨基酸构成的间隔区结合的情况;羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇与药物化合物残基通过以肽键结合的2至8个氨基酸构成的间隔区结合的情况;通过以肽键结合的2至8个氨基酸构成的低聚肽上结合有-NH-Y-CO〔式中,Y表示碳原子数1至8个的亚烷基或-C6H4-CH2-O-(-C6H4-表示亚苯基,该亚苯基也可以具有1个或2个以上的取代基,优选为对亚苯基)表示的基团〕表示的连结基团的间隔区结合的情况等。本说明书中使用的“修饰”这一术语包括糖化合物与羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇直接或通过连结物间接地以共价键相结合的状态,应当是最广义的解释,任何一种含义均不作限定性解释。
上述DDS化合物中含有的药物化合物残基是指作为例如抗肿瘤药、抗炎药、抗菌药等药物,用于治疗和/或预防包括人在内的哺乳动物疾病的药物化合物在主要部分结构。但是,该药物化合物的用途并不限于上述用途,作为药物化合物只要具有能够与羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇或间隔区结合的1或2个以上反应活性官能团(例如氨基、羧基、羟基、巯基、酯基等),任何物质均可使用。药物化合物的残基也可以结合在羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的羧基上,或间隔区存在的反应活性官能团(例如使用肽间隔区时,其N末端氨基或C末端羧基、或构成间隔区的氨基酸上存在的反应活性官能团)上。另外,在本说明书中称作药物化合物时,也包括其自身含有具有药物作用的化合物主要结构作为其部分结构,在生物体内再生该化合物的前体药物。
在上述发明中,药物化合物的残基是指假定羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇或间隔区与药物化合物残基的结合是通过药物化合物中的反应活性官能团与羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇或间隔区中的反应活性官能团之间的反应(例如脱水缩合等)形成的场合,结合后的化合物中存在的来源于药物化合物的部分结构。例如,药物化合物用D-NH2、D-COOH、D-COOR、D-OH、D-SH、D-CONH2、D-NH-COOR(R为低级烷基等)表示时,药物化合物的残基分别用D-NH-(D-NH-CO-Q等)、D-CO-(D-CO-NH-Q、D-CO-O-Q、D-CO-S-Q等)、D-CO-(D-CO-NH-Q、D-CO-O-Q、D-CO-S-Q等)、D-O-(D-O-CO-Q、D-O-Q等)、D-S-(D-S-CO-Q、D-S-Q等)、D-CONH-(D-CO-NH-CO-Q等)、D-NH-CO-(D-NH-CO-O-Q、D-NH-CO-NH-Q等)表示(括号内表示间隔区或羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇与药物化合物残基的结合,Q表示分别由间隔区和羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇除去反应活性官能团和羧基后残留的部分结构)。
作为药物化合物的残基,例如多柔比星、柔红霉素、丝裂霉素C、博莱霉素、安西他滨、长春新碱、长春碱、甲氨蝶呤、铂类抗肿瘤药(顺铂或其衍生物)、紫杉醇或其衍生物、喜树碱或其衍生物(特开平6-87746号公报中记载的抗肿瘤药,优选权利要求2记载的(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并〔de〕吡喃并〔3’,4’:6,7〕中氮茚并〔1,2-b〕喹啉-10,13(9H,15H)-二酮等)等抗肿瘤药的残基。另外,还优选例如琥珀酸氢化可的松、琥珀酸泼尼松等甾体类抗炎药,或甲灭酸、氟灭酸、双氯芬酸、布洛芬、替诺立定等非甾体类抗炎药的残基。
作为结合药物化合物的残基与羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的间隔区,使用1个氨基酸构成的间隔区或以肽键结合的2至8个氨基酸构成的间隔区时,该间隔区具有1个氨基酸残基(是指分别从氨基酸的氨基和羧基上除去1个氢原子和1个羟基得到的残基)或以肽键结合的2至8个氨基酸构成的低聚肽残基(是指分别从N末端的氨基和C末端的羧基上除去1个氢原子和1个羟基得到的残基)的形态。
优选的间隔区是2至6个氨基酸构成的低聚肽的残基。构成间隔区的氨基酸的种类没有特别的限定,例如可以使用L-或D-氨基酸,优选L-氨基酸,除α-氨基酸以外,还可以使用β-丙氨酸、ε-氨基己酸、γ-氨基丁酸等。这种α-氨基酸以外的氨基酸优选在间隔区中处于与多糖化合物接近的位置。
例如使用低聚肽间隔区时的结合方向没有特别的限定,一般间隔区的N末端可以通过酰胺键结合在羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的羧基上,间隔区的C末端可以结合在药物化合物的氨基上。另外,例如含有赖氨酸残基作为肽间隔区的构成单元时,如果使赖氨酸残基的α-氨基以及ε-氨基分别与其它氨基酸的羧基形成酰胺键,由于肽间隔区的两个末端均为N末端,也可以与药物化合物的羧基结合。而且,间隔区中含有1个或2个以上二胺化合物或二羧酸化合物的残基(例如乙二胺等二胺的残基或琥珀酸等二羧酸的残基等)作为构成单元时,也可以使用两个末端均为N末端的间隔区和两个末端均为C末端的间隔区。
使用低聚肽构成的间隔区时,氨基酸序列没有特别的限定,优选使用例如间隔区为-X-Z-表示的二肽残基(X表示疏水性氨基酸的残基,Z表示亲水性氨基酸的残基,-X-Z-是指疏水性氨基酸(X)与亲水性氨基酸(Z)分别形成N末端侧和C末端侧,分别从通过肽键结合的二肽的N末端氨基与C末端羧基上除去1个氢原子和1个羟基得到的残基),或含有该二肽残基作为部分肽序列的间隔区。疏水性氨基酸可以使用例如苯基丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸等,亲水性氨基酸可以使用例如甘氨酸、丙氨酸等。间隔区也可以具有这种二肽残基的交替序列(例如-X-Z-X-Z-、-X-Z-X-Z-X-Z-等)。
如果使用含有这种二肽结构的间隔区,在认为肽酶丰富的肿瘤部位或炎症部位间隔区被水解,在该部位短时间游离出高浓度的药物化合物。因此,含有上述二肽的间隔区与药物化合物结合形成的部分结构是本发明DDS化合物优选的部分结构。作为药物化合物的残基,在使用浓度依存型的抗肿瘤药(例如多柔比星等)的残基时,优选使用-X-Z-表示的上述二肽残基构成的间隔区或含有该二肽残基作为部分肽序列的间隔区。
另外,作为药物化合物的残基,使用必须在一定浓度以上持续作用的时间依存型抗肿瘤药时,有时通过使用上述间隔区可以达到较高的抗肿瘤效果。这种抗肿瘤药例如特开平6-87746号公报中记载的抗肿瘤药,优选权利要求2记载的抗肿瘤药。一般并不限于上述间隔区,从抗肿瘤药的作用机理、体内动态或毒性表达的特征、抗肿瘤药在体内的游离性等观点来看,有必要选择好的间隔区。另外,一般对于增殖迅速的癌种,优选选择可以短时间游离出高浓度药物化合物的上述间隔区。
可以作为间隔区利用的低聚肽的具体实例如下表所示,DDS化合物中根据需要使用的间隔区并不限于下述物质,本领域技术人员当然可以适当进行是否应当使用间隔区的选择或者使用间隔区时对其种类的选择,以得到药物化合物的最适游离速度(表中,肽序列左侧为N末端,C末端侧结合药物化合物的残基。D-Phe表示D-苯丙氨酸,其它氨基酸表示L-氨基酸。另外,游离速度的大小可根据结合多柔比星的DDS化合物对Walker 256荷瘤大鼠的药效表达程度或Walker256荷瘤大鼠肿瘤部位的游离多柔比星浓度判断)。这些间隔区中,对于多柔比星优选使用(N末端)-Gly-Gly-Phe-Gly-等可以短时间游离出高浓度药物化合物的间隔区。
表1
(a)游离速度大的间隔区
-Leu-Gly-
-Tyr-Gly-
-Phe-Gly-
-Gly-Phe-Gly-
-Gly-Gly-Phe-Gly-
-Gly-Phe-Gly-Gly-
-Phe-Gly-Gly-Gly-
-Phe-Phe-Gly-Gly-
-Gly-Gly-Gly-Phe-Gly-
(b)游离速度比较大的间隔区
-Gly-Gly-Phe-Phe-
-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-
(c)游离速度比较小的间隔区
-Phe-Phe-
-Ala-Gly-
-Pro-Gly-
-Gly-Gly-Gly-Phe-
(d)游离速度小的间隔区
-Gly-
-D-Phe-Gly-
-Gly-Phe-
-Ser-Gly-
-Gly-Gly-
-Gly-Gly-Gly-
-Gly-Gly-Gly-Gly-
本发明的DDS化合物特征在于含有糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇作为高分子载体。本发明的DDS化合物中羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的多元醇度没有特别的限定,构成羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的葡聚糖多元醇优选在实质上可以完全多元醇化的条件下处理葡聚糖得到葡聚糖多元醇。
用于制备羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的葡聚糖的种类没有特别的限定,可以以任意比例含有α-D-1,6-键。例如,可以使用α-D-1,6-键的比例为85%以上、90%以上或95%以上的葡聚糖等。葡聚糖的分子量没有特别的限定,例如可以使用约1000至2000000的物质,优选约3000至800000的物质。构成羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的羧基C1-4烷基的C1-4烷基可以使用直链或支链状的C1-4烷基,具体地说可以使用甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基等,优选使用甲基。
使用葡聚糖作为原料时,使葡聚糖依次与大量过剩的高碘酸钠和硼氢化钠作用,可以制得将葡聚糖实质上完全多元醇化的葡聚糖多元醇。可是,葡聚糖的多元醇化方法并不限于上述方法,只要本领域技术人员可以利用,任何一种方法均可采用。羧基C1-4烷基化可以通过使氯醋酸、溴醋酸、α-氯丙酸、α-甲基-α-氯丙酸、β-氯丙酸、α-甲基-β-氯丙酸、α-氯丁酸、β-氯丁酸、γ-氯丁酸等卤化C1-4烷基羧酸,优选氯醋酸,对葡聚糖多元醇的羟基反应,使羟基部分或完全羧基C1-4烷基化进行。
例如,将葡聚糖多元醇溶解于与反应无关的惰性溶剂(例如水、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等),在碱(例如氢氧化钠或氢氧化钾等)存在下添加卤化C1-4烷基羧酸或其盐,使之在冰冷条件下至约100℃的温度范围内反应数分钟至数日即可。羧基C1-4烷基引入的程度可以通过例如适当选择羧基C1-4烷基化的反应温度和用作试剂的卤化C1-4烷基羧酸及碱的量容易地调节,这种手段是本领域技术人员众所周知的。对于葡聚糖多元醇的糖残基,羧基C1-4烷基化程度没有特别的限定,例如0.01~2.0,优选0.1~1.0。
修饰羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的糖化合物的种类没有特别的限定,本领域技术人员可以根据DDS化合物所应指向的脏器的种类或体内动态等条件适当选择。作为糖化合物,可以使用单糖类或低聚糖类或者它们的衍生物中任意一种。另外,糖化合物与羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的结合的种类没有特别的限定。糖化合物与羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇例如可以通过O-α-糖苷键或O-β-糖苷键等直接结合,或者两者也可以通过适当的连结物结合。本说明书中使用的“连结物”这一术语有必要作最广义的解释,包括糖化合物残基与羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇结合时可以使用的任何一种物质。相对于羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇,糖化合物的引入量(取代度)没有特别的限定,可以根据糖化合物的种类、所需的靶向性的程度、药物化合物的种类等各种条件适当选择,一般每个羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的糖残基为约0.01~1.0。
使用连结物时,连结物的种类没有特别的限定,例如优选利用-O-(CH2)n-NH-(n为1至16的整数)或-(O-CH2CH2)m-NH-(m为1至10的整数)表示的连结物。通过使这些连结物的O末端或N末端,优选O末端通过O-α-糖苷键或O-β-糖苷键结合在糖化合物上,使另一端与羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的羧基形成酰胺键或酯键,可以实现用糖化合物修饰羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇。
另外,通过使用适合所谓簇形修饰的连结物,也可以制备簇形修饰体。簇形修饰体是使用适于簇形修饰的连结物,对于羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的羧基使糖化合物呈絮状结合的化合物,其具体的手段记载于例如专利第2774417号说明书、专利第2774429号说明书或Biol.Pharm.Bull.,20,pp.259-266,1997等中。簇形修饰体的特征在于由于在一定空间内配制多个糖化合物,与受体的亲和性高,可以发挥优良的脏器靶向性。本发明的DDS化合物中簇形修饰的一个例子如下所述(下述结构式表示簇形修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇分子的部分结构,省略了药物化合物的残基)。可是,能够用于本发明的DDS化合物的簇形修饰方法并不限于下述具体实例,本领域技术人员当然可以选择适当的手段。
单糖类例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、神经氨酸、糖醛酸等己糖;半乳糖胺、葡糖胺等己糖胺;核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖、木糖等戊糖等。作为它们的衍生物,例如可以使用N-或O-酰基衍生物、O-烷基衍生物、硫酸酯、磷酸酯等。作为单糖的衍生物,更具体地说,例如N-乙酰基神经氨酸、N-乙酰基半乳糖胺、N-乙酰基葡糖胺、甘露糖-6-磷酸、半乳糖-3-磷酸、6-O-苯甲酰基葡萄糖、6-O-羧甲基-N-乙酰基葡糖胺、2-N-苯甲基葡糖胺等。低聚糖例如可以使用上述单糖类或它们的衍生物构成的直链或支链状的杂低聚糖或高低聚糖。更具体地说,可以使用蔗糖、唾液酸LewisA(sialylLewisA)、唾液酸Lewis X(sialyl Lewis X)、乳糖、麦芽糖、LewisX、硫酸Lewis X等。其中,作为提高肝脏靶向性的糖化合物,优选半乳糖或半乳糖胺或其衍生物,或者在非还原末端侧具有半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺的低聚糖(例如乳糖),特别优选半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺。
本发明的DDS化合物的制备方法没有特别的限定,例如下述一般的制备方法。另外,在本说明书的实施例中具体而且详细地说明了这样一个实例。本领域技术人员参照下述一般性说明以及实施例中记载的制备方法,适当选择制备原料、反应试剂以及反应条件等,必要时对这些方法进行修饰或改变,可以容易地制备本发明所包括的DDS化合物。一般,采用适当的方法用糖化合物修饰羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇,使该修饰体与结合在药物化合物残基或药物化合物上的间隔区反应,可以制备本发明的DDS化合物。通常,将羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇配制成钠盐或钾盐等碱金属盐形态的水溶液,在水中或含水有机溶剂中进行糖化合物的修饰以及与药物化合物(或药物化合物上结合的间隔区)反应。
或者,也可以将羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇或糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇转变成有机胺盐的形态,之后在实质上不含水的有机溶剂中进行反应。作为有机胺的盐,除三乙胺、三甲胺、三乙醇胺等脂肪族胺类的盐之外,还可以使用例如N-甲基吡咯烷、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二甲氨基吡啶等脂环式或芳香族胺类的盐,氯化四甲基铵、氯化四乙基胺等季铵盐等。由羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇或糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的钠盐转变成有机胺的盐可以使用离子交换树脂等进行。例如可以将羧甲基葡聚糖多元醇或其糖化合物修饰体的钠盐溶解于水中,装在填充有Bio-Rad AG50W-X2(200-400目,H+型)树脂的柱上,用水洗脱后,添加三乙胺等有机胺,冷冻干燥。另外,也可以将羧甲基葡聚糖多元醇或其糖化合物修饰体的钠盐溶解于水中,使之通过三乙胺型的树脂,进行一步转变。
药物化合物自身与羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的羧基的结合、或者结合有药物化合物的间隔区与羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的羧基的结合一般只要使药物化合物自身具有的反应活性氨基或间隔区的反应活性氨基(肽间隔区的N末端氨基等)与羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的羧基形成酰胺键即可。可是,间隔区与羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的羧基的结合并不仅限于上述结合,也可以利用其它化学键或者1或2以上的间隔区来结合。例如,也可以使肽间隔区的C末端羧基或药物化合物的羧基与羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的羧基形成酸酐,或者也可以使用乙二胺等二胺化合物作为间隔区,使各自的羧基与二胺的各氨基形成酰胺键。
使药物化合物自身具有的反应活性氨基或肽间隔区的N末端氨基与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基通过酰胺键结合时,可以使用形成肽键时通常使用的脱水缩合剂,例如N,N’-二环己基碳化二亚胺(DCC)等N,N’-二环烷基碳化二亚胺类、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDAPC)等碳化二亚胺衍生物、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(EEDQ)等。这种情况下,必要时也可以加入1-羟基苯并三唑(HOBT)等苯并三唑衍生物。另外,也可以采用活性酯法或酰卤法等进行反应。
非水系统中进行反应时的溶剂,只要是实质上不含水的有机溶剂,并且可以溶解反应原料(糖化合物修饰的羧甲基葡聚糖多元醇的有机胺盐以及药物化合物或结合有药物化合物的间隔区等)即可,可以使用任何一种物质。例如使用N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、环丁砜等较合适。在糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇上引入的药物化合物残基的量没有特别的限定,应当根据药物化合物残基的种类以及DDS化合物的体内动态、药效和毒性等观点适当选择。一般可以选择0.1~30重量%的范围,优选约2~15重量%的范围。作为药物化合物使用特开平6-87746号公报的权利要求2记载的抗肿瘤药时引入量为1~15重量%,优选约4~8重量%。羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇上引入的药物化合物残基的比例可以根据例如吸光度分析等很容易地确定。
例如,作为药物化合物使用特开平6-87746号公报权利要求2记载的抗肿瘤药时,已知该药物化合物在酸性水性介质中(例如约pH3)平衡偏于形成内酯环的化合物(闭环体),另一方面在碱性水性介质中(例如约pH10)平衡偏于内酯环开环的化合物(开环体)。引入了这种开环体和闭环体相应残基的DDS化合物具有相同的抗肿瘤效果,但是使糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇与结合有上述药物化合物的间隔区(例如低聚肽间隔区)反应时,如果在反应系统中存在开环型的反应原料,有时来源于内酯环的羧基和来源于间隔区的氨基之间会发生缩合反应,不仅反应收率显著降低,而且得不到所需的均一的DDS化合物。在未达到平衡的非水系统中使用闭环体作为反应原料可以避免这种副反应。
本发明的DDS化合物具有下述特征,可以根据药物化合物残基的种类(例如抗肿瘤药或抗炎药等药物化合物的残基)使之在肿瘤部位或炎症部位等局部特异性表达所需的药物活性,而且可以减低药物化合物自身具有的毒性。另外,本发明的DDS化合物具有优良的血管通透性。由于蛋白酶(肽酶)在肿瘤部位或炎症部位表达,具有低聚肽构成的间隔区的DDS化合物在间隔区部分容易被水解,游离的药物化合物移行到细胞内发挥药效,或者通过识别靶细胞糖的受体将DDS化合物摄取到细胞内,被蛋白酶游离的药物发挥药效。
另外,羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇在生物体内,例如肝脏、脾脏或骨髓等中,作为异物高分子被识别的程度低。因此,它们向脏器的移行性低,另一方面与糖化合物种类相应的糖受体以高浓度分布在丰富的脏器中。例如,具有半乳糖修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的本发明DDS化合物对于肝脏具有优良的靶向性。因此,作为药物化合物结合有抗肿瘤药的DDS化合物对于肝癌的治疗是有用的。
含有本发明DDS化合物的药物通常能以冷冻干燥制品等形态填充到小瓶等中,作为使用时溶解的注射用或输液用制剂等非口服给药用制剂用于临床,这种药物的制剂形态并不仅限于上述方式。制备上述制剂时,可以使用助溶剂、pH调节剂、稳定剂等本领域可以利用的制剂用添加剂,上述制剂可以作为药物组合物进行配制。上述药物的给药量没有特别的限定,通常应当根据构成药物化合物残基的药物化合物的给药量、DDS化合物中引入的药物化合物残基的量、患者的状态和疾病的种类等确定。例如,投给以约6重量%的比例引入特开平6-87746号公报中权利要求2记载的抗肿瘤药残基的DDS化合物时,非口服给药的场合,一般优选每日每1m2体表面积一次投给约0.1~100mg,优选1~30mg,每3~4周重复给药一次。
从另一观点来看,本发明还提供高分子载体与药物化合物残基通过含有肽键结合的2至8个氨基酸的间隔区结合的DDS化合物的测定方法,包括用肽酶处理该DDS化合物,测定所得水解产物的步骤。
本发明说明书中使用的“测定”这一术语包括以定量、定性等为目的进行的测定,有必要作最广义的解释,但优选表示定量。作为本发明测定方法的对象的DDS化合物是高分子载体与药物化合物残基通过含有肽键结合的2至8个氨基酸的间隔区结合的化合物,在任何一种含义中均不作限定性解释。作为含有肽键结合的2至8个氨基酸的间隔区,除仅由肽键结合的2至8个氨基酸构成的间隔区之外,还可以列举出肽键结合的2至8个氨基酸构成的低聚肽上结合有-NH-Y-CO〔式中,Y表示碳原子数1至8个的亚烷基或-C6H4-CH2-O-(-C6H4-表示亚苯基,该亚苯基也可以具有1个或2个以上的取代基,优选为对亚苯基)表示的基团〕表示的连结基团的间隔区等。本发明的测定方法例如可以用于测定血液或体液等生物试样中含有的DDS化合物自身的浓度。另外,本发明的方法也可以用于测定DDS化合物中引入的药物化合物残基的引入量(例如药物化合物残基相对于DDS化合物总重量的重量%等)。
本发明方法的测定对象——DDS化合物中含有的药物化合物残基的含义与上述说明相同,作为药物化合物,只要具有能与间隔区结合的1或2个以上反应活性官能团(例如氨基、羧基、羟基、巯基、酯基等),可以使用任何一种药物。药物化合物的残基可以与间隔区的N末端氨基或C末端羧基、或者构成间隔区的氨基酸中存在的反应活性官能团结合。
药物化合物残基的具体实例如对于糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇与药物化合物残基通过间隔区结合的上述DDS化合物的说明,优选使用的药物化合物残基也相同。
本发明方法的测定对象——DDS化合物中含有的药物化合物残基是指通过间隔区与高分子载体结合,优选的间隔区是肽键结合的2至8个氨基酸构成的低聚肽残基或者肽键结合的2至8个氨基酸构成的低聚肽上结合有-NH-Y’-CH2-O-CO-(式中,Y’表示对亚苯基)表示的连结基团的间隔区,构成间隔区的氨基酸的种类、间隔区的结合方向、氨基酸序列、具体实例等与糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇和药物化合物残基通过低聚肽间隔区结合的上述DDS化合物的说明相同。
作为构成本发明方法的测定对象——构成DDS化合物的高分子载体,除多糖衍生物之外,还可以使用例如合成高分子等。作为多糖衍生物和合成高分子,只要是实质上对生物体不显示毒性,并可以用作药物载体的物质即可,可以使用任何一种物质。例如,在DDS化合物的制备中以前一直使用的多糖衍生物和合成高分子均可以用作高分子载体。例如,优选使用具有羧基的多糖衍生物,特别优选使用多元醇化多糖衍生物。另外,合成高分子例如聚乙二醇类;聚谷氨酸、聚天冬氨酸或聚赖氨酸等聚氨基酸类;或N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺等聚乙烯化合物的衍生物。
更具体地说,具有羧基的多糖衍生物可以使用例如多糖类或对其进行化学或生物学修饰的衍生物,优选使用分子中具有羧基的物质。作为分子中具有羧基的高分子载体的实例,除透明质酸、果胶酸、海藻酸、软骨素、肝素等多糖类之外,可以使用对茁酶多糖、葡聚糖、甘露聚糖、甲壳质、旋覆花素、左聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖、甘露葡聚糖、壳聚糖等多糖的一部分或全部羟基引入具有羧基的官能团的物质等。例如优选使用对羟基进行羧基C1-4烷基化的物质或使多元酸的一个羧基与羟基形成酯键的物质等。另外,也可以使用对上述多糖类进行多元醇化后引入具有羧基的官能团的物质。
使用羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇作为高分子载体的DDS化合物是本发明方法特别优选的测定对象。羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的多元醇化度、制备时使用的葡聚糖的种类以及制备方法等与糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇和药物化合物残基通过间隔区结合的上述DDS化合物的说明相同。
另外,作为高分子载体使用糖化合物修饰的高分子载体的DDS化合物也是本发明测定方法的合适对象。例如优选使用糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇等作为高分子载体。用糖化合物修饰高分子载体的方法和糖化合物的种类等与糖化合物修饰的上述羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇中的说明相同。
本发明测定方法的对象也可以是使用所谓适于簇形修饰的连结物制备的DDS化合物(所谓簇形修饰体)。簇形修饰的概念与糖化合物修饰的上述羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇中的说明相同。
本发明的方法特征在于在测定上述DDS化合物时,使肽酶对DDS化合物作用,测定所得水解产物。肽酶只要是可以水解DDS化合物的间隔区包含的低聚肽部分(2至8个氨基酸通过肽键结合的低聚肽部分)即可,其种类没有特别的限定。例如枯草杆菌蛋白酶、α-糜蛋白酶、IV型胶原酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性硬蛋白酶等,其中优选α-糜蛋白酶或木瓜蛋白酶。
水解产物的种类没有特别的限定,优选采用紫外吸收光谱、荧光光谱等常规的分光学手法可以检测。通常,作为水解产物,除药物化合物自身之外,还可以测定一部分间隔区残留并结合在药物化合物残基上的化合物,例如结合有来源于间隔区的1个氨基酸的药物化合物、结合有来源于间隔区的2至8个氨基酸构成的低聚肽的药物化合物或通过-NH-Y-CO-〔式中,Y表示碳原子数1至8的亚烷基或-C6H4-CH2-O-(-C6H4-表示亚苯基,该亚苯基也可以具有1个或2个以上的取代基,优选为对亚苯基)表示的基团〕表示的连结基团结合有来源于间隔区的1个氨基酸或上述低聚肽的药物化合物。另外,上述水解产物中,药物化合物的部分或全部反应活性官能团也可以被水解。可以根据DDS化合物的种类选择适当的肽酶,测定所需的水解产物。
作为用于测定的试样,除了从投给DDS化合物的动物(包括人)分离出的血液、淋巴液、唾液、尿、粪、摘出组织等生物试样之外,还可以使用DDS化合物的水溶液或实质上不抑制酶反应的水性有机溶剂的溶液等。对于各种肽酶来说,合适的反应条件是本领域技术人员公知的,本领域技术人员可以根据肽酶的种类容易地选择合适的反应条件,例如基质浓度、pH、缓冲液、反应温度、反应时间等。通常,必要时对上述试样进行匀浆或脱蛋白等预处理后,将DDS化合物稀释到所需的基质浓度,在反应液中添加肽酶,继续反应直到DDS化合物完全水解。
测定水解产物的方法没有特别的限定,进行DDS化合物的定量或药物化合物引入量的定量时,优选根据水解产物的性质,单独或组合采用紫外吸收光谱测定、荧光光谱测定等常规的分光学手法。另外,也可以适当组合高效液相色谱等分离操作进行测定。预先在测定系统中制作标准曲线,可以高精度地进行定量。另外,在本说明书的实施例中,具体而且详细地说明了本发明方法的代表例,本领域技术人员基于上述一般性说明以及实施例的具体说明,必要时对其进行适当的改变或修饰,可以容易地实施本发明的方法。
实施例
以下结合实施例更具体地说明本发明,但是本发明的范围并不受下述实施例的限定。
例1
按照国际公开WO97/46260号的实施例15记载的方法制备高分子载体羧甲基葡聚糖多元醇(下面有时使用CM-Dex-PA或CM葡聚糖多元醇等简略符号)与抗肿瘤药(特开平6-87746号公报中权利要求2记载的(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并〔de〕吡喃并〔3’,4’:6,7〕中氮茚并〔1,2-b〕喹啉-10,13(9H,15H)-二酮,以下在实施例中简记为DX-8951)通过-Gly-Gly-Phe-Gly-(低聚肽的序列是从N末端侧开始表示。以下相同)表示的四肽间隔区结合的DDS化合物(化合物1)。CM-Dex-PA使用平均分子量228K,羧甲基化度(每个糖残基的羧甲基取代度)为0.4的物质。
用蒸馏水将上述DDS化合物配制成400μg/ml,将其10μl添加到180μl的Britton Robinson缓冲液(pH6.0)中,再添加用蒸馏水配制成10mg/ml的α-糜蛋白酶溶液10μl.将反应液在40℃下培养2小时后,加入含有50%乙腈的0.5N HCl溶液200μl,用HPLC定量游离的水解产物(来源于间隔区的甘氨酸通过肽键结合DX-8951的氨基的化合物:国际公开WO97/46260号的实施例50记载的化合物,以下简记为G-DX-8951)。HPLC测定使用Symmetry C18(4.6×100mm,3.5μm,Watars公司)柱,用含有有机溶剂(甲醇∶乙腈=1∶2)36.5%的0.1M醋酸钠(pH5.0)进行洗脱,通过荧光光谱测定(Ex.375nm以及Em.445nm)检测水解产物。结果,上述DDS化合物的DX-8951含量为5.7%。另一方面,以DX-8951的UV吸收(366nm)作为指标,使用分光光度计,计算出上述DDS化合物的DX-8951含量为4.9%。
例2
如下所述制备CM-Dex-PA与DX-8951通过-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-(CH2)4-CO-表示的间隔区结合的DDS化合物(化合物2)。使用Dean-Stark,使5-氨基戊酸(1.0g)、对甲苯磺酸(1.95g)和苯甲醇(5ml)在甲苯(50ml)中,在140℃下反应5小时,同时除去生成的水。浓缩反应液,在得到的残渣中加入乙醚固化。过滤得到的固体,用乙醚洗涤使之干燥,得到5-氨基戊酸苯甲酯的甲苯磺酸盐2.9g。
将Boc-Gly-Gly-Gly-Phe-OH(575mg)、HOSu(182mg)和DCC(326mg)溶解于DMF(20ml)中,搅拌30分钟。向该溶液中加入将5-氨基戊酸苯甲酯的甲苯磺酸盐(500mg)与三乙胺(0.184ml)溶解于DMF(10ml)得到的溶液,在室温下搅拌3天。浓缩反应液,用柱色谱法(CH2Cl2∶MeOH=20∶1)精制残渣,得到
Boc-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-(CH2)4-COOBzl 380mg(Bzl表示苯甲基)。将Boc-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-(CH2)4-COOBzl(380mg)溶解于50%含水甲醇(20ml)中,加入5%Pd-C(含水50%)(300mg),在氢气常压下,搅拌1夜。过滤除去反应液中的催化剂,浓缩干燥固化,得到Boc-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-(CH2)4-COOH 330mg。
将Boc-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-(CH2)4-COOH(150mg)、DCC(70mg)和HOSu(40mg)溶解于DMF中,搅拌30分钟。向该溶液中加入将DX-8951(160mg)和三乙胺(0.040ml)溶解于DMF中得到的溶液,在室温下搅拌1夜。浓缩反应液,用柱色谱法(CH2Cl2∶MeOH=20∶1)精制得到的残渣,得到Boc-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-(CH2)4-CO-DX-8951110mg。将Boc-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-(CH2)4-CO-DX-8951(110mg)溶解于TFA(2ml),使之反应1小时后,浓缩反应液,在得到的残渣中加入乙醚使之固化。除去上清液,干燥固体,得到H-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-(CH2)4-CO-DX-8951的三氟醋酸盐100mg。
1H-NMR(DMSO-d6):δ8.45-8.55(m,2H),8.28-8.35(m,2H),7.95-8.10(br,2H),7.79(d,1H,J=10.7Hz),7.70-7.75(m,1H),7.32(s,1H),7.20-7.30(m,5H),7.15-7.25(m,4H),6.50-6.60(br,1H),5.50-5.60(m,1H),5.40-5.50(m,2H),5.18(s,2H),4.50-4.60(m,1H),3.55-3.95(m,7H),3.00-3.25(m,5H),2.75-2.85(m,1H),2.50(s,3H),2.15-2.25(m,4H),1.86-2.00(m,2H),1.55-1.65(m,2H),1.45-1.55(m,2H),0.88(t,3H,J=7.35Hz)
将按照特开平8-144421号公报实施例13记载的方法制备的平均分子量为337K,羧甲基化度(每个结构糖残基的羧甲基取代度)为0.4的CM-Dex-PA(350mg)溶解于水(10ml)。向该溶液中加入将H-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-(CH2)4-CO-DX-8951的三氟醋酸盐(50mg)溶解于甲醇(10ml)中得到的溶液,再加入将HOBt(7mg)溶解于甲醇(5ml)中得到的溶液。将反应液的pH调节为7.0,加入水溶性碳化二亚胺(10mg),搅拌14小时。再加入水溶性碳化二亚胺(10mg),搅拌2小时后,加入水溶性碳化二亚胺(10mg),搅拌2小时。用超纯水稀释反应液,使用超滤膜(50K)除去低分子,冷冻干燥,将得到的粉体溶解于3M食盐水,滴加到乙醇中,通过离心分离析出的固体进行分离。除去上清液,将固体再次溶解于水中,用超滤膜(50K)除去低分子后,通过0.22μm的滤器,冷冻干燥,得到目的产物280mg。
用蒸馏水将上述DDS化合物配制成2.63mg/ml的溶液,向该溶液10μl中添加用Britton Robinson缓冲液(pH6)配制成2mg/ml的α-糜蛋白酶溶液,或用Tris-HCl(pH9)配制成2mg/ml的枯草杆菌蛋白酶A溶液。将该反应液在40℃下培养2小时后,加入含有50%乙腈的0.5N HCl溶液500μl,用HPLC定量游离的水解产物〔NH2-(CH2)4-CO-DX-8951〕。HPLC测定使用Symmetry C18(4.6×100mm,3.5μm,Watars公司)柱,用含有有机溶剂(甲醇∶乙腈=1∶2)32%的0.1M三氟醋酸溶液进行洗脱,通过荧光光谱测定(Ex.375nm以及Em.445nm)检测水解产物。结果,NH2-(CH2)4-CO-DX-8951洗脱出约4.8成。使用标准曲线,计算上述DDS化合物中的DX-8951含量为3.2%。另一方面,以DX-8951作标准曲线,从上述DDS化合物的UV吸收计算出DX-8951含量为2.9%。
例3
使用①枯草杆菌蛋白酶A(0.1M Tris-HCl pH9.0)、②α-糜蛋白酶(0.1M Tris-HCl pH8.0)、③嗜热菌蛋白酶(0.1M Tris-HCl/1mM CaCl2 pH9.0),测定例1制备的DDS化合物(化合物1)的DX-8951含量。向各酶用的缓冲液180μl中添加配制成400μg/ml的化合物110μl(最终浓度:20μg/ml)。向该混合物中添加用各缓冲液配制成100mg/ml的各酶10μl后(最终浓度:5mg/ml),在40℃下使之反应3小时。反应后,添加含有50%乙腈的0.5N HCl溶液200μl,将其10μl用HPLC分析。使用Symmetry C18(4.6×250mm)柱,用含有有机溶剂(甲醇∶乙腈=1∶2)31%的0.1M AcONa缓冲液pH5.0洗脱。通过荧光光谱测定(Ex.375nm以及Em.445nm)测定水解产物,使用分别含有G-DX-8951、DX-8951以及结合有来源于化合物1间隔区的苯丙氨酸-甘氨酸的DX-8951(FG-DX-8951)2nmol/ml的溶液,制成标准曲线,根据该标准曲线对酶反应溶液中的水解产物进行定量。结果,枯草杆菌蛋白酶A与α-糜蛋白酶在上述条件下分别从化合物1游离出G-DX-8951 100%。另外,嗜热菌蛋白酶游离出FG-DX-8951 100%。
例4
将腹腔内继代维持的Meth A细胞(1×106细胞/小鼠)移植到BALB/c(
)小鼠的腹腔内,5日后将化合物1(DX-8951含量:5.2%)按照10和2.5mg/kg(DX-8951换算量)腹腔内给药。给药后,经时(2、4、8、24和48小时)由心取血,放置10分钟后,以12000rpm离心分离10分钟,得到血清。再采集这时的癌性腹水。向血清和癌性腹水25μl中添加80%甲醇水溶液100μl后,以12000rpm离心分离5分钟,在其上清液25μl中添加用0.1M Tris-HCl pH8.5/0.1MCaCl2配制成2mg/ml的嗜热菌蛋白酶溶液225μl,在50℃下反应1小时。之后,添加含有50%乙腈的0.5N HCl 250μl,取其20μl进行HPLC分析。柱使用Symmetry C18(4.6×100mm),用含有甲醇和乙腈的混合液(1∶2)41%的0.1M AcONa(pH5)溶液洗脱,通过荧光光谱测定(Ex.375nm以及Em.445nm)检测水解产物。结果,以10mg/kg给药时,腹水中化合物1的浓度随时间的经过而减少,血药浓度在给药后逐渐上升,24小时达到最大值,之后逐步达到与腹水浓度几乎相同的程度(图1)。以2.5mg/kg给药时,腹水浓度和血药浓度的变化与10mg/kg的场合相同。
例5
将腹腔内继代维持的Meth A细胞(1×106细胞/小鼠)移植到BALB/c(
)小鼠的腹腔内,5日后将化合物1(DX-8951含量:6.6%)按照10和2.5mg/kg(DX-8951换算量)静脉内给药(1组3只)。给药后,经时(5分钟、30分钟、2、4、8、24和48小时)由心取血,放置10分钟后,以12000rpm离心分离10分钟,得到血清。再采集这时的癌性腹水。向血清和癌性腹水25μl中添加用BrittonRobinson缓冲液(pH6)配制成2mg/ml的α-糜蛋白酶溶液225μl,在40℃下反应2小时。之后,添加含有50%乙腈的0.5N HCl 250μl,以12000rpm离心分离5分钟,取其上清液10μl进行HPLC分析。从HPLC分析得到的G-DX-8951浓度以及使用的化合物1中DX-8951含量推测出化合物1的浓度。HPLC分析按照例4的条件进行。结果,以10mg/kg给药时,血中化合物1的浓度随时间的经过而减少。腹水中化合物1的浓度在给药后逐渐上升,48小时达到与血药浓度几乎相同的程度(图2)。以2.5mg/kg给药时,化合物1的腹水浓度和血药浓度的变化与10mg/kg的场合相同。
例6
如下所述制备具有糖化合物修饰的高分子载体的DDS化合物。在下述方案中,作为糖链的结构单元,示例性地记载了引入羧甲基的1个或2个结构单元,实施例中记载的DDS化合物的羧甲基葡聚糖多元醇部分应当理解成并不是通过上述结构单元的反复构成的物质。另外,羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度(每个结构糖残基的羧甲基取代度)是通过将羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐转变成游离酸型后,溶解于0.1N氢氧化钠水溶液,用0.1N盐酸滴定求出的。将羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐的水溶液用Bio-Rad AG50W-x2(H+)柱处理,将通过液冷冻干燥,用作试样。将该试样溶解于一定过剩量的0.1氢氧化钠水溶液中,以酚酞作为指示剂,用0.1N盐酸滴定。试样的采集量为s(mg)、0.1N氢氧化钠水溶液的一定过剩量为a(ml)、0.1N盐酸的滴定量为b(ml),按照13.4(a-b)/[s-5.8(a-b)]求出羧甲基化度。另外,药物的引入量(重量%)由利用药物特性吸收的吸光度分析(362nm附近)求出。而且,凝胶过滤法按照以下条件进行(柱:TSK gel G4000 PWXL、洗脱液:0.1M NaCl、流速0.8ml/min、柱温度:40℃)。
(A)化合物2-2的合成
将化合物2-1(5.0g)与2-〔2-(2-氯乙氧基)乙氧基〕乙醇(3.75ml)溶解于二氯甲烷(75ml),加入三氟化硼醚络合物(7.7g),搅拌5小时。用二氯甲烷(100ml)稀释反应液,用水、饱和碳酸氢钠水溶液、食盐水洗涤有机层,用硫酸镁干燥,过滤除去硫酸镁后,蒸馏除去溶剂,用硅胶柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯=2∶1)精制得到的残渣,得到氯代化合物3.3g。将得到的氯代化合物(3.3g)与NaN3(2.0g)在DMF(15ml)中60℃下搅拌2天。蒸馏除去溶剂,溶解于乙酸乙酯与水的混合液,用水洗涤有机层,用硫酸镁干燥,过滤除去硫酸镁,蒸馏除去溶剂,得到叠氮化物2.8g。
将得到的叠氮化物(1.5g)溶解于甲醇(30ml),加入含有28%MeONa的甲醇溶液,使溶液的pH达到10,搅拌1小时。向反应液中加入Dowex 50WX8(H+)使溶液达到中性,过滤除去树脂,蒸馏除去溶剂。将得到的残渣溶解于甲醇(50ml)和水(10ml)的混合液中,加入5%Pd-C(含水50%)(2.0g),在氢气常压下搅拌1夜。过滤除去催化剂,蒸馏除去溶剂,得到化合物2-2 1.2g。
1H-NMR(DMSO-d6):δ4.20-4.30(1H,br),4.00-4.10(1H,br),3.80-3.85(1H,br),3.50-3.75(14H,m),2.75-2.90(2H,m)
(B)半乳糖修饰CM葡聚糖多元醇的合成
向葡聚糖4(Funacocy公司生产,平均分子量4000-6000)(20g)的0.1M醋酸缓冲液(pH5.5)(2000ml)中加入过碘酸钠(66.0g)的水溶液(2000ml)。避光,在4℃下搅拌10天后,加入乙二醇(14.0ml),搅拌1夜。在冰冷条件下,用8M氢氧化钠水溶液将反应液调节为pH7.5后,加入硼氢化钠(28g)。溶解后,在室温下搅拌1夜。在冰冷条件下用醋酸调节为pH5.5,在4℃下搅拌1小时。冰冷条件下用8M氢氧化钠水溶液将pH调节为7.5。将以上步骤进行2次,将得到的水溶液合2为1,使用Biomax-3膜(Millipoa公司生产),采用超滤法除去低分子部分,得到残留溶液。使该残留溶液通过Biomax-30膜。使用Biomax-3膜,采用超滤法使通过的溶液脱盐后,冷冻干燥,得到精制葡聚糖多元醇(12.0g)。该物质的分子量(凝胶过滤、茁酶多糖标准)为9K。
将氢氧化钠(39.3g)溶解于水(282ml),在得到的水溶液中加入上述精制葡聚糖多元醇(9.4g),在室温下使之溶解。在冰冷条件下向该溶液中加入一氯醋酸(56.4g),使之溶解后,在室温下反应20小时。用醋酸将该反应液调节为pH8后,使用Biomax-5膜采用超滤法除去低分子部分。将残留溶液冷冻干燥后,得到羧甲基(以下简记为CM)葡聚糖多元醇的钠盐(12g)。将氢氧化钠(17g)溶解于水(120ml),向得到的水溶液中加入所得CM葡聚糖多元醇的钠盐(4.0g),在室温下使之溶解。在冰冷条件下向该溶液中加入一氯醋酸(24g),使之溶解后,在室温下反应20小时。
用醋酸将该反应液调节为pH8后,使用Biomax-5膜采用超滤法除去低分子部分。冷冻干燥残留溶液,得到CM葡聚糖多元醇的钠盐(4.0g)。该物质的分子量(凝胶过滤,茁酶多糖标准)为14K,根据碱滴定每个糖残基的CM化度为0.7。将得到的CM葡聚糖多元醇的钠盐(1.0g)溶解于水(100ml),加入实施例1的化合物2-2(800mg)的甲醇(100ml)溶液。而且,每隔2小时添加水溶性碳化二亚胺(240mg),添加3次,共计搅拌6小时。蒸馏除去反应液中的溶剂,将得到的油状物溶解于水,使用Biomax-3采用超滤法进行脱盐。将得到的水溶液冷冻干燥,得到标题化合物1.1g。本化合物中半乳糖含量采用苯酚-硫酸法进行定量,结果每10个糖残基为1.0。
(C)半乳糖修饰CM葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951的合成
将上述(B)得到的半乳糖修饰CM葡聚糖多元醇的钠盐(1.0g)溶解于水(30ml),加入Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951的三氟醋酸盐(150mg)和1-羟基苯并三唑(35mg)的甲醇溶液(40ml)。将溶液的pH调节为7.0,每2小时添加水溶性碳化二亚胺盐酸盐(35mg),添加3次后,搅拌1夜。蒸馏除去反应液中的溶剂,将得到的残渣溶解于3M氯化钠水溶液(20ml),滴加到乙醇(100ml)中,通过离心分离(3500rpm,8分钟)收集析出的沉淀。将该沉淀溶解于水,使用Biomax-3膜采用超滤法脱盐。用微孔滤器(0.22μm)过滤不能透过膜的残留溶液后,冷冻干燥,得到标题化合物900mg。将本化合物溶解于0.1M氯化钠水溶液后,用GPC(柱:东SO-TSK Gel PW-4000XL,溶剂:0.1M NaCl水溶液、流速:0.8ml/min)分析的结果以及本化合物的紫外吸收光谱(pH9.0,0.1M Tris缓冲液中)分别如图3和图4所示。本化合物中DX-8951的含量基于在含有30%乙腈的0.1MTris缓冲液(pH10.0)中366nm处的吸光度进行定量时为4.9%(W/W)。
(D)CM葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951的合成
将上述(B)得到的CM葡聚糖多元醇的钠盐(2.0g)溶解于水,使之通过Dowex-50WX8(Et3NH+),得到CM葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(1.9g)。将所得CM葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(1.9g)溶解于含有50%N,N-二甲基甲酰胺的水溶液中,向该溶液中依次加入含有三乙胺(0.112ml)和Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951的三氟醋酸盐(350mg)的N,N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(1.9g),在室温下搅拌1夜使之反应。蒸馏出反应液中的溶剂,将得到的残渣溶解于3M氯化钠水溶液(20ml),滴加到乙醇(100ml)中,通过离心分离(3500rpm)收集析出的沉淀。将该沉淀溶解于水,使用Biomax-3膜采用超滤法脱盐。用微孔滤器(0.22μm)过滤不能透过膜的残留溶液后,冷冻干燥,得到标题化合物1.4g。将本化合物溶解于0.1M氯化钠水溶液后,用GPC(柱:东SO-TSK Gel PW-4000XL,溶剂:0.1M NaCl水溶液、流速:0.8ml/min)分析的结果以及本化合物的紫外吸收光谱(pH9.0,0.1M Tris缓冲液中)分别如图6和图9所示。本化合物中DX-8951的含量基于在含有30%乙腈的0.1M Tris缓冲液(pH10.0)中366nm处的吸光度进行定量时为5.2%(W/W)。
(E)DDS化合物的测定
将上述(C)得到的半乳糖修饰DDS化合物和作为对照的上述(D)的DDS化合物溶解于注射用蒸馏水,配制成按DX-8951换算的浓度为0.5mg/ml。将这些DDS化合物水溶液由尾静脉投给C57BL/6小鼠,每组5只。给药量按DX-8951换算为5mg/kg。给药后,经时(0.5、1、2、4和24小时)采集肝脏,求出这些DDS化合物量。相对于所得肝脏的重量添加5倍量的水,匀浆。将该溶液以3000rpm离心分离10分钟,再将上清液以15000rpm离心分离15分钟。在得到的上清液50μl中添加用pH6的Britton-Robinson缓冲液(B.R.B)配制成2mg/ml的α-糜蛋白酶溶液450μl,在40℃下反应2小时。之后,添加含有50%乙腈的0.5N HCl溶液500μl,以12000rpm离心分离5分钟,取其上清液20μl进行HPLC分析,通过定量游离的G-DX8951求出DDS化合物量。这时,将用于给药的各DDS化合物水溶液用蒸馏水配制成50、10、2μg/ml,分别取50μl按照上述方法进行酶处理,定量G-DX8951,制作标准曲线。
HPLC分析条件
柱:Symmetry C18(4.6×100mm)
流速:1.0ml/min
柱温度:40℃
检测波长(荧光):Ex.375nm、Em.445nm
洗脱液:甲醇∶乙腈=1∶2(29%),0.1%TFA(71%)
结果如图5所示。上述半乳糖修饰DDS化合物与作为对照的DDS化合物(上述(D))相比显示较高的肝脏蓄积性。
例7:半乳糖修饰CM葡聚糖多元醇-Gly-GLy-Phe-Gly-DX-8951的合成
向葡聚糖T500(法玛西亚公司生产,分子量500K)(50g)的0.1M醋酸缓冲液(pH5.5)(5000ml)中加入过碘酸钠(165.0g)的水溶液(5000ml)。避光,在4℃下搅拌10天后,加入乙二醇(35.0ml),搅拌1夜。在冰冷条件下,用8M氢氧化钠水溶液将反应液调节为pH6.5后,加入将硼氢化钠(70g)悬浊于水(2000ml)中得到的液体。溶解后,在室温下搅拌1夜。在冰冷条件下用醋酸调节为pH5.5,在4℃下搅拌1小时。冰冷条件下用8M氢氧化钠水溶液将pH调节为7.5。对于得到的水溶液,使用Biomax-50膜采用超滤法除去低分子部分,得到残留溶液。使该残留溶液通过超滤膜(1000K,Filterone公司生产)。使用Biomax-50膜,采用超滤法使通过的溶液脱盐后,冷冻干燥,得到葡聚糖多元醇(21.1g)。该物质的分子量(凝胶过滤、茁酶多糖标准)为128K。
将氢氧化钠(13.84g)溶解于水(150ml),在得到的水溶液中加入上述葡聚糖多元醇(5g),在室温下使之溶解。在冰冷条件下向该溶液中加入一氯醋酸钠盐(61.6g),使之溶解后,在室温下反应1夜。将该反应液调节为pH8.5后,使用Biomax-50膜采用超滤法除去低分子部分。将高分子部分冷冻干燥后,得到CM葡聚糖多元醇的钠盐(6.2g)。该物质的分子量(凝胶过滤,茁酶多糖标准)为428K,根据碱滴定每个糖残基的CM化度为0.9。将得到的CM葡聚糖多元醇的钠盐(500mg)溶解于水(50ml),加入实施例1的化合物2-2(400mg)的甲醇(20ml)溶液和1-羟基苯并三唑(160mg)的甲醇(20ml)溶液。而且,每隔2小时添加水溶性碳化二亚胺盐酸盐(120mg),添加3次,共计搅拌6小时。蒸馏除去反应液中的溶剂,将得到的油状物溶解于水,使用Biomax-50膜采用超滤法除去低分子部分。将得到的残留溶液冷冻干燥,得到目的产物600mg。本化合物中半乳糖含量采用苯酚-硫酸法进行定量,结果每10个糖残基为1.7。
将得到的半乳糖修饰CM葡聚糖多元醇的钠盐(200mg)溶解于水(3ml),加入Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951的三氟醋酸盐(27mg)的甲醇溶液(3ml)和1-羟基苯并三唑(7mg)的甲醇溶液(3ml)。将溶液的pH调节为7.0,每2小时添加水溶性碳化二亚胺盐酸盐(7mg),添加3次后,搅拌1夜。蒸馏除去反应液中的溶剂,将得到的残渣溶解于3M氯化钠水溶液(10ml),滴加到乙醇(100ml)中,通过离心分离(3500rpm)收集析出的沉淀。将该沉淀溶解于水,使用Biomax-50膜采用超滤法脱盐。用微孔滤器(0.22μm)过滤不能透过膜的残留溶液后,冷冻干燥,得到标题化合物180mg。将本化合物溶解于0.1M氯化钠水溶液后,用GPC(柱:东SO-TSK Gel PW-4000XL,溶剂:0.1M NaCl水溶液、流速:0.8ml/min)分析的结果以及本化合物的紫外吸收光谱(pH9.0,0.1M Tris缓冲液中)分别如图7和图10所示。本化合物中DX-8951的含量基于在含有30%乙腈的0.1M Tris缓冲液(pH10.0)中366nm处的吸光度进行定量时为3.7%(W/W)。
例8:2-〔2-(2-氨基乙氧基)乙氧基〕乙基-β-D-2-氨基-2-脱氧半乳糖的合成
将按照特开平5-202085号公报记载的方法合成的2-〔2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基〕乙基-β-D-2-乙酰氨基-2-脱氧-3,4,6-三乙酰基半乳糖(2.64g)溶解于甲醇(10ml),用冰冷却得到的溶液。向该溶液中加入甲醇钠的28%甲醇溶液(0.64ml),这样在冰冷条件下搅拌5小时。在反应液中加入醋酸(0.186ml)后,减压干燥固化。用硅胶柱色谱法(洗脱液:二氯甲烷∶甲醇=9∶1溶液)精制残渣,得到2-〔2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基〕乙基-β-D-2-氨基-2-脱氧半乳糖(1.98g)。
1H-NMR(CD3OD)δ:4.44(d,1H,J=8.8Hz),3.94-3.98(m,1H),3.92(dd,1H,J=8.8,10.7Hz),3.83(d,1H,J=2.9Hz),3.62-3.79(m,11H),3.58(dd,1H,J=3.4,10.7Hz),3.49(dd,1H,J=5.9,6.3Hz),3.39(t,2H,J=4.9Hz),1.99(s,3H).
将上述2-〔2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基〕乙基-β-D-2-氨基-2-脱氧半乳糖(640mg)溶解于乙醇(10ml),向所得溶液中加入林德乐催化剂(Lindlar catalyst)(430mg),在常压氢气下催化还原1.5小时。进一步加入林德乐催化剂(215mg),常压氢气下催化还原3.5小时。过滤除去催化剂后,减压干燥滤液,得到2-〔2-(2-氨基乙氧基)乙氧基〕乙基-β-D-2-氨基-2-脱氧半乳糖(601mg)。
1H-NMR(CD3OD)δ:4.32(d,1H,J=7.5Hz),3.80-3.91(m,2H),3.30-3.75(m,14H),2.73(t,2H,J=6.5Hz),1.98(s,3H).
例9:N-乙酰基半乳糖胺修饰CM葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951的合成
将例7得到的CM葡聚糖多元醇的钠盐(375mg)溶解于水(10ml),加入将例8得到的2-〔2-(2-氨基乙氧基)乙氧基〕乙基-β-D-2-氨基-2-脱氧半乳糖(300mg)溶解于甲醇(10ml)得到的溶液和将1-羟基苯并三唑(120mg)溶解于甲醇(10ml)得到的溶液。将溶液的pH调节为7.0后,每隔2小时添加水溶性碳化二亚胺(90mg),添加3次。搅拌1夜后,使用Biomax-50膜采用超滤法由反应液除去低分子部分。将没有通过膜的残留溶液冷冻干燥,得到N-乙酰基半乳糖胺修饰CM葡聚糖多元醇(443mg)。本化合物中N-乙酰基半乳糖胺含量采用Eluson-Molgan法进行定量,结果每10个糖残基为1.6。
将得到的N-乙酰基半乳糖胺修饰CM葡聚糖多元醇(200mg)溶解于水(10ml),加入将Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951的三氟醋酸盐(30mg)溶解于甲醇(10ml)得到的溶液以及将1-羟基苯并三唑(30mg)溶解于甲醇(10ml)得到的溶液。将溶液的pH调节为7.0,每隔2小时添加水溶性碳化二亚胺盐酸盐(10mg),添加3次。搅拌2小时后,将pH调节为8.5。使用Biomax-50膜采用超滤法由反应液除去低分子部分。用微孔滤器(0.22μm)过滤不能透过膜的残留溶液后,冷冻干燥,得到标题化合物(203mg)。将本化合物溶解于0.1M氯化钠水溶液后,用GPC(柱:东SO-TSK Gel PW-6000XL,溶剂:含有20%乙腈的0.1M醋酸缓冲液(pH5.0)、流速:0.8ml/min)分析的结果以及本化合物的紫外吸收光谱(0.1M Tris缓冲液(pH10.0)∶乙腈=7∶3中,0.16mg/ml)分别如图8和图11所示。本化合物中药物化合物残基的含量基于在0.1M Tris缓冲液(pH10.0)∶乙腈=7∶3中366nm处的吸光度进行定量时为4.6%(W/W)。
例10:CM-Dex-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-Y’-CH2-O-CO-DX-8951中DX-8951含量的测定
在用蒸馏水配制成1mg/ml的CM-Dex-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-Y’-CH2-O-CO-DX-8951(Y’表示对亚苯基)溶液5μl中添加用Britton Robinson缓冲液(pH6)配制成2mg/ml的木瓜蛋白酶溶液95μl。将反应液在40℃下培养4小时后,加入含有50%乙腈的0.5NHCl溶液100μl,用HPLC定量游离的水解产物〔DX-8951〕。HPLC测定使用Symmetry C18(4.6×100mm,3.5μm,Waters公司)柱,用有机溶剂(甲醇∶乙腈=1∶2)经12分钟由20%变成70%的0.1%三氟醋酸溶液进行洗脱,通过荧光光谱测定(Ex.375nm以及Ex.445nm)检测水解产物。结果,DX-8951洗脱出约5.7成。用DX-8951作标准曲线,计算出上述DDS化合物中DX-8951含量为4.0%。另一方面,以DX-8951作标准曲线,由上述DDS化合物的UV吸收计算出DX-8951含量为3.3%。
例11:CM-Dex-PA-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-Y’-CH2-O-CO-DX-8951中DX-8951含量的测定
在用蒸馏水配制成1mg/ml的CM-Dex-PA-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-Y’-CH2-O-CO-DX-8951溶液5μl中添加用Britton Robinson缓冲液(pH6)配制成2mg/ml的α-糜蛋白酶溶液95μl。将反应液在40℃下培养4小时后,加入含有50%乙腈的0.5N HCl溶液100μl,用HPLC定量游离的水解产物〔DX-8951〕。HPLC测定使用Symmetry C18(4.6×100mm,3.5μm,Waters公司)柱,用有机溶剂(甲醇∶乙腈=1∶2)经12分钟由20%变成70%的0.1%三氟醋酸溶液进行洗脱,通过荧光光谱测定(Ex.375nm以及Em.445nm)检测水解产物。结果,DX-895 1洗脱出约5.7成。用DX-8951作标准曲线,计算出上述DDS化合物中DX-8951含量为2.5%。另一方面,以DX-8951作标准曲线,由上述DDS化合物的UV吸收计算出DX-8951含量为1.7%。
例12:CM-Dex-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH2)4-CO-DX-8951中DX-8951含量的测定
在用蒸馏水配制成100μg/ml的CM-Dex-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH2)4-CO-DX-8951溶液5μl中添加用Britton Robinson缓冲液(pH6)配制成2mg/ml的木瓜蛋白酶溶液95μl。将该反应液在40℃下培养4小时后,加入含有50%乙腈的0.5N HCl溶液100μl,用HPLC定量游离的水解产物〔NH2-(CH2)4-CO-DX-8951〕。HPLC测定使用Symmetry C18(4.6×100mm,3.5μm,Waters公司)柱,用含有有机溶剂(甲醇∶乙腈=1∶2)32%的0.1%三氟醋酸溶液进行洗脱,通过荧光光谱测定(Ex.375nm以及Em.445nm)检测水解产物。结果,DX-8951洗脱出约5.3成。用NH2-(CH2)4-CO-DX-8951作标准曲线,计算出上述DDS化合物中DX-8951含量为3.0%。另一方面,以DX-8951作标准曲线,由上述DDS化合物的UV吸收计算出DX-8951含量为3.1%。
例13:CM-Dex-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-DXR(DXR:多柔比星)中DXR含量的测定
在用蒸馏水配制成1mg/ml的DDS化合物溶液10μl中添加用Britton Robinson缓冲液(pH6)配制成2mg/ml的木瓜蛋白酶溶液190μl。将反应液在40℃下培养2小时后,加入乙腈200μl,用HPLC定量游离的水解产物〔DXR〕。HPLC测定使用Symmetry RP18(4.6×100mm,3.5μm,Waters公司)柱,用含有有机溶剂(甲醇∶乙腈=1∶2)34%的0.1%三氟醋酸溶液进行洗脱,通过荧光光谱测定(Ex.480nm以及Em.590nm)检测水解产物。结果,DXR洗脱出约3.8成。用DXR作标准曲线,计算出上述DDS化合物中DXR含量为5.3%。另一方面,以DXR作标准曲线,由上述DDS化合物的UV吸收计算出DXR含量为4.3%。
例14:CM葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-DXR中DXR的合成
将按照WO97/46260实施例24记载的方法制备的平均分子量为274K、羧甲基化度(每个糖残基的羧甲基取代度)为0.4的羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(30mg)溶解于含有50%甲醇的0.05MCollidine-HCl缓冲液(2ml)中。向该溶液中加入含有按照WO97/46260实施例43记载的方法合成的Gly-Gly-Phe-Gly-DXR的盐酸盐(4mg)的甲醇溶液(400μl)、含有1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(2.4mg)的甲醇溶液(240μl),搅拌2小时。向其中加入3M食盐水30ml,使用Biomax-50膜采用超滤法进行脱盐。用微孔滤器(0.22μm)过滤不能通过膜的残留溶液后,冷冻干燥,得到标题化合物(25mg)。本化合物的药物化合物残基的含量在基于PBS(pH4.7)中480nm处的吸光度定量时为4.3%(W/W)。
例15:CM-Dex-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH2)4-CO-DX-8951的合成
将Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-OH(575mg)、HOSu(182mg)和DCC(326mg)溶解于DMF(20ml)中,搅拌30分钟。向其中加入将5-氨基戊酸苯甲酯的甲苯磺酸盐(500mg)与三乙胺(0.184ml)溶解于DMF(10ml)得到的溶液,在室温下搅拌3天。浓缩反应液,用柱色谱法(CH2Cl2∶MeOH=20∶1)精制残渣,得到Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH2)4-COOBzl 560mg。将Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH2)4-COOBzl(560mg)溶解于50%含水甲醇(60ml)中,加入5%Pd-C(含水50%)(1.5g),在氢气常压下,搅拌1夜。过滤除去反应液中的催化剂,浓缩干燥固化,得到Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH2)4-COOH 300mg。
将Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH2)4-COOH(300mg)、DCC(138mg)和HOSu(77mg)溶解于DMF中,搅拌30分钟。向该溶液中加入将DX-8951(317mg)和三乙胺(0.078ml)溶解于DMF中得到的溶液,在室温下搅拌1夜。浓缩反应液,用柱色谱法(CH2Cl2∶MeOH=10∶1)精制得到的残渣,得到Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH2)4-CO-DX-8951 400mg。
将Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH2)4-CO-DX-8951(300mg)溶解于TFA(2ml),使之反应1小时后,浓缩反应液,在得到的残渣中加入乙醚使之固化。除去上清液,干燥固体,得到H-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH2)4-CO-DX-8951的三氟醋酸盐250mg。
1H-NMR(DMSO-d6):δ8.45-8.55(m,2H),8.28-8.35(m,2H),7.95-8.10(br,2H),7.79(d,1H,J=10.7Hz),7.70-7.75(m,1H),7.32(s,1H),7.20-7.30(m,5H),7.15-7.25(m,4H),6.50-6.60(br,1H),5.50-5.60(m,1H),5.40-5.50(m,2H),5.18(s,2H),4.50-4.60(m,1H),3.55-3.95(m,7H),3.00-3.25(m,5H),2.75-2.85(m,1H),2.50(s,3H),2.15-2.25(m,4H),1.86-2.00(m,2H),1.55-1.65(m,2H),1.45-1.55(m,2H),0.88(t,3H,J=7.35Hz)
将按照WO97/46260实施例24记载的方法制备的平均分子量为337K、羧甲基化度(每个糖残基的羧甲基取代度)为0.4的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(200mg)溶解于DMF(10ml)中。向其中加入含有H-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH2)4-CO-DX-8951的三氟醋酸盐(30mg)、三乙胺(10μl)的甲醇(4ml)溶液,进一步加入含有1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(200mg)的甲醇(3ml)溶液,避光条件下,在室温下搅拌1夜。用3M食盐水稀释反应液,用超滤膜(50K)除去低分子,通过0.22μm的滤器,冷冻干燥,得到目的产物178mg。
工业实用性
以糖化合物修饰的羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇作为高分子载体使用的本发明DDS化合物脏器靶向性非常高,作为可以发挥优良治疗效果的药物是有用的。另外,本发明的DDS化合物的测定方法可以准确而且简便的定量DDS化合物的血药浓度和DDS化合物中引入的药物化合物残基的含量,因此在DDS化合物适用于临床时可以作为非常有用的方法利用。
Claims (15)
1、高分子载体和药物化合物残基通过包含肽键结合的2至8个氨基酸的间隔区结合的DDS化合物的测定方法,包括用肽酶处理该DDS化合物,测定所得水解产物的步骤。
2、如权利要求1所述的方法,用于测定生物体试样中含有的该DDS化合物的浓度。
3、如权利要求1所述的方法,用于测定该DDS化合物中引入的药物化合物残基的含量。
4、如权利要求1至3中任意一项所述的方法,该水解产物为药物化合物。
5、如权利要求1至3中任意一项所述的方法,该水解产物为药物化合物残基上结合有一部分间隔区的化合物。
6、如权利要求5所述的方法,间隔区的一部分为来源于间隔区的1个氨基酸。
7、如权利要求1至6中任意一项所述的方法,该高分子载体为具有羧基的多糖衍生物。
8、如权利要求7所述的方法,该高分子载体为羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇。
9、如权利要求1至8中任意一项所述的方法,该DDS化合物中引入的药物化合物为抗肿瘤药或抗炎药。
10、如权利要求1至9中任意一项所述的方法,间隔区为从N末端侧开始用-Gly-Gly-Phe-Gly-表示的四肽或者从N末端开始用-Gly-Gly-Gly-Phe-表示的四肽。
11、如权利要求1至9中任意一项所述的方法,间隔区为从N末端开始用-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-Y’-CH2-O-CO-表示的基团或从N末端开始用-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-Y’-CH2-O-CO-表示的基团(式中,Y’表示对亚苯基)。
12、如权利要求1至11中任意一项所述的方法,肽酶为α-糜蛋白酶或木瓜蛋白酶。
13、如权利要求1至12中任意一项所述的方法,药物化合物为(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并〔de〕吡喃并〔3’,4’:6,7〕中氮茚并〔1,2-b〕喹啉-10,13(9H,15H)-二酮。
14、如权利要求1至6中任意一项所述的方法,用于测定羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇与(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并〔de〕吡喃并〔3’,4’:6,7〕中氮茚并〔1,2-b〕喹啉-10,13(9H,15H)-二酮通过包含从N末端侧开始用-Gly-Gly-Phe-Gly-表示的四肽或者从N末端开始用-Gly-Gly-Gly-Phe-表示的四肽的间隔区结合的DDS化合物。
15、如权利要求14所述的方法,使用α-糜蛋白酶或木瓜蛋白酶作为肽酶,测定水解产物(1S,9S)-9-乙基-5-氟-1-甘氨酰氨基-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并〔de〕吡喃并〔3’,4’:6,7〕中氮茚并〔1,2-b〕喹啉-10,13(9H,15H)-二酮。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP31013098 | 1998-10-30 | ||
JP310130/1998 | 1998-10-30 | ||
JP32927298 | 1998-11-19 | ||
JP329272/1998 | 1998-11-19 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB998152889A Division CN1191093C (zh) | 1998-10-30 | 1999-10-29 | Dds化合物及其测定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1661044A true CN1661044A (zh) | 2005-08-31 |
Family
ID=26566202
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB998152889A Expired - Fee Related CN1191093C (zh) | 1998-10-30 | 1999-10-29 | Dds化合物及其测定方法 |
CN2004100115162A Pending CN1661044A (zh) | 1998-10-30 | 1999-10-29 | Dds化合物及其测定方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB998152889A Expired - Fee Related CN1191093C (zh) | 1998-10-30 | 1999-10-29 | Dds化合物及其测定方法 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6811996B1 (zh) |
EP (2) | EP1619210A1 (zh) |
KR (1) | KR20010090602A (zh) |
CN (2) | CN1191093C (zh) |
AU (1) | AU765409B2 (zh) |
BR (1) | BR9915198A (zh) |
CA (1) | CA2348931A1 (zh) |
EA (1) | EA003790B1 (zh) |
HK (1) | HK1042438A1 (zh) |
ID (1) | ID29943A (zh) |
IL (1) | IL142842A0 (zh) |
MX (1) | MXPA01004239A (zh) |
NO (1) | NO20012128L (zh) |
TW (1) | TWI232930B (zh) |
WO (1) | WO2000025825A1 (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105849126A (zh) * | 2013-12-25 | 2016-08-10 | 第三共株式会社 | 抗trop2抗体-药物偶联物 |
CN109069529A (zh) * | 2016-03-07 | 2018-12-21 | 箭头药业股份有限公司 | 用于治疗性化合物的靶向配体 |
WO2024104186A1 (zh) * | 2022-11-17 | 2024-05-23 | 菲鹏生物股份有限公司 | 化合物及其制备方法和封闭剂 |
Families Citing this family (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TW527183B (en) | 1996-06-06 | 2003-04-11 | Daiichi Seiyaku Co | Drug complex |
EA003398B1 (ru) * | 1998-05-22 | 2003-04-24 | Дайити Фармасьютикал Ко., Лтд. | Лекарственный комплекс c полимерным носителем |
US6811996B1 (en) * | 1998-10-30 | 2004-11-02 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. | DDS compounds and method for assaying the same |
CN1449412A (zh) * | 2000-06-29 | 2003-10-15 | 第一制药株式会社 | Dds化合物及其制备方法 |
US7569556B2 (en) * | 2004-05-10 | 2009-08-04 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Method of use of carboxylated polysaccharides topically on the eyeball |
US9820986B2 (en) * | 2005-03-04 | 2017-11-21 | Taiwan Hopaz Chems, Mfg. Co., Ltd. | Glycopeptide compositions |
EP1926498A2 (en) * | 2005-09-22 | 2008-06-04 | Hadasit Medical Research Services And Development Company Ltd. | Dextran and arabinogalactan conjugates of therapeutically active compounds |
CN1973902B (zh) * | 2006-12-12 | 2010-11-10 | 东北师范大学 | 以人参多糖为载体的抗肿瘤药物阿霉素复合物及制备方法 |
US9320805B2 (en) | 2010-05-25 | 2016-04-26 | Syndevrx, Inc. | Polymer-conjugated MetAP2 inhibitors, and therapeutic methods of use thereof |
US9895449B2 (en) | 2010-05-25 | 2018-02-20 | Syndevrx, Inc. | Polymer-conjugated MetAP2 inhibitors, and therapeutic methods of use thereof |
TW201348244A (zh) * | 2012-05-23 | 2013-12-01 | Iner Aec Executive Yuan | 醣質藥物造影劑前驅物之合成方法 |
KR102087017B1 (ko) | 2012-10-11 | 2020-03-10 | 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 | 항체-약물 콘주게이트 |
EP2910573B1 (en) | 2012-10-19 | 2020-02-19 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Antibody-drug conjugate produced by binding through linker having hydrophilic structure |
CA2908993C (en) | 2013-04-10 | 2023-05-23 | Syndevrx, Inc. | Metap2 inhibitors and methods of treating obesity |
SG11201603960XA (en) | 2014-01-31 | 2016-07-28 | Daiichi Sankyo Co Ltd | Anti-her2 antibody-drug conjugate |
US11185594B2 (en) | 2014-04-10 | 2021-11-30 | Daiichi Sankyo Company, Limited | (Anti-HER2 antibody)-drug conjugate |
CN111228511B (zh) | 2014-04-10 | 2024-06-18 | 第一三共株式会社 | 抗her3抗体-药物偶联物 |
BR112017027690A2 (pt) | 2015-06-29 | 2018-10-09 | Daiichi Sankyo Co Ltd | método para produção de uma composição de conjugado anticorpo-fármaco, e, composição de conjugado anticorpo-fármaco |
DK3386956T3 (da) | 2015-12-10 | 2021-10-11 | Syndevrx Inc | Fumagillolderivater og polymorfer deraf |
EP3402529A1 (en) | 2016-01-11 | 2018-11-21 | Syndevrx, Inc. | Treatment for tumors driven by metabolic dysfunction |
SG11201901841TA (en) | 2016-09-02 | 2019-03-28 | Arrowhead Pharmaceuticals Inc | Targeting ligands |
SG10201912173RA (en) | 2016-10-07 | 2020-02-27 | Daiichi Sankyo Co Ltd | Therapy for drug-resistant cancer by administration of anti-her2 antibody/drug conjugate |
EP3552626A4 (en) | 2016-12-12 | 2020-06-10 | Daiichi Sankyo Company, Limited | ASSOCIATION OF AN ANTIBODY DRUG CONJUGATE AND AN IMMUNE CONTROL POINT INHIBITOR |
JP6679762B2 (ja) | 2017-01-17 | 2020-04-15 | 第一三共株式会社 | 抗gpr20抗体及び抗gpr20抗体−薬物コンジュゲート |
TW202330036A (zh) | 2017-05-15 | 2023-08-01 | 日商第一三共股份有限公司 | 抗體-藥物結合物之製造方法 |
EP3677589A4 (en) | 2017-08-31 | 2021-04-21 | Daiichi Sankyo Company, Limited | IMPROVED PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY-ACTIVE CONJUGATE |
CN117838880A (zh) | 2017-08-31 | 2024-04-09 | 第一三共株式会社 | 制备抗体-药物缀合物的新方法 |
CN117815404A (zh) | 2018-05-18 | 2024-04-05 | 第一三共株式会社 | 抗-muc1抗体-药物缀合物 |
WO2020087077A1 (en) | 2018-10-26 | 2020-04-30 | Syndevrx,Inc. | Biomarkers of metap2 inhibitors and applications thereof |
EP3997093A1 (en) | 2019-07-10 | 2022-05-18 | Cybrexa 2, Inc. | Peptide conjugates of cytotoxins as therapeutics |
MX2022000450A (es) | 2019-07-10 | 2022-04-25 | Cybrexa 3 Inc | Conjugados peptídicos de agentes dirigidos a microtúbulos como terapéuticos. |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4386026A (en) * | 1981-04-20 | 1983-05-31 | Merck & Co., Inc. | Cell-specific glycopeptide ligands |
JP2791001B2 (ja) | 1990-02-16 | 1998-08-27 | 株式会社ディ・ディ・エス研究所 | グリコシル−蛋白誘導体 |
ES2117664T3 (es) | 1991-02-21 | 1998-08-16 | Drug Delivery System Inst Ltd | Carboximetilmanoglucanos y derivados de los mismos. |
JP2589431B2 (ja) | 1991-05-13 | 1997-03-12 | 株式会社ディ・ディ・エス研究所 | 糖修飾ポリグルタミン酸誘導体及びその製造法 |
JP2774417B2 (ja) | 1991-08-07 | 1998-07-09 | 株式会社ディ・ディ・エス研究所 | ペプチド骨格を有する分枝鎖型糖複合体及び微粒子キャリヤー |
JP2589435B2 (ja) | 1991-09-17 | 1997-03-12 | 株式会社ディ・ディ・エス研究所 | 糖修飾ポリリジン誘導体 |
JP2774429B2 (ja) | 1992-03-17 | 1998-07-09 | 株式会社ディ・ディ・エス研究所 | 糖骨格を有する分枝鎖型誘導体 |
JP3359955B2 (ja) | 1992-07-16 | 2002-12-24 | 第一製薬株式会社 | 抗腫瘍剤 |
DK0640622T3 (da) | 1993-02-26 | 2000-10-23 | Drug Delivery System Inst Ltd | Polysaccharidderivat og lægemiddelbærer |
US6214345B1 (en) * | 1993-05-14 | 2001-04-10 | Bristol-Myers Squibb Co. | Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates |
JPH0784481A (ja) | 1993-06-26 | 1995-03-31 | Ricoh Co Ltd | 画像形成装置 |
GB2282384B8 (en) | 1993-08-18 | 1997-09-04 | Europ Economic Community | Drug delivery agents incorporating mitomycin |
JP3418693B2 (ja) | 1993-09-06 | 2003-06-23 | 敏宏 赤池 | ポリ−ε−置換−L−リジンのD−ガラクトピラノシル−グルコン酸誘導体 |
JPH07228688A (ja) | 1994-02-18 | 1995-08-29 | Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd | 糖修飾ポリ−ω−置換−L−グルタミン酸誘導体およびその製造方法 |
DE69530553T2 (de) | 1994-05-13 | 2004-03-25 | KURARAY CO., LTD, Kurashiki | Medizinisches polymergel |
JP3001381B2 (ja) | 1994-09-16 | 2000-01-24 | 株式会社ディ・ディ・エス研究所 | 臓器移行性を有する多糖誘導体および薬物担体 |
US5886143A (en) * | 1994-12-07 | 1999-03-23 | Neorx Corporation | Hepatic-directed compounds and reagents for preparation thereof |
JP3053764B2 (ja) * | 1995-03-17 | 2000-06-19 | 財団法人神奈川科学技術アカデミー | 糖鎖高分子及びそれを用いた細胞処理剤並びに処理方法 |
US5714511A (en) * | 1995-07-31 | 1998-02-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Selective prevention of organ injury in sepsis and shock using selection release of nitric oxide in vulnerable organs |
CA2182851A1 (en) * | 1995-08-15 | 1997-02-16 | August Masaru Watanabe | Method for treating substance abuse withdrawal |
TW527183B (en) | 1996-06-06 | 2003-04-11 | Daiichi Seiyaku Co | Drug complex |
US6368598B1 (en) * | 1996-09-16 | 2002-04-09 | Jcrt Radiation Oncology Support Services, Inc. | Drug complex for treatment of metastatic prostate cancer |
JP2001505194A (ja) * | 1996-11-05 | 2001-04-17 | ブリストル―マイヤーズ・スクイブ・カンパニー | 分枝ペプチド・リンカー |
WO1998026747A2 (en) * | 1996-12-17 | 1998-06-25 | Terman David S | Superantigen based methods and compositions for treatment of diseases |
DE69833487T9 (de) | 1997-06-12 | 2007-03-01 | Innovata Plc, Ruddington | Polymer-wirkstoff-konjugate zur behandlung von krebs |
EA003398B1 (ru) * | 1998-05-22 | 2003-04-24 | Дайити Фармасьютикал Ко., Лтд. | Лекарственный комплекс c полимерным носителем |
US6811996B1 (en) * | 1998-10-30 | 2004-11-02 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. | DDS compounds and method for assaying the same |
-
1999
- 1999-10-29 US US09/807,980 patent/US6811996B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-29 CN CNB998152889A patent/CN1191093C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-29 CN CN2004100115162A patent/CN1661044A/zh active Pending
- 1999-10-29 ID IDW00200101143A patent/ID29943A/id unknown
- 1999-10-29 EP EP05015058A patent/EP1619210A1/en not_active Withdrawn
- 1999-10-29 WO PCT/JP1999/006016 patent/WO2000025825A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1999-10-29 AU AU64880/99A patent/AU765409B2/en not_active Ceased
- 1999-10-29 KR KR1020017005434A patent/KR20010090602A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-10-29 MX MXPA01004239A patent/MXPA01004239A/es unknown
- 1999-10-29 IL IL14284299A patent/IL142842A0/xx unknown
- 1999-10-29 EP EP99952805A patent/EP1155702A4/en not_active Ceased
- 1999-10-29 BR BR9915198-7A patent/BR9915198A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-10-29 EA EA200100485A patent/EA003790B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-10-29 CA CA002348931A patent/CA2348931A1/en not_active Abandoned
- 1999-10-30 TW TW091113738A patent/TWI232930B/zh not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-04-30 NO NO20012128A patent/NO20012128L/no not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-06-03 HK HK02104211.3A patent/HK1042438A1/zh unknown
-
2004
- 2004-04-13 US US10/822,661 patent/US7041818B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105849126A (zh) * | 2013-12-25 | 2016-08-10 | 第三共株式会社 | 抗trop2抗体-药物偶联物 |
CN105849126B (zh) * | 2013-12-25 | 2020-02-18 | 第一三共株式会社 | 抗trop2抗体-药物偶联物 |
CN109069529A (zh) * | 2016-03-07 | 2018-12-21 | 箭头药业股份有限公司 | 用于治疗性化合物的靶向配体 |
CN109069529B (zh) * | 2016-03-07 | 2021-08-20 | 箭头药业股份有限公司 | 用于治疗性化合物的靶向配体 |
WO2024104186A1 (zh) * | 2022-11-17 | 2024-05-23 | 菲鹏生物股份有限公司 | 化合物及其制备方法和封闭剂 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU765409B2 (en) | 2003-09-18 |
AU6488099A (en) | 2000-05-22 |
NO20012128L (no) | 2001-06-20 |
TWI232930B (en) | 2005-05-21 |
EP1619210A1 (en) | 2006-01-25 |
HK1042438A1 (zh) | 2002-08-16 |
EA200100485A1 (ru) | 2001-12-24 |
MXPA01004239A (es) | 2002-06-04 |
US6811996B1 (en) | 2004-11-02 |
ID29943A (id) | 2001-10-25 |
BR9915198A (pt) | 2001-08-14 |
CA2348931A1 (en) | 2000-05-11 |
EP1155702A4 (en) | 2004-12-15 |
KR20010090602A (ko) | 2001-10-18 |
CN1191093C (zh) | 2005-03-02 |
EA003790B1 (ru) | 2003-10-30 |
IL142842A0 (en) | 2002-03-10 |
US20040192644A1 (en) | 2004-09-30 |
US7041818B2 (en) | 2006-05-09 |
CN1332640A (zh) | 2002-01-23 |
EP1155702A1 (en) | 2001-11-21 |
NO20012128D0 (no) | 2001-04-30 |
WO2000025825A1 (fr) | 2000-05-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1191093C (zh) | Dds化合物及其测定方法 | |
CN1250293C (zh) | 药物复合物 | |
CN106573962B (zh) | 新颖的聚糖共轭物及其用途 | |
CN1182870C (zh) | 结合稳定的治疗剂组合物、传递和诊断制剂 | |
CN1155392C (zh) | 高分子嵌段共聚物-药物复合制剂 | |
CN1227034C (zh) | 药物复合物的制造方法 | |
JP6283616B2 (ja) | 糖鎖修飾心房性ナトリウム利尿ペプチド | |
CN1241932C (zh) | 新的低聚糖、其制备方法及其药物组合物 | |
CN1607962A (zh) | 聚谷氨酸-治疗剂结合物的生产方法 | |
CN1225654A (zh) | 抑制血管生成的化合物 | |
CA2972072A1 (en) | Novel glycan conjugates and methods of use thereof | |
BE1025210B1 (fr) | Conjugues immunogenes et leur utilisation | |
BE1022878A1 (fr) | Vaccins anti-meningococciques | |
EP3613755A1 (en) | Lysine-specific chemoenzymatic protein modifications using microbial transglutaminase | |
CN104321079A (zh) | 糖类-糖脂类缀合物疫苗 | |
WO2023019242A9 (en) | Compositions and methods for reducing immune intolerance and treating autoimmune disorders | |
WO2023122599A1 (en) | Glycosylated dendrimers for targeted intracellular delivery | |
CN1449412A (zh) | Dds化合物及其制备方法 | |
AU2018235063A1 (en) | Glycopolymers sequestering carbohydrate-binding proteins | |
BE1025443A1 (fr) | CONJUGUES nOMV-ANTIGENE ET LEUR UTILISATION | |
CN1323215A (zh) | 使用树枝状聚合物抑制毒物或毒性物质 | |
CN1254496C (zh) | 制备分枝型聚乙二醇的方法 | |
CN101039965A (zh) | 唾液酸衍生物 | |
CN114522244B (zh) | 视黄酸修饰的lytac分子及其制备方法和应用 | |
CN102573921A (zh) | 低聚物-拟钙剂结合物及相关化合物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |