KR20010090602A

KR20010090602A - 디디에스 화합물 및 그의 측정방법

Info

Publication number: KR20010090602A
Application number: KR1020017005434A
Authority: KR
Inventors: 스사키히로시; 이노우에카즈히로; 쿠가히로시; 이케다마사히로; 시오세요시노부; 코레나가히로시
Original assignee: 스즈키 다다시; 다이이찌 세이야꾸 가부시기가이샤
Priority date: 1998-10-30
Filing date: 1999-10-29
Publication date: 2001-10-18
Also published as: EA003790B1; TWI232930B; HK1042438A1; CN1661044A; US20040192644A1; AU6488099A; WO2000025825A1; BR9915198A; IL142842A0; CN1191093C; NO20012128L; EP1155702A4; EA200100485A1; NO20012128D0; CA2348931A1; CN1332640A; MXPA01004239A; AU765409B2; EP1155702A1; US7041818B2

Abstract

당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 이 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜에 결합한 의약화합물 잔기를 포함하는 DDS 화합물, 및 펩티드 결합한 2 내지 8개의 아미노산을 포함하는 스페이서를 통하여 고분자담체와 의약화합물 잔기가 결합한 DDS 화합물의 측정방법에 있어서, 이 DDS 화합물을 펩티다아제로 처리하여 얻어지는 가수분해물을 측정하는 단계를 포함하는 방법.

Description

디디에스 화합물 및 그의 측정방법{DDS Compounds and Method for Assaying the Same}

폐암과 소화기암 등의 고형암과 백혈병 등의 혈액암 치료에 사용되는 항종양제는 정맥내투여와 경구투여 등의 투여경로에 의해 전신적으로 투여된 후, 특정 종양부위로 이행하여 암세포의 증식을 저해 내지 억제함에 따라 치료효과를 발휘한다. 그러나, 전신투여된 항종양제는, 혈중으로부터 간장·망내계장기에 신속히 받아들여지거나 또는 신속히 요중배설되기 위해 혈중농도가 저하하여 종양부위로의 이행이 충분하지 않은 경우가 있다. 또한, 통상의 항종양제 자체로는 종양부위로의 이행선택성(종양선택성)이 낮기 때문에, 항종양제가 전신 여러 곳의 세포와 조직에 널리 분포해버려 정상세포와 조직에 대해서도 세포독으로서 작용하므로, 구토, 발열 또는 탈모 등의 부작용을 상당히 높은 비율로 발생시키는 문제가 있다. 따라서, 항종양제를 효율적이며 또한 선택적으로 종양부위에 이행시키는 수단의 개발이 요구되어 지고 있다.

이러한 수단의 하나로서, 카르복실기를 갖는 다당화합물을 고분자담체로서 사용하여, 이 고분자담체에 대해서 항종양제를 결합시켜 항종양제의 혈중에서의 소실을 지연시킴과 함께, 암조직으로의 지향성을 높이는 방법이 제안되고 있다. 예를 들면, 국제공개 WO94/19376호에는 카르복실기를 갖는 다당 카르복실기에 펩티드쇄(아미노산수 1 내지 8)가 결합되어 있고, 그 위에 이 펩티드쇄를 통해서 독소루비신, 다우노루비신, 마이토마이신 C, 또는 블레오마이신 등을 결합한 DDS 화합물이 개시되어 있다. 또한, 특개평 7-84481호 공보에는, 카르복시메틸화된 만노글루칸 유도체에 시프염기(Schiff's base)와 산아미드결합을 통해서 상기의 항종양제를 유도한 DDS 화합물이 개시되어 있다.

이들 DDS 화합물(약물 복합체」라고 불리는 경우도 있음)은 고분자담체에 결합된 항종양제를 단독으로 사용한 경우에 비해서 보다 뛰어난 항종양 효과를 갖음과 동시에, 독성·부작용이 경감되는 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 다당화합물 등의 고분자담체와 항종양제 등의 의약화합물을 1 내지 8개의 아미노산으로 이루어지는 스페이서를 통해서 결합시킴에 따라 항종양제 등의 의약화합물을 목적 조직에 대해서 부위 선택적으로 이행시킬 수 있는 DDS 화합물을 제공하고 있다(국제공개 WO97/46260호). 또한, 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜이 고분자담체로서 극히 뛰어난 성질을 갖고 있다는 것을 발견하고, 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 고분자담체로 함유한 DDS 화합물을 제공하였다(상기 국제공개).

그 외, 폴리알콜화 다당 화합물을 고분자담체로 사용한 DDS 화합물에 관한 기술에 대해서는, 「다당-펩티드-독소루비신복합체에 관한 연구·다당화합물의 혈중 안정성과 항종양 효과의 관계」(제 10회 일본 DDS학회 강연요지집, 279, 1994);「다당-펩티드-독소루비신복합체에 관한 연구, 체내동태와 항종양효과」(제 9회 일본 약물동태학회 연회 강연요지집, 292, 1994); 제 19회 연구개발동향 세미나(의약품기구주최) 요지집, D-9, 1995; 및 「다당담체에 의한 종양으로의 약물송달에 관한 연구」(제 12회 콜로이드·계면기술심포지움, 일본화학회, 강연요지집, 51, 1995) 등의 보고가 있다.

다당화합물 등의 고분자담체의 장기지향성을 높이는 방법으로서, 예를 들면, 당수식 폴리글루타민산 유도체(특개평 5-178986호 공보), 당수식 폴리리신 유도체 (특개평 5-222187 공보), 폴리-ε-치환-L-리신의 D-갈락토피라노실-글루콘산 유도체(특개평 7-70311호 공보), 당수식 폴리-ω-치환-L-글루타민산 유도체(특개평 7-228688호 공보), 링커를 통해서 당화합물을 결합시킨 다당화합물(특개평 8-85703호 공보), 및 글루코실-단백유도체(특개평 9-118699호 공보) 등이 알려져 있다. 그러나, 종래의 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 고분자담체로 이용한 DDS 화합물의 장기지향성을 높이는 방법은 보고되어 있지 않다.

한편, 고분자담체와 의약화합물 잔기가 올리고 펩티드를 포함한 스페이서를 통해서 결합한 DDS 화합물을 임상에서 사용하는 경우에는 DDS 화합물 자체의 혈중농도를 정확히 측정할 필요가 있고, 또한 적정 투여량을 결정하거나 제품의 롯트차를 검정하기 위해서는 DDS 화합물 중으로 도입된 항종양제 등의 의약화합물 잔기의 함유량을 정확히 측정할 필요가 있다. 종래의 DDS 화합물의 혈중농도 측정과 DDS 화합물의 의약화합물 잔기의 함유량 측정은, 의약화합물에서 발하는 형광과 UV흡수를 지표로 하여 DDS 화합물보다 의약화합물 또는 이에 스페이서의 일부가 결합한 화합물을 분리하지 않고, DDS 화합물 자체를 직접 측정하는 것에 의해 수행된다. 또한, DDS 화합물 자체의 NMR측정에 의한 방법과 DDS 화합물을 산처리해서 생기는 분해물을 측정하는 방법도 제안되고 있다.

그러나, 의약화합물이 산에 대해서 불안정한 경우에는, 산처리 등에 의한 분해물의 정량법을 이용할 수는 없고, NMR측정에 의한 정량은 정확도가 낮다는 문제가 있다. 또한, DDS 화합물에 존재하는 의약화합물 잔기의 UV흡수는, 고분자담체와 펩티드스페이서로부터 받는 영향에 의해 의약화합물자체에 비해 극대파장이 시프트하거나 몰흡광계수가 변화하고 있는 경우가 있기 때문에, DDS 화합물 중으로 도입된 의약화합물 잔기의 함유량을 정확히 측정하는 것은 일반적으로 어렵다. 더우기, 생체에 투여된 조직 중의 DDS 화합물을 NMR측정에 의한 방법과 UV흡수에 의해 정량하는 것은 극히 어렵다.

발명의 개시

본 발명의 과제는, 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 고분자담체로 포함하는 DDS 화합물의 장기지향성(예를 들면, 간장으로의 지향성 등)을 높이는 수단을 제공하고, 상기 특징을 갖는 DDS 화합물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 과제는, 상기 특징을 갖는 DDS 화합물의 제조용 원료로서 유용한 다당화합물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 과제는, 고분자담체와 의약화합물 잔기가 올리고 펩티드를 함유한 스페이서를 통해 결합한 DDS 화합물의 측정방법을 제공하는 데 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 과제는 DDS 화합물 자체 또는 DDS 화합물 중으로 도입된 항종양제 등의 의약화합물 잔기의 함유량을 정확히 측정하는 방법을 제공하는 데 있다. 더욱 구체적으로, 투여된 DDS 화합물의 혈중농도와 조직내 농도를 정확히 정량할 수 있고, 또는 DDS 화합물에 도입된 의약화합물 잔기의 함유량을 정확히 정량할 수 있는 측정방법을 제공하는 것이 본 발명의 과제이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행하였는 바, 당화합물로 수식한 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 고분자담체로서 사용하면, 상당히 장기지향성이 높은 DDS 화합물을 제조할 수 있고, 특히 갈락토오스를 결합시킨 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 함유한 DDS 화합물은 뛰어난 간장지향성을 갖고 있는 것을 발견하였다.

또한, 본 발명자들은 고분자담체와 의약화합물 잔기가 올리고 펩티드를 포함한 스페이서를 통해 결합한 DDS 화합물을 펩티다아제로 처리하여, 얻어진 가수분해물을 측정함에 의해, DDS 화합물의 혈중농도와 DDS 화합물에 도입된 의약화합물 잔기의 함유량을 정확히 또한 간편하게 정량할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명은 상기 지견을 근거하여 완성된 것이다.

즉, 본 발명은 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 이 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜에 결합한 의약화합물 잔기를 함유한 DDS 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 의약화합물 잔기가 스페이서를 통해서 결합한 상기 DDS 화합물; 스페이서가 1개의 아미노산 또는 펩티드 결합한 2 내지 8개의 아미노산인 상기 DDS 화합물; 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜이, 당화합물과 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜이 링커를 통해서 결합한 상기 DDS 화합물; 및, 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜이 링커를 통해서 당화합물에 의해 집단(cluster) 수식된 상기 DDS 화합물이 제공된다.

또한, 본 발명에 의해 카르복시 C_1-4알킬부분의 일부 카르복실기가 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜에 대해서 의약화합물 잔기를 결합시켜 제조할 수 있는 DDS 화합물이 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 이 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과의약화합물 잔기를 스페이서를 통해서 결합시켜 제조할 수 있는 상기 DDS 화합물; 및, 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 카르복시 C_1-4알킬부분의 일부 카르복실기에 당화합물 또는 당화합물에 결합한 링커를 결합시켜 제조된 이 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜에 대해서 의약화합물 잔기를 결합시켜 제조할 수 있는 상기 DDS 화합물이 제공된다.

또한, 본 발명에 의해 카르복시 C_1-4알킬부분의 일부 카르복실기에 의약화합물 잔기가 스페이서를 통해서 결합한 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 당화합물로 수식하여 제조할 수 있는 DDS 화합물이 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 이 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 당화합물을 링커를 통해서 결합시켜 제조할 수 있는 상기 DDS 화합물; 및, 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 카르복시 C_1-4알킬부분의 일부 카르복실기에 1개의 아미노산으로 이루어진 스페이서 또는 펩티드 결합한 2 내지 8개의 아미노산으로 이루어진 스페이서를 통해서 의약화합물 잔기를 결합시켜 제조된 이 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 당화합물로 수식하여 제조할 수 있는 상기 DDS 화합물이 제공된다.

본 발명의 더욱 바람직한 태양에 의하면, 당화합물이 갈락토오스 혹은 갈락토사민 또는 그들 유도체인 상기 DDS 화합물; 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 구성하는 덱스트란폴리알콜이 실질적으로 완전히 폴리알콜화가 가능한 조건하에서덱스트란을 처리하여 얻어진 덱스트란폴리알콜인 상기 DDS 화합물; 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜이 카르복시 메틸덱스트란폴리알콜인 DDS 화합물; 갈락토오스 혹은 갈락토사민 또는 그것들의 유도체, 또는 집단화된 갈락토오스 혹은 갈락토사민 또는 그것들의 유도체의 치환도가 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 당잔기당 0.01 내지 1.0인 상기 DDS 화합물; 의약화합물이 항종양제 또는 항염증제인 상기 DDS 화합물; 의약화합물이 (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-하이드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온인 상기 DDS 화합물; 및 간암 치료제인 상기 DDS 화합물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜; 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜로 구성된 고분자담체: 및, 상기 DDS 화합물의 제조에 사용하기 위한 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜이 본 발명에 의해 제공된다. 또 다른 관점에서, 상기 DDS 화합물 제조를 위한 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜 사용이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 발명에 의해, 펩티드 결합한 2 내지 8개의 아미노산을 포함한 스페이서를 통해서 고분자담체와 의약화합물 잔기가 결합한 DDS 화합물의 측정방법으로서, 이 DDS 화합물을 펩티다아제로 처리하여 얻어지는 가수분해물을 측정하는 공정을 포함한 방법이 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 생체시료 중에 포함되는 이 DDS 화합물의 농도측정에 사용하는 상기 방법; 이 DDS 화합물에 도입된 의약화합물 잔기의 함유량을 측정하기 위해 사용하는 상기 방법; 이 가수분해물이 의약화합물인 상기 방법; 이 가수분해물이 의약화합물 잔기에 스페이서의 일부가 결합한 화합물인 상기 방법; 및, 스페이서의 일부가 스페이서 유래의 1개 아미노산인 상기 방법이 제공된다.

본 발명의 더욱 바람직한 태양에 의하면, 이 고분자담체가 카르복실기를 갖는 고분자담체, 바람직하게는 다당유도체인 상기 방법; 이 고분자담체가 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜, 바람직하게는 카르복시 메틸덱스트란폴리알콜인 상기 방법; 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 구성하는 덱스트란폴리알콜이 실질적으로 완전히 폴리알콜화가 가능한 조건 하에서 덱스트란을 처리하여 얻어진 덱스트란폴리알콜인 것을 특징으로 하는 상기 방법; 이 고분자담체가 당화합물로 수식된 상기 방법; 이 DDS 화합물 중으로 도입된 의약화합물이 항종양제 또는 항염증제인 상기 방법; 스페이서가 N말단측부터 -Gly-Gly-Phe-Gly-로 나타나는 테트라 펩티드 또는 말단측부터 -Gly-Gly-Gly-Phe-로 나타나는 테트라 펩티드인 상기 방법; 스페이서가 N말단측부터 -Gly-Gly-Phe-Gly-NH-Y'-CH₂-O-CO-로 나타나는 기 또는 N말단측부터 -Gly-Gly-Gly-Phe-NH-Y'-CH₂-O-CO-로 나타나는 기(이때, Y'는 p-페닐렌기를 표시한다)인 상기 방법; 펩티다아제가 α-키모트립신 또는 파파인인 상기 방법; 및, 의약화합물이 (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-하이드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온인 상기 방법이 제공된다.

상기 발명의 특히 바람직한 태양에서는, 상기 방법은 N말단측에서 -Gly-Gly-Phe-Gly-로 나타나는 테트라 펩티드 또는 N말단측에서 -Gly-Gly-Gly-Phe-로 나타나는 테트라 펩티드를 함유한 스페이서를 통해서 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-하이드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온을 측정하여 상기 DDS 화합물 또는 상기 DDS 화합물에 도입된 상기 항종양제의 함유량을 정량할 수 있다.

본 발명은 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 항종양제 등의 의약화합물을 결합시킨 DDS(drug delivery system) 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 고분자담체와 항종양제 등의 의약화합물을 결합시킨 DDS 화합물의 측정방법에 관한 것이다.

도 1은 발명의 방법(실시예 4)에서 측정한 DDS 화합물의 혈중 및 복수 중 농도를 나타내는 도면이다.

도 2는 본 발명의 방법(실시예 5)에서 측정한 DDS 화합물의 혈중 및 복수 중 농도를 나타내는 도면이다.

도 3은 당화합물로 수식된 고분자담체를 갖는 본 발명의 DDS 화합물(실시예 6)의 자외선흡수 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

도 4는 당화합물로 수식된 고분자담체를 갖는 본 발명의 DDS 화합물(실시예6)의 GPC차트를 나타내는 도면이다.

도 5는 실시예 6에서 제조한 DDS 화합물((C) 및 (D))의 간장으로의 집적성을 나타내는 도면이다.

도 6은 본 발명의 DDS 화합물(실시예 6(D))의 자외선흡수 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

도 7은 본 발명의 DDS 화합물(실시예 7)의 자외선흡수 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

도 8은 본 발명의 DDS 화합물(실시예 9)의 자외선흡수 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

도 9는 본 발명의 DDS 화합물(실시예 6(D))의 GPC차트를 나타내는 도면이다.

도 10은 본 발명의 DDS 화합물(실시예 7)의 GPC차트를 나타내는 도면이다.

도 11은 본 발명의 DDS 화합물(실시예 9)의 GPC차트를 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 상태

본 발명의 DDS 화합물은, 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 이 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜에 결합한 의약화합물 잔기를 포함하는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 DDS 화합물은, (1) 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 의약화합물 잔기가 스페이서를 통하지않고 결합해 있는 경우; 및, (2) 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 의약화합물 잔기가 스페이서를 통해서 결합해 있는 경우를 모두 포함한다.

당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 의약화합물 잔기가 스페이서를 통해서 결합한 경우의 예로서는, 예를 들면, 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 의약화합물 잔기가 1개의 아미노산으로 구성되는 스페이서로 결합한 경우, 또는 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 의약화합물 잔기가 펩티드 결합한 2 내지 8개의 아미노산으로 구성되는 스페이서를 통해서 결합한 경우와, 펩티드 결합한 2 내지 8개의 아미노산으로 구성되는 올리고 펩티드에 -NH-Y-CO-[이때, Y는 탄소수 1 내지 8개의 알킬렌기 또는 -C₆H₄-CH₂-0-(-C₆H₄-는 페닐렌기를 표시, 이 페닐렌기는 1 또는 2개 이상의 치환기를 가지고 있어도 되고, 바람직하게는 p-페닐렌기임)로 나타나는 기를 표시한다]로 나타나는 연결기가 결합한 스페이서를 통해서 결합한 경우 등을 들 수 있다. 본 명세서에 있어서 사용되는 「수식」이라는 용어는, 당화합물과 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜이 직접적으로, 또는 링커를 통해서 간접적으로 공유결합에 의해서 결합한 상태를 포함해서 가장 넓은 의미로 해석해야 하며, 어떠한 의미에 있어서도 한정적으로 해석해서는 안 된다.

상기 DDS 화합물에 포함되는 의약화합물 잔기는 예를 들면, 항종양제, 항염증제, 항균제 등의 의약으로서 사람을 포함한 포유류의 병치료 및, 또는 예방에 사용되는 의약화합물의 주요한 부분구조를 의미한다. 그러나, 이 의약화합물의 용도는 상기의 것에 한정되는 것이 아니라, 의약화합물로서는 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜 또는 스페이서의 결합에 관여할 수 있는 1 또는 2 이상의 반응성 관능기(예를 들면, 아미노기, 카르복실기, 수산기, 티올기, 에스테르기 등)를 갖는 것이라면 어떤 것을 사용해도 좋다. 의약화합물 잔기는, 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 카르복실기, 스페이서에 존재하는 반응성 관능기(예를 들면, 펩티드스페이서를 사용하는 경우에는, 그 N말단 아미노기 혹은 C말단 카르복실기, 또는 스페이서를 구성하는 아미노산에 존재하는 반응성 관능기)에 결합해 있어도 된다. 또한, 본 명세서에 있어서, 의약화합물의 경우에는 그 자제가 의약작용을 갖는 화합물의 주요구조를 그 부분구조로 가지고 생체내에서 이 화합물을 재생할 수 있는 프로드럭(prodrug) 화합물도 포함된다.

상기 발명에 있어서, 의약화합물 잔기란 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜 또는 스페이서와 의약화합물 잔기와의 결합이, 의약화합물 중의 반응성 관능기와 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜 또는 스페이서 중의 반응성 관능기와의 반응(예를 들면, 탈수축합 등)에 의해 형성되었다고 가정한 경우에, 결합 후의 화합물 중에 존재하는 의약화합물에 유래하는 부분구조인 것이다. 예를 들면, 의약화합물이 D-NH₂, D-COOH, D-COOR, D-OH, D-SH, D-CONH₂, D-NH-COOR(R은 저급 알킬기 등)으로 표현되는 경우, 의약화합물 잔기는 각각 D-NH-(D-NH-CO-Q 등), D-CO-(D-CO-NH-Q, D-CO-O-Q, D-CO-S-Q 등), D-CO-(D-CO-NH-Q, D-CO-O-Q, D-CO-S-Q 등), D-O-(D-O-CO-Q, D-O-Q 등), D-S-(D-S-CO-Q, D-S-Q 등), D-CONH-(D-CO-NH-CO-Q 등), D-NH-CO-(D-NH-CO-O-Q, D-NH-CO-NH-Q 등)으로 표현된다(괄호 내는 스페이서 또는 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 의약화합물 잔기와의 결합을 나타내고, Q는 스페이서 및 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜에서 각각 반응성 관능기 및 카르복실기를 제외한 나머지 부분구조를 나타냄).

의약화합물 잔기로는 예를 들면, 독소루비신, 다우노루비신, 마이토마이신 C, 블레오마이신, 시크로시티딘, 빈크리스틴, 빈브라스틴, 메토트렉세이트, 백금계 항종양제(시스플라틴 혹은 그 유도체), 택솔 혹은 그 유도체, 캄프토테신 혹은 그 유도체(특개평 6-87746호 공보에 기재된 항종양제, 바람직하게는 청구항 2에 기재된 (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[DE]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온 등)등의 항종양제 잔기를 바람직하게 사용할 수 있다. 또한 예를 들면, 숙신산히드로코르티존, 숙신산프레드니조론 등의 스테로이드계 항염증제, 또는 메페남산 (mefenamic acid), 플루페남산(flufenamic acid), 디클로페낙 (diclofenac), 이부프로펜, 티노리신(tinoridine) 등의 비스테로이드계 항염증약의 잔기도 바람직하다.

의약화합물 잔기와 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 결합하는 스페이서로서 1개의 아미노산으로 구성되는 스페이서 또는 펩티드 결합한 2 내지 8개의 아미노산으로 구성된 스페이서를 사용하는 경우에는, 이 스페이서는 1개의 아미노산잔기(아미노산의 아미노기 및 카르복실기에서 각각 1개의 수소원자 및 1개의 수산기를 제외한 잔기를 의미함), 또는 펩티드 결합한 2내지 8개의 아미노산으로 구성되는 올리고 펩티드 잔기(N말단의 아미노기 및 C말단의 카르복실기에서 각각 1개의 수소원자 및 1개의 수산기를 제외한 잔기를 의미함)의 형태를 갖고 있다.

바람직한 스페이서는 2 내지 6개의 아미노산으로 구성되는 올리고 펩티드 잔기이다. 스페이서를 구성하는 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어서, L- 또는 D-아미노산, 바람직하게는 L-아미노산을 사용할 수 있고, α-아미노산 외에, β-알라닌, ε-아미노카프론산, γ-아미노부티릭산 등을 사용해도 무방하다.

올리고 펩티드로 구성된 스페이서를 사용하는 경우의 아미노산 배열은 특별히 한정되지 않으나, 이러한 α-아미노산이외의 아미노산은, 스페이서 중에서 다당화합물에 근접한 위치에 배치되는 것이 바람직하다.

예를 들면, 올리고 펩티드 스페이서를 사용하는 경우의 결합방향은 특별히 한정되지 않으나, 일반적으로 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 카르복실기에 스페이서의 N말단을 산아미드 결합에 의해서 결합하고, 의약화합물의 아미노기에 스페이서의 C말단을 결합할 수 있다. 또한, 예를 들어서 펩티드스페이서의 구성단위로서 리신잔기를 포함해두고, 리신잔기의 α-아미노기 및 ε-아미노기를 각각 다른 아미노산의 카르복실기와 산아미드 결합시키면 펩티드스페이서의 양말단이 N말단이 되므로, 의약화합물의 카르복실기를 결합하는 것이 가능해 진다. 게다가, 스페이서 중에 1개 또는 2개 이상의 디아민화합물 또는 디카르본산화합물 잔기(예를 들면, 에틸렌디아민 등의 디아민 잔기와 숙신산 등의 디카르본산의 잔기 등)를 구성단위로 포함해두고, 각각 양말단이 N말단의 스페이서 및 양말단이 C말단의 스페이서를 이용해도 된다.

올리고 펩티드로 구성되는 스페이서를 사용하는 경우의 아미노산 배열은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 스페이서가 -X-Z-로 표현되는 디펩티드 잔기(X는 소수성 아미노산 잔기를 나타내고, Z는 친수성 아미노산 잔기를 나타내고, -X-Z-는 소수성 아미노산(X)과 친수성 아미노산(Z)이 각각 N말단측 및 C말단측이 되어 펩티드 결합한 디펩티드의 N말단의 아미노기 및 C말단의 카르복실기에서 각각 1개의 수소원 및 1개의 수산기를 제외한 잔기를 의미함)지만, 또는 이 디펩티드 잔기를 부분 펩티드배열로서 포함하는 스페이서를 바람직하게 사용할 수 있다. 소수성 아미노산으로서는 예를 들면, 페닐알란닌, 티로신, 로이신 등을 사용할 수 있고, 친수성 아미노산으로서는 예를 들면, 글리신, 알라닌 등을 사용할 수 있다. 스페이서가 이러한 디펩티드 잔기의 반복 배열(예를 들어, -X-Z-X-Z-, -X-Z-X-Z-X-Z- 등)을 가지고 있어도 된다.

이러한 디펩티드구조를 포함한 스페이서를 사용하면, 스페이서가 펩티다아제가 풍부하다고 생각되는 종양부위와 염증부위에서 가수분해되어, 그 부위에 단시간에 고농도의 의약화합물이 유리한다. 따라서, 상기 디펩티드를 포함하는 스페이서와 의약화합물이 결합하여 형성되는 부위구조는, 본 발명의 DDS 화합물의 바람직한 부분구조이다. 의약화합물의 잔기로서, 농도의존형 항종양제(예를 들어, 독소루비신 등)의 잔기를 사용하는 경우에는, -X-Z-로 표현되는 상기 디펩티드 잔기로 구성되는 스페이서 또는 이 디펩티드 잔기를 부분 펩티드배열로 포함하는 스페이서를 사용하는 것이 바람직한다.

또한, 의약화합물 잔기로서 일정 농도이상에서 작용시간의 지속을 필요로 하는 시간의존형 항종양제를 사용하는 경우에도, 상기 스페이서를 사용함에 의해 높은 항종양 효과를 달성할 수 있는 때가 있다. 이러한 항종양제는, 특개평 6-87746호 공보에 기재된 항종양제, 바람직하게는 청구항 2에 기재된 항종양제를 예로 들 수 있다. 일반적으로는 상기 스페이서에 한정되는 일 없이, 항종양제의 작용기구, 체내동태와 독성발현의 특징, 체내에서의 항종양제 유리성 등의 관점에서 바람직한 스페이서를 선택할 필요가 있다. 또한, 일반적으로 증식이 빠른 암종에 대해서는, 단시간에 고농도의 의약화합물을 유리할 수 있는 상기 스페이서를 선택하는 것이 바람직하다.

스페이서로서 이용가능한 올리고 펩티드의 구체 예를 아래의 표에 나타냈으나, DDS 화합물에 필요에 따라 사용할 수 있는 스페이서는 아래의 것에 한정되지 않고, 스페이서를 이용하든지 하지 않든지의 선택, 또는 스페이서를 사용하는 경우에 그 종류의 선택은, 당업자가 의약화합물의 적당한 유리속도를 부여하도록 적절한 것으로 할 수 있다(표에서, 펩티드 배열은 좌측이 N말단이고, C말단측에 의약화합물 잔기가 결합한다. D-Phe는 D-페닐알라닌 잔기를 나타내고, 그 외에 아미노산은 L-아미노산을 나타낸다. 또한, 유리속도의 차이는 독소루비신을 결합한 DDS 화합물의 Walker256 담암(tumor bearing) 랫트의 종양부위에서 유리하여 독소루비신 농도에 의해 판정했음). 이것들의 스페이서 중, 독소루비신에 대해서는(N말단) -Gly-Gly-Phe-Gly- 등의 단시간에 고농도 의약화합물을 유리할 수 있는 스페이서를 사용하는 것이 바람직하다.

표 1

(a) 유리속도가 큰 스페이서

-Leu-Gly-

-Tyr-Gly-

-Phe-Gly-

-Gly-Phe-Gly-

-Gly-Gly-Phe-Gly-

-Gly-Phe-Gly-Gly-

-Phe-Gly-Gly-Gly-

-Phe-Phe-Gly-Gly-

-Gly-Gly-Gly-Phe-Gly-

(b) 유리속도가 비교적 큰 스페이서

-Gly-Gly-Phe-Phe-

-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-

(c) 유리속도가 비교적 작은 스페이서

-Phe-Phe-

-Ala-Gly-

-Pro-Gly-

-Gly-Gly-Gly-Phe-

(d) 유리속도가 작은 스페이서

-Gly-

-D-Phe-Gly-

-Gly-Phe-

-Ser-Gly-

-Gly-Gly-

-Gly-Gly--Gly-

-Gly-Gly--Gly-Gly-

본 발명의 DDS 화합물은, 고분자담체로서 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 DDS 화합물에 있어서, 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 폴리알콜화도는 특별히 한정되지 않으나, 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 구성하는 덱스트란폴리알콜이 실질적으로 완전히 폴리알콜화가 가능한 조건 하에서 덱스트란을 처리하여 얻어진 덱스트란폴리알콜인 것이 바람직한다.

카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 제조하기 위해 사용하는 덱스트란의 종류는 특별히 한정되지 않으나, α-D-1, 6-결합을 임의의 비율로 포함하고 있어도 된다. 예를 들어, α-D-1, 6-결합의 비율이 85%이상, 90%이상, 또는 95%이상의 덱스트란 등을 사용할 수 있다. 덱스트란의 분자량은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 1,000정도 부터 2,000,000정도의 것, 바람직하게는 3,000정도 부터 8,000,000정도의 것을 사용할 수 있다. 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 카르복시 C_1-4알킬기를 구성하는 C_1-4알킬로서는, 직쇄 또는 분지쇄의 C_1-4알킬, 구체적으로는 메틸기, 에틸기, ｎ-프로필기, 이소프로필기, ｎ-부틸기, sec-부틸기 등을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 메틸기를 사용할 수 있다.

출발원료로서 덱스트란을 사용할 경우에는, 덱스트란에 다량의 과요오드산나트륨과 붕수소화나트륨을 순차작용시켜서 덱스트란을 실질적으로 완전히 폴리알콜화한 덱스트란폴리알콜을 제조할 수 있다. 그러나, 덱스트란의 폴리알콜화 방법은 상기의 것에 한정되지 않고, 당업자에게 이용가능한 것이면 어떠한 방법을 채용해도 된다. 카르복시 C_1-4알킬은 예를 들어, 덱스트란폴리알콜의 수산기에 대해서 염화초산, 브롬초산, α-염화프로피온산, α-메틸-α-염화프로피온산, β-염화프로피온산, α-메틸-β-염화프로피온산, α-염화락산, β-염화락산, γ-염화락산 등의 할로겐화 C_1-4알킬카르본산, 바람직하게는 염화초산을 반응시켜서 수산기를 부분적 또는 완전히 카르복시 C_1-4알킬화함에 의해 행할 수 있다.

예를 들어, 덱스트란폴리알콜을 반응에 관여하지 않는 불활성 용매(예를 들어, 물, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸설폭시드 등)에 용해하고, 염기(예를 들어, 수산화나트륨과 수산화칼륨 등)의 존재하에 할로겐 C_1-4알킬카르본산 또는 그 염을 첨가하고, 빙냉하 내지 100℃정도의 온도범위에서 수분 내지 수일간 반응시키면 된다. 카르복시 C_1-4알킬기의 도입 정도는, 예를 들어 카르복시 C_1-4알킬화의 반응온도와 시약으로 사용하는 할로겐화 C_1-4알킬카르본산 및 염기량을 적절히 선택함에 의해 쉽게 조절가능하고, 그러한 수단은 당업자에게 널리 알려져 있다. 덱스트란폴리알콜의 당잔기에 대한 카르복시 C_1-4알킬화의 정도는 특별이 한정되지 않으나, 0.01 내지 2.0의 범위, 바람직하게는 0.1 내지 1.0의 범위가 적절하다.

카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 수식하는 당화합물 종류는 특별히 한정되지 않으나, DDS 화합물이 지향할 장기의 종류와 체내동태 등의 조건에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 당화합물로서는 단당류 혹은 올리고당류, 또는 그것들의 유도체의 어느 것을 사용해도 된다. 또한, 당화합물과 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과의 결합 종류는 한정되지 않는다. 당화합물과 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜이, 예를 들어 0-α-글리코시드결합 또는 0-β-글리코시드결합 등에 의해 직접 결합해도 되고, 또는 적절한 링커를 통해서 양자가 결합해도 된다. 본 명세서에서 사용되고 있는 「링커」라는 용어는, 당화합물 잔기와 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과의 결합에 사용되는 모든 것도 포함하도록, 가장 넓은 의미로해석할 필요가 있다. 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜에 대한 당화합물의 도입량(치환도)은 특별히 한정되지 않으나, 당화합물의 종류, 소망하는 지향성 정도, 의약화합물의 종류 등 모든 조건에 의해서 적절한 선택이 가능하지만, 일반적으로 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 당잔기당 0.01 내지 1.0정도이다.

링커를 사용하는 경우, 링커의 종류는 특별히 한정되지 않으나 예를 들어, -O-(CH₂)_n-NH-(n은 1 내지 16의 정수) 또는 -(O-CH₂CH₂)_m-NH-(m은 1 내지 10의 정수)로 표현되는 링커를 이용하는 것이 바람직하다. 이것들의 링커의 O말단 또는 N말단, 바람직하게는 O말단을 당화합물에 O-α-글리코시드결합 또는 O-β-글리코시드결합으로 결합하고, 다른 말단을 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 카르복실기와 아미드결합 또는 에스테르결합시켜, 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 당화합물로 수식하는 것이 가능하다.

또한, 소위 집단(cluster)수식에 적합한 링커를 사용함에 따라 집단수식체를 제조할 수도 있다. 집단수식체는, 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 카르복실기에 대해서 집단수식에 적합한 링커를 사용해서 당화합물을 집단적으로 결합시킨 화합물로, 그 구체적 수단은 예를 들어, 특허 제 2774417호 명세서, 특허 제 2774429호 명세서, 또는 Biol. Pharm. Bull., 20, pp.259-266, 1997 등에 기재되어 있다. 집단 수식체는 복수개의 당화합물을 일정 공간내에 배치하기 위해, 수용체와의 친화성이 높아지고, 뛰어난 장기지향성을 발휘할 수 있다는 특징이 있다. 본 발명의DDS 화합물에 있어서 집단 수식의 일례를 아래에 나타낸다(아래의 구조식에서는, 집단 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜 분자의 부분구조를 나타내고 있고, 의약화합물 잔기는 생략하고 있음). 그러나, 본 발명의 DDS 화합물에 이용가능한 집단 수식 방법은 아래의 구체예에 한정되지 않으며, 당업자가 적절한 수단을 선택할 수 있다.

단당류로서는, 글루코스, 프럭토스, 만노오스, 갈락토오스, 푸코오스, 뉴라민산, 우론산(uronic acid) 등의 헥소스; 갈락토사민, 글루코사민 등의 헥소사민; 리보오스, 데옥시리보오스, 아라비노오스, 크실로오스 등의 펜토오스 등을 들 수 있다. 이것들의 유도체로서 예를 들어, N-또는 O-아실유도체, O-알킬유도체, 황산에스테르(sulfuric acid ester), 인산에스테르(phosphoric acid ester) 등을 사용해도 된다. 단당류 유도체로서 보다 구체적으로, N-아세틸노일아민산, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 만노오스-6-인산, 갈락토오스-3-인산, 6-0-벤조일글루코오스, 6-0-카르복시메틸-N-아세틸글루코사민, 2-N-벤질글루코사민 등을 들 수 있다. 올리고당류로서는 예를 들어, 상기 단당류 또는 그것들의 유도체로 구성되는 직쇄상 또는 분지쇄상 헤테로올리고당 또는 호모올리고당을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는 수크로오스, 시아릴루이스 A(sialyl Lewis A), 시아릴루이스 X, 락토오스, 말토오스, 루이스 X, 황산화루이스 X 등을 사용할 수 있다. 이것들 중, 간장지향성을 높이는 당화합물로서는, 갈락토오스 혹은 갈락토사민 또는 그 유도체, 혹은 갈락토오스 또는 N-아세틸갈락토사민을 비환원 말단측에 갖는 올리고당(예를 들어, 락토오스)이 바람직하고, 특히 갈락토오스 또는 N-아세틸갈락토사민이 바람직하다.

본 발명의 DDS 화합물의 제조방법은 특별히 한정되지 않으나, 이하에 일반적인 제조방법을 나타낸다. 또한, 그 일례를 본 명세서의 실시예에 구체적이고 상세하게 나타내었다. 당업자는 하기의 일반적 설명 및 실시예에 기재된 제조방법을 참조하면서 제조원료, 반응시약, 및 반응조건 등을 적절히 선택하고, 필요에 따라 그 방법들을 개량하여, 본발명에 포함되는 DDS 화합물을 쉽게 제조할 수 있다. 일반적으로, 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 적합한 방법에 따라 당화합물로 수식하고, 이 수식체를 의약화합물 잔기 또는 의약화합물에 결합한 스페이서와 반응시킴에 의해, 본 발명의 DDS 화합물을 제조하는 것이 가능하다. 통상적으로, 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 나트륨염 또는 칼륨염 등의 알카리금속염 형태의 수용액으로서 제조하고, 당화합물 수식 및 의약화합물(또는 의약화합물에 결합한 스페이서)과의 반응을 수중, 또는 함수 유기용매 중에서 행할 수 있다.

또는, 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜 또는 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 유기 아민염 형태로 변환하고, 그 후의 반응을 실질적으로 물을 포함하지 않은 유기용매 중에서 행하는 것이 가능하다. 유기 아민염으로는 예를 들어, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 트리에탄올아민 등 지방족(aliphatic) 아민류의 염외에, N-메틸피롤리딘, N-메틸피페리딘, N-메틸모폴린(morpholine), 디메틸아미노피리딘 등의 지환식(alicyclic) 또는 방향족 아민류의 염, 염화테트라메틸암모늄, 염화테트라에틸암모늄 등의 4급 암모늄염 등을 사용할 수 있다. 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜 또는 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 나트륨염에서 유기아민염으로의 변환은 이온교환수지 등을 사용해서 행할 수 있다. 예를 들어, 카르복시 메틸덱스트란폴리알콜 또는 그 당화합물 수식체의 나트륨염을 물에 용해하고, Bio-Rad AG50W-X2 (200-400 메쉬, H⁺형)수지를 사용한 컬럼에 대해서 물로 용출한 후, 트리에틸아민 등의 유기아민을 첨가하여 동결건조시킬 수 있다. 또한, 카르복시 메틸덱스트란폴리알콜 또는 그 당화합물 수식체인 나트륨을 물에 용해하고, 트리에틸암모늄형의 수지를 통과시킴에 의해 일공정으로 변환을 시키는 것도 가능하다.

의약화합물 자체와 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 카르복실기와의 결합, 또는 의약화합물을 결합시킨 스페이서와 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 카르복실기와의 결합은, 일반적으로 의약화합물 자체가 갖는 반응성 아미노기 또는 스페이서의 반응성 아미노기(펩티드 스페이서에서는 N말단 아미노기 등)와 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 카르복실기를, 산아미드결합시키면 된다. 그러나, 스페이서와 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 카르복실기의 결합은 상기에 한정되지 않으며, 다른 화학결합과 1 내지 2 이상의 스페이서를 이용한 결합이어도 된다. 예를 들어, 펩티드스페이서의 C말단 카르복실기 또는 의약화합물의 카르복실기와 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 카르복실기에 의해 산무수물을 형성시켜도 되고, 또한 에틸아민 등의 디아민화합물을 스페이서로 사용하여 각각의 카르복실기를 디아민의 각 아미노기에 산아미드결합시켜도 된다.

의약화합물 자체가 갖는 반응성 아미노기 또는 펩티드 스페이서의 N말단 아미노기와 카르복시 메틸덱스트란폴리알콜의 카르복실기를 산아미드결합에 의해 결합시킨 경우에는 펩티드쇄의 합성에 사용하는 통상의 탈수축합제(dehydration condensation agents), 예를 들면 N,N'-디시크로헥실 카르보디이미드(DCC) 등의 N,N'-디시크로알킬카르보디이미드류, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDAPC) 등의 카르보디이미드 유도체, 1-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디히드록시퀴놀린(EEDQ) 등을 사용할 수 있다. 이 경우, 필요에 따라 1-히드록시벤조트리아졸(HOBT) 등의 벤조트리아졸 유도체를 가하여도 된다. 또한, 활성 에스테르법과 산할로겐화법 등에 의해 반응을 행하여도 된다.

반응을 비수계로 행할 경우의 용매로는, 실질적으로 물을 포함하지 않는 유기용매로서 반응물(당화합물로 수식된 카르복시 덱스트란폴리알콜의 유기아민염 및 의약화합물 또는 의약화합물을 결합시킨 스페이서 등)을 용해할 수 있는 것이라면 어떠한 것을 사용해도 된다. 예를 들면, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 술포란(sulfolane) 등을 사용하는 것이 바람직하다. 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜에 도입되는 의약화합물 잔기의 양은 특별히 한정되지 않으나, 의약화합물 잔기의 종류, 및 DDS 화합물의 체내동태, 약효, 및 독성 등의 관점에서 적절히 선택해야 한다. 일반적으로는, 0.1 내지 30중량%, 바람직하게는 2 내지 15중량%정도의 범위를 선택할 수 있다. 의약화합물로서 특개평 6-87746호 공보의 청구항 2에 기재된 항종양제를 사용하는 경우의 도입량은, 예를 들어 1 내지 15중량%, 바람직하게는 4 내지 8중량%정도이다. 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜에 도입된 의약화합물 잔기의 비율은, 예를 들어 광흡도 분석 등에 의해 용이하게 결정할 수 있다.

예를 들어, 의약화합물로서 특개평 6-87746호 공보의 청구항 2에 기재된 항종양제를 사용하는 경우, 이 의약화합물은 산성수성 매체 중(예를 들면 pH 3정도)에서는 락톤환을 형성한 화합물(폐환체)(closed ring)에 평형이 이동하고, 반면, 염기성 수성용체 중(예를 들면, pH 10정도)에서는 락톤환이 개환한화합물(개환체)(opened ring)에 평형이 이동한다는 것으로 알려져 있다. 이러한 폐환체 및 개환체에 대응하는 잔기를 도입한 DDS 화합물은 동등한 항종양 효과를 가지고 있으나, 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 상기 의약화합물을 결합시킨 스페이서(예를 들면 올리고 펩티드 스페이서)를 반응시키는 경우에 개환형의 반응종이 반응계에 존재하면, 락톤환에 유래하는 카르복실기와 스페이서 유래의 아미노기 사이에서 축합반응이 진행하고, 현저히 반응수율이 저하할 뿐 아니라, 목적으로 하는 DDS 화합물을 얻을 수 없는 경우가 있다. 이러한 부반응은 평형이 달성되지 않는 비수계에서 반응종으로 폐환체를 사용함에 따라 회피할 수 있다.

본 발명의 DDS 화합물은, 의약화합물 잔기의 종류(예를 들면, 항종양제 또는 항염증제 등의 의약화합물 잔기)에 따라서, 소망하는 의약활성을 종양부위와 염증부위 등의 국소에 특이하게 발현시킬 수 있고, 또한, 의약화합물 자체가 갖는 독성을 저감할 수 있는 특징을 갖는다. 또한, 본 발명의 DDS 화합물은 뛰어난 혈관투과성을 가지고 있다. 종양부위와 염증부위에서는 프로테아제(펩티다아제)가 발현되고 있기 때문에, 올리고 펩티드로 구성되는 스페이서를 갖는 DDS 화합물은 스페이서 부위에서 용이하게 가수분해되고, 유리한 의약화합물이 세포내에 이행해서 약효를 발휘하거나, 또는 표적세포의 당을 인식하는 수용체를 통하여 DDS 화합물이 세포내에 받아들여지고, 프로테아제에 의해 유리한 약물이 약효를 발휘한다.

또한, 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜은 생체내, 예를 들어 간장, 비장,또는 골수 등에서 이물 고분자로서 인식되는 정도가 낮다. 이 때문에, 이것들의 장기로의 이행성이 낮은 반면 당화합물의 종류에 따라 대응 당수용체가 풍부한 장기에는 고농도로 분포하는 특징이 있다. 예를 들어, 갈락토오스로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 갖는 본 발명의 DDS 화합물은 간에 대해서 뛰어난 지향성을 가지고 있다. 따라서, 의약화합물로서 항종양제를 결합한 DDS 화합물은 간암 치료에 유용하다.

본 발명의 DDS 화합물을 포함하는 의약은, 통상 동결건조품 등의 형태로 바이알 등에 사용할 수 있고, 용시용해형 주사용 또는 점적용 제제 등의 비경구 투여용 제제로서 임상에 제공되지만, 이러한 의약 제제형태는 상기 형태에 한정되는 것은 아니다. 상기 제제의 제조에는, 예를 들어 용해보조제, pH조절제, 안정화제 등 당업계에서 이용가능한 제제용 첨가물을 사용할 수 있고, 상기 제제는 의약 조성물로서 조제할 수 있다. 상기 의약의 투여량은 특별히 한정되지 않으나, 통상은 의약 화합물 잔기를 구성하는 의약화합물의 투여량, DDS 화합물 중에 도입된 의약화합물 잔기의 양, 환자의 상태와 질환의 종류 등을 감안해서 결정해야 한다. 예를 들어 특개평 6-87746호 공보의 청구항 2에 기재된 항종양제의 잔기가 약 6중량% 정도의 비율로 도입된 DDS 화합물을 투여할 경우에는, 비경구 투여일 때는 일반적으로 1일에 체표면적 1㎡에 대해서 0.1 내지 100㎎정도, 바람직하게는 약1 내지 30㎎의 범위에서 1회 투여하고, 3 내지 4주마다 투여를 반복하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명에 의해 펩티드 결합한 2 내지 8개의아미노산을 포함하는 스페이서를 고분자담체와 의약화합물 잔기가 결합한 DDS 화합물의 측정법에 있어서, 이 DDS 화합물을 펩티다아제로 처리하여 얻어지는 가수분해물을 측정하는 공정을 포함하는 방법이 제공된다.

본 명세서에 있어서 사용되는 「측정」이라는 용어는, 정량, 정성 등을 목적으로 하여 행해지는 측정을 포함하며, 가장 광의하게 해석할 필요가 있으나 바람직하게는 정량을 의미한다. 본 발명의 측정방법 대상이 되는 DDS 화합물은, 펩티드 결합한 2 내지 8개의 아미노산을 포함하는 스페이서를 통해서 고분자담체와 의약화합물 잔기가 결합한 화합물로, 어떠한 의미에서도 한정적으로 해석해서는 안 된다. 펩티드 결합한 2 내지 8개의 아미노산을 포함하는 스페이서로는, 펩티드 결합한 2 내지 8개의 아미노산만으로 이루어지는 스페이서 외에 펩티드 결합한 2 내지 8개의 아미노산으로 이루어지는 올리고 펩티드에 -NH-Y-CO-[이때, Y는 탄소수 1 내지 8개의 알킬렌기 또는 -C₆H₄-CH₂-O-(-C₆H₄-는 페닐렌기를 나타내며, 이 페닐렌기는 1 또는 2개 이상의 치환기를 가지고 있어도 되고, 바람직하게는 p-페닐렌기임)로 나타나는 기를 표시함]로 나타나는 연결기가 결합한 스페이서 등을 들 수 있다. 본 발명의 측정방법은, 예를 들어 혈액과 체액 등의 생체시료에 포함되는 DDS 화합물 자체의 농도를 측정하기 위해 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 DDS 화합물에 도입된 의약화합물 잔기의 도입량(예를 들어, DDS 화합물 전중량에 대한 의약화합물 잔기의 중량% 등)을 측정하기 위해 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 측정대상인 DDS 화합물에 포함되는 의약화합물 잔기의 의미는 상기에 설명한 것과 같으며, 의약화합물로서는 스페이서결합에 관여할 수 있는 1 또는 2 이상의 반응성 관능기(예를 들어, 아미노기, 카르복실기, 수산기, 티올기. 에스테르기 등)를 갖는 것이라면 어떠한 것을 사용해도 된다. 의약화합물 잔기는, 스페이서의 N말단 아미노기 혹은 C말단의 카르복실기, 또는 스페이서를 구성하는 아미노산에 존재하는 반응성 관능기에 결합해 있어도 된다.

의약화합물 잔기의 구체예는, 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 의약화합물 잔기가 스페이서를 통하여 결합한 상기 DDS 화합물에 대해서 설명한 대로이고, 바람직하게 사용할 수 있는 의약화합물 잔기도 이와 같다.

본 발명방법의 측정대상인 DDS 화합물에 포함되는 의약화합물 잔기의 의미는 스페이서를 통하여 고분자담체와 결합하지만, 바람직한 스페이서는 펩티드 결합한 2 내지 8개의 아미노산으로 이루어 지는 올리고 펩티드 잔기, 또는 펩티드 결합한 2 내지 8개의 아미노산으로 이루어 지는 올리고 펩티드에 -NH-Y'-CH₂-O-CO-(이때, Y'는 p-페닐렌기를 나타낸다)로 나타나는 연결기가 결합한 스페이서이고, 스페이서를 구성하는 아미노산의 종류, 스페이서의 결합방향, 아미노산 배열, 구체예 등은 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 의약화합물 잔기가 올리고 펩티드 스페이서를 통하여 결합한 상기 DDS 화합물에 대하여 설명한 것과 같다.

본 발명의 방법에 있어서, 측정대상인 DDS 화합물을 구성하는 고분자담체로는, 예를 들어 다당유도체 외에, 합성고분자 등을 사용할 수 있다. 다당유도체 및 합성고분자로는 생체에 대하여 실질적으로 독성을 나타내지 않고 약물담체로 작용할 수 있는 것이라면 어떠한 것을 사용해도 된다. 예를 들어, DDS 화합물 제조에 종전부터 사용되고 있는 다당유도체 및 합성고분자는 모두 고분자담체로 이용가능하다. 예를 들어 카르복실기를 갖는 다당유도체를 바람직하게 사용할 수 있고, 폴리알콜화 다당유도체를 특히 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 합성고분자로는 예를 들어 폴리에틸렌글리콜류; 폴리글루타민산, 폴리아스파라긴산, 혹은 폴리리신 등의 폴리아민산류; 또는, N-(2-히드록시프로필)메타아크릴아미드 유도체 등의 폴리비닐화합물 유도체를 들 수 있다.

보다 구체적으로, 카르복실기를 갖는 다당유도체로는 예를 들어 다당류 또는 그것들을 화학적 혹은 생물학적으로 수식한 유도체를 사용할 수 있고, 바람직하게는 분자 중에 카르복실기를 갖는 것을 사용할 수 있다. 분자 중에 카르복실기를 갖는 고분자담체의 예로는, 히알론산, 펙틴산, 아르긴산, 콘드로이친, 헤파린 등의 다당류 외에, 풀루란(pullulan), 덱스트란, 만난, 키틴, 이눌린, 레반, 크시란, 아라반(araban), 만노글루칸, 키토산 등의 다당 일부와 전부의 수산기에 대해서 카르복실기를 갖는 관능기를 도입한 것 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 수산기를 카르복시 C_1-4알킬화한 것과 수산기에 다염기산의 하나인 카르복실기를 에스테르결합시킨 것 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 상기의 다당류를 폴리알콜화한 후에, 카르복실기를 갖는 관능기를 도입한 것을 사용해도 된다.

카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 고분자담체로 사용한 DDS 화합물은 본 발명의 방법에 있어서 특히 바람직한 측정대상이다. 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 폴리알콜화도(polyalcoholation degree), 제조에 사용하는 덱스트란의 종류, 및 제조방법 등은 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 의약화합물 잔기가 스페이서를 통해서 결합한 상기 DDS 화합물에 대해서 설명한 것과 같다.

또한, 고분자담체로서 당화합물로 수식된 고분자담체를 사용한 DDS 화합물도 본 발명의 측정방법의 바람직한 대상이다. 예를 들어, 당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜 등을 고분자담체로서 바람직하게 사용할 수 있다. 고분자담체를 당화합물로 수식하는 방법과 당화합물의 종류 등은 당화합물로 수식된 상기 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜에 대해서 설명한 것과 같다.

본 발명의 측정방법의 대상은 이른바 집단(cluster) 수식에 적합한 링커를 사용하여 제조된 DDS 화합물(이른바, 집단 수식체)이어도 된다. 집단 수식의 개념은 당화합물로 수식된 상기 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜에 대하여 설명한 것과 같다.

본 발명의 방법은, 상기 DDS 화합물을 측정할 때 DDS 화합물에 펩티다아제를 작용시켜서 얻어지는 가수분해물을 측정하는 것을 특징으로 한다. 펩티다아제로는, DDS 화합물의 스페이서에 포함되는 올리고 펩티드 부분(2 내지 8개의 아미노산이 펩티드 결합한 올리고 펩티드 부분)을 가수분해할 수 있는 것이라면 그 종류는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 서브틸리신, α-키모트립신, 타입Ⅳ 콜라게나아제, 펩신, 서모리신, 파파인, 에라스타아제 등을 사용할 수 있으나, 이것들 중, α-키모트립신 또는 파파인이 바람직하다.

가수분해물의 종류는 특별히 한정되지 않으나, 자외선흡수 스펙트럼, 형광스펙트럼 등의 통상 분광학적 수법에 의해 검출가능한 것이 바람직하다. 통상은 가수분해물로서, 의약화합물자체 외에 스페이서의 일부가 잔존하여 의약화합물 잔기에 결합해 있는 화합물, 예를 들어 스페이서 유래의 1개의 아미노산이 결합한 의약화합물, 스페이서 유래의 2 내지 8개의 아미노산으로 이루어 지는 올리고 펩티드가 결합한 의약화합물, 또는 -NH-Y-CO-[이때, Y는 탄소수 1 내지 8개의 알킬렌기 또는 -C₆H₄-CH₂-O-(-C₆H₄-는 페닐렌기를 나타내고, 이 페닐렌기는 1 또는 2개 이상의 치환기를 가지고 있어도 되고, 바람직하게는 p-페닐렌기임)로 표현되는 기를 나타냄]로 표현되는 연결기를 통하여 스페이서 유래 1개의 아미노산 혹은 상기 올리고 펩티드가 결합한 의약화합물 등을 측정할 수 있다. 또한, 상기 가수분해물에 있어서는, 의약화합물의 반응성 관능기 일부 또는 전부가 가수분해 되어도 된다. DDS 화합물의 종류에 따라 적합한 펩티다아제를 선택함에 의해 소망하는 가수분해물을 측정하는 것이 가능해 진다.

측정을 위한 시료로는, DDS 화합물을 투여한 동물(사람을 포함)로부터 분리된 혈액, 림프액, 타액, 뇨, 변, 적출조직 등의 생체시료 외에, DDS 화합물의 수용액, 또는 실질적으로 효소반응을 저해하지 않는 수성 유기용매의 용액 등을 사용할 수 있다. 각종 펩티다아제에 대하여 바람직한 반응조건이 당업계에 알려져 있고, 당업자는 펩티다아제 종류에 따라 적합한 반응조건, 예를 들면 기질농도, pH, 완충액, 반응온도, 반응시간 등을 용이하게 선택할 수 있다. 통상은, 상기 시료를 필요에 따라 현탁화와 탈단백질 등의 전처리를 거친 후, DDS 화합물이 소망하는 기질농도가 되도록 희석한 반응액에 펩티다아제를 첨가하고, DDS 화합물이 완전히 가수분해될 때까지 반응을 계속하면 된다.

가수분해물을 측정하는 방법은 특별히 한정되어 있지 않으나, DDS 화합물의 정량, 또는 의약화합물 도입량의 정량을 행하는 경우에는 가수분해물의 성질에 따라, 자외선흡수 스펙트럼 측정, 형광 스펙트럼 측정 등 통상의 분광학적 수법을 단독으로 또는 조합하여 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 고속액체 크로마토그래피 등의 분리조작을 적절하게 조합하여 측정하여도 무방하다. 측정시에 미리 검량선 (calibration curve)을 작성하면, 정확하게 정량을 행할 수 있다. 또한, 본 명세서의 실시예에는 본 발명의 방법의 대표예가 구체적이고 상세하게 설명되어 있으므로, 당업자는 상기 일반적 설명 및 실시예의 구체적인 설명을 근거하여 필요에 따라 그것들의 적절히 개량하여, 본 발명방법을 용이하게 실시할 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1:

고분자담체인 카르복시 메틸덱스트란폴리알콜(이하, CM-Dex-PA 또는 CM덱스트란폴릴알콜 등의 약호를 사용하는 경우가 있음)과 항종양제(특개평 6-87746호 공보의 청구항 2에 기재된(1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-하이드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13 (9H,15H)-디온: 이하, 실시예에 있어서 DX-8951이라고 약함)가 -Gly-Gly-Phe-Gly- (올리고 펩티드는 N말단부터의 배열로서 나타내며 이하에서도 동일함)부터로 나타나는 테트라 펩티드 스페이서를 통하여 결합한 DDS 화합물(화합물 1)을, 국제공개 WO97/46260호의 실시예 15에 기재된 방법에 준하여 제조하였다. CM-Dex-PA로는, 평균분자량 228K, 카르복시메틸화도(구성당의 잔기당 카르복시메틸기의 치환도) 0.4인 것을 사용하였다.

증류수에 의해 400㎍/㎖로 제조한 상기 DDS 화합물 10㎕을 180㎕의 Britton Robinson 완충액(pH 6.0)에 첨가하고, 또한 증류수로 10㎎/㎖ 제조한 α-키모트립신용액을 10㎕을 첨가하였다. 반응액을 40℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 50%의 아세토니트릴을 함유한 0.5N HCl용액을 200㎕ 첨가하고, 유리한 가수분해물(스페이서 유래의 글리신이 DX-8951의 아미노기에 펩티드 결합한 화합물: 국제공개 WO97/46260호의 실시예 50에 기재된 화합물 이하, G-DX-8951이라고 약함)을 HPLC로써 정량하였다. HPLC측정은, Symmetry C18(4.6×100㎜; 3.5㎛, Waters사)컬럼을 사용하여, 유기용매(메탄올:아세토니트릴=1:2)를 36.5% 함유하는 0.1M초산나트륨 (pH 5.0)으로 용출을 행하고, 형광스펙트럼 측정(Ex.375nm 및 Em.445nm)에 의해 가수분해물을 검출하였다. 이 결과, 상기 DDS 화합물의 DX-8951 함유량은 용해시키고 실온에서 하룻밤 혼합하였다. 반응액을 농축하고 얻어진 잔사를 컬럼크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=20:1)로 정제하고,Boc-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-(CH₂)₄-CO- DX-8951을 110㎎ 얻었다. Boc-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-(CH₂)₄-CO-DX-8951(110㎎)을 TFA(2㎖)에 용해하고, 1시간 반응시킨 후, 반응액을 농축하고 얻어진 잔사에 에테르를 가하여 고형화시켰다. 상등액을 제거하고 고체를 건조하여 H-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-(CH₂)₄-CO -DX-8951의 트리플루오로초산염을 100㎎ 얻었다.

H-NMR(DMSO-d₆): δ 8.45-8.55(m,2H), 8.28-8.35(m,2H), 7.95-8.10(br,2H), 7.79(d,1H,J=10.7Hz), 7.70-7.75(m,1H), 7.32(s,1H), 7.20-7.30(m,5H), 7.15-7.25(m,4H), 6.50-6.60(br,1H), 5.50-5.60(m,1H), 5.40-5.50(m,2H), 5.18(s,2H), 4.50-4.60(m,1H), 3.55-3.95(n,7H), 3.00-3.25(m,5H), 2.75-2.85(m,1H), 2.50(s,3H), 2.15-2.25(m,4H), 1.86-2.00(m,2H), 1.55-1.65(m,2H), 1.45-1.55(m,2H), 0.88(t,3H,J=7.35Hz)

특개평 8-144421호 공보의 실시예 13에 기재된 방법에 준하여 제조한 평균분자량 337K, 카르복시에틸화도(구성당의 잔기당 카르복시메틸기의 치환도)0.4의 CM-Dex-PA(350㎎)을 물(10㎖)에 용해하였다. 이 용액에, H-Gly-Gly-Gly-Phe-NH- (CH₂)₄-CO-DX-8951의 트리플루오로초산염(50㎎)을 메탄올(10㎖)에 용해시킨 용액을 가하고, 또 HOBt(7㎎)을 메탄올(5㎖)에 용해시킨 용액을 가하였다. 반응액의 pH를7.0에 적정 하고 수용성카르보디이미드(10㎎)를 가하여 14시간 혼합하였다. 또한 수용성 카르보디이미드(10㎎)를 가하여 2시간 혼합한 후에, 수용성 카르보디이미드 (10㎎)를 가하여 2시간 혼합하였다. 반응액을 초순수 증류수로 희석하고 한외여과막(50K)을 사용하여 저분자를 제거하고, 동결건조하여 얻어진 분체를 3M 식염수에 용해 시키고, 에탄올에 적하하여 석출한 고체를 원심분리기를 사용하여 분리하였다. 상등액을 제거하고 고체를 다시 증류수에 용해하여 한외여과막(50K)으로 저분자 분획을 제거한 후, 0.22㎛의 필터를 통하여 동결건조하고 목적물 280㎎을 얻었다.

증류수로 2.63㎎/㎖ 제조한 상기 DDS 화합물 용액 10㎕에 Britton Robinson 완충액(pH 6)으로 2㎎/㎖ 제조한 α-키모트립신용액, 또는 Tris-HCl(pH 9)로 2㎎/㎖ 제조한 서브티리신A 용액을 490 ㎕첨가하였다. 이 반응액을 40℃에서 2시간 반응한 후, 50%의 아세토니트릴을 함유한 0.5N HCl 용액을 500㎕ 가하고, 유리된 가수분해물[NH₂-(CH₂)₄-CO-DX-8951]을 HPLC로 정량하였다. HPLC측정은 Symmetry C18 (4.6×100㎜;3.5㎛, Waters사)컬럼을 사용하여, 유기용매(메탄올:아세토니트릴 =1:2)를 32%함유하는 0.1% 트리플루오로초산 용액에서 용출하고, 형광스펙트럼측정 (Ex.375㎚ 및 Em.445㎚)에 의해 가수분해물을 검출하였다. 이 결과, NH₂-(CH₂)₄- CO-DX-8951은 약 4.8분에 용출되었다. NH₂-(CH₂)₄-CO-DX-8951을 검량선으로 사용하여 상기 DDS 화합물 중의 DX-8951 함유량을 산출한 바 3.2%로 산출되었다. 한편, DX-8951을 검량선으로 상기 DDS 화합물의 UV흡수로부터 DX-8951 함유량을 산출한경우에는 2.9%로 산출되었다.

실시예 3:

①서브티리신 A(0.1 M Tris-HCl pH 9.0), ②α-키모트립신(0.1 M Tris-HCl pH 8.0), ③서모리신(0.1 M Tris-HCl/1 mM CaCl₂pH 9.0)을 사용하여, 실시예 1에서 제조한 DDS 화합물(화합물1)의 DX-8951 함유량을 측정하였다. 각 효소용 완충액 180㎕에 400㎍/㎖ 제조한 화합물 1을 10㎕ 첨가하였다(최종농도: 20㎍/㎖). 이 혼합물에 각 완충액으로 100㎎/㎖ 제조한 각 효소를 10㎕ 첨가한 후(최종농도: 5㎎/㎖), 40℃에서 3시간 반응시켰다. 반응 후, 50% 아세토니트릴을 함유한 0.5N 인돌리진 용액을 200㎕ 첨가하고, 그 10㎕을 HPLC로 분석하였다. Symmetry C18(4.6×250㎜)컬럼을 사용, 유기용매(아세토니트릴:메탄올=2:1)을 31% 함유하는 0.1M AcONa 완충액 pH 5.0으로 용출하였다. 형광스펙트럼 측정(Ex.375㎚ 및 Em.445㎚)에 의해 가수분해물을 측정하고, G-DX-8951, DX-8951, 및 화합물 1의 스페이서 유래인 페닐알라닌글리신이 결합한 DX-8951(FG-DX-8951)을 각각 2n㏖/㎖함유하는 용액을 사용하여 작성한 검량선에 의해 효소반응용액 중 가수분해물을 정량하였다. 이 결과 서브티리신 A와 α-키모트립신은 상기 조건에 의해 각각 화합물 1로부터 G-DX-8951을 100% 유리되었다. 또한, 서모리신은 FG-DX-8951을 100% 유리되었다.

실시예 4:

복강내에 있어서 계대유지한 Meth A 세포(1×10⁶cells/mouse)를 BALB/c(♂)마우스의 복강내에 이식하고, 5일후에 화합물1(DX-8951 함유량: 5.2%)을 10 및 2.5㎎/㎏(DX-8951 환산량)으로 복강내 투여하였다. 투여 후 시간의 경과에 따라(2, 4, 8, 24, 및 48시간) 심채혈하고 10분 방치한 후, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 또한, 그 때의 암성복수(tumorous ascites)를 채취하였다. 혈청 및 암성복수 25㎕에 80% 메탄올수를 100㎕ 첨가한 후, 12,000rpm에서 5분간 원심분리하고 그 상등액의 25㎕에 0.1M Tris-HCl pH 8.5/0.1M CaCl₂를 사용하여 2㎎/㎖ 제조한 서모리신용액을 225㎕ 첨가하고, 50℃에서 1시간 반응시킨 후, 50% 아세토니트릴 함유 0.5N HCl를 250㎕ 첨가하고, 그 20㎕을 HPLC 분석하였다. 컬럼으로서 Symmetry C 18(4.6×100㎜)을 사용, 메탄올과 아세토니트릴 혼합액(1:2)을 41% 포함하는 0.1M AcONa(pH5)용액에서 용출하고, 형광스펙트럼 측정(Ex. 375㎚, Em.445㎚)에 의해 가수분해물을 검출하였다. 그 결과, 10㎎/㎏투여로 복수 중의 화합물 1의 농도는 시간의 경과와 함께 감소하지만, 혈중농도는 투여 후 점점 상승하여 24시간에 최대치가 되고, 그 후 복수농도와 거의 같은 정도의 추이다(도 1). 2.5㎎/㎏ 투여시의 복수 및 혈중농도의 추이는 10㎎/㎏인 경우와 같았다.

실시예 5:

복강내에 있어서 계대유지한 Meth A 세포(1×10⁶cells/mouse)을 BALB/c(♂)마우스의 복강내에 이식하고, 5일후에 화합물1(DX-8951 함유량: 5.2%)을 10 및 2.5㎎/㎏(DX-8951 환산량)으로 복강내 투여하였다(1군 3마리). 투여 후 시간의 경과에 따라(5분, 30분, 2, 4, 8, 24, 및 48시간)으로 심채혈하고 10분 방치한 후, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 또한, 그 때의 암성복수를 채취하였다. 혈청 및 암성복수 25㎕에 Britton Robinson 완충액(pH 6)을 사용하여 2㎎/㎖ 제조한 α-키모트립신용액을 225㎕ 첨가하고, 40℃에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 50%아세토니트릴 함유 0.5N HCl를 250㎕ 첨가하고, 12,000rpm에서 5분간 원심분리하여 그 상등액의 10㎕을 HPLC 분석하였다. HPLC분석으로 얻어진 G-DX-8951농도, 및 사용한 화합물1의 DX-8951 함유량으로부터 추정되는 화합물 1의 농도로 산출하였다. HPLC분석은 실시예 4의 조건에 따라 행하였다. 이 결과 10㎎/㎏투여로 복수 중의 화합물 1의 농도는 시간의 경과와 함께 감소하였다. 복수에서의 화합물 1의 농도는 투여 후 점점 상승하여 48시간에 혈중농도와 거의 같은 정도가 되었다 (도 2). 2.5㎎/㎏ 투여시의 복수 및 혈중농도의 추이는 10㎎/㎏인 경우와 같았다.

실시예 6:

당화합물로 수식된 고분자담체을 갖는 DDS 화합물을 이하와 같이 하여 제조하였다. 하기에 있어서, 당쇄의 구성단위로서 카르복시메틸기가 도입된 1개 또는 1개의 구성단위를 예시적으로 기재하지만, 실시예에 기재한 DDS 화합물의 카르복시 메틸폴리알콜 부분은, 상기 구성단위의 반복에 의해 구성되는 것은 아니다. 또한 카르복시 메틸폴리알콜의 카르복시메틸화도(구성당의 잔기당 카르복시메틸기의 치환도)는, 카르복시 메틸폴리알콜의 나트륨염을 유리산형으로 변환한 후, 0.1N 수산화나트륨 수용액에 용해하고,0.1N 염산으로 적정함에 의해 구하였다. 카르복시 메틸폴리알콜의 나트륨염 수용액을 카르복시 메틸폴리알콜의 나트륨염 수용액을 Bio-Rad AG50W-x2(H⁺)컬럼에 대해서 통과액을 동결건조하여 시료로 사용하였다. 이 시료를 소정 과잉량의 0.1N 수산화나트륨 수용액에 용해하고, 페놀프탈렌을 지시약으로 0.1N 염산으로 적정하였다. 시료의 채취량을 s(㎎), 0.1N 수산화나트륨 수용액의 소정 과잉량을 a(㎖), 0.1N염산의 적정량을 b(㎖)로 하고, 카르복시메틸화도를 13.4(a-b)/[s-5.8(a-b)]의 식에 의해 구하였다. 또한, 약물의 도입량(중량%)은 약물의 특성흡수를 이용한 흡광도 분석(362㎚부근)으로 구하였다. 또한, 겔여과법은 다음의 조건에 따라 행하였다(컬럼: TSK gel G4000 PW_XL, 용리액: 0.1M NaCl, 유속: 0.8㎖/min, 컬럼온도: 40℃).

(A) 화합물 2-2의 합성

화합물 2-1(5.0g)과 2-[2-(2-클로로에톡시)에톡시]에탄올(3.75㎖)을 디클로로메탄(75㎖)에 용해시키고, 3플로오로화 붕소 에테르착체(7.7g)를 가하여 5시간 혼합하였다. 반응액을 디클로로메탄(100㎖)으로 희석하여, 유기층을 물, 포화탄산수소나트륨 수용액, 식염수로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조하여 황산마그네슘을 여과한 후, 용매를 증발시키고 얻어진 잔사를 실리카겔을 이용한 컬럼 크로마토그래피(헥산:초산에테르 2:1)로 정제하여, 염화물 3.3g 얻었다. 얻어진 염화물 (3.3g)와 NaN₃(2.0g)를 DMF(15㎖) 중에서 60℃로 2일간 혼합하였다. 용매를 증발시키고 초산에테르와 물의 혼합액에 용해시키고, 유기층을 물로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조하고, 황산마그네슘을 여과하고, 용매를 증발시켜 아지드체를 2.8g 얻었다.

얻어진 아지드체(1.5g)를 메탄올(30㎖)에 용해시키고, 용액의 pH가 10이 될 때까지 28% MeONa 함유 메탄올 용액을 가하여 1시간 혼합하였다. 반응액에 Dowex 50WX8(H+)을 용액의 액성이 중성이 될 때까지 가하여 수지를 여과하고 용매를 증발시켰다. 얻어진 잔사를 메탄올(50㎖)과 물(10㎖)의 혼합액에 용해시키고 5%Pd-C(50%함수)(2.0g)를 가하여 수소상압 하에서 하룻밤 혼합하였다. 촉매를 여과하고, 용매를 증발시켜 화합물 2-2를 1.2g 얻었다.

¹H-NMR(DMSO-d₆):δ4.20-4.30(1H,br), 4.00-4.10(1H,br), 3.80-3.85(1H,br), 3.50-3.75(14H,m),2.75-2.90(2H,m)

(B) 갈락토오스 수식 CM덱스트란폴리알콜의 합성

덱스트란 4(후나코시 사, 평균분자량 4000-6000)(20g)의 0.1M 초산 완충액(pH 5.5)(2000㎖)에 과요오드산나트륨(66.0g) 수용액(2000㎖)을 가하였다. 차광하고 4℃에서 10일간 혼합한 후, 에틸렌글리콜(14.0㎖)을 가하여 하룻밤 혼합하였다. 반응액을 빙냉하에서 8M 수산화나트륨 수용액을 사용하여 pH를 7.5에 적정한 후, 수산화요오드나트륨(28g)을 가하였다. 용해 후, 실온에서 하룻밤 혼합하였다. 빙냉하여 초산으로 pH 5.5로 적정하고, 4℃에서 1시간 혼합하였다. 빙냉하에서 8M 수산화나트륨 수용액을 사용하여 pH를 7.5로 적정하였다. 이상의 과정을 2회 반복하고 얻어진 두 개의 수용액을 하나로 합치고, 바이오맥스-3막(밀리포어사제)을 사용한 한외여과법에 의한 저분자 분획 제거를 실행하여 잔류용액을 얻었다. 이 잔류용액을 바이오맥스-30막을 통과시켰다. 통과한 용액을 바이오맥스 -3막을 사용한 한외여과법에 의해 탈염한 후, 동결건조하여 정제 덱스트란폴리알콜(12.0g)을 얻었다. 이 물질의 분자량(겔여과, 플루란표준)은 9K이었다.

수산화나트륨(39.3g)을 물(282㎖)에 용해시켜서 얻어지는 수용액에 상기의 정제덱스트란폴리알콜(9.4g)을 가하여, 실온에서 용해시켰다. 이 용액에 빙냉하에서 모노염화 초산(56.4g)을 가하여 용해시킨 후, 실온에서 20시간 반응시켰다. 이 반응액을 초산으로 pH 8에 적정한 후, 바이오맥스-5막을 사용한 한외여과법에 의한 저분자 분획 제거를 행하였다. 잔류용액을 동결건조하여 카르복시메틸(이하, CM이라고 약함)덱스트란폴리알콜의 나트륨염(12g)을 얻었다. 얻어진 CM덱스트란폴리알콜의 나트륨염(4.0g)을, 수산화나트륨(17g)을 물(120㎖)에 용해시켜서 얻어지는 수용액에 가하여 실온에서 용해시켰다. 이 용액에 빙냉하에서 모노염화초산 (24g)을 가하여 용해시킨 후, 실온에서 20시간 반응시켰다.

이 반응액을 초산으로 pH 8로 적정한 후, 바이오맥스-5막을 사용한 한외여과법에 의한 저분자 분획의 제거를 행하였다. 잔류용액을 동결 건조하여 CM덱스트란폴리알콜의 나트륨염(4.0g)을 얻었다. 이 물질의 분자량(겔여과. 플루란표준)은14K이고, 당잔기당 CM화도는 알카리적정에서 0.7이었다. 얻어진 CM덱스트란폴리알콜의 나트륨염(1.0g)을 물(100㎖)에 용해하고, 실시예 1 화합물2-2(800㎖)의 메탄올(100㎖)용액을 가한다. 또한, 수용성 카르복시아미드 염산염(240㎎)을 2시간 간격으로 3회 첨가하고, 총 6시간 혼합한다. 반응액 중의 용매를 증발시키고 얻어진 유상물을 물에 용해하고, 바이오맥스-3을 사용한 한외여과법에 의해 탈염하였다. 얻어진 수용액을 동결 건조하여 표기 화합물을 1.1g 얻었다. 본 화합물 중의 갈락토오스 함유량을 페놀황산법에 의해 정량한 결과, 당 10잔기당 1.0 비율이었다.

(C) 갈락토오스 수식 CM덱스트란폴리알콜 -Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951의 합성

상기(B)에서 얻어진 갈락토오스 수식 CM덱스트란폴리알콜의 나트륨염(1.0g)을 물(30㎖)에 용해시키고, Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951의 트리플루오로 초산염(150㎎)과 1-히드록시벤조트리아졸(35㎎)의 메탄올용액(40㎖)을 가하였다. 용액의 pH를 7.0으로 하고, 수용성 카르복시아미드 염산염(35㎎)을 2시간마다 3회 가한 후,하룻밤 혼합하였다. 반응액 중의 용매을 증발시키고 얻어진 잔사를 3M 염화 나트륨 수용액(20㎖)에 용해시키고, 에탄올(100㎖)에 적하하여 석출한 침전을 원심분리 (3500rpm, 8분)에 의해 모았다. 이 침전을 물에 용해시키고, 바이오맥스-3막을 사용한 한외여과법에 의해 탈염하였다. 막을 투과하지 않은 잔류용액을 밀리포어필터(2.22㎛)로 여과한 후 동결 건조하여 표제화합물을 900㎎을 얻었다. 본 화합물을 0.1M 염화나트륨 수용액에 용해시킨 후, GPC(컬럼: TOSOH TSK Gel PW-4000XL, 용매:0.1M NaCl 수용액, 유속:0.8㎖/min)으로 분석한 결과, 및 본 화합물의 자외선흡수 스펙트럼(pH 9.0, 0.1M 트리스 완충액 중)을 각각 도 3 및 도 4에 나타낸다. 본 화합물 중의 DX-8951함유량을 30% 아세토니트릴을 포함하는 0.1M 트리스 완충액 (pH 10.0) 중에서 366㎚에 있어서의 흡광도에 근거하여 정량한 바, 4.9%(w/w)이었다.

(D) CM덱스트란폴리알콜 -Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951의 합성

상기 (B)에서 얻어진 CM덱스트란폴리알콜의 나트륨염(2.0g)을 물에 용해시키고, Dowex-50WX8(Et₃NH⁺)을 통하여 CM덱스트란폴리알콜의 트리에틸암모늄염(1.9g)을 얻었다. 얻어진 CM덱스트란폴리알콜의 트리에틸암모늄염(1.9g)을 50% N,N-디메틸포름아미드를 포함하는 수용액에 용해하고, 이 용액에 트리에틸아민(0.112㎖)과 -Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951의 트리플루오로 초산염(350㎎)을 포함하는 N,N-디메틸포름아미드(10㎖)용액, 1-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디히드록시퀴놀린(1.9g)을 차례로 가하여 실온에서 하룻밤 혼합하면서 반응시켰다. 반응액 중의 용매를 증발시키고, 얻어진 잔사를 3M 염화나트륨 수용액(20㎖)에 용해시키고, 에탄올(100㎖)에 적하하고, 석출한 침전을 원심분리(3500rpm)에 의해 모았다. 이 침전을 물에 용해시키고, 바이오맥스-3막을 사용한 한외여과법에 의해 탈염하였다. 막을 투과하지 않은 잔류용액을 밀리포어필터(0.22㎛)로 여과한 후 동결 건조하여 표기 화합물을 1.4g 얻었다. 본 화합물을 0.1M 염화나트륨 수용액에 용해한 후, GPC(컬럼: TOSOH -TSK Gel PW-4000XL, 용매: 0.1M NaCl 수용액, 유속:0.8㎖/min)로 분석한 결과, 및 본 화합물의 자외선흡수 스펙트럼(pH 9.0, 0.1M 트리스 완충액 중)을 각각 도 6 및 도 9에 나타내었다. 본 화합물 중의 DX-8951함량을 30% 아세토니트릴을 포함하는 0.1M 트리스 완충액(pH 10.0) 중에서의 366㎚에 있어서의 흡광도에 근거하여 정량한 바, 5.2%(w/w)이었다.

(E) DDS 화합물의 측정

상기 (C)에서 얻어진 갈락토오스 수식의 DDS 화합물 및 대조로서 상기 (D)의DDS 화합물을 주사용 증류수로 용해하고, DX-8951로 환산한 농도가 0.5㎎/㎖가 되도록 제조하였다. 이 DDS 화합물 수용액들을 C57BL/6 마우스에 1군 5마리로 꼬리 정맥내에 투여하였다. 투여량은 DX-8951 환산하여 5㎎/㎏으로 하였다. 투여 후, 시간의 경과에 따라(0.5, 1, 2, 4 및 24시간)으로 간을 채취하고, 이것들의 DDS 화합물량을 구하였다. 얻어진 간의 중량에 대해 물을 5배 가량 첨가하여 현탁하여 3000rpm에서 10분간 원심분리하고 또한 상등액을 15,000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 얻어진 상등액의 50㎕에 pH 6의 Britton-Robinson Buffer(B. R. B)에 의해 2㎎/㎖ 조제한 α-키모트립신 용액 450㎕을 첨가하여 40℃에서 2시간 반응 후, 50% 아세토니트릴 함유 0.5 N HCl용액을 500㎕ 첨가하여, 12,000rpm에서 5분간 원심분리하고 그 상등액의 20㎕을 HPLC 분석하고, 유리한 G-DX8951를 정량하는 것으로 DDS 화합물을 구하였다. 이 때, 투여에 사용한 각 DDS 화합물 수용액을 증류수에 의해 50, 10, 2㎕/㎖으로 조제하고 각각 50㎕를 상술한 방법에 의해 효소처리하여 G-DX89451을 정량한 것을 검량선(calibration curve)이라 한다.

HPLC 분석조건

컬럼: Symmetry C18(4.6×100㎜)

유속: 1.0㎖/min

컬럼 온도: 40℃

검출파장(형광): Ex.375㎚, Em.445㎚

용출액: 메탄올:아세토니트릴=1:2(29%) 0.1TFA(71%)

결과를 도 5에 나타내었다. 상기 갈락토오스 수식 DDS 화합물은 대상의 DDS 화합물(상기(D))에 비하여 높은 간 집적성(liver accumulation)을 나타내었다.

실시예 7: 갈락토오스 수식 CM덱스트란폴리알콜 -Gly-Gly-Phe-Gly- DX-8951의 합성

덱스트란 T500(파마시아 사제, 분자량 500K)(50g)의 0.1M초산 완충액(pH 5.5)(5000㎖)에 과요오드산 나트륨(165.0g) 수용액(5000㎖)을 가하였다. 차광하여 4℃에서 10일간 혼합한 후, 에틸렌글리콜(35.0㎖)을 가하고, 하룻밤 혼합하였다. 반응액을 빙냉하에서 8M 수산화나트륨 수용액을 사용하여 pH 6.5로 적정하고, 수산화요오드나트륨(70g)을 물(2000㎖)에 현탁시킨 용액을 가하였다. 용해 후, 실온에서 하룻밤 혼합하였다. 빙냉하고 초산에서 pH 5.5로 적정하여 4℃에서 1시간 혼합하였다. 빙냉하에서 8M 수산화나트륨 수용액을 사용하여 pH를 7.5로 적정하였다. 얻어진 수용액을 바이오맥스-50막을 사용한 한외여과법에 의한 저분자 분획 (fraction)을 제거하여 잔류용액을 얻었다. 이 잔류용액을 한외여과막(1000K, 필트론 사제)을 통과시키고 통과한 용액을 바이오맥스-50막을 사용한 한외여과법에 의해 탈염한 후, 동결 건조하여 덱스트란폴리알콜(21.1g)을 얻었다. 이 물질의 분자량(겔여과, 플루란표준)은 128K이다.

수산화나트륨(13.84g)을 물(150㎖)에 용해시키고 얻어지는 수용액에 상기에서 얻은 덱스트란폴리알콜(5g)을 가하고, 실온에서 용해시켰다. 이 용액에 빙냉하에서 모노염화초산의 나트륨염(61.6g)을 가하여 용해시킨 후, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 이 반응액의 pH를 8.5로 적정한 후, 바이오맥스-50막을 사용한 한외여과법에 의한 저분자 분획을 제거하였다. 고분자 분획을 동결건조하고 CM덱스트란폴리알콜의 나트륨염(6.2g)을 얻었다. 이 물질의 분자량(겔여과, 플루란표준)은 428K이고, 당잔기당 CM화도는 알칼리 적정에서 0.9이다. 얻어진 CM덱스트란폴리알콜의 나트륨염(500㎎)을 물(50㎖)에 용해하고, 실시예 1의 화합물 2-2(400㎎)의 메탄올(20㎖)용액과 1-히드록시벤조트리아졸(160㎎)의 메탄올(20㎖)용액을 가하였다. 또한, 수용성 카르복시아미드 염산염(120㎎)을 2시간 간격으로 3회 첨가하고, 총 6시간 혼합하였다. 반응액 중의 용매를 증발시키고 얻어진 유상물을 물에 용해하고, 바이오맥스-50막을 사용한 한외여과법에 의한 저분자 분획을 제거하였다. 잔류용액을 동결 건조하여 목적물을 600㎎ 얻었다. 본 화합물 중의 갈락토오스 함량을 페놀황산법에 의해 정량한 결과, 당 10잔기당 1.7비율이었다.

얻어진 갈락토오스 수식 CM덱스트란폴리알콜의 나트륨염(200㎎)을 물(3㎖)에 용해시키고, Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951의 트리플루오로 초산염(27㎎)의 메탄올용액 (3㎖)과 1-히드록시벤조트리아졸(7㎎)의 메탄올 용액(3㎖)을 가하였다. 용액의 pH를 7.0으로 하고, 수용성카르복시 아미드 염산염(7㎎)을 2시간 간격으로 3회 가한 후, 하룻밤 혼합하였다. 반응액 중의 용매를 증발시키고, 얻어진 잔사를 3M 염화나트륨 수용액(10㎖)에 용해시키고, 에탄올(100㎖)에 적하하여 석출한 침전을 원심분리(3500rpm)에 의해 모은 후 이 침전을 물에 용해시키고, 바이오맥스-50막을 사용한 한외여과법에 의해 탈염하였다. 막을 투과하지 않은 잔류용액을 밀리포어필터 (0.22㎛)로 여과한 후, 동결 건조하여 표제화합물을 180㎎ 얻었다. 본 화합물을 0.1M 염화나트륨 수용액에 용해 후, GPC(컬럼: TOSOH -TSK Gel PW-4000XL, 용매:0.1M NaCl 수용액, 유속: 0.8㎖/min)으로 분석한 결과, 및 본 화합물의 자외선흡수 스펙트럼(pH 9.0, 0.1M 트리스 완충액 중)을 각각 도 7 및 도 10에 나타내었다. 본 화합물 중의 DX-8951함량을 30% 아세토니트릴을 포함하는 0.1M 트리스 완충액 (pH 10.0) 중에서 366㎚에 있어서의 흡광도를 근거로 정량한 바, 3.7%(w/w)이었다.

실시예 8: 2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸-β-D-2-아미노-2-디옥시갈락토오스의 합성

특개평 5-202085호 공보에 기재된 방법에 의해 합성한 2-[2-(2-아미노에톡시) 에톡시]에틸-β-D-2-아세틸아미노-2-디옥시-3,4,6-트리스아세틸갈락토오스(2.64g)를 메탄올(10㎖)에 용해한 후, 용액을 빙냉하였다. 이 용액에 나트륨메톡시드(sodium methoxide) 28% 메탄올 용액(0.64㎖)을 가하고, 그대로 빙냉하에서 5시간 혼합하였다. 반응액에 초산(0.186㎖)을 가한 후, 감압건조하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(용출액: 디클로로메탄:메탄올=9:1용액)로 정제하고 2-[2-(2 -아미노에톡시)에톡시]에틸-β-D-2-아미노-2-디옥시갈락토오스 (1.98g)를 얻었다.

¹H-NMR(CD₃OD)δ:4.44(d,1H,J=8.8Hz), 3.94-3.98(m,1H), 3.92(dd,1H,J=8.8,10.7Hz), 3.83(d,1H,J=2.9Hz), 3.62-3.79(m,11H), 3.58(dd,1H,J=3.4,10.7Hz), 3.49(dd,1H,J=5.9, 6.3Hz), 3.39(t,2H,J=4.9Hz),1.99(s,3H)

상기의 2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸-β-D-2-아미노-2-디옥시갈락토오스(640㎎)를 에탄올(10㎖)에 용해한 용액에 린들라(Lindlar) 촉매(430㎎)를 가하고 상압수소 하에서 1.5시간 접촉환원하였다. 다시 린들라(Lindlar) 촉매(215㎎)를 가하고, 상압수소 하에서 3.5시간 접촉환원하였다. 촉매를 여과한 후, 여액을 감압건조하여 2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸-β-D-2-아미노-2-디옥시갈락토오스 (601㎎)를 얻었다.

¹H-NMR(CD₃OD)δ:4.32(d,1H,J=7.5Hz), 3.80-3.91(m,2H), 3.30-3.75(m,14H), 2.73(t,2H,J=6.5Hz), 1.98(s,3H)

실시예 9: N-아세틸갈락토사민 수식 CM덱스트란폴리알콜 -Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951의 합성

실시예 7에서 얻어진 CM덱스트란폴리알콜의 나트륨염(375㎎)을 물(10㎖)에 용해하고, 실시예 8에서 얻어진 2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸-β-D-2-아미노 -2-디옥시갈락토오스(300㎎)을 메탄올(10㎖)에 용해한 용액과, 1-히드록시벤조트리아졸(120㎎)을 메탄올(10㎖)에 용해한 용액을 가한다. 용액의 pH를 7.0으로 한 후, 수용성카르복시아미드 염산염(90㎎)을 2시간 간격으로 3회 첨가한다. 하룻밤 혼합한 후, 반응액에서 바이오맥스-50막을 사용한 한외여과법에 의해 저분자 분획을 제거하였다. 막을 통과하지 않은 잔류용액을 동결건조하고, N-아세틸갈락토사민 수식 CM덱스트란폴리알콜(443㎎)을 얻었다. 본 화합물의 N-아세틸갈락토사민 함량을 엘손-모르간(Elson-Morgan)법으로 정량한 결과, 당 10잔기당 1.6 비율이었다.

얻어진 N-아세틸갈락토사민 수식 CM덱스트란폴리알콜(200㎎)을 물(10㎖)에 용해하고, Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951의 트리플루오로 초산염(30㎎)을 메탄올(10㎖)에 용해한 용액, 1-히드록시벤조트리아졸(30㎎)을 메탄올(10㎖)에 용해한 용액을가하였다. 용액의 pH를 7.0으로 한 후, 수용성카르복시아미드 염산염(10㎎)을 2시간 간격으로 3회 첨가하였다. 2시간 혼합한 후 pH를 8.5로 적정하였다. 반응액에서 바이오맥스-50막을 사용한 한외여과법에 의해 저분자 분획을 제거하였다. 막을 통과하지 않은 잔류용액을 밀리포어필터(0.22㎛)로 여과한 후, 동결 건조하여 표기 화합물(203㎎)을 얻었다. 본 화합물을 0.1M 염화나트륨 수용액에 용해 후, GPC(컬럼: TOSOH -TSK Gel PW-6000XL, 용매: 20% 아세토니트릴 함유 0.1M 초산완충액(pH 5.0), 유속: 0.8㎖/min)로 분석한 결과, 및 본 화합물의 자외선흡수 스펙트럼(0.1M 트리스 완충액(pH 10.0):아세토니트릴=7.3 중, 0.16㎎/㎖)을 각각 도 8 및 도 11에 나타내었다. 본 화합물의 의약화합물 잔기의 함량을 0.1M 트리스 완충액(pH 10.0):아세토니트릴=7:3중에서 366㎚에 있어서 흡광도에 근거하여 정량한바, 4.6% (w/w)이었다.

실시예 10: CM-DeX-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-Y'-CH₂-O-CO-DX-8951 중의 DX-8951 함유량 측정

증류수로 1㎎/㎖ 제조한 CM-DeX-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-Y'-CH₂-O-CO-DX-8951 (Y'는 p-페닐렌기를 나타냄)의 용액 5㎕에 Britton Robinson 완충액(pH 6)으로 2㎎/㎖ 제조한 파파인용액을 95㎕ 첨가하였다. 이 반응액을 40℃에서 4시간 반응시킨 후, 50%의 아세토니트릴을 함유한 0.5N HCl용액을 100㎕ 가하고, 유리된 가수분해물[DX-8951]을 HPLC로 정량하였다. HPLC측정은 Symmetry C18(4.6×100㎜; 3.5㎛, Waters사)컬럼을 사용, 유기용매(메탄올:아세토니트릴=1:2)가 12분간 20%에서 70%가 되도록 0.1% 트리플루오로 초산염 용액으로 용출하고, 형광스펙트럼 측정 (Ex.375㎚ 및 Em.445㎚)에 의해 가수분해물을 검출하였다. 이 결과, DX-8951는 약 5.7분에 용출되었다. DX-8951을 검량선으로 사용하여 상기 DDS 화합물 중의 DX-8951 함유량을 산출한 바, 4.0%로 산출되었다. 반면, DX-8951을 검량선으로 상기 DDS 화합물의 UV흡수로부터 DX-8951함유량을 산출한 경우에는 3.3%로 산출되었다.

실시예 11: CM-Dex-PA-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-Y'-CH₂-0-C0-DX-8951 중의 DX-8951 함유량 측정

증류수로 1㎎/㎖ 제조한 CM-Dex-PA-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-Y'-CH₂-0-C0-DX-8951 용액 5㎕에 Britton Robinson 완충액(pH 6)으로 2㎎/㎖ 제조한 α-키모트립신 용액을 95㎕ 첨가하였다. 이 반응액을 40℃에서 4시간 반응시킨 후, 50% 아세토니트릴을 포함하는 0.5N HCl용액을 100㎕ 가하고, 유리한 가수분해물[DX-8951]을 HPLC로 정량하였다. HPLC측정은 Symmetry C18(4.6×100㎜; 3.5㎛, Waters사) 컬럼을 사용하여, 유기용매(메탄올:아세토니트릴=1:2)가 12분 동안에 20%에서 70%가 되는 0.1% 트리플루오로 초산 용액으로 용출하고, 형광 스펙트럼 측정(Ex.375㎚ 및 Em.445㎚)에 의해 가수분해물을 검출하였다. 이 결과, DX-8951은 약 5.7분에 용출되었다. DX-8951을 검량선으로 사용하여 상기 DDS 화합물 중의 DX-8951함유량을 산출한 바, 2.5%로 산출되었다.

한편, DX-8951을 검량선으로 상기 DDS 화합물의 UV흡수로부터 DX-8951함유량을 산출한 경우에는 1.7%로 산출되었다.

실시예 12: CM-Dex-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH₂)₄-CO-DX-8951 중의 DX-8951 함유량 측정

증류수로 100㎍/㎖ 제조한 CM-Dex-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH₂)₄-CO-DX-8951용액 5㎕에 Britton Robinson 완충액(pH 6)으로 2㎎/㎖ 제조한 파파인용액을 95㎕ 첨가하였다. 이 반응액을 40℃에서 4시간 반응시킨 후, 50% 아세토니트릴을 함유한 0.5N HCl용액을 100㎕ 가하고, 유리한 가수분해물[NH₂-(CH₂)₄-CO-DX-8951]을 HPLC로 정량하였다. HPLC측정은 Symmetry C18(4.6×100㎜; 3.5㎛, Waters사) 컬럼을 사용, 유기용매(메탄올:아세토니트릴=1:2)를 32% 함유하는 0.1% 트리플루오로 초산 용액으로 용출을 행하고, 형광 스펙트럼 측정(Ex.375㎚ 및 Em.445㎚)에 의해 가수분해물을 검출하였다. 이 결과, DX-8951은 약 5.3분에 용출되었다. NH₂-(CH₂)₄-CO-DX-8951을 검량선으로 사용하여 상기 DDS 화합물 중의 DX-8951함유량을 산출한 바, 3.0%로 산출되었다.

한편, DX-8951을 검량선으로 상기 DDS 화합물의 UV흡수로부터 DX-8951 함유량을 산출한 경우에는 3.1%로 산출되었다.

실시예 13: CM-Dex-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-DXR(DXR: 독소루비신) 중의 DXR 함유량 측정

증류수로 1㎎/㎖ 제조한 DDS 화합물 용액 10㎕에 Britton Robinson 완충액 (pH 6)으로 2㎎/㎖ 제조한 파파인 용액을 190㎕ 첨가하였다. 이 반응액을 40℃에서 2시간 반응시킨 후, 아세토니트릴을 200㎕ 가하고, 유리한 가수분해물[DXR]을 HPLC로 정량하였다. HPLC측정은, Symmetry C18(4.6×100㎜; 3.5㎛, Waters사) 컬럼크로마토그래피를 이용하여 유기용매(메탄올: 아세토니트릴=1:2)를 34% 함유하는 0.1%트리플루오로 초산 용액으로 용출하고, 형광스펙트럼 측정(Ex.480㎚ 및 Em.590㎚)에 의해 가수분해물을 검출한 결과 DXR은 약 3.8분에 용출되었다. DXR을 검량선으로 사용하여 상기 DDS 화합물 중의 DXR함유량을 산출한 바, 5.3%로 산출되었 다. 한편, DXR을 검량선으로 상기 DDS 화합물의 UV흡수로부터 DXR함유량을 산출한 경우에는 4.3%로 산출되었다.

실시예 14:CM덱스트란폴리알콜 -Gly-Gly-Phe-Gly-DXR 합성

WO97/46260의 실시예 24에 기재된 방법에 준하여 제조한 평균 분자량 274K,카르복시메틸화도(구성당의 잔기당 카르복시메틸기의 치환도) 0.4의 카르복시 메틸덱드스트란폴리알콜의 나트륨염(30㎎)을 50% 메탄올을 함유한 0.05M 콜리딘 (collidine)-HCl 완충액(2㎖)에 용해시켰다. 이 용액에 WO97/46260의 실시예 43에 기재된 방법에 준하여 합성한 Gly-Gly-Phe-Gly-DXR 염산염(4㎎)을 포함하는 메탄올 용액(400㎕), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(2.4㎎)을 포함하는 메탄올 용액(240㎕)을 가하고, 2시간 혼합하였다. 여기에 3M 식염수 30㎖을 가하고, 바이오맥스-50K막을 사용한 한외여과법에 의해 탈염하였다. 막을 통과하지 않은 잔류용액을 밀리포어필터(0.22㎛)로 여과한 후, 동결건조하여 표제화합물 (25㎎)을 얻었다. 본 화합물의 의약화합물 잔기 함유는, PBS(pH 7.4) 중에서 480㎚에 있어서 흡광도에 근거하여 정량한 바, 4.3%(w/w)이었다.

실시예 15: CM-Dex-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH₂)₄-CO-DX-8951의 합성

Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-OH(575㎎), HOSu(182㎎)과 DCC(326㎎)를 DMF(20㎖)에 용해하고, 30분간 혼합하였다. 여기에 5-아미노펜타논산벤질에스테르의 토실산염 (500㎎)과 트리에틸아민(0.184㎖)을 DMF(10㎖)에 용해시킨 용액을 가하여 실온에서 3일간 혼합하였다. 반응액을 농축하고 잔사를 컬럼크로마토그래피 (CH₂Cl₂:MeOH=20:1)로 정제하고, Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH₂)₄-COOBzl을 560㎎ 얻었다. Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH₂)₄-COOBzl(560㎎)을 50% 함수 메탄올(60㎖)에용해시키고, 5% Pd-C(50% 함수)(1.5g)을 가하고, 수소상압 하에서 하룻밤 혼합하였다. 반응액 중의 촉매를 여과하고, 농축건조하여 Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH₂)₄-COOH를 300㎎ 얻었다.

Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH₂)₄-COOH(300㎎)와 DCC(138㎎)와 HOSu(77㎎)를 DMF에 용해시키고 30분간 혼합하였다. 여기에 DX-8951(317㎎)과 트리에틸아민 (0.078㎖)을 DMF에 용해시킨 용액을 가하여 실온에서 하룻밤 혼합하였다. 반응액을 농축하여 얻어진 잔사를 컬럼크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=10:1)로 정제하고, Boc-Gly- Gly-Phe-Gly-NH-(CH₂)₄-CO-DX-8951을 400㎎ 얻었다.

Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH₂)₄-CO-DX-8951(300㎎)을 TFA(2㎖)에 용해시키고 1시간 반응시킨 후 반응액을 농축한다. 얻어진 잔사에 에테르를 가하여 고형화시키고 상등액을 제거하고 고체를 건조하여, H-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH₂)₄-CO-DX-8951의 트리플루오로 초산염을 250㎎ 얻었다.

¹H-NMR(DMSO-d₆):δ 8.45-8.55(m,2H), 8.28-8.35(m,2H), 7.95-8.10(br,2H), 7.79(d,1H,J=10.7Hz), 7.70-7.75(m,1H), 7.32(s,1H), 7.20-7.30(m,5H), 7.15-7.25(m,4H), 6.50-6.60(br,1H), 5.50-5.60(m,1H), 5.40-5.50(m,2H), 5.18(s,2H), 4.50-4.60(m,1H), 3.55-3.95(m,7H), 3.00-3.25(m,5H), 2.75-2.85(m,1H), 2.50(s,3H), 2.15-2.25(m,4H), 1.86-2.00(m,2H),1.55-1.65(m,2H), 1.45-1.55(m,2H), 0.88(t,3H,J=7.35Hz)

WO97/46260의 실시예 24에 기재된 방법에 준하여 제조한 평균분자량 337K, 카르복시메틸화도(구성당 잔기당 카르복시메틸기의 치환도) 0.4 카르복시 메틸덱스트란폴리알콜의 트리에틸암모늄염(200㎎)을 DMF(10㎖)에 용해시킨다. 여기에 H-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH₂)₄-CO-DX-8951의 트리플루오로 초산염(30㎎), 트리에틸아민(10㎕)을 포함하는 메탄올(4㎖) 용액을 가하고, 또한 1-에톡시카르보닐-2-에톡시 -1,2-디히드록시퀴놀린(200㎎)을 포함하는 메탄올(3㎖) 용액을 가하고 차광하, 실온에서 하룻밤 혼합하였다. 반응액을 3M 식염수로 희석하고, 한외여과막 (50K)으로 저분자 분획을 제거하고, 0.22㎛의 필터를 통하여 동결건조하여 목적물을 178㎎얻었다.

당화합물로 수식한 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 고분자담체로서 사용한 본 발명의 DDS 화합물은, 극히 장기지향성이 높고 뛰어난 치료효과를 발휘할 수 있는 의약으로서 유용하다. 또한, 본 발명의 DDS 화합물의 측정방법은, DDS 화합물의 혈중농도와 DDS 화합물에 도입된 의약화합물 잔기의 함유량을 정확하고 간편하게 정량할 수 있으므로, DDS 화합물의 임상 적용에 있어서 극히 유용한 방법으로 이용할 수 있다.

Claims

당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 이 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜에 결합한 의약화합물 잔기를 포함하는 DDS 화합물.
제 1항에 있어서,

당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 의약화합물 잔기가 스페이서를 통하여 결합하는

DDS 화합물.
제 2항에 있어서,

스페이서가 1개의 아미노산 또는 펩티드 결합한 2 내지 8개의 아미노 산인

DDS 화합물.
제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,

당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜이 당화합물과 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜이 링커를 통하여 결합한

DDS 화합물.
제 4항에 있어서,

당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜이 링커를 통하여 당화합물에 의해 집단(cluster) 수식된

DDS 화합물.
카르복시 C_1-4알킬 부분의 일부 카르복실기가 당화합물로 수식된 카르복시

C_1-4알킬덱스트란폴리알콜에 대하여 의약화합물 잔기를 결합시켜 제조할 수 있는 DDS 화합물.
청구항 6에 있어서,

카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 의약화합물 잔기를 스페이서를 통하여 결합시켜 제조할 수 있는

DDS 화합물.
제 6항 또는 제 7항에 있어서,

카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 카르복시 C_1-4알킬 부분의 일부 카르복실기에 당화합물 또는 당화합물에 결합한 링커를 결합시켜 제조된 이 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜에 대하여, 의약화합물 잔기를 결합시켜 제조할 수 있는

DDS 화합물.
카르복시 C_1-4알킬부분의 일부 카르복실기에 의약화합물 잔기가 스페이서를 통하여 결합한 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 당화합물로 수식하여 제조할 수 있는 DDS 화합물.
제 9항에 있어서,

카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 당화합물을 링커를 통하여 결합시켜 제조할 수 있는

DDS 화합물.
제 9항 또는 제 10항에 있어서,

카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 카르복시 C_1-4알킬 부분의 일부 카르복실기에 1개의 아미노산으로 이루어 지는 스페이서 또는 펩티드 결합한 2 내지 8개의 아미노산으로 이루어지는 스페이서를 통하여 의 약화합물 잔기를 결합시켜 제조된 이 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 당화합물로 수식하여 제조할 수 있는

DDS 화합물.
제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 있어서,

당화합물이 갈락토오스 혹은 갈락토사민 또는 그것들의 유도체인

DDS 화합물.
제 1항 내지 제 12항의 어느 한 항에 있어서,

당화합물이 N-아세틸갈락토사민인

DDS 화합물.
제 12항에 있어서,

갈락토오스 혹은 갈락토사민 또는 그것들의 유도체, 또는 집단(cluster)화된 갈락토오스 혹은 갈락토사민 또는 그것들의 유도체 의 치환도가 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜의 당잔기당 0.01 내지 1.0인

DDS 화합물.
제 1항 내지 제 14항의 어느 한 항에 있어서,

카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜을 구성하는 덱스트란폴리알콜이, 실질적으로 완전하게 폴리알콜화 가능한 조건하에서 덱스트란을 처리 하여 얻어진 덱스트란폴리알콜인

DDS 화합물.
제 1항 내지 제 15항의 어느 한 항에 있어서,

카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜이 카르복시 메틸덱스트란폴리알콜인

DDS 화합물.
제 1항 내지 제 16항의 어느 한 항에 있어서,

의약화합물이 항종양제 또는 항염증제인

DDS 화합물.
제 17항에 있어서,

의약화합물이 항종양제인

DDS 화합물.
제 1항 내지 제 18항의 어느 한 항에 있어서,

의약화합물이 (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-하이드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2- b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온인

DDS 화합물.
제 19항에 있어서,

간암 치료제인

DDS 화합물.
제 1항 내지 제 20항의 어느 한 항에 있어서,

DDS 화합물의 제조에 사용하기 위해 당화합물로 수식된

카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜.
당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜.
당화합물로 수식된 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜로 이루어진 고분자담체.
펩티드 결합한 2 내지 8개의 아미노산을 포함하는 스페이서를 고분자담체와 의약화합물 잔기가 결합한 DDS 화합물의 측정방법에 있어서, 이 DDS 화합물을 펩티다아제로 처리하여 얻어지는 가수분해물을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
제 24항에 있어서,

생체시료 중에 포함되는 이 DDS 화합물의 농도측정에 사용하는

방법.
제 24항에 있어서,

DDS 화합물에 도입된 의약화합물 잔기의 함유량을 측정하기 위해 사용 하는

방법.
제 24항 내지 제 26항의 어느 한 항에 있어서,

가수분해물이 의약화합물인

방법.
제 24항 내지 제 26항의 어느 한 항에 있어서,

가수분해물이 의약화합물 잔기에 스페이서의 일부가 결합한 화합물인 방법.
제 28항에 있어서,

스페이서의 일부가 스페이서 유래의 1개 아미노산인

방법.
제 24항 내지 제 29항의 어느 한 항에 있어서,

고분자담체가 카르복실기를 갖는 다당유도체인

방법.
제 30항에 있어서,

고분자담체가 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜인

방법.
제 24항 내지 제 31항의 어느 한 항에 있어서,

DDS 화합물 중에 도입된 의약화합물이 항종양제 또는 항염증제인

방법.
제 24항 내지 제 32항의 어느 한 항에 있어서,

스페이서가 N말단에서 -Gly-Gly-Phe-Gly-로 표현되는 테트라 펩티드 또는 N말단측에서 -Gly-Gly-Gly-Phe-로 나타내는 테트라 펩티드인

방법.
제 24항 내지 제 32항의 어느 한 항에 있어서,

스페이서가 N말단에서 -Gly-Gly-Phe-Gly-NH-Y'-CH₂-O-CO-로 나타내는 기 또는 N말단측에서 -Gly-Gly-Gly-Phe-NH-Y'-CH₂-O-CO-로 나타내는 기(이때, Y'는 p-페닐렌기를 나타낸다)인

방법.
제 24항 내지 제 34항의 어느 한 항에 있어서,

펩티다아제가 α-키모트립신 또는 파파인인

방법.
제 24항 내지 제 35항의 어느 한 항에 있어서,

의약화합물이 (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-

하이드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2- b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온인

방법.
제 24항 내지 제 29항의 어느 한 항에 있어서,

N말단에서 -Gly-Gly-Phe-Gly-로 나타내는 테트라 펩티드 또는 N말단측에서 -Gly-Gly-Gly-Phe-로 나타내는 테트라 펩티드를 포함하는 스페이 서를 통하여 카르복시 C_1-4알킬덱스트란폴리알콜과 (1S,9S)-1-아미노-

9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-하이드록시-4-메틸-1H,12H-

벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디 온이 결합한 DDS 화합물 측정에 사용하는

방법.
제 37항에 있어서,

펩티다아제로 α-키모트립신 또는 파파인을 사용하여 가수분해물로서 (1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-1-글리실아미노-2,3-디히드로-9-하이드록 시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]

퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온을 측정하는

방법.