KR20030031502A - 디디에스 화합물 및 그의 제조방법 - Google Patents

디디에스 화합물 및 그의 제조방법 Download PDF

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노구치시게루
야마구치타쯔야
야기쯔토무
카와베타케후미
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다이이찌 세이야꾸 가부시기가이샤
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Abstract

의약화합물로서 (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 1번 위치의 아미노기와 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복실기가 1개의 아미노산 또는 펩티드 결합한 2~8개의 아미노산으로 구성되는 스페이서를 개재하여 결합한 DDS화합물에 있어서, 의약화합물잔기의 도입량이 3.2~8.4중량%의 범위이며, 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 평균분자량이 240,000~480,000의 범위, 카르복시메틸화도가 0.14~0.47의 범위인 것을 특징으로 하는 DDS화합물 및 덱스트란을 함유한 수용액에 4℃±2℃의 온도에서 과요오드산나트륨을 함유한 수용액을 첨가하여 덱스트란을 산화시킨 후, 수득된 반응액을 15℃이하의 온도에서 수소화 붕소나트륨을 함유하는 수용액에 첨가하여 덱스트란폴리알콜을 수득하는 공정 등을 포함하는 전기 DDS화합물의 제조방법.

Description

디디에스 화합물 및 그의 제조방법{DDS Compound and Process for the Preparation Thereof}
폐암이나 소화기암 등의 고형암이나 백혈병 등의 혈액암 치료에서 이용되는 항종양제는 정맥 내 투여나 경구투여 등의 투여경로로 전신적으로 투여된 후, 특정의 종양부위에 이행되어 암세포의 증식을 저해 내지 억제함으로써 치료효과를 발휘한다. 그러나, 전신투여된 항종양제는 혈중에서 간장, 세망 내피계에 신속하게 투입되거나 또는 신속하게 소변으로 배설되기 위해, 혈중 농도가 저하하여 종양부위로의 이행이 제한되는 경우가 있다. 또한, 통상적으로 항종양제 자체의 종양부위로의 이행선택성(종양선택성)이 낮기 때문에, 항종양제가 전신의 여러 가지 세포나 조직으로 넓게 분포되어, 정상적인 세포나 조직에 대해서도 세포독으로서 작용하여 설사, 발열, 구토 또는 탈모 등의 부작용을 지극히 고율로 발생시키는 문제가 있다. 따라서, 항종양제를 효율적이며 선택적으로 종양부위에 이행시키는 수단의 개발이 필요하게 되었다.
이와 같은 수단의 하나로서, 다당유도체를 약물 담체로서 이용하고 전기 다당유도체에 대해 항종양제를 결합시켜 항종양제의 혈중 소실을 지연시킴과 동시에, 암조직으로의 지향성을 제고하는 방법이 제안되고 있다. 카르복실기를 가지는 다당의 카르복실기에 펩티드 연쇄를 개재하여 약제를 결합시킨 것(국제공개 WO94/19376호), 카르복시메틸화한 만노글루칸 유도체에 시프 염기나 아미드 결합을 개재하여 약제를 도입한 것(특공평7-84481호), 폴리알콜화 다당유도체를 약물 담체로서 이용하여 펩티드 연쇄를 개재하고, 또한 펩티드 연쇄 및 파라아미노벤질옥시카보닐기를 개재하여 약제를 결합시킨 것(국제공개WO99/61061호) 등이 개시되어 있다.
다당유도체를 약물 담체로서 이용한 DDS화합물 중에서 카르복시메틸덱스트란을 폴리알콜화한 다당유도체를 약물 담체로서 이용하여, 펩티드 연쇄를 개재하고 약물화합물 잔기를 결합한 DDS화합물은 종양선택성이 특히 우수하기 때문에 항종양제로서의 개발이 기대되고 있다. 그 중에서도, 의약화합물 잔기로서 (IS, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온을 결합시킨 전기 DDS화합물은 우수한 종양선택성 및 항종양활성을 발휘가능하여, 임상에서 유용성을 기대할 수 있는 DDS화합물이다.
그러나, 본 발명자들의 연구에 의하면 의약화합물 잔기로서(1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온을 카르복시메틸덱스트란을 폴리알콜화한 다당유도체에 대해 펩티드 스페이서를 개재하여 결합시킨 상기 DDS화합물은 약물 담체인 고분자 담체 부분의 분자량, 카복시메틸화도 및 상기 의약화합물 잔기의 도입량의 변화에 따라 안전성 및 약효가 크게 변동한다는 것이 판명되었다. 이러한 이유로 상기 DDS화합물에 있어서, 높은 안전성과 광범위한 약효를 제공하는 특정의 DDS화합물을 선택하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명자들은 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 제조에 있어서, 덱스트란폴리알콜의 제조시의 발열로 인해 고분자 담체의 저분자화가 발생하고, 더욱이 덱스트란폴리알콜을 카르복시메틸화할 때의 발열로 인해 카르복시메틸화도가 충분히 억제되지 않아, 일정 품질의 고분자 담체를 제조할 수 없다는 문제에 직면하고 있었다. 또한, 상기의 의약화합물과 펩티드 스페이서를 결합시키는 공정 및 펩티드 스페이서를 개재하여 의약화합물을 고분자 담체에 결합시키는 공정에서도 종래의 방법에서는 목적물의 분리나 정제가 필요하기 때문에 작업이 번잡하고, 목적물의 수율이 낮아, 양호한 품질의 제품을 제공할 수 없는 문제가 있어, 그 해결의 필요성이 더욱 급박해졌다.
본 발명은 카르복시메틸덱스트란을 폴리알콜화한 다당유도체와 의약화합물을 결합시킨 약물전달 시스템 화합물(이하, 「DDS화합물」이라 한다) 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기 DDS화합물에서 약물 담체인 고분자 담체 부분의 분자량, 카복시메틸화도 및 상기 의약화합물 잔기의 도입량을 선택하여, 높은안전성과 광범위한 약효를 가지는 상기 DDS화합물을 제공하는 데 있다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 상기의 특정 DDS화합물을 고품질, 효율적으로 고수율에서 제조하고, 공업화에 적당한 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해 예의 노력하여, 상기 DDS화합물에 있어서, 높은 안전성 및 광범위한 약효를 가지는 화합물을 선택하는 것에 성공하였다. 보다 구체적으로는, 약물 담체인 고분자 담체 부분의 분자량, 카르복시메틸화도 및 상기 의약화합물 잔기의 도입량에 관한 최적화를 행하여, 특정의 조건을 만족하는 화합물이 높은 안전성과 광범위한 약효를 가지는 것을 발견하였다. 또한, 상기의 특정 DDS화합물을 제조함에 있어서, 반응온도를 제어하기 위한 수단, 반응의 진행을 모니터하기 위한 수단 및 반응시약 등을 선택하여, 목적의 DDS화합물을 일정 품질로, 효율적으로 제조할 수 있는 것을 발견하였다. 본 발명은 이들의 지견을 근거로 하여 완성된 것이다.
즉, 본 발명은 (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 1번 위치의 아미노기와 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복실기가 1개의 아미노산 또는 펩티드 결합한 2~8개의 아미노산으로 구성되는 스페이서를 개재하여 결합한 DDS화합물에 있어서, (1) (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 잔기의 도입량이 DDS화합물 전중량에 대해 3.2~8.4중량%의 범위이며,
(2) 상기 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 플루란 표준중량 평균분자량이 240,000~480,000의 범위이고,
(3) 상기 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복시메틸화도가 0.23~0.47의 범위인 것을 특징으로 하는 DDS화합물을 제공하는 것이다.
또한, (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 1번 위치의 아미노기와 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복실기가 1개의 아미노산 또는 펩티드 결합한 2~8개의 아미노산으로 구성되는 스페이서를 개재하여 결합한 DDS화합물에 있어서,
(1) (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 잔기의 도입량이 DDS화합물 전중량에 대해 3.2~8.4중량%의 범위이며,
(2) 상기 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 플루란 표준중량 평균분자량이 240,000~480,000의 범위이고,
(3) 상기 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복시메틸화도가 0.14~0.47의 범위인 것을 특징으로 하는 DDS화합물도 본 발명에 의해 제공된다. 이들의 DDS화합물에 있어서, 표준물질을 분해법 또는 NMR법으로 측정함으로써 수득할 수 있는 검량선을 이용하여 모세관 전기영동법으로 상기의 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복시메틸화도를 측정한 상기 DDS화합물도 본 발명에 의해 제공된다.
또한, 본 발명으로 상기 DDS화합물을 포함하는 의약 및 상기 DDS화합물을 포함하는 항종양제 및 상기 의약의 제조를 위한 상기 DDS화합물의 사용 및 악성종양의 치료방법으로서, 상기 DDS화합물의 치료유효량을 사람을 포함하는 포유류 동물에 투여하는 공정을 포함하는 방법이 제공된다.
다른 관점에서는 본 발명으로 상기 DDS화합물의 제조방법이 제공된다. 본 발명의 방법은 상기 DDS화합물의 제조방법으로서 하기의 공정;
(A) 덱스트란을 함유하는 수용액에 4℃±2℃의 온도에서 과요오드산나트륨을 함유하는 수용액을 첨가하여 덱스트란을 산화시킨 후, 수득된 반응액을 15℃이하의 온도에서 수소화 붕소나트륨을 함유하는 수용액에 첨가하여 덱스트란폴리알콜을 수득하는 공정;
(B) 덱스트란폴리알콜에 모노클로로초산나트륨을 반응시켜 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 제조하는 공정으로서, 카르복시메틸화의 반응종점을 모세관 전기영동법으로 결정하는 것을 특징으로 하는 공정;
(C) (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 1번 위치의 아미노기와 α-아미노기가 tert-부톡시카보닐기로 보호된 1개의 아미노산의 α-아미노기 또는 N말단이 tert-부톡시카보닐기로 보호된 2~8개의 아미노산으로 구성되는 올리고펩티드의 C말단 카르복실기를 결합하는 공정으로, 축합제로서 1-에틸-3(디메틸아미노프로필)카보디이미드 또는 그 염을 이용하는 것을 특징으로 하는 공정; 및,
(D) (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 1번 위치의 아미노기와 α-아미노기가 tert-부톡시카보닐기로 보호된 1개의 아미노산의 α-카르복실기 또는 N말단이 tert-부톡시카보닐기로 보호된 2~8개의 아미노산으로 구성되는 올리고펩티드의 C말단 카르복실기를 결합한 축합체에서 tert-부톡시카보닐기를 제거하여 수득한 탈보호체와 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 축합한 공정으로서, 축합제로서 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카보디이미드 또는 그 염을 이용하는 것을 특징으로 하는 공정으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1이상의 공정을 포함한다.
본 발명의 바람직한 방법은 상기 (A)부터 (D)의 공정에서 선택되는 2이상의 공정을 포함하는 것이며, 더욱 바람직한 방법은 상기 (A)부터 (D)의 공정에서 선택되는 3이상의 공정을 포함하는 것이고, 가장 바람직한 방법은 상기 (A)부터 (D)의 모든 공정을 포함하는 것이다. 또한, 공정 (D)에서 축합반응의 종점을 고속액체 크로마토그래피로 결정하는 것이 바람직한 태양으로서 제공된다.
또한, 본 발명으로 상기의 DDS화합물의 제조로 이용하기 위한 플루란 표준중량 평균분자량이 240,000~480,000의 범위이며, 카르복시메틸화도가 0.23~0.47의 범위인 카르복시메틸덱스트란폴리알콜, 상기의 DDS화합물의 제조에 이용하기 위한 플루란 표준중량 평균분자량이 240,000~480,000의 범위이며, 카르복시메틸화도가 0.14~0.47의 범위인 카복시메틸덱스트란폴리알콜 및 상기의 카복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복시메틸화도가 분해법 또는 NMR법으로 수득되는 검량선을 이용하여 모세관 전기영동법으로 측정한 카르복시메틸화도인 카르복시메틸덱스트란폴리알콜이 제공된다.
또한, 상기 DDS화합물의 제조를 위한 상기 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 사용이 본 발명으로 제공된다.
더욱이, 상기 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 제조방법으로서,
(A) 덱스트란을 함유한 수용액에 4℃±2℃의 온도에서 과요오드산나트륨을 함유한 수용액을 첨가하여 덱스트란을 산화시킨 후, 수득된 반응액을 15℃이하의 온도에서 수소화 붕소나트륨을 함유하는 수용액에 첨가하여 덱스트란폴리알콜을 수득하는 공정;
(B) 상기 공정 (A)에서 수득한 덱스트란폴리알콜에 모노클로로초산나트륨을 반응시켜 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 제조하는 공정으로서, 카르복시메틸화의 반응종점을 모세관 전기영동법으로 결정하는 것을 특징으로 하는 공정을 포함하는 방법이 제공된다.
일본국특허출원 제 2000-195919호(2000년 6월 29일 출원)의 모든 개시를 참조로서 본 명세서의 개시에 포함한다.
본 발명의 DDS화합물은 (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온(이하, 본 명세서에서 「의약화합물」이라고 하는 경우가 있다)의 1번 위치의 아미노기와 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복실기가 1개의 아미노산 또는 펩티드 결합한 2~8개의 아미노산으로 구성되는 스페이서를 개재한 DDS화합물에서,
(1) 상기 의약화합물의 잔기의 도입량이 DDS화합물 전중량에 대해서 3.2~8.4중량%, 바람직하게는 5.6~7.6중량%의 범위이며,
(2) 상기 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 플루란 표준중량 평균분자량이 240,000~480,000의 범위이고,
(3) 상기 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복시메틸화도가 0.23~0.47의 범위인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명으로 제공되는 다른 DDS화합물은 (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온(이하, 본 명세서에서 「의약화합물」이라고 하는 경우가 있다)의 1번 위치의 아미노기와 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복실기가 1개의 아미노산 또는 펩티드 결합한 2~8개의 아미노산으로 구성되는 스페이서를 개재하여 결합한 DDS화합물에 있어서,
(1) 상기 의약화합물의 잔기의 도입량이 DDS화합물 전중량에 대해서 3.2~8.4중량%, 바람직하게는 5.6~7.6중량%의 범위이며,
(2) 상기 카르복시메틸덱스트란폴리알콜플루란 표준중량 평균분자량이 240,000~480,000의 범위이고,
(3) 상기 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복시메틸화도가 0.14~0.47의 범위인 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서, 「~」로 표시되는 수치범위는 하한 및 상한의 수치를 포함하는 범위이다.
(1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 1번 위치의 아미노기와 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복실기가 1개의 아미노산 또는 펩티드 결합한 2~8개의 아미노산으로 구성되는 스페이서를 개재하여 결합한 약물 복합체는 국제공개WO97/46260에 개시되어 있으나, 상기의 특정의 DDS화합물은 개시되어 있지 않다.
본 발명의 DDS화합물에서 약물 담체로서 기능하는 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 중량 평균분자량은, 240,000~480,000의 범위이다. 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 플루란 표준중량 평균분자량은 당업자에게 주지의 방법에 따라서 측정가능하나, 예를 들면, 겔 여과크로마토그래피법에 따라서 플루란을 표준으로서 측정할 수 있다. 표준으로 하는 플루란은 Shodex사 등으로부터 구입할 수 있다. 또한, 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복시메틸화도는 0.14~0.47의 범위 또는 0.23~0.47의 범위이다.
카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복시메틸화도는 당업자에게 주지의 방법에 따라 측정 가능하나, 예를 들면, 모세관 전기영동법에 따라서 측정할 수 있다. 모세관 전기영동법으로 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복시메틸화도의 측정을 함으로써, 표준물질을 이용하여 구한 검량선을 이용할 수 있다. 표준물질로서는 카르복시메틸기의 도입량이 다른 여러 종의 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 조제하여 이용할 수 있다. 검량선은 예들 들면, 분해법 또는 NMR법 중 어느 한 방법으로 수득할 수 있으나, 분해법과 NMR법은 동일한 표준물질에 대해서 다른 카르복시메틸화도의 측정치를 부여하는 경우가 있다. 일반적으로, NMR법에 의한 카르복시메틸화도의 측정치는 분해법에 따른 측정법에 비해서 0.09정도 낮아지는 경향이 있다. 따라서, NMR법으로 제조한 검량선을 이용하는 경우에는 카르복시메틸화도가 0.14~0.38의 범위인 것이 바람직하다.
분해법에서는 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 산가수분해로 각각 정량적으로 생성된 글리세롤(Glr), 글리콜알데하이드(GA), 카르복시메틸글리세롤(CM-Glr) 및 카르복시메틸글리콜알데하이드(CM-GA)를 정량한다. 가수분해물 중의 글리세롤은 염기성 조건 하에 고속액체 크로마토그래피로 직접 정량할 수 있으며, 글리콜알데하이드는 알데하이드 표식화시약인 단실하이드라진과 반응시킨 후, 반응생성물을 고속액체 크로마토그래피로 정량할 수 있다. 카르복시메틸글리세롤과 카르복시메틸글리콜알데하이드에 대해서는, 카르복시메틸글리콜알데하이드의 알데하이드를 환원하여 카르복시메틸에틸렌글리콜(CM-EG)로 변환한 후, 각각 카본산의 형광표식화 시약인 9-안스릴디아조메탄과 반응시켜, 반응생성물을 고속액체 크로마토그래피로 정량할 수 있다. 카르복시메틸화도는 하기의 식 : CM-Glr/(Glr+CM-Glr)+CM-EG/(GA+CM-EG)로 계산할 수 있다.
NMR법에서는 카르복시메틸기의 도입량이 다른 여러 종류의 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 표준물질로서 이용하여, 그들의13C-NMR을 측정한다. 각 표준물질의 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 C-1번 위치 및 C-5번 위치 및 카르복시메틸기가 측쇄부분에 결합하고 있는 C-1번 위치 및 C-5번 위치 4개의 시그널 면적강도를 합계 산출하여, C-1위 및 C-5위 면적강도 합계 중, 카르복시메틸기가 측쇄부분에 결합하고 있는 C-1번 위치 및 C-5번 위치의 면적강도가 차지하는 비율로, 각 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복시메틸화도를 구한다.
본 발명의 DDS화합물을 구성하는 스페이서로서는 1개의 아미노산 잔기를 포함하는 스페이서 또는 펩티드 결합한 2개에서 8개의 아미노산 잔기로 구성되는 올리고펩티드 잔기를 포함하는 스페이서를 이용할 수 있다. 전기 스페이서는 1개의 아미노산 잔기(아미노산의 아미노기 또는 카르복실기에서 각각 1개의 수소원자 및 수소기를 제외한 잔기를 의미한다) 또는 펩티드 결합한 이 2 내지 8개의 아미노산 잔기를 포함하는 올리고펩티드의 잔기(N미만의 아미노기 및 C말단의 카르복실기에서 각각 1개의 수소원자 및 1개의 수소기를 제외한 잔기를 의미한다)의 형태를 가지고 있으며, C말단(1개의 아미노산을 포함하는 스페이서의 경우에는 α-카르복실기)으로 (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 1번 위치의 아미노기에 펩티드 결합한다.
바람직한 스페이서는 2개에서 6개의 아미노산 잔기로 구성되는 올리고펩티드 잔기를 포함하는 스페이서이다. 스페이서를 구성하는 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, L-또는 D-아미노산, 바람직하게는 L-아미노산을 이용할 수 있으며, α-아미노산 외에, β-알라닌, ε-아미노카프론산, γ-아미노브티르산을 이용하여도 무방하다. 이와 같은 α-아미노산 이외에 아미노산은 스페이서 중에서 약물 담체에 근접한 위치에 배치되는 것이 바람직하다.
올리고펩티드 잔기를 포함하는 스페이서를 이용하는 경우의 아미노산 배열은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 스페이서가 -X-Z-로 표시되는 디펩티드의 잔기(X는 소수성 아미노산이 잔기를, Z는 친수성 아미노산의 잔기를 나타내고, -X-Z-는 소수성 아미노산(X)과 친수성 아미노산(Z)이 각각 N말단측 및 C말단측이 되어 펩티드 결합한 디펩티드의 N말단의 아미노기 및 C말단이 카르복실기에서 각각 1개의 수소원자 및 1개의 수소기를 제외한 잔기를 의미한다)이거나 또는 전기 디펩티드의 잔기를 부분 펩티드 배열로서 포함하는 스페이서를 적절하게 이용할 수 있다. 소수성 아미노산으로서는 예를 들면, 페닐알라닌, 티로신, 루이신 등을 이용할 수 있으며, 친수성 아미노산으로서는 예를 들면, 글리신, 알라닌 등을 이용할 수 있다. 스페이서가 이와 같은 디펩티드 잔기의 반복배열(예를 들면,-X-Z-X-Z-, -X-Z-X-Z-X-Z-등)을 가지고 있어도 무방하다.
이와 같은 디펩티드 구조를 포함하는 스페이서를 이용하면, 스페이서가 펩티다아제가 풍부하다고 여겨지는 종양부위나 염증부위에서 가수분해되어, 그 부위에서 단시간에 고농도의 의약화합물이 유리되기 때문에, 상기 디펩티드를 포함하는 스페이서와 의약화합물이 결합하여 형성되는 부분 구조는 본 발명의 DDS화합물의 바람직한 부분 구조이다.
스페이서로서 이용가능한 올리고펩티드 잔기의 구체적 예를 이하의 표에 나타내나, 본 발명의 DDS화합물에 이용되는 스페이서는 이하의 것에 한정되는 것이아니라, 스페이서 종류의 선택은 의약화합물의 적당한 유리속도를 조절할 수 있도록 당업자가 적의할 수 있는 것은 자명한 일이다(펩티드 배열은 좌측이 N말단이며, C말단(1개의 아미노산을 포함하는 스페이서의 경우에는 α-카르복실기)으로 (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 1번 위치의 아미노기에 펩티드 결합한다). D-Phe는 D-페닐알라닌 잔기를 나타내고, 그 외의 아미노산은 L-아미노산을 나타낸다. 또한, 유리속도의 대소는 독소루비신을 결합한 DDS화합물의 Walker256담암 랫트에 대한 약효의 발현의 정도 또는 Walker256담암 랫트의 종양부위에 유리독소루비신 농도에 따라 판정하였다). 이들 중, 본 발명의 DDS화합물에서는 스페이서로서 -Gly-Gly-Phe-Gly-를 이용하는 것이 가장 바람직하다.
(a) 유리속도가 큰 스페이서
-Leu-Gly-
-Tyr-Gly-
-Phe-Gly-
-Gly-Phe-Gly-
-Gly-Gly-Phe-Gly-
-Gly-Phe-Gly-Gly-
-Phe-Gly-Gly-Gly-
-Phe-Phe-Gly-Gly-
-Gly-Gly-Gly-Phe-Gly-
(b) 유리속도가 비교적 큰 스페이서
-Gly-Gly-Phe-Phe-
-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-
(c) 유리속도가 비교적 작은 스페이서
-Phe-Phe-
-Ala-Gly-
-Pro-Gly-
-Gly-Gly-Gly-Phe-
(d) 유리속도가 작은 스페이서
-Gly-
-D-Phe-Gly-
-Gly-Phe-
-Ser-Gly-
-Gly-Gly-
-Gly-Gly-Gly-
-Gly-Gly-Gly-Gly-
(1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 특개평5-59061호 공보에 기재된방법으로 합성할 수 있다. 본 발명의 DDS화합물에서 상기 의약화합물의 잔기의 도입량은 DDS화합물의 중량에 대해서 3.2~8.4중량%이며, 바람직하게는 5.6~7.6중량%이다. 상기 의약화합물의 도입량은 예를 들면, 흡광도 분석으로 당업자가 용이하게 확인할 수 있다.
본 발명의 DDS화합물은 소망하는 항종양성을 종양부위 특이적으로 발현할 수 있으며, 높은 안전성을 보지한 항종양제로서 이용할 수 있다. 본 발명의 DDS화합물을 포함하는 의약은 통상적으로 동결건조품 등의 형태로 바이알 등에 충전할 수 있으며, 용시용해형의 주사용 또는 점적용 제제 등의 비경구 투여용 제제로서 임상으로 제공되어지나, 본 발명의 의약 제제형태는 상기 태양으로 한정되는 것은 아니다. 상기 제제의 제조에는 예를 들면, 용해보조제, pH조정제, 안정화제 등의 당업계에서 이용가능한 제조용 첨가물을 이용할 수 있다. 본 발명의 의약 투여량은 특별히 한정되지 않으나, 1일 당 체표면적 1㎡에 약 1~500㎎정도, 바람직하게는 약 10~100m에서 1일 1회 투여하고, 3 내지 4주 마다 반복해주는 것이 바람직하다.
본 발명의 DDS화합물의 제조법은 특별히 한정되지 않으나, 본 발명으로 제공되는 상기의 제조방법으로 적절하게 제조할 수 있다. 본 발명의 발명은 상기의 공정(A)부터 (D) 중 어느 1공정 또는 2이상의 공정을 조합하여 포함하며, 가장 바람직하게는 (A)부터 (D)공정을 모두 포함하는 것이다. 이하, 본 발명의 가장 바람직한 형태로서 (A)부터 (D)공정을 모두 포함하는 방법에 대해서 설명하겠으나, 본 발명의 범위는 이 바람직한 형태에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 방법은,
(A) 덱스트란을 함유하는 수용액에 4℃±2℃의 온도에서 과요오드산나트륨을 함유하는 수용액을 첨가하여 덱스트란을 산화시킨 후, 수득된 반응액을 15℃이하의 온도에서 수소화 붕소나트륨을 함유하는 수용액에 첨가하여 덱스트란폴리알콜을 수득하는 공정;
(B) 상기 공정(A)에서 수득된 덱스트란폴리알콜에 모노클로로초산나트륨을 반응시켜 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 제조하는 공정으로서, 카르복시메틸화의 반응 종점을 모세관 전기영동법으로 결정하는 것을 특징으로 하는 공정;
(C) (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 1번 위치의 아미노기와 α-아미노기가 tert-부톡시카보닐기로 보호된 1개의 아미노산의 α-카르복실기 또는 N말단이 tert-부톡시카보닐기로 보호된 2~8개의 아미노산으로 구성되는 올리고펩티드의 C말단 카르복실기를 축합하는 공정으로, 축합제로서 1-에틸-3(디메틸아미노프로필) 카보디이미드 또는 그 염을 이용하는 것을 특징으로 하는 공정; 및,
(D) 상기 공정(C)에서 수득된 축합체에서 tert-부톡시카보닐기를 제거하여 수득한 탈보호체와 공정(B)로 수득된 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 축합하는 공정으로서, 축합제로서 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필) 카보디이미드 또는 그 염을 이용하는 것을 특징으로 하는 공정을 포함하고 있다.
공정(A)는 덱스트란에서 덱스트란폴리알폴을 수득하는 공정이다. 출발원료인 덱스트란의 종류는 특별히 한정되지 않으며, α-D-1, 6-결합을 임의로 포함하여도 무방하다. 예를 들면, α-D-1, 6-결합의 비율이 85%이상, 90%이상 또는 95%이상의 덱스트란 등을 이용할 수 있다. 원료로 이용하는 덱스트란으로는, 덱스트란 T-500(Pharmacia제) 등의 분자량이 500,000정도의 것이 바람직하다. 수득되는 덱스트란폴리알콜화도는 특별히 한정되지 않으나, 실질적으로 완전하게 폴리알콜화 가능한 조건 하에서 덱스트란을 처리하는 것이 바람직하다.
상기 과요오드산나트륨을 이용한 산화반응에서 반응 시의 온도상승으로, 덱스트란폴리알콜의 저분자화가 발생하는 경우가 있으나, 본 발명의 방법으로는 이 저분자화를 억제하기 위해 덱스트란을 포함하는 수용액 중에, 4℃±2℃의 온도에서 과요오드산나트륨을 함유하는 수용액을 첨가하는 것을 특징으로 한다. 덱스트란을 함유하는 수용액은 예를 들면, 완충제를 포함하고 있어도 무방하다. 과요오드산나트륨을 포함하는 수용액을 첨가할 때에는 반응액이 온도상승이 발생하지 않도록 첨가속도를 억제하는 것이 바람직하며, 부분적인 온도상승을 피하기 위해 적절한 교반을 행하는 것이 바람직하다. 반응은 수일에서 20일 정도로, 통상적으로는 10일 정도로 완료한다. 반응액 중의 덱스트란의 농도는 예를 들면, 반응액 1리터 당 수그램에서 100그램 정도로, 바람직하게는 1리터 당 10그램 정도이다.
반응의 완료 후, 필요에 따라서 수득된 반응액에 에틸렌글리콜 등을 첨가하여 과잉의 과산을 소비시켜, 필요에 따라 반응액의 pH를 중성부근(예를 들면, pH 6.5 정도)으로 조절한 후. 이 반응액을 15℃이하의 온도에서 수소화 붕소나트륨을 포함하는 수용액에 첨가하여 환원한다. 환원반응에 있어서도, 반응 시의 온도상승으로 덱스트란폴리알콜의 저분자화가 발생하는 경우가 있으나, 본 발명의 방법에서는 이 저분자화를 억제하기 위해 상기의 산화반응의 반응액을 수소화 붕소나트륨을 포함하는 수용액에 15℃이하의 온도에서 첨가하는 것을 특징으로 한다. 첨가속도는 반응액의 온도상승이 발생하지 않도록 억제하는 것이 바람직하며, 부분적인 온도상승을 피하기 위해 적절한 교반을 하는 것이 바람직하다. 일반적으로는 첨가 후에 반응혼합물을 빙냉온도로 유지함으로써, 반응은 수시간에서 수일, 바람직하게는 1일 정도에서 완료한다.
수득된 반응액에서 소망하는 분자량을 포함하는 덱스트란폴리알콜을 분획하고, 차공정(B)의 원료로서 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 한외여과막을 이용하여 저분자량 및 고분자량의 분획을 제거하는 것이 바람직하고, 필요에 따라서 탈염 및 농축 등의 공정을 부가하여도 무방하다. 탈염 및 농축도 한외여과막을 이용하여 행할 수 있다.
공정(B)는 상기 공정(A)에서 수득한 덱스트란폴리알콜을 카르복시메틸화하여 중량 평균분자량(플루란표준)이 240,000~480,000의 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 제조하는 공정이다. 덱스트란폴리알콜의 카르복시메틸화는 예를 들면, 덱스트란폴리알콜의 수산기에 대해서 클로로초산, 브롬초산 등의 할로겐화초산 또는 그 염, 바람직하게는 모노클로로초산의 나트륨염을 반응시켜, 덱스트란폴리알콜의 수산기를 부분적으로 카르복시메틸화하는 것으로 행할 수 있다. 예를 들면, 덱스트란폴리알콜을 반응에 관여하지 않는 불활성 용매(예를 들면, 물, N,N-디메틸포아미드, 디메틸술폭시드 등)에 용해하고, 염기(예를 들면, 수산화나트륨이나 수산화칼륨 등)의 존재 하에 할로겐화초산 또는 할로겐화초산의 염을 첨가하여 빙냉하 내지 100℃의 온도범위에서 수분 내지 수일간 반응시키면 된다. 바람직하게는 20℃에서, 수시간에서 1일 정도 반응시킬 수 있다. 반응 후, 한외여과막을 이용하여 저분자량 및 고분자량의 분획을 제거하는 것이 바람직하며, 필요에 따라 한외여과막을 이용한 탈염 및 농축 등의 공정을 부가하여도 무방하다.
카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복시메틸화도는 카르복시메틸화의 반응온도나 시약으로서 이용하는 할로겐화초산 또는 그 염의 첨가량 등으로 어느 정도의 제어가 가능하나, 본 발명의 방법에서는, 보다 엄밀히 카르복시메틸화의 정도를 0.14~0.47 또는 0.23~0.47의 범위 내가 되도록 제어하기 위해 카르복시메틸화의 반응종점을 모세관 전기영동법으로 결정하는 것을 특징으로 한다.
모세관 전기영동(capillary electrophoresis, CE)은 통상적으로 내경 100㎛ 이하의 용융 실리카제의 모세관 내에서 전기영동을 행하는 방법이다(예를 들면, 바바 요시노부, 분세키, 342, 1995 등을 참조). 모세관 전기영동에는 모세관존 전기영동(CZE), 도전 크로마토그래피(EKC), 모세관겔 전기영동(CGE) 등 수종의 분리 모드가 제안되고 있으나, 본 발명의 방법에는 이들의 분리 모드 중 어느 것을 이용하여도 무방하다. 바람직하게는 모세관존 전기영동을 이용할 수 있으며, 모세관 내에 인산, 구연산, 붕산 등의 완충액을 충분히 하여 분리를 행할 수 있다. 이 방법으로 단위분자량 당의 전하를 정확하게 측정할 수 있으며, 상기 반응액 중의 시료의 카르복시메틸화도를 단시간에, 고감도로 측정할 수 있다. 그 방법의 상세한 내용은 본 명세서의 실시예에 구체적으로 나타내었기 때문에, 당업자는 상기의 간행물의 일반적인 설명 및 그 외의 간행물을 참조하여, 본 명세서의 실시예에 기재된 구체적 방법에 따라, 필요에 따라 그들을 적절하게 수식 내지 변형함으로써, 카르복시메틸화의 반응종점(카르복시메틸화도가 0.14~0.47 또는 0.23~0.47의 범위)을 용이하고 정확하게 확인할 수 있다.
앞서 설명한 것과 같이, 모세관 전기영동법으로 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복시메틸화도의 측정에 있어서, 표준물질을 이용하여 구한 검량선을 채용할 수 있다. 검량선은 예를 들면, 분해법 또는 NMR법 중 어느 한 방법으로 수득할 수 있으나, 분해법과 NMR법으로는 동일한 표준물질에 대해서 다른 카르복시메틸화도의 측정치를 부여하는 경우가 있다. 일반적으로, NMR법에 의한 카르복시메틸화도의 측정치는 분해법에 의한 측정치에 비해 0.09정도 낮아지는 경향이 있다. 따라서, NMR법으로 제조한 검량선을 이용하는 경우에는 카르복시메틸화도가 0.14~0.38의 범위가 바람직하다.
공정(C)는 (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 1번 위치의 아미노기를 스페이서로서 이용하는 올리고펩티드의 C말단 카르복실기(1개의 아미노산을 이용하는 경우에는 α-카르복실기)와 축합하는 공정이다. 스페이서로서 이용하는 상기 올리코펩티드 또는 아미노산은 이 반응에 이바지하기 위해 각각 N말단 아미노기 또는 α-카르복실기를 tert-부톡시카보닐기로 보호해 둘 필요가 있으나, 그 수단은 당업자에게 주지, 관용되고 있다.
본 발명의 방법에서는, 상기의 축합반응을 행함에 있어서 축합제로서1-에틸-3-(디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EPCI) 또는 그 염, 바람직하게는 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필) 카보디이미드염산기를 이용하는 것을 특징으로 한다. 상기의 축합제를 이용하면, N,N'-디시크로헥실카보디이미드(DCC)와 같은 N,N'-디시크로알킬카보디이미드류를 축합제로서 이용하는 경우에 비해 반응조작을 간략화할 수 있으며, 반응시간도 대폭 단축할 수 있게 된다. 보다 구체적으로는 축합제제거를 위한 원심분리 및 원주조작을 회피할 수 있으며, 반응시간도 DCC를 이용한 경우의 약 1/5정도로 단축가능하다. 기질농도도 DCC를 이용한 경우에 비해 약 5배 증가시킬 수 있다. 특히, 공업화를 지향한 대량합성계에서, 시약삭감, 시간단축 등으로 대폭적인 비용절감을 도모할 수 있다.
상기 반응은 축합제로서 EPC1 또는 그 염을 이용하는 것 이외에, 통상적인 축합제를 이용한 펩티드 결합형성을 위한 축합반응과 동일하게 행할 수 있다. 상기 의약화합물에 대해서 tert-부톡시카보닐화 아미노산 또는 tert-부톡시카보닐화 올리고펩티드를 1~1.5당량 정도 이용하고, 디메틸포름아미드 등의 불활성용매 중에서 반응을 행할 수 있다. 반응은 일반적으로 실온하에서 수시간에서 1일 정도, 바람직하게는 실온하에 3시간 정도로 종료한다. 반응액 중의 의약화합물의 농도는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 통상적으로는 1리터 당 50~200그램 정도, 바람직하게는 1리터당 100~150그램 정도이다.
공정(D)는 상기 공정(C)에서 수득된 축합체에서 tert-부톡시카보닐기를 제거하여 수득된 탈보호체와 공정(B)에서 수득된 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 축합하는 공정이다. tert-부톡시카보닐기를 제거하는 방법은 당업자에게 주지·관용되고 있으나, 예를 들면, 트리플루오로초산으로 처리하는 방법이 바람직하다. 탈보호체를 정제하는 경우에는 예를 들면, 이소프로필 등으로 세정할 수 있다.
본 발명의 방법에서는, 의약화합물이 결합한 스페이서의 N말단 아미노기(1개의 아미노산을 스페이서로서 이용하는 경우에는 α-아미노산)과 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복실기를 결합시킴에 있어서, 축합제로서 1-에틸-3(디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EPCI) 또는 그 염, 바람직하게는 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필) 카보디이미드염 잔기를 이용하는 것을 특징으로 한다. 상기의 축합제를 이용하면, N,N'-디시크로헥실카보디이미드(DDC)와 같은 N,N'-디시크로알킬카보디이미드류를 축합제로서 이용하는 경우에 비해, 축합제 제거를 위한 원심분리 및 원주조작을 회피할 수 있으며, 반응시간도 대폭 단축할 수 있어 공업화를 지향한 대량합성계에서 대폭적인 비용절감을 도모할 수 있다. 상기 반응의 종점은 HPLC로 결정하면 된다.
상기 반응은, 축합제로서 EPC1을 이용하는 것 이외에는 통상적으로 축합제를 이용한 펩티드 결합형성을 위한 축합반응과 동일하게 행할 수 있다. 카르복시메틸덱스트란폴리알콜 1중량부에 대해서 의약화학물을 결합한 아미노산 또는 올리고펩티드를 0.1~0.2 중량부 정도 이용하고, 함수메탄올 등의 불활성 용매 중에서 반응시킬 수 있다. 반응은 일반적으로 실온하에서 수시간에서 1일 정도, 바람직하게는 실온하에 2~3시간 정도에서 종료한다.
또한, 본 발명의 방법의 구체적 예가 본 명세서의 실시예에 나타나 있기 때문에 당업자는, 상기의 일반적인 설명 및 실시예의 구체적 설명을 참조하며, 필요에 따라서 적절하게 수식 내지 변형을 가함으로써, 본 발명의 방법을 행할 수 있다. 또한 반응온도나 반응시간, 시약의 농도 등은 당업자가 본 발명의 범위 내에서 적절히 선택가능한 것은 자명한 것이다.
본 발명의 DDS화합물을 포함하는 의약은, 통상적으로 동결건조품 등의 형태로 바이알 등으로 충전할 수 있으며, 용시용해형의 주사용 또는 점적용 제제 등의 비경구 투여용 제제로서, 종양치료를 위한 의약으로서 임상에 제공된다. 본 발명의 DDS화합물의 종량치료를 위한 의약으로서의 사용에 관해서 국제공개 WO97/46260호의 개시를 참조로서 본 명세서의 개시에 포함한다. 하지만, 본 발명의 의약의 제제 형태는 상기 태양에 한정되는 것은 아니며, 상기 의약의 제조에는 예를 들면, 용해보조제, pH조절제, 안정화제 등 당업계에서 이용가능한 제제용 첨가물을 이용할 수 있다. 상기 의약의 투여량은 특별히 한정되지 않으나, 통상적으로는 1일 당 체표면적 1㎡에 약 0.1~100㎎ 정도, 바람직하게는 1~30㎎의 범위에서 비경구적으로 1회 투여하고, 3~4주 마다 투여를 반복하는 것이 바람직하다.
이하, 실시예로 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하겠다. 본 발명의 범위는 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 실시예 중에서 (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온을 「의약화합물A」로 칭하는 경우가 있으며, 「Gly-Gly-Phe-Gly」는 글리실글리실페닐알라닐글리신 또는 그 잔기를 의미한다. 또한, 시험예에서 사용한 DDS화합물은 상기의 의약화합물과 카르복시메틸덱스트란폴리알콜이 테트라펩티드스페이서(Gly-Gly-Phe-Gly)를 개재하여 결합한 DDS화합물이며, 다른 카르복시메틸화도 및 분자량의 다른 고분자 담체를 가지도록 조제하였다.
실시예 1: 덱스트란폴리알콜(Dex-PA)의 합성
덱스트란-T500(Pharmacia제, 300g)을 pH 5.5로 조정한 0.2M 초산완충액(15L), NaIO4(990g)을 순수한 물(15L)로 용해하여 저온실(약 4℃)에서 하룻밤 방치하였다. 다음날, 덱스트란-T500용액(3.5℃)에 NaIO4(3.5℃)를 온도상승(7.0℃이하)이 일어나지 않도록 서서히 부어, 주입한 다음, 그 상태 그대로 저온실에서 교반(100rpm)하였다. 10일간 교반 후, 에틸렌글리콜(210㎖)을 첨가하여 2시간 교반하고 과산의 소실을 Peroxid시험지로 확인한 후, 10% NaOH를 이용하여 반응액을 pH 6.5로 조정하였다. 이어서, 이 반응액을 빙냉하에서NaOH4용액(420g, 12L)에 적하하였다. 이 때, 계내온도가 15℃를 초과하지 않도록 하고, 3시간에 걸쳐 적하하였다. 그 후, 반응혼합물을 저온실에서 하룻밤 교반하고, 다음날 초산으로 pH 5.5로 조정한 후, 1시간 교반하여 10%NaOH에서 pH를 7.0으로 하였다. 수득한 반응액을 폴 필트론의 한외여과막(1,000k)에서 처리하여, 미립자 및 고분자획분를 제거하였다. 또한, 밀리포어의 한외여과막(50k)에서 탈염(순수한 물 90~100L정도를 사용) 및 농축하여, HPLC에서 모니터하면서 1,997㎖까지 농축하였다. 그 중 일부(1㎖ x 3)를 샘플링하여 동결건조한 결과, 60.1㎎이었기 때문에 수득량은 120g으로 산출되었다.
실시예 2: 카르복시메틸덱스트란폴리알콜(CM-Dex-PA)의 합성
(A) 카르복시메틸덱스트란폴리알콜(CM-Dex-PA)의 합성
NaOH(193g)을 순수한 물(1,537㎖)에 용해하여, 온도는 25℃로 계속 유지하고 덱스트란폴리알콜 수용액을 첨가하여, 계내온도를 25℃로 계속 유지하면서 교반하였다. 이 혼합물에 모노클로로초산나트륨을 서서히 첨가하여, 동 온도에서 15시간 교반하였다. 반응종점을 모세관 전기영동법으로 확인한 후, 초산에서 pH 8.0 정도로 조정하고, 한외여과를 행하였다. 최초 1,000k의 막에서 고분자를 제거하고, 50k의 막에서 저분자(시약 및 염)를 제거하여 농축하였다. 그 때의 저분자의 제거상황은 수시로 HPLC로 파악하고, 저분자가 거의 제거된 것을 확인하고 한외여과를 종료하였다. 카르복시메틸덱스트란폴리알콜용액을 3,770㎖까지 농축하고, 그 1㎖를 동결건조한 것이 32.1㎎이였기 때문에, 수득량은 121g으로 산출되었다.
(B) 모세관 전기영동에 의한 카르복시메틸화도 측정-1
모세관 전기영동은 검출기로서 포토다이오드 어레이 190㎚-300㎚(검출195㎚), 모세관으로서 퓨즈드실리카제 내경 7.5㎛, 유효 길이 500㎜, 전체 길이 670㎚의 것을 이용하여, 전기영동액으로 20mM 4붕산나트륨 수용액을 이용하였다. 시료는 0.02%아지화나트륨수용액에서 2㎎/㎖로 조제하였다. 시료로서 반응시간 19시간, 19.5시간 및 20시간의 로트를 이용하였다. 검량선은 분해법으로 카르복시메틸화도가 0.22, 0.42 및 0.62로 확인된 3종류의 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 표준물질로서 이용하여 제작하였다. 각각의 보지시간(분)은 5.325, 5.400 및 5.446이었다. 이 결과에서 각각의 시료의 카르복시메틸화도는 0.38, 0.40 및 0.41이었다.
실시예 3: tert-부톡시카보닐(Boc)-Gly-Gly-Phe-Gly-의약화합물A의 합성
의약화합물A·메탄술폰산염(80g)와 tert-부톡시카보닐-Gly-Gly-Phe-Gly-OH(68g)을 N, N-디메틸포름아미드(1,200㎖)에 현탁하였다. 빙냉교반하에서, 트리에틸아민(48㎖), 1-에틸-3(디메틸아미노프로필) 카보디이미드염산염(EPCI·HCl, 29.6g) 하이드록시벤조트리아졸(HBT, 20.8g)을 첨가하여, 실온에서 교반하였다. 반응종점을 HPLC로 확인 후, 빙냉교반 하, 반응액에 물(80㎖)을 내온이 20℃이하로 유지되도록 30분간 적하하여, 결정을 석출하였다. 그 후, 다시 물(1,200㎖)을 적하하였다. 다음으로, 초산으로 용액의 pH를 7로 조정하였다. 석출된 고체를 여과하여 수세하고, 수득된 결정을 감압하에 건조하여 표제의 화합물(120.4g, 정량적)을 수득하였다.
1H-NMR(DMSO-d6/TMS)δ(ppm) : 0.97(3H, m), 1.11(2H, d, J=6.3Hz), 1.41(9H, s), 1.91(2H, m), 2.05(1H, m), 2.33(4H, m), 2.95-3.10(4H, m), 3.58-3.72(2H, m), 3.8(1H, m), 4.03(1H, m), 4.34(1H, m), 4.74(1H, m), 5.13(1H, m), 5.33(1H, m), 5.58(2H, m), 7.18(5H, m), 7.49(2H, m)
실시예 4: H-Gly-Gly-Phe-Gly- 의약화합물A·트리플루오로초산염의 합성
상기 실시예 3에서 수득한 tert-부톡시카보닐-Gly-Gly-Phe-Gly-의약화합물A(120g)에 트리플루오로초산(360㎖)을 빙냉하에서 적하하였다. tert-부톡시카보닐-Gly-Gly-Phe-Gly-의약화합물A를 완전히 용해한 후, HPLC에서 탈tert-부톡시카보닐 반응의 종료를 확인하였다. 이 반응액에 메탄올(360㎖) 및 이소프로필에테르(720㎖)를 내온이 0℃~15℃ 사이가 되도록 적하하였다. 석출한 결정을 여취하여 초산에틸(500㎖)에서 3회 세정하고, 수득된 결정을 내온 50℃이하에서 20% 함수메탄올(400㎖)로 용해하여 그 후, 초산에틸(400㎖)에 이어 이소프로필에테르(800㎖)를 첨가하여 재결정하였다. 이 결정을 여취하여 함수메탄올(400㎖)에 용해하고 활성탄(4.4g)을 첨가하여 탈색처리하였다. 상기용액을 여과하고, 여액에 초산에틸(400㎖)과 이소프로필에테르(800㎖)를 55℃이하에서 첨가하여 재결정하였다. 여과한 결정을 감압하에서 건조하여,H-Gly-Gly-Phe-Gly-의약화합물A(111.8g, 의약화합물A에서 산출하여 90%)을 수득하였다.
1H-NMR(DMSO-d6/TMS)δ(ppm) : 0.87(3H, m), 1.87(2H, m), 2.17(2H, m), 2.37(3H, m), 2.74(1H, m), 3.00(1H, m), 3.16(1H, m), 3.58(2H, s), 3.65-3.91(4H, m), 4.48(1H, m), 5.2(2H, s), 5.39(2H, m), 5.58(1H, m), 6.53(1H, s), 7.21(5H, m), 7.75(1H, d, J=10.9Hz), 8.06(2H, s), 8.28(1H, d, J=8.2Hz), 8.49(1H, m), 8.52(1H, m)
실시예 5: 본 발명의 DDS화합물의 합성
카르복시메틸덱스트란폴리알콜(800g)을 포함하는 수용액에 카르복시메틸덱스트란폴리알콜 수용액분과 합쳐 32L가 되도록 순수한 물을 첨가하고 또한, 메탄올(60L)을 첨가하였다. 이 혼합액에 실시예 4에서 수득한 H-Gly-Gly-Phe-Gly-의약화합물A(133g)와 하이드록시벤조트리아졸(23.4g)을 용해한 20%함수메탄올(4L)을 첨가하였다. 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카보디이미드염산염(33.1g)을 첨가하여, 1N NaOH에서 pH를 6.8~7.2로 조정하였다. 이 혼합물을 온실(23℃±5℃)에서 2~3시간 반응시켰다. 또한, 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필) 카보디이미드염산염(8.1g)을 첨가하여, 1N HCl에서 pH를 6.8~7.2로 조정하고, 이어서 2~3시간 정도 반응시켰다. 또한 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카보디이미드염산염(5.6g)을 첨가하고, 1N HCl에서 pH를 6.8~7.2로 조정하고, 이어서 1시간 정도 반응시켰다. 반응종료 후, 1N NaOH에서 반응액의 pH를 8.7~9.2로 조정하고, 10℃이하에서 보존하였다. 그 후, 한외여과막(50k)에서 용액을 탈염 및 농축하였다. 다음으로, 멤브레인필터로 정밀여과하여, 수득한 용액을 동결건조하고, 본 발명의 DDS화합물(880g)을 수득하였다.
실시예 6: 덱스트란폴리알콜의 저분자화에 대한 반응온도의 영향(산화반응)
기질농도 1%, 20g 스케일로 실시예 1에 따라 덱스트란의 산화반응을 행하였다. 반응온도를 4, 8, 12, 15℃로 설정하고, 반응시간을 변화시킨 때의 생성체의 겔여과 크로마토그래피에서의 보지시간을 측정하였다. 표 1에 나타나듯이, 반응온도 12℃ 및 15℃의 경우에, 6일째에는 저분자화에 의한 확실한 보지시간의 뒤떨어짐이 확인되었다. 8℃에 있어서도 10일째에는 확실한 보지시간의 뒤떨어짐을 확인할 수 있었다.
반응온도/시간 3일간 6일간 10일간
4℃ 10.46분 10.44분 10.53분
8℃ 10.52분 10.63분 10.83분
12℃ 10.45분 10.63분 -
15℃ 10.59분 10.92분 -
실시예 7: 덱스트란폴리알콜의 저분자화에 대한 반응온도의 영향(산화반응)
실시예 6의 결과에 근거하여, 온도변화를 더욱 세밀하게 설정(4℃, 1℃, 6.5℃)하여 동일한 실험을 하였다. 표 2에 나타낸 것과 같이, 모든 온도범위에서 저분자화가 일어나는 일 없이 반응은 진행되었으나, 1℃에서 반응시킨 경우에는, 반응계 중의 염의 석출이 많았다. 이상의 결과로부터 이 반응의 온도의 안전성은 2~6℃로 판단되었다.
반응온도/시간 3일간 6일간 10일간
4℃ 10.40분 10.39분 10.49분
1℃ 10.42분 10.39분 10.45분
6.5℃ 10.40분 10.36분 10.39분
실시예 8: 덱스트란폴리알콜의 저분자화에 대한 반응온도의 영향(환원반응)
실시예 1에 따라, 덱스트란의 산화반응에 이어 환원반응을 하였다. 반응온도를 10, 15, 20, 30℃로 설정하고, 12~24시간 반응시킨 후, 생성체의 겔여과 크로마토그래피에서의 보지시간을 측정하였다. 표 3에 나타내는 것과 같이, 반응온도가 15℃를 초과한다고 하는 확실한 저분자화가 인정되었다.
반응온도 겔여과 크로마토그래피에 따른 판정
10℃ 저분자화 없음
20℃ 약간의 저분자화
30℃ 저분자화
40℃ 현저한 저분자화
실시예 9: 카르복시메틸화도의 측정방법에 따른 DDS화합물의 카르복시메틸화도의 측정치변동
3종류의 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 표준물질로서 이용하여 분해법 및 NMR법으로 검량선을 작성하였다. 이 검량선을 이용하여 실시예 2의 (B)와 동일하게 하여, DDS화합물(3로트)의 카르복시메틸화도를 측정하였고, 결과를 이하에 나타내었다. NMR에서 구한 검량선을 이용하면, 어느 로트에 대해서도 카르복시메틸화도의 측정치가 분해법으로 구한 경우보다도 0.09 감소하였다.
표준물질(카르복시메틸덱스트란폴리알콜)의 카르복시메틸화도
표준물질 No.1 표준물질 No.2 표준물질No.3
분해법 0.333 0.439 0.584
NMR법 0.248 0.360 0.523
DDS화합물의 카르복시메틸화도
로트 1 로트 2 로트 3
분해법 0.36 0.37 0.37
NMR법 0.27 0.28 0.28
차이 △0.09 △0.09 △0.09
이하에 시험예를 나타내었다. 시험예 중에 나타낸 카르복시메틸화도는 분해법으로 구한 값이다.
시험예 1
(A) 방법
동물은 생후 6주의 수컷 BALB/c마우스(일본SLC주식회사)를 시판 사료 및 물을 자유롭게 섭취시켜, 1주간의 순화 후에 시험에 제공하였다. 종양세포는 마우스 종양세포 Meth A 선유육종을 같은 종의 마우스인 BALB/c의 복강내에서 1주 마다 계대유지하였다. 엔도톡신 농도 50pg/㎖이하의 행크스배지(HBSS, Gibco-BRL)를 이용하여 마우스의 복강내에서 종양세포를 채취하여, 수회의 원심조작(약 600rpm, 5~10분, 4℃)으로 세정한 후, HBSS배지에 부유하여 1 x 106/0.1㎖/마우스의 비율로 마우스 복강내에 이식하였다.
항종양시험에서는 Meth A세포를 1 x 106/0.1㎖/마우스의 비율로 마우스의 오른쪽 서경부(inguinal region)에 피하이식하고(dayO), 이식 후 7일 또는 12일에 노기스(caliper)로 측정한 종양의 장경(L) 및 단경(W)으로 산출한 측정종양중량(ETW = L x W2/2mg)의 그룹 평균이 약 100mg이 되도록 마우스를 6마리 또는 7마리로 구분지어, 검체를 1회 혹은 4일 마다 4회의 용법으로 정맥 내 투여하였다. 마우스를 종양이식 후 21일 또는 26일에 경추탈구(cervical dislocation)로 도살하여, 종양을 추출하고 그 중량을 측정하였다. 종양증식 억제효과(1R)는 IR=(1-TWt/TWc)x100(%)의 식을 이용하여 종양중량치에서 산출하였다(TWt, TWc는 각각 검체투여군 및 대조군의 평균종양중량). IR이 58%이상의 경우에 항종양효과를 유효로 판단하였다. 대조군과 검체투여군의 종양중량의 유의차검정은 더넷법(Dunnet method)으로 행하였다.
또한, 검체의 부작용의 강도를 평가하기 위해서 체중감소율(BWL) 및 사용마우스 수에 대한 독성사한 마우스 수와의 비(D/U)를 독성 파라미터로 설정하였다. BWL은 BWL은 BWL=(1-BWn/BWs)x100(%)의 식을 사용하고, 투여개시 시에 마우스의 평균체중(BWs) 및 n일째의 마우스의 평균체중(BWn)으로 산출하였다. 이 BWL의 최대치를 BWLmax로 하였다. 단, 투여개시일에 비교하여 체중감소가 인정되지 않는 경우는 BWLmax를 0이하(< 0)으로 나타냈다. 또한, 검체는 일본약국방주사용생리식염수에 용해하여, 투여액량 10 또는 20㎖/㎏을 정맥내 투여하였다.
(B) 결과
카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 분자량이 48,000~457,000인 DDS화합물(카르복시메틸화도 0.37~0.46, 약물도입량 4.6~6.4중량%)에 대해서 1회투여로 시험을 행여, 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 분자량이 200,000~300,000에서는 사용량이 안정되어 58%이상의 유의한 항종양효과가 확인되었으나, 분자량이 200,000미만에서는 최소유효량이 증대하였다. 또한, 분자량이 50,000미만의 경우에는 독성 및 항종양효과가 감소하는데, 이것은 뇨배설(urinary excretion)에 의한 것이다. 따라서, 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 분자량이 200,000이상이면, 사용량이 안정된 항종양효과를 얻을 수 있다고 결론지었다. 한편, 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 분자량이 500,000을 넘으면 점성 때문에 물리적 상해에 대한 안정성이 나쁘다는 문제점 등이 발생하였다. 이 결과들에서 DDS화합물에서 카르복시메틸덱스트란알콜의 분자량은 50,000~500,000의 범위의 것이 필요하며, 소망하는 항종양효과를 달성하고 안정된 제품을 제조하기 위해서는 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 플루란 표준중량 평균분자량이 240,000~480,000의 범위인 것이 바람직하다고 결론지었다.
시험예 2
생후 7주의 BALB/c계 수컷 마우스 69마리(일본SLC주식회사)를 1주간 순화하여, 1그룹 당 5마리로 카르복시메틸화도가 다른 DDS화합물(약물도입량 5.3~6.3 중량%, 분자량 270,000~330,000)을 투여하였다. 투여 시의 평균체중은 21.1 내지 25.4g이었다. 동물은 실온(23±2℃), 온도(55±20%), 조명시간12시간(8:00~20:00)으로 설정된 실내에서 알루미늄으로 제조된 우리에 5마리 씩 수용하고, 시판되는 고형사료(F2, 센쿄농장제) 및 염소첨가 상수도수를 자유롭게 섭취시켜서 사육하였다. DDS화합물은 일본약국방생리식염수에 용해하여, 1.02~1.36㎎/㎖의 농도로서 1㎖/㎏의 액량을 꼬리 정맥내에 투여하였다.
동물의 증상을 1일 1회, 투여일을 포함하여 15일간 관찰하여, 투여 전 및 투여 후 3, 7, 10 및 14일에 체중을 측정하였다. 사망예는 사망 발견 후 신속히 부검하고, 생존예는 투여 후 14일에 에테르 마취 아래에 복대동맥절단으로 방혈도살(bleeding to death)하여, 전신의 모든 장기를 육안으로 관찰하였다. 체중 데이터는 그룹 평균치 ±표준편차치를 산출하고, 그 후 유의수준 5%로 통계학적 해석을 하였다. 그 결과, 카르복시메틸화도가 0.38, 0.43 및 0.47의 DDS화합물의 최대내용량(MTD:maximum tolerant dose)은 각각 11.7, 11.7 및10.3㎎/㎏으로, 카르복시메틸화도가 0.43을 상회하면 독성이 강해지는 경향이 시사되었다. 또한, 카르복시메틸화도가 0.53의 DDS화합물을 이용하여 동일하게 독성을 평가한 결과, 10㎎/㎏투여 그룹에서 6마리 중 3마리가 사망하였으며, 체중감소 및 치사독성이 현저히 증강되었다. 한편, 카르복시메틸화도가 0.23의 DDS화합물의 MTD는 카르복시메틸화도가 0.38의 DDS화합물과 동일하였다. 따라서, 안전성의 면에서 DDS화합물의 카르복시메틸화도는 0.23~0.47의 범위가 바람직하다고 결론지었다.
시험예 3
상기 시험예 2와 동일하게 하여, 의약화합물 잔기의 도입량이 3.2~15중량%의 DDS화합물(카르복시메틸화도 0.37~0.40, 분자량 260,000~320,000)에 대해서 항종양시험을 실시하였다. 이 결과, 1.25㎎/㎏ 투여 그룹에서는 도입률 3.2~7.3 중량%의 범위에서 IR 80%이상으로 약효가 인정되었으나, 도입률이 8.4중량%를 상회하면(~15%의 범위까지) 약효가 이들보다도 분명하게 저하하는 경향이 인정되었다. 또한, 도입률 8.4중량%를 상회하는 경우에는 2.5 또는 5㎎/㎏ 투여 그룹에서 다른 복합체와 동등한 약효를 나타내지만, 10㎎/㎏ 투여 그룹에서 치사 독성의 증강이 인정되었다. 이 결과들에서, 소망하는 항종양효과를 달성하고, 안전성이 높은 DDS화합물을 제공하기 위해서는, 의약화합물 잔기의 도입량을 3.2~8.4중량%의 범위로 하는 것이 바람직하다고 결론지었다.
본 발명의 DDS화합물은 높은 안전성과 광범위한 약효를 가지고 있으며, 항종양제로서 임상에서 지극히 유용하다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 DDS화합물을 고품질에 효율적으로 고수율에서 제조할 수 있어, 공업화에 적당하다.

Claims (16)

  1. (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 1번 위치의 아미노기와 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복실기가 1개의 아미노산 또는 펩티드 결합한 2~8개의 아미노산으로 구성되는 스페이서를 개재하여 결합한 DDS화합물에 있어서,
    (1) (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 잔기의 도입량이 DDS화합물 전중량에 대해 3.2~8.4중량%의 범위이며,
    (2) 상기 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 플루란 표준중량 평균분자량이 240,000~480,000의 범위이고,
    (3) 상기 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복시메틸화도가 0.23~0.47의 범위인 것을 특징으로 하는 DDS화합물.
  2. (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 1번 위치의 아미노기와 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복실기가 1개의 아미노산 또는 펩티드 결합한 2~8개의 아미노산으로 구성되는 스페이서를 개재하여 결합한 DDS화합물에 있어서,
    (1) (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 잔기의 도입량이 DDS화합물 전중량에 대해 3.2~8.4중량%의 범위이며,
    (2) 상기 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 플루란 표준중량 평균분자량이 240,000~480,000의 범위이고,
    (3) 상기 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복시메틸화도가 0.14~0.47의 범위인 것을 특징으로 하는 DDS화합물.
  3. (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 1번 위치의 아미노기와 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복실기가 1개의 아미노산 또는 펩티드 결합한 2~8개의 아미노산으로 구성되는 스페이서를 개재하여 결합한 DDS화합물에 있어서,
    (1) (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 잔기의 도입량이 DDS화합물 전중량에 대해 3.2~8.4중량%의 범위이며,
    (2) 상기 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 플루란 표준중량 평균분자량이 240,000~480,000의 범위이고,
    (3) 상기 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 카르복시메틸화도가 0.14~0.38의 범위인 것을 특징으로 하는 DDS화합물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (3)에서 카르복시메틸화도가 표준물질인 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 분해법 또는 NMR법으로 측정함으로써 수득할 수 있는 검량선을 이용하여 모세관 전기영동법으로 측정된 카르복시메틸화도인 것 을 특징으로 하는
    DDS화합물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 (3)에서 카르복시메틸화도가 표준물질인 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 분해법으로 측정함으로써 수득된 검량선을 이용하여 모세관전기영동법으로 측정된 카르복시메틸화도인 것을 특징으로 하는
    DDS화합물.
  6. 제 3항에 있어서,
    상기 (3)에서 카르복시메틸화도가 표준물질인 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 NMR법으로 측정함으로써 수득된 검량선을 이용하여 모세관 전기영동법으로 측정된 카르복시메틸화도인 것을 특징으로 하는
    DDS화합물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 개시된 DDS화합물을 포함하는 항종양제.
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 개시된 DDS화합물의 제조방법으로서,
    (A) 덱스트란을 함유하는 수용액에 4℃±2℃의 온도에서 과요오드산나트륨을 함유하는 수용액을 첨가하여 덱스트란을 산화시킨 후, 수득된 반응액을 15℃이하의 온도에서 수소화 붕소나트륨을 함유하는 수용액에 첨가하여 덱스트란폴리알콜을 수득하는 공정;
    (B) 덱스트란폴리알콜에 모노클로로초산나트륨을 반응시켜 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 제조하는 공정으로서, 카르복시메틸화의 반응종점을 모세관 전기영동법으로 결정하는 것을 특징으로 하는 공정;
    (C) (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H,15H)-디온의 1번 위치의 아미노기와 α-아미노기가 tert-부톡시카보닐기로 보호된 1개의 아미노산의 α-아미노기 또는 N말단이 tert-부톡시카보닐기로 보호된 2~8개의 아미노산으로 구성되는 올리고펩티드의 C말단 카르복실기를 결합하는 공정으로, 축합제로서 1-에틸-3(디메틸아미노프로필)카보디이미드 또는 그 염을 이용하는 것을 특징으로 하는 공정; 및,
    (D) (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 1번 위치의 아미노기와 α-아미노기가 tert-부톡시카보닐기로 보호된 1개의 아미노산의 α-카복실기 또는 N말단이 tert-부톡시카보닐기로 보호된 2~8개의 아미노산으로 구성되는 올리고펩티드의 C말단 카르복실기를 결합한 축합체에서 tert-부톡시카보닐기를 제거하여 수득된 탈보호체와 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 축합한 공정으로서, 축합제로서 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카보디이미드 또는 그 염을 이용하는 것을 특징으로 하는 공정으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1이상의 공정을 포함하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 개시된 DDS화합물의 제조방법으로서,
    (A) 덱스트란을 함유한 수용액에 4℃±2℃의 온도에서 과요오드산나트륨을 함유한 수용액을 첨가하여 덱스트란을 산화시킨 후, 수득된 반응액을 15℃이하의 온도에서 수소화 붕소나트륨을 함유하는 수용액에 첨가하여 덱스트란폴리알콜을 수득하는 공정;
    (B) 상기 공정 (A)에서 수득된 덱스트란폴리알콜에 모노클로로초산나트륨을 반응시켜 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 제조하는 공정으로서, 카르복시메틸화의 반응종점을 모세관 전기영동법으로 결정하는 것을 특징으로 하는 공정;
    (C) (1S, 9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2, 3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H, 12H-벤조[de] 피라노[3', 4': 6, 7] 인돌리지노[1, 2-b] 퀴놀린-10, 13(9H, 15H)-디온의 1번 위치의 아미노기와 α-아미노기가 tert-부톡시카보닐기로 보호된 1개의 아미노산의 α-카복시기 또는 N말단이 tert-부톡시카보닐기로 보호된 2~8개의 아미노산으로 구성되는 올리고펩티드의 C말단 카르복실기를 결합하는 공정으로서, 축합제로서 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카보디이미드 또는 그 염을 이용하는 것을 특징으로 하는 공정; 및,
    (D) 상기 공정(C)에서 수득된 결합체에서 tert-부톡시카보닐기를 제거하여 수득된 탈보호체와 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 축합하는 공정으로서, 축합제로서 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카보디이미드 또는 그 염을 이용하는 것을 특징으로 하는 공정을 포함하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    DDS화합물의 제조에 이용하기 위한 플루란 표준중량 평균분자량이 240,000~480,000의 범위이며, 카르복시메틸화도가 0.23~0.47의 범위인것을 특징으로 하는
    카르복시메틸덱스트란폴리알콜.
  11. 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 있어서,
    DDS화합물의 제조에 이용하기 위한 플루란 표준중량 평균분자량이 240,000~480,000의 범위이며, 카르복시메틸화도가 0.14~0.47의 범위인 것을 특징으로 하는
    카르복시메틸덱스트란폴리알콜.
  12. 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 있어서,
    DDS화합물의 제조에 이용하기 위한 플루란 표준중량 평균분자량이 240,000~480,000의 범위이며, 카르복시메틸화도가 0.14~0.38의 범위인 것을 특징으로 하는
    카르복시메틸덱스트란폴리알콜.
  13. 제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 카르복시메틸화도가 표준물질인 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을분해법 또는 NMR법으로 측정함으로써 수득되는 검량선을 이용하여 모세관 전기영동으로 측정된 카르복시메틸화도인 것을 특징으로 하는카르복시메틸덱스트란폴리알콜.
  14. 제 10항에 있어서,
    상기 카르복시메틸화도가 표준물질인 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 분해법으로 측정함으로써 수득되는 검량선을 이용하여 모세관 전기영동으로 측정된 카르복시메틸화도인 것을 특징으로 하는
    카르복시메틸덱스트란폴리알콜.
  15. 제 12항에 있어서,
    상기 카르복시메틸화도가 표준물질인 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 NMR법으로 측정함으로써 수득되는 검량선을 이용하여 모세관 전기영동으로 측정된 카르복시메틸화도인 것을 특징으로 하는
    카르복시메틸덱스트란폴리알콜.
  16. 제 10항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 개시된 카르복시메틸덱스트란폴리알콜의 제조방법으로서,
    (A) 덱스트란을 함유한 수용액에 4℃±2℃의 온도에서 과요오드산나트륨을 함유한 수용액을 첨가하여 덱스트란을 산화시킨 후, 수득된 반응액을 15℃이하의 온도에서 수소화 붕소나트륨을 함유하는 수용액에 첨가하여 덱스트란폴리알콜을 수득하는 공정; 및,
    (B) 상기 공정 (A)에서 수득된 덱스트란폴리알콜에 모노클로로초산나트륨을 반응시켜 카르복시메틸덱스트란폴리알콜을 제조하는 공정으로서, 카르복시메틸화의 반응종점을 모세관 전기영동법으로 결정하는 것을 특징으로 하는 공정을 포함하는 방법.
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