EA007353B1 - pH-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ КОНЪЮГАТЫ АНТРАЦИКЛИНОВЫХ КАНЦЕРОСТАТИЧЕСКИХ АКТИВНЫХ АГЕНТОВ ДЛЯ ТЕРАПИИ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ - Google Patents

pH-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ КОНЪЮГАТЫ АНТРАЦИКЛИНОВЫХ КАНЦЕРОСТАТИЧЕСКИХ АКТИВНЫХ АГЕНТОВ ДЛЯ ТЕРАПИИ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ Download PDF

Info

Publication number
EA007353B1
EA007353B1 EA200400802A EA200400802A EA007353B1 EA 007353 B1 EA007353 B1 EA 007353B1 EA 200400802 A EA200400802 A EA 200400802A EA 200400802 A EA200400802 A EA 200400802A EA 007353 B1 EA007353 B1 EA 007353B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
amino acids
polymer
units
conjugates
antibodies
Prior art date
Application number
EA200400802A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200400802A1 (ru
Inventor
Карел Ульбрих
Томаш Этрих
Бланка Ржигова
Маркета Елинкова
Марек Коварж
Original Assignee
Зентива А. С.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Зентива А. С. filed Critical Зентива А. С.
Publication of EA200400802A1 publication Critical patent/EA200400802A1/ru
Publication of EA007353B1 publication Critical patent/EA007353B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Изобретение относится к конъюгатам, состоящим из полимерного носителя, включающего 30-3000 связанных мономерных единиц, формирующих полимерную цепь, включающих а) 60-98,5% N-(2-гидроксипропил)метакриламидных единиц, б) 1-25% единиц метакрилоилированных гидразонов α-аминокислот, ε-аминокислот, ароматических аминокислот или олигопептидов, заканчивающихся молекулой антрациклинового канцеростатика, в) 0,5-15% единиц метакрилоилированных α-аминокислот, ε-аминокислот, ароматических аминокислот, олигопептидов или их натриевых солей.

Description

Изобретение относится к полимерным противораковым препаратам, которые способны целенаправленно транспортироваться в организме и фокусироваться на определенных мишенях при терапии рака.
Предпосылки изобретения
Развитие новых лекарственных препаратов и их форм все чаще фокусируется на использовании полимерных веществ, особенно водорастворимых полимеров, как носителей этих препаратов. Был синтезирован и изучен ряд полимерных конъюгатов канцеростатических препаратов и растворимых полимеров, в которых противоопухолевый агент был связан с полимером нерасщепляемой ковалентной связью, гидролитически нестабильной ионной связью или ковалентной связью, подверженной ферментному или обычному гидролизу. Эта попытка была предпринята для того, чтобы синтезировать препараты с усовершенствованными фармакокинетическими и фармакодинамическими характеристиками, применяющимися в целенаправленной терапии рака. Полимерные препараты, синтезированные на основе сополимеров гидроксипропилметакриламида (НРМА), образуют важную группу. Противораковый агент в таких соединениях связан с полимерным И-(2-гидроксипропил)метакриламидным носителем посредством олигопептидной последовательности, расщепляемой под воздействием ферментов, синтезированной как субстрат для лизосомных энзимов (ферментов, представленных в клетках млекопитающих). Структура, синтез и свойства таких конъюгатов описаны в патенте [Иипсап, 1985]. Основные результаты в данной области обобщены Коресек с соавторами [Коресек е! а1., 2000]. Вышеуказанные полимерные препараты эффективны при воздействии на ряд опухолей у мышей и крыс. В настоящее время два полимерных конъюгата даже были испытаны клинически [Уакеу 1999 е! а1., 1и1уап е! а1., 1999, Тйошкоп е! а1., 1999]. Результаты таких клинических тестирований продемонстрировали, что конъюгаты доксорубицина обладают более низкой неспецифической токсичностью, чем несвязанный активный агент. Его максимально допустимое количество - 320 мг/м2, что в 4-5 раз превышает количество обычно использующегося в клинике несвязанного доксорубицина (60-80 мг/м2). Не отмечалось существенного влияния полимерного препарата на сердечные функции, хотя индивидуальное общее количество достигало 1680 мг/м2. Все другие виды токсичности, сопряженные с применением несвязанных антрациклиновых антибиотиков ненаправленного действия, были существенно ниже. Одним из недостатков клинически исследованных полимерных конъюгатных препаратов является относительно низкая специфичность воздействия, так как такие конъюгаты либо вообще не содержат мишень, как, например, РК1, либо содержат углевод с относительно низкой специфичностью (галактозамин в РК2 конъюгате, где тестировалась способность направлять полимерный препарат к печени). Следовательно, разрабатываются конъюгаты, в которых достигают направленного специфического действия благодаря присоединению специфической молекулымишени (например, антитела, лектин, гормон роста, трансферин и т.д.) к молекуле-носителю.
Другим недостатком клинически тестированных конъюгатов, включая поли(НРМА) и доксорубицин, является тот факт, что препарат в его фармакологически активной форме высвобождается из таких конъюгатов только в клетках благодаря ферментной реакции, происходящей в лизосомах. Это означает, что препарат эффективен только в клетках с высокой концентрацией лизосомных ферментов - пептидаз. Еще один недостаток - сравнительно сложная структура конъюгата, требующая включения последовательности, от которой препарат отделяется с помощью пептидаз, как правило, тетрапептидного звена С1уРйеЕеиС1у, что делает синтез более дорогостоящим и сложным.
На сегодняшний день достаточно информации о приготовлении и изучении свойств полимеров, к которым канцеростатик присоединен посредством связи, подвергающейся гидролизу в водной среде. Результаты обобщены Кга1х |Кга1х е! а1., 1999]. Природные макромолекулы, такие как альбумин, декстраны, трансферин, альгинаты или антитела, наиболее часто использовались как носители канцеростатических активных агентов. Синтетические полимерные носители полиэтиленгликоль и полиглютамины использовались в некоторых случаях. Препараты были присоединены к носителю посредством связей, обеспечивающих гидролитическое высвобождение активного агента во внеклеточное пространство и внутрь клеток. В случае доксорубицина (Иох) связь наиболее часто была образована эфирами цис-аконитовой кислоты или гидразоном. Однако ίη у1уо тестирования всех вышеупомянутых рН-чувствительных конъюгатов на животных не привели к убедительным результатам. Следовательно, ни один из полимерных конъюгатов не использовался и клинически не испытывался для лечения опухолей.
Полимерные канцеростатики, разработанные авторами настоящего изобретения и синтезированные на основе сополимеров НРМА и канцеростатических агентов, присоединенных рН-чувствительной гидразоновой связью, как было показано в тестах ίη у1уо и ίη уйто на мышах, обладают большей эффективностью в отношении ряда опухолевых линий, чем конъюгаты с активным агентом, который связан с полимерным носителем с помощью связи, расщепляемой под действием ферментов, посредством олигопептидного звена. Синтез таких конъюгатов по сравнению с синтезом конъюгатов с поли(НРМА), разработанных ранее, более прост и легок и менее дорогостоящий, поскольку в качестве связующего звена можно использовать только одну аминокислоту вместо олигопептидной последовательности, способной расщепляться под действием ферментов, и присоединеие активного агента к полимеру представляет собой простую реакцию. Активный агент высвобождается в результате изменения рН среды, и, следова
- 1 007353 тельно, присутствие лизосомных ферментов не является существенным. Скорость такого высвобождения (и, следовательно, мгновенная концентрация цитостатика) существенно выше, чем у конъюгатов, содержащих последовательности, разрушаемые ферментами [ΚίΕονά с1 а1., 2001, Е1гус11 е1 а1., 2001].
Сущность изобретения
В соответствии с изобретением получены линейные и разветвленные полимерные конъюгаты доксорубицина, дауномицина, фарморубицина и других антрациклиновых канцеростатических активных агентов, содержащих карбонильную группу с сополимерами, синтезированными на основе Ы-(2-гидроксипропил)метакриламида (НРМА), и в ряде случаев с антителами, их фрагментами или неспецифическими иммуноглобулинами (фиг. 3). Характерным для этих конъюгатов является то, что полимерный носитель вместе с антителом (иммуноглобулином) обеспечивает продолжительную циркуляцию полимерного препарата в кровеносных сосудах и последующее пассивное или активное накопление препарата в опухоли. Противораковый агент соединен с носителем связью, устойчивой в кровеносных сосудах (при рН=7,4). После того как препарат соединен с полимером, канцеростатик теряет свое биологическое действие и в неактивной форме транспортируется по кровеносным сосудам. Цитотоксический препарат активируется лишь внутриклеточно, в органеллах клеток-мишеней, так как рН уменьшается и связь между препаратом и полимером гидролизуется. Конъюгаты состоят из полимерного носителя, содержащего 303000 связанных мономерных единиц, формирующих полимерную цепь, включающих 60-99% Ы-(2-гидроксипропил)метакриламидных единиц, 1-25% единиц метакрилоилированных гидразонов «-аминокислот, ε-аминокислот, ароматических аминокислот или олигопептидов, заканчивающихся молекулой антрациклинового канцеростатика (предпочтительно доксорубицина), и 0,5-15% единиц метакрилоилированных α-аминокислот, ε-аминокислот, ароматических аминокислот, олигопептидов или их натриевых солей, также полимерный носитель может включать 0,5-10% единиц метакрилоилированных гидразидов α-аминокислот, ε-аминокислот, ароматических аминокислот или олигопептидов, а также конъюгат может содержать 0,5-5% метакрилоилированных α-аминокислот, ε-аминокислот, ароматических аминокислот, олигопептидов, заканчивающихся молекулой иммуноглобулина или специфического моно- либо поликлонального антитела.
Помимо вышеуказанных единиц, разветвленные макромолекулярные структуры также содержат 0,1-5% единиц, образующих звенья, соединяющие отдельные полимерные цепи в разветвленную макромолекулярную структуру, эти звенья представляют собой ферментативно расщепляемые метакрилоилированные олигопептиды, преимущественно трипептиды С1уРЕеС1у, С1уЬеиС1у либо тетрапептид С1уРйеЬеиС1у, связанные диаминами (этилендиамином, гексаметалендиамином).
Характерной особенностью полимерных конъюгатов с направленным противоопухолевым действием согласно изобретению является связь между активным агентом - цитостатиком - и полимерным носителем посредством гидразоновой группы, которая образуется в результате реакции между карбонильной группой молекулы активного агента и гидразидной группой полимера. Присоединение активного агента к полимерному носителю существенно увеличивает молекулярный вес препарата, что приводит к увеличению времени циркуляции в крови и продлевает присутствие активного агента в организме. Связь между активным агентом и полимером относительно устойчива во время транспортировки препарата по кровеносным сосудам и гидролитически расщепляется в слабокислой среде внутри клеток, в частности в клеточных органеллах, характеризующихся кислым рН. Это означает, что активный агент, связанный с полимером, транспортируется по кровеносным сосудам в неактивной форме, а высвобождается и активируется лишь после проникновения в опухолевые клетки-мишени. Активация препарата в клеткахмишенях устраняет побочные эффекты токсичных цитостатиков и фокусирует их воздействие преимущественно на опухолевых клетках. Полимерный носитель на основе сополимеров НРМА отвечает за целенаправленный транспорт к опухоли либо опухолевым клеткам. Когда используется разветвленный высокомолекулярный поли(НРМА)-носитель, полимерный препарат накапливается в ткани опухоли, что обусловлено пассивной направленной доставкой препарата и эффектом повышенной проницаемости и удерживания (ЕРК). Полимер может быть выведен из организма благодаря последующему ферментному расщеплению олигопептидных звеньев в виде более коротких полимерных цепочек, например, с помощью гломерулярной фильтрации. В носителях, содержащих антитела (иммуноглобулин), антитело связано с носителем через гидразоновую связь, которая образуется в реакции между альдегидными группами, введенными в Рс фрагмент антитела с помощью окисления периодатом натрия, и гидразоновыми группами носителя. Антитело (иммуноглобулин) может также быть соединено с цепочкой полимерного носителя с помощью бифункциональных агентов. В этом случае молекулу антитела модифицируют реакцией с 2-иминотиоланом (введение -8Н групп), малеимидные группы вводят в полимер с помощью реакций гидразидных групп полимера с сукцинимидным эфиром 3-малеимидпропионовой кислоты, затем происходит конъюгация благодаря взаимодействию -8Н группы антитела с двойной связью малеимидной группы полимера. Аналогично, конъюгация может также быть инициирована другими бифункциональными агентами, такими как Ν-гидроксисукцинимидный эфир 3-(2-пиридилдитио)пропионовой кислоты (8РЭР), которые могут быть использованы для конъюгирования антитела (иммуноглобулина). содержащего -8Н группу, непосредственно с гидразидными группами полимерного носителя.
- 2 007353
Конъюгат с антителом (иммуноглобулином) накапливается в органах/тканях-мишенях пассивно и активно. Пассивное накопление обусловлено высоким молекулярным весом конъюгата и так называемым эффектом повышенной проницаемости и удерживания, активное накопление обеспечивается процессом, в котором связывающий сайт антитела взаимодействует с соответствующими рецепторами на поверхности клеток-мишеней. В последнем случае сополимер НРМА играет роль носителя и защитной оболочки, существенно уменьшая иммуногенность гликопротеина в конъюгате.
Полимерный препарат согласно этому изобретению может быть использован в трех формах, различающихся по структуре. Первая структура представлена линейным полимерным конъюгатом с активным агентом без антитела (иммуноглобулина) и изображена на фиг. 1, где для биологических экспериментов предпочтительно использовали конъюгат, где х=94 мол.%, а=3 мол.%, Ь=2 мол.%, с=1 мол.%, Х=АВ или АК при использовании аминокислот и 61уРйеЬеи61у при использовании олигопептида. В представленной на фиг. 1 структуре Х=а-аминокислота, ε-аминокислота, ароматическая аминокислота, олигопептид. Вторая структура является высокомолекулярной и представляет собой разветвленною полимерную структуру с олигопептидными звеньями, расщепляемыми под действием биологических агентов, как показано на фиг. 2, где предпочтительный молекулярный вес конъюгата - 120000 г/моль. Содержание сшивки, доксорубицина (Ό0Χ), гидразоновых и карбоксильных групп - 0,5, 9, 2 и 2 мол.% соответственно. Третья структура включает также молекулу направленного действия на мишень (иммуноглобулин) (фиг. 3). Для биологических экспериментов предпочтительно использовали конъюгат, где х=92 мол.%, а=3 мол.%, Ь=0,7 мол.%, с=2 мол.%, 6=2,3 мол.%, Х=АВ или АК при использовани аминокислоты в качестве спейсера и С1уРйеЬеиС1у при использовании олигопептида. В представленной на фиг. 3 структуре Х=а-аминокислота, ε-аминокислота, ароматическая аминокислота, олигопептид, 8 для макромолекулярного полимера является биорасщепляемым олигопептидным звеном, представляющим собой С1уЬеиС1у, С1уРйеС1у, С1уРйеЬеиС1у или аналогичную последовательность и соединяющим другие полимерные цепи.
Получение линейных полимерных препаратов без антител осуществляется посредством нескольких реакционных стадий. Первая стадия включает получение полимерного предшественника I, как показано на фиг. 4 (Х=а-аминокислота, ε-аминокислота, ароматическая аминокислота, олигопептид), являющегося сополимером НРМА и метакрилоилированных химически активных эфиров (4-нитрофениловых эфиров, Ν-гидроксисукцинимидных эфиров и т.д.) аминокислот или олигопептидов, вторая стадия, ведущая к получению полимерного предшественника II, включает гидразинолитическую трансформацию концевых эфирных групп в гидразиды. На третьей стадии канцеростатик, содержащий кетоновую группу, присоединяют к гидразидным группам посредством гидразоновой связи.
Получение разветвленного полимерного препарата начинают с получения полимерного предшественника I, содержащего ферментативно расщепляемый олигопептид в боковой цепи, преимущественно С1уР11еС1у. С1уЬеиС1у, С1уРйеЬеиС1у, С1уЬеиРйеС1у. На второй стадии осуществляют легкое разветвление полимера с помощью реакции полимерного предшественника I и алкилендиамина (этил, бутил, гексил) и последующий гидразинолиз гидразингидратом, как описано в предыдущем случае.
Препараты с антителами (иммуноглобулином) могут быть приготовлены из двух предыдущих типов препаратов последующей реакцией с антителом (иммуноглобулином), в структуру которого предварительно были введены альдегидные группы посредством мягкого окисления с помощью КЮ4 или +1Ю|, либо путем их конъюгации с антителом (иммуноглобулпном) с использованием бифункциональных агентов, как описывалось выше.
Это изобретение может быть использовано для получения полимерных препаратов для лечения различных типов опухолей у людей.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показана структура полимерного конъюгата с активным агентом без антител.
На фиг. 2 представлена схема получения и структура разветвленных макромолекулярных конъюгатов с биорасшепляемыми олигопептидными звеньями.
На фиг. 3 показана общая структура полимерного конъюгата с активным агентом с антителом.
На фиг. 4 показаны структуры полимерных предшественников.
Фиг. 5 демонстрирует измерение скорости высвобождения доксорубицина из полимеров, отличающихся составом спейсера, А) при моделировании рН среды эндосом (рН 5); В) при моделировании рН крови (рН 7,4). Содержание активного агента в конъюгата - 10 вес.%.
Фиг. 6 демонстрирует результат сравнения ίη νίίτο ингибирующей активности конъюгатов, содержащих активный агент, присоединенный посредством различных звеньев; протестирована лейкемическая линия мыши ЕЬ4 (Т-клеточная лимфома ЕЬ4).
Фиг. 7 демонстрирует результат сравнения ίη νίνο ингибирующей активности конъюгатов, содержащих активный агент, присоединенный посредством различных звеньев; протестирована лейкемическая линия К 562.
- 3 007353
Фиг. 8 демонстрирует результаты исследования противоопухолевой активности ίη νΐνο конъюгатов, содержащих гидролитически высвобождаемый доксорубицин (защитный режим); Т-клеточная лимфома ЕЬ4: 105 клеток/мышь.
Примеры
Пример 1. Получение линейного полимерного препарата, не содержащего антител, на основе доксорубицина.
Синтез полимерного препарата осуществляют за четыре этапа. На первом этапе получают мономеры, Ы-(2-гидроксипропил)метакриламид (НРМА) и 4-нитрофениловые эфиры метакрилоилированной аминокислоты или олигопептида (ΜΑ-Χ-ΟΝρ). Вторым этапом было получение полимерного предшественника I радикальной сополимеризацией НРМА и ΜΑ-Χ-ΟΝρ. На третьем этапе получают полимерный предшественник II путем гидразинолиза полимерного предшественника I и на последнем этапе осуществляют присоединение доксорубицина (Όοχ) к этому полимерному предшественнику.
Получение мономеров.
НРМА получают методом, описанным ранее |и1Ьпс11. 2000]. Метакрилоилированные реакционноспособные сложные эфиры получают метакрилоилированием соответствующей аминокислоты или олигопептида (Х=С1у, ди-С1у, С1уЕсиС1у, С1уРйеС1у, С1уРйеЕеиС1у, β-аланина, ε-аминокапроновой кислоты (АКар), парааминобензойной кислоты (АВ) и т.д.) реакцией Шоттена-Баумана и последующей реакцией полученного производного метакриловой кислоты с 4-нитрофенолом в присутствии дициклогексилкарбодиимида (ΏΟΟ).
Протокол получения 4-нитрофениловых эфиров метакрилоилированных ε-аминокислот.
Способ получения мономеров ΜΑ-Ο1ν-ΟΝρ, ΜΑ-Ο1νΟ1ν-ΟΝρ и ΜΑ-ΑΒ-ΟΝρ одинаков для всех трех случаев. Способ получения ΜΑ-ΑΒ-ΟΝρ описан ниже.
ΜΑ-ΑΒ-ΟΝρ.
0,024 моля (3,34 г) парааминобензойной кислоты растворяют в трехгорлой колбе в 15 мл раствора из 0,024 молей (0,97 г) гидроксида натрия. 0,024 моля (2,55 г) хлорангидрида метакриловой кислоты и 0,024 молей (0,97 г) раствора гидроксида натрия в 10 мл воды одновременно добавляют по каплям к водному раствору натриевой соли аминокислоты при перемешивании и охлаждении (5°С). В процессе реакции рН реакционной смеси не должен превысить рН 9. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч, а затем подкисляют до рН 2, получившийся белый осадок фильтруют на стеклянном фильтре 84. Продукт очищают кристаллизацией из смеси воды с этиловым спиртом.
4-Нитрофениловый эфир получают путем реакции 0,014 молей (2,85 г) Ν-метакрилоила 4аминобензойной кислоты с 0,014 молями (1,93 г) 4-нитрофенола в диметилформамиде при -10°С в присутствии 0,0153 молей (3,16 г) дициклогексилкарбодиимида. Реакция длится 10 ч, после чего осажденную дициклогексилмочевину фильтруют и продукт очищают кристаллизацией из смеси ацетона с водой. Другие два 4-нитрофениловых эфира (ΜΑ-Χ-ΟΝρ) получают аналогичным способом.
Метакрилоилированные производные СБЕ-еиСЕ, С1уРйеС1у, С1уРйеЕеиС1у, β-аланина и ε-аминокапроновой кислоты также получают метакрилоилированием олигопептидов или кислоты, однако, во время подкисления водной фазы, производные метакриловой кислоты следует экстрагировать в этилацетат и выделить кристаллизацией. Соответствующие реакционноспособные сложные эфиры (ΟΝρ сложные эфиры) получают аналогично ΜΑ-ΑΒ-ΟΝρ, за исключением того, что реакционной средой для этерификации МА-С1у^еиС1у-ΟΗ и ΜΑ-С1уРйе^еиС1у-ΟΗ является тетрагидрофуран.
Получение полимерного предшественника I.
г смеси НРМА (95 мол.%, 0,89 г) и МА-ΑΒ-ΟΝρ (5 мол.%, 0,11 г) и 0,048 г азобисизобутиронитрила растворяют в 6,95 г ацетона и раствор помещают в ампулу для полимеризации. После продувания полимеризационной смеси азотом ампулу герметизируют и проводят полимеризацию при 50°С в течение 24 ч. Осажденный полимер фильтруют, трижды промывают ацетоном и диэтиловым эфиром и сушат в вакууме. Структура боковых цепей, заканчивающихся реактивными -ΟΝρ группами (строение сополимера), зависит от состава исходных продуктов для полимеризации (соотношения мономеров). Тот же процесс используют для приготовления всех полимерных промежуточных продуктов, различающихся по составу боковых цепей.
Получение полимерного предшественника II.
Сополимер поли(НРМА-со-МА-АВ-ННХН2) получают путем реакции полимерного предшественника I с гидратом гидразина. 300 мг полимерного предшественника I (1,3 х 10-4 моля ΟΝρ) растворяют в мл метанола и раствор 69 мг ΝΗ2ΝΗ2Η2Ο в 1 мл метанола (1,3 х 10-3 моля, 10-кратный избыток по сравнению с ΟΝρ) добавляют при интенсивном перемешивании. Реакционную смесь выдерживают в течение ч, чтобы прошла реакция, после чего раствор в метаноле разбавляют дистиллированной водой до 30 мл и продукт очищают от низкомолекулярных примесей, используя диализ против дистиллированной воды (в течение 2 дней). Конечный продукт выделяют из водного раствора лиофильной сушкой. Молекулярную массу (Μν) и полидисперсность полимера определяют гель-хроматографией со светодисперсионным детектором. Количество гидразидных групп определяют спектроскопией с последующей реакцией гидразидных групп с ΤΝΒ8 (тринитробензолсульфоновой кислотой). Промежуточные продукты, содер
- 4 007353 жащие другие аминокислоты и олигопептиды, получают таким же образом. Полимерные промежуточные продукты II также получают радикальной осадительной сополимеризацией соответствующего метакрилоилированного олигопептида Ν-трет-бутилоксикарбонилгидразида или соединения аминокислота(поли(НРМА-со-МЛ-Х-ПНПН-ВОС)) с НРМА при условиях, описанных выше. После удаления защитной ВОС группы из поли(НРМА-со-МА-Х-NНNН-ΒΟС) трифторуксусной кислотой полимерные промежуточные продукты II осаждают в смесь ацетона и диэтилового эфира, растворяют в воде, диализуют против воды и подвергают лиофильной сушке.
Присоединение доксорубицина к полимерному предшественнику.
250 мг полимерного предшественника II (поли(НΡΜΑ-СΟ-ΜΑ-ΑΒ-NНNН2) (0,1 ммоль ΝΗΝΗ2) растворяют в 3 мл метанола. Этот раствор полимера добавляют к 23 мг Όοχ. НС1 (40 мкмоль). К реакционной смеси добавляют 2 капли уксусной кислоты и неоднородный раствор перемешивают при комнатной температуре (в темноте). После реакции в течение 48 ч однородный раствор дважды очищают гельфильтрацией для отделения свободного Όοχ в колонке, заполненной 8ерйабех ЬН-20 в метаноле. Полимерную фракцию выделяют и концентрируют в вакуумном испарителе. Продукт повторно осаждают из метанола диэтиловым эфиром и сушат до постоянного веса. Содержание Όοχ и гидразидных групп определяют спектроскопией (λ=480 нм, ε=11500 л моль-1 см-1, вода) и методом ΤΝΒδ, соответственно. <Μν> и распределение молекулярной массы определяют жидкостной хроматографией (колонка 8ирегоке™6 (300х10 мм), 0,3 М ацетатный буфер (СН3СООNа/СН3СООН; рН 6,5; 0,5 г/л ΝαΝ3), скорость потока 0,5 мл/мин, детекция дифференциальным рефрактометром, светодисперсионный детектор (ΌΑ^Ν-ΌδΡ-Ρ, \Уу;Ш Тес11по1оду. США) и ультрафиолетовый детектор (280 и 488 нм). Вышеописанный метод используют для получения всех остальных полимерных конъюгатов доксорубицина.
Пример 2. Получение разветвленного макромолекулярного конъюгата.
400 мг полимерного предшественника I, содержащего олигопептидные последовательности С1уРйеС1у, С1уЬеиС1у или С1уРйеЬеиС1у (0,19 ммоль ΟΝρ) растворяют в 1,1 мл диметилсульфоксида. 105 мкл 0,2 М раствора 1,2 этилендиамина в диметилсульфоксиде (21 мкмоль ΕΌΑ) добавляют при энергичном перемешивании и реакционную смесь оставляют для прохождения реакции при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавляют раствор 100 мг гидрата гидразина (2 ммоль) в 0,3 мл диметилсульфоксида при интенсивном перемешивании раствора полимера и в течение последующих 3 ч реакционную смесь продолжают энергично перемешивать. Затем реакционную смесь разбавляют дистиллированной водой до 30 мл и очищают продукт диализом против дистиллированной воды (2 дня). Высокомолекулярный предшественник подвергают лиофильной сушке. <М2.-> и распределение молекулярной массы определяют жидкостной хроматографией, содержание гидразидных групп определяют спектроскопически и методом ΤΝΒδ. Доксорубицин присоединяют к полимеру и характеристики конъюгата определяют при тех же условиях, которые описаны в примере 1.
Пример 3. Получение конъюгата I с антителом (иммуноглобулином).
Сополимер, содержащий гидразидные и малеимидные группы (МЦ (поли(НРМА-со-МА-Х-ХНХН2СО-ΜΑ-Χ-ΝΗΝΗ-Μ!)) в боковых цепях, получают частичной модификацией гидразидных групп полимерного предшественника II, содержащего от 10 до 15 мол.% гидразидных групп, с использованием Νгидроксисукцинимидильного эфира малеимидилпропионовой кислоты (δΜΡ). 250 мг предшественника II поли(НРМА-со-МА-ди-С1у-ХНХН2) (125 ммоль гидразидных групп) растворяют в 1,2 мл диметилсульфоксида и добавляют раствор 16,6 мг δΜΡ (62,5 ммоль) в 0,6 мл диметилсульфоксида. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 8 ч. После очистки на колонке ΡΌ-10 (элюент - дистиллированная вода) определяют <М2.-> и распределение молекулярной массы жидкостной хроматографией, определяют количество малеимидных групп модифицированным тестом Эллмана и определяют содержание оставшихся гидразидных групп методом ΤΝΒδ. Доксорубицин связывают с этим сополимером таким же способом, как описано в примере 1.
Введение -δΗ групп в молекулу антитела (иммуноглобулина).
мг антител (поликлонального антитимоцита ^С) (0,1 мкмоль) помещают в 1 мл фосфатного буфера (0,05 М ΝαΗ2ΡΟ.1/Να2ΗΡΟ.1; 0,1 М №С1; 0,01 М ΕΌΤΑ; рН 7,4) в колонку ΡΌ-10. 0,67 мг 2-иминотиолана (4 мкмоль) растворяют в 50 мкл диметилформамида и добавляют к раствору антител при сильном перемешивании. Через 2,5 ч перемешивания при комнатной температуре продукт выделяют гельфильтрацией в колонке ΡΌ-10 (фосфатный буфер, рН 7,4). Уровень модификации антитела (иммуноглобулина) определяют методом с использованием реакции -δΗ групп с реактивом Эллмана. Конъюгацию 60 мг поли(ΗΡΜΑ-сο-ΜΑ-ди-С1у-NΗN=^οx-сο-ΜΑ-X-NΗNΗ2-сο-ΜΑ-X-NΗNΗ-Μ), содержащего доксорубицин, гидразидные и малеимидные группы, с 20 мг модифицированных антител проводят в фосфатном буфере при рН 7,4 (см. выше) при комнатной температуре. Конечный продукт очищают гельфильтрацией и его характеристики определяют ультрафиолетовой спектроскопией (содержание Бох), аминокислотным анализом (содержание антител и иммуноглобулина) и электрофорезом с использованием ΡΙιακΙίΛ'κΚιη - Ρΐιαηηααα ЬКВ (наличие свободного белка или активного агента).
- 5 007353
Пример 4. Получение конъюгата II с антителом (иммуноглобулином).
На первом этапе синтеза полимерный предшественник II модифицируют 8ΡΌΡ (бифункциональный кросслинкер) при условиях, сходных с теми, при которых в примере 3 проводят модификацию полимера 8ΜΡ.
К раствору 42 мг поли(НРМА-со-МА-ди-61у-МНН=Пох-со-МА-ди-61у-МНМН2-со-МА-ди-61у-ЫНМН-РП) (с содержанием 3,3 мкмоль пиридилтио-(РЭ) групп) в 0,6 мл буфера добавляют 14 мг антител, иммуноглобулина (см. выше), модифицированного -8Н группами, содержащих 0,68 мкмоль -8Н групп, растворенных при перемешивании в 1,7 мл фосфатного буфера (0,05 М ΝαΗ2ΡΟ4/Να2ΗΡΟ4; 0,1 М ЫаС1; 0,01 М ΕΌΤΆ; рН 7,4). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 7 ч, после чего низкомолекулярные вещества и несвязанный полимер удаляют гель-фильтрацией. Затем конъюгат концентрируют ультрафильтрацией и определяют его характеристики способом, аналогичным описанному в примере 3.
Пример 5. Получение конъюгата III с антителом (иммуноглобулином).
Эти конъюгаты получают взаимодействием антител с молекулами, в которые были введены альдегидные группы мягким окислением периодатом натрия гидразидных групп, оставшихся после реакции полимерного предшественника II с доксорубицином.
Получение окисленных антител.
мг антител (поликлональный антитимоцит !§С) помещают в ацетатный буфер (0,02 М СНзСООNа/ СН3СООН; 0,15 М №С1; рН 5) с помощью колонки ΡΌ-10. 0,1 М раствор №1Ю4 готовят в том же буфере в темноте.
Растворы антител и периодата смешивают в отношении 4:1 для получения конечных концентраций №1Ю( и антител 0,02 моль/л и 9 мг/л, соответственно. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в темноте в течение 2 ч, после чего добавляют 25 мкл этиленгликоля на каждый мл реакционной смеси. Через 20 мин окисленные антитела (иммуноглобулин) очищают и выделяют жидкостной хроматографией на колонке ΡΌ-10. Концентрацию антител (иммуноглобулина) в растворе определяют спектрофотометрией. Количество альдегидных групп определяют методом, использующим реакцию альдегидных групп с красителем ЬисЦсг Ус11о\у СН.
Пример приготовления пробы конъюгата.
36,5 мг окисленных антител в 5 мл ацетатного буфера (0,02 М СНзСОΟNа/СНзСООН; 0,15 М №С1; рН 5) после охлаждения до 15°С смешивают с раствором 73 мг полимерного предшественника II со связанным Эох. поли(ΜА-со-ΜА-ди-С1у-NНN=^оx-со-ΜА-ди-С1у-NНNН2), растворенного в 1 мл буфера. Реакционную смесь перемешивают при 15°С в темноте в течение 16 ч. Через 16 ч доводят рН реакционной смеси до 7,2 с помощью 0,1 М №1ОН. Низкомолекулярные вещества и несвязанный полимер удаляют гель-фильтрацией. Затем конъюгат концентрируют и определяют его характеристики тем же способом, как характеристики других конъюгатов с антителами (иммуноглобулином).
Для конъюгации с полимерами используют неспецифический иммуноглобулин человека и кролика ОдС), поликлональные антитимоцитные антитела (АТС), моноклональные антитела анти-Тйу 1.2, антиСЭ4, анти-СЭ71, анти-ВСЫ, анти-СО4, анти-СП8, анти-СП14 и другие антитела против опухолеспецифических антигенов (анти-ТАА).
Пример 6. Высвобождение доксорубицина из полимерного конъюгата ίη νίίΓΟ.
Гидролитическую стабильность конъюгатов и скорость высвобождения активного агента из полимера измеряют в модельных системах при различных рН и температурах. На фиг. 5 показаны результаты измерения скорости высвобождения доксорубицина из полимеров, различающихся составом спейсера, при кислотности среды, соответствующей рН крови (7,4), и при кислотности среды, соответствующей рН среды эндосом или лизосом (рН 5-6). Концентрация связанного Эох (0,5 ммоль/л) в ацетатном буфере 0,1 М в экспериментах является постоянной (СН3СООМа/СН3СООН, 0,05 М №1С1). Образцы инкубируют при 37°С в темноте и порции по 0,1 мл забирают через заданные интервалы и анализируют методом ВЭЖХ после экстракции Эох из раствора. Результаты показывают, что структура связующего звена между лекарственным средством и полимерным носителем влияет на скорость отделения активного агента от носителя. Скорость высвобождения является относительно низкой при рН крови и более чем в 10 раз выше при рН, соответствующем клеточной среде. Принимая во внимание факт, что период задержки активного агента в кровеносных сосудах является относительно коротким, эксперимент подтверждает относительную устойчивость полимерных конъюгатов во время транспортировки и их способность к высвобождению активного агента сразу после его проникновения в клетки.
Пример 7. Цитотоксическая активность ίη νίΙΐΌ полимерных конъюгатов, содержащих доксорубицин, гидролитически высвобождаемый в клетках с нормальным содержанием лизосом (фиг. 6).
Способность полимерных конъюгатов снижать деление клеток или пролиферацию клеток-мишеней называют цитотоксической или цитостатической активностью. Цитотоксическую активность определяют ίη νίΙΐΌ путем ингибирования инкорпорации 3Н-тимидина в ядра клетки-мишени |ЙПю\'а и др., 2000]. Инкорпорация тимидина и активность конъюгатов обратно пропорциональны. Низкая инкорпорация тимидина означает высокую цитотоксическую активность тестируемых веществ. Клетки отобранных линий опухоли (Т-лейкемическая линия мыши ЕЬ4, клеточная В-лейкемия мыши ВСЬ1, В-клеточная лимфома
- 6 007353 мыши 38С13, первичная колоректальная карцинома человека 8А480. метастазирующая колоректальная карцинома человека 8А620. колоректальная карцинома человека 8А620. генетически модифицированная геном мыши для Тйу 1.2 8А620/Т) и спленоцитов мыши. стимулированных Т-клеточным митогеном. то есть конканавалином А. и периферические лимфоциты человека закапывают из пипетки в количествах 1 х 104 - 5 х 105 (в зависимости от тестируемых клеточных систем) в среду для выращивания ΚΡΜΙ 1640 в 96-луночный ЕВ-культуральный планшет (ΝυΝΟ. Дания). Последующее культивирование проводят или без дополнительной стимуляции (все линии опухоли и необработанные мышиные и человеческие лимфоциты). или когда изучают влияние на нормальные. быстроразмножающиеся Т-лимфоциты. в присутствии Т-клеточного митогена конканавалина А. Концентрация митогена конканавалина А. при которой выращивают клетки. составляет 1.25 мкг на лунку. Образцы для тестирования или свободный доксорубицин в конечных концентрациях 0.0016-80 мкг/мл добавляют в каждую лунку планшета. содержащего тестируемые клетки в питательной среде с митогеном конканавалином А или без него. Общий объем лунок составляет 250 мкл. Каждую концентрацию тестируют параллельно для одного образца и одной линии по 3-5 раз. Титрационные микрокультуральные планшеты инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 24-72 ч. После завершения культивирования в каждую лунку добавляют 1 мкКи 3Нтимидина. Через 5-6 ч после этого (в зависимости от тестируемой системы) клетки собирают (коллектор клеток Тот1ес) на стекловолоконный фильтр (Е111етта1. Аа11ас). сушат и проверяют уровень их радиоактивности (М1стоВе1а ТтЛих. Аа11ас). 1С50 для конъюгатов без антител. содержащих гидролитически высвобождаемый доксорубицин. составляет от 0.01 до 1.41 мкг доксорубицина/мл в зависимости от устойчивости (чувствительности к обработке используемой линии клеток-мишеней) и от типа конъюгата. Подтверждается. что цитотоксичность - исключительное свойство конъюгатов. содержащих гидролитически высвобождаемый доксорубицин. так как конъюгаты без активного агента не являются цитотоксичными.
Испытания ίη νίίτο доказали. что а) активность конъюгатов с гидролитически высвобождаемым активным агентом не зависит от ферментативного разрушения ковалентной связи между этим агентом и олигопептидным звеном и б) конъюгаты. где связующее звено между основной полимерной цепью и активным агентом представляет собой только ε-аминокапроновую кислоту или парааминобензойную кислоту. так же эффективны. как те. которые содержат ди- или тетрапептидное звено.
Пример 8. Цитотоксическая активность ίη νίίτο полимерных конъюгатов. содержащих гидролитически высвобождаемый доксорубицин. в клетках с низким содержанием лизосом.
Испытание цитотоксической активности ίη νίίτο проводят таким же образом. как описано в примере
7. В качестве клеток-мишеней выбирают клетки эритролейкемической линии К 562 с низким содержанием лизосом. Доказано. что конъюгаты. содержащие гидролитически высвобождаемый доксорубицин. являются значительно более цитотоксичными даже в этой линии. в которой конъюгаты с ферментативно высвобождаемым доксорубицином являются цитотоксичными в очень ограниченной степени (фиг. 7). Эти результаты показывают. что конъюгаты с гидролитически высвобождаемым доксорубицином эффективны даже в клеточных системах. бедных лизосомами.
Пример 9. Противоопухолевая активность ίη νΐνο полимерных конъюгатов. содержащих гидролитически высвобождаемый доксорубицин (фиг. 8).
Мышам линии С57ВЬ/10 подкожно трансплантируют клетки Т-клеточной лимфомы (ЕЬ4). Опухолевые клетки вводят подопытным животным в нижнюю половину спины в количестве 1х10 клеток на мышь. День трансплантации клеток отмечают как день 0. Затем полимерные конъюгаты с гидролитически высвобождаемым доксорубицином вводят интраперитонеально или в дни 1. 3. 5. 7 и 9 (защитный режим). или в дни 10. 12. 14. 16 и 18. или в дни 12. 14. 16. 18 и 20 (терапевтический режим). Суточная доза доксорубицина составляет 50 мкг/мышь. Конъюгаты значительно замедляют рост опухоли и увеличивают количество подопытных животных. выживающих в течение длительного времени. В то время как полимерный конъюгат без активного агента вообще не оказывает никакого эффекта и классический. то есть немодифицированный. доксорубицин оказывает очень ограниченный эффект (максимальный период выживания подопытных животных составляет 40 дней по сравнению с 35 днями в контрольной группе). назначение полимерных конъюгатов с гидролитически высвобождаемым доксорубицином приводит к долговременному выживанию. то есть больше чем 80 дней. 40 и 20% мышей в защитном режиме и терапевтическом режиме. соответственно.
Мышам линии Ва1Ь/с внутрибрюшинно вводят клетки мышиной В-клеточной лейкемии ВСЬ1. Опухолевые клетки вводят в количестве 5 х 105 клеток на мышь. День трансплантации клеток отмечают как день 0. Затем полимерные конъюгаты с гидролитически высвобождаемым доксорубицином внутривенно вводят в дни 11. 13 и 17 (терапевтический режим). Суточная доза доксорубицина составляет 100 мкг/мышь. Тестируемые конъюгаты имеют значительную антиопухолевую активность. В то время как мыши контрольной группы живут не дольше чем 40 дней. 20% мышей. пролеченных тестируемыми конъюгатами. живут дольше чем 100 дней. а 10% - дольше чем 140 дней.
Литература
В. Описан. ТВ. Ь1оуб. Т Коресек. Р. Ре) тавота. к 81гойа1т. К. ШЬпсй. В. Ρίΐιονά. V. Сйуйу: ЗуШНеПс Ро1утепс Огадз. Схесй. Ρν 0095/85. АиЦтаЛа 589587. Саваба 130053. Эешпагк 164485. Еигоре 0187547. υδ 5.037.883. ,1арап 000137/86
- 7 007353
К. ТЛЬпск, V. 8иЬг, I. 8йо11а1т. ϋ Ρΐοοονή, Μ. ΙοΙίηΙ/ονά. В. ΒίΙιονά. Ро1утепс Эгида Вазск оп Сощида1сз о£ ΞνηίΙιοίίο апс1 №1ига1 Масгото1еси1е8 I. ΞνηίΙιοδίδ апс1 Р11у51со-с11сгтса1 СЬагасГспзайоп. I. Соп1го11ек Ке1. 64, 63-79 (2000)
Уазеу Р.А., Кауе 8.В., Мотзоп К., Т\\с1\с5 С., ХУйзоп Р., Эипсап К., ТЬотзоп А.Н., Миггау Ь.8., Ηίΐάίΐοΐι Т.Е., Миггау Т., ВигИез Ега1ег Э., Епдепо Е., Сазз14у, I.: Рказе I с1пйса1 апк ркагтасокшейс δίιιάν о£ РК1 [Т4-(241укгохургору1)те111асгу1агшке соро1утег с1охогиЫс1п1|: кгз! тетЬег о£ а пс\\ с1азз о£ сйетоШегареикс адсгЩ - кгид ро1утег соп|ида1С5. СНтса1 Сапсег Кезеагск 5, 83-94 (1999)
1и1уап. Ρ1., Зеутоиг, БДУ., Ееггу, Э.К., Эагуат, Βοίνίη, СН. М., Эогап, I., Эау1к, М., Апкегзоп, Э., Скп81окои1ои, С.Н., Уоипд. А.М., Нс551с\\оос1. Кегг, Э.1.: Ргекттагу сктса1 51ис1у о£ 1ке к181пЬийоп о£ НРМА соро1утег8 Ьсаппд кохогиЫст апк да1ас1озатте, ГСоп1го1. Ке1. 57, 281-290 (1999)
Ткотзоп А.Н., Уазеу Р.А., Миггау Б.З., СаззМу I., Ега1ег Э., Епдепо Ε., Т\\1с\с5 С.: Рори1акоп ркагтасоктексз ίη рказе I скид кеуе1ортеп1: а рказс I з!ис1у о£ ΡΚΙ ίη ρηίίοηίδ ννίίΐι зоНс1 кпиогз, Вг. 1. Сапсег. 81,99-107(1999)
1. Коресек, Р. Корескоуа, Т. Мшко, Ζ. Ей, НРМА соро1утег-апксапсег Эгид Соп|ида1сз: Эс51дп. Аскуйу, апк Мескатзт о£ Аскоп. Еигор. 1. Ркагт. Вюркагт. 50, 61-81 (2000)
Е. ΚγηΙζ, и. Веуег, Н.Т. Зскике, Эгид-Ро1утсг Соп|ида1сз Соп1аттд Ас1с1-С1са\аЫс Вопкз. Спкса1 Βονίο\\5 ίη Тйегареикс Эгид Сагпегз §у81ет8, 16 (3), 245-288 (1999)
В. ΚίΗονή, Т. Екуск, М. РссЬаг. Μ. ΙοΙίηΙ/ονά. М. §1'азк1у, О. Ноуогка, Μ. Κονήί, К. 1ЛЬпск ЭохогиЫст Воипк ΐο А НРМА Соро1утег Сатег ТЬгоидЬ Нускагопс Вопк 18 Ейескуе а1зо ίη А Сапсег СеН Бте \\ ί 1Н А Эпикск Соп1еп1 оРЕузозотез. 1. Соп1го11ек Ке1еазе 74, 225-232 (2001)
Тотаз ЕГгусЬ. Магке1а 1οΙίηΙ<ονά. В1апка ΚίΗονή, Каге1 ТЛЬпск, Νο\ν НРМА соро1утег8 соп!аттд кохогиЫст Ьоипк У1а рН зспзШус Нпкадс. ΞνηίΙιοδίδ. ίη νίΐίο апк ίη νίνο Ью1од1са1 ргорегкез. 1. Соп1го11ек Ке1. 73, 89-102 (2001)

Claims (9)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Конъюгаты, состоящие из полимерного носителя, содержащего 30-3000 связанных мономерных единиц, формирующих полимерную цепь, включающих
    60-99% Т4-(2-гидроксипропил)метакриламидных единиц,
    1-25% единиц метакрилоилированных гидразонов α-аминокислот, ε-аминокислот, ароматических аминокислот или олигопептидов, заканчивающихся молекулой антрациклинового канцеростатика,
    0,5-15% единиц метакрилоилированных α-аминокислот, ε-аминокислот, ароматических аминокислот, олигопептидов или их натриевых солей; и при необходимости
    0,5-10% единиц метакрилоилированных гидразидов а-аминокислот, ε-аминокислот, ароматических аминокислот или олигопептидов.
  2. 2. Конъюгаты по п.1, дополнительно содержащие 0,5-5% метакрилоилированных α-аминокислот, εаминокислот, ароматических аминокислот, олигопептидов, заканчивающихся молекулой иммуноглобулина или специфического моно- либо поликлонального антитела.
  3. 3. Конъюгаты по π. 1 или 2, дополнительно содержащие 0,1-5% единиц ферментативно расщепляемых метакрилоилированных олигопептидов, соединенных алкилендиаминами, образующих связующие звенья между полимерными цепями с образованием поперечно-сшитой структуры конъюгата.
  4. 4. Конъюгаты по любому из пп.1-3, где антрациклиновым канцеростатиком является доксорубицин.
    соон
    -8007353 где отдельные структурные единицы распределены в цепи произвольным образом, X представляет собой звено, образованное остатком ос-аминокислоты, ε-аминокислоты или олигопептида, и х имеет значения от 20 до 3000, а - от 1 до 750, каждый из Ь и с имеет значения от 1 до 450.
  5. 6. Конъюгаты по п.2, имеющие общую формулу
    СООН сн—он νη,.ηο где X, х, а, Ь и с такие, как указано выше, ά имеет значения от 1 до 150, 8 представляет собой антитело, выбранное из группы, включающей γ-глобулин для внутривенного введения, аутологические антитела, антитела анти-17-1-А, анти-СА 15-3 и аналогичные, присоединенные к полимерной цепи, либо 8 представляет собой биологически расщепляемое олигопептидное звено, соединяющее другие аналогичные цепи.
  6. 7. Конъюгаты по пп.1-6, где аминокислоты или олигопептиды выбраны из группы, включающей СИу, А1а, Ьеи, СИуСИу, С1уЬеиС1у, СНуРйеСИу, С1уР11еЬеиС1у, β-аланин, γ-аминомасляную кислоту, εаминокапроновую кислоту (АКар), парааминобензойную кислоту (АВ).
  7. 8. Конъюгаты по п.2 или 6, где антитела выбраны из группы, включающей γ-глобулин для внутривенного введения, аутологические антитела, антитела анти-17-1-А, анти-СА 15-3 и другие опухолеспецифические и опухолеассоциированные антитела.
  8. 9. Конъюгаты по п.З, где связующие звенья, соединяющие полимерные цепи, выбраны из группы, включающей С1уР11еЬеиС1у, Ст1уЬеиСт1у, СНуРНеСНу, О1уЬеиР11еО1у.
  9. 10. Фармацевтическая композиция для лечения опухолей, характеризующаяся тем, что содержит в качестве активного агента конъюгат, охарактеризованный в любом из пп.1-9.
    И. Фармацевтическая композиция по и. 10, предназначенная для лечения опухолей, таких как рак молочной железы или колоректальная опухоль.
EA200400802A 2001-12-20 2002-12-20 pH-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ КОНЪЮГАТЫ АНТРАЦИКЛИНОВЫХ КАНЦЕРОСТАТИЧЕСКИХ АКТИВНЫХ АГЕНТОВ ДЛЯ ТЕРАПИИ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ EA007353B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20014653A CZ293787B6 (cs) 2001-12-20 2001-12-20 pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii
PCT/CZ2002/000070 WO2003053473A2 (en) 2001-12-20 2002-12-20 Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline drug

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200400802A1 EA200400802A1 (ru) 2005-02-24
EA007353B1 true EA007353B1 (ru) 2006-10-27

Family

ID=5473644

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200400802A EA007353B1 (ru) 2001-12-20 2002-12-20 pH-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ КОНЪЮГАТЫ АНТРАЦИКЛИНОВЫХ КАНЦЕРОСТАТИЧЕСКИХ АКТИВНЫХ АГЕНТОВ ДЛЯ ТЕРАПИИ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ

Country Status (18)

Country Link
US (1) US7919076B2 (ru)
EP (2) EP1782833A3 (ru)
JP (1) JP4718117B2 (ru)
KR (1) KR20040076874A (ru)
AT (1) ATE439864T1 (ru)
AU (1) AU2002366715A1 (ru)
CA (1) CA2470976A1 (ru)
CZ (1) CZ293787B6 (ru)
DE (1) DE60233434D1 (ru)
DK (1) DK1463529T5 (ru)
EA (1) EA007353B1 (ru)
ES (1) ES2331303T3 (ru)
HU (1) HUP0500541A3 (ru)
PL (1) PL216518B1 (ru)
PT (1) PT1463529E (ru)
SI (1) SI1463529T1 (ru)
SK (1) SK2912004A3 (ru)
WO (1) WO2003053473A2 (ru)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ294996B6 (cs) * 2003-07-16 2005-04-13 Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr Reaktivní polymery a kopolymery na bázi N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, způsob jejich přípravy a jejich použití pro syntézu polymerních léčiv, pro modifikaci biologicky aktivních proteinů a přípravu systémů pro dopravu genů
US8614228B2 (en) 2004-08-11 2013-12-24 Arqule, Inc. Quinone prodrug compositions and methods of use
CA2583700A1 (en) 2004-08-11 2006-02-23 Arqule, Inc. Quinone prodrug compositions and methods of use
CZ2005558A3 (cs) * 2005-09-05 2007-04-04 Zentiva, A. S. Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva
CZ2006207A3 (cs) * 2006-03-28 2008-01-16 Zentiva, A. S. Micelární nosiče léčiv s protinádorovou aktivitou
CN103257223B (zh) * 2006-08-09 2015-04-01 住友电木株式会社 糖链捕获物及其用途
CZ2006505A3 (cs) * 2006-08-09 2008-04-09 Zentiva, A. S. Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy
CZ298945B6 (cs) 2006-09-18 2008-03-19 Zentiva, A. S. Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby
TWI401081B (zh) 2007-04-30 2013-07-11 Arqule Inc 苯醌化合物的羥基磺酸鹽及其用途
CZ301288B6 (cs) * 2008-10-23 2009-12-30 Zentiva, A. S Polymerní prípravek se synergickým úcinkem pri lécbe nádorových onemocnení
CZ302830B6 (cs) * 2009-12-15 2011-11-30 Ústav makromolekulární chemie AV CR, v.v.i. Vysokomolekulární polymerní nosice léciv odvozené od dendrimeru a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru
EP3069715A1 (en) 2015-03-20 2016-09-21 Salmon Pharma GmbH Immediate release dosage forms of Atomoxetine
EP3525808A4 (en) 2016-10-14 2020-06-24 University of Utah Research Foundation ANTIBODY-POLYMER-DRUG CONJUGATES
CZ309828B6 (cs) * 2019-10-09 2023-11-15 I.T.A.-Intertact S.R.O. Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití
JP2023500112A (ja) * 2019-10-30 2023-01-04 シーアイエス ファーマ アクツィエンゲゼルシャフト 活性剤を送達する生体適合ポリマー薬物担体

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8500209D0 (en) 1985-01-04 1985-02-13 Ceskoslovenska Akademie Ved Synthetic polymeric drugs

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHOI W.-M. ET AL.: "Synthesis of HPMA copolymer containing adriamycin bound via an acid- labile spacer and its activity toward human ovarian carcinoma cells", JOURNAL OF BIOACTIVE AND COMPATIBLE POLYMERS 1999 UNITED STATES, vol. 14, no. 6, 1999, pages 447-456, XP008019678, ISSN: 0883-9115, abstract; figure 1 *
ETRYCH T. ET AL.: "New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH-sensitive linkage: synthesis and preliminary in vitro and in vivo biological properties", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE: OFFICIAL JOURNAL OF THE CONTROLLED RELEASE SOCIETY. 18 MAY 2001, vol. 73, no. 1, 18 May 2001 (2001-05-18), pages 89-102, XP002248058, ISSN: 0168-3659 *
LU Z. R. ET AL.: "Modification of cyclosporin A and conjugation of its derivative to HPMA copolymers", BIOCONJUGATE CHEMISTRY. 2001 JAN-FEB, vol. 12, no. 1, January 2001 (2001-01), pages 129-133, XP002248060, ISSN: 1043-1802, scheme 2 *
R?ìHOV?ü B. ET AL.: "Doxorubicin bound to a HPMA copolymer carrier through hydrazone bond is effective also in a cancer cell line with a limited content of lysosomes", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE: OFFICIAL JOURNAL OF THE CONTROLLED RELEASE SOCIETY. 6 JUL 2001, vol. 74, no. 1-3, 6 July 2001 (2001-07-06), pages 225-232, XP002248059, ISSN: 0168-3659, figure 2; table 1 *
SOLOVSKIJ M. V. ET AL.: "Synthesis of N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymers with antimicrobial activity", BIOMATERIALS. JAN 1983, vol. 4, no. 1, January 1983 (1983-01), pages 44-48, XP0001149273, ISSN: 0142-9612, abstract; table 2 *
ULBRICH K. ET AL.: "HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin. In vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE: OFFICIAL JOURNAL OF THE CONTROLLED RELEASE SOCIETY. 21 FEB 2003, vol. 87, no. 1-3, 21 February 2003 (2003-02-21), pages 33-47, XP002248061, ISSN: 0168-3659, figure 1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CZ293787B6 (cs) 2004-07-14
CZ20014653A3 (cs) 2003-08-13
AU2002366715A8 (en) 2003-07-09
SI1463529T1 (sl) 2010-01-29
CA2470976A1 (en) 2003-07-03
SK2912004A3 (en) 2004-12-01
ATE439864T1 (de) 2009-09-15
DK1463529T3 (da) 2009-10-19
HUP0500541A3 (en) 2011-08-29
AU2002366715A1 (en) 2003-07-09
EP1463529B1 (en) 2009-08-19
EA200400802A1 (ru) 2005-02-24
US7919076B2 (en) 2011-04-05
ES2331303T9 (es) 2011-08-18
PT1463529E (pt) 2009-11-03
US20060057099A1 (en) 2006-03-16
DK1463529T5 (da) 2011-06-27
JP4718117B2 (ja) 2011-07-06
WO2003053473A3 (en) 2004-04-29
DE60233434D1 (de) 2009-10-01
WO2003053473A2 (en) 2003-07-03
EP1463529B9 (en) 2011-03-23
ES2331303T3 (es) 2009-12-29
EP1782833A2 (en) 2007-05-09
JP2005519044A (ja) 2005-06-30
PL370719A1 (en) 2005-05-30
KR20040076874A (ko) 2004-09-03
PL216518B1 (pl) 2014-04-30
EP1463529A2 (en) 2004-10-06
EP1782833A3 (en) 2008-03-19
HUP0500541A2 (hu) 2005-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Etrych et al. New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH-sensitive linkage: synthesis and preliminary in vitro and in vivo biological properties
US7041818B2 (en) DDS compound and method for measurement thereof
JP2620517B2 (ja) 重合性薬剤
EA007353B1 (ru) pH-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ КОНЪЮГАТЫ АНТРАЦИКЛИНОВЫХ КАНЦЕРОСТАТИЧЕСКИХ АКТИВНЫХ АГЕНТОВ ДЛЯ ТЕРАПИИ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ
EP2063914B1 (en) Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation
EP0329184A2 (en) Antimers and antimeric conjugation
EP1922087B1 (en) Method for the preparation of polymeric conjugates of doxorubicin with ph-controlled release of the drug
WO2000066091A1 (en) Amplification of folate-mediated targeting to tumor cells using polymers
CA2145502A1 (en) Alginate-bioactive agent conjugates
CA2257233A1 (en) Process for producing drug complexes
Gaál et al. Low toxicity and high antitumour activity of daunomycin by conjugation to an immunopotential amphoteric branched polypeptide
JP5781084B2 (ja) 樹状高分子量ポリマー薬物担体および特に固形腫瘍の処置のための薬物とのそれらの結合体
Pechar et al. Poly (ethylene glycol)-doxorubicin conjugates with pH-controlled activation
WO2013127885A1 (en) A conjugate of methotrexate and hydroxyethyl starch for use in the treatment cancer
SK9785A3 (en) Polymeric remedy and preparation method thereof
Özer Investigation of antibody-dye conjugates
CZ2003605A3 (en) pH sensitive polymeric conjugates of anthracycline cancerostatic for targeted therapy
Komissarenko et al. Selective killing of tumor cells in vitro by immunotoxin composed of antitumor antibiotic streptonigrin and polyclonal specific antibodies
AU2004201277A1 (en) Amplification of folate-mediated targeting to tumor cells using polymers
JPS60168726A (ja) 細胞毒性物質を結合した反応性高分子およびその製造法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): KG MD TJ TM