JP2005519044A

JP2005519044A - ターゲット療法用アントラサイクリン系制癌薬のｐＨ感受性重合体コンジュゲート

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Publication number: JP2005519044A
Application number: JP2003554229A
Authority: JP
Inventors: ウルブリヒ，カレル; エトリフ，トマーシュ; ジーホバー，ブランカ; イェリーンコバー，マルケータ; コバージ，マレク
Original assignee: ゼンティーバ，アー．エス．
Priority date: 2001-12-20
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2005-06-30
Anticipated expiration: 2022-12-20
Also published as: WO2003053473A2; CZ293787B6; AU2002366715A1; HUP0500541A3; SK2912004A3; PT1463529E; ES2331303T9; EP1463529A2; ES2331303T3; US7919076B2; PL216518B1; EP1782833A3; PL370719A1; EA200400802A1; HUP0500541A2; DE60233434D1; EP1463529B1; ATE439864T1; CA2470976A1; CZ20014653A3

Abstract

a）60〜99％のN-（2-ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドのユニット、ｂ）1〜25％のアントラサイクリン系制癌剤分子で終わるα-アミノ酸、ε-アミノ酸、芳香族アミノ酸又はオリゴペプチドのメタクリロイル化ヒドラゾンのユニット、ｃ）0.5〜15％のメタクリロイル化されたα-アミノ酸、ε-アミノ酸、芳香族アミノ酸又はオリゴペプチド、あるいはそのナトリウム塩のユニットから成る、重合体鎖を形成するように連結された30〜3,000の単量体ユニットによって構成される重合体担体から成るコンジュゲート。

Description

本発明には、体内のターゲット輸送を可能にし人間医療におけるターゲット腫瘍療法に焦点をあてた重合体抗癌薬が関与している。

新しい薬物及び薬物形態の開発では、近年、薬物担体としての重合体物質、特に水溶性重合体の利用に対し増々焦点があてられてきている。非分割性共有結合、加水分解不安定性イオン結合又は酵素又は単純な加水分解不安定性イオン結合又は酵素又は単純な加水分解を受けやすい共有結合により重合体に腫瘍薬が付着させられている、制癌薬及び可溶性重合体の重合体コンジュゲートが多数調製され研究されてきた。この努力は、腫瘍のターゲット療法を可能にする増強された薬物動態学的及び薬力学的挙動をもつ薬物を調製することを目的としていた。ＨＰＭＡ共重合体に基づいて調製された重合体薬物は、１つの重要な基を形成する。このような物質内の抗癌薬は、リソソーム酵素（哺乳動物の細胞内に存在する酵素）のための基質として調製される酵素分割可能なオリゴペプチド配列によって、重合体Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド担体に付着している。このようなコンジュゲートの構造、合成及び物性については、特許［Duncan 1985］の中で記述されてきた。これまでこの分野で得られた結果は、Kopecek et al [Kopecek et al 2000]により明確にまとめられている。上述の重合体薬物は、マウス及びラットにおける多数の腫瘍の治療において有効であった。現在のところ、重合体コンジュゲートのうちの２つは臨床試験されている［Vasey 1999 et al.,Julyan et al 1999, Thomson et al 1999]。かかる臨床試験の結果は、ドキソルビシンの重合体コンジュゲートが、遊離の薬物に比べて低い非特異的毒性を有していることを示した。その最大許容量（Ｍアミノ酸）３２０ｍｇ／ｍ²であり、これは、通常用いられる遊離ドキソルビシンの臨床量（６０〜８０ｍｇ／ｍ²）よりも４〜５倍高い。個々の累積量は最高１６８０ｍｇ／ｍ²に達したものの、重合体薬物の投与後、心臓の機能に対する有意な効果は全く観察されなかった。遊離のすなわち非指向性アントラサイクリン系抗生物質の投与に関連して観察されたその他の毒性部域は全て、有意な形で減少していた。臨床試験に付された重合体コンジュゲート薬物の不利な点の１つは、かかるコンジュゲートがＰＫ１といったようなターゲティング・ユニットを全く含有しないか又は比較的低い特異性の炭水和物を含有する（肝臓に対して重合体薬物を導く能力が試験されつつあるＰＫ２コンジュゲート内のガラクトサミン）ことから、効果の特異性が比較的低いという点にある。従って、目的となっている特異的効果が担体分子に対し特異的ターゲティング分子（例えば抗体ならびにレクチン、成長ホルモン、トランスフェリンなど）を付着させることによって達成されるコンジュゲートが開発されつつある。

ポリ（ＨＰＭＡ）及びドキソルビシンのコンジュゲートを含む臨床試験に付されたコンジュゲートのもう１つの不利な点は、薬理学的に活性な形態にある薬物が、リソソーム内で起こる酵素反応によってのみ細胞内でかかるコンジュゲートから放出される、ということにある。このことはすなわち、その薬物が、高濃度のリソソーム酵素−ペプチダーゼを伴う細胞中でのみ有効である、ということを意味している。もう１つの不利点は、主にＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙテトラペプチドによる連結であるペプチダーゼにより薬物を放出する配列の包含を必要とするコンジュゲートの比較的複雑な構造にあり、これにより合成がより高価でかつ複雑なものとなっている。

水性媒質内で加水分解しやすい結合により制癌薬が付着されている重合体の調製及び物性研究についての多くの情報が、複数の論文により提供されている。結果は、Kratzによりまとめられている［Kratz et al, 1999］。アルブミン、デキストラン、トランスフェリン、アルギン酸塩又は抗体といったような自然の高分子が、主に、制癌薬のための担体として用いられてきた。一部のケースにおいて、合成重合体担体、ポリ（エチレングリコール）及びポリグルタミンが使用されてきた。薬物は、細胞外空間内及び細胞内部の両方で活性薬物の加水分解制御された放出を可能にする結合により担体に対して付着された。ドキソルビシン（Ｄｏｘ）の場合には、結合はシス−アコニチル酸のエステルにより形成されることが最も多く、そうでなければそれはヒドラゾン結合であった。しかしながら、動物の体内での上述のｐＨ感受性コンジュゲート全てのin vivo試験が、最終的な結果を提供しなかった。従って、重合体コンジュゲートはいずれも腫瘍の治療のために使用されたことも又臨床試験されたこともない。

我々が開発しｐＨ感受性ヒドラゾン結合によって連結された制癌薬及びＨＰＭＡ共重合体をベースにして調製された重合体制癌薬は、マウスでのin vitro及びin vivoの両方の試験において、オリゴペプチドによる連結を介して酵素分割可能な結合により重合体担体に付着された薬物とのコンジュゲートに比べて、数多くの腫瘍系統との関係において著しく高い抗腫瘍効力を示した。以前に開発されたポリ（ＨＰＭＡ）コンジュゲートと比べてかかるコンジュゲートの合成は、酵素分解可能なオリゴペプチド配列の代りに連結として１つのアミノ酸のみを使用することができ重合体に対する薬物の結合は単純な反応であることから、より簡単で、より廉価でかつより管理し易いものである。薬物は、媒質内でのｐＨの変化の結果として放出され、従ってリソソーム酵素の存在は活性化にとって不可欠ではない。かかる放出の速度（ひいては即時細胞増殖抑制濃度）は、酵素によってのみ分解可能な配列を含有するコンジュゲートと比べてはるかに高いものである［Rihova et al, 2001, Etrych et al, 2001］。

本発明は、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）をベースにして調製された共重合体、任意には抗体、そのフラグメント又は非特異的免疫グロブリン（図３）との、ドキソルビシン、ダウノマイシン、ファルモルビシン及びカルボニル基を含むその他のアントラサイクリン系制癌薬の直鎖及び有枝重合体コンジュゲートを提供する。これらのコンジュゲートの特徴は、重合体担体が抗体（免疫グロブリン）と共に血管内の重合体薬物の長時間にわたる循環及びそれに続く腫瘍内でのその好ましい受動的又は能動的蓄積を保証しているということにある。抗癌薬は、血管中で安定した結合により担体に付着している（ｐＨ７．４で）。薬物が重合体に連結された後、制癌剤はその生物学的効果を失ない、その不活性形態で血管によって輸送される。細胞毒性薬物は、ｐＨが低下し薬物と重合体の間の結合が加水分解された場合にのみ、標的細胞の細胞小器官の中で細胞内活性化された状態となる。

コンジュゲートは、重合体鎖を形成するように連結された３０〜３０００の単量体ユニットにより形成された重合体担体を含んで成り、それらのうちの６０〜９９％はＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド・ユニットによって構成されており、１〜２５％は、アントラサイクリン系制癌剤の分子（好ましくはドキソルビシン）で終結されたα−アミノ酸、ε−アミノ酸、芳香族アミノ酸又はオリゴペプチドのメタクリロイル化ヒドラゾン・ユニットであり、０．５〜１５％は、メタクリロイル化されたα−アミノ酸、ε−アミノ酸、芳香族アミノ酸又はオリゴペプチド又はそのナトリウム塩のユニットである；任意には、０．５〜１０％のα−アミノ酸、ε−アミノ酸、芳香族アミノ酸又はオリゴペプチドのメタクリロイル化ヒドラジド・ユニットが含有されており、コンジュゲートは任意には、免疫グロブリン分子で終結されたメタクリロイル化α−アミノ酸、ε−アミノ酸又はオリゴペプチド又は特異的モノクローナル又はポリクローナル抗体を０．５〜５％含有し得る。

上述のユニットの他に、有枝高分子構造は同様に、有枝高分子構造を形成するべく個々の重合体鎖を相互連結し、酵素分解可能なメタクリロイル化オリゴペプチド、好ましくはジアミン（エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン）によって相互連結されたトリペプチドＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ又はテトラペプチドＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙから成る連結を形成するユニットを０．１〜５％含有する。

本発明のターゲット抗腫瘍作用をもつ重合体コンジュゲートの１つの特徴は、重合体のヒドラジド基と薬物分子のカルボニル基の間の反応の中で形成されるヒドラゾン基を介した重合体担体と活性成分（細胞増殖抑制性）の間のリンケージにある、重合体担体に対する薬物のリンケージは、薬物の分子量を増大させ、その結果、体内の活性成分の合計保持時間及び血中循環時間を延長することになる。薬物と重合体の間のリンケージは、血管内の薬物輸送中比較的安定しており、細胞の内側のわずかに酸性の循環すなわち酸性ｐＨを特徴とする細胞小器官内で加水分解により分割可能である。このことはすなわち、薬物が、重合体に連結された状態でその不活性形態で血管中を輸送され、標的腫瘍細胞にそれが浸透した後に初めて活性化される、ということを意味している。標的細胞内の薬物活性化は、そうでなければ毒性をもつ細胞増殖抑制物質の副作用を無くし、その効果を優先的に腫瘍細胞に集束させる。ＨＰＭＡ共重合体をベースとする重合体担体が、腫瘍又は腫瘍細胞に対するターゲット輸送を担当している。有枝高分子ポリ（ＨＰＭＡ）担体が用いられる場合、重合体薬物は、受動的ターゲティング及びＥＰＲ効果（増強された浸透性及び保持効果）に起因して、中実腫瘍組織内に貯蔵される。重合体は、例えば糸球体ろ過によって、より短かい重合体鎖の形でのオリゴペプチドによる連結の酵素分解の後、体から放出され得る。抗体（免疫グロブリン）を含有する担体の中では、抗体は、過ヨウ素酸ナトリウム酸化により抗体のＦｃフラグメント内に取込まれたアルデヒド基と担体のヒドラゾン基の間の反応の中で形成されたヒドラゾン結合を介して担体に付着させられる。二官能性作用物質を用いて重合体担体鎖に対し抗体（免疫グロブリン）を付着させることもできる。このような場合、抗体分子は、２−イミノチオレーンと反応させることによって（−ＳＨ基の導入）修飾され、そのヒドラジド基と３−マレイミドプロピオン酸のスクシニミドエステルとを反応させることによって重合体内にマレイミド基が導入され、このとき、重合体のマレイミド基の２重結合に抗体の−ＳＨ基を添加することによって、接合が発生する。類似の要領で、重合体担体のヒドラジド基に対して直接抗体（免疫グロブリン）を含む−ＳＨ基を接合させるのに使用可能なＳＰＤＰ（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル）といったようなもう１つの２官能性作用物質によっても、接合を開始させることができる。

抗体（免疫グロブリン）とのコンジュゲートは、受動的及び能動的α両方の形で標的器官（組織）内に蓄積される。受動的蓄積は、コンジュゲートのより高い分子量により可能となり、いわゆるＥＰＲ効果が関与し、能動的蓄積は、ターゲティング抗体の結合部位が、標的細胞の表面上の関連するレセプタと相互作用するプロセスによって確保される。後者の場合、ＨＰＭＡ共重合体は、コンジュゲート内のターゲティング糖タンパク質の免疫原性を著しく低下させる保護的ラップ及び担体の両方の役割を果たす。

本発明に従った重合体環は、その詳細に説明される構造が異なる３つの形態において使用可能である。第１の構造は、ターゲティング抗体（免疫グロブリン）無しの薬物との線形重合体コンジュゲートによって表わされる（図１）。第２の構造は、高分子構造であり、生分解性オリゴペプチドによる連結を伴う有枝重合体構造を表わす（図２）。第３の構造は、ターゲティング分子（免疫グロブリン）をも含有する（図３）。

非ターゲット線形重合体薬物の調製は、複数の反応段階で起こる。第１段階には、メタクリロイル化された反応性エステル（４−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルなど）及びＨＰＭＡの共重合体としての重合体前駆体Ｉの調製（図４参照）が関与し、重合体前駆体ＩＩの調製を導く第２段階には、末端エステル基のヒドラジドへのヒドラジン分解による変換が関与する。第３段階では、分子内にケト基を含有する制癌剤を、化学的ヒドラゾン結合によりヒドラジン基に付着させる。

有枝重合体薬物の調製は、好ましくはＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ又はＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙといった酵素分解可能なオリゴペプチドをその側鎖内に含有する重合体前駆体Ｉから出発する必要がある。第２段階は、重合体前駆体Ｉ及びアルキレン・ジアミン（エチル、ブチル、ヘキシル）を反応させることによって重合体をわずかに分枝させることによって開始され、前ケースにおいて記述されたようなその後のヒドラジン水和物による加水分解によって終結される。

抗体（免疫グロブリン）でターゲット薬物は、以前の両方のタイプの薬物から、ＫＩＯ₄又はＮａＩＯ₄との穏やかな反応によりその構造内にアルデヒド基が予め導入されている抗体（免疫グロブリン）とのその後の反応によって、又は、以上で記述したような２官能性作用物質を用いた抗体（免疫グロブリン）とのそのコンジュゲートを用いて、調製可能である。

本発明は、ヒトの医薬におけるさまざまなタイプの腫瘍の治療のための重合体薬物を調製するために使用可能である。

実施例１
ドキソルビシンをベースとした非ターゲテット線形重合体薬物の調製
重合体薬物の合成は、４つの合成段階で行なわれた。第１段階では、単量体、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）及びメタクリロイル化アミノ酸又はオリゴペプチドの４−ニトロフェニルエステル（ＭＡ−Ｘ−ＯＮｐ）が調製された。第２段階は、ＨＰＭＡとＭＡ−Ｘ−ＯＮｐのラジカル共重合体による重合体前駆体Ｉの調製であった。第３段階では、前駆体Ｉのヒドラジン分解により重合体前駆体ＩＩが調製され、最後の段階では、重合体前駆体に対するＤｏｘのリンキングが実施された。

単量体の調製
以前に記述された通りの［Ulbrich 2000］の方法によりＨＰＭＡを調製した。Schotten-Bauman反応及びそれに続くジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）の存在下での４−ニトロフェノールと結果として得られたメタクリル酸誘導体の反応による適切なアミノ酸又はオリゴペプチド（Ｘ＝Ｇｌｙ、ｄｉＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ、β−アラニン、ε−アミノカプロン酸（Ａｋａｐ）、ｐ−アミノ安息香酸（ＡＢ）など）のメタクリロイル化によって、メタクリロイル化反応性エステルを調製した。

メタクリロイル化ε−アミノ酸の４−ニトロフェニルエステルの調製のためのプロトコル
ＭＡ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ、ＭＡ−ＧｌｙＧｌｙ−ＯＮｐ及びＭＡ−ＡＢ−ＯＮｐ単量体の調製プロセスは、三つのケース全てにおいて同一である。ＭＡ−ＡＢ−ＯＮｐの調製プロセスは、以下に記述されている：
ＭＡ−ＡＢ−ＯＮｐ：０．０２４モル（３．３４ｇ）のｐ−アミノ安息香酸を、三口フラスコ内で０．０２４モル（０．９７ｇ）の水酸化ナトリウム溶液１５ｍｌ中に溶解させた。攪拌及び冷却（５℃）下でアミノ酸のナトリウム塩の水溶液に対し滴下にて０．０２４モル（２．５５ｇ）の塩化メタクリロイル及び１０ｍｌの水中に溶解した０．０２４モル（０．９７ｇ）の水酸化ナトリウム溶液を同時に添加した。反応中、反応混合物のｐＨは、ｐＨ９を超えてはならない。反応混合物を１時間攪拌し、ｐＨ２までそれを酸性化した後、結果として得られた白色沈殿物をフィルターグラスＳ４上でろ過した。生成物を、エタノール−水混合物から結晶化によって精製した。

０．０１５３モル（３．１６ｇ）のジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で、ジメチルホルムアミド中の０．０１４モル（１．９３ｇ）の４−ニトロフェノールと０．０１４モル（２．８５ｇ）のＮ−メタクリロイル４アミノ安息香酸を−１０℃で反応させることによって、４−ニトロフェニルエステルを調製した。反応は１０時間行なわれ、その後、沈殿したジシクロヘキシル尿素をろ過し、生成物をアセトン−水混合物からの結晶化によって精製した。その他の２つの４−ニトロフェニルエステル（ＭＡ−Ｘ−ＯＮｐ）も類似の要領で調製することができる。

ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ、β−アラニン及びε−アミノカプロン酸のメタクリロイル化された誘導体も同様に、オリゴペプチド又は酸のメタクリロイル化によって調製したが、水相の酸性化の後、メタクリロイル化された酸を酢酸エチル中に抽出させ結晶化により単離しなければならなかった。ＭＡ−ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ−ＯＨ及びＭＡ−ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ−ＯＨのエステル化のための反応媒質がテトラヒドロフランであったという点を除いて、ＭＡ−ＡＢ−ＯＮｐと類似の形で適切な反応性エステルＣＯＮｐエステル）を調製した。

重合体前駆体Ｉの調製：６．９５ｇのアセトン中に、ＨＰＭＡ（９５％ｍｏｌ、０．８９ｇ）とＭＡ−ＡＢ−ＯＮｐ（５％ｍｏｌ、０．１１ｇ）の混合物１ｇ及びアゾ−ビス−イソブチロニトリル０．０４８ｇを溶解させた。重合混合物を窒素でバブリングした後、アンプルを密閉し、重合を２４時間５０℃で実施した。沈殿した重合体をろ過させ、アセトン及びジエチルエーテルで３回洗浄し、真空乾燥させた。反応性−ＯＮｐ基で終結された側鎖の含有率（共重合体組成物）は、重合負荷の組成（単量体の比率）により制御可能である。側鎖の組成が異なる全ての重合体前駆体を調製するために、同じプロセスを使用した。

重合体前駆体ＩＩの調製：重合体前駆体Ｉをヒドラジン水和物と反応させることによってポリ（ＨＰＭＡ：ｃｏ−ＭＡ−ＡＢ−ＮＨＮＨ₂）共重合体を調製した。２ｍｌのメタノール中で３００ｍｇの重合体前駆体Ｉ（１．３×１０^-4モルＯＮｐ）を溶解させ、１ｍｌのメタノール（１．３×１０^-3モル、ＯＮｐに比べ１０倍の余剰）中の６９ｍｇのＮＨ₂ＮＨ₂Ｈ₂Ｏの溶液を徹底的な攪拌下で添加した。反応混合物を３時間反応させ、その後メタノール溶液を３０ｍｌまで精製水で希釈し、精製水に対する透析を用いて低分子成分を生成物から取り除いた（２日間）。最終生成物を、凍結乾燥により水溶液から単離した。重合体の分子量（Ｍｗ）及び多分散性を、光分散検出器の備わったゲルクロマトグラフィを用いて測定した。ヒドラジド基の量は、ＴＮＢＳ（トリニトロベンゼンスルホン酸）とヒドラジド基の反応の後、分光法によって決定した。その他のアミノ酸及びオリゴペプチドを含有する前駆体を、同じ要領で調製した。重合体前駆体ＩＩも同様に、以上で記述された条件下でＨＰＭＡとメタクリロイル化オリゴペプチド又はアミノ酸（ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−Ｘ−ＮＨＮＨ−ＢＯＣ））の対応するＮ−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルヒドラジドのラジカル沈殿共重合によって調製した。保護ＢＯＣ基をポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−Ｘ−ＮＨＮＨ−ＢＯＣ）からトリフルオロ酢酸で除去した後、重合体前駆体ＩＩをアセトンジエチルエーテル混合物中に沈殿させ、水中で溶解させ、水に対して透析させ、凍結乾燥させた。

重合体前駆体に対するドキソルビシンのリンケージ：３ｍｌのメタノール中に２５０ｍｇの重合体前駆体ＩＩ（ポリ（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−ＭＡ−ＡＢ−ＮＨＮＨ₂）（０．１ｍｍｏｌＮＨＮＨ₂）を溶解させた。この重合体溶液を２３ｍｇのＤｏｘ、ＨＣｌ（４０μｍｏｌ）に添加した。反応混合物に対し酢酸を２滴添加し、実験室温度（暗所内）で不均質溶液を攪拌した。４８時間反応させた後、均質溶液をゲルろ過によって２回精製し：Sephadox ＬＨ−２０が満たされたカラム内でメタノール中で遊離Ｄｏｘを分離した。重合体画分を単離し、真空蒸発器の中で濃縮させた。生成物をメタノールからジエチルエーテル内に再度沈殿させ、一定の重量まで乾燥させた。Ｄｏｘ及びヒドラジド基の含有率を、それぞれ分光法（λ４８０ｎｍ、ε１１５００Ｌｍｏｌ^-1ｃｍ^-1、水）及びＴＮＢＳによって決定した。液体クロマトグラフィ（Superose^TM６（３００×１０ｍｍ）カラム、０．３Ｍの酢酸緩衝液（ＣＨ₃ＣＯＯＮａ／ＣＨ₃ＣＯＯＨ；ｐＨ６．５；０．５ｇ／ＬＮａＮ₃）、流速０．５ｍｌ／分、差動屈折計、光分散検出器（ＤＡＷＮ−ＤＳＰ−Ｆ、Wyatt Technology, USA）及びＵＶ検出器（２８０及び４８８ｎｍ））により、＜Ｍｗ＞及び分子量分布を決定した。

ドキソルビシンの全てのその他の重合体コンジュゲートを調製するために上述の方法を使用した。

実施例２
有枝高分子コンジュゲートの調製
１．１ｍｌのＤＭＳＯ中に、オリゴペプチド配列ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ又はＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ（０．９ｍｍｏｌＯＮｐ）を含有する４００ｍｇの重合体前駆体Ｉを溶解させた。勢いよく攪拌しながら、ＤＭＳＯ中の１，２−エチレンジアミンの０．２Ｍ溶液（２１μｍｏｌのＥＤＡ）１０５μｌを添加し、反応混合物を１時間実験室温度で反応させた。重合体溶液を激しく攪拌しながら、０．３ｍｌのＤＭＳＯ中の１００ｍｇのヒドラジン水和物の溶液（２ｍｍｏｌ）を添加し、さらに３時間反応混合物を勢いよく攪拌した。その後反応混合物を精製水で３０ｍｌまで希釈し、精製水に対する透析により生成物を精製した（２日）。高分子前駆体を凍結乾燥させた。液体クロマトグラフィにより＜Ｍｗ＞及び分子量分布を決定し、ＴＮＢＳＡ方法を用いて分光法によりヒドラジド基含有率を決定した。重合体に対しドキソルビシンを連結し、実施例１に記述されているものと同じ条件下でコンジュゲートを特徴づけした。

実施例３
抗体（免疫グロブリン）ターゲット・コンジュゲートＩの調製
その側鎖中にヒドラジン及びマレイミド基（ＭＩ）を担持する共重合体（ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−Ｘ−ＮＨＮＨ₂−ｃｏ−ＭＡ−Ｘ−ＮＨＮＨ−ＭＩ））を、マレイミジルプロピオン酸のＮヒドロキシスクレイミジルエステル（ＳＭＰ）を用いた１０〜１５％ｍｏｌのヒドラジド基を含有する重合体前駆体ＩＩのヒドラジド基の部分的修飾によって調製した。２５０ｍｇの前駆体ＩＩｐｏｌｙ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ｄｉＧｌｙ−ＮＨＮＨ₂）（１２５μｍｏｌのヒドラジド基）を１．２ｍｌのＤＭＳＯ中に溶解させ、０．６ｍｌのＤＭＳＯ中の１６．６ｍｇＳＭＰの溶液（６２．５μｍｏｌ）を添加した。実験室温度で８時間反応混合物を攪拌した。ＰＤ−１０カラム（溶離液：精製水）中での精製後、マレイミド基の量を、修飾されたEllman試験により決定し、残留ヒドラジド基の含有率をＴＮＢＳ方法によって決定した。実施例１に記述されているものと同じ要領でこの共重合体に対しドキソルビシンを連結した。

抗体（免疫グロブリン）分子中への−ＳＨ基の導入：ＰＤ−１０カラム内で１ｍｌのリン酸緩衝液（０．０５ＭのＮａＨ₂ＰＯ₄／Ｎａ₂ＨＰＯ₄；０．１ＭのＮａＣｌ；０．０１ＭのＥＤＴＡ；ｐＨ７．４）中に、１５ｍｇの抗体（ポリクローナル抗胸腺細胞ＩｇＧ）（０．１μｍｏｌ）を移した。５０μｌのＤＭＦ中で０．６７ｍｇの２−イミノチオラン（４μｍｏｌ）を溶解させ、これを激しく攪拌した抗体の溶液に添加した。実験室温度で２．５時間攪拌した後、生成物をＰＤ−１０カラム（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）中でのゲルろ過により単離した。Ellman試薬と−ＳＨ基の反応を利用した方法により、抗体（免疫グロブリン）の修飾レベルを決定した。

２０ｍｇの修飾済み抗体との、ドキソルビシン、ヒドラジド及びマレイミド基を含有する６０ｍｇのポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ｄｉＧｌｙ−ＮＨＮ＝Ｄｏｘ−ｃｏ−ＭＡ−Ｘ−ＮＨＮＨ₂−ｃｏ−ＭＡ−Ｘ−ＮＨＮＨ−ＭＩ）の接合を、実験室温度でｐＨ７．４のリン酸緩衝液内で実施した。ゲルろ過によって最終生成物を精製し、ＵＶ分光法（Ｄｏｘ含有率）、アミノ酸分析（抗体及び免疫グロブリン含有率）及びPhastsystem-Pharmacia ＬＫＢでの電気泳動（遊離タンパク質又は薬物の存在）を用いてこれを特徴づけした。

実施例４
抗体（免疫グロブリン）ターゲット・コンジュゲートＩＩの調製
第１の合成段階では、実施例３でＳＭＰでの重合体の修飾が行なわれた条件と類似の条件下でＳＰＤＰで、重合体前駆体ＩＩを修飾した。

０．６ｍｌの緩衝液中の（３．３μｍｏｌのピリジルジチオ（ＰＤ）基を含有する）４２ｍｇのポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ｄｉＧｌｙ−ＮＨＮ＝Ｄｏｘ−ｃｏ−ＭＡ−ｄｉＧｌｙ−ＮＨＮＨ₂−ｃｏ−ＭＡ−ｄｉＧｌｙ−ＮＨＮＨ−ＰＤ）の溶液を、攪拌しながら、１４ｍｇの抗体つまり１．７ｍｌのリン酸緩衝液／０．０５ＭのＮａＨ₂ＰＯ₄／Ｎａ₂ＨＰＯ₄；０．１ＭのＮａＣｌ；０．０１ＭのＥＤＴＡ；ｐＨ７．４）中に溶解した０．６８μｍｏｌの−ＳＨ基を含有する、−ＳＨ基で修飾された免疫グロブリン（以上参照）に添加した。反応混合物を７時間実験室温度で攪拌し、その後、低分子部分及びあらゆる未結合重合体をゲルろ過によって除去した。次にコンジュゲートを限外ろ過で濃縮し、実施例３で記述されたものと同様の要領で特徴づけした。

実施例５
抗体（免疫グロブリン）ターゲット・コンジュゲートＩＩＩの調製
これらのコンジュゲートは、穏やかな過ヨウ酸ナトリウム酸化によりその分子内にアルデヒド基が導入された抗体と、ドキソルビシンとの重合体前駆体−ＩＩの反応後に残ったヒドラジド基を反応させることによって調製された。

酸化された抗体の調製：ＰＤ−１０カラムを用いて緩衝酢酸溶液（０．０２ＭのＣＨ₃ＣＯＯＮａ／ＣＨ₃ＣＯＯＨ；０．１５ＭのＮａＣｌ；ｐＨ５）に対し４０ｍｇの抗体（ポリクローナル抗胸腺細胞ＩｇＧ）を移送した。ＮａＩＯ₄の０．１Ｍ溶液を、同じ緩衝液中で暗所にて調製した。抗体及び過ヨウ酸塩の溶液を４：１の比で混合して、ＮａＩＯ₄と抗体のそれぞれ０．０２ｍｏｌ／ｌ及び９ｍｇ／ｌという最終濃度に達した。反応混合物を２時間暗所にて実験室温度で攪拌し、その後反応混合物１ｍｌにつき２５μｌのエチレングリコールを添加した。２０分後、酸化された抗体（免疫グロブリン）を精製し、ＰＤ−１０カラム内での液体クロマトグラフィにより単離した。溶液中の抗体（免疫グロブリン）の濃度は、分光測光法によって決定した。アルデヒド基の数をLucifier Yellow ＣＨ染料とアルデヒド基の反応を利用した方法により決定した。

コンジュゲートサンプルの調製例：５ｍｌの緩衝酢酸溶液（０．０２ＭのＣＨ₃ＣＯＯＮａ／ＣＨ₃ＣＯＯＨ；０．１５ＭのＮａＣｌ；ｐＨ５）中の３６．５ｍｇの酸化された抗体を、１５℃まで冷却した時点で、１ｍｌの緩衝液中に溶解した結合済みＤｏｘを伴う７３ｍｇのポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ｄｉＧｌｙ−ＮＨＮ）＝Ｄｏｘ−ｃｏ−ＭＡ−ｄｉＧｌｙ−ＮＨＮＨ₂）重合体前駆体ＩＩの溶液と混合した。１６時間後に、反応混合物のｐＨを０．１ＭのＮａＯＨでｐＨ７．２まで調整した。低分子部分と未結合重合体をゲルろ過によりコンジュゲートから除去した。その後コンジュゲートを濃縮し、抗体（免疫グロブリン）とのその他のコンジュゲートと同じ要領で特徴づけした。

重合体との接合のためには、ヒト及びウサギの非特異的免疫グロブリン（ＩｇＧ）、ポリクローナル抗胸腺細胞（ＡＴＧ）、モノクローナル抗体抗Ｔｈｙ１，２、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ７１、抗−ＢＣＬＩ、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ８、抗−ＣＤ１４及び腫瘍関連抗原に対するその他の抗体（抗−ＴＡＡ）が用いられた。

実施例６
重合体コンジュゲートからのドキソルビシンのin vitro放出
コンジュゲートの加水分解安定性及び重合体からの活性薬物の放出速度を、さまざまなｐＨ及び温度でモデル系の中で測定した。図５は、血液ｐＨをモデル化するｐＨ（７．４）及びエンドソーム又はリソソーム環境をモデル化するｐＨ（ｐＨ５〜６）における、スペーサ組成の異なる重合体からのドキソルビシン放出速度の測定結果を示している。連結されたＤｏｘの濃度（０．５ｍｍｏｌ．１^-1）は、実験中０．１Ｍの緩衝酢酸溶液（ＣＨ₃ＣＯＯＮａ／ＣＨ₃ＣＯＯＨ、０．０５Ｍ、ＮａＣｌ）内で一定であった。サンプルを３７℃で暗所にてインキュベートし、予め定義された間隔で０．１ｍｌの部分を取り、溶液からのＤｏｘの抽出後ＨＰＬＣを用いて分析した。結果は、薬物と重合体担体の間の連結の構造が担体からの薬物の放出速度に影響を及ぼし、放出速度は血液ｐＨで比較的低く細胞環境をモデル化するｐＨでは１０倍以上高いものである、ということを示している。血管内の薬物保持期間が比較的短かいという事実を考慮すると、実験は、輸送中の重合体コンジュゲートの相対的安定性そして細胞中へのその浸透後に最初に活性薬物を放出するその能力を確認するものである。

実施例７
正常なリソソーム含有率をもつ細胞内の加水分解により放出されたドキソルビシンを含有する重合体コンジュゲートのin vitro細胞毒性活性
標的細胞の細胞分裂又は増殖を減少させる重合体コンジュゲートの能力は、細胞毒性又は細胞増殖抑制活性と呼ばれる。細胞増殖抑制活性は、標的細胞核に対する³Ｈ−チミジンの取込みの阻害によりin vitroで検出された［Rihova et al, 2000］。チミジンの取込み及びコンジュゲートの活性は、間接的に正比例する。チミジンの低い取込みは、テスト対象物質の高い細胞毒性活性を意味する。選択されたＴＭ系統（マウスＴ白血病系統ＥＬ４、マウスＢ細胞白血病ＢＣＬ１、マウスＢ細胞リンパ腫３８Ｃ１３、原発ヒト結腸直腸ガンＳＷ４８０、転移性ヒト結腸直腸ガンＳＷ６２０、Ｔｈｙ１．２についてマウス遺伝子によって遺伝的に修飾されたヒト結腸直腸ガンＳＷ６２０、ＳＷ６２０／Ｔ）及びＴ細胞マイトジェンすなわちコンカナバリンＡにより刺激されたマウス脾細胞、及びヒト末梢リンパ球を、成長培地ＲＰＭＩ中１×１０⁴〜５×１０⁵（使用されるテスト細胞系による）の量で９６ウェルのＦＢ組織平板（ＮＵＮＣ、デンマーク）内にピペットで取った。その後の培養は、さらなる刺激を与えずに（全てのＴＭ系統及び罹患していないマウス及びヒトリンパ球）、又は正常な激しく増殖するＴ−リンパ球についての効果を研究すべきである場合には、コンカナバリンのＴ細胞マイトジェンの存在下で実施した。細胞が中で培養されるコンカナバリンＡの濃度は、１．２５μｇ／ウェルであった。コンカナバリンＡを伴う又はそれを伴わない培地中のテスト細胞を含有する組織平板の各々の実験用ウェルに対して、０．００１６〜８０μｇ／ｍｌの最終濃度のテストサンプル又は遊離ドキソルビシンを添加した。合計ウェル容積は２５０μｌであった。各々の濃度を１つのサンプル及び１つの系統において３〜５回並行してテストした。マイクロタイトレーション組織平板を３７℃で２４〜７２時間、５％のＣＯ₂の雰囲気内でインキュベートした。培養完了後、１μＣｉの³Ｈ−チミジンを各ウェルに添加した。さらに５〜６時間後（システムによる）、グラスファイバフィルタ（Filtermat, Wallac）上に細胞を収集し（Tomtec細胞収集装置）、乾燥させ、取込まれた放射能について評価した（MicroBeta Trilux, Wallac）。加水分解によって放出されたドキソルビシンを含有する非ターゲット・コンジュゲートについてのＩＣ₅₀は、コンジュゲートの耐性（使用される標的系統の治療に対する感受性）及びタイプに応じて、０．０１μｇドキソルビシン／ｍｌ〜１．４１μｇドキソルビシン／ｍｌの範囲内であった。細胞毒性は、薬物を伴わないコンジュゲートが細胞毒性を示さないことから、加水分解により放出されたドキソルビシンを含有するコンジュゲートに限られた特性であるということが確認された。

in vitro試験は、ａ）加水分解により放出可能な薬物を伴うコンジュゲートの活性が薬物とオリゴペプチドによる連結の間の共有結合の酵素分解性によって左右されないこと、そしてｂ）基本的重合鎖と薬物の間の連結がε−アミノカプロン酸又はｐ−アミノ安息香酸によってのみ形成されているコンジュゲートが、ジ−又はテトラペプチドによる連結を含有するものと同等に有効であること、を証明した。

実施例８
低いリソソーム含有率をもつ細胞内での加水分解により放出されるドキソルビシンを含む重合体コンジュゲートのin vitro細胞毒性活性
実施例７で記述したものと同じ要領で、細胞毒性活性のin vitro試験を実施した。標的細胞として、低いリソソーム含有率をもつ赤白血病系統Ｋ５６２の細胞を選択した。酵素により放出されるドキソルビシンを伴うコンジュゲートがきわめて限定された度合でしか細胞毒性を有していないこの系統においてさえ、加水分解により放出されるドキソルビシンを含有するコンジュゲートが著しく細胞毒性を示す、ということが証明された（図７）。この結果は、加水分解により放出されるドキソルビシンが、リソソームの少ない細胞系においてさえ有効であることを示している。

実施例９
加水分解により放出されるドキソルビシンを含有する重合体コンジュゲートのin vivo抗腫瘍活性（図８）
近交系Ｃ５７ＢＬ／１０のマウスに、Ｔ−細胞リンパ腫（ＥＬ４）を皮下移植した。腫瘍細胞をマウス一匹につき１×１０⁵個の細胞という量で実験動物の背中の下半身に注射した。細胞移植の日を０日目とマークした。次に加水分解により放出されるドキソルビシンを伴う重合体コンジュゲートを１、３、５、７及び９日目（予防的投与計画）、１０、１２、１４、１６及び１８日目又は１２、１４、１６、１８及び２０日目（治療的投与計画）のいずれかに腹腔内投与した。ドキソルビシンの日用量はマウス一匹あたり５０μｇであった。コンジュゲートは、ＴＭの成長を有意な形で減少させ、長期生存実験動物の数を増大させた。薬物を含まない重合体コンジュゲートは全く効果がなく、従来のすなわち修飾されていないドキソルビシンは非常に限定された効果（対照グループにおける３５日とは異なり、実験動物の最大生存期間は４０日であった）を有していた一方で、加水分解により放出されるドキソルビシンを伴う重合体コンジュゲートの投与は、それぞれ保護的投与計画及び治療的投与計画にあるマウスの４０％及び２０％において、長期生存すなわち８０日以上の生存を可能にした。

近交系Ｂａｌｂ／Ｃのマウスに、Ｂ−細胞白血病ＢＣＬ１を腹腔内移植した。腫瘍細胞をマウス一匹につき５×１０⁵個の細胞という量で注射した。細胞移植の日を０日目とマークした。次に加水分解により放出されるドキソルビシンを伴う重合体コンジュゲートを１１、１３、及び１７日目（治療的投与計画）に静脈内投与した。ドキソルビシンの日用量はマウス一匹あたり１００μｇであった。テスト対象のコンジュゲートは、有意な抗ＴＭ活性を有していた。対照マウスは４０日未満しか生存しなかったが、テスト対象のコンジュゲートで治療されたマウスの２０％は、１００日以上、そして１０％は１４０日以上生存した。

参考文献
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K. Ulbrich, V. Subr, J. Strohalm, D. Plocova, M. Jelinkova, B. Rihova,合成及び天然の高分子Ｉのコンジュゲートをベースとした重合体薬物。合成及び物理化学的特徴づけ。J. Controlled Rel. 64, 63-79 (2000)
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Julyan, P.J., Seymour, L.W., Ferry, D.R., Daryani, S., Boivin, CH. M, Doran,J., David, M., Anderson, D., Christodoulou, CH., Young, A.M., Hesslewood, S., Kerr, D.J.: ドキソルビシン及びガラクトサミンを担持するＨＰＭＡ共重合体の分布の予備的臨床研究、J. Control. Rel. 57, 281-290 (1999)
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Tomas Etrych, Marketa Jelinkova, Blanka Rihova, Karel Ulbrich, ｐＨ感受性リンケージを介して結合したドキソルビシンを含有する新しいＨＰＭＡ共重合体。合成、in vitro及びin vivoでの生物学的特性 J. Controlled Rel. 73, 89-102 (2001)

薬物との線形重合体コンジュゲートの構造を示す。生分解性オリゴペプチドによる連結を伴う重合体有枝高分子構造を示している。ターゲティング抗体を含むコンジュゲートの構造を示す。重合体前駆体を示す。本発明のコンジュゲートからのドキソルビシンの放出速度の測定結果を示す。さまざまな連結を用いて結合させられた本発明のコンジュゲートのin vitro阻害活性の比較結果を示す。さまざまな連結を用いて結合させられた本発明のコンジュゲートのin vitro阻害活性の比較結果を示す。本発明のコンジュゲートの抗腫瘍活性のin vivo研究の結果を示す。

Claims

重合体鎖を形成するように連結された３０〜３０００の単量体ユニットによって構成される重合体担体から成るコンジュゲートであって、以下の：
ａ．６０〜９９％の、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドのユニット、
ｂ．１〜２５％の、アントラサイクリン系制癌剤分子を末端にもつα−アミノ酸、ε−アミノ酸、芳香族アミノ酸又はオリゴペプチドのメタクリロイル化ヒドラゾンのユニット、
ｃ．０．５〜１５％の、メタクリロイル化α−アミノ酸、ε−アミノ酸、芳香族アミノ酸又はオリゴペプチド、あるいはそのナトリウム塩のユニット、及び、場合により
ｄ．０．５〜１０％の、α−アミノ酸、ε−アミノ酸、芳香族アミノ酸又はオリゴペプチドのメタクリロイル化ヒドラジドのユニット、
から成る前記コンジュゲート。
０．５〜５％の、免疫グロブリン、又は特異的モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体の分子を末端にもつメタクリロイル化α−アミノ酸、ε−アミノ酸又はオリゴペプチドをさらに含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
０．１〜５％の、重合体鎖の間で２価の連結を形成し、それにより前記コンジュゲートの架橋構造を形成する、アルキレン・ジアミンとインターリンクした酵素分解可能なメタクリロイル化オリゴペプチド・ユニットをさらに含む、請求項１又は２に記載のコンジュゲート。
前記アントラサイクリン系制癌剤がドキソルビシンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
以下の一般式：

によって表される、請求項１に記載のコンジュゲートであって、個々の構造ユニットが鎖内に無作為に配置されており、かつ、式中、Ｘが、α−アミノ酸、ω−アミノ酸又はオリゴペプチド由来のアミノ酸又はオリゴペプチド残基により形成された好適な連結であり、ｘが、２０〜３０００の範囲内にあり、ａが、１〜７５０の範囲内のあり、ｂとｃが、各々１〜４５０の範囲内にある前記コンジュゲート。
以下の一般式：

｛式中、
Ｘ、ｘ、ａ、ｂ及びｃが、先に規定した通りであり、
ｄが、１〜５０の範囲内にあり、
Ｓが、記号の付いた構造により重合体鎖に連結された以下の組：静中用γ−グロブリン、自己抗体、抗１７−１Ａ抗体、抗ＣＡ１５−３抗体などの中から選択されるいずれかの抗体であるか、又は
Ｓが、さらなる類似の鎖を連結する生分解性オリゴペプチドを意味する。｝によって表される、請求項２に記載のコンジュゲート。
使用されるアミノ酸又はオリゴペプチドが、以下の組：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＧｌｙＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ、β−アラニン、γ−アミノブチル酸、ε−アミノカプロン酸（ＡＫａｐ）、ｐ−アミノ安息香酸（ＡＢ）の中から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
使用される抗体が、以下の組：静中用γ−グロブリン、自己抗体、抗１７−１Ａ抗体、抗ＣＡ１５−３抗体及び他の腫瘍特異的及び腫瘍関連抗体の中から選択される、請求項２又は６に記載のコンジュゲート。
線状鎖を連結する２価のユニットが、以下の組：ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙの中から選択される、請求項３に記載のコンジュゲート。
活性成分として請求項１〜９のいずれか１項に記載のコンジュゲートを含むことを特徴とする、腫瘍治療用医薬組成物。
乳房腫瘍又は結腸直腸腫瘍といった腫瘍の治療のために設計された、請求項１０に記載の医薬組成物。