CZ297827B6 - Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva - Google Patents
Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva Download PDFInfo
- Publication number
- CZ297827B6 CZ297827B6 CZ20050558A CZ2005558A CZ297827B6 CZ 297827 B6 CZ297827 B6 CZ 297827B6 CZ 20050558 A CZ20050558 A CZ 20050558A CZ 2005558 A CZ2005558 A CZ 2005558A CZ 297827 B6 CZ297827 B6 CZ 297827B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- polymer
- process according
- doxorubicin
- polymerization
- polymeric
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Abstract
Zpusob prípravy polymerních konjugátu N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu a methakryloylaminoacylhydrazonu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva, zahrnující tri stupne syntézy: a. prípravu monomerního methakryloylaminoacylhydrazinu, kde aminoacyl je odvozen od aminokyseliny nebo oligopeptidu,reakcí methakryloyl halogenidu s príslusným peptidem, aminokyselinou nebo jejich derivátem a následnou hydrazinolýzou, b. syntézu polymerních prekurzoru prímou kopolymerací N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu s methakryloylaminoacylhydrazinem a c. navázání doxorubicinu na polymerní prekurzor jeho reakcí s doxorubicin hydrochloridem.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu vodorozpustných polymerních kancerostatik umožňujících cílený transport a řízené uvolňování cytostatik v organizmu, preferenčně v nádorové tkáni a nádorových buňkách. Použití polymerních konjugátů je zaměřeno na cílenou terapii nádorových onemocnění v humánní medicíně.
Dosavadní stav techniky
Vývoj nových farmakologicky účinných látek, především kancerostatik, se stále více zaměřuje na formy, které umožňují specifické působení aktivní složky pouze v určité tkáni a nebo dokonce jen v určitém typu buněk. Při příprav těchto látek se stále více uplatňuje použití přírodních a nebo syntetických makromolekul - polymerů. Byla připravena a studována celá řada polymerních konjugátů kancerostatik a bylo ukázáno, že ve většině případů je nezbytné pro dosažení farmakologické účinnosti polymemí formy léčiva zajistit uvolnění cytotoxické látky zjejí polymemí formy. Dále bylo ukázáno, že vhodná molekulová hmotnost polymereího nosiče může zajistit přednostní ukládání polymemího léčiva v nádorové tkáni celé řady pevných nádorů (tzv. EPR efekt) [H. Maeda, J. Wu, T. Sawa, Y. Matsumura, K. Hoři, Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J. Control. Release 65, 271-284 (2000)]. Uvolnění cytostatika z polymemího nosiče může být řešeno prostřecnictvím biodegradovatelné spojky, použité k vazbě léčiva na polymer, jejíž degradace v cílové tkáni vede k cílené a řízené aktivaci léčiva přednostně v této tkáni. Významnou skupinu takovýchto léčiv tvoří polymemí léčiva připravená na bázi kopolymerů A-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA). Přehled dosud dosažených výsledků v této oblasti je velmi dobře zpracován v monografii (G. S. Kwona a práci J. Kopečka a spol. [J. Kopeček, P. Kopečková, T. Minko, Z. Lu, HPMA Copolymer-Anticancer Drug Conjugates: Design, Activity, and Mechanism of Action. Europ. J. Pharm. Bioharm. 50, 61-81 (2000)., G.S. Kwon, Polymeric Drug Delivery Systems, Series: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol 148, Dekker, Marcel Incorporated, 2005]. V poslední době byly publikovány studie o působení polymerních léčiv, ve kterých bylo kancerostatikum dexorubicin navázáno na polymemí nosič, připravený na bázi kopolymerů HPMA, prostřednictvím hydrolytické nestálé hydrazonové vazby [T. Etrych, M. Jelínková, B. Říhová, K. Ulbric, New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH sensitive linkage. Synthesis, in vitro and in vivo biological properties. J. Controlled Rel. 73, 89-102 (2001), T. Etryc, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, K. Ulbrich, Synthesis of HPMA Copolymers Containing Doxorubicin Bound via a Hydrazone Linkage. Effect of Spacer on Drug Release and in vitro Cytotoxicity. Macromolecular Biosci. 2, 43-52 (2002). B. Říhová, T. Etrych, M. Pechar, M. Jelínková. M. Šťastný, O. Hovorka, K. Kovář. K. Ulbrich, Doxorubicin Bound to a HPMA Copolymer Carrier Through Hydrazone Bond is Effective also in a Cancer Cell Line with a Limited Content of Lysosomes. J. Controlled Release 74, 225-232 (2001), K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková. B. Říhová, HPMA Copolymers with pH-Controlled Release of Doxorubicin. In vitro Cytotoxicity and in vivo Antitumor Activity J. Controlled Release 87, 33-47 (2003), K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, Antibody-Targeted Polymer-Doxorubicin Conjugates with pH-Controlled Activation. J. Drug Targeting, 12, 477-490 (2004), K. Ulbrich. T. Etrych, P. Chytil, M. Pechar, M. Jelínková, B. Říhová, Polymeric Anticancer Drugs with pHControlled Activation. Int. J. Pharm. 277/1-2 67-72 (2004)] a tyto látky byly patentovány [K. Ulbrich, T. Etiych. B. Říhová, M. Jelínková, M. Kovář: pH Senzitivní polymemí konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii. CZ 293787; CZ 293886], Takováto léčiva vykazovala podstatné snížení vedlejších, především toxických účinků na zdravý organizmus za současného výrazného zvýšení protinádorového účinku ve srovnání s běžně užívanými cytostatiky [B. Říhová, T. Etrych, M. Pechar, M. Jelínková, M. Šťastný, O. Hovorka. M. Kovář, K.
- 1 CZ 297827 B6
Ulbrich, Doxorubicin Bound to a HPMA Copolymer Carrier Throgh Hydrazone Bond is Effective also in a Cancer Cell Line with a Limited Content of Lysosomes. J. Controlled Release 74, 225-232 (2001), M. Kovář, L. Kovář, V. Šubr, T. Etrych, K. Ulbrich, T. Mrkvan, J. Loucká and B. Říhová, HPMA Copolymers Containing Doxorubicin Bound by Proteolyticaly or Hydrolytically Cleavable Bond: Comparison of Biological Properties In vitro. J. Controlled Release 99,301-314 (2004), O. Hovorka, T. Etrych, M. Šubr, J. Strohalm, K. Ulbrich, B. Říhová, Differences in the Intracellular Fate of Free and Polymer-Bound Doxorubicin. J. Controlled Release 80, 101-117(2002)].
Syntéza takovýchto konjugátů byla prováděna nejdříve polymeranalogickou reakcí polymemích 4-nitrofenylových esterů (ONp) s hydrazinem a později kopolymerizací HPMA s jV-Boc (tbutyloxykarbonyl) skupino chráněnými methakryloylovanými hydrazidy. Ani jeden z postupů nevedl k přípravě přesně definovaných preparátů (v případě ONp esterů dochází k přenosovým reakcím a hydrolýze části ONp skupin v průběhu hydrazinolýzy, v případě Boc hydrazidů k degradačním reakcím v průběhu odblokování hydrazidových skupin) a zároveň neumožňoval volbu širokého rozmezí molekulových hmotností polymemího řetězce, syntéza neumožňovala přípravu velkých šarží a reprodukovatelnost přípravy jednotlivých šarží byla poměrně nízká. Navíc syntézy byly vícekrokové, což představovalo jistou časovou a finanční náročnost příprav. Předmětem tohoto vynálezu je optimalizovaný a reprodukovatelný způsob přípravy polymemích cytostatik na bázi kopolymerů HPMA s doxorubicinem vázaným pH labilní hydrazonovou vazbou k polymemímu nosiči, který odstraňuje prakticky všechny výše uvedené nedostatky dříve publikovaných příprav, především umožňuje zvýšit výtěžky při syntéze monomerů i polymemího prekurzoru, poskytuje možnost přesně řídit molekulové hmotnosti polymemích prekurzorů a konečného produktu, struktura je díky výhodným kopolymeračním parametrům dobře definovaná, syntéza je výrazně jednodušší a levnější, umožňuje „scale-up“ na velké šarže a reprodukovatelnost syntézy je velmi dobrá. Protinádorová aktivita polymemích cytostatik připravených podle patentového postupuje stejná, nebo dokonce i lepší nežli u cytostatik připravených původními postupy.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je postup přípravy polymemího konjugátu HPMA kopolymerus doxorubicinem vázaným na polymer prostřednictvím různých spojen obsahujících hydrolyticky štěpitelné hydrazonové vazby. Postup přípravy zahrnuje třístupňovou syntézu sestávající ze syntézy monomerů, tj. přípravy monomemího methakryloyl aminoacylhydrazinu, syntézy polymemích prekurzorů a finální vazby kancerostatika doxorubicinu na polymemí nosič kovalentní hydrazonovou vazbou.
Syntéza monomerů vychází ze syntézy HPMA monomeru již dříve popsaným způsobem [K. Ulbrich, V. Šubrt, J. Strohalm, D. Plocová, M. Jelínková, B. Říhová, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules I. Syntihesis and Physico-chemical Characterisation J. Controlled Rel. 64, 63-79 (2000)]. Syntéza mehakryloyl(aminoacyl)-hydrazinů lišících se strukturou acylové komponenty byla velmi podobná u všech připravených monomerů a vychází z methakryloylace methalesteru hydrochloridu příslušné aminokyseliny nebo oligopeptidu methakryloylchloridem prováděné v dichlormethanu v přítomnosti bezvodého uhličitanu sodného. Výsledný produkt byl převeden na methakryloylovaný aminoacylhydrazin hydrazinolýzou příslušného methylesteru hydrazin hydrátem prováděnou v methanolovém roztoku v přítomnosti NaOH. Jako aminoacyl v methakryloyl(aminoacyl)hydrazinech byl s výhodou použit glycyl, glycylglycyl, β-alanyl, 6-aminohexanoyl, 4-aminobenzoyl a nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly nebo GlyPheLeuGly. Jako příklad syntézy methakryloyl(aminoacyl)hydrazinu je uvedena v příkladu 1 syntéza 6-methakroyl(aminohexanoyl)hydrazinu jako příklad syntézy jednoduchého acylu (spaceru), methakroylglycylglycylhydrazinu jako monomeru s dipeptidovým spacerem a methakroylglycyfenylalanylleucylglycylhydrazinu jako monomeru s enzymaticky degradovatelným oligopeptidem.
-2CZ 297827 B6
Syntéza polymerních prekurzorů - kopolymerů HPMA s methakryloylovanými aminoacylhydraziny je založena na přímé radikálové kopolymerizaci HPMA s odpovídajícími methakryloylovanými hydraziny. Polymerace je prováděna v roztoku za použití methanolu, ethanolu, dimethylsulfoxidu nebo dimethylformamidu jako polymeračního prostředí. V obou případech je polymerizace iniciována tepelně rozložitelnými iniciátory radikálové polymerizace na bázi azo nebo peroxy iniciátorů. S výhodou byl použit azobis(izobutyronitril) (AIBN), azobis(izokyanovalerová kyselina) (ABIK) nebo diizopropylperkarbonát (DIP). Teplota polymerizace se řídí příslušným iniciátorem a použitým rozpouštědlem (AIBN, ABIK v methanolu, ethanolu, DMF a DMSO 50 až 60 °C, DIP 40 až 50 °C). Obvyklá doba polymerizace je 15 až 18 h. Příprava všech polymerních prekurzorů radikálovou polymerizací je analogická, příklady kopolymerizace HPMA s methakrylovanými hydrazidy jsou uvedeny v příkladech 2a až 2c. Oproti dříve používané hydrazinolýze reaktivních esterů nebo kopolymerizaci Boc skupinou chráněných hydrazidů vede přímá kopolymerizace k definovaným a reprodukovatelně připraveným polymerům připraveným ve velkých šaržích a ve velkém výtěžku.
Vazba doxorubicinu na polymemí prekurzor vychází z vazebné reakce doxorubicin hydrochloridu na polymemí acylhydrazin za vzniku hydrazonové vazby. Reakce se provádí s výhodou v methanolu za katalýzy definovaného množství kyseliny octové. Reakce může být prováděna i v dimethylsulfoxidu, dimethylformamidu, sušeném ethanolu a dimethylacetamidu. Při použití jiných rozpouštědel nežli methanol reakce probíhá dobře, její výtěžky jsou však nižší. Vliv struktury spojky na průběh vazebné reakce je minimální. Pro dosažení optimálního výtěžku vazby a minimálního obsahu nenavázaného doxorubicinu v produktu je ve všech případech důležité dodržet koncentrace polymeru a kyseliny octové v reakční směsi: koncentrace polymeru 170 mg/ml, koncentrace kyseliny octové 55 mg/mL. Optimální doba reakce je 22 h při teplotě 25 °C. Polymemí léčivo je izolováno z reakční směsi srážením do ethylacetátu a přesrážením z methanolu opět do ethylacetátu. Příprava polymemího doxorubicinu vázaného na polymemí prekurzor - kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2)hydrazonovou vazbou (HMPA-AHNH-N=DOX) je uvedena v příkladu 3.
Součástí přípravy, i když ne nezbytnou, je i finální čištění konjugátu od volného nenavázaného léčiva pomocí gelové filtrace za použití kolony naplněné Sephadexem LH-20 a methanolu jako mobilní fáze.
Přehled obrázku na výkrese
Obr. 1 znázorňuje graf uvolňování DOX z polymerních konjugátů lišících se strukturou použité spojky mezi léčivem a polymerem. Teplota 37 °C, fosfátový pufr pH 5,5. GFLG je spojka tvořená sekvencí -GlyPheLeuGly-, GLG je -GlyLeuGly-, Aminobenzoic je 4-aminobenzoyl a Acap je 6-aminohexanoyl.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Syntéza monomerů
HPMA byl připraven podle dříve popsaného postupu [K. Ulbrich, V. Šubr, J. Strohalm, D. Plocová, M. Jelínková, B. Říhová, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules I. Synthesis and Physico-chemical Characterisation. J. Controlled Rel. 64, 6379 (2000)]. Elementární analýza: vypočteno 58,8 % C, 9,16 % H, 9,79 % N; nalezeno 58,98 % C, 9,18 % H, 9,82 % N. Produkt byl chromatograficky čistý.
-3CZ 297827 B6
6-(Methakroylamino)hexanoylhydrazin (MA-AH-NHNH2)
Methyl(6-aminohexanoát) hydrochlorid (30 g, 0,165 mol) byl za intenzivního míchání při laboratorní teplotě rozpuštěn ve 350 ml dichlormethanu s přídavkem cca 100 mg hydrochinonu. Roztok byl ochlazen na 10 až 15 °C, přidán bezvodý uhličitan sodný (50 g, 0,48 mol), teplota snížena na 5 až 10 °C a poté přikapán roztok methankroylchloridu (17,3 g, 0,165 mol (ekv.)) ve 100 ml dichlormethanu takovou rychlostí, aby teplota reakční směsi nepřesáhla 15 °C. Po spotřebování veškerého methakroylchloridu byla směs míchána ještě 45 min při teplotě 15 až 20 °C, poté byla chladicí lázeň odstavena, suspenze míchána ještě 20 min, odsáta na fritě č. 3, promyta 300 ml dichlormethanu a filtrát odpařen na rotační vakuové odparce do sucha. Odparek byl rozpuštěn ve 150 ml methanolu, přidán hydrazin hydrát (13 ml « 13,4 g, 0,267 mol), NaOH (1,5 g, 37,5 mmol) a reakční směs byla míchána 3 h při laboratorní teplotě. Po skončení hydrazinolýzy bylo pH roztoku upraveno přídavkem 35% HC1 (cca 12 ml) na 6,2 až 6,5, přidáno 300 g bezvodého síranu sodného a směs i se sušidlem odpařena k suchu. K odparku bylo přidáno 500 ml dichlormethanu, suspenze intenzivně míchána 2 h, odsáta na fritě č. 4, důkladně promyta dalšími 500 ml dichlormethanu a filtrát zahuštěn na odparce na objem 150 až 200 ml. Roztok byl zředěn 1500 ml ethylacetátu, zahuštěn ke krystalizaci na odparce na objem 300 až 350 ml a ponechán dokrystalovat po dobu 24 h v mrazicím boxu. Produkt byl odsát, promyt malým množstvím chladného ethylacetátu a vakuově sušen. Výtěžek po první krystalizaci činil 29,5 g produktu (84 %) teplotou tání 79 až 81 °C, opakovaná krystalizace stejným postupem poskytla 27,0 g produktu (77 %) s teplotou tání 80 až 82 °C. Elementární analýza: Vypočteno: C 56,32 %, H, 8,98 %, N 19,70 % Nalezeno: C 56,49 %, H 8,63 %, N 19,83 %. H-NMR 300 MHz, (CDC13, 297 K): 1,35 m (2H, CH2(CH2)2-N); 1,50-169 m (4H, CH2CH2CH2CH2-N); 1,95 dd (3H, CH3); 2,17 t (2H, ((C=O)-CH2); 3,26 dt (2H, N-CH2); 3,91 s (2H, NH2); 5,30 t (1H, C=CH2E); 5,67 t (1H, C=CH2Z); 6,10 s (1H, NHNH2); 7,45 s (1H, NH-CH2). Produkt byl chromatografícky čistý, 1 pík při 4,72 min (kolona s reverzní fází Tessek SGX Cjg (7 pm, 125x4 mm), průtok 0,5 ml/min, gradient od 40 do 100% roztoku B v průběhu 35 min (roztok A: 10% methanol, 89,9% voda, 0,1 % trifluoroctové kyseliny (TFA); roztok B: 89,9 % methanol; 10 % voda; 0,1 % TFA), UV detekce).
Methakroylglycylglycylhydrazin (MA-GlyGly-NHNH2)
Příprava MA-GlyGly-NHNH2 byla prováděna za podobných podmínek, jako v případě MAAH-NHNH2. Glycylglycin methylester (21,4 g, 0,1 mol) byl rozpuštěn ve 250 ml dichlormethanu s přídavkem 60 mg hydrochinonu. Po ochlazení na cca 12 °C byl přidán bezvodý uhličitan sodný (30,2 g, 0,29 mol), a za chlazení na 5 až 10 °C pomalu přikapán roztok methakroylchloridu (10,4 g, 0,1 mol) v 60 ml dichlormethanu. Po ukončení reakce, odfiltrování a promytí sraženiny cca 230 ml dichlormethanu bylo odpařeno veškeré rozpouštědlo. Odparek byl rozpuštěn ve 120 ml methanolu a provedena hydrazinolýza hydrazin hydrátem (7,9 ml « 8,1 g, 0,166 mol), prováděná v přítomnosti NaOH (0,91 g, 22,7 mmol). Po skončení hydrazinolýzy bylo pH roztoku upraveno přídavkem 35% HCI (cca 12 ml) na 6,2 až 6,5, přidáno 230 g bezvodého síranu sodného a směs i se sušidlem odpařena k suchu.Po extrakci 300 ml dichlormethanu byla suspenze odsáta na fritě, promyta dalšími 300 ml dichlormethanu a filtrát zahuštěn na objem cca 120 ml. Roztok byl zředěn 900 ml ethylacetátu a po zahuštění na odparce na 250 ml ponechán krystalovat v mrazicím boxu. Po rekrystalizaci byl produkt izolován filtrací, promyt malým množstvím chladného ethylacetátu a sušen za vakua. Výtěžek byl 15,0 g produktu (70 %), t.t. 172 až 174 °C. Elementární analýza: Vypočteno: C 44,86 %, H 6,54 %, N 26,16 % Nalezeno: C 45,01 % H, 6,57 %, N 26,02 %. Produkt byl chromatografícky čistý, jeden pík při 21,97 min.
Methakroylglycylfenylalanylleucylglycylhydrazin (MA-Gly-D,L-PheLeuGly-NHNH2)
Syntéza tohoto monomeru byla prováděna obdobně jako v obou předchozích případech (postup viz výše). Složení reakční směsi a podmínky byly následující:
-4CZ 297827 B6
Glycylfenylalanylleucylglycin methylester (22,32 g, 0,05 mol), dichlormethan 510 ml (270 + 240 ml), hydrochinon (60 ml), uhličitan sodný (15,1 g, 0,145 mol) a methakroylchlorid 5,2 g (0,5 mol) byly použity pro přípravu methakrylovaného methylesteru. K hydrazinolýze bylo použito 4,1 g (0,085 mol) hydrazin hydrátu ve 120 ml methanolu a 0,46(11,3 mmol) NaOH. Pro sušení bylo použito 210 g bezvodého síranu sodného a pro extrakce 2 x 290 ml dichlormethanu. Produkt byl krystalován ze směsi dichlormethan - ethylacetát. Výtěžek byl 60 % produktu t.t. 139 až 140 °C. Elementární analýza: Vypočteno: C 58,10 %, H 7,36 %, N 17,68 % Nalezeno: C 58,21 %, H 7,39 %, N 17,54 %. Produkt byl chromatograficky čistý, dva píky o shodné ploše při 19,39 (monomer obsahující L-Phe) a 19,91 min (D-Phe).
Příklad 2a: Syntéza polymemího prekurzoru - kopolymeru HPMA s 6-(methakroylamino)hexanoylhydrazine (poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2))
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHNH2 iniciovanou AIBN v methanolu při 60 °C. 122,8 g HPMA a 13,94 g MA-AH-NHNH2 (18 hmotn. % monomerů) bylo rozpuštěno v 780 ml metanolu, k roztoku bylo přidáno 6,06 g ABIN (0,8 hmotn. %) Po filtraci byla polymerizační směs vložena v argonové atmosféře do polymerizačního reaktoru (objem 1,5 1) umístěného v termostatu. Polymerizační směs byla míchána při vyšších otáčkách (kolem 100 rpm). Nad hladinu byl ještě několik minut zaváděn dusík. Teplota polymerizační směsi byla nastavena na 60 °C polymerizace probíhala za míchání (50 rpm) v dusíkové atmosféře. Dusík byl odváděn před probublávací zařízení.
Polymerizační směs byla po 17 h vyjmuta z termostatu, ochlazena v lázni na pokojovou teplotu a polymer byl izolován vysrážením do ethylacetátu (celkem 8 1). Vysrážený polymer byl ponechán sedimentovat cca 0,5 h, roztok nad sraženinou byl odsát a polymer byl izolován filtrací na fritě S4. Sraženina byla promyta ethylacetátem, přemístěna na velké Petriho misky a sušena při laboratorní teplotě za vakua membránové vývěvy cca 1 h.
Polymer byl za pomoci ultrazvuku rozpuštěn v 550 ml methanolu (Erlenmeyerova baňka o objemu 1 1) a přesrážen do 7,5 1 ethylacetátu stejným postupem jako při prvé izolaci. Vysrážený polymer byl po cca 0,5 h sedimentaci izolován filtrací na fritě S4, promyt ethylacetátem a sušen do konstantní hmotnosti (cca 5 h) na membránové vývěve a dosušen za vakua olejové vývěvy.
Charakterizace kopolymeru:
Výtěžek 114 g (83 %), obsah hydrazidových skupin 5,83 mol %, molekulová hmotnost Mw = 28500 g/mol, index polydisperzita In = 1,9.
Příklad 2b: Syntéza polymemího prekurzoru - kopolymeru HPMA s methakroylglycylglycylhydrazinem (poly(HPMA-co-MA-GlyGly-NEINH2))
Provedení a postup polymerizace byly stejné jako v příkladu 2a, rozdíl byl ve složení polymerizační směsi. Složení polymerizační směsi bylo následující: HPMA 10 g (70 mmol), MAGlyGly-NHNH2 1,5 g (7 mmol), diizopropylperkarbonát 1,15 g (0,91 % hmotn.) a dimethylformamid 115 ml. Teplota polymerizace byla 50 °C, doba polymerizace byla 16 h. Polymemí roztok byl před srážením do přebytku ethylacetátu zahuštěn na vakuové odparce na cca 2/3 původního objemu a srážení polymemího produktu bylo prováděno do 20tinásobného objemu srážedla. Polymer byl zbaven nízkomolekulámích příměsí přesrážením z methanolu do ethylacetátu. Výtěžek byl 8,5 g (70 %), obsah hydrazidových skupin 9,5 mol. %, molekulová hmotnost Mw = 41 700 g/mol, index polydispersity In = 2,1.
-5 CZ 297827 B6
Příklad 2c: Syntéza polymemího prekurzoru - kopolymerů HPMA s methakroylglycylfenylalanylleucylglycylhydrazinem (poly(HPMA-co-MA-GlyPheLeuGly-NHNH2))
Postup polymerizace byl stejný jako v příkladu 2a, rozdíl byl opět jen ve složení polymerizační směsi. Složení polymerizační směsi bylo následující:
HPMA 10 g (70 mmol), HPMA-co-MA-GlyPheLeuGly-NHNH2 2,5 g (5,6 mmol), azobis(izokyanovalerová kyselina) 1,125 g (1 % hmotn.) a dimethylsulfoxid 100 ml. Polymerizace byla prováděna při 55 °C a ukončena po 18 h. Polymer byl z polymerizační směsi izolován vysrážením do 20tinásobného přebytku ethylacetátu. Polymer byl přečištěn přesrážením z methanolu do ethylacetátu.
Výtěžek byl 9,75 g (78 %), obsah hydrazidových skupin byl 5,5 mol %, molekulová hmotnost Mw = 43 200 g/mol, index polydispersity In = 2,1.
Příklad 3: Příprava polymemího konjugátu PHPMA-AH-NH-N=DOX
Kopolymery s DOX navázaným k PHPMA nosiči hydrolyticky štěpitelnou hydrazonovou vazbou byly připraveny reakcí kopolymerů obsahujících hydrazidové skupiny poly(HPMA-co-MAAH-NHNH2) s DOX.HC1 v methanolu za katalýzy octovou kyselinou.
Roztok 15,384 g kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) v 92,1 ml methanolu (167 mg polymeru/ml) byl vložen do termostatované cely, ve které bylo umístěno 2,5 g DOX.HC1 (4,3 mmol). Nehomogenní suspenze byla míchána v temnu při 25 °C a po 1 minutě bylo přidáno
4.9 ml kyseliny octové (celkový objem 116 ml). V průběhu reakce došlo k pozvolnému rozpuštění suspenze, po 22 h reakce byl z homogenního roztoku polymemí produkt izolován srážením do 1 1 ethylacetátu, precipitát polymemího léčiva byl izolován filtrací na fritě S4, promyt 150 ml ethylacetátu a sušen do konstantní hmotnosti. Obsah celkového DOX byl stanoven spektrálně.
Mw a Mn byly stanoveny kapalinovou chromatografií (LC AKTA) s detekcí rozptylem světla (Multiangel detector DAWN DSP, Wyatt).
Charakterizace polymemího léčiva: Celkový výtěžek reakce vazby léčiva: 17,2 g (96 %), obsah celkového DOX 11,3 % váhových, obsah volného DOX 1,52 % z celkového obsahu DOX.
Příklad 4: Uvolňování doxorubicinu z polymemích konjugátů
Uvolňování doxorubicinu z konjugátů lišících se strukturou spojky mezi léčivem a polymerem („spacer“) bylo prováděno inkubací v 0,1 M fosfátovém pufru obsahujícím 0,15 M NaCl při 37 °C. pH pufru bylo nastaveno na podmínky v endosomech buněk, tj. mírně kyselé prostředí o pH 5,5. Alikvotní podíl inkubačního média byl odebírán v příslušných časových intervalech a obsah DOX byl stanoven po přidání uhličitanového pufru (0,1 M Na2CO3 + 4M NaCl), po extrakci do chloroformu a po odpaření rozpouštědla a převedení do methanolového roztoku pomocí HPLC (Shimadzu VP) na koloně C18 s reverzní fází Tessek SGX Cis (7 pm, 125x4 mm) při průtoku eluentu 0,5 ml/min a s použitím gradientu od 40 do 100 % roztoku B v průběhu 35 min (roztok A: 10 % methanol, 89,9 % voda, 0,1 % trifluoroctové kyseliny (TFA); roztok B:
89.9 % methanol; 10 % voda; 0,1 % TFA). Pro detekci byl použit fluorescenční detektor (Shimadzu RF-10AXL) (Xexc = 480 nm, λαη = 560 nm). Kalibrační křivka byla sestrojena pomocí doxorubicinu.
Výsledky měření uvolňování léčiva z konjugátů lišících se strukturou použité spojky („spaceru“) jsou uvedeny na obr. 1.
Claims (5)
1. Způsob přípravy polymemích konjugátů N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu a methakryloylaminoacylhydrazonu doxorubicinu spH-řízeným uvolňováním léčiva, vyznačující se třemi stupni syntézy:
a) reakcí methakryloyl halogenidu s peptidem nebo aminokyselinou vybranými ze skupiny zahrnující glycin, glycylglycin, β-alanin, kyselinu 6-aminohexanovou, kyselinu 4-aminobenzoovou a oligopeptidy GlyPheGly, GlyLeuGly nebo GlyPheLeuGly, nebo jejich derivátem, za vzniku methakryloylaminoacylhydrazinu a následnou reakcí s hydrátem hydrazinu,
b) přímou kopolymerací N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu se vzniklým methakryloyl aminoacylhydrazinem za vzniku polymemího prekurzoru a
c) reakcí získaného polymemího prekurzoru s doxorubicin hydrochloridem.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se acylace ve stupni a) provádí reakcí methylesteru hydrochloridu příslušné aminokyseliny nebo oligopeptidu s methakryloylchloridem v chlorovaném uhlovodíku v přítomnosti bezvodého uhličitanu sodného.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se reakce s hydrátem hydrazinu provádí reakcí methylesteru methakryloylované aminokyseliny nebo oligopeptidu s hydrátem hydrazinu za přítomnosti silné báze.
4. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se ve stupni b) provádí radikálová kopolymerace N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu s methakryloylaminoacylhydrazinem, iniciovaná tepelně rozložitelnými iniciátory na bázi azo nebo peroxy iniciátorů, s výhodou azobis(izobutyronitrilem), azobis(izokyanovalerovou kyselinou) nebo diizopropylperkarbonátem.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se polymerace provádí v rozpouštědle zvoleném buď z nízkých Cl až C5 alkoholů, nebo z aprotického polárního rozpouštědla.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že rozpouštědlo je zvoleno z methanolu, ethanolu, dimethylformamidu nebo dimethylsulfoxidu.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že je-li iniciátor zvolen zazobis(izobutyronitrilu) nebo azobis(izokyanovalerové kyseliny), provádí se polymerace při teplotě 45 až 70 °C, a použije-li se jako iniciátor diizopropylperkarbonát, provádí se polymerace při 30 až 60 °C.
8. Způsob podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se reakce polymemího prekurzoru ve stupni c) provádí v rozpouštědle zvoleném z bezvodých alkoholů C1 až C5 nebo polárních aprotických rozpouštědel za katalýzy kyselinou octovou a výsledný konjugát se vy sráží ethylacetátem.
9. Způsob podle nároku 8, v y z n a č u j í c í se t í m , že se rozpouštědlo zvolí z methanolu, sušeného ethanolu, dimethylformamidu nebo dimethylsulfoxidu.
10. Způsob podle nároku 9, vyznaču j ící se tí m , že se vstupní koncentrace polymeru zvolí v rozmezí 100 až 190 mg/ml a koncentrace kyseliny octové 30 až 80 mg/ml.
-7 CZ 297827 B6
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že je koncentrace polymeru 170 mg/ml a kyseliny octové 55 mg/ml při teplotě 25 °C.
5 12. Způsob podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se výsledný produkt čistí gelovou filtrací.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20050558A CZ2005558A3 (cs) | 2005-09-05 | 2005-09-05 | Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva |
| US12/065,745 US20080318879A1 (en) | 2005-09-05 | 2006-09-05 | Method for the Preparation of Polymeric Conjugates of Doxorubicin with Ph-Controlled Release of the Drug |
| EA200800756A EA015091B1 (ru) | 2005-09-05 | 2006-09-05 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНЫХ КОНЪЮГАТОВ ДОКСОРУБИЦИНА С КОНТРОЛИРУЕМЫМ pH ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА |
| AT06775676T ATE520419T1 (de) | 2005-09-05 | 2006-09-05 | Verfahren zur herstellung von polymer-konjugaten von doxorubicin mit ph-kontrollierter freisetzung des arzneimittels |
| PCT/CZ2006/000056 WO2007028347A2 (en) | 2005-09-05 | 2006-09-05 | Method for the preparation of polymeric conjugates of doxorubicin with ph- controlled release of the drug |
| UAA200804282A UA94594C2 (ru) | 2005-09-05 | 2006-09-05 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНЫХ КОНЪЮГАТОВ ДОКСОРУБИЦИНА С рН-КОНТРОЛИРОВАННЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ ЛЕКАРСТВЕННОГО ВЕЩЕСТВА |
| EP06775676A EP1922087B1 (en) | 2005-09-05 | 2006-09-05 | Method for the preparation of polymeric conjugates of doxorubicin with ph-controlled release of the drug |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20050558A CZ2005558A3 (cs) | 2005-09-05 | 2005-09-05 | Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ297827B6 true CZ297827B6 (cs) | 2007-04-04 |
| CZ2005558A3 CZ2005558A3 (cs) | 2007-04-04 |
Family
ID=37667174
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20050558A CZ2005558A3 (cs) | 2005-09-05 | 2005-09-05 | Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20080318879A1 (cs) |
| EP (1) | EP1922087B1 (cs) |
| AT (1) | ATE520419T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ2005558A3 (cs) |
| EA (1) | EA015091B1 (cs) |
| UA (1) | UA94594C2 (cs) |
| WO (1) | WO2007028347A2 (cs) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ298945B6 (cs) * | 2006-09-18 | 2008-03-19 | Zentiva, A. S. | Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby |
| CZ299053B6 (cs) * | 2006-08-09 | 2008-04-09 | Zentiva, A. S. | Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103257222A (zh) | 2006-08-09 | 2013-08-21 | 住友电木株式会社 | 糖链捕获物及其用途 |
| US20100316697A1 (en) * | 2007-05-10 | 2010-12-16 | Clear Direction Ltd. | Methods and compositions for drug targeting |
| WO2010127271A1 (en) | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Intezyne Technologies, Incorporated | Polymer micelles containing anthracylines for the treatment of cancer |
| US8524784B2 (en) | 2009-04-30 | 2013-09-03 | Intezyne Technologies, Incorporated | Polymer micelles containing anthracylines for the treatment of cancer |
| CN103936945B (zh) * | 2013-01-23 | 2017-02-08 | 中国科学院化学研究所 | 一类高效抗肿瘤靶向药物载体及其制备方法 |
| CN105727309B (zh) * | 2016-03-31 | 2019-04-30 | 中国药科大学 | 双敏感两亲性多糖-阿霉素偶联物及其药学组合物的制备和应用 |
| CN105963706B (zh) * | 2016-04-15 | 2019-03-15 | 四川大学 | 一种支化hpma共聚物-dox偶联物及其制备方法和应用 |
| CN105903031A (zh) * | 2016-05-05 | 2016-08-31 | 上海交通大学 | 肿瘤微环境敏感的药物控释纳米体系的制备方法及其应用 |
| GB2551979A (en) * | 2016-06-30 | 2018-01-10 | Rs Arastirma Egitim Danismanlik Llac Sanayi Ticaret Ltd | Cleavable polymer drug conjugates |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6060518A (en) * | 1996-08-16 | 2000-05-09 | Supratek Pharma Inc. | Polymer compositions for chemotherapy and methods of treatment using the same |
| CZ293787B6 (cs) * | 2001-12-20 | 2004-07-14 | Zentiva, A.S. | pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii |
| CZ293886B6 (cs) * | 2002-12-20 | 2004-08-18 | Zentivaźáa@S | pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii |
| EP1447099A2 (de) * | 1996-09-11 | 2004-08-18 | Felix Kratz | Antineoplastisch wirkende Polyethylenkonjugate zytostatischer Verbindungen und diese enthaltende Arzneimittel |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002953073A0 (en) * | 2002-11-21 | 2003-01-16 | Access Pharmaceuticals Australia Pty Limited | Amplification of biotin-mediated targeting |
| CZ294996B6 (cs) * | 2003-07-16 | 2005-04-13 | Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr | Reaktivní polymery a kopolymery na bázi N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, způsob jejich přípravy a jejich použití pro syntézu polymerních léčiv, pro modifikaci biologicky aktivních proteinů a přípravu systémů pro dopravu genů |
| WO2005117932A1 (en) * | 2004-06-04 | 2005-12-15 | The Board Of Governors For Higher Education, State Of Rhode Island And Providence Plantations | Bisubstrate inhibitors of protein tyrosine kinases as therapeutic agents |
| GB0413613D0 (en) * | 2004-06-17 | 2004-07-21 | Univ London | Small molecule carriers |
| US7968085B2 (en) * | 2004-07-05 | 2011-06-28 | Ascendis Pharma A/S | Hydrogel formulations |
-
2005
- 2005-09-05 CZ CZ20050558A patent/CZ2005558A3/cs not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-09-05 US US12/065,745 patent/US20080318879A1/en not_active Abandoned
- 2006-09-05 UA UAA200804282A patent/UA94594C2/ru unknown
- 2006-09-05 EP EP06775676A patent/EP1922087B1/en not_active Not-in-force
- 2006-09-05 AT AT06775676T patent/ATE520419T1/de not_active IP Right Cessation
- 2006-09-05 WO PCT/CZ2006/000056 patent/WO2007028347A2/en active Application Filing
- 2006-09-05 EA EA200800756A patent/EA015091B1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6060518A (en) * | 1996-08-16 | 2000-05-09 | Supratek Pharma Inc. | Polymer compositions for chemotherapy and methods of treatment using the same |
| EP1447099A2 (de) * | 1996-09-11 | 2004-08-18 | Felix Kratz | Antineoplastisch wirkende Polyethylenkonjugate zytostatischer Verbindungen und diese enthaltende Arzneimittel |
| CZ293787B6 (cs) * | 2001-12-20 | 2004-07-14 | Zentiva, A.S. | pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii |
| CZ293886B6 (cs) * | 2002-12-20 | 2004-08-18 | Zentivaźáa@S | pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ299053B6 (cs) * | 2006-08-09 | 2008-04-09 | Zentiva, A. S. | Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy |
| CZ298945B6 (cs) * | 2006-09-18 | 2008-03-19 | Zentiva, A. S. | Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA015091B1 (ru) | 2011-06-30 |
| US20080318879A1 (en) | 2008-12-25 |
| EP1922087A2 (en) | 2008-05-21 |
| WO2007028347A3 (en) | 2007-05-10 |
| ATE520419T1 (de) | 2011-09-15 |
| CZ2005558A3 (cs) | 2007-04-04 |
| EA200800756A1 (ru) | 2008-06-30 |
| UA94594C2 (ru) | 2011-05-25 |
| EP1922087B1 (en) | 2011-08-17 |
| WO2007028347A2 (en) | 2007-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ297827B6 (cs) | Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva | |
| Chytil et al. | N-(2-Hydroxypropyl) methacrylamide-based polymer conjugates with pH-controlled activation of doxorubicin for cell-specific or passive tumour targeting. Synthesis by RAFT polymerisation and physicochemical characterisation | |
| JP4883515B2 (ja) | 均一分子量ポリマー | |
| JP5944836B2 (ja) | 高分子薬物送達結合体ならびにその製造および使用方法 | |
| Dvořák et al. | High-molecular weight HPMA copolymer–adriamycin conjugates | |
| WO2008034391A1 (en) | Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation | |
| EP2049157B1 (en) | Polymeric conjugates of doxorubicin with ph-regulated release of the drug and a method of preparing | |
| SK2912004A3 (en) | pH-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy | |
| CA3046541A1 (en) | Biocompatible and hydrophilic polymer conjugate for targeted delivery of an agent | |
| Mahkam et al. | Synthesis and characterization of acrylic type hydrogels containing azo derivatives of 5-amino salicylic acid for colon-specific drug delivery | |
| WO2007110003A2 (en) | Micellar carriers for drugs with anti-cancer activity | |
| Arslan et al. | A modular and orthogonally reactive platform for fabrication of polymer–drug conjugates for targeted delivery | |
| Chytil et al. | Structural design and synthesis of polymer prodrugs | |
| JP2003528939A (ja) | 分解性ポリマー | |
| Sintov et al. | Polymeric drug delivery of enzymatically degradable pendant agents: Peptidyl-linked procainamide model system studies | |
| EP4045088A1 (en) | Method for the preparation of polymeric carriers for ph- controlled drug release and their conjugates with drugs | |
| EP3442594A1 (en) | Block copolymer for overcoming drug resistance of tumours to chemotherapy, its polymer-drug conjugate, pharmaceutical composition containing them, method of preparation and use thereof | |
| Class et al. | Patent application title: POLYMERIC CONJUGATES OF DOXORUBICIN WITH PH-REGULATED RELEASE OF THE DRUG AND A METHOD OF PREPARING Inventors: Tomas Etrych (Praha, CZ) Karel Ulbrich (Praha, CZ) | |
| WO2021121446A1 (en) | Copolymer with hydrolytic release of cancerostatic agent cytarabine, method of its preparation and use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20210905 |