CZ2006207A3 - Micelární nosiče léčiv s protinádorovou aktivitou - Google Patents

Micelární nosiče léčiv s protinádorovou aktivitou Download PDF

Info

Publication number
CZ2006207A3
CZ2006207A3 CZ20060207A CZ2006207A CZ2006207A3 CZ 2006207 A3 CZ2006207 A3 CZ 2006207A3 CZ 20060207 A CZ20060207 A CZ 20060207A CZ 2006207 A CZ2006207 A CZ 2006207A CZ 2006207 A3 CZ2006207 A3 CZ 2006207A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
polymer
hydrophobic
micelle
drug
acid
Prior art date
Application number
CZ20060207A
Other languages
English (en)
Inventor
Chytil@Petr
Etrych@Tomáš
Hrubý@Martin
Ulbrich@Karel
Říhová@Blanka
Original Assignee
Zentiva, A. S.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zentiva, A. S. filed Critical Zentiva, A. S.
Priority to CZ20060207A priority Critical patent/CZ2006207A3/cs
Priority to PCT/CZ2007/000020 priority patent/WO2007110003A2/en
Publication of CZ2006207A3 publication Critical patent/CZ2006207A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6907—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a microemulsion, nanoemulsion or micelle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Micelární systém určený k řízenému uvolňování léčiva je tvořen micelární strukturouvytvořenou hydrofilním nebo amfifilním polymerem, ke kterému je léčivou vázáno kovalentní vazbou, jehož molekuly jsou uspořádány na hydrofilním povrchu micely, zatímco jádro micely jetvořeno hydrofobními komponentami systému, které jsou s polymerem na povrchu spojeny chemickou vazbou.

Description

Oblast techniky
Vynález se týká micelární ch polymerních nosičů kancerostatik umožňujících cílený transport protinádorových léčiv, zejména doxorubicinu, do pevných nádorů a zaměřených na cílenou terapii nádorových onemocnění v humánní medicíně.
Dosavadní stav techniky
V posledních letech se vývoj nových léčiv a lékových forem stále více zaměřuje na využití polymerních látek, zvláště vodorozpustných polymerů jako nosičů léčiv. Velmi často se tento vývoj zaměřuje do oblasti nových kancerostatik. Vysoká molekulová hmotnost polymerů zabraňuje rychlému vyloučení léčiva z organizmu glomerulámí filtrací, a tím zajišťuje prodlouženou dobu cirkulace v krvi a setrvání v organizmu a tím i větší biologickou využitelnost léčiva. Navíc se mohou makromolekulámí látky a zvláště syntetické polymery akumulovat v pevných nádorech díky EPR (enhanced permeability and retention) efektu [Maeda 2000, 2001]. Této skutečnosti je možné, v případě navázání kancerostatika na makromolekulámí nosič, využít pro jeho cílenou akumulaci v nádoru. Byla vyvinuta celá řada systémů, které jsou založeny na tomto principu. Tak např. byly připraveny a studovány polymemí konjugáty kancerostatik s rozpustnými polymery, ve kterých bylo léčivo s protinádorovým účinkem připojeno k polymeru neštěpitelnou kovalentní vazbou, hydrolyticky nestabilní iontovou vazbou a nebo kovalentní vazbou náchylnou k enzymatické či prosté chemické hydrolýze. Takové systémy jsou schopny uvolnit kancerostatikum z nosiče v jeho aktivní formě buď v nádoru, nebo i více specificky, přímo v nádorové buňce. Významnou skupinu tvoří polymemí léčiva připravená na bázi kopolymerů N-(2hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) [Duncan 1985, Říhová 2000, Kopeček 2001, 2000],
V literatuře existuje celá řada informací o přípravě a studiu vlastností polymerů nesoucích kancerostatikum připojené k polymeru vazbou náchylnou k hydrolýze ve vodném prostředí [Kratz 1999]. Mezi nimi zaujímají významné postavení kopolymery HPMA, nesoucí kancerostatikum doxorubicin vázaný k polymemímu řetězci hydrolyticky štěpitelnou hydrazonovou vazbou [Etrych 2002, Ulbrich 2004a, Ulbrich 2004b, Ulbrich - patenty]. Tato vazba je relativně stálá v prostředí krevního řečiště (v průběhu transportu v organizmu) a » · · » · · · · hydrolyticky labilní v mírně kyselém prostředí živé buňky. Rychlost hydrolýzy této vazby řídí i rychlost uvolňování léčiva, a tedy i koncentraci aktivní látky v místě požadovaného účinku. Takováto polymerní kancerostatika vykazovala při in vitro i in vivo testech na myších podstatně vyšší protinádorovou účinnost proti řadě nádorových linií než volné léčivo a v řadě případů vedlo jejich použití k úplnému vyléčení pokusných zvířat i při terapeutickém způsobu podání. [Říhová a spol.,2001, Etrych a spol., 2001].
Polymerní micely jsou dalším nosičovým systémem vyvíjeným s cílem nádorově specifické dopravy cytostatik do pevných nádorů, využívajícím EPR efektu pevných nádorů pro zvýšenou akumulaci vysokomolekulámího léčiva. Jsou obvykle připravovány uspořádáním amfifilních diblokových kopolymerů do vysokomolekulámích micelámích útvarů, ve kterých je léčivo vázáno do hydrofobního jádra micely fyzikálními (hydrofóbní interakce, iontové vazby) a nebo kovalentními vazbami [Kataoka 2001, Yokoyama 1999, Bae 2003, Yoo 2002, Bronich 1999]. Hydrofóbní jádro micely je obaleno hydrofilní vrstvou tvořenou bloky hydrofilního polymeru, většinou poly(oxyethylenu), chránící celý systém před agregací a nežádoucími interakcemi s komponentami živého organizmu. Ačkoli ještě nejsou nosičové a micelámí systémy v humání medicíně běžně používány, představují spolu s liposomy novou generaci účinnějších a bezpečnějších kancerostatik, nežli představují doposud užívaná klasická chemoterapeutika.
Podstata vynálezu
Zavedení hydrofobních substituentů do struktury vodorozpustného polymeru - nosiče léčiv vede k uspořádávání takovýchto makromolekul ve vodném prostředí do polymerních micelámích útvarů sjádrem tvořeným hydrofobními substituenty a obalem tvořeným hydro filními řetězci polymeru. Tyto útvary mohou být intramolekulámího nebo intermolekulámího charakteru. Micelámí útvar popisovaný v tomto patentu je tvořen hydrofilní vrchní vrstvou tvořenou hydrofilními polymemími řetězci, např. HPMA kopolymeru, kopolymeru vinylpyrolidonu nebo multiblokového poly(oxyethylenu) [Pechar 2000, 2001, 2003], nesoucími jednak kancerostatikum, např. doxorubicin, připojený k polymeru pomocí spojek obsahujících pH-senzitivní hydrolyticky štěpitelné hydrazonové vazby, nebo pomocí enzymaticky štěpitelné sekvence, např. GlyPheLeuGly. K polymeru mohou být připojena chemickou vazbou i jiná kancerostatika, např. mitomycin C, deriváty cisPt, raltitrexát, metotrexát, taxol a další kancerostatika. Hydrofóbní jádro micely je tvořeno • · · · hydrofobními molekulami (nasycené i nenasycené alifatické řetězce a jejich deriváty, cholesterol a jeho deriváty, kyselina cholová a její deriváty), připojenými k řetězci HPMA kopolymerů esterovými nebo amidickými vazbami nebo podobným způsobem jako molekuly léčiva, tj. hydrolyticky labilní hydrazonovou vazbou. Jádro micely je drženo pohromadě díky hydrofobním interakcím mezi hydrofobními substituenty. Na rozdíl od klasických micel, kde je léčivo obvykle situováno v hydrofobním jádře micely, je v tomto případě léčivo připojeno enzymaticky nebo pH-labilní kovalentní vazbou k hydrofilnímu obalu micely. Celý micelámí systém o velikosti 8 až 150 nm (podle složení a struktury hydrofobního substituentu) je stálý při transportu organizmem (pH 7,4) a aktivuje se a uvolňuje léčivo až po případné akumulaci v pevných nádorech (díky EPR efektu) a po průniku do cílových nádorových buněk (pH 5 až 6). V závislosti na detailní struktuře kopolymerů se vysokomolekulámí micelámí sytém hydrolyzuje, v první fázi se uvolní léčivo, případně později v druhé fázi degradace se uvolní i hydrofóbní substituenty, které mohou být metabolizovány. Celý vysokomolekulámí micelámí systém se tak rozpadne na relativně malé vodorozpustné polymemí fragmenty na bázi HPMA kopolymerů, vyloučitelné z organizmu, např. glomerulámí filtrací.
Popis micelárního léčiva • Micelámí systémy připravené podle vynálezu se vyznačují tím, že micelámí struktura je vytvořena amfifilními molekulami HPMA kopolymerů uspořádanými do nadmolekulámí micelámí struktury, s jádrem micely tvořeným hydrofobními komponentami systému a hydrofílní vnější vrstvou micely tvořenou hydrofilními částmi polymemího řetězce nesoucími kovalentně vázané kancerostatikum. Schematicky je micela zobrazena na obrázku č. 1.
• hlavní polymemí řetězec je tvořen kopolymerem 7V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) obsahujícím 80 až 98 %mol jednotek HPMA a 2 až 20 %mol jednotek komonomerů - esterů kyseliny methakrylové a/nebo methakryloylovaných, na karboxylové skupině modifikovaných a-aminokyselin, ε-aminokyselin, aromatických aminokyselin nebo oligopeptidů, z nichž 0,5 až 10 %mol je zakončeno hydrofobními molekulami a 0,5 až 8 %mol je zakončeno kancerostatikem doxorubicinem či jiným kancerostatikem připojeným k methakryloylovanému zbytku α-aminokyseliny, εaminokyseliny, aromatické aminokyseliny nebo oligopeptidu hydrolyticky štěpitelnou hydrazonovou vazbou nebo vazbou štěpitelnou lysosomálními enzymy.
• · · · • hydrofobní molekulou může být s výhodou acyl kyseliny oleové, cholové a cholanové nebo deoxycholové (deoxycholic acid), acyl mastných kyselin s C10-C18 řetězcem nebo obecně acyl nenasycených kyselin (kyseliny olejové, linolové, linoleové) připojený ke zbytku komonomemí jednotky hydrazidovou, amidovou nebo esterovou vazbou, nebo
- hydrazon 2-keto olefinů s 02 - 08 řetězci, nebo hydrazon cholest-4-en-3onu, nebo ester cyklických nebo polycyklických uhlovodíků nebo jejich derivátů, s výhodou cholesterolu, 7-dehydrocholesterolu, cholestanolu, vitamínu D, nebo
- ester alifatického alkoholu s C9 - C30 řetězcem, výhodně C9 - C 18 řetězcem • jako α-aminokyselina může být s výhodou pouřit glycin, alanin, valin, jako εaminokyselina β-alanin, kyselina δ-aminobutanová, kyselina ε-aminokapronová, jako aromatická aminokyselina 4-aminobenzoová a jako oligopeptid GlyGly, GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly, GlyLeuPheGly apod.
• hydrofobní molekula může být do struktury kopolymeru zabudována polymeranalogickou reakcí chloridu příslušné kyseliny, jeho reaktivního esteru (4nitrofenyl, sukcinimidyl), thiazolidin-2-thionového amidu apod., reakcí samotné kyseliny po aktivaci karbodiimidy, nebo zakopolymerováním příslušného methakrylamidového či methakryloylesterového monomeru.
• molekulová hmotnost kopolymerů se pohybuje v rozmezí 3000 až 60 000 g/mol.
Struktury základních typů kopolymerů použitých pro tvorbu micelámích nosičů kancerostatika doxorubicinu jsou uvedeny na obrázku č. 2 a 3.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 představuje schematické znázornění polymemí micely.
Obr. 2 znázorňuje strukturu kopolymerů s DOX vázaným hydrazonovou vazbou a hydrofobním substituentem vázaným na polymer ve formě esteru. X je aminokyselina nebo oligopeptidický spacer, RE je zbytek cholesterolu, dehydrocholesterolu, vitamínu D nebo alifatického alkoholu.
Obr. 3 znázorňuje strukturu kopolymerů s DOX vázaným hydrazonovou vazbou a hydrofobním substituentem vázaným na polymer ve formě acylu příslušné hydrofobní • · · » · · « kyseliny (její acyl je ve schématu znázorněn jako RK) hydrazidovou nebo amidickou vazbou, nebo 2-ketoolefmu vázaného na polymer hydrazonovou vazbou. X je aminokyselinový nebo oligopeptidický spacer.
Obr. 4 znázorňuje strukturu polymemího prekurzoru s cholesterolem, připraveného podle příkladu 2.
Obr. 5 znázorňuje strukturu polymemího prekurzoru obsahujícího hydrofobní oleoyl, připraveného podle příkladu 4.
Obr. 6 znázorňuje strukturu polymemího prekurzoru s hydrofobním dodecylovým sustituentem vázaným esterovou vazbou, připraveného podle příkladu 5.
Obr. 7 znázorňuje strukturu polymemího prekurzoru s hydrazidovými skupinami a hydrazidem kyseliny deoxycholové, připraveného podle příkladu 6.
Obr. 8 představuje distribuci velikostí micel ve fyziologickém roztoku měřenou pomocí rozptylu světla (QELS). Micely byly připraveny z kopolymeru obsahujících oleylovou (----), dodecylovou (......) a cholesterylovou (-) hydrofobní skupinu. Pro srovnání je připojen konjugát bez hydrofobních skupin (-·-·-·).
Obr. 9 představuje uvolňování doxorubicinu zmicelámích roztoků polymerů lišících se strukturou hydrofobního substituentu. Fosfátový pufr pH 5,0, 37 °C, koncentrace polymeru 5 mg/ml. Micely byly připraveny z kopolymerů obsahujících oleylovou (□----), dodecylovou (o......) a cholesterylovou (Δ-) hydrofobní skupinu. Pro srovnání je připojen konjugát bez hydrofobních skupin (▼-·-·-·).
Obr. 10 znázorňuje velikost nádoru (průběžný stav den 42) u myší B/6 s inokulováným myším lymfomem EL 4 léčených micelámími konjugáty DOX nebo „klasickým“ rozpustným konjugátem (B-578) po i.v. podání jedné dávky 10 mg/k nebo dvou dávek 2x5 mg/kg ekvivalentu DOX v terapeutickém režimu podání léčiva. Vzorky B-651 jsou HPMA kopolymery s oleylovým substituentem, vzorky B-652 s cholesterylovým substituentem.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Syntéza monomerů
HPMA byl připraven podle dříve popsaného postupu [Ulbrich a kol. 2000]. Elementární analýza: vypočteno 58,8 % C, 9,16 % H, 9,79 % N; nalezeno 58,98 % C, 9,18 % H, 9,82 % N. Produkt byl chromatografícky čistý.
6-(Methakryloylamino)hexanoylhydrazin (A’-(6-hydrazino-6-oxohexyl)-2-methylakrylamid) (MA-AH-NHNH2) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Ulbrich patenty, Etrych patent].
6-(methakryloylamino)hexanoyl-A'-(fórí.-butyloxykarbonyl)hydrazin (MA-AH-NHNH-Boc) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Ulbrich 2004]
17-(l,5-Dimethyl-hexyl)-10,13-dimethyl-2,3,4,7,8,9,10,ll,12,13,14,15,16,17-tetradekahydrolH-cyklopenta[a]phenanthren-3-yl ester 6-(2-methakryloylamino)hexanové kyseliny (MAAH-chol) byl připraven reakcí methakrylované 6-aminohexanové kyseliny (připravené podle dříve popsaného postupu [Ulbrich patenty]) (MA-AH-OH) s cholesterolem pomocí konjugačního činidla dicyklohexyl karbodiimidu (DCC) v tetrahydrofuranu (THF).
250 mg MA-AH-OH (1,26 mmol) a 456 mg cholesterolu (1,26 mmol) bylo rozpuštěno v čerstvě předestilovaném THF. 1,2 molární nadbytek DCC (311 mg, 1,51 mmol) byl rozpuštěn v 0,75 ml THF, roztok obsahoval několik krystalků ΛζΑ-dimethylaminopyridinu (DMAP). Oba roztoky byly ochlazeny na -18 °C. Po 1 h po ochlazení byly roztoky slity a reakční směs byla ponechána 1 h při -18 °C a 1 6h při 4 °C. Nezreagovaný DCC byl odstraněn reakcí s 50 μΐ koncentrované kyseliny octové za míchání při laboratorní teplotě. Za 0,5 h byla vyloučená dicyklohexylmočovina (DCU) odstraněna filtrací, THF byl odpařen a produkt rozpuštěn v ethylacetátu. Zbytky vyloučené DCU byly opět odstraněny filtrací. Nezreagovaná MA-AH-OH byla odstraněna vytřepáváním do 2 hm-% roztoku NaHCO3 a MA-AH-chol byl separován krystalizací z acetonu a přečištěn rekrystalizaci.
Y=46 %, 329 mg. bod tání: 93-95 °C, elementární analýza: teor. 78,25 %C, 10,83 %H, 2,47 %N, exp. 78,73 %C, 10,85 %H, 2,34 %N, TLC: ethylacetát:hexan 1:1, Rf =0,8.
Příklad 2: Syntéza polymerního prekurzoru - kopolymeru HPMA s MA-AH-NHNH2 a MAAH-chol (poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-chol))
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-chol) byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA, MA-AH-NHNH2 a MA-AH-cholesteryl v methanolu při 60 °C.
601,3 mg (4,20 mmol) HPMA, 69,3 mg (0,327 mmol) MA-AH-NHNH2 a 79,46 mg (0,140 mmol) MA-AH-chol (14 hm% monomerů) a 53,6 mg (0,326 mmol) ABIN (1 hm%) bylo rozpuštěno v 5,76 ml methanolu. Roztok byl přelit do ampule obsahující 79,46 mg (0,140 mmol) (celkem 14 hm% monomerů) s 15 min probubláván dusíkem. Ampule byla zatavena • ·
a nerozpuštěný podíl byl rozpuštěn při 60 °C. Po 20 h polymerace při 60 °C byla reakční směs vysrážena do 150 ml ethylacetátu a sraženina odcentrifugována. Polymer byl přesrážen z methanolu do ethylacetátu, odfiltrován na fritě S4 a sušen do konstantní hmotnosti.
Struktura viz obrázek č. 4.
Obecně, všechny polymerní prekurzory byly charakterizovány stanovením obsahu cholesterolu nebo alifatické složky pomocí1 H-NMR, a vodorozpustné prekurzory stanovením váhového průměru molekulových hmotností A/w a polydisperzity pomocí GPC systému (AKTA™ Explorer, Pharmacia, Sweden) vybaveného Rl, UV a víceúhlovým LS detektorem (DAWN DSP-F, Wyatt Technology Corp., USA). Pro charakterizaci byla použita kolona TSK 3000 a eluent 0.3 M acetátový pufr o pH 6.5 (20%) a methanol (80%), případně kolona Superose™ 12 nebo Superose™ 6 a 0.3 M acetátový pufr o pH 6.5. Polymerní prekurzory tvořící ve vodném prostředí polymerní micely byly charakterizovány pomocí statického či dynamického rozptylu světla (LS, QELS) a velikosti částic byly určovány pomocí Zetasizer Nano instrument (Malvem, model ZEN 3600, UK).
Příklad 3: Syntéza polymerního prekurzorů - reakce cholesteryl chloroformátu s poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2)
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHNH-chol) byl připraven polymeranalogickou reakcí poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) s chlormravenčanem cholesterolu.
Příklad reakce: 250 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) (1,30.1 θ'4 mol) bylo rozpuštěno v 1,5 ml ////'-dimethylformamidu (DMF). 15,1 mg (7,78.10-5 mol) chlormravenčanu cholesterolu bylo rozpuštěno v 0,02 ml dichlormethanu a roztok přidán do míchaného roztoku polymeru. Reakce probíhala 0,5 h při 4 °C (chlazení směsí voda-led). Reakční směs byla poté vysrážena do dvacetinásobku ethylacetátu a odcentrifugována. Polymer byl rozpuštěn v methanolu, vysrážen do ethylacetátu, přefiltrován na fritě S4 a sušen do konstantní hmotnosti.
• · ··· ·
Příklad 4: Syntéza poiymerního prekurzoru - reakce N-hydroxysukcinimidového esteru olejové kyseliny s poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2)
Terpolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHNH-oleoyl) byl připraven polymer-analogickou reakcí poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) s TV-hydroxysukcinimidovým esterem olejové kyseliny.
Příklad reakce: 245,2 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) (1,17.104 mol) bylo rozpuštěno v 1 ml methanolu. 29,5 mg 7V-hydroxysukcinimidového esteru olejové kyseliny (7,78.10'5 mol) bylo rozpuštěno v 0,3 ml methanolu a přidáno do míchaného roztoku polymeru. Reakce probíhala 5 h při laboratorní teplotě a pak 16 h při 4 °C. Reakční směs byla poté vysrážena do ethylacetátu a polymer odcentrifugován. Polymer byl rozpuštěn v methanolu, vysrážen do dvacetinásobku ethylacetátu, přefiltrován na fritě S4 a sušen do konstantní hmotnosti.
Struktura viz obrázek č. 5.
Příklad 5: Syntéza poiymerního prekurzoru - terpolymeru HPMA, MA-AH-NHNH2 a dodecylmethakrylátu (poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-DDM))
Terpolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-DDM) byl připraven ve dvou krocích. Prvním krokem byla roztoková radikálová kopolymerizace HPMA s MA-AH-NHNH-Boc a dodecylmethakrylátem (DDM) v methanolu při 60 °C. Ve druhém kroku byly odstraněny chránící skupiny pomocí trifluoroctové kyseliny (TFA).
Příklad reakce:
I. krok: 782 mg (5,46 mmol) HPMA, 155 mg (0,496 mmol) MA-AH-NHNH-Boc, 72,6 mg (0,285 mmol) čerstvě předestilovaného DDM (14 hm% monomerů) a 71,4 mg (0,435 mmol) ABIN (1 hm%) bylo rozpuštěno v 7,7 ml methanolu. Ampule s roztokem polymerizační směsi byla 10 min probublávána dusíkem, poté zatavena a na 20 h umístěna do termostatu na 60 °C. Reakční směs byla vysrážena do 175 ml a sraženina odcentrifugována. Polymer byl přesrážen z methanolu opět do směsi aceton : diethylether 3:1, sraženina odfiltrována na fritě S4 a polymer byl sušen do konstantní hmotnosti.
II. krok: 288 mg polymeru bylo rozpuštěno ve 3 ml směsi TFA : triisopropylsilan : voda 95 : 2,5 : 2,5. Po 20 minutách byla směs zahuštěna na vakuové odparce, rozpuštěna v pětinásobku methanolu a znovu odpařena. Rozpouštění a odpařování bylo několikrát opakováno, dokud se nevyloučily po odpaření krystalky. Produkt byl rozpuštěn ve vodě a pH vodného roztoku bylo zvýšeno na pH = 7 - 8 pomocí NaOH. Polymer byl dále čištěn a izolován pomocí dialýzy proti vodě (3 dny) a následné lyofilizace.
• · • ·
Struktura viz obrázek č. 6.
Příklad 6. Příprava polymemího prekurzoru obsahujícího kyselinu deoxycholovou vázanou hydrazidovou vazbou (poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHNH-cholA))
Příprava vycházela ze sukcinimidového esteru kyseliny deoxycholové a prekurzoru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2). 300 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) (1,56.10-4 mol hydrazidových skupin) bylo rozpuštěno ve 2 ml DMF. 30 mg (5,7.10-5 mol) sukcinimidového esteru kyseliny deoxycholové bylo rozpuštěno v 0,25 ml dichlormethanu a roztok přidán do míchaného roztoku polymeru. Reakční směs byla míchána po dobu 1,5 h při pokojové teplotě, potom byl polymer vysrážen do dvacetinásobku ethylacetátu a sraženina odcentrifugována. Polymer byl přesrážen z methanolu do směsi ethylacetát-diethylether, sraženina promyta diethyletherem, odfiltrována na fřitě S4 a finální polymerní prekurzor byl sušen do konstantní hmotnosti.
Struktura viz obrázek č. 7.
Příklad 7. Příprava polymerních konjugátů obsahujících doxorubicin a hydrofobní substituent (PHPMA-AH-NH-N=DOX-co-MA-AH-chol/oleyl/dodecyl)
Kopolymery sDOX navázaným kPHPMA nosiči hydrolyticky štěpitelnou hydrazonovou vazbou obsahující hydrofobní substituent byly připraveny reakcí polymerních prekurzorů obsahujících hydrazidové a hydrofobní skupiny (alifatický substituent, ester a hydrazid cholesterolu ěi cholové kyseliny) s DOX.HC1 v methanolu za katalýzy kyselinou octovou. Roztok 15,384 g kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-chol) v 92,1 ml methanolu (167 mg polymeru/ml) byl vložen do termostatované cely, ve které bylo umístěno 2,5 g DOX.HC1 (4,3 mmol). Nehomogenní suspenze byla míchána v temnu při 25 °C a po 1 minutě bylo přidáno 4,9 ml kyseliny octové (celkový objem 116 ml). V průběhu reakce došlo k pozvolnému rozpuštění suspenze, po 22 h reakce byl z homogenního roztoku polymerní produkt izolován srážením do 1 1 ethylacetátu, precipitát polymemího léčiva byl izolován filtrací na fřitě S4, promyt 150 ml ethylacetátu a sušen do konstantní hmotnosti. Obsah celkového DOX byl stanoven spektrálně. A/w a Mn byly stanoveny kapalinovou chromatografií (LC AKTA) s detekcí rozptylem světla (Multiangel detector DAWN DSP, Wyatt). Charakterizace polymemího léčiva: Celkový výtěžek reakce vazby léčiva: 17,2 g (96 %), obsah celkového DOX 11,3 % váhových, obsah volného DOX 1,52 % z celkového obsahu
DOX. Postup vazby doxorubicinu na polymemí prekurzory hydrazonovou vazbou byl stejný pro všechny tytpy prekurzorů.
Příklad 8. Příprava polymerního konjugátu s léčivem a hydrofobním substituentem navázanými hydrolyticky labilní hydrazonovou vazbou.
(A) Kopolymer HPMA (92,5 molámich procent) s MA-AH-NHNH2 (7,5 molárního procenta) (poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) o Mw = 22 000, 100 mg; (0,052 mmol hydrazidových skupin) byl reagován s 2-dodekanonem (37 mg, 0,20 mmol) v methanolu (2,0 ml) za přídavku kyseliny octové (50 μΐ) při laboratorní teplotě za míchání po dobu 3 dnů. Pak byl polymer izolován vysrážením do směsi aceton (20 ml) - diethylether (40 ml) a přečištěn přesrážením z methanolu do směsi aceton-diethylether. Výtěžek 98 mg. Výsledný polymer obsahuje 6,1 molámich procent monomemích jednotek zbytkových hydrazidových skupin (stanoveno TNBSA, Etrych a kol. 2001), tj. 81 % konverze hydrazidových skupin na hydrazon. DOX byl navázán na polymer v následném kroku za použití postupu popsaného v příkladu 7.
(B) Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) (7,5 molárního procenta hydrazidů) o Mw = 22 000,100 mg; 0,052 mmol hydrazidových skupin) byl reagován s 2-oktadekanonem (54 mg, 0,20 mmol) v methanolu (2,0 ml) za přídavku kyseliny octové (50 μΐ) při laboratorní teplotě za míchání po dobu 3 dnů. Pak byl polymer izolován vysrážením do směsi aceton (20 ml) diethylether (40 ml) a přečištěn přesrážením z methanolu do směsi aceton-diethylether. Výtěžek 91 mg. Výsledný polymer obsahuje 5,9 molámich procent monomemích jednotek zbytkových hydrazidových skupin (stanoveno TNBSA) tj. 79 % konverze hydrazidových skupin na hydrazon. DOX byl navázán na polymer v následném kroku za použití postupu popsaného v Příkladu 7.
(C) Konjugát připravený kopolymerizací monomerů
Syntéza monomem MA-AH-NHN=dodekan
2,00 g MA-AH-NHNH2 (9,38 mmol), 1,73 g dodekanonu (9,38 mmol), 100 mikrolitrů kyseliny octové, cca 5 mg inhibitoru a 25 ml 96 % ethanolu bylo vařeno 5 hodin pod zpětným chladičem. Pak byl k ještě horkému roztoku přidán triethylamin (600 μΐ) a vše bylo odpařeno do sucha. Monomer byl přečištěn kapalinovou chromatografií na chromatografické koloně plněné padesátinásobným hmotnostním nadbytkem silikagelu 60 za použití ethylacetátu jako • · • · »··· ·« • « · r · · • · · · · · ·* • t »····· ·«·· ··«· ·· ·· ·· ·· mobilní fáze, Rp hydrazon = 0,25, RF hydrazid = 0,00, Rf dodekanon = 1,00. Teoretický výtěžek 3,56 g (9,38 mmol), izolovaný výtěžek 2,26 g (63 %; 5,95 mmol).
Výsledný polymer byl připraven radikálovou kopolymerizací 92,5 %mol HPMA, 4,5 %mol MA-AH-NHNH2 a 3 %mol MA-Acap-NHN=dodekanu a následnou vazbou DOX na volné hydrazidové skupiny. Polymer byl vysrážen do ethylacetátu, promyt diethyletherem a usušen za vakua, DOX byl navázán metodou popsanou v Příkladu 7. Kopolymer obsahoval 9,5 % váh. DOX a 2,8 %mol dodekanových skupin.
Příklad 9. Příprava micel ve vodném prostředí
Obecný postup: 20 mg polymemích konjugátů, jejichž příprava byla popsána v příkladech 6 až 8 (obsahující DOX vázaný hydrazonovou vazbou a hydrofobní substituent) byly rozpuštěny ve 200 ml fyziologického roztoku (rozpouštění je možné provádět i v destilované vodě). K dokonalému rozpuštění na micelámí roztok byla použita ultrazvuková lázeň K 5 (Kraintek s.r.o.), sonifikace byla prováděna po dobu 1-5 min, podle složení rozpouštěného vzorku. Vzorky - polymerní micely byly před charakterizací rozptylem světla a před in vitro i in vivo testováním filtrovány na membráně Whatman, velikost pórů 0,22 pm.
Polymerní prekurzory tvořící ve vodném prostředí polymerní micely byly charakterizovány pomocí statického či dynamického rozptylu světla (LS, QELS) a velikosti částic byly určovány ve fyziologickém roztoku pomocí Zetasizer Nano instrument (Malvem, model ZEN 3600, UK) při koncentraci polymeru 2 mg/ml. Ukázka distribuční křivky velikostí micel je uvedena na obrázku č. 8.
Příklad 10: Uvolňováni doxorubicinu z polymemích micel tvořených polymery s různým hydrofobním substituentem
Bylo měřeno množství doxorubicinu uvolněného z polymemích micel po jejich inkubaci ve fosfátovém pufru o pH 5,0 (0,1 M fosfátový pufř obsahujícím 0,15 M NaCl) modelujícím intracelulámí prostředí a fosfátovém pufru pH 7,4 modelujícím krevní řečiště. Množství uvolňovaného DOX v inkubačním roztoku bylo stanoveno pomocí HPLC (Shimadzu). V předem určených časových intervalech bylo odebíráno 50 pl inkubačního roztoku a analyzováno na koloně TSKGel G 3000, izokratický průtok 0,5 ml/min mobilní fáze složené ze směsi methanoV.octanový pufr pH 6,5 (80 : 20 % obj.). Množství DOX bylo určeno z ploch píků volného a vázaného DOX (UV-VIS detekce při 488 nm). Po inkubaci micel (koncentrace 5 mg/ml) ve fyziologickém prostředí při 37 °C (fosfátový pufr, pH 7,4) k uvolňování DOX
99 • 9 9 9
99
9·9
9 9
9999 99
9 9 • 9 9 • · A 9
9 9 9
99
9· ···· • 9 9 «999 • 9 · « 9
9 9 9 *· nedochází a nebo se uvolňuje jen malé množství léčiva (do 8 %/24 hod); rychlost uvolňování DOX z micel při pH 5,0 je uvedena na obrázku č. 9. Je vidět, že rychlost uvolňování DOX, a tedy rychlost aktivace cytotoxického léčiva jev mírně kyselém prostředí značná, hydrofóbní substituenty v micelámím systému sice rychlost uvolňování léčiva snižují, tento efekt je však minimální.
Příklad 11: Hydrolytický rozpad micely s DOX a hydrofobním substituentem vázaným hydrolyticky štěpitelnou hydrazonovou vazbou
Uvolňování doxorubicinu z micelámích roztoků polymerů lišících se strukturou hydrofobního substituentu. Fosfátový pufř pH 5,0, 37 °C, koncentrace polymeru 5 mg/ml.
Kopolymer připravený podle příkladu 8(A) (obsahující dodekanonový hydrofóbní substituent) byl rozpuštěn v PBS pufřu (0,15 mol.f1, pH 5,0 respektive 7,4) na micelámí roztok o koncentraci 2 mg/ml a byl sledován rozpad micel metodou dynamického rozptylu světla (QELS). Poměrně velké micely o hydrodynamickém průměru 274 nm se rozpadají při 37 °C podstatně rychleji při pH 5,0 a to až na rozpustný polymemí produkt vyloučitelný z organizmu (model nádorové tkáně; intenzita rozptýleného světla 6,9 % původní hodnoty po 24 hod) než při pH 7,4 (model krevní plazmy; intenzita rozptýleného světla 87 % původní hodnoty po 24 hod). Tato závislost je obdobná, jako v případě uvolňování léčiva.
Polymer připravený podle příkladu 7(B) (oktadekanonový substituent) tvoří micely o hydrodynamickém průměru blízkému 200 nm a rychlost jejich rozpadu je srovnatelná s rozpadem polymeru připraveného podle příkladu 8(A). Konečným produktem rozpadu micel po 4 denní inkubaci při obou pH (7,4 a 5,0) je hydrazidový polymer o hydrodynamickém průměru 7 nm, tedy polymer vyloučitelný z organizmu. Zároveň se z roztoku vyloučí nízkomolekulární hydrofóbní ketony jako makroskopická sraženina.
Příklad 12. Ukázka in vitro biologické aktivity micelárníchkonjugátů doxorubicinu při inkubaci s buňkami různých nádorovým linií.
Byla sledována antiproliferační cytostatická aktivita vodorozpustných kopolymerů na bázi HPMA obsahující v postranním řetězci 6-aminohexanovou kyselinu, na kterou je hydrazonovou vazbou připojený doxorubicin a rovněž hydrofóbní cholesteryl nebo oleoyl, tvořících ve vodném prostředí micelámí roztoky. V in vitro pokusech byla sledována antiproliferační, cytostatická aktivita metodou inkorporace 3H-thymidinu na pěti nádorových liniích lidského a myšího původu a na T-mitogenem (konkanavalinem A (Con A)) • · · · • ·
stimulovaných myších splenocytech. Nádorové linie myšího původu byly: T-buněčný lymfom EL4, B-buněčný lymfom 3803, fibroblastová linie 3T3 a B-buněčná leukémie. Nádorová linie lidského původu byla metastazující linie kolorektálního karcinomu SW 620. Nádorové linie byly, kromě jiného, vybrány na základě citlivosti na použité cytostatikum. Výsledky měření jsou uvedeny v tabulce 1.
Vzorek Struktura EL4 3803 SW620 ConA 3T3 BCL1
HPMA kopolymer s oleoylovým substituentem P -AK-NH- N=D0X \ oleoyl 0.151 0.0122 0.040 <0.040 0.040 0.093
HPMA kopolymer s cholesterylovým substituentem P -AK-NH- N=D0X \ cholesteryl 0.135 0.0104 0.040 0.069 0.040 0.064
D0X.HC1 0.015 0.0005 0.003 0.029 0.009 0.003
Tabulka 1: Cytotoxicita micelámích polymemích konjugátů doxorubicinu pro různé buněčné linie měřená metodou inkorporace 3H-thymidinu. V tabulce jsou uvedeny hodnoty IC50, t.j. koncentrace v pg/ml, při které dochází k inhibici proliferace u poloviny testovaných buněk.
Na původní léčivo byla nejcitlivější myší linie 3803 s IC50 = 0,0005 pg/ml. O jeden až dva řády jsou méně citlivé ostatní linie a také stimulované normální T splenocyty (Con A). V in vitro testech není mezi vzorky s oleoylovým a cholesterylovým substituentem zásadní rozdíl, chovají se obdobně. Po vazbě DOX na polymerní nosič se IC50 snižuje o řád až dva. Nejmenší rozdíl byl pozorován u normálních splenocytů.
Příklad 13. Ukázka in vivo biologické aktivity micelámích konjugátů doxorubicinu u myší inokulovaných T buněčným lymfomem EL4
Pro in vivo pokusy byl použit model myšího T buněčného lymfomu EL 4. Konjugáty byly podány intravenózně buď 1x10 mg/kg nebo 2x5 mg/kg. Jednorázové podání se uskutečnilo osmý den po transplantaci nádorových buněk, v případě podání dvou dávek byla první dávka podána také osmý den po transplantaci nádorových buněk, druhá dvanáctý den. Všechny • · • ·
experimentální skupiny vykázaly již třetí den po první aplikaci významně zpomalený růst nádorů při srovnání s kontrolami. Mnohem výraznější protinádorový efekt má vzorek s cholesterolem, vyšší jednorázová dávka (10 mg/kg) je nejúčinnější. Čtrnáctý den po transplantaci nádorových buněk je patrná určitá progrese u skupiny zvířat léčené vzorkem s oleoylem, která je ale samozřejmě mnohem menší než u kontrol. U experimentálních skupin léčených vzorkem s cholesterylem je v této době zřetelný významný ústup nádoru, nejúčinnější je léčba jednou vyšší dávkou. Osmnáctý den po transplantaci a desátý den po prvním podání léčiva se objevují první vyléčené myši a to ve vysokém procentu (sedm zvířat z osmi) u vyšší dávky, čtyři z osmi u nižší dávky. U kontrolní léčby nemicelámím rozpustným konjugátem byly vyléčeny tři myši z osmi. Čtrnáctý den po prvním podání léčiva jsou 100% vyléčeny myši léčené konjugáty s cholesterolem podaným v obou schématech a tento stav zatím trvá až do 42 dne. Konjugáty s oleoylem jsou méně účinné, i když protinádorový efekt ve srovnání s kontrolami je zřejmý. LTS (long-term survivors) je ve skupině léčené vzorkem s oleoylem při vyšší dávce 1/8, při dvou nižších dávkách 2/8, ve skupině léčené vzorkem s cholesterylem 8/8 v případě obou schémat dávkování. U „klasického“ nemicelámího hydrazonu to jsou (při zvoleném dávkování) 4/8. Kontroly jsou mrtvé všechny, nej kratší interval přežití je 20 dní a nejdelší 30 dní. Průměr byl 22 dní. Výsledky in vivo testů jsou uvedeny na obrázku č. 10 a v tabulce 2.
B-651 B-651 B-652 B-652 B-578 Kontroly
1x10 2x5 1x10 2x5 1x15 0
30 38 LTS LTS 31 20
36 41 LTS LTS 39 21
39 42 LTS LTS 42 22
39 LTS? LTS LTS LTS? 22
42 LTS? LTS LTS LTS 25
42 LTS? LTS LTS LTS 30
LTS? LTS LTS LTS LTS 30
LTS LTS LTS LTS LTS 31
Tabulka 2. Přežívání B/6 myší s inokulovaným myším lymfomem EL 4 léčených micelámími konjugáty DOX po i.v. podání jedné dávky 10 mg/k nebo dvou dávek 2x5 mg/kg ekvivalentu DOX v terapeutickém režimu podání léčiva. Vzorky B-651 jsou HPMA kopolymery s oleylovým substituentem, vzorky B-652 s cholesterylovým substituentem. Vzorek B-578 je kontrolní „klasický“ rozpustný nemicelámí konjugát. Dny znamenají jednotlivé dny úhynu • · » · • 9 9 9 9 9
99 9 9
99 zvířat, LTS přežívající zvířata bez hmatatelného nádoru, LTS? Pak přežívající zvířata s hmatatelným nádorem.
Literatura.
Bae, Y. S.; Fukushima, S.; Harada, A.; Kataoka, K. pH responsive drug-loaded polymeric micelles: Intracellular drug release correlated with in vitro cytotoxicity on human smáli cell lung cancer SBC-3. 2003. Salt Lake City, Utah, U.S.A. Winter Symposium and llth International Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Systems. 2003.
Bronich, T. K.; Nehls, A.; Eisenberg, A.; Kabanov, V. A.; Kabanov, A. V. Colloids Surf. B 1999, 76,243-251.
R. Duncan, J.B. Lloyd, J. Kopeček, P. Rejmanová, J. Strohalm, K. Ulbrich, B. Říhová, V. Chytrý: Synthetic Polymeric Drugs (1985). Czech. PV 0095/85, Australia 589587, Canada 130053, Denmark 164485, Europe 0187547, US 5,037,883, Japan 000137/86
Etrych, T., Jelínková, M., Říhová, B. and Ulbrich K., New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH sensitive linkage. Synthesis, in vitro and in vivo biological properties. J. Controlled Release 73, 89-102 (2001).
T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, K. Ulbrich, Synthesis of HPMA Copolymers Containing Doxorubicin Bound via a Hydrazone Linkage. Effect of Spacer on Drug Release and in vitro Cytotoxicity. Macromolecular Biosci. 2, 43-52 (2002)
Etrych T., Chytil P., Pechar M., Studenovský M., Říhová B., Ulbrich K.: Způsob přípravy polymerních konjugátů doxorubicinu s pH-řízeným uvolňováním léčiva, CZ PV 2005-558
Kataoka, K.; Harada, A.; Nagasaki, Y. Adv. Drug Delivery Rev. 2001,47, 113-131.
J. Kopeček, P. Kopečková, T. Minko, Z. Lu, HPMA Copolymer-Anticancer Drug Conjugates: Design, Activity, and Mechanism of Action. Europ. J. Pharm. Biopharm. 50, 61 - 81 (2000)
Kopeček, J., Kopečková, P., Minko, T., Lu, Z.R., Peterson, C.M. (2001) “Water soluble polymers in tumor targeted delivery”. J. Controlled Release 74, 165-173.
• · · ·
F. Kratz, U. Beyer, M.T. Schutte, Drug-polymer conjugates containing acid-cleavable bonds, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 16 (1999) 245-288.
Maeda, H., J. Wu, T. Sawa, Y. Matsumura, and K. Hoři. 2000. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. JControl Release 65:271-284.
Maeda, H. 2001. The enhanced permeability and retention (EPR) effect in tumor vasculature: the key role of tumor-selective macromolecular drug targeting. Adv Enzyme Regul 41:189-207.
M. Pechar, J. Strohalm, K. Ulbrich, E. Schacht, Biodegradable Drug Carriers Based on Poly(ethyleneglycol) Block Copolymers. Macromol. Chem.Phys. 198, 1009-1020 (1997)
M. Pechar, K. Ulbrich, V. Šubr, L.W. Seymour, E. Schacht, Poly(Ethylene Glycol) Multiblock Copolymers as a Carier of Anti-Cancer Drug Doxorubicin. Bioconjugate Chem. 11, 131-139, 2000
M. Pechar, K. Ulbrich, M. Jelínková, B. Říhová: Conjugates of Antibody-Targeted PEG Multiblock Polymers with Doxorubicin in Cancer Therapy. Macromol. Biosci. 3, 364-372 (2003)
B. Říhová, M. Jelínková, J. Strohalm, V. Šubr, D. Plocová, O. Hovorka, M. Novák, D. Plundrová, Y. Germano, K. Ulbrich, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules II. Anti-cancer Activity of antibody or (Fab')2-targeted Conjugates and Combined Therapy with Immunomodulators. J. Controlled Rel. 64, 241-261 (2000)
K. Ulbrich, V. Šubr, J. Strohalm, D. Plocová, M. Jelínková, B. Říhová, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules I. Synthesis and Physicochemical Characterisation. J. Controlled Rel. 64, 63-79 (2000)
K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, Antibody-Targeted PolymerDoxorubicin Conjugates with pH-Controlled Activation, J, Drug Targeting 12(8) (2004) 477489], (C) • · • · ···· ·« • · · · · · • · « · ····
K. Ulbrich, V. Šubr, Polymeric Anticancer Drugs with pH-Controlled Activation, Adv. Drug Delivery Rev. 56/7, 1025-1052 (2004)
K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M. Pechar, M. Jelínková, B. Říhová, Polymeric Anticancer Drugs with pH-Controlled Activation. Int. J. Pharm. 277/1-2 67-72 (2004)
K. Ulbrich, T. Etrych, B. Říhová, M. Jelínková, M. Kovář: pH Senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii. CZ 293787, CZ 293886
Yokoyama, M.; Okano, T.; Sakurai, Y.; Fukushima, S.; Okamoto, K.; Kataoka, K. J. Drug Targeting 1999, 7, 171-186.
Yoo, H. S.; Lee, E. A.; Park, T. G. J. Controlled Release 2002, 82,17-27.
py 2uo6~zs7

Claims (15)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Micelámí systém určený k řízenému uvolňování léčiva vyznačující se micelámí strukturou vytvořenou hydrofilním nebo amfifilním polymerem, ke kterému je léčivo vázáno kovalentní vazbou, jehož molekuly jsou uspořádány na hydrofilním povrchu micely, zatímco jádro micelyje tvořeno hydrofobními komponentami systému, které jsou s polymerem na povrchu spojeny chemickou vazbou.
  2. 2. Micelámí systém podle nároku 1, vyznačující se tím, že je hydrofilní polymer zvolen ze skupiny zahrnující kopolymery 7V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, Nvinylpyrolidonu a multiblokové polymerů na bázi poly(oxyethylen)u.
  3. 3. Micelámí systém podle nároku 2, vyznačující se tím, že je micelámí struktura vytvořena amfifilními molekulami kopolymerů V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu s methakryloylovanými deriváty cytostatik a hydro fobními molekulami.
  4. 4. Systém podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že léčivo v něm obsažené je kancerostatikum, s výhodou doxorubicin, metotrexát, taxol nebo deriváty cis-platiny.
  5. 5. Systém podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že je léčivo (kancerostatikum) vázáno ke kopolymerů hydrolyticky odbouratelnými hydrazonovými vazbami nebo enzymaticky degradovatelnými oligopeptidovými sekvencemi.
  6. 6. Systém podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se velikost micely pohybuje v rozmezí 8 až 150 nm.
  7. 7. Systém podle kteréhokoli z nároků 3 až 6, vyznačující se tím, že obsahuje 80 až 98 %mol jednotek A-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu a 2 až 20 %mol jednotek komonomerů, to jest esterů kyseliny methakrylové a/nebo methakryloylováných na karboxylové skupině modifikovaných a-aminokyselin, ε-aminokyselin, aromatických • · • · aminokyselin nebo oligopeptidů, z nichž 0,5 až 10 %mol je zakončeno hydrofobními molekulami a 0,5 až 8 %mol je zakončeno kancerostatikem.
  8. 8. Systém podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že je jeho hydrofóbní součást tvořena alifatickými uhlovodíky s řetězcem C9 až C30 nebo jejich deriváty nebo cyklickými nebo polycyclickými uhlovodíky nebo jejich deriváty, s výhodou cholesterolem, cholestanolem nebo jejich deriváty, nebo vitamínem D.
  9. 9. Systém podle nároku 8, vyznačující se tím, že je hydrofóbní molekula zvolena z řady acylů mastných kyselin s CIO až Cl8, popřípadě nenasycených mastných kyselin, nebo kyseliny cholové, cholanové (5B-cholan.24-oic acid) nebo 7-dehydrocholové.
  10. 10. Systém podle nároku 8, vyznačující se tím, že hydrofóbní molekula připojená k polymeru hydrolyticky labilní hydrazonovou vazbou je zvolena z řady 2- keto olefinů s řetězcem 02 až Cl8 nebo byl k vazbě použit cholest-4-en-3-on.
  11. 11. Systém podle nároku 8, vyznačující se tím, že je hydrofóbní molekula zvolena z řady esterů cholesterolu nebo 7-dehydrocholesterolu, cholestanolu, vitamínu D nebo alifatických alkoholů s C9 až 08 řetězci.
  12. 12. Systém podle nároku 7 až 11, vyznačující se tím, že obsahuje a-aminokyselinu zvolenou z řady glycin, alanin, valin a/nebo ε-aminokyselinu zvolenou z řady B-alanin, kyselina δ-aminobutanová, kyselina ε-aminokapronová a/nebo kyselinu 4aminobezeovou jako aromatickou aminokyselinu a/nebo oligopeptid zvolený z řady GlyGly, GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly, GlyLeuPheGly.
  13. 13. Systém podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se jeho molekulová hmotnost pohybuje v rozmezí 3000 až 70 000 g/mol.
  14. 14. Způsob výroby systémů podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že je hydrofóbní molekula zabudována do polymemího řetězce polyméranalogickou reakcí, přičemž reaktivní skupiny obsahuje polymemí prekurzor, neboje hydrofóbní molekula předem aktivována zavedením aktivního substituentu.
    • ·
  15. 15. Způsob výroby systémů podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že hydrofóbní molekula, po její případné aktivaci zavedením aktivního substituentu, nejprve reaguje s příslušnou monomemí jednotkou, která je následně polymerována.
CZ20060207A 2006-03-28 2006-03-28 Micelární nosiče léčiv s protinádorovou aktivitou CZ2006207A3 (cs)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20060207A CZ2006207A3 (cs) 2006-03-28 2006-03-28 Micelární nosiče léčiv s protinádorovou aktivitou
PCT/CZ2007/000020 WO2007110003A2 (en) 2006-03-28 2007-03-28 Micellar carriers for drugs with anti-cancer activity

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20060207A CZ2006207A3 (cs) 2006-03-28 2006-03-28 Micelární nosiče léčiv s protinádorovou aktivitou

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2006207A3 true CZ2006207A3 (cs) 2008-01-16

Family

ID=38230079

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20060207A CZ2006207A3 (cs) 2006-03-28 2006-03-28 Micelární nosiče léčiv s protinádorovou aktivitou

Country Status (2)

Country Link
CZ (1) CZ2006207A3 (cs)
WO (1) WO2007110003A2 (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ301288B6 (cs) * 2008-10-23 2009-12-30 Zentiva, A. S Polymerní prípravek se synergickým úcinkem pri lécbe nádorových onemocnení

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ303072B6 (cs) * 2009-02-13 2012-03-21 Zentiva, K.S. Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika
US8524784B2 (en) 2009-04-30 2013-09-03 Intezyne Technologies, Incorporated Polymer micelles containing anthracylines for the treatment of cancer
WO2010127271A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Intezyne Technologies, Incorporated Polymer micelles containing anthracylines for the treatment of cancer
EP2438908A1 (en) * 2010-10-11 2012-04-11 Vectum Pharma, S.L. Anchoring compositions for topical applications
FR2967581B1 (fr) * 2010-11-19 2012-12-28 Sanofi Aventis Conjugues polymeriques de principes actifs, leur procede de preparation et leurs intermediaires polymeriques

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ293787B6 (cs) * 2001-12-20 2004-07-14 Zentiva, A.S. pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ301288B6 (cs) * 2008-10-23 2009-12-30 Zentiva, A. S Polymerní prípravek se synergickým úcinkem pri lécbe nádorových onemocnení

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007110003A2 (en) 2007-10-04
WO2007110003A3 (en) 2008-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chytil et al. HPMA copolymer–drug conjugates with controlled tumor‐specific drug release
Etrych et al. Polymer conjugates of doxorubicin bound through an amide and hydrazone bond: Impact of the carrier structure onto synergistic action in the treatment of solid tumours
Etrych et al. New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH-sensitive linkage: synthesis and preliminary in vitro and in vivo biological properties
Kostka et al. HPMA-based star polymer biomaterials with tuneable structure and biodegradability tailored for advanced drug delivery to solid tumours
EP2063914B1 (en) Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation
CZ2006207A3 (cs) Micelární nosiče léčiv s protinádorovou aktivitou
Šírová et al. The structure of polymer carriers controls the efficacy of the experimental combination treatment of tumors with HPMA copolymer conjugates carrying doxorubicin and docetaxel
EP1463529B1 (en) Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy
KR100831391B1 (ko) ｐＨ 민감성 이미다졸 그룹을 함유한 키토산 복합체 및 그제조방법
JP5781084B2 (ja) 樹状高分子量ポリマー薬物担体および特に固形腫瘍の処置のための薬物とのそれらの結合体
CZ303072B6 (cs) Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika
CN110366430A (zh) 用于靶向递送试剂的生物相容且亲水的聚合物缀合物
Etrych et al. Comparison of the pharmacological and biological properties of HPMA copolymer-pirarubicin conjugates: A single-chain copolymer conjugate and its biodegradable tandem-diblock copolymer conjugate
CN109762099A (zh) 一种聚合物-抗肿瘤药物偶联物及其制备方法和用途
ES2356991T3 (es) Conjugados poliméricos de doxorubicina con liberación del fármaco regulada por ph y un método de preparación.
Chytil et al. Structural design and synthesis of polymer prodrugs
CZ308419B6 (cs) Blokový kopolymer pro překonání lékové rezistence nádorů k chemoterapii, jeho polymerní konjugát s léčivem, farmaceutická kompozice je obsahující, způsob jejich přípravy a jejich použití
CZ293886B6 (cs) pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii