CZ293886B6

CZ293886B6 - pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii

Info

Publication number: CZ293886B6
Application number: CZ2003605A
Authority: CZ
Inventors: Ulbrichákareládoc@Áing@Ádrsc; Etrychátomášámgr; Říhovááblankaáprof@Árndr@Ádrsc; Jelínkováámarkétaámgr@Áphd; Kovářámarekámgr
Original assignee: Zentivaźáa@S
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2004-08-18
Also published as: CZ2003605A3

Abstract

Konjugáty sestávající z polymerního nosiče tvořeného @ až @ monomerními jednotkami spojenými do polymerního řetězceŹ složené z aB @ až @ÚŹQ @ jednotek N@}@hydroxypropylBmethakrylamiduŹ bB � až @Q @ jednotek methakryloylovaných hydrazonů oligopeptidů zakončených molekulou antracyklinového kancerostatikaŹ cB @ŹQ až �Q @ methakryloylovaných oligopeptidů či jejich sodných solí a případně dB @ŹQ až �@ @ jednotek methakryloylovaných hydrazidů oligopeptidůŹ zaměřené na cílenou terapii nádorových onemocnění v humánní medicíněŕ

Description

pH senzitivní polymemí konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii

Oblast techniky

Vynález se týká polymemích kancerostatik umožňujících cílený transport v organizmu a zaměřených na cílenou terapii nádorových onemocnění v humánní medicíně.

Stav techniky

V posledních letech se vývoj nových léčiv a lékových forem stále více zaměřuje na využití polymerních látek, zvláště vodorozpustných polymerů jako nosičů léčiv. Byla připravena a studována celá řada polymemích konjugátů kancerostatik s rozpustnými polymery, ve kterých bylo léčivo s protinádorovým účinkem připojeno k polymeru neštěpitelnou kovalentní vazbou, hydrolyticky nestabilní iontovou vazbou a nebo kovalentní vazbo náchylnou k enzymatické či prosté hydrolýze. Cílem bylo připravit léčiva se zlepšeným farmakologickým a farmakodynamickým chováním, umožňujícím cílenou terapii nádorových onemocnění. Významnou skupinu tvoří polymemí léčiva připravená na bázi kopolymerů ΗΡΜΑ. V těchto látkách je kancerostatikum připojeno k polymemímu 2V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidovému nosiči enzymaticky štěpitelnou oligopeptidovou sekvencí, připravenou jako substrát pro lysozomální enzymy (enzymy přítomné v savčích buňkách). Struktura, syntéza a vlastnosti takovýchto konjugátů jsou popsány v patentu [Duncan 1985]. Přehled dosud dosažených výsledků v této oblasti velmi dobře zpracoval Kopeček a spol. [Kopeček a spol. 2000]. Polymemí léčiva popsaného typu byla účinná při léčení celé řady nádorů u myší a krys. Dva polymemí konjugáty jsou v současné době dokonce testovány klinicky [Vasey 1999 a spol., Julyan a spol 1999, Thomson a spol. 1999]. Výsledky klinického testování ukázaly, že polymemí konjugát doxorubicinu je méně nespecificky toxický než volné léčivo. Jeho maximální tolerovaná dávka (MTD) je 320 mg/m² což je 4 a 5x více než je normálně používaná klinická dávka volného doxorubicinu (60 až 80 mg/m²). Po podání polymemího léčiva nebylo pozorováno žádné závažné ovlivnění srdečních funkcí, ačkoliv individuální kumulativní dávka obsáhla hodnoty až 1680 mg/m². Všechny ostatní toxicity, pozorované v souvislosti s podáváním volných tj. nesměřovaných antracyklinových antibiotik byly významně sníženy. Nevýhodou dosud klinicky testovaných polymemích konjugátů léčiv je poměrně malá specifita účinku, neboť tyto konjugáty buď neobsahují směrující jednotku vůbec, jako například PK1, a nebo poměrně málo specifický uhlovodík (galaktosamin v konjugátu PK2, u kterého se ověřuje schopnost směrovat polymemí léčivo do jater). Ve vývoji jsou proto i konjugáty, u kterých by mělo být dosaženo cíleného specifického účinku připojením specifické směrující molekuly (například protilátky, ale také lektinu, růstového hormonu, transferiu apod.) k molekule nosiče.

Další nevýhodou dosud klinicky testovaných konjugátů, včetně konjugátů poly(HPMA) s doxorubicinem, je skutečnost že léčivo je z nich intracelulámě uvolňováno ve farmakologicky aktivní podobě pouze enzymatickou reakcí, ke které dochází v lysozomech. To znamená, že takové léčivo je účinné pouze v buňkách, ve kterých se vyskytuje vysoká koncentrace lysozomálních enzymů - peptidáz. Další nevýhodou je i poměrně složitá struktura konjugátu, který musí obsahovat sekvenci, z níž se léčivo působením peptidáz uvolňuje, většinou tetrapeptidovou spojku GlyPheLeuGly, což prodražuje a komplikuje syntézu.

V literatuře existuje celá řada informací o přípravě a studiu vlastností polymeru nesoucích připojené kancerostatikum vazbu náchylnou k hydrolýze ve vodném prostředí. Výsledky jsou shrnuty v přehledném článku Kratze [Kratz a spol., 1999]. Jako nosiče kancerostatik byly většinou použity přírodní makromolekuly, např. albumin, dextrany, transferin, algináty nebo protilátky. V několika případech byly použity i syntetické polymemí nosiče, poly(ethylenglykol) a polyglutaminy. Léčiva byla k nosičům připojena vazbami umožňujícími hydrolýzou řízené uvolnění aktivního léčiva jak v extracelulámím prostoru, tak i uvnitř buněk. V případě doxorubicinu (DOX) to byla nejčastěji vazba tvořená estery kyseliny cis-akonitylové nebo hydrazo- 1 CZ 293886 B6 nová vazba. In vivo testováno všech výše zmíněných pH senzitivních konjugátů na pokusných zvířatech však nepřineslo přesvědčivé výsledky a tak žádný z polymemích konjugátů není při léčení nádorových onemocnění používán ani klinicky testován.

Námi vyvinutá polymemí kancerostatika připravená na bázi kopolymerů HPMA s kancerostatikem navázaným pomocí hydrozonové pH senzitivní vazby vykazovala při in vitro i in vivo testech na myších podstatně vyšší protinádorovou účinnost proti řadě nádorových linií než vykazovaly konjugáty, u kteiých bylo léčivo připojeno na polymemí nosič enzymaticky štěpitelnou vazbou přes oligopeptidovou spojku. K uvolnění léčiva dochází na základě změny pH okolo a není proto k aktivaci nutná přítomnost lysozomálních enzymů. Rychlost uvolnění (a tedy okamžitá koncentrace cytostatika) je mnohem vyšší, nežli v případě konjugátů obsahujících sekvence štěpitelné pouze enzymaticky [Říhová a spol., 2001, Etrych a spol., 2001].

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu jsou lineární a větvené polymemí konjugáty doxorubicinu, daunomycinu, farmorubicinu a dalších antracyklinových kancerostatik, obsahujících karbonylovou skupinu s kopolymery připravenými na bázi 7V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) a případně s protilátkami, jejich fragmenty či nespecifickým imunoglobulinem (obr. 3). Tyto konjugáty se vyznačují tím, že polymemí nosič spolu s protilátkou (imunoglobulinem) zajistí prodlouženou cirkulaci polymemího léčiva v krevním řečišti a jeho následnou přednostní pasivní nebo aktivní akumulaci v nádoru. Kancerostatikum je k nosiči připojeno přednostní vazbou stálou v krevním řečišti (při pH 7,4). Po navázání léčiva na polymer ztrácí kancerostatikum biologický účinek, je transportováno krevním řečištěm v neaktivní formě a k aktivaci cytotoxického léčiva dojde až intracelulámě v organelách cílových buňkách v důsledku poklesu pH a hydrolýzy vazby, kterou je léčivo k polymeru připojeno.

Konjugáty sestávají z polymemího nosiče tvořeného 30 až 3000 monomemími jednotkami spojenými do polymemího řetězce, z nichž 60 až 98,5 % tvoří jednotky 7V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, 1 až 25 % tvoří jednotky methakryloylovaných hydrazonů oligopeptidů zakončených molekulou antracyklinového kancerostatika (s výhodou doxorubicinu) a 0,5 až 15 % tvoří jednotky methakryloylovaných oligopeptidů či jejich sodných solí, případně je obsaženo 0,5 až 10% jednotek methakryloylovaných hydrazidů oligopeptidů a konjugát může mít případně navázáno 0,5 až 5 % methakryloylovaných α-aminokyselin, ε—aminokyselin nebo oligopeptidů zakončených molekulou imunoglobulinu nebo specifické monoklonální nebo polyklonální protilátky.

Větvené vysokomolekulámí struktury obsahující kromě výše uvedených jednotek ještě 0,1 až 5 % jednotek tvořících spojky, propojující jednotlivé polymemí řetězce do vysokomolekulámí větvené struktury, které sestávají z enzymaticky degradovatelných methakryloylových oligopeptidů, s výhodou ptripeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly nebo tetrapeptidu GlyPheLeuGly, propojených diaminy (ethylendiamin, hexamethylendiamin).

Podstatou polymemích konjugátů s cíleným protinádorovým účinkem podle vynálezu je vazba aktivní složky - cytostatika - na polymemí nosič prostřednictvím hydrazonové skupiny vzniklé reakcí karbonylové skupiny v molekule léčiva s hydrazidovou skupino polymeru. Vazbou léčiva na polymemí nosič dojde k výraznému zvýšení molekulové hmotnosti léčiva, a tím k prodloužení doby cirkulace v krevním oběhu i celkové doby setrvání účinné látky v organizmu. Vazba léčiva k polymeruje relativně stálá v průběhu transportu léčiva v krevním řečišti a hydrolyticky štěpitelná v místě kyselém prostředí uvnitř buněk, jmenovitě v buněčných organelách vyznačujících se kyselým pH. To znamená, že léčivo je transportováno krevním řečištěm v neaktivní, na polymemí vázané formě, a kjeho uvolnění a aktivaci dojde až po průniku do cílových nádorových buněk. Aktivace léčiva až v cílových buňkách vede k eliminaci vedlejších účinků jinak toxických cytostatik a k zacílení jejich účinku přednostně na nádorové buňky. Za cílený transport

-2CZ 293886 B6 do nádoru či nádorových buněk je odpovědný polymemí nosič na bázi kopolymerů HPMA. V případě nesměřovaného nebo větveného vysokomolekulámího poly(HPMA) nosiče dochází k ukládání polymemího léčiva do tkáně pevných nádorů v důsledku pasivního „targetingu“ a EPR efektu (Enhancer Permeability and Reteition effect). Polymer může být z organizmu uvolněn po enzymatické degradaci oligopeptidových spojen ve formě kratších polymemíchřetězců např. glumerulámí filtrací. V případě nosičů obsahujících protilátky (imunoglobulin) je protilátka připojena k nosiči pomocí hydrazonové vazby vzniklé reakcí aldehydových skupin zavedených do F_c fragmentu protilátky oxidací jodistanem sodným s hydrazonovými skupinami nosiče. Protilátka (imunoglobulin) může být připojena k řetězci polymemího nosiče rovněž za použití bifunkčních činidel. V tomto případě je molekula protilátky modifikována reakcí s 2-iminothiolanem (zavedení -SH skupin), nebo mohou být do protilátky zavedeny -SH skupiny redukcí někteiých -S-S- skupin (můstků) redukcí, např. glutathionem. Do polymeru jsou zavedeny maleinimidové skupiny reakcí hydrazidových skupin polymeru se sukcinimidovým esterem 3maleinimidopropionové kyseliny a ke konjugaci dojde adicí -SH skupiny protilátky na dvojnou vazbu maleinimidové skupiny polymeru. Obdobně je možné ke konjugaci použít i jiného bifunkčního činidla, např. SPDP (N-hydroxysukcinimidový ester kyseliny 3-(2-pyridyldithio)propionové), kterým je možné konjugovat -SH skupiny obsahující protilátku nebo její fragmenty (imunoglobulin) přímo khydrazidovým skupinám polymemího nosiče.

Konjugát s protilátkou (imunoglobulinem) nebo jinou směrující skupinou (fragment protilátky, lektin, biologicky aktivní oligopeptid) je v cílových orgánech/tkáních akumulován pasivně a aktivně. Pasivní akumulaci umožňuje vyšší molekulová hmotnost konjugátu a uplatňuje se při ní tzv. EPR efekt, aktivní akumulaci zajišťuje proces, při kterém dochází i interakci vazebného místa směrující struktury (např. protilátky) s odpovídajícími receptory na povrchu cílových buněk. V tomto případě hraje HPMA kopolymer roli nejen nosiče, ale i ochranného obalu, kteiý podstatným způsobem snižuje imunogenicitu směrujícího glykoproteinu vkonjugátu.

Polymemí léčivo podle vynálezu může být použito ve třech formách, lišících se bez detailní strukturou. První struktura představuje lineární polymemí konjugát s léčivem bez směrující protilátky (imunoglobulinu) (obr. 1), druhá struktura je vysokomolekulámí a představuje větvenou strukturu polymeru s biodegradovatelnými oligopeptidovými spojkami (obr. 2) a třetí struktura zahrnuje i směrující strukturu - protilátku (imunoglobulin), protein nebo lektin (obr. 3).

Příprava nesměřovaných lineárních polymemích léčiv probíhá ve více reakčních krocích. V prvém kroku je připraven polymemí prekurzor I (viz. obr. 4) jako kopolymer HPMA s methakryloylovými reaktivními estery (4-nitrofenylovými, A-hydroxysukcinimidovými a pod.) oligopeptidů, v druhém kroku, vedoucím k přípravě polymemího prekurzoru II, jsou koncové reaktivní esterové skupiny převedeny hydrazinolýzou na hydrazidy a ve třetím krokuje připojeno k hydrazidovým skupinám chemickou hydrazonovou vazbu kancerostatikum obsahující keto skupinu v molekule. Druhá cesta syntézy polymemího léčiva, respektive polymemího prekurzoru II vychází z přípravy chráněného (např. /-butyloxykarbonyl, Boc) hydrazidu methakryloylovaného oligopeptidu, jeho kopolymerizace s HPMA a po sejmutí chránící skupiny (trifluoroctová kyselina) je polymemí prekurzor použit pro vazbu kancerostatika obdobně jako v předchozím případě.

Při přípravě větveného polymemího léčívaje třeba vyjít zpolymemího prekurzoru I obsahujícího v postranních řetězcích enzymaticky degradovatelný oligopeptid, s výhodou GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyPheLeuGly nebo GlyLeuPheGly. Druhý krok je zahájen mírným větvením polymeru reakcí polymemího prekurzoru I s alkylendiaminem (ethyl, butyl, hexyl) a dokončen následnou hydrazinolýzou zbývajících reaktivních skupin hydrazin hydrátem jako v předešlém případě.

Protilátkami (imunoglobulinem) směrovaná léčiva je možné připravit z obou předchozích typů léčiv následnou reakcí s protilátkou (imunoglobulinem), do jejíž struktury byly předem zavedeny mírnou oxidací KIO₄ nebo NaIO₄ aldehydové skupiny a nebo jejich konjugací s protilátkou (imunoglobulinem) pomocí bifunkčních činidel, jak je popsáno výše. V tomto případě je potřeba

-3CZ 293886 B6 použít polymemí prekurzor s vyšším obsahem reaktivních ONp a tedy i hydrazidových skupin, nežli při přípravě specificky nesměřovaného polymemího léčiva.

Vynález je využitelný k přípravě polymemích léčiv, použitelných pro léčbu různých typů nádorových onemocnění v humánní medicíně.

Přehled obrázků

Obr. 1 představuje strukturu lineárního polymemího konjugátu s léčivem. Jedná se o nesměřované polymemí léčivo. Pro biologické experimenty byl s výhodou používán konjugát s x = 94 % mol., a = 3 % mol., b = 2 % mol., c =1 °/o mol a X = GlyPheLeuGly nebo GlyGly.

Obr. 2 představuje schéma přípravy a struktury větvených vysokomolekulámích konjugátů s biodegradovatelnými oligopeptidovými spojkami. Vhodná molekulová hmotnost konjugátu je 120 000 g/mol. Obsah příčných vazeb 0,5 % mol., obsah DOX 9 % hmotn., obsah hydrazonových skupin 2 % mol. a karboxylů 2 % mol.

Obr. 3 znázorňuje obecnou strukturu konjugátu zahrnujícího i směrující protilátku. Pro biologické experimenty byl s výhodou použit konjugát s X = 92 % mol., a = 3 °/o mol., b = 0,7 % mol., c = 2 % mol, d = 2,3 % mol. a X = GlyPheLeuGly nebo GlyGly.

Obr. 4 znázorňuje strukturu polymemího prekurzoru.

Obr. 5 znázorňuje výsledky měření rychlosti uvolňování doxorubicinu z konjugátů podle vynálezu lišících se složením „spáčem“; A) při pH modelujícím prostředí endosomů (pH 5); B) při pH modelujícím pH krve (7,4). Obsah léčiva v konjugátech byl 10 % hmotn.

Obr. 6 znázorňuje výsledky zjišťování protinádorové aktivity konjugátů podle vynálezu obsahujících hydrolyticky uvolňovaný doxorubicin in vivo (protektivní režim). T buněčný lymfom EL4: 10⁵ buněk/myš,s.c.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava nesměřovaného lineárního polymemího léčiva na bázi doxorubicinu

Syntéza polymemího léčiva byla provedena ve čtyřech syntetických krocích. V prvním kroku byly připraveny monomery 7V-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) a 4-nitrofenylové estery methakryloylovaného oligopeptidu (MA-X-ONp). Druhým krokem byla připravena polymemího prekurzoru I radikálovou kopolymerizací HPMA s MA-X-ONp. Ve třetím kroku byl hydrazinolýzou prekurzoru i připraven polymemí prekurzor II a v posledním kroku byla provedena vazba DOX na polymemí prekurzor.

Příprava monomerů:

HPMA byl připraven dříve popsanou metodou [Ulbrich 2000]. Methakryloylované reaktivní estery byly připraveny methakryloylací příslušného oligopeptidu (X = diGly, GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly, - a pod.), reakcí dle Schotten-Baumana a následnou reakcí vzniklého derivátu methakrylové kyseliny s 4-nitrofenolem v přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu (DCCI).

-4CZ 293886 B6

Methakryloxylované deriváty GlyLeuGly, GlyPheGIy, GlyPheLeuGly a GlyLeuPheGly byly připraveny methakryloylací oligopeptidů, jak je popsáno v prácí [Ulbrich 2000, Subr 1992]. Syntéza je podobná pro deriváty všech uvedených oligopeptidů, proto je uveden pouze příklad pro syntézu Ma-GlyLeuGly-ONp.

MA-GlyLeuGly-ONp·. V trojhrdlé baňce bylo rozpuštěno 0,024 mol (5,88 g) tripeptidu HGlyLeuGly-OH v 15 ml roztoku 0,024 mol (0,97 g) hydroxidu sodného. K. vodnému roztoku sodné soli aminokyseliny bylo za míchání a chlazení (5 °C) po kapkách současně přidáno 0,024 mol (2,55 g) methakryloylchloridu a roztoku 0,024 mol (0,97g) hydroxidu sodného rozpuštěného v 10 ml vody. V průběhu reakce nesmí pH reakční směsi překročit pH 9. Reakční směs byla míchána 1 hod a po okyselení reakční směsi na pH 2 byl methakryloylovaný tripeptid Ma=GlyLeuGly-OH extrahován do ethylacetátu a izolován krystalizaci. Produkt byl přečištěn krystalizaci ze směsi ethanol-voda.

4-nitrofenylový ester byl připraven reakcí 0,014 mol (4.40 g) JV-methakryloyl glycylleucylglycinu s 0,0014 mol (1,93 g) 4-nitrofenolu v tetrahydrofuranu při -10 °C v přítomnosti 0,0513 mol (3,16 g) dicyklohexylkarbodiimidu. Reakce probíhala po dobu 10 hod, potom byla vyloučení dicyklohexylmočovina odfiltrována a produkt přečištěn krystalizaci ze směsi aceton-voda.

Příprava polymemího prekurzoru I: 1 g směsi HPMA (95 % mol; 0,89 g) a Ma-GlyLeuGlyONp (5 % mol; 0,157 g) a 0,048 g azo-bis-izobutyronitrilu bylo rozpuštěno v 6,95 g acetonu a roztok předložen do polymerizační ampule. Po probublání polymerizační směsi dusíkem byla ampule zatavena a polymerizace prováděna při 50 °C po dobu 24 hod. Vyloučený polymer byl odfiltrován, třikrát promyt acetonem, diethyletherem a usušen za vakua. Obsah postranních řetězců zakončených reaktivními -ONp skupinami (složení kopolymerů) je možné řídit složením polymerizační násady (poměrem monomerů). Stejným způsobem byly připraveny všechny polymemí prekurzory lišící se složením postranního řetězce.

Příprava polymemího prekurzoru II: Kopolymer poly(HPMA-co-MA-GlyLeuGly-NHNH₂) byl připraven reakcí polymemího prekurzoru I s hydrazin hydrátem. 300 mg polymemího prekurzoru I (1,3 x ΙΟΛηοΙ ONp) bylo rozpuštěno ve 2 ml methanolu a za intenzivního míchání byl přidán roztok 69 mg NH₂NH₂.H₂O v 1 ml methanolu (1,3.10'³ moll, lOtinásobný přebytek proti ONp). Reakční směs byla ponechána reagovat 3 hodiny, potom byl methanolový roztok naředěn destilovanou vodou na 30 ml a produkt zbaven nízkomolekulámích složek pomocí dialýzy proti destilované vodě (2 dny). Finální produkt byl izolován z vodného roztoku lyofilizaci. Molekulová váha (M_w) a polydisperzita polymeru byla stanovena pomocí gelové chromatografíe opatřené detektorem rozptylu světla. Množství hydrazidových skupin bylo zjištěno spektrálně po reakci hydrazidových skupin s TNBS (kyselinou trinitrobenzensulfonovou). Stejným způsobem byly připraveny prekurzory obsahující ostatní aminokyseliny a oligopeptidy.

Polymemí prekurzory II byly alternativně rovněž připraveny radikálovou srážecí kopolymerací odpovídajícího TV-terc.butyloxykarbonylhydrazidu methakryloylovaného oligopeptidů (poly(HPMA-co-MA-X-NHNH-BOC)) s HPMA za podmínek uvedených výše. Monomery Ma-X-NHNH-BOC (X = GlyLeuGly, GlyPheLeuGly GlyPheGIy) byly připraveny z odpovídajícího methakryloylovaného oligopeptidů (kyseliny) reakcí shydrazinem hydrátem za použití dicyklohexylkarbodiimidu, jak je obvyklé v peptidové syntéze Polymemí prekurzory II byly v tomto případě před sejmutím chránící BOC skupiny z poly(HPMA-co-MA-XNHNH-BOS vysráženy do směsi aceton-diethylether a chránící BOC skupina byla sejmuta z polymeru kyselinou trifluoroctovou Výsledný polymemí prekurzor II byl rozpuštěn ve vodě, dialyzován proti vodě a lyofilizován.

Vazba doxorubicinu na polymemí prekurzor. 250 mg polymemího prekurzoru II (poly(HPMA-co-MA-GlyLeuGly-NHNH₂) (0,1 mmol NHNH₂) bylo rozpuštěno v 3 ml methanolu. Takto připravený roztok polymeru byl přidán k 23 mg DOX.HC1 (40 pmol). Do reakční směsi byly přidány 2 kapky kyseliny octové a tento nehomogenní roztok byl míchán při labora

-5CZ 293886 B6 torní teplotě (ve tmě). Po 48 hodinách reakce byl homogenní roztok dvakrát čištěn gelovou filtrací od volného DOX na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Polymemí frakce byla izolována, zahuštěna na vakuové odparce a produkt srážen do diethyletheru. Produkt byl přesrážen z methanolu do diethyletheru a sušen do konstantní hmotnosti. Obsah DOX byl stanoven spektrálně (λ 480 nm, ε 11 500 L mol'¹ cm¹, voda) a obsah hydrazidových skupin TNBS metodou. <M_W> a distribuce molekulových hmotností byly zjištěny pomocí kapalinové chromatografie (kolona Superose™ 6 (300 x 10 mm), 0,3M octanový pufr (CH₂COONa/CH₃COOH; pH 6,5; 0,5 g/L NaN₃), průtok 0,5 ml/min, detekce diferenciálním refraktometrem, detektorem rozptylu světla (DAW-DSPF, Wyatt Technology, USA) v UV detektorech (280 až 488 nm).

Uvedený postup byl použit při přípravě všech ostatních polymemích konjugátů doxorubicinu.

Příklad 2

Příprava větveného vysokomolekulámího konjugátu

400 mg polymemího prekurzoru I obsahujícího oligopeptidové sekvence GlyPheGly, GlyLeuGly nebo GlyPheLeuGly (0,19 mmol ONp) bylo rozpuštěno v 1,1 ml DMSO. Za výrazného míchání roztoku polymeru bylo přidáno 105 μΐ 9,2 M roztoku 1,2-ethylendiaminu v DMSO (21 μπιοί EDA) a reakční směs byla nechána při laboratorní teplotě reagovat 1 hodinu. Za intenzivního míchání roztoku polymeru byl přidán roztok 100 mg hydrazin hydrátu (2 mmol) v 0,3 mL DMSO a reakční směs byla další 3 hodiny intenzivně míchána. Poté byla reakční směs naředěna destilovanou vodou na 30 ml a produkt byl čištěn dialýzou proti destilované vodě (2 dny). Vysokomolekulámí prekurzor byl lyofilizován. <M_W> a distribuce molekulových hmotností byla zjištěna pomocí kapalinové chromatografie, obsah hydrazidových skupin byl zjištěn spektrálně TNBS metodou. Doxorubicin byl vázán k polymeru a konjugát charakterizován za podmínek popsaných v příkladu 1.

Příklad 3

Příprava protilátkami (imunoglobulinem) směrovaného konjugátu I

Částečnou modifikací hydrazidových skupin polymemího prekurzoru II s obsahem hydrazidových skupin 10 až 15 % mol pomocí AMiydroxysukcinimidylového esteru kyseliny maleinimidylpropionové (SMP) byl připraven kopolymer nesoucí v postranních řetězcích hydrazidové a maleinimidové skupiny (MI) (poly(HPMA-co-MA-X-NHNH₂-co-Ma-X-MHNH-MI)). 250 mg prekurzoru II poly(HPMA-co-MA-diGly-NHNH₂ (125 pmol hydrazidových skupin) bylo rozpuštěno v 1,2 ml DMSO a přidán roztok 16,6 mg SMP (62,5 pmol) v 0,6 ml DMSO. Reakční směs byla míchána při laboratorní teplotě 8 hodin. Po přečištění na koloně PD-10 (eluent: destilovaná voda) byla stanovena <Μψ> a distribuce molekulových hmotností konjugátu pomocí kapalinové chromatografie, množství maleirimidových skupin bylo stanoveno modifikovanou Ellmanovou zkouškou na obsah zbývajících hydrazidových skupin metodou TNBS. K tomuto polymeru byl navázán doxorubicin stejným způsobem, jak bylo uvedeno v příkladu 1.

Zavedení -SH skupin do molekuly protilátky (imunoglobulinu): 15 mg protilátek (polyklonální anti-thymocytámí IgG) (0,1 pmol) bylo na koloně PD-10 převedeno do 1 ml fosfátového pufru (0,005M NaH₂PO₄/Na₂HPO₄; 0,1 MNaCl; 0,01 EDTA; pH 7,4). 0,67 mg 2-iminothiolanu (4 pmol) bylo rozpuštěno v 50 pL DMF a přidáno k roztoku intenzivně míchaných protilátek. Produkt byl po 2,5 hodinách míchání při laboratorní teplotě izolován gelovou filtrací na koloně PD-10 (fosfátový pufr, pH 7,4). Stupeň modifikace protilátky (imunoglobulinu) byl stanoven metodou využívající reakcí sulfhydrylových skupin sElImanovým činidlem.

-6CZ 293886 B6

Konjugace 60 mg polymeru poly(HPMA-co-MA-diGly-NHN=DOW-co-Ma-X-NHNH₂-coMA-X-NHNH-MI obsahujícího doxorubicin, hydrazidové a maleinimidové skupiny s 20 mg modifikovaných protilátek byla provedena ve fosfátovém pufru pH 7,4 (viz výše) při pokojové teplotě. Konečný produkt byl čištěn gelovou filtrací a charakterizován pomocí UV spektroskopie (obsah DOX), aminokyselinovou analýzou (obsah protilátek, imunoglobulinu) a elektroforézou Phastsystem - Pharmacia LKB (přítomnost volného proteinu či léčiva).

Příklad 4

Příprava protilátkami (imunoglobulinenm) směrovaného konjugátu II

Polymemí prekurzor II byl modifikován v prvním kroku syntézy pomocí SPDP za obdobných podmínek, za jakých byla provedena modifikace polymeru pomocí SMP uvedená v příkladu 3.

Ke 14 mg -SH skupinou modifikovaných protilátek, imunoglobulinu (viz výše) obsahujících 0,68 pmol SH skupin rozpuštěných v 1,7 ml fosfátovém pufru (0,05 M NaH₂PO₄/Na₂HPO₄+ 0,lM NaCl; 0,01 EDTA; pH 7,4) byl za míchání přidán roztok 42 mg polymeru poly(HPMAco-MA-diGly-NHN=DOX-co-MA-diGly-NHNH₂-CO-Ma-diGlyNHNH-PD (obsahujícího 3,3 gmol pyridyldithiových (PD) skupiny) v 0,6 m pufru. Reakční směs byla míchána 7 hodin při laboratorní teplotě. Po této době byl od konjugátu gelovou filtrací odstraněny nízkomolekulární podíly a nenavázaný polymer, následně byl konjugát zahuštěn ultrafiltrací a charakterizován obdobně jak je uvedeno v příkladu 3.

Příklad 5

Příprava protilátkami (imunoglobulinem) směrového konjugátu III

Tyto konjugáty byly připraveny reakcí protilátek, do jejichž molekuly byly zavedeny aldehydové skupiny mírnou oxidací jodistanem sodným s hydrazidovými skupinami zbylými po reakci polymerního prekurzoru II s doxorubicinem.

Příprava oxidovaných protilátek): 40 mg protilátek (polyklonální anti-thymocytámí IgG) bylo po koloně PD-10 převedeno do octanového pufru (0,02 M CH₃COONa/CH₃COOH; 0,15 M NaCl; pH 5). Ve stejném pufru byl za tmy připraven roztok 0,1 M NaIO₄. Roztoky protilátek a jodistanu byly smíchány v poměru 4:1 tak, aby výsledná koncentrace NaIO₄ byla 0,02 mol/1 a koncentrace protilátek byla 9 mg/ml. Reakční směs byla při laboratorní teplotě ve tmě míchána dvě hodiny a poté bylo přidáno 25 μΐ ethylenglykolu na každý ml reakční směsí. Po 20 minutách byly oxidované protilátky (imunoglobulin) čištěny a izolovány kapalinovou chromatografií na koloně PD10. Koncentrace protilátek (imunoglobulinu) v roztoku byla stanovena spektrofotometricky. Počet aldehydových skupin byl stanoven metodou využívající reakci aldehydových skupin s barvivém Lucifer Yellow CH.

Příklad přípravy vzorku konjugátu: 36,5 mg oxidovaných protilátek v 5 ml acetátového pufru (0,02 M CH₃COONa/CH₃COOH; 0,15 M NaCl; pH 5) bylo za chlazení na 15 °C smícháno s roztokem 73 mg polymemího prekurzoru II poly(HPMA-co-MA-diGly-NHN=DOX-co-MadiGIy-NHNH₂ s navázaným DOX rozpuštěným v 1 ml pufru. Reakční směs byla míchána ve tmě 16 hodin při 15 °C. Po 16 hodinách bylo pH reakční směsi upraveno 0,lM NaOH na pH 7,2. Od konjugátu byly odstraněny gelovou filtrací nízkomolekulární podíly a nenavázaný polymer, následně byl konjugát zahuštěn a charakterizován obdobně jako ostatní konjugáty s protilátkami (imunoglobulinem).

Ke konjugacím s polymery byl použit lidský i králičí nespecifický imunoglobulin (IgG), polyklonální anti-thymocytové protilátky (ATG), monoklonální protilátky anti-Thy 1.2, anti-CD4, anti

-7 CZ 293886 B6

CD 71, anti-BCll, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD14 a další protilátky proti tumor-asociujícím antigenům (anti-TAA).

Příklad 6

In vitro uvolňováni doxorubicinu z polymemích konjugátů

Hydrolytická stabilita konjugátů a rychlost uvolňování aktivního léčiva z polymeru byly měřeny v modelových systémech při různých pH a teplotách. Na obr. 5 jsou uvedeny výsledky měření rychlosti uvolňování doxorubicinu z polymerů lišících se složením „spaceru“ při pH modelujícím pH krve (7,4) a pH modelujícím prostředí endozomů či lysozomů (pH 5 až 6). Při experimentech byla koncentrace vázaného DOX konstantní (0,5 mmol.l¹) νΟ,ΙΜ acetátovém pufru (CH₃COONa/CH₃COOH, 0,05 M NaCl). Vzorky byly inkubovány ve tmě při 37 °C a v předem daných časových intervalech byly odebírány 0,1 ml části vzorků a analyzovány pomocí HPLC po extrakci DOX z roztoku. Z výsledků je zřejmé, že struktura spojky mezi léčivem a polymemím nosičem ovlivňuje rychlost uvolňování léčiva z nosiče, přičemž rychlost uvolňování je poměrně malá při pH krve a více než o řád rychlejší při pH modelujícím prostředí buňky. Vezmeme-li v úvahu, že doba setrvání léčiva v krevním řečišti je poměrně krátká, experiment potvrzuje relativní stálost polymemího konjugátu v průběhu transportu a jeho schopnost uvolnit aktivní léčivo až po průniku do buněk.

Příklad 7

Cytotoxická aktivita in vitro polymemích konjugátů obsahujících hydrolyticky uvolňovaný doxorubicin u buněk s normálním obsahem lysozomů (tabulka 1)

Schopnost polymemích konjugátů omezit buněčné dělení neboli proliferaci cílových buněk je označována jako cytotoxická nebo cytostatická aktivita. Tato cytotoxická aktivita byla in vitro detekována inhibici inkorporace ³H-thymidinu do jader cílových buněk [Říhová a spol. 2000]. Inkorporace thymidinu a aktivita konjugátů jsou nepřímo úměrné. Nízká inkorporace thymidinu znamená vysokou cytotoxickou aktivitu testovaných látek. Buňky vybraných nádorových linií (myší T leukemické linie EL4, myší B buněčné leukémie BCL 1, myšího B buněčného lymfomu 38C13, lidského kolorektálního karcinomu primárního SW 480, lidského kolorektálního karcinomu metastázujícího SW 620, lidského kolorektálního karcinomu SW620 geneticky modifikovaného myším genem pro Thy 1.2 SW620/T) a T buněčným mitogenem tj. konkavalinem A stimulované myší splenocyty a lidské periferní lymfocyty byly v dávkách 1 x 10⁴ - 5 x 10⁵ (v závislosti na použitých testovacích buněčných systémech) v růstovém médiu RPMI 1640 napipetovány do 96jamkových FB-tkáňových destiček (NUNC, Dánsko). Další kultivace proběhla buď bez další stimulace (všechny nádorové linie a neovlivněné myší a lidské lymfocyty) nebo v přítomnosti T buněčného mitogenu konkanavalinu A pokud se jednalo o zjištění efektu na normální intenzivně proliferující T lymfocyty. Koncentrace konkanavalinu A, ve které byly buňky kultivovány, byla 1,25 μΐ/jamku. Ke každé experimentální jamce tkáňové destičky, obsahující testované buňky v médiu bez nebo s přítomností konkavalinu A, byly přidány testované vzorky nebo volný doxorubicin v konečných koncentracích 0,0016 až 80 pg/ml. Celkový objem jamky byl 250 μΐ. Každá koncentrace byla paralelně testována u jednoho vzorku a jedné linie tři až pětkrát. Mikrotitrační tkáňové destičky byly inkubovány 24 až 72 hodin při 37 °C v prostředí 5 % CO2. Po ukončení kultivace bylo do každé jamky přidáno 1 pCi³H-thymidinu. Po dalších pěti až šesti hodinách (v závislosti na testovacím systému) byly buňky sesbírány (sběrač buněk-Tomtec) na skleněný vláknitý filtr (Filterman, Wallac), usušeny a vyhodnoceny na inkorporovanou radioaktivitu (MicroBeta Trilux, Wallac). IC50 pro nesměřované konjugáty obsahující hydrolyticky uvolňovaný doxorubicin se pohybovalo od 0,01 pg doxorubicinu/ml do 1,41 pg doxorubicinu/ml v závislosti na rezistenci (citlivosti použité cílové linie na terapii) a na typu konjugátu. Bylo

-8CZ 293886 B6 potvrzeno, že cytotoxicita je výlučnou vlastností konjugátů obsahujících hydrolyticky uvolňovaný doxorubicin, protože konjugát bez léčiva není cytotoxický.

Testy in vitro prokázaly, že a) aktivita konjugátů s hydrolyticky uvolnitelným léčivem nezávisí na enzymatické degradovatelnosti kovalentní vazby mezi tímto léčivem a oligopeptidickou spojkou.

Tabulka 1. Porovnáni in vitro inhibičních aktivit vzorků obsahujících léčivo vázané pomocí různých spojek; testovaná linie myší leukemie EL4 (T buněčný lymfom EL4)

Vzorek	IC₅₀ (gg DOX/ml)
P-GFLG-DOX (PK1)	19,1
P-GG-DOW (hydrazon)	0,40
P-GFLG-DOW (hydrazon)	0,26
Doxorubicin (DOX)	0,02

IC50 je koncentrace léčiva způsobující 50% inhibici proliferace.

Příklad 8

Cytotoxická aktivita in vitro polymemích konjugátů obsahujících hydrolyticky uvolňovaný doxorubicin u buněk s nízkým obsahem lysozomů

Test cytotoxické aktivity in vitro byl prováděn stejně jako je uvedeno v příkladu 7. Jako cílové buňky byly vybrány buňky erytroleukemické linie K 562 s nízkým obsahem lysozomů. Bylo prokázáno, že konjugáty obsahující hydrolyticky uvolňovaný doxorubicin jsou významně cytotoxické i u této linie u které jsou jen velmi omezeně cytotoxické konjugáty s enzymaticky uvolňovaným doxorubicinem (tabulka 2). Tento výsledek prokazuje, že konjugáty s hydrolyticky uvolňovaným doxorubicinem jsou účinné i v buněčných systémech, které jsou chudé na lysozomy.

Tabulka 2. Porovnání in vitro inhibičních aktivit vzorků obsahujících léčivo vázané pomocí různých spojek; testovaná erytroleukemická linie K 562.

Vzorek	IC₅o (gg DOX/ml)
P-GFLG-DOX (PK1)	9,71
P-GG-DOW (hydrazon)	0,06
Doxorubicin (DOX)	0,28

IC₅₀ je koncentrace léčiva způsobující 50% inhibici proliferace.

Příklad 9

Protinádorová aktivita polymemích konjugátů obsahujících hydrolyticky uvolňovaný doxorubicin in vitro (obr. 6)

Myši inbredního kmene C57BL/10 byly subkutánně transplantovány T buněčným lymfomem (EL4). Nádorové buňky byly injikovány do dolní poloviny zad experimentálních zvířat v dávce 1 x 10⁵ buněk/myš. Den transplantace buněk byl označován jako den 0. Poté byly polymemí konjugáty s hydrolyticky uvolňovaným doxorubicinem podány intraperitoneálně buď v den 1, 3, 5, 7 a 9 (protektivní režim), v den 10, 12, 14, 16 a 18 nebo v den 12, 14, 16, 18 a 20 (terapeutický

-9CZ 293886 B6 režim). Denní dávka doxorubicinu byl 50 pg/myš. Konjugáty významným způsobem potlačovaly růst nádoru a zvyšovaly počet dlouhodobě přežívajících experimentálních zvířat. Zatímco polymerní konjugát bez léčiva byl zcela bez účinku a klasický tj. nemodifikovaný doxorubicin měl účinek jen velmi omezený (maximální doba přežití exprimentálních zvířat byla 40 dnů oproti 35 dnům u skupiny kontrolní), podání polymemích konjugátů s hydrolyticky uvolňovaným doxorubicinem umožnilo dlouhodobé přežití tj. více než 80 dní v protektivním režimu u 40 % myší, v terapeutickém režimu u 20 % myší.

Myším inbredního kmene Balb/c byla i.p. transplantová na myší B buněčnou leukemie BCL1. Národové buňky byly injikovány v dávce 5 x 10⁵ buněk/myš. Den transplantace byl označen jako den 0. Poté byly polymemí konjugáty s hydrolyticky uvolňovaným doxorubicinem podány intravenózně v den 11, 13 a 17 (terapeutický režim). Denní dávka doxorubicinu byla 100 pg/myš. Testované konjugáty měly výraznou protinádorovou aktivitu. Zatím co kontrolní myši přežívaly maximálně 40 dní, 20% myší léčených testovanými konjugáty přežilo déle než 100 dní a 10 % déle než 140 dní.

Literatura

R. Dulcan, J.B. Lloyd, J. Kopeček. P. Rajmanová, J. Strohalm, K. Ulbrich. B. Říhová, V. Chytrý: Synthetic Polymeric Drugs. Czech PV. 0095/85, Australia 589587, Canada 130053, Denmark 164485, Europe 0187547, US 5,037,883, Japan 000137/86

K. Ulbrich. V. Šubr, J. Strohalm, D. Plocová, M. Jelínková, B. Říhová, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules I. Synthesis and Physicochemical Characterisation. J. Controlled Rel. 64, 63-79 (2000)

Vsey P. A., Kaye S.B., Morrison R., Twelves C., Wilson P., Duncan R., Thomson A.H. Murray

L. S., Hiditch T.E., Murray T., Burtles S., Fraier D., Frigerio E. Casidy, J.: Phase I clinical and pharmacokinetic study of PK1 [N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymer doxorubidin]: first member of a new class of chemotherapeutic agents - drug polymer conjugates, Clinical Cancer Research 5, 83-94 (1999)

Julyan, P.J. Seymour, L.W., Feerry, D.R., Daryani, S., Boivin, CH. M. Doran, J., David, M., Anderson, D., Christodoulou, CH., Young, A.M., Hesslewood, S., Kerr, D.J.: Preliminary clinical study of the distribution of HPMA copolymers bearing doxorubicin and galastosamine, J. Control. Rel. 57, 281-290 (1999)

Thomson A. H., Vasey P.A., Murray L. S., Cassidy J., Fraier D., Frigerio E., Twleves C.: Population pharmacokinetics in phase I drug development: a phase I study of PK1 in patiets with solid tumors, Br. J. Cancer. 81, 99-107 (1999)

J. Kopeček. P. Kopečková, T. Minko, Z. Lu, HPMO Copolymer-Anticancer Drug Conjugates: Design, Activity, and Mechanism of Action. Europ. J. Pharm. Biopharm. 50, 61-81 (2000)

K. Kratz, U. Beyer, H.T. Schutte, Drug-Polymer Conjugates Containing Acid-Cleavable Bonds. Critical Reviews „in Therapeutic Drug Carriers Systems“, 16(3), 245-288 (1999)

B. Říhová, T. Etrych, M. Pechar, M. Jelínková, M. Šťastný, O. Hovorka, M. Kovář, K. Ulbrich, Doxorubicin Bound to a HPMA Copolymer Carrier Through Hydrazone Bond is Effective also in a Cancer Cell Line with a Limited Content of Lysosomes. J. Controlled Release 74, 225-232 (2001)

T. Etrych. M. Jelínková, B. Říhová, K. Ulbrich, New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH sensitive linkage. Synthesis, in vitro and in vivo biological properties. J. Controlled Rel. 73, 89-102 (2001).

-10CZ 293886 B6

V. Šubr, J. Strohalm, K. Ulbrich, R. Duncar, I.C. Hume, Polymers, Containing Enzymatically Degradable bonds, XII. Effects of Spacer Structure on the Rate Release of Daunomycin and Adriamycin from Poly[N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide] Drug Carriers in vitro and Antitumour Activity Measured in vivo, J. ControlledRel., 18, 123-132 (1992)

Claims

1. Konjugáty sestávající z polymemího nosiče tvořeného 30 až 3000 monomemími jednotkami spojenými do polymemího řetězce, složené z

a) 60 a 98,5 % jednotek jV-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu,

b) 1 až 25 % jednotek methakryloylovaných hydrazonů oligopeptidů zakončených molekulou antracykl inového kancerostatika,

c) 0,5 až 15 % jednotek methakryloylovaných oligopeptidů či jejich sodných solí a případně

d) 0,5 až 10 % jednotek methakryloylovaných hydrazidů olegopeptidů.

2. Konjugáty podle nároku 1, které dále obsahují 0,5 až 5 % methakryloylovaných oligopeptidů zakončených molekulou imunoglobulinů nebo specifické monoklonální nebo polyklonální protilátky.

3. Konjugáty podle nároku 1 nebo 2, které dále obsahují 0,1 až 5 % jednotek enzymaticky odbouratelných methakryloylovaných oligopeptidů propojených alkylendiaminy, které tvoří bivalentní spojku mezi jednotlivými polymemími řetězci, čímž vytváří větvenou strukturu konjugátu.

4. Konjugáty podle nároku 1,2 nebo 3, kde antracyklinovým kancerostatikem je doxorubicin.

-11 CZ 293886 B6

5. Konjugáty podle nároku 1 obecného vzorce přičemž jednotlivé strukturní jednotky jsou v řetězci uspořádány náhodně a kde X představuje vhodnou spojku tvořenou oligopeptidovým zbytkem a X nabývá hodnot 20 až 3000, a je 1 až 750, b i c jsou 1 až 450.

- 12CZ 293886 B6

6. Konjugát podle nároku 2 obecného vzorce 2, je schematické znázornění Imunoslobulinu (protilátky) a X, x, a, b a c mají shora uvedený význam a d nabývá hodnot 1 až 150, Sje buď protilátka 5 zvolená z následující řady: γ-globulin pro i.v. aplikace, autologní protilátky, protilátky anti-17Al, anti-CA 15-3 a další, připojená k polymemímu řetězci strukturou vzorce, nebo S znamená biodegradabilní oligopeptidovou spojku, kterou jsou připojeny další obdobné řetězce.

7. Konjugáty podle kteréhokoli z předcházejících nároků, kde jsou použité oligopeptidy volené z řady GlyGly, GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly a GlyLeuPheGly.

8. Konjugáty podle nároku 2 nebo 6, kde jsou použity protilátky volené z řady γ-globulin pro 15 i.v. aplikace, autologní protilátky, protilátky anti-17-Al, anti-CA 15-3 a další nádorově specifické a nádorově asociované protilátky.

-13 CZ 293886 B6

9. Konjugáty podle nároku 3, kde jsou bivalentní jednotky spojující lineární řetězce volené z řady GlyPheLeuGly, GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyLeuPheGly.

5

10. Farmaceutická kompozice kléčbě nádorových onemocnění, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje konjugát podle kteréhokoli z předcházejících nároků.

11. Farmaceutická kompozice podle nároku 10, určená k léčbě nádorů, jako je nádor prsu nebo kolorektální nádor.