CZ308419B6 - Blokový kopolymer pro překonání lékové rezistence nádorů k chemoterapii, jeho polymerní konjugát s léčivem, farmaceutická kompozice je obsahující, způsob jejich přípravy a jejich použití - Google Patents

Blokový kopolymer pro překonání lékové rezistence nádorů k chemoterapii, jeho polymerní konjugát s léčivem, farmaceutická kompozice je obsahující, způsob jejich přípravy a jejich použití Download PDF

Info

Publication number
CZ308419B6
CZ308419B6 CZ2016-206A CZ2016206A CZ308419B6 CZ 308419 B6 CZ308419 B6 CZ 308419B6 CZ 2016206 A CZ2016206 A CZ 2016206A CZ 308419 B6 CZ308419 B6 CZ 308419B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
group
drug
block
molecular weight
dox
Prior art date
Application number
CZ2016-206A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2016206A3 (cs
Inventor
Tomáš Etrych
Libor KOSTKA
Alena Braunová
Lucie Cuchalová
Milada Šírová
Olga Janoušková
Original Assignee
Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.
Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i., Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i. filed Critical Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.
Priority to CZ2016-206A priority Critical patent/CZ308419B6/cs
Priority to PCT/CZ2017/050015 priority patent/WO2017177991A1/en
Priority to EP17721952.4A priority patent/EP3442594B1/en
Publication of CZ2016206A3 publication Critical patent/CZ2016206A3/cs
Publication of CZ308419B6 publication Critical patent/CZ308419B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/407—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. ketorolac, physostigmine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6907—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a microemulsion, nanoemulsion or micelle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
    • C08F20/52—Amides or imides
    • C08F20/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F20/58—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-acryloylmorpholine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
    • C08F20/52—Amides or imides
    • C08F20/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F20/60—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Předkládané řešení se týká blokového kopolymeru pro překonání lékové rezistence nádorů k chemoterapii, zahrnujícího bloky A a B navzájem spojené kovalentní vazbou nebo hydrolyticky či enzymaticky biodegradovatelnou spojkou, přičemž hydrofilní blok A je tvořen poly(-(2-hydroxypropyl)methakrylamidem), popřípadě s příměsí komonomerů umožňujících kovalentní navázání léčiv, a hydrofobní blok B je tvořen polypropylenoxidem. Řešení se dále týká polymerního konjugátu, obsahujícího blokový kopolymer a nízkomolekulární léčivo, farmaceutické kompozice je obsahující a jejich použití v medicíně.

Description

Blokový kopolymer pro překonání lékové rezistence nádorů k chemoterapii, jeho polymerní konjugát s léčivem, farmaceutická kompozice je obsahující, způsob jejich přípravy a jejich použití
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká blokového kopolymeru pro překonání lékové rezistence nádorů k chemoterapii, jeho polymemího konjugátu s léčivem, farmaceutické kompozice je obsahující, způsobů jejich přípravy a jejich použití jako micelámích nosičů léčiv, umožňujících překonání vícečetné lékové rezistence nádorů.
Dosavadní stav techniky
V současné době je v oblasti léčby různých onemocnění, zejména nádorových, snaha využít ve větší míře látky na bázi polymerů, které mohou sloužit jako tzv. polymerní nosiče léčiv. Podmínkou jejich použití pro lékařské účely je jejich biokompatibilita, schopnost snížení nespecifické toxicity navázaného léčiva oproti nízkomolekulámímu léčivu, prodloužení cirkulace léčiva v krevním řečišti, možnost vyloučení polymemího nosiče z organismu (nejlépe pomocí glomerulámí filtrace) po dopravení léčiva do místa určení a v neposlední řadě i akumulace léčiva v cílové tkáni a jeho řízené uvolňování z polymemího nosiče. Již dříve bylo zjištěno, že vysoká molámí hmotnost polymemích nosičů a jejich konjugátů s léčivy významně ovlivňuje a přispívá ktzv. pasivní akumulaci léčiva v pevných nádorech. Tento jev se nazývá EPR efekt (Enhanced Permeability and Retention effect). Na jeho základě jsou v pevných nádorech přednostně akumulovány vysokomolekulámí látky jak ve vodě rozpustné, tak i tvořící ve vodě částice o rozměrech několik desítek až stovek nanometrů. Tento fakt je dnes již ve velké míře využíván pro přípravu polymemích konjugátů s kovalentně vázaným kancerostatikem, specificky se akumulujících ve většině pevných nádorů. Nízkomolekulámí kancerostatikum je na polymerní nosič navázáno degradovatelnou vazbou umožňující řízené uvolnění dopravovaného léčiva z nosiče v jeho původní aktivní formě buď v nádorové tkáni, nebo přímo v nádorové buňce.
V posledních letech se velmi rozšířil výzkum a vývoj polymemích nosičů léčiv na bázi kopolymerů 7V-(2-hydroxypropylmethakryl)amidu (PHPMA), které jsou vodorozpustné, netoxické pro živý organismus, zcela biokompatibilní s živými tkáněmi, a navíc umožňují vazbu např. léčiva, inhibitoru ABC transportérů, struktur směmjících k buněčným receptorům a dalších biologicky aktivních molekul. PHPMA umožňují modifikaci hlavního řetězce jiným polymemím řetězcem, a to jak na koncích řetězce, tak i podél tohoto řetězce tzv. roubováním. Jinými typy polymerů, studovanými i využívanými v klinické praxi jako různé typy či formy polymemích nosičů léčiv, jsou např. různé deriváty poly(ethylenoxid)u, kopolymery poly(ethylenoxid)u a poly(propylenoxid)u (Pluronic nebo Poloxamer), póly(N-vinylpyrrolidon)u, kopolymery kyseliny mléčné a glykolové, deriváty polyfosfazenů, polyanhydridů, poly(s-kaprolakton)u, polyfosfoesterů, poly(kyanoakrylát)u, poly(methylakrylát)ů a poly(methakrylové kyseliny), poly(N-isopropylakrylamid)u a další. Pro vazbu nízkomolekulámího kancerostatika na polymerní nosič kovalentní vazbou jsou využívány biodegradovatelné vazby, např. amidová, hydrazonová, acetalová, disulfidová apod. Tyto vazby jsou obvykle stálé v krevním řečišti a jsou specificky štěpeny v prostředí nádoru či nádorové buňky. Není zde proto riziko, že se nízkomolekulámí kancerostatikum uvolní nespecificky již při cirkulaci v krevním řečišti, kde by působilo toxicky, a navíc by se ve velmi krátké době vyloučilo z organismu, aniž by dosáhlo požadovaného místa určení (např. nádom).
Doprava kancerostatika do místa požadovaného účinku je však jedním, nikoli jediným předpokladem pro úspěšnou léčbu nádorových onemocnění. Při opakované léčbě cytostatiky často dochází ke snížení její účinnosti v důsledku rezistence nádorových buněk vůči strukturně i fůnkčně odlišným cytotoxickým léčivům, zejména pak antracyklinovým antibiotikům, mezi něž
- 1 CZ 308419 B6 patří např. doxorubicin (DOX). Rezistence nádorových buněk (anglicky multidrug resistance; MDR) vůči léčivům je vyvolána většinou dlouhodobým působením cytotoxických látek na tyto buňky a jejich obrannou reakcí je proto snižování intracelulámí koncentrace léčiva pomocí různých mechanismů. Jedním z nej významnějších, a proto také často studovaných mechanismů, je eflux léčiva, při němž dochází prostřednictvím speciálních transmembránových proteinů k „vypumpovávání“ cytostatik ven z buňky, a to dříve, než léčivo může v buňce působit. Ve velké většině případů je tento jev způsoben membránovým vysokomolekulámím glykoproteinem, nazvaným P-glykoprotein (P-gp). P-gp patří do velké rodiny tzv. ABC transportérů, které jsou charakterizovány dvěma ATP doménami, na nichž probíhá hydrolýza ATP za uvolnění energie, potřebné k transportu substrátu ven z buňky. P-gp je ATP dependentní efluxní pumpou endogenních či exogenních látek s širokou substrátovou specifitou, která jej značně odlišuje od ostatních ABC transportérů, jejichž substráty bývají úzké skupiny látek. P-glykoprotein je součástí plazmatické membrány buněk a nachází se v buňkách řady důležitých orgánů, např. jater, ledvin, střev a dalších, kde se účastní aktivního transportu iontů, aminokyselin, peptidů, cukrů, ale právě i léčiv a jejich metabolitů zevnitř buňky do extracelulámího prostředí. Zatímco ve zdravých buňkách P-gp funguje jako ochrana proti průniku xenobiotik do organismu, v případě nádorových buněk, kde je tento protein exprimován v mnohem větším množství, přispívá díky této své vlastnosti k odolnosti nádorových buněk vůči působení léčiv. Inhibicí tohoto procesuje možné docílit lepšího pronikání léčiv do buněk a udržet zde dostatečně vysokou hladinu léčiva potřebnou pro účinnější terapii.
Jedním z možných řešení, jak docílit inhibice funkce P-gp, a tím i umožnění vstupu léčiva do buňky a jeho působení uvnitř, je strukturní modifikace léčiv, nebo použití speciálních inhibitorů P-gp v kombinaci s terapeutikem. Použití samotného inhibitoru však mívá velmi závažné vedlejší účinky. Navíc hrozí inhibice funkce P-gp i v normálních, tedy zdravých buňkách. V současnosti se vědci snaží řešit otázku vedlejších účinků P-gp inhibitorů (např. na bázi Ritonaviru či Reversinu) jejich vazbou na makromolekulám! nosič, na který je rovněž navázáno cytostatikum, případně kombinací polymemího inhibitoru s polymemím kancerostatikem.
Jinou alternativu nabízí použití polymemího konjugátu s léčivem, kdy část polymemího nosiče působí zároveň jako P-gp inhibitor. Z literatury je známo studium micelámích nosičů na bázi Pluronicu, triblokového kopolymeru poly(ethylenoxid)u (PEO) a poly(propylenoxid)u (PPO) PEO-PPO-PEO, u kterého bylo zjištěno, že je schopen inhibovat P-gp. Micelámí systémy na bázi Pluronicu mohou být používány jako solubilizátory ve vodě nerozpustných léčiv (např. DOX) a zároveň jako „nanokontejnery“ pro tato léčiva, která mají být uvolněna pouze ve specifickém místě působení (např. v pevném nádom). Polymemí micely, polymerosomy nebo jiné formy nanočástic, např. nanosystémy na bázi dendrimerů, jsou typem polymemího nosiče, který by měl být schopen (vlivem EPR efektu) pasivně směrovat celý systém do vaskularizovaných pevných nádorů, kde by mělo dojít ke zvýšené akumulaci vysokomolekulámího léčiva. Micely se skládají z hydrofobního jádra, do kterého je buď fýzikálními interakcemi, nebo kovalentně inkorporováno nízkomolekulámí léčivo, a z hydrofilního obalu (slupky), která je většinou tvořena hydrofilními polymery (nejčastěji na bázi PEO) chránícími celý systém před agregací a před interakcemi s komponentami živého organismu (makrofágy a buňky imunitního systému, buňky RES) a zachycováním v játrech. Systémy na bázi vysokomolekulámích látek, ať již ve formě vodorozpustných nosičů, micel, liposomů, polymerosomů či jiných nanosystémů, slibují účinnější a bezpečnější použití kancerostatik oproti současné klasické chemoterapii.
Léčiva, která obchází mnohačetnou lékovou rezistenci inhibicí funkce P-glykoproteinu (P-gp) blokovými kopolymery PPO s PEO (US 2013/0195964 (AI); Batrakova, E.V.; Kabanov, A.V., J. Control. Release 2008; 130: 988 až 106; Chen, L.; Sha, X.; Jiang, X.; Chen, Y.; Ren, Q.; Fang, X., Int. J. Nanomedicine 2013; 8: 73 až 84; Alakhova, D.Y.; Rapoport, N.Y.; Batrakova, E.V.; Timoshin, A.A.; Li, S.; Nicholls, D.; Alakhov, V.Y., Kabanov, A.V.; J. Control. Release 2010; 142(1): 89 až 100; Alakhova, D.Y.; Zhao, Y.; Li, S.; Kabanov, A.V., PLOS ONE, 2013; 8(8): c72238) a která současně používají tyto amfifilní kopolymery jako micelámí nosiče léčiva, mají hydrofobní léčivo zachyceno v hydrofobním jádře micely pouze hydrofobními interakcemi a
-2 CZ 308419 B6 k jeho uvolnění dochází kombinací difúze a rozpadu micely při snížení koncentrace kopolymeru v tělních tekutinách pod kritickou micelámí koncentraci (CMC). Nevýhodou systémů s nekovalentně inkorporovanými léčivy je neustálé uvolňování léčiva způsobené difúzí, a to i ve zdravých částech organismu, v průběhu transportu systému do cílové tkáně.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká blokového kopolymeru, jeho biodegradovatelného konjugátu s nízkomolekulámím léčivem a přípravků pro léčbu zejména nádorových onemocnění. Výsledná polymemí kancerostatika umožňují cílenou terapii zejména špatně léčitelných rezistentních nádorových onemocnění v humánní medicíně. Tato polymemí kancerostatika umožňují cílený účinek kancerostatik (zejména doxorubicinu) na pevné nádory při současném překonání vícečetné lékové rezistence (MDR) nádorů k chemoterapii. Vynález se týká amfifilního blokového kopolymeru, popřípadě jeho konjugátu s léčivem, který ve vodném prostředí vytváří polymemí micely, jejichž velikost a struktura se řídí hydrofilicitou a hydrofobicitou jednotlivých bloků, jejich délkou a poměrem hydrofilní a hydrofobní části molekuly. Polymemí micely, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, se skládají z hydrofilní obalové vrstvy, tvořené hydrofilním polymerem na bázi N-(2-hydroxypropylmethakryl)amidu (HPMA), a z hydrofobního jádra, tvořeného polymerem na bázi poly(propylenoxid)u (PPO). Případné léčivo jek polymeru vázáno pH-senzitivní kovalentní vazbou, což zamezuje samovolnému uvolňování léčiva v tělních tekutinách difúzí nebo při rozpadu micely při snížení koncentrace kopolymem pod kritickou micelámí koncentraci (CMC). Blokový kopolymer podle předkládaného vynálezu působí sám o sobě jako inhibitor P-glykoproteinu, lze jej proto využít i samostatně (bez konjugovaného léčiva) v kombinaci s nízkomolekulámími léčivy pro překonání vícečetné lékové rezistence nádorů k chemoterapii.
Předmětem předkládaného vynálezu je blokový kopolymer pro překonání lékové rezistence nádorů k chemoterapii, zahrnující alespoň jeden blok A a alespoň jeden blok B, ve kterém alespoň jeden blok A a alespoň jeden blok B jsou navzájem spojeny hydrolyticky nebo enzymaticky biodegradovatelnou spojkou L, kterou je oligopeptid o počtu aminokyselin od 2 do 5, navázaný k blokům A a B amidovou vazbou, přičemž bloky A a B jsou uspořádané v pořadí A-L-B nebo A-L-B-L-A nebo B-L-A-L-B, nebo podle obecného vzorce III,
L— B (III), a přičemž hydrofilní blok A je tvořen poly(A'-(2-hydroxypropyl)mcthakrylamidcm). popřípadě obsahujícím do 20 mol. % monomemích jednotek obecného vzorce I,
-3 CZ 308419 B6 (I), kde R je aminoacyl vybraný ze skupiny sestávající z glycylu, glycylglycylu, /Calanylu. 6aminohexanoylu, -/-aminobcnzoylu. acylů vycházejících z oligopeptidů o počtu aminokyselin od 2 do 5, zejména GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly a GlyPheLeuGly; navázaný aminoskupinou aminoacylu R ke karbonylové skupině monomemí jednotky obecného vzorce I, a/nebo do 15 mol. % monomemích jednotek obecného vzorce II,
CH<.
f 1 1 —|-C——
C™Q
T (Π), kde T je oligopeptid vybraný ze skupiny sestávající z oligopeptidů o počtu aminokyselin od 2 do 5, navázaný aminoskupinou oligopeptidů ke karbonylové skupině monomemí jednotky obecného vzorce II, s výhodou je oligopeptidem GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly, GlyPheLeuGly, AspProLys, AspProSer a AspProGly;
a hydrofobní blok B je tvořen polypropylenoxidem;
přičemž blok A má molekulovou hmotnost Mn v rozmezí od 4000 do 60 000 g/mol (což odpovídá 25 až 400 monomemím jednotkám), s výhodou je Mn v rozmezí od 5500 do 40 000 g/mol (37 až 260 monomemích jednotek), a blok B má molekulovou hmotnost Mn v rozmezí od 1000 do 17 600 g/mol (což odpovídá 23 až 400 monomemím jednotkám), s výhodou má molekulovou hmotnost 1500 až 12 000 g/mol (34 až 270 monomemích jednotek);
a přičemž molekulová hmotnost blokového kopolymem je v rozmezí od 5000 do 95 000 g/mol.
V dalším provedení je spojka L vybraná ze skupiny zahrnující oligopeptidy AspProLys, AspProLysProAsp, GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly, GlyLeuPheGly.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž polymemí konjugát, který obsahuje blokový kopolymer podle předkládaného vynálezu, a který dále obsahuje od 1 do 25 % hmota, nízkomolekulámího léčiva, kovalentně vázaného hydrazonovou vazbou hydrazidové skupiny monomemí jednotky obecného vzorce (I) s karbonylovou skupinou nízkomolekulámího léčiva a/nebo amidovou vazbou aminoskupiny nízkomolekulámího léčiva ke karboxylu skupiny T monomemí jednotky obecného vzorce (II) bloku A, přičemž léčivem je nízkomolekulámí cytostatikum vybrané ze skupiny obsahující doxombicin, docetaxel, paklitaxel, pirambicin, mitomycin C, daunorubicin, larotaxel. Nízkomolekulámím léčivem se rozumí léčivo, které má molekulovou hmotnost v rozmezí od 200 do 1000 g/mol.
Molekula nízkomolekulámího léčiva je k monomeru bloku A polymemího konjugátu vázána hydrolyticky štěpitelnou kovalentní vazbou, s výhodou hydrazonovou nebo peptidovou vazbou.
V jednom provedení je blokový kopolymer podle předkládaného vynálezu a/nebo polymemí konjugát podle předkládaného vynálezu ve formě micely. Velikost a struktura micel závisí na hydrofilicitě a hydrofobicitě bloků A a B a na jejich délce. Hydrofilní obalová vrstva micely je tvořena blokem A, s případně navázaným léčivem, a hydrofobní jádro je tvořeno blokem B.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž způsob přípravy blokového kopolymeru podle předkládaného vynálezu, s vyloučením přípravy látek obecného vzorce (III), který obsahuje následující kroky:
- krok radikálové polymerizace A-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, popřípadě s obsahem do 20 mol. % monomeru obecného vzorce I, kde R je aminoacyl vybraný ze skupiny sestávající z glycylu, glycylglycylu, /Lalanylu. 6-aminohexanoylu, 4-aminobenzoylu, acylů vycházejících z oligopeptidů o počtu aminokyselin od 2 do 5, zejména GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly a GlyPheLeuGly, chráněného na hydrazidových skupinách terc-butyloxykarbonylovými (Boc) skupinami, a/nebo popřípadě s obsahem do 15 mol. % monomeru obecného vzorce II, kde T je oligopeptid vybraný ze skupiny sestávající z oligopeptidů o počtu aminokyselin od 2 do 5, s výhodou je oligopeptidem GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly, GlyPheLeuGly, AspProLys, AspProSer a AspProGly;
při teplotě v rozmezí od 40 do 100 °C, s výhodou 50 až 80 °C, a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující DMSO, vodné pufry, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofuran, propanol, terc-butanol nebo jejich směsí, za iniciace iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující ABIK-TT a ABIK-N3, kde ABIK-TT je 2-[(Z)-[l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3-yl)butyl]azo]-2-methyl-5-oxo-5-(2thioxothiazolidin-3-yl)pentannitril a ABIK-N3 je A-(3-azidopropyl)-4-[(Z)-[4-(3azidopropylamino)-1 -kyano-1 -methyl-4-oxo-butyl]azo]-4-kyano-pentanamid, popřípadě za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou vybraného ze skupiny CTA-TT a CTA-N3, kde CTA-TT je [l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3-yl)butyl] benzenkarbodithioát a CTA-N3 je [4-(3-azidopropylamino)-l-kyano-l-methyl-4-oxo-butyl]benzenkarbodithioát, za vzniku hydrofilního bloku A jakožto semitelechelického hydrofilního polymemího bloku A;
- krok, ve kterém reaguje semitelechelický hydrofilní polymemí blok A z předchozího kroku se semitelechelickým hydrofobním polymemím blokem B obecného vzorce Y-PPO-Y, kde Y je NH2, oligopeptid o počtu aminokyselin od 2 do 5, sukcinimidylkarbonát nebo dibenzocyklooktinová skupina, za vzniku amfifilního blokového kopolymem podle předkládaného vynálezu, který se může, popřípadě dále podrobit odstranění chránících Boc skupin např. kyselinou trifluoroctovou, a lyofilizaci. Lyofilizace výsledného produktu umožňuje skladování amfifilního kopolymem bez rizika jeho dekompozice a okamžitou tvorbu micel po jeho rozpuštění. Typy reakcí, které se s výhodou použijí pro přípravu amfifilního blokového kopolymem podle předkládaného vynálezu, jsou polykondenzace (např. při použití komerčního NH2-PPO-NH2 nebo PPO-(oligopeptid)2), klik reakce (např. při použití koncových skupin dibenzylcyklooktinu, resp. azidu, u semitelechelických bloků A, resp. B), RAFT polymerizace (s využitím předem připraveného přenosového činidla, např. PPO-(CTA)2). Zatímco NH2-PPO-NH2 je komerčně dostupný, ostatní deriváty obecného vzorce Y-PPO-Y lze připravit aktivací koncových OH skupin komerčně dostupného PPO, která se provede reakcí s fosgenem, Nhydroxysukcinimidem a ΛΆ'-diisopropylcthylamincm. čímž se koncové skupiny převedou na sukcinimidylkarbonátové skupiny, které se mohou případně dále převést na dibenzocyklooktinové skupiny reakcí s DBCO-aminem a ΛΆ'-diisopropylcthylamincm. nebo které se mohou modifikovat trifluoracetátem oligopeptidů, s výhodou o počtu aminokyselin od 2 do 5, a ΛΆ'-diisopropylcthyliamincm.
-5 CZ 308419 B6
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž způsob přípravy polymemího konjugátu podle předkládaného vynálezu, s vyloučením přípravy látek obecného vzorce (III), který obsahuje následující kroky:
- krok radikálové polymerizace /V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, popřípadě s obsahem do 20 mol. % monomeru obecného vzorce I, kde R je aminoacyl vybraný ze skupiny sestávající z glycylu, glycylglycylu, /Lalanylu. 6-aminohexanoylu, 4-aminobenzoylu, acylů vycházejících z oligopeptidů o počtu aminokyselin od 2 do 5, zejména GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly a GlyPheLeuGly, chráněného na hydrazidových skupinách terc-butyloxykarbonylovými (Boc) skupinami, a/nebo popřípadě s obsahem do 15 mol. % monomeru obecného vzorce II, kde T je oligopeptid vybraný ze skupiny sestávající z oligopeptidů o počtu aminokyselin od 2 do 5, s výhodou je oligopeptidem GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly, GlyPheLeuGly, AspProLys, AspProSer a AspProGly; přičemž monomer obecného vzorce I a/nebo monomer obecného vzorce II může popřípadě obsahovat kovalentně navázánou molekulu nízkomolekulámího léčiva, s výhodou vybraného ze skupiny obsahující doxorubicin, docetaxel, paklitaxel, pirarubicin, mitomycin C, daunorubicin, larotaxel;
při teplotě v rozmezí od 40 do 100 °C, a výhodou 50 až 80 °C, a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující DMSO, vodné pufry, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofůran, propanol, terc-butanol a jejich směsí, za iniciace iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující ABIK-TT a ABIK-N3, kde ABIK-TT je 2-[(Z)-[l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3-yl)butyl]azo]-2-methyl-5-oxo-5-(2thioxothiazolidin-3-yl)pentannitril a ABIK-N3 je A-(3-azidopropyl)-4-[(Z)-[4-(3azidopropylamino)-1 -kyano-1 -methyl-4-oxo-butyl]azo]-4-kyano-pentanamid, popřípadě za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou vybraného ze skupiny CTA-TT a CTA-N3, kde CTA-TT je [l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3-yl)butyl] benzenkarbodithioát a CTA-N3 je [4-(3-azidopropylamino)-l-kyano-l-methyl-4-oxo-butyl]benzenkarbodithioát, za vzniku hydrofilního bloku A, popřípadě obsahujícího kovalentně navázané nízkomolekulámí léčivo, jakožto semitelechelického hydrofilního polymemího bloku A, popřípadě obsahujícího kovalentně navázané nízkomolekulámí léčivo;
- krok, ve kterém reaguje semitelechelický hydrofilní polymemí blok A, popřípadě obsahující kovalentně navázané nízkomolekulámí léčivo, z předchozího kroku se semitelechelickým hydrofobním polymemím blokem B obecného vzorce Y-PPO-Y, kde Y je -NH2, oligopeptid o počtu aminokyselin od 2 do 5, sukcinimidylkarbonát nebo dibenzocyklooktinová skupina, za vzniku amfifilního blokového kopolymem podle vynálezu nebo popřípadě, pokud hydrofilní blok A z předchozího kroku již obsahuje kovalentně navázané léčivo, za vzniku polymemího konjugátu podle vynálezu. Zatímco NH2-PPO-NH2 je komerčně dostupný, ostatní deriváty obecného vzorce Y-PPO-Y lze připravit aktivací koncových OH skupin komerčně dostupného PPO se provede reakcí s fosgenem, /V-hydroxysukcinimidem a Λ'.Λ'-diisopropylcthylamincm. čímž se koncové skupiny převedou na sukcinimidylkarbonátové skupiny, které se mohou případně dále převést na dibenzocyklooktinové skupiny reakcí s DBCO-aminem a N,Ndiisopropylethylaminem, nebo které se mohou modifikovat trifluoracetátem oligopeptidů, s výhodou o počtu aminokyselin od 2 do 5, a Λ'Ν-diisopropylcthylamincm.
- popřípadě krok odstranění chránících Boc skupin, kdy výsledný amfifilní blokový kopolymer nebo polymemí konjugát z předchozího kroku reaguje např. s kyselinou trifluoroctovou;
- popřípadě krok konjugace volných hydrazidových skupin a/nebo amidových skupin amfifilního blokového kopolymem, vzniklého v jednom z předchozích dvou kroků, s nízkomolekulámím léčivem v jeho volné formě nebo ve formě jeho soli s kyselinou, např. HC1, nebo derivátu, např. s kyselinou levulovou; přičemž nízkomolekulámím léčivem je léčivo, které má molekulovou hmotnost v rozmezí od 200 do 1000 g/mol, s výhodou je nízkomolekulámím léčivem doxombicin, docetaxel, paklitaxel, pirarubicin, mitomycin C, daunombicin, larotaxel;
- popřípadě krok lyofilizace výsledného produktu z předchozího kroku.
-6 CZ 308419 B6
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž farmaceutická kompozice pro léčbu pevných nádorů a/nebo lymfomu a/nebo leukémie, která obsahuje:
blokový kopolymer podle předkládaného vynálezu a nízkomolekulámí léčivo v jeho volné formě, které má molekulovou hmotnost v rozmezí od 200 do 1000 g/mol, s výhodou je léčivem nízkomolekulámí cytostatikum, nejvýhodněji je nízkomolekulámí cytostatikum vybrané ze skupiny obsahující doxombicin, docetaxel, paklitaxel, pirarubicin, mitomycin C, daunorubicin, larotaxel, v jeho volné formě; a/nebo polymemí konjugát podle předkládaného vynálezu;
přičemž farmaceutická kompozice dále obsahuje alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou přísadu, vybranou ze skupiny zahrnující antiadheziva, pojivá, potahovací látky, barviva, bobtnadla, ochucovadla, maziva, konzervanty, sladidla, sorbenty. S výhodou je blokový kopolymer a/nebo polymemí konjugát ve farmaceutické kompozici přítomen v lyofilizované formě, která umožní jeho rychlou rekonstituci do micelámí formy po rozpuštění ve vodném prostředí.
Předmětem předkládaného vynálezu je také blokový kopolymer podle předkládaného vynálezu pro použití jako adjuvans k léčivu pro inhibici vícečetné lékové rezistence nádorů k chemoterapii, s výhodou pro použití jako adjuvans k cytostatikům, výhodněji pro použití jako adjuvans k léčivu pro léčbu pevných nádorů a/nebo lymfomu a/nebo leukémie.
Předmětem předkládaného vynálezu je dále polymemí konjugát podle předkládaného vynálezu pro použití jako léčivo k léčbě pevných nádorů a/nebo lymfomu a/nebo leukémie.
Předmětem předkládaného vynálezu je také farmaceutická kompozice podle předkládaného vynálezu pro použití jako léčivo k léčbě pevných nádorů a/nebo lymfomu a/nebo leukémie.
Objasnění výkresů
Obr. 1: Ukázka distribuční křivky velikosti částic v závislosti na intenzitě rozptýleného světla.
Obr. 2: Uvolňování léčiva doxorubicinu z diblokového polymemího konjugátu s doxombicinem, připraveným v příkladu 21, při 37 °C v pufrech o pH 5,0 a 7,4.
Obr. 3: Závislost rychlosti uvolňování derivátu docetaxelu (Dtx-UEV) z roztoku micelámího polymemího konjugátu s navázaným Dtx-LEV podle příkladu 22 pomocí pH-labilní hydrazonové vazby ve fosfátových pufrech o pH 5,0 a pH 7,4 při 37 °C.
Obr. 4: Kalceinová zkouška u NB3/DOX linie: Míra inhibice P-gp zprostředkovaného efluxu různými koncentracemi diblokového polymeru PHPMA-PPO 20 (DB). Vyjádřeno jako procenta MFI kontroly, 10 μΜ CsA (cyklosporin A).
Obr. 5: Kalceinová zkouška u NB4/DOX linie: Míra inhibice P-gp zprostředkovaného efluxu různými koncentracemi diblokového polymeru PHPMA-PPO 20 (DB). Vyjádřeno jako procenta MFI kontroly, 10 pM CsA (cyklosporin A).
Obr. 6: Kalceinová zkouška u P388/MDR linie: Míra inhibice P-gp zprostředkovaného efluxu různými koncentracemi diblokového polymem PHPMA-PPO 20 (DB). Vyjádřeno jako procenta MFI kontroly, 10 pM CsA (cyklosporin A).
Obr. 7: Stoupající řada koncentrací doxombicinu při jednotné koncentraci diblokového prekurzom z příkladu 20 (DB; 62,5 pg/ml). V rámečcích jsou IC50 označeny příslušným symbolem dle křivky (čtverečky - DOX; kosočtverce - kopolymer na bázi PPO-PHPMA
-7 CZ 308419 B6 z příkladu 20). Provedeno na P388/MDR buněčné linii. Hodnoty jsou vyneseny jako procenta kontrol.
Obr. 8: Průměrný růst nádorů (a) a přežití (b) myší C57BL/6 s lymfomem EL4 po léčbě micelámím diblokovým konjugátem dle příkladu 21 (DB-DOX) nebo lineárním konjugátem s doxorubicinem (PHPMA-DOX) nebo volným doxorubicinem (jak je popsáno v tabulce 4). Velikost nádorů je udána jako objem V=a*b2/2, kde „a“ je delší průměr nádorového ložiska, „b“ je kratší průměr.
Obr. 9: Závislost množství DOX, akumulovaného v pevných nádorech EL4 T-buněčného lymfomu u myší, na čase po podání diblokového polymemího konjugátu s DOX dle příkladu 21 (DB-DOX). Jako kontrolní skupiny byl využit lineární konjugát na bázi PHPMA s DOX (PHPMA-DOX) a volné léčivo (DOX), dávka 10 mg Dox/ kg, volné léčivo 2x5 mg DOX/kg.
Obr. 10: Závislost množství DOX cirkulujícího v krevním oběhu myší s inokulovaným EL4 Tbuněčným lymfomem na čase po podání diblokového polymemího konjugátu s DOX dle příkladu 21 (DB-DOX). Jako kontrolní skupiny byl využit lineární konjugát na bázi PHPMA s DOX (PHPMA-DOX) a volné léčivo (DOX), dávka 10 mg Dox/ kg, volné léčivo 2x5 mg Dox/kg.
Obr. 11: Schéma micely tvořené diblokovým amfífílním kopolymerem typu A-L-B s kovalentně navázaným léčivem doxorubicinem (DOX).
Obr. 12: Schéma micely tvořené triblokovým amfífílním kopolymerem typu A-L-B-L-A s kovalentně navázaným léčivem doxorubicinem (DOX).
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Syntéza přenosového činidla PPO-(CTA)2 pro RAFT polymerizaci
PPO-(CTA)2
Polymemí přenosové činidlo PPO-(CTA)2 využitelné pro řízenou radikálovou polymerizaci bylo připraveno reakcí poly(propylenoxid)-bis-2-aminopropyletheru (NH2-PPO-NH2; M 4000 g/mol; 48,43 mg; 24,2 x 103 mmol -NH2) s 2,5násobným přebytkem komerčně dostupného sukcinimidového esteru 4-kyan-4-(fenylkarbonothioylthio)pentanové kyseliny (CTA-NHS; 22,8 mg; 60,5 x 103 mmol). NH2-PPO-NH2 byl rozpuštěn v 0,5 ml dichlormethanu (DCM) a tento roztok byl přidán k suspenzi CTA-NHS v 0,2 ml DCM. Reakční směs byla ponechána za míchání reagovat přes noc. Surový produkt byl přečištěn na silikagelu ve směsi rozpouštědel chloroform/ethylacetát (5/1) a chloroform/methanol (5/1). Rozpouštědlo bylo odpařeno a produkt byl sušen za vakua do konstantní hmotnosti. Produkt byl charakterizován pomocí TLC, HPLC a GPC. Výtěžek 46 mg (80 % hmota.). Funkcionalita koncových DTB skupin výsledného produktu byl 1,96. Pokud není dále uvedeno jinak, jedná se u všech výchozích monomerů a připravených polymerů vždy o racemické směsi.
Příklad 2: Syntéza semitelechelického statistického kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AHNHNH-Boc)-TT (hydrofilní blok A) roztokovou radikálovou kopolymerací
poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT
Semitelechelický statistický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT, obsahující koncové thiazolidin-2-thionové skupiny (TT) a chráněné hydrazidové skupiny (-NHNH-Boc) podél polymemího řetězce, byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací N-(2hydroxypropyljmethakrylamidu (HPMA) a methakryloyl-6-aminohexanoylhydrazidu chráněného na hydrazidových skupinách íerc-butyloxykarbonylovými skupinami (MA-AH-NHNH-Boc) v DMSO při 60 °C za iniciace iniciátorem ABIK-TT (2-[(Z)-[l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2thioxothiazolidin-3 -yljbutyl] azo] -2-methyl-5 -oxo-5 -(2-thioxothiazolidin-3 -yljpentannitril) (CZ 298945). Charakterizace výsledného kopolymeru: Mn (SEC) 12 400 g/mol; £> ~ 1,60; F(tt) 1,18; obsah (NHNH2) ~ 5,4 mol%; Rh ~ 4.4 nm.
Podle postupu v příkladu 2 byly analogicky připraveny další kopolymery poly(HPMA-co-MAAH-NHNH-Boc)-TT s různými molámími hmotnostmi Mn v intervalu od 4000 do 58 000 g/mol, přičemž index polydisperzity D byl ve všech případech v rozmezí 1,5 až 1,8. Funkcionalita koncových skupin TT byla v rozmezí 110 až 120 % (F(tt) = 1,10-1,20). Obsah -NHNH2 skupin podél řetězce (0,5 až 19,5 mol %). Viz tabulka 1.
Tabulka 1: Fyzikálně-chemická charakterizace semitelechelických statistických kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT připravených podle příkladu 2
Vzorek Mn (g/mol) D F(tt) NHNH2 skupin (mol%) Rh (nm)
2-1 12400 1,60 1,18 5,4 4,4
2-2 19800 1,65 0,96 0,5 4,4
2-3 4200 1,72 0,95 15,6 3,9
2-4 34500 1,79 0,94 10,6 4,5
2-5 57900 1,66 0,96 19,5 4,9
Příklad 3: Syntéza semitelechelického statistického kopolymeru poly(HPMA-co-MA-GFLGDOX)-TT (hydrofilní blok A) roztokovou radikálovou kopolymerací
Semitelechelický statistický kopolymer poly(HPMA-co-MA-GFLG-DOX)-TT byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a monomeru obsahujícího doxorubicin (Nmethacryloylglycyl-DL-phenylalanylleucylglycyl)doxorubicin (Ma-GFLG-DOX), který byl připraven reakcí ekvivantního množství /V-methakryloylglycyl-DL-fenylalanyl-L-leucylglycin 4nitrofenyl esteru (Ma-GFLG-ONp) s DOX.HC1 v DMF při 4 °C, v DMSO při 60 °C za iniciace iniciátorem ABIK-TT (2-[(Z)-[l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3-yl)butyl]azo]-2methyl-5-oxo-5-(2-thioxothiazolidin-3-yl)pentannitril). 220 mg (1,54 mmol) HPMA, 25 mg (0,025 mmol) MA-GFLG-DOX bylo rozpuštěno v 1,7 ml DMSO a tento roztok byl umístěn do polymerační ampule, ve které již bylo naváženo 84 mg (0,170 mmol) ABIK-TT (4 % hmota.). Roztok v ampuli byl 15 min probubláván dusíkem, ampule byla zatavena a umístěna do termostatu vyhřívaného na 60 °C. K rozpuštění iniciátoru došlo po 3 min při teplotě 60 °C. Po 6 h byla reakční směs vysrážena do 50 ml směsi aceton : diethylether 2:1. Kopolymer byl rozpuštěn ve 3 ml methanolu a opět vysrážen do 50 ml stejné srážecí směsi. Vysrážený kopolymer byl odfiltrován na fritě S4 a sušen do konstantní hmotnosti. Charakterizace kopolymeru poly(HPMAco-MA-GFLG-DOX)-TT: Mn (SEC) 13 200 g/mol; £> ~ 1,61; F(TT) 1,20; Obsah GFLG monomemích jednotek: 3 mol %; obsah (DOX) ~ 8,9 % hmota.; Rh ~ 4.4 nm. Podle postupu v příkladu 3 byly analogicky připraveny další kopolymery poly(HPMA-co-MA-GFLG-DOX)-TT s různými molámími hmotnostmi Mn v intervalu od 4500 do 59 500 g/mol, přičemž index polydisperzity D byl ve všech případech v rozmezí 1,5 až 1,8. Funkcionalita koncových skupin TT byla v rozmezí 110 až 125 % (F(tt) = 1,10-1,20). Obsah GFLG skupin podél řetězce (0,5 až 15 mol %). Viz tabulka 2.
Tabulka 2: Fyzikálně-chemická charakterizace semitelechelických statistických kopolymerů poly(HPMA-co-MA-GFLG-DOX)-TT připravených podle příkladu 3
Vzorek Mn (g/mol) D F(tt) GFLG mon .jednotka (mol%) Rh (nm)
3-1 13200 1,61 1,20 3,0 4,4
3-2 4500 1,63 0,96 5,6 3,8
3-3 16800 1,76 0,95 15,0 4,6
- 10CZ 308419 B6
3-4 39800 1,74 0,94 9,8 4,8
3-5 59500 1,61 0,96 0,5 5,2
Příklad 4: Syntéza semitelechelického statistického kopolymeru raft-poly(HPMA-co-MA-AHNHNH-Boc)-TT (hydrofilní blok A) pomocí řízené radikálové RAFT polymerizace
raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT
Semitelechelický statistický kopolymer raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT, obsahující koncové thiazolidin-2-thionové skupiny (TT) a chráněné hydrazidové skupiny (-NHNH-Boc) podél polymemího řetězce, byl připraven pomocí řízené radikálové RAFT polymerizace, kdy molámí poměr iniciátoru/přenašeče/komonomerů byl 1/2/150. Poměr komonomerů HPMA/MA-AH-NHNH-Boc byl 92/8 mol %. HPMA byl rozpuštěn v tercbutanolu (6,747 ml), MA-AH-NHNHBoc, iniciátor 2-[(Z)-[l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2thioxothiazolidin-3 -yljbutyl] azo] -2-methyl-5 -oxo-5 -(2-thioxothiazolidin-3 -yljpentannitril (ABIK-TT) a přenašeč [1-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3-yljbutyl] benzenkarbodithioát (CTA-TT) byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO; 1,687 ml). Tyto roztoky byly smíchány dohromady v polymerizační ampuli. Polymerizační směs byla probublávána 10 min argonem. Kopolymerizace probíhala při 70° C po dobu 16 h v zatavené ampuli. Produkt byl izolován srážením do směsi aceton/diethylether v poměru 1:1, zfiltrován a sušen do konstantní hmotnosti. Reaktivní ω-koncové dithiobenzoátové skupiny (DTB) byly odstraněny pomocí 2,2'-azobisisobutyronitrilu (AIBN). Charakterizace kopolymeru raftpoly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT: Mn (SEC) 8 400 g/mol; £> ~ 1,20; F(Tt) 0,98; obsah (NHNH2) ~ 5,9 mol %; konverze ~ 46 % (833 mg); Rh ~ 4,5 nm.
Podle postupu v příkladu 4 byly analogicky připraveny další kopolymery raft-poly(HPMA-coMA-AH-NHNH-Boc)-TT s různými molámími hmotnostmi Mn v intervalu od 4000 do 60 000 g/mol, přičemž index polydisperzity £> byl ve všech případech v rozmezí 1,1 až 1,2. Funkcionalita koncových skupin TT byla v rozmezí 90 až 99 % (F(tt) = 0,90 až 0,99). Obsah NHNH2 skupin podél řetězce (0,5 až 20,5 mol %). Viz tabulka 3.
Tabulka 3: Fyzikálně-chemická charakterizace semitelechelických statistických kopolymerů raftpoly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT připravených podle příkladu 4
Vzorek Mn (g/mol) D F(tt) NHNH2 skupin (mol%) Rh (nm)
4-1 8400 1,20 0,98 5,9 4,5
- 11 CZ 308419 B6
4-2 16200 1,15 0,96 12,3 4,9
4-3 38000 1,12 0,95 0,6 5,3
4-4 58900 1,19 0,94 6,8 5,6
4-5 4100 1,16 0,96 19,8 3,8
Příklad 5: Syntéza telechelického statistického kopolymeru raft-TT-poly(HPMA-co-MA-AHNHNH-Boc)-TT (hydrofilní blok A) pomocí řízené radikálové RAFT polymerizace
raft-TT-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT
Telechelický statistický kopolymer raft-TT-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT, obsahující koncové thiazolidin-2-thionové skupiny (TT) a chráněné hydrazidové skupiny (-NHNH-Boc) podél polymemího řetězce, byl připraven pomocí řízené radikálové RAFT polymerizace obdobně jako v příkladu 4. Pouze ω-koncové dithiobenzoátové skupiny (DTB) nebyly odstraněny pomocí AIBN, ale byly převedeny na TT následujícím způsobem. Byl připraven 15% roztok polymeru s ABIK-TT (10% hmota.) v DMSO. Roztok v ampuli byl probublán 10 minut argonem, zataven a ponechán 3 h při 80 °C. Produkt byl izolován srážením do směsi aceton/diethylether v poměru 1:1, zfiltrován a sušen do konstantní hmotnosti. Charakterizace: Mn (SEC) 8 500 g/mol; D = 1,19; F(td 1,7; obsah (NHNFF) = 5,9 mol %; Rh = 4,8 nm.
Podle postupu v příkladu 5 byly analogicky připraveny další kopolymery raft-TT-poly(HPMAco-MA-AH-NHNH-Boc)-TT s různými molámími hmotnostmi Mn v intervalu od 5000 do 59 000 g/mol. Viz tabulka 4.
Tabulka 4: Fyzikálně-chemická charakterizace telechelických statistických kopolymerů raft-TTpoly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT připravených podle příkladu 5
Vzorek Mn (g/mol) D F(tt) NHNH2 skupin (mol%) Rh (nm)
5-1 8500 1,19 1,70 5,9 4,8
5-2 5000 1,18 1,75 15,6 4,2
5-3 18200 1,16 1,76 0,9 5,0
5-4 35600 1,15 1,69 18,6 5,3
5-5 58600 1,16 1,67 9,8 5,6
Příklad 6: Příprava semitelechelického statistického kopolymeru raft-poly(HPMA-co-MA-AHNHNH-Boc)-N3 (hydrofilní blok A) pomocí RAFT polymerizace
- 12CZ 308419 B6
raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-N3
Semitelechelický statistický kopolymer raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-N3 s koncovými azidovými skupinami, byl připraven obdobným způsobem jako semitelechelický kopolymer raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT na bázi PHPMA v příkladu 4. Molámí poměr iniciátoru/přenašeče/komonomerů byl 1/2/180. Poměr komonomerů HPMA/MA-AHNHNH-Boc byl 92/8 mol %. HPMA byl rozpuštěn v íerc-butanolu (6,747 ml), MA-AH-NHNHBoc, iniciátor A-(3-azidopropyl)-4-[(Z)-[4-(3-azidopropylamino)-l-kyano-l-methyl-4-oxobutyl]azo]-4-kyano-pentanamid (ABIK-N3) a přenašeč [4-(3-azidopropylamino)-l-kyano-lmethyl-4-oxo-butyl]benzenkarbodithioát (CTA-N3) byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO; 1,687 ml). Tyto roztoky byly smíchány dohromady v polymerizační ampuli. Polymerizační směs byla probublávána 10 min argonem. Kopolymerizace probíhala při 70 0 C po dobu 16 h v zatavené ampuli. Produkt byl izolován srážením do směsi aceton/diethylether v poměru 1:1, zfiltrován a sušen do konstantní hmotnosti. Reaktivní ω-koncové dithiobenzoátové skupiny (DTB) byly odstraněny pomocí 2,2'-azobisisobutyronitrilu (AIBN). Charakterizace produktu: Ma (SEC) 9100 g/mol; £> ~ 1,21; F<n3) 0,99; obsah (NHNH2) ~ 5,4 mol%; konverze ~ 63% (750 mg); Rh ~ 4,5 nm.
Příklad 7: Příprava poly(propylenoxid)-tris(sukcinimidylkarbonát)u (PPO-TSC; hydrofobní blok B)
- 13 CZ 308419 B6
PPO-TSC
Poly(propylenoxid)-tris(sukcinimidylkarbonát) (PPO-TSC) byl připraven dle následujícího postupu: komerčně dostupný poly(propylenoxid)triol PPO(OH)3 (CAS 25791-96-2, Aldrich; M~5000 g/mol; 85 mg; 51 x 10-3 mmol -OH) byl nejprve dvakrát přesušen azeotropickou destilací ze sušeného destilovaného toluenu, poté byl rozpuštěn ve směsi toluen/DCM (0,637 ml/0,213 ml) a k roztoku PPO byl přidán 20% roztok fosgenu v toluenu (0,5 ml). Reakční směs byla ponechána reagovat přes noc. Ráno byl fosgen odpařen za vakua do sucha. Odparek byl rozpuštěn ve směsi rozpouštědel toluen/DCM (0,240 ml/0,120 ml), do směsi byl přidán pevný A-hydroxysukcinimid (58 mg; 0,504 mmol) a N,/V-diisopropylethylamin (DIEA; 0,02 ml; 0,117 x 10-3 mmol) a směs byla ponechána reagovat při laboratorní teplotě na třepačce do druhého dne. Rozpouštědlo bylo odpařeno a produkt byl sušen za vakua do konstantní hmotnosti. Produkt byl použit do další reakce (viz příklad 9) bez dalšího čištění.
Příklad 8: Příprava poly(propylenoxid)-bis(sukcinimidylkarbonát)u (PPO-BSC; hydrofobní blok B)
PPO-BSC
Při syntéze poly(propylenoxid)-bis(sukcinimidylkarbonát)u (PPO-BSC) byl jako výchozí polymer použit komerčně dostupný poly(propylenoxid) (HO-PPO-OH) s M ~ 4000 g/mol. Postup přípravy byl analogický jako v případě syntézy PPO-TSC (viz příklad 7). Postup v příkladu 8 byl analogicky použit pro aktivaci koncových OH skupin poly(propylenoxid)u s molámími hmotnostmi Ma 2000 až 17 000 g/mol.
Příklad 9: Příprava PPO-(DBCO)3 (hydrofobní blok B)
- 14CZ 308419 B6
PPO-(DBCO)3
Pro přípravu poly(propylenoxid)u s koncovými dibenzocyklooktinovými skupinami (PPO(DBCO)3) byl jako výchozí polymer použit PPO-TSC, připravený v příkladu 7, (85 mg; 51 x 10-3 mmol TSC) který byl rozpuštěn v DCM. Do roztoku polymeru byl přidán roztok DBCO-aminu (21,14 mg; 76,5 x 10-3 mmol NH2) v DCM spolu s DIEA (0,026 ml; 153 x 103 mmol). Reakční směs byla ponechána reagovat za stálého míchání přes víkend. Rozpouštědlo bylo odpařeno za vakua a výsledný produkt PPO-(DBCO)3 byl přečištěn kolonovou chromatografri (Sephadex LH20, methanol). Frakce se vzorkem byla odpařena za vakua a produkt byl sušen do konstantní hmotnosti. Výtěžek 81 % (80 mg). Obsah DBCO skupin byl 71 % (2,12 skupin na polymemí řetězec). Podle postupu v příkladu 9 byl analogicky modifikován i PPO-BSC, připravený v příkladu 8, na výsledný PPO-(DBCO)2.
Příklad 10: Příprava poly(propylenoxid)u modifikovaného tripeptidem Asp-Pro-Lys (PPO-(AspPro-Lys)2; hydrofobní blok B)
PPO-(Asp-Pro-Lys)2
PPO-(Asp-Pro-Lys)2 byl připraven modifikací PPO-BSC (příklad 8) tripeptidem Asp-Pro-Lys. Trifluoracetát tripeptidu Asp-Pro-Lys byl připraven syntézou peptidů na pevné fázi. PPO-BSC (50 mg; 0,05 mmol SC skupin) byl rozpuštěn v dimethylformamidu (DMF) a přidán k nadbytku tripeptidu Asp-Pro-Lys .TFA (34 mg; 0,1 mmol). Do reakční směsi byl ihned přidán přebytek DIEA (51 μΐ; 0,3 mmol). Reakční směs byla ponechána reagovat při laboratorní teplotě přes noc. Produkt byl triturován s etherem a dále čištěn na koloně LH20 v MeOH. Polymemí frakce byla
- 15 CZ 308419 B6 za vakua odpařena do sucha a produkt byl sušen do konstantní hmotnosti. Výtěžek 47 mg (70 %). Obdobně byly na PPO-BSC, případně PPO-TSC, navázány další biodegradovatelné spojky, např. Asp-Pro-Leu, Asp-Pro-Ser, GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly a GlyPheLeuGly.
Příklad 11: Syntéza diblokového amfifilního kopolymeru typu A-L-B ([raft-poly(HPMA-co-MAAH-NHNH-Boc)]-b-PPO-NH2)
NH
HN °=<
CH3
[raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)]-b-PPO-NH2
Při syntéze Boc-chráněného diblokového kopolymeru [raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNHBoc)]-PPO-NH2 jsme vycházeli z komerčně dostupného poly(propylenoxid)-bis-2aminopropyletheru (NH2-PPO-NH2; M ~ 4000 g/mol; 33,2 mg; 16,6 x 103 mmol -NH2), který byl rozpuštěn v 1 ml dimethylacetamidu (DMA). Rovněž semitelechelický kopolymer raftpoly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT, připravený v příkladu 4, (71 mg; 8,3 x 103 mmol, Mn ~ 7614, Ftt ~ 0,89) byl rozpuštěn v 1 ml DMA. Roztok kopolymeru raft-poly(HPMA-co-MAAH-NHNH-Boc)-TT byl pomalu za stálého míchání přidáván do roztoku NH2-PPO-NH2 a reakční směs byla ponechána reagovat za stálého míchání při laboratorní teplotě přes noc. Po cca 16 h reakce byla reakční směs naředěna methanolem (MeOH) a přečištěna kolonovou chromatografií přes Sephadex LH-20 v MeOH s detekcí RI a UV (230 nm) a TLC. Přečištěný produkt byl poté odpařen za vakua do konstantní hmotnosti. Výtěžek 80 mg (77 %). Charakterizace Boc-chráněného diblokového polymeru [raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNHBoc)]-PPO-NH2: M„ ~ 15 230 g/mol, Mn ~ 12 950 g/mol (v organické mobilní fázi 0, D ~ 1,18, Rh~ 14 nm (ve fyziologickém roztoku nebo PBS). Obdobným postupem byl připraven diblokový amfifilní kopolymer z polymeru příkladu 2.
Příklad 12: Syntéza diblokového amfifilního kopolymeru poly(HPMA-co-MA-GFLG-DOX)PPO-NH2 s léčivem vázaným přes enzymaticky štěpitelný oligopeptid
- 16CZ 308419 B6
poly(HPMA-co-MA-GFLG-DOX)-PPO-NH2
Při syntéze diblokového kopolymeru poly(HPMA-co-MA-GFLG-DOX)-PPO-NH2 jsme postupovali obdobným postupem jako v příkladu 11. Poly(propylenoxid)-bis-2aminopropyletheru (NH2-PPO-NH2; M ~ 4000 g/mol; 33,2 mg; 16,6 x 103 mmol -NH2) byl rozpuštěn v 1 ml dimethylacetamidu (DMA). Rovněž semitelechelický kopolymer poly(HPMAco-MA-GFLG-DOX)-TT z příkladu 3 (69 mg; 8,3 x 103 mmol) byl rozpuštěn v 1 ml DMA. Roztok kopolymeru poly(HPMA-co-MA-GFLG-DOX)-TT byl pomalu za stálého míchání přidáván do roztoku NH2-PPO-NH2 a reakční směs byla ponechána reagovat za stálého míchání při laboratorní teplotě přes noc. Po cca 16 h reakce byla reakční směs naředěna methanolem (MeOH) a přečištěna kolonovou chromatografri přes Sephadex LH-20 v MeOH s detekcí RI a UV (230 nm) a TLC. Přečištěný produkt byl poté odpařen za vakua do konstantní hmotnosti. Výtěžek 82 mg (78 %). Charakterizace diblokového polymeru poly(HPMA-co-MA-GFLGDOX)-PPO-NH2 : Mw ~ 20 230 g/mol, Mn ~ 14 950 g/mol (v organické mobilní fázi), R^- 15 nm (ve fýziologickém roztoku nebo PBS).
Příklad 13: Syntéza triblokového amfifilního kopolymeru [raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNHBoc)]2-PPO
[raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)]2-PPO
Triblokový amfifilní kopolymer typu A-L-B-L-A, kopolymer [raft-poly(HPMA-co-MA-AHNHNH-Boc)]2-PPO, byl připraven obdobným postupem jako jeho diblokový analog [raft
- 17CZ 308419 B6 poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)]-PPO-NH2 z příkladu 11, a to polykondenzací NH2-PPONH2 a semitelechelického kopolymeru raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT. NH2PPO-NH2 (M ~ 4000 g/mol; 28 mg; 14xl0’3 mmol -NH2) a raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNHBoc)-TT (115 mg; 14xl0-3 mmol, Mn ~ 8450, Ftt ~ 0,98) byly rozpuštěny odděleně v DMA (1,575 mL). Roztok NH2-PPO-NH2 byl pomalu za stálého intenzivního míchání přikapáván do roztoku semitelechelického kopolymeru raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT a reakční směs byla ponechána reagovat za stálého míchání při laboratorní teplotě. Po 24 h reakce byla reakční směs vysrážena do diethyletheru (47 ml). Jemná sraženina byla odstředěna a rozpouštědlo bylo dekantováno. Polymemí produkt byl sušen za vakua do konstantní hmotnosti. Výtěžek 120 mg (84 %). Charakterizace připraveného Boc-chráněného triblokového kopolymeru [raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)]2-PPO: Mw ~ 22 200 g/mol, Μ ~ 18 790 g/mol (v organické mobilní fázi), D ~ 1,18, Rh ~ 15 nm (ve fyziologickém roztoku nebo PBS). Obdobným postupem byl připraven triblokový amfifílní polymer s využitím semitelechelického polymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT.
Příklad 14: Syntéza triblokového amfifilního kopolymeru NH2-PPO-[raft-poly(HPMA-co-MAAH-NHNH-Boc)]-PPO-NH2
NH2-PPO-[raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)]-PPO-NH2
Triblokový amfifílní kopolymer typu B-L-A-L-B, tj. NH2-PPO-[raft-poly(HPMA-co-MA-AHNHNH-Boc)]-PPO-NH2, byl připraven analogicky jako triblok typu A-L-B-L-A polykondenzací NH2-PPO-NH2 a Boc-chráněného telechelického kopolymeru raft-TT-poly(HPMA-co-MA-AHNHNH-Boc)-TT v molámím poměru bloků polymerů NH2-PPO-NH2 : raft-TT-poly(HPMA-coMA-AH-NHNH-Boc)-TT) 2:1. Roztok Boc-chráněného telechelického kopolymeru raft-TTpoly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT byl pomalu za stálého míchání přidáván do roztoku PPO a reakční směs byla ponechána reagovat za stálého míchání při laboratorní teplotě přes noc. Druhý den byla reakční směs naředěna MeOH a přečištěna kolonovou chromatografri přes Sephadex LH-20 v MeOH s detekcí RI a UV (230 nm) a TLC. Přečištěný produkt byl poté odpařen za vakua do konstantní hmotnosti. Výtěžek 100 mg (74 % hmoto.). Charakterizace připraveného Boc-chráněného triblokového kopolymeru NH2-PPO-[raft-poly(HPMA-co-MAAH-NHNH-Boc)]-PPO-NH2: M„ ~ 15 200 g/mol, Mn ~ 13 390 g/mol (v organické mobilně fázi), D ~ 1,14, Rh ~ 16 nm (ve fyziologickém roztoku nebo PBS).
Příklad 15: Příprava blokového kopolymeru na bázi PPO-raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNHBocjs pomocí klik reakce
- 18 CZ 308419 B6
PPO-raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)3
Pro přípravu větveného blokového kopolymeru typu obecného vzorce III, kopolymeru PPO-raft5 poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)3, byl využit polymer PPO-(DBCO)3 (3,12 mg; 1,606 x
103 mmol DBCO skupin) a kopolymer HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-N3 (52 mg; Mn 27 000 g/mol; 1,926 x 10-3 mmol N3 skupin). Polymery byly rozpuštěny ve směsi rozpouštědel MeOH (80 %)/0,3M octanový pufr pH 6,5 (20 %) a ponechány reagovat přes noc při laboratorní teplotě za stálého míchání. Reakce byla sledována pomocí SEC. Produkt byl poté přečištěn kolonovou ίο chromatografií přes kolonku PD10 (Sephadex G25) ve vodě. Polymemí frakce byla zamražena a zlyofilizována. Charakterizace připraveného Boc-chráněného blokového kopolymem PPO-raftpoly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)3: Mw ~ 29 380 g/mol, Ma ~ 22 600 g/mol (v organické mobilně fázi), D ~ 1,30, Rh 19 nm (ve fyziologickém roztoku nebo PBS).
Příklad 16: Příprava triblokového kopolymem raft-(polyHPMA)2-PPO pomocí RAFT polymerizace s využitím polymemího přenosového činidla PPO-(CTA)2
- 19CZ 308419 B6
raft-(polyHPMA)2-PPO
Triblokový kopolymer typu A-L-B-L-A, kopolymer raft-(polyHPMA)2-PPO, byl připraven řízenou radikálovou RAFT polymerizací za použití PPO-(CTA)2, připraveného v příkladu 1, jako přenosového činidla. Molámí poměr iniciátoru/přenašeče/monomeru byl 1/2/150. HPMA (33,64 mg; 0,235 mmol) byl rozpuštěn v terc-butanolu (0,232 ml), PPO-(CTA)2 (10 mg; 4,35 x 103mmol) a AIBN (0,36 mg; 2,18 x 103mmol) byly rozpuštěny v DMSO (0,026 ml). Tyto roztoky byly smíchány dohromady v polymerizační ampuli. Polymerizační směs byla probublávána 10 min argonem a poté byla ampule zatavena. Kopolymerizace probíhala při 70 ° C po dobu 16 h. Produkt byl izolován vysrážením do směsi aceton/ether v poměru 3/1. Jemná sraženina byla zcentrifiigována, odfiltrována a za vakua sušena do konstantní hmotnosti. Reaktivní ω-koncové DTB skupiny byly odstraněny pomocí AIBN. Charakterizace: Ma (SEC) ~ 14 600 g/mol (v organické mobilně fázi), D ~ 1,13; konverze ~ 60 % (26 mg); Rh ~ 14,5 nm (ve fyziologickém roztoku nebo PBS).
Příklad 17: Příprava triblokového kopolymeru raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)2-PPO pomocí RAFT polymerizace s využitím polymemího přenosového činidla PPO-(CTA)2
raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNHBoc)2-PPO
Triblokový kopolymer raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNHBoc)2-PPO byl připraven obdobně jako triblokový kopolymer poly(HPMA)2-PPO v příkladu 16. Molámí poměr iniciátom/přenašeče/komonomerů byl 1/2/150. Poměr komonomerů HPMA/MA-AH-NHNH-Boc byl 90/10 mol %. Reaktivní ω-koncové DTB skupiny byly odstraněny pomocí AIBN. Charakterizace: Mn (SEC) = 8 750 g/mol (v organické mobilně fázi); D 1,56; konverze 50 % (8,3 mg); Rh 14,0 nm (ve fyziologickém roztoku nebo PBS).
Příklad 18: Příprava Boc-chráněného diblokového kopolymem obsahujícího ve své struktuře biodegradovatelné spojky Asp-Pro-Lys
-20CZ 308419 B6
Blokový kopolymer raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT a PPO-(Asp-Pro-Lys)2
Diblokový biodegradovatelný kopolymer byl připraven polykondenzací kopolymeru raftpoly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT a PPO-(Asp-Pro-Lys)2 obdobným způsobem jako diblokový amfifilní kopolymer [raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)]-PPO-NH2 (viz Příklad 11). Obdobným způsobem byly připraveny diblokové kopolymery obsahující další biodegradovatelné oligopeptidové spojky, vyjmenované v příkladu 10.
Příklad 19: Příprava triblokového biodegradovatelného kopolymeru typu A-L-B-L-A na bázi raftpoly(HPMA-co MA-AH-NHNH-Boc)-TT a PPO-(Asp-Pro-Lys)2
Blokový kopolymer raft-poly(HPMA-co MA-AH-NHNH-Boc)-TT a PPO-(Asp-Pro-Lys)2
Triblokový biodegradovatelný kopolymer na bázi raft-poly(HPMA-co MA-AH-NHNH-Boc)-TT a PPO-(Asp-Pro-Lys)2, obsahující mezi hydrofilním blokem A a hydrofobním blokem B hydrolyticky i enzymaticky biodegradovatelnou peptidovou sekvencí Asp-Pro-Lys, byl připraven obdobným způsobem jako triblokový amfifilní kopolymer [raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNHBoc)]2-PPO (viz příklad 13), tj. polykondenzací kopolymeru raft-poly(HPMA-co-MA-AHNHNH-Boc)-TT a polymeru PPO-(Asp-Pro-Lys)2. Obdobným způsobem byly připraveny triblokové kopolymery obsahující další biodegradovatelné oligopeptidové spojky, vyjmenované v příkladu 10.
Příklad 20: Odstranění chránící skupiny Boc na hydrazidových skupinách diblokového polymemího prekurzoru [raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)]-PPO-NH2
-21 CZ 308419 B6
NH
H2N
[raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2)]-PPO-NH2
Diblokový polymerní prekurzor [raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2)]-PPO-NH2 byl připraven z diblokového kopolymeru [raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)]-PPO-NH2 (50 mg), který obsahoval hydrazidové skupiny chráněné terc-butyloxykarbonylovou skupinou (Boc). Diblokový kopolymer [raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)]-PPO-NH2 byl rozpuštěn v 1,08 ml směsi trifluoroctové kyseliny (TFA) / triisopropylsilanu (TIS) / vody (95/2,5/2,5). Ihned po rozpuštění byla tato směs za vakua odpařena do sucha. Odparek byl poté rozpuštěn v borátovém pufru (pH 8,0; 200 μΐ) a pH roztoku bylo upraveno titrací nasyceným roztokem NaOH na pH 6,5 až 8,0. Surový produkt byl odsolen a přečištěn na kolonce PD10 (Sephadex G25) ve vodě a zlyofilizován. Výtěžek 40 mg (78 %). Chrakterizace: M„ = 16 200 g/mol, Mn = 13 500 g/mol (v organické mobilní fázi), Rh~ 14,5 nm (ve fyziologickém roztoku nebo PBS).
Stejným způsobem byly tyto chránící skupiny odstraněny i z polymemích prekurzorů připravených v příkladech 13ažl5al7ažl9.
Příklad 21: Příprava diblokového polymemího konjugátu s léčivem, navázaným hydrolyticky labilní hydrazonovou vazbou:
(A) Diblokový polymerní konjugát [raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHN-DOX)]-PPO-NH2 s hydrazonově navázaným doxombicinem
-22CZ 308419 B6
[raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHN-DOX)]-PPO-NH2
Diblokový polymemí prekurzor [raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2)]-PPO-NH2, připravený v příkladu 20, s volnými hydrazidovými skupinami (120 mg) byl rozpuštěn v MeOH (960 μΐ). Roztok polymeru byl přidán k pevnému doxorubicin hydrochloridu (DOX . HC1; 12,94 mg) a do suspenze bylo přidáno 38,4 μΐ koncentrované kyseliny octové. Reakční směs byla třepána na třepačce ve tmě při laboratorní teplotě přes noc. Reakce byla sledována pomocí TLC (CHCh/MeOH/kyselina octová ~ 8/2/1). Po 24 h reakce byla reakční směs naředěna MeOH a surový produkt byl přečištěn kolonovou chromatografií v MeOH přes Sephadex LH-20. Polymemí frakce byla za vakua odpařena do sucha a sušena do konstantní hmotnosti. Obsah navázaného doxorubicinu byl stanoven spektroskopicky (λ ~ 488 nm, voda, ε ~ 9800 1 x mol1 x cm1). Výtěžek byl 110,8 mg (83 %), obsah léčiva na polymeru 8,9 % hmota. Charakterizace: Mw = 18 300 g/mol, Mn = 14 100 g/mol (v organické mobilní fázi), Rh~ 14,2 nm (ve fýziologickém roztoku nebo PBS). Obdobným způsobem byl připraven diblokový polymemí konjugát s léčivem pirambicinem nebo daunombicinem, obsah léčiva na těchto konjugátech byl 9,9 % hmota, pirambicinu nebo 9,5 % hmota, daunombicinu. Charakterizace konjugátu s pirambicinem: Mw = 19 200 g/mol, Mn = 14 300 g/mol (v organické mobilní fázi), Rh ~ 14,4 nm (ve fýziologickém roztoku nebo PBS). Charakterizace konjugátu s daunombicinem: Mw = 18 800 g/mol, Mn = 14 500 g/mol (v organické mobilní fázi), R\t~ 13,9 nm (ve fýziologickém roztoku nebo PBS).
(B) Diblokový polymemí konjugát s hydrazonově navázaným derivátem docetaxelu
-23 CZ 308419 B6
[raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHN-Dtx)]-PPO-NH2
Docetaxel, derivatizovaný kyselinou levulovou (Dtx-LEV), byl připraven reakcí docetaxelu s kyselinou levulovou za přítomnosti diisopropylkarbodidimidu v DMSO. Diblokový polymerní prekurzor [raft-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2)]-PPO-NH2 připravený v příkladu 20 (191,5 mg) a derivát léčiva Dtx-LEV (22,9 mg) byly rozpuštěny v MeOH (172 μΐ) a do reakční směsi byla ihned přidána koncentrovaná kyselina octová (70 μΐ). Reakční směs byla míchána 2,5 h. Poté byla naředěna MeOH a produkt byl přečištěn kolonovou chromatografri v MeOH (Sephadex LH-20, MeOH; detekce UV-230 nm, RI], Frakce polymemího konjugátu s Dtx-LEV byla zachycena, odpařena za vakua do sucha a sušena do konstantní hmotnosti. Výtěžek byl 172 mg (80 %). Charakterizace: Mw = 17 500 g/mol, Mn = 13 600 g/mol (v organické mobilní fázi), Rh~ 14 nm (ve fýziologickém roztoku nebo PBS). Obsah derivátu Dtx-LEV, po kompletní kyselé hydrolýze (HC1 o pH ~ 2,0) a extrakci do chloroformu stanoven chromatograficky (HPLC), byl 9,0 % hmota.). Obdobným způsobem byl derivatizován také paklitaxel a larotaxel a posléze byla obě léčiva obdobným postupem popsaným výše navázána na polymerní nosič. Charakterizace konjugátu s paklitaxelem: Mw = 18 500 g/mol,Ma = 14 100 g/mol (v organické mobilní fázi), Rh~ 14,3 nm (ve fýziologickém roztoku nebo PBS). Obsah derivátu paklitaxel-LEV byl 9,6 % hmota.). Charakterizace konjugátu s larotaxelem: Mw = 17 800 g/mol, Mn = 14 200 g/mol (v organické mobilní fázi), Rh ~ 14,1 nm (ve fýziologickém roztoku nebo PBS). Obsah derivátu larotaxel-LEV byl 9,4 % hmota).
Po odstranění chránících Boc skupin podle příkladu 20 je možné obdobným postupem jako v příkladu 21 navázat výše uvedená léčiva i na polymerní prekurzory připravené v příkladech 13 až 15 a 17 až 19.
Příklad 22: Příprava lyofilizované formy polymemích konjugátů s léčivem
-24CZ 308419 B6
Blokové polymemí konjugáty s léčivy, připravené podle příkladu 21, a blokové polymemí prekurzory bez léčiv byly pomocí lyofilizace s přídavnými látkami převedeny na lyofilizovanou formu, která usnadňuje převedení pevné formy polymemího léčiva do roztoku i vznik nanočásticových micelámích struktur do 1 minuty od přídavku příslušného pufru nebo fýziologického roztoku. Diblokový polymemí konjugát s léčivem, připravený v příkladu 21 (100 mg; 8,7 % hmoto. DOX navázaných na polymeru), NaEhPCh x 2 H2O (2,40 mg), Na2HPC>4 x 2H2O (9,54 mg) a laktóza (332 mg) byly rozpuštěny v destilované vodě, roztok byl zamražen a zlyofilizován. Výsledný lyofilizát (100 mg původního polymemího konjugátu s léčivem) byl rozpuštěn v 17,2 ml vodného roztoku NaCl o koncentraci 9 g/1 (fyziologický roztok). Lyofílizační koláče polymemích prekurzorů a jejich konjugátů s léčivy byly rozpouštěny ve fýziologickém roztoku (0,9% NaCl), který byl před použitím přefiltrován přes membránu Whatman (PVDF) s velikostí pórů 0,20 pm.
Příklad 23: Příklad charakterizace polymemích prekurzorů a konjugátů
Připravené kopolymery, polymemí prekurzory i jejich konjugáty s léčivy byly charakterizovány stanovením váhového i početního průměru molámích hmotností (Mw, Mn) a příslušného indexu polydisperzity (D) pomocí rozměrově vylučovací chromatografie (SEC) na systému vybaveném UV detektorem (Shimadzu, Japan), RI detektorem (Optilab REX, Wyatt Technology Corp., USA) a víceúhlovým detektorem rozptylu světla (DAWN Heleos-II, Wyatt Technology Corp., USA). Některé systémy byly charakterizovány pomocí FFF systému (Eclipse 3+ modul) vybaveného DLS (DAWN 8+; Wyatt Technology Corp., USA), UV a RI (Optilab REX; Wyatt Technology Corp., USA) detekcí. Pro charakterizaci byla v případě SEC použita kolona TSK 3000 Super SW a jako mobilní fáze směs MeOH (80 %) a 0,3M octanového pufru o pH 6,5 (20 %), v případě FFF byla pro dělení použita membrána z regenerované celulózy (10 kDa) a jako mobilní fáze voda s NaN;. Koncentrace vzorků byla ve všech případech 3 mg/ml.
Obsah koncových -DTB, -DBCO, -TT skupin a hydrazidových skupin, zakopolymerovaných statisticky podél polymemího řetězce, byl stanoven spektrofotometricky. Všechna měření byla prováděna na UV-VIS spektrofotometm Specord 205 (Analytik Jena, Německo). Obsah -TT skupin byl stanoven podle literatury (Subr, V.; Koňák, C.; Laga, R.; Ulbrich, K. Biomacromolecules 2006, 7(1)'. 122 až 130) vmethanolu (8305 = 10 800 1 . mol1 . cm1). Obsah hydrazidových skupin (po deprotekci směsí TFA (95 %), triisopropylsilan (2,5 %) a voda (2,5 %)) byl stanoven dle metody popsané v Etrych, T.; Jelínková, M., Říhová, B. and Ulbrich, K., J. Control. Release 2001; 73'. 89 až 102 (8500 = 17 200 1 . molfcm1). Obsah koncových -DBCO nebo -DTB skupin byl stanoven spektrofotometricky v MeOH (-DTB: 8302 = 12 400 1 . mol1.cm1, -DBCO: 8302 = 13 000 1. mol1 .cm1).
Velikosti nanočástic, tvořených polymemí prekurzory a konjugáty s léčivy ve vodném prostředí, byly stanoveny dynamickým rozptylem světla (Nano-ZS Zetasizer, Malvem) a statickým rozptylem světla (ALV instrument, Německo) ve vodném roztoku pufm (PBS, pH 7,4). Statický rozptyl světla byl měřen v rozsahu 30 až 140° s krokem 10° při koncentracích 0,5 až 10 mg/ml a teplotách, 25 °C a 37 °C. Ukázka distribuční křivky velikosti částic je uvedena na obr. 1.
Příklad 24: Uvolňování léčiva (A) Polymemí konjugáty s doxorubicinem, připravené podle příkladu 21 A:
Množství doxorubicinu uvolněného z polymemích micel bylo stanoveno po inkubaci polymemích konjugátů s DOX při 37 °C ve fosfátovém pufm o pH 5,0 (0,1 M fosfátový pufir obsahujícím 0,05 M NaCl), modelujícím prostředí v endosomech a lysozomech nádorových buněk, a fosfátovém pufm o pH 7,4 (0,1 M fosfátový pufir obsahujícím 0,05 M NaCl), který modeluje prostředí krevního řečiště. V předem stanovených časových intervalech byla odebírána část inkubačního roztoku a množství uvolněného DOX bylo stanoveno pomocí SEC (Shimadzu, Japan; izokratický průtok 0,3 ml/min; mobilní fáze: MeOH (80 %) / 0,3M octanový pufir o pH 6,5
-25 CZ 308419 B6 (20 %)) na koloně TSK 3000 Super SW. Množství uvolněného DOX bylo vypočítáno z ploch píků volného a vázaného DOX, detekovaných při vlnové délce 488 nm. Zatímco při inkubaci polymemích micel v pH 5,0 docházelo k rychlému uvolňování DOX z nosiče (více než 70 % DOX uvolněno za 9 h inkubace), při inkubaci polymemích konjugátů ve fýziologickém prostředí (pH 7,4) k hydrolýze hydrazonové vazby téměř nedochází a léčivo je uvolňováno jen velmi zvolna (do 9 % za 24 h). Rychlost uvolňování léčiva DOX pro obě prostředí (pH 5,0 a pH 7,4) z námi připravených nanočásticových systémů je ukázána na obr. 2.
(B) Polymemí konjugáty s derivátem docetaxelu, připravené podle příkladu 21B:
Množství docetaxelu (Dtx) nebo jeho derivátů, uvolněných z polymemích konjugátů po jejich inkubaci ve fosfátovém pufru o pH 5,0 (0,1 M fosfátový pufir obsahujícím 0,05 M NaCl), modelujícím intracelulámí prostředí, a fosfátovém pufru pH 7,4 (0,1 M fosfátový pufir obsahujícím 0,05 M NaCl), modelujícím prostředí krevního řečiště, bylo stanoveno pomocí HPLC. V předem určených časových intervalech bylo odebíráno 200 μΐ inkubačního roztoku a po extrakci uvolněných léčiv a jejich derivátů do chloroformu bylo jejich množství stanoveno pomocí HPLC systému (Shimadzu HPLC systém vybavený kolonou s reverzní fází Chromolith Performance RP-18e (100 x 4,6 mm) a UV-VIS detektom Shimadzu SPD- lOAVvp (230 nm); eluent voda-acetonitril s gradientem 50 až 100 obj. % acetonitrilu, průtok 0,5 ml x min ’). Po inkubaci konjugátů (koncentrace 5 mg/ml) ve fýziologickém prostředí při 37 °C (fosfátový pufr, pH 7,4) se uvolňuje léčivo Dtx (či jeho deriváty) významně pomaleji (obr. 3) než v mírně kyselém prostředí při pH 5,0, modelujícím prostředí v endozomech a lysozomech nádorových buněk (obr. 3). Rozpad derivátu léčiva na volné léčivo nebo přímé odštěpení léčiva z polymemího konjugátu je předpokládáno účinkem enzymů, a to především karboxyesteráz.
Příklad 25: Rozpad micel na bázi PHPMA-PPO
Rozpad micel na bázi PHPMA-PPO na polymemí řetězce vyloučitelné z organismu je možný dvěma způsoby: i) po snížení koncentrace vzorku pod hodnotu kritické micelámí koncentrace (CMC), nebo ii) po rozpadu biodegradovatelných spojek mezi bloky kopolymem, popřípadě kombinací obou postupů. Kopolymer připravený podle příkladu 18 byl (po odstranění chránících Boc skupin podle příkladu 20) rozpuštěn v PBS pufru (0,15 mol.I1, pH 7,4) na micelámí roztok o koncentraci 2 mg/ml a následně ředěn. Velikost micel byla sledována metodou dynamického rozptylu světla (QELS). CMC byla stanovena pomocí izotermální kalorimetrie (ITC). CMC pro odchráněný diblokový kopolymer z příkladu 18 byla stanovena jako 0,01 až 0,02 mg/ml. Pod touto koncentrací se micely rozpadají na jednotlivé polymemí řetězce vyloučitelné z organismu. Enzymatické degradace odchráněného polymemího dibloku z příkladu 18 byly studovány v 0,1 M fosfátovém pufru (NafLPOýNaOH. pH = 6,0; 5 mM glutathion; 1 mM EDTA), obsahujícím lysosomální enzym katepsin B, tj. v prostředí modelujícím prostředí sekundárního lysosomu v nádorových buňkách při koncentraci substrátu 10 mg/ml. Odchráněný diblokový kopolymer z příkladu 18, byl rozpuštěn ve fosfátovém pufm v koncentraci 10 mg/ml a těsně před umístěním do termostatu (teplota 37 °C) byl přidán zásobní roztok katepsinu B tak, aby výsledná koncentrace katepsinu B byla 5.10-7 Μ. V předem určených intervalech byly z inkubačních roztoků odebírány alikvotní podíly (200 μΐ), které byly odsoleny na kolonách PD-10 a zlyofilizovány. Molekulová hmotnost degradačních produktů byla změřena stejným způsobem popsaným výše (příklad 23). Konjugát obsahující oligopeptidový spacer Asp-Pro-Lys, případně GFLG aj., byl v roztoku obsahujícím katepsin B (5.10 7 M) pozvolna degradován. Po 48h inkubaci s katepsinem B bylo stanoveno, že 40 % polymemích podílů je ve formě rozpustných podílů s molekulovou hmotností pod limitem renální filtrace. Zmíněný experiment potvrdil biodegradabilitu blokových polymemích konjugátů na degradační produkty vyloučitelné z organismu.
Příklad 26: In vitro cytotoxická aktivita diblokových a triblokových polymerů na bázi PHPMAPPO kopolymerů
-26CZ 308419 B6
Cytotoxická aktivita diblokových a triblokových polymemích prekurzorů na bázi PHPMA-PPO byla studována na několika nádorových liniích, především na neuroblastomových liniích NB3, NB4 a od nich odvozených linií rezistentních na DOX (NB3/DOX a NB4/DOX), dále na liniích T-buněčného lymfomu EL4, lymfomu P388 a od něj odvozené rezistentní linie P388/MDR. V in vitro pokusech byla stanovena viabilita buněk po 72h inkubaci s různými koncentracemi diblokového a triblokového polymemího prekurzoru metodou AlamarBlue. Bylo zjištěno, že ani koncentrace 500 pg/ml těchto polymemích systémů není pro buňky toxická, nezpůsobuje pokles jejich viability.
Příklad 27: In vitro biologická aktivita diblokových a triblokových polymerů na bázi PHPMAPPO jako inhibitorů P-gp
Schopnost diblokových a triblokových polymerů inhibovat transmembránové pumpy, jmenovitě P-gp, které jsou jednou z hlavních příčin lékové rezistence, byla prokázána pomocí kalceinové zkoušky. Experimenty byly provedeny na neuroblastomových liniích NB3, NB4 a od nich odvozených liniích rezistentních na doxombicin NB3/DOX a NB4/DOX a na lymfomové linii P388/MDR. U zmíněných buněčných linií bylo prokázáno, že léková rezistence je způsobena zvýšenou expresí P-gp.
V in vitro pokusech byly buňky inkubovány s různými koncentracemi diblokových a triblokových polymerů po různou dobu (0,5 h, 2 h a 6 h nebo 4 h, 8 h a 24 h) a poté k nim byl na 20 minut přidán Kalcein304, který jev buňkách rozštěpen na fluorescenčně aktivní Kalcein (excitace 485 nm / emise 530 nm). Kalcein je zároveň odstraňován z buněk se zvýšenou aktivitou P-gp. Míra schopnosti inhibice P-gp byla stanovena jako fluorescenční aktivita Kalceinu vztažená ke kontrole (lOmM Cyclosporin A - CsA, nízkomolekulámí inhibitor P-gp). Významná schopnost inhibice P-gp byla detekována u všech studovaných DOX rezistentních linií, a to NB3/DOX (obr. 4), NB4/DOX (obr. 5) a P388/MDR (obr. 6). V případě NB3/DOX a NB4/DOX linií byla nejvyšší míra inhibice P-gp zjištěna pro nejvyšší koncentrace 250 a 500 pg/ml a klesala se snižující se koncentrací použitých polymerů. U linie P388/MDR byla nejvyšší míra inhibice nalezena pro koncentrace 31 až 125 pg/ml. U parentálních linií NB3, NB4 a P388 nebyla detekována žádná směrodatná změna, což je v souladu s velmi nízkou expresí P-gp u těchto linií. Studované koncentrace v rozmezí 30 až 250 pg/ml polymerů jsou plně v souladu s předpokládanými koncentracemi polymemích systémů, použitých při léčbě solidních nádorů vykazujících vícečetnou lékovou rezistenci.
Příklad 28: In vitro biologická aktivita diblokových a triblokových konjugátů - ovlivnění cytotoxického účinku
Byl sledován vliv inhibice P-gp u buněk neuroblastomových linií pomocí diblokového kopolymeru poly(HPMA-co-MA-GFLG-DOX)-PPO-NH2 z příkladu 11 (DB) a triblokového kopolymeru připraveného v příkladu 19 (TB), s volnými hydrazidovými skupinami odstraněnými podle příkladu 20, na změnu IC50 léčiv: i) DOX; ii) polymemího doxombicinu PHPMA-DOX (lineární hydrazonový konjugát s DOX na bázi PHPMA); iii) diblokového polymemího konjugátu z příkladu 21 (DB-DOX). V in vitro pokusech byly buňky nejprve inkubovány Ih s/bez DB nebo TB v koncentracích 125 a 250 pg/ml a poté k nim byla přidána výše uvedená léčiva v koncentrační řadě. Po 72h inkubaci byla stanovena metabolická aktivita buněk metodou AlamarBlue a z ní určena IC50 jednotlivých léčiv. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5.
Tabulka 5: Zvýšení cytotoxicity léčiv: doxombicinu (DOX), lineárního hydrazonového konjugátu s DOX na bázi PHPMA (PHPMA-DOX) a diblokového konjugátu z příkladu 21 (DB-DOX) způsobené zablokováním transmembránových pump P-gp u neuroblastomových linií rezistentních na doxombicin: NB3/DOX aNB4/DOX, měřené metodou AlamarBlue. V tabulce 5 jsou uvedeny hodnoty IC50, t.j. koncentrace v pg/ml, při které dochází ke snížení viability u poloviny testovaných buněk.
-27CZ 308419 B6
IC50 po 72h inkubaci NB3/DOX NB4/DOX
DOX 0,215 ±0,004 2,61 ±0,17
DOX + DB (125ug/ml) 0,025 ±0,010 0,49 ±0,01
DOX + DB (250ug/ml) 0,020 ±0,001 0,42 ± 0,03
IC50 po 72h inkubaci NB3/DOX
DOX 0,168 ±0,005
DOX + TB (125ug/ml) 0,036 ±0,009
DOX + TB (250ug/ml) 0,032 ± 0,003
ICso po 7211 inkubaci NB3/DOX NB4/DOX
PHPMA-DOX 2,596 ±0,132 35,00 ±2,79
PHPMA-DOX ± DB (125ug/ml) 0,381 ±0,001 6,99 ±0,14
PHPMA-DOX ± DB (250ug/ml) 0,340 ± 0,006 5,60 ± 0,32
IC50 po 72h inkubaci NB3/DOX
PHPMA-DOX 3,338 ±0,110
PHPMA-DOX ± TB (125ug/ml) 1,028 ±0,010
PHPMA-DOX ± TB (250ug/ml) 0,521 ±0,006
IC50 po 72h inkubaci NB3/DOX NB4/DOX
DB-DOX 0,919 ±0,020 7,07 ±0,11
DB-DOX ± DB (125ug/ml) 0,181 ±0,019 4,60 ± 0,32
DB-DOX ± DB (250ug/ml) 0,152 ±0,007 3,92 ±0,13
Z tabulky 5 vyplývá, že jak koncentrace DB (kopolymer z příkladu 20), tak TB (kopolymer z příkladu 19 s volnými hydrazidovými skupinami) 250 pg/ml, tak již téměř 125 pg/ml, zajistila zvýšení cytotoxicity, tj. snížení hodnoty IC50, polymemího konjugátu PHPMA-DOX a volného DOX o jeden řád. Mírně vyšší efekt byl pozorován u DB než u TB. Pro DB byl pozorován vyšší efekt na nádorové rezistentní linii NB3/DOX, která exprimuje vyšší množství transmembránové P-gp pumpy. Z výše zmíněného je možné usuzovat, že inhibiční efekt DB a TB na rezistentní nádorové buňky bude tím vyšší, čím vyšší je hladina P-gp transmembránových pump. Samotný diblokový polymemí konjugát z příkladu 21 (DB-DOX) vykazuje 3 až 5krát vyšší cytotoxicitu u obou rezistentních neuroblastomových linií než PHPMA-DOX, tedy lineární hydrazonový konjugát s DOX (koncentrace DB nosiče při IC50 je přibližně 10 pg/ml). Přidání DB kopolymeru z příkladu 20 ke konjugátu DB-DOX z příkladu 21 zvýšilo cytotoxicitu DB-DOX (konjugát z příkladu 21) méně než v případě PHPMA-DOX nebo volného DOX. Efekt DB (kopolymer z příkladu 20) je patrný již při biologické aktivitě in vitro samotného DB-DOX (konjugát z příkladu 21) a přidání samotného DB nosiče (kopolymer z příkladu 20) již má jen doplňující efekt.
Tabulka 6 (viz níže) znázorňuje efekt stoupající řady koncentrace diblokového prekurzoru z příkladu 20 (DB) na cytostatický efekt volného (nízkomolekulámího) doxorubicinu při testování na rezistentní linii P388/MDR, detekce proliferace pomocí inkorporace thymidinu. Koncentrace dibloku PHPMA-PPO z příkladu 20 (DB) byly odvozeny na základě kalceinové zkoušky popsané výše. Nejúčinnější koncentrace 62,5 pg/ml a 31,25 pg/ml inhibují růst buněk (zvyšují cytostatickou aktivitu doxorubicinu) 3,6krát (viz obrázek 30) a 2,7krát. Polymemí konjugát z příkladu 21 (DB-DOX) vykázal při srovnání IC50 s lineárním konjugátem s DOX vázaným hydrazonovou vazbou přibližně 1 Okřát vyšší cytostatický efekt.
-28 CZ 308419 B6
Bylo prokázáno, že diblokový polymer DB na bázi PHPMA-PPO (kopolymer z příkladu 20) je schopný u vybraných rezistentních nádorových linií zvyšovat cytotoxický efekt, a to až o jeden řád. Tento efekt se prokázal jak pro jiná polymemí dlouho cirkulující léčiva (např. PHPMADOX), tak pro klasické nízkomolekulámí léčivo DOX. Samotný polymemí konjugát s léčivem na bázi blokových kopolymerů PHPMA-PPO z příkladu 21 (DB-DOX) vykazuje významně vyšší cytostatický účinek na rezistentní nádorové linie než obdobné polymemí systémy na bázi PHPMA.
Tabulka 6: Vliv zvyšující se koncentrace přídavku diblokového polymem na bázi PHPMA-PPO z příkladu 20 (DB) na cytostatický efekt nízkomolekulámího léčiva DOX při in vitro testování na linii P388/-MDR
Koncentrace DB (pg/ml) IC50 DOX+DB (pg/ml)
0 (DOX) 4,3
7,8 2,9
15,6 2,2
31,25 1,6
62,5 1,2
125 1,7
250 1,3
Příklad 29. Ukázka cytostatické aktivity micelámího diblokového konjugátu s doxombicinem z příkladu 21 (DB-DOX) in vitro při působení na buňky nádorových linií
Na prokázání cytostatické aktivity micelámího diblokového polymemího konjugátu nesoucího doxombicin z příkladu 21 (DB-DOX) byly použity buňky několika stabilních nádorových linií různého původu. Byly to myší nádorové linie (CT26 - linie karcinomu střeva, 4T1 - linie karcinomu mléčné žlázy, obě původem z inbredního kmene myší BALB/c, dále EL4.IL-2 - linie T-buněčného lymfomu původem z myšího inbredního kmene C57BL/6) a FaDu - lidská linie dlaždicobuněčného karcinomu hlavy a krku. Buňky byly kultivovány v 96-ti jamkových kultivačních destičkách s různými koncentracemi DB-DOX po dobu 72 hodin. Proliferace buněk byla pak stanovena standardní metodou inkorporace 3H-thymidinu, který byl přidán na posledních 6 hodin kultivace. Následně byly kultury zpracovány pomocí harvestom Tomtec Mach III, a po usušení byla radioaktivita získaných vzorků změřena beta-scintilačním počítačem Microbeta Trilux (Wallac) s použitím pevného scintilátom (Meltilex; Perkin Elmer). Výsledky testu jsou vyjádřeny jako hodnota IC50, rovná koncentraci DB-DOX (udává se pomocí obsahu doxombicinu v konjugátu), která je potřebná k indukci právě 50% inhibice růstu (proliferace) daných nádorových buněk (viz tabulka 7). Cytostatická aktivita DB-Dox byla porovnávána s aktivitou jiného micelámího konjugátu na bázi HPMA s doxombicinem, dále s aktivitou lineárního HPMA kopolymeru s doxombicinem, a s volným léčivem.
Tabulka 7: Cytostatická účinnost DB-DOX z příkladu 21, dalších konjugátu na bázi HPMA a volného doxombicinu u čtyř vybraných nádorových linií. Aktivita konjugátů byla stanovena pomocí inkorporace 3H-thymidinu po 72 hodinách kultivace buněk s různými koncentracemi léčiv. Hodnoty IC50 jsou uvedeny v ng doxombicinu/ml a byly vypočteny jako průměr z několika nezávislých stanovení.
CT26 4TI EL4.1L-2 FaDu
DB-DOX (konjugát 21) 108,7 56,3 104,6 28,8
micelámí konjugát 117,6 56,1 125,4 31,7
lineární konjugát 232,3 101,6 195,1 63
doxombicin 42,5 14,3 12,2 4,8
-29CZ 308419 B6
U všech testovaných linií, a to citlivých vůči doxorubicinu (FaDu) nebo málo citlivých (CT26) je patrné, že cytostatická aktivita DB-DOX (konjugát dle příkladu 21) je stejná nebo dokonce mírně vyšší než aktivita jiného typu micelámího konjugátu na bázi HPMA. Lineární konjugát s doxorubicinem (PHPMA-DOX) vykazoval u všech linií aktivitu podstatně nižší než DB-DOX (konjugát dle příkladu 21). U linie s vysokou mírou přirozené rezistence proti cytostatiku (CT26) se cytostatický efekt doxorubicinu snížil navázáním léčiva na diblokový nosič (konjugát dle příkladu 21) pouze 2,6krát, zatímco u linií citlivějších na léčivo 6 až 8,6krát (EL4.IL-2 a FaDu) (viz tabulka 7). V celé škále použitých koncentrací bylo přitom množství diblokového polymemího systému nižší, než jsou koncentrace prokazatelně fungující při blokádě ABC transportérů viz výše. Diblokový micelámí konjugát s doxorubicinem (konjugát z příkladu 21) vykazuje významnou cytostatickou aktivitu proti nádorovým liniím různého původu in vitro.
Příklad 30: In vivo biologická aktivita micelámího diblokového konjugátu s doxombicinem z příkladu 21 (DB-DOX) při léčbě myšího T-buněčného lymfomu EL4
In vivo protinádorový efekt micelámího diblokového polymemího konjugátu z příkladu 21 nesoucího doxorubicin (DB-DOX) byl studován na modelu myšího T-buněčného lymfomu EL4 u inbredního kmene myší C57BL/6. Konjugát byl myším podán intravenózně (i.v.) ve formě jednorázové dávky ekvivalentní 7,5 mg doxombicinu/kg. Léčivo bylo injikováno 8 dní po s.c. podání 1 x 105 nádorových buněk EL4, tedy v době, kdy už jsou nádory vyvinuty a velikost nádorového ložiska je zhmba 6 až 8 mm v průměru. Pro srovnání terapeutického účinku diblokového kopolymem z příkladu 21 (DB-DOX) jsme podali lineární HPMA kopolymer s doxombicinem (PHPMA-DOX) ve stejné dávce. Jak diblokový micelámí konjugát z příkladu 21 (DB-DOX), tak lineární konjugát (PHPMA-DOX) nesly doxombicin navázaný hydrazonovou vazbou. Dále byl k léčbě použit volný doxombicin (DOX), injikovaný v celkové dávce 10 mg/kg, která byla z důvodu rozdílné farmakokinetiky nízkomolekulámího léčiva, a s tím souvisejícího nebezpečí vysoké systémové toxicity, injikována ve dvou dílčích i.v. dávkách 8. a 12. den po transplantaci nádorových buněk (každá dávka 5 mg doxorubicinu).
Myši ve skupině léčené diblokovým konjugátem z příkladu 21 (DB-DOX) vykázaly ve srovnání s neléčenými kontrolami stagnaci růstu nádorů do tří dnů a významnou redukci růstu mezi třetím a šestým dnem po aplikaci léčiva. Podobnou stagnaci růstu nádorů vykázala i skupina léčená lineárním konjugátem (PHPMA-DOX), do šesti dnů zde došlo ke zmenšení nádorů, které ale bylo méně výrazné ve srovnání se skupinou léčenou DB-DOX (konjugát z příkladu 21). Naproti tomu ve skupině léčené volným doxombicinem (DOX) byl průměrný růst nádorů sice pomalejší než u neléčených myší, ale vykazoval stabilní progresi. Už 8 dní po podání léčby se ve skupině léčené DB-DOX objevila první myš s úplnou regresí nádoru, 13 dní po podání léčby byly bez zjevného nádoru v místě podání 4 myši ve skupině (z celkových 8), zatímco u dalších myší nádory postupně rostly, ovšem jejich velikost byla vždy významně menší než u neléčených kontrol v téže době. K znovuobjevení malého nádorového ložiska v původní lokalizaci došlo u jedné ze 4 myší, u níž byla předtím pozorována úplná regrese nádom, a to velmi pozdě (po 40. dnu pokusu, tedy za 32 dní po podání léčby). Neléčené myši mají přitom průměrné přežití 29 dní (SD 2,0 dny, střední doba přežití 29 dní). Diblokový konjugát DB-DOX (konjugát z příkladu 21) tedy nakonec indukoval úplné vyléčení u 3 z 8 jedinců (37,5 %) s tím, že přežití ostatních myší bylo významně prodlouženo ve srovnání s neléčenými kontrolami (viz tabulka 4). Prodloužení přežití ve skupině léčené DB-DOX (konjugát z příkladu 21) je statistický významné, medián přežití je 47,5 dne proti 29 dnům ve skupině neléčených myší. Lineární konjugát s doxorubicinem (PHPMA-DOX) vyléčil pouze 1 myš (12,5 %), zatímco volný doxorubicin (DOX) nevyléčil žádnou. Průměrný růst nádorů je uveden na obr. 8a, přežití myší po léčbě v tabulce 8 a na obr. 8b.
Tabulka 8: Přežívání C57B/6 myší s inokulovaným myším lymfomem EL4, léčených micelámím diblokovým konjugátem DB-Dox dle příkladu 21 po i.v. podání jedné dávky 7,5 mg/kg, nebo lineárním konjugátem s doxorubicinem (PHPMA-DOX) ve stejné dávce, nebo volným doxorubicinem (DOX) podaným ve dvou dávkách (2x5 mg/kg). Dny znamenají dobu úhynu
-30CZ 308419 B6 zvířat po podání nádorových buněk (IxlO5 buněk EL4 s.c. v den 0), LTS („long term survivor“) znamená myši dlouhodobě přežívající bez známek nádoru (nejméně do dne 70 po podání nádorových buněk). Poslední řádek obsahuje údaj o střední době (medián) přežití ve skupinách.
DB-DOX Lineární konjugát doxorubicin Neléčené kontrolv
1x7,5 mg DOX ekv./kg 1x7,5 mg DOX ekv./kg 2x5 mg DOX/kg 0 mg DOX/kg
37 30 35 27
39 34 38 27
42 35 39 27
42 37 42 28
60 42 53 30
LTS 44 53 30
LTS 45 — 31
LTS LTS — 32
47,5 39,5 40,5 29
Podání DB-DOX (konjugát dle příkladu 21) neindukovalo u léčených myší žádné pozorovatelné známky systémové toxicity (např. snížení tělesné váhy, naježenou srst, nahrbené postavení, poruchy příjmu potravy). Bez rizika systémové toxicity lze podávat i vyšší dávku tohoto léčiva. Důležitým rysem léčby diblokovým konjugátem dle příkladu 21 (DB-DOX) je ustavení rezistence proti nádoru, která je nádorově specifická, dlouhodobá a je zprostředkována imunitními protinádorovými mechanismy. Byla prokázána retransplantací vyléčených myší (LTS) stejnou dávkou živých nádorových buněk EL4, jaká byla použita pro indukci onemocnění, ale při ponechání těchto myší bez jakékoli léčby. Rezistentní jedinci po této retransplantací nevyvinuli žádný nádor a dlouhodobě přežívají. Myši vyléčené v popsaném pokusu (LTS) byly retransplantovány až 119 dnů po podání prvního nádoru, a z těchto tří myší dvě byly rezistentní. Micelámí konjugát dle příkladu 21 (DB-DOX) prokázal vysokou aktivitu jako transportní systém pro cytotoxické léčivo (doxorubicin) při léčbě experimentálního myšího lymfomu.
Příklad 31: Akumulace léčiva v pevných nádorech a doba cirkulace v krevním oběhu
Akumulace léčiva v pevném nádoru a doba jeho cirkulace v krvi byla stanovena na myších s inokulovaným T-buněčným lymfomem EL4. V předem stanovených časových intervalech byla myším odebírána krev a rovněž vzorky nádorů. Tyto vzorky byly zhomogenizovány a následně analyzovány na obsah léčiva. Obsah léčiva byl stanoven po kyselé hydrolýze v 1M HC1 při 50 °C, kdy dochází k rozpadu DOX na aglykon, který je následně vytřepán do organického rozpouštědla nemísitelného s vodou a stanoven na HPLC (Shimadzu HPLC systém vybavený kolonou s reverzní fází Chromolith Performance RP-18e (100 * 4,6 mm) a UV-VIS detektorem Shimadzu SPD-lOAVvp (230 nm); eluent voda-acetonitril s gradientem 50 až 100 obj.% acetonitrilu, průtok 0,5 mi min1).
Po podání diblokového konjugátu na bázi PHPMA-PPO s DOX navázaným hydrazonovou vazbou (DB-DOX, tj. konjugát dle příkladu 21) bylo stanoveno 4krát vyšší množství léčiva v nádorové tkáni než u lineárního PHPMA konjugátu (PHPMA-DOX), viz obr. 9. Rovněž bylo zjištěno, že akumulace v nádorové tkáni je více jak 20tinásobná v porovnání s akumulací léčiva po podání volného léčiva v maximální tolerované dávce. Také při stanovení doby cirkulace v krevním oběhu bylo zjištěno, že léčivo navázané na diblokový PHPMA-PPO polymemí systém (konjugát dle příkladu 21) cirkuluje v krevním oběhu významně déle, než v případě lineárního PHPMA konjugátu (PHPMA-DOX) a volného léčiva (DOX) (viz obr. 10). Oba experimenty prokázaly schopnost blokových kopolymerů na bázi PHPMA-PPO být vysoce účinnými dopravními systémy pro léčiva s významně lepšími farmakokinetickými parametry.

Claims (11)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Blokový kopolymer, obsahující alespoň jeden blok A a alespoň jeden blok B, kde alespoň jeden blok A a alespoň jeden blok B jsou navzájem spojeny hydrolyticky nebo enzymaticky biodegradovatelnou spojkou L, kterou je oligopeptid o počtu aminokyselin od 2 do 5, navázaný k blokům A a B amidovou vazbou, přičemž bloky A a B jsou uspořádané v pořadí A-L-B nebo A-L-B-L-A nebo B-L-A-L-B, nebo podle obecného vzorce III, (III), a přičemž hydrofilní blok A je tvořen poly(N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidem), popřípadě obsahujícím do 20 mol. % monomemích jednotek obecného vzorce I
    CH
    A.
    NH Η·.,Ν (I), z glycylu, glycylglycylu, /Lalanylu. 6kde R je aminoacyl ze skupiny sestávající aminohexanoylu, 4-aminobenzoylu, acylů vycházejících z oligopeptidů o počtu aminokyselin od 2 do 5, zejména GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly a GlyPheLeuGly; navázaný aminoskupinou aminoacylu R ke karbonylové skupině monomemí jednotky obecného vzorce I, a/nebo do 15 mol. % monomemích jednotek obecného vzorce II
    CH.
    r 1 1 —ýC—CHŽ-|
    C^Q
    I
    T (II), kde T je oligopeptid vybraný ze skupiny sestávající z oligopeptidů o počtu aminokyselin od 2 do 5, navázaný aminoskupinou oligopeptidů ke karbonylové skupině monomemí jednotky obecného vzorce II, s výhodou je oligopeptidem GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly, GlyPheLeuGly, AspProLys, AspProSer a AspProGly;
    -32CZ 308419 B6 a hydrofobní blok B je tvořen polypropylenoxidem;
    přičemž blok A má molekulovou hmotnost Mn od 4000 do 60 000 g/mol, a blok B má molekulovou hmotnost Mn od 1000 do 17 600 g/mol;
    a přičemž molekulová hmotnost blokového kopolymeru je v rozmezí od 5000 do 95 000 g/mol.
  2. 2. Blokový kopolymer podle nároku 1, kde spojka L je vybraná ze skupiny zahrnující oligopeptidy AspProLys, AspProLysProAsp, GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly, GlyLeuPheGly.
  3. 3. Polymemí konjugát, který obsahuje blokový kopolymer podle nároku 1 nebo 2, který dále obsahuje od 1 do 25 % hmota, nízkomolekulámího léčiva, kovalentně vázaného hydrazonovou vazbou hydrazidové skupiny monomemí jednotky obecného vzorce (I) s karbonylovou skupinou nízkomolekulámího léčiva a/nebo amidovou vazbou aminoskupiny nízkomolekulámího léčiva ke karboxylu skupiny T monomemí jednotky obecného vzorce (II) bloku A, přičemž léčivem je nízkomolekulámí cytostatikum vybrané ze skupiny obsahující doxorubicin, docetaxel, paklitaxel, pirambicin, mitomycin C, daunorubicin, larotaxel.
  4. 4. Použití blokového kopolymem podle kteréhokoliv z nároků 1 a 2 k tvorbě micel ve vodném prostředí.
  5. 5. Použití polymemího konjugátu podle nároku 3 k tvorbě micel ve vodném prostředí.
  6. 6. Způsob přípravy blokového kopolymem podle nároku 1 nebo 2, s vyloučením přípravy látek obecného vzorce (III), vyznačený tím, že obsahuje následující kroky:
    - krok radikálové polymerizace A-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, popřípadě s obsahem do 20 mol. % monomem obecného vzorce I, kde R je aminoacyl vybraný ze skupiny sestávající z glycylu, glycylglycylu, /Calanyhi. 6-aminohexanoylu, 4-aminobenzoylu, acylů vycházejících z oligopeptidů o počtu aminokyselin od 2 do 5, zejména GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly a GlyPheLeuGly, chráněného na hydrazidových skupinách terc-butyloxykarbonylovými skupinami, a/nebo popřípadě s obsahem do 15 mol. % monomem obecného vzorce II, kde T je oligopeptid vybraný ze skupiny sestávající z oligopeptidů o počtu aminokyselin od 2 do 5, s výhodou je oligopeptidem GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly, GlyPheLeuGly, AspProLys, AspProSer a AspProGly;
    při teplotě v rozmezí od 40 do 100 °C, s výhodou 50 až 80 °C, a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující DMSO, vodné pufry, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofotan, propanol, terc-butanol nebo jejich směsi, za iniciace iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující ABIK-TT a ABIK-N3, kde ABIK-TT je 2-[(Z)-[l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3-yl)butyl]azo]-2-methyl-5-oxo-5-(2thioxothiazolidin-3-yl)pentannitril a ABIK-N3 je A-(3-azidopropyl)-4-[(Z)-[4-(3azidopropylamino)-1 -kyano-1 -methyl-4-oxo-butyl]azo]-4-kyano-pentanamid, popřípadě za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou vybraného ze skupiny CTA-TT a CTA-N3, kde CTA-TT je [l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3-yl)butyl] benzenkarbodithioát a CTA-N3 je [4-(3-azidopropylamino)-l-kyano-l-methyl-4-oxo-butyl]benzenkarbodithioát, za vzniku hydrofilního bloku A jakožto semitelechelického hydrofilního polymemího bloku A;
    - krok, ve kterém reaguje semitelechelický hydrofilní polymemí blok A z předchozího kroku se semitelechelickým hydrofobním polymemím blokem B obecného vzorce Y-PPO-Y, kde Y je NH2, oligopeptid o počtu aminokyselin od 2 do 5, sukcinimidylkarbonát nebo dibenzocyklooktinová skupina, za vzniku amfifilního blokového kopolymem podle kteréhokoliv
    -33 CZ 308419 B6 z nároků 1 až 2, který se může, popřípadě dále podrobit odstranění chránících Boc skupin kyselinou trifluoroctovou a lyofilizaci.
  7. 7. Způsob přípravy polymemího konjugátu podle nároku 3, s vyloučením přípravy látek obecného vzorce (III), vyznačený tím, že obsahuje následující kroky:
    - krok radikálové polymerizace /V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, popřípadě s obsahem do 20 mol. % monomem obecného vzorce I, kde R je aminoacyl vybraný ze skupiny sestávající z glycylu, glycylglycylu, /Calanylu. 6-aminohexanoylu, 4-aminobenzoylu, acylů vycházejících z oligopeptidů o počtu aminokyselin od 2 do 5, zejména GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly a GlyPheLeuGly, chráněného na hydrazidových skupinách terc-butyloxykarbonylovými skupinami, a/nebo popřípadě s obsahem do 15 mol. % monomem obecného vzorce II, kde T je oligopeptid vybraný ze skupiny sestávající z oligopeptidů o počtu aminokyselin od 2 do 5, s výhodou je oligopeptidem GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly, GlyPheLeuGly, AspProLys, AspProSer a AspProGly; přičemž monomer obecného vzorce I a/nebo monomer obecného vzorce II může popřípadě obsahovat kovalentně navázánou molekulu nízkomolekulámího léčiva;
    při teplotě v rozmezí od 40 do 100 °C, s výhodou 50 až 80 °C a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující DMSO, vodné pufry, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofutan, propanol, terc-butanol nebo jejich směsi, za iniciace iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující ABIK-TT a ABIK-N3, kde ABIK-TT je 2-[(Z)-[l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3-yl)butyl]azo]-2-methyl-5-oxo-5-(2thioxothiazolidin-3-yl)pentannitril a ABIK-N3 je A'-(3-azidopropyl)-4-|(Z)-|4-(3azidopropylamino)-1 -kyano-1 -methyl-4-oxo-butyl]azo]-4-kyano-pentanamid, popřípadě za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou vybraného ze skupiny CTA-TT a CTA-N3, kde CTA-TT je [l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3-yl)butyl] benzenkarbodithioát a CTA-N3 je [4-(3-azidopropylamino)-l-kyano-l-methyl-4-oxo-butyl]benzenkarbodithioát, za vzniku hydrofilního bloku A, popřípadě obsahujícího kovalentně navázané nízkomolekulámí léčivo, jakožto semitelechelického hydrofilního polymemího bloku A, popřípadě obsahujícího kovalentně navázané nízkomolekulámí léčivo;
    - krok, ve kterém reaguje semitelechelický hydrofilní polymemí blok A, popřípadě obsahující kovalentně navázané nízkomolekulámí léčivo, z předchozího kroku se semitelechelickým hydrofobním polymemím blokem B obecného vzorce Y-PPO-Y, kde Y je -NH2, oligopeptid o počtu aminokyselin od 2 do 5, sukcinimidylkarbonát nebo dibenzocyklooktinová skupina, za vzniku amfifilního blokového kopolymem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 nebo popřípadě za vzniku polymemího konjugátu podle nároku 3;
    - popřípadě krok odstranění chránících Boc skupin;
    - popřípadě krok konjugace volných hydrazidových skupin a/nebo amidových skupin s nízkomolekulámím léčivem;
    - popřípadě krok lyofilizace.
  8. 8. Farmaceutická kompozice pro léčbu pevných nádorů a/nebo lymfomu a/nebo leukémie, vyznačená tím, že obsahuje:
    blokový kopolymer podle nároku 1 nebo 2 a nízkomolekulámí léčivo v jeho volné formě, s výhodou je nízkomolekulámím léčivem nízkomolekulámí cytostatikum, nejvýhodněji je nízkomolekulámí cytostatikum vybrané ze skupiny obsahující doxombicin, docetaxel, paklitaxel, pirambicin, mitomycin C, daunorubicin, larotaxel;
    -34CZ 308419 B6 a/nebo polymerní konjugát podle nároku 3;
    přičemž farmaceutická kompozice dále obsahuje alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou přísadu, vybranou ze skupiny zahrnující antiadheziva, pojivá, potahovací látky, barviva, 5 bobtnadla, ochucovadla, maziva, konzervanty, sladidla, sorbenty.
  9. 9. Blokový kopolymer podle nároku 1 nebo 2 pro použití jako adjuvans k léčivu pro inhibici vícečetné lékové rezistence nádorů k chemoterapii, s výhodou pro použití jako adjuvans k cytostatikům, výhodněji pro použití jako adjuvans k léčivu pro léčbu pevných nádorů a/nebo to lymfomu a/nebo leukémie.
  10. 10. Polymerní konjugát podle nároku 3 pro použití jako cytostatikum, s výhodou pro použití jako léčivo k léčbě pevných nádorů a/nebo lymfomu a/nebo leukémie.
  11. 15 11. Farmaceutická kompozice podle nároku 8 pro použití jako cytostatikum, s výhodou pro použití jako léčivo k léčbě pevných nádorů a/nebo lymfomu a/nebo leukémie.
CZ2016-206A 2016-04-11 2016-04-11 Blokový kopolymer pro překonání lékové rezistence nádorů k chemoterapii, jeho polymerní konjugát s léčivem, farmaceutická kompozice je obsahující, způsob jejich přípravy a jejich použití CZ308419B6 (cs)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2016-206A CZ308419B6 (cs) 2016-04-11 2016-04-11 Blokový kopolymer pro překonání lékové rezistence nádorů k chemoterapii, jeho polymerní konjugát s léčivem, farmaceutická kompozice je obsahující, způsob jejich přípravy a jejich použití
PCT/CZ2017/050015 WO2017177991A1 (en) 2016-04-11 2017-04-10 Block copolymer for overcoming drug resistance of tumours to chemotherapy, its polymer-drug conjugate, pharmaceutical composition containing them, method of preparation and use thereof
EP17721952.4A EP3442594B1 (en) 2016-04-11 2017-04-10 Block copolymer for overcoming drug resistance of tumours to chemotherapy, its polymer-drug conjugate, pharmaceutical composition containing them, method of preparation and use thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2016-206A CZ308419B6 (cs) 2016-04-11 2016-04-11 Blokový kopolymer pro překonání lékové rezistence nádorů k chemoterapii, jeho polymerní konjugát s léčivem, farmaceutická kompozice je obsahující, způsob jejich přípravy a jejich použití

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2016206A3 CZ2016206A3 (cs) 2017-11-01
CZ308419B6 true CZ308419B6 (cs) 2020-08-12

Family

ID=58672241

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2016-206A CZ308419B6 (cs) 2016-04-11 2016-04-11 Blokový kopolymer pro překonání lékové rezistence nádorů k chemoterapii, jeho polymerní konjugát s léčivem, farmaceutická kompozice je obsahující, způsob jejich přípravy a jejich použití

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP3442594B1 (cs)
CZ (1) CZ308419B6 (cs)
WO (1) WO2017177991A1 (cs)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110028674A (zh) * 2018-01-12 2019-07-19 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种两亲性高分子材料体系、其制备方法与应用
CZ309067B6 (cs) * 2019-10-18 2022-01-12 Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i. Způsob přípravy polymerních nosičů pro pH-řízené uvolňování léčiv a jejich konjugátů s léčivy
WO2021209859A1 (en) * 2020-04-14 2021-10-21 3M Innovative Properties Company Monomers, polymers, and articles for biomaterial capture

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ2006592A3 (cs) * 2006-09-18 2008-03-19 Zentiva, A. S. Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby
RU2541100C2 (ru) 2010-09-03 2015-02-10 Боард Оф Регентс Оф Зе Юниверсити Оф Небраска Способ и композиция для лечения рака

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. Braunová a kol.: Block copolymers of poly(N-2-hydroxypropyl methacrylamide and poly(propyleneglycol) – The way to inhibit P-Glycoprotein?" Pharm. Anal. Acta 2015, 6 (1) 30. *
A. Braunova: „Block copolymers of poly(N-2-hydroxypropyl methacrylamide) and poly(propyleneglycol) – the way to inhibit P-Glycoprotein?" 5th International Conference and Exhibition on Pharmaceutics & Novel Drug Delivery Systems 16-18.3.2015 Crowne Plaza, Dubai, http://generic-market.pharmaceuticalconferences.com/abstract/2015/block-copolymers-of-poly-n-2-hydroxypropyl-methacrylamide-and-poly-propylene-glycol-the-way-to-inhibit-p-glycoprotein *
http://slideplayer.com/slide/8097208/ obr 7, 9 a 10. A. Braunová „Block copolymers of poly(N-2-hydroxypropyl methacrylamide) and poly(propyleneglycol) – the way to inhibit P-Glycoprotein?" *
R. Wei a kol.: „Reduction- responsive disassembable core-cross-linked micelles based on poly(ethyleneglycol)-b-poly(N-2-hydroxypropyl methacrylamide)-lipoic acid conjugates for triggered intracellular anticancer drug release." Biomacromolecules 13 (8) 2429-38 (2012) *
T. Etrych a kol.: „HPMA Copolymer Conjugates of Paclitaxel and Docetaxel with pH-controlled Drug Release" Mol. Pharmaceutics, 2010, 7(4) 1015-1026 *
T. Etrych a kol.: „New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH-sensitive linkage: synthesis and preliminary in vitro and in vivo biological properties" Journal of Controlled Release 73, 89-102 (2001) *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017177991A1 (en) 2017-10-19
CZ2016206A3 (cs) 2017-11-01
EP3442594B1 (en) 2024-02-07
EP3442594C0 (en) 2024-02-07
EP3442594A1 (en) 2019-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chytil et al. HPMA copolymer–drug conjugates with controlled tumor‐specific drug release
Braunová et al. Tumor-targeted micelle-forming block copolymers for overcoming of multidrug resistance
Delplace et al. Recent trends in the design of anticancer polymer prodrug nanocarriers
US6623729B2 (en) Process for preparing sustained release micelle employing conjugate of anticancer drug and biodegradable polymer
Xu et al. Dual-responsive mPEG-PLGA-PGlu hybrid-core nanoparticles with a high drug loading to reverse the multidrug resistance of breast cancer: an in vitro and in vivo evaluation
US6589548B1 (en) Controlled drug delivery system using the conjugation of drug to biodegradable polyester
Nakamura et al. Comparison between linear and star-like HPMA conjugated pirarubicin (THP) in pharmacokinetics and antitumor activity in tumor bearing mice
Etrych et al. Polymer conjugates of doxorubicin bound through an amide and hydrazone bond: Impact of the carrier structure onto synergistic action in the treatment of solid tumours
Sivak et al. Overcoming multidrug resistance via simultaneous delivery of cytostatic drug and P-glycoprotein inhibitor to cancer cells by HPMA copolymer conjugate
US11478493B2 (en) Fabrication and application of a hetero-targeted nano-cocktail with traceless linkers
KR101705077B1 (ko) Ｈｐｍａ-도세탁셀 또는 젬시타빈 컨쥬게이트 및 이의 용도
CN102120036B (zh) 生物降解的高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束及其制备方法
EP2509421B1 (en) Drug delivery of temozolomide for systemic based treatment of cancer
US20180214563A1 (en) Immunostimulatory nanocarrier
Braunová et al. Polymer nanomedicines based on micelle-forming amphiphilic or water-soluble polymer-doxorubicin conjugates: Comparative study of in vitro and in vivo properties related to the polymer carrier structure, composition, and hydrodynamic properties
Clemente et al. Immunotherapy of experimental melanoma with ICOS-Fc loaded in biocompatible and biodegradable nanoparticles
CZ2006592A3 (cs) Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby
Gao et al. Reversal of multidrug resistance by reduction-sensitive linear cationic click polymer/iMDR1-pDNA complex nanoparticles
Luo et al. Dual stimuli-responsive dendronized prodrug derived from poly (oligo-(ethylene glycol) methacrylate)-based copolymers for enhanced anti-cancer therapeutic effect
CN109762099B (zh) 一种聚合物-抗肿瘤药物偶联物及其制备方法和用途
Šírová et al. The structure of polymer carriers controls the efficacy of the experimental combination treatment of tumors with HPMA copolymer conjugates carrying doxorubicin and docetaxel
Etrych et al. High-molecular weight star conjugates containing docetaxel with high anti-tumor activity and low systemic toxicity in vivo
WO2014084378A1 (ja) 環状ｒｇｄ配列含有ペプチドを含む抗癌剤
Zhou et al. A linear polyethylenimine (LPEI) drug conjugate with reversible charge to overcome multidrug resistance in cancer cells
EP3442594B1 (en) Block copolymer for overcoming drug resistance of tumours to chemotherapy, its polymer-drug conjugate, pharmaceutical composition containing them, method of preparation and use thereof