CZ309067B6 - Způsob přípravy polymerních nosičů pro pH-řízené uvolňování léčiv a jejich konjugátů s léčivy - Google Patents

Způsob přípravy polymerních nosičů pro pH-řízené uvolňování léčiv a jejich konjugátů s léčivy Download PDF

Info

Publication number
CZ309067B6
CZ309067B6 CZ2019649A CZ2019649A CZ309067B6 CZ 309067 B6 CZ309067 B6 CZ 309067B6 CZ 2019649 A CZ2019649 A CZ 2019649A CZ 2019649 A CZ2019649 A CZ 2019649A CZ 309067 B6 CZ309067 B6 CZ 309067B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
group
hpma
random linear
linear copolymer
dioxopyrrolidin
Prior art date
Application number
CZ2019649A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2019649A3 (cs
Inventor
Petr Chytil
Chytil Petr RNDr., Ph.D.
Eva Randárová
Randárová Eva PharmDr., Ph.D.
Tomáš Etrych
Ph.D. DSc. Etrych Tomáš RNDr.
Original Assignee
Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i. filed Critical Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i.
Priority to CZ2019649A priority Critical patent/CZ309067B6/cs
Priority to EP20810857.1A priority patent/EP4045088A1/en
Priority to PCT/CZ2020/050080 priority patent/WO2021073667A1/en
Publication of CZ2019649A3 publication Critical patent/CZ2019649A3/cs
Publication of CZ309067B6 publication Critical patent/CZ309067B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0054—Macromolecular compounds, i.e. oligomers, polymers, dendrimers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
    • C08F20/52—Amides or imides
    • C08F20/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F20/58—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-acryloylmorpholine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
    • C08F20/52—Amides or imides
    • C08F20/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F20/60—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/58—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-(meth)acryloylmorpholine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/60—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/30—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F2438/00—Living radical polymerisation
    • C08F2438/03—Use of a di- or tri-thiocarbonylthio compound, e.g. di- or tri-thioester, di- or tri-thiocarbamate, or a xanthate as chain transfer agent, e.g . Reversible Addition Fragmentation chain Transfer [RAFT] or Macromolecular Design via Interchange of Xanthates [MADIX]

Abstract

Předkládané řešení se týká efektivního způsobu přípravy kopolymerů N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) a methakryloylaminoacylhydrazidu, vhodných pro navázání léčiv obsahujících keto skupinu pro pH-řízené uvolňování léčiva, přičemž tento způsob obsahuje kroky: a) příprava monomerů statistického lineárního kopolymeru, b) polymeraci monomerů statistického lineárního kopolymeru, c) zavedení hydrazidových skupin za současné modifikace koncových skupin statistického lineárního kopolymeru, popřípadě zavedení biologicky aktivních látek na konce polymerních řetězců. Předkládané řešení se dále týká způsobu přípravy konjugátu statistického lineárního kopolymeru na bázi HPMA kopolymerů a léčiva pomocí pH-senzitivní hydrolyzovatelné hydrazonové vazby.

Description

Způsob přípravy polymemích nosičů pro pH-řízené uvolňování léčiv a jejich konjugátů s léčivy
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu přípravy polymemích nosičů léčiv umožňujících cílený transport a řízené uvolňování aktivních látek v organizmu, zejména v nádorové tkáni, zánětlivé tkáni, nádorových buňkách a buňkách imunitního systému. Použití těchto polymemích konjugátů je zaměřeno na cílenou terapii nádorových, zánětlivých a autoimunitních onemocnění v humánní medicíně.
Dosavadní stav techniky
V rámci vývoje nových léčivých přípravků se věnuje velká pozornost dopravním systémům léčiv, které umožňují zamčit správnou farmakokinetiku a vysokou účinnost léčiv s minimálními vedlejšími účinky. Hojně studovanými jsou systémy na bázi lipozomů, micel, polymerozomů, nanočástic a vodorozpustných polymemích konjugátů léčiv. Při návrhu a syntéze těchto systémů se uplatňují ve velké míře přírodní nebo syntetické makromolekuly. Ve většině uvedených dopravních systémů léčiv je nezbytné a klíčové pro dosažení kýženého účinku léčiva zajistit uvolnění nesené bioaktivní látky z jejího dopravního systému vdaném místě organizmu, např. nádom, zánětlivé části, zatímco během dopravy do místa účinkuje celý systém stálý, neuvolňuje aktivní látky a je tedy bez vedlejších účinků. Významnou vlastností uvedených dopravních systémů je větší rozměr ve vodném prostředí, který může zajistit přednostní ukládání dopravního systému s léčivem v nádorové tkáni celé řady pevných nádorů (tzv. EPR efekt) a v zánětlivé tkáni (tzv. ELVIS efekt). Uvolnění aktivního léčiva z dopravního systému může být s výhodou řešeno prostřednictvím biodegradovatelné spojky, použité k vazbě léčiva na polymer, jejíž degradace v cílové tkáni vede k cílené a řízené aktivaci léčiva přednostně v této tkáni. Systémy využívající k aktivaci biodegradovatelné spojky často využívají vodorozpustných polymemích materiálů, přičemž významnou skupinu takovýchto systémů tvoří polymemí léčiva připravená na bázi kopolymerů JV-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA). Výrazně vyšší protinádorový účinek ve srovnání s běžně užívanými cytostatiky a podstatné snížení vedlejších, především toxických, účinků na zdravý organizmus prokázaly polymemí nosiče na bázi HPMA kopolymerů nesoucí léčivo, navázané na nosič pomocí hydrolyticky labilní hydrazonové vazby. Syntéza takovýchto konjugátů byla prováděna nejdříve pomocí klasické radikálové polymerace, která vedla k přípravě polymemích systémů s poměrně širokou distribucí molámích hmotností polymerů s indexem disperzity £> okolo 2.
Později byla popsána metoda kontrolované radikálové polymerizace (RAFT, reversible additionfragmentation chain transfer, tedy řízená radikálová polymerace s reverzibilně-fragmentačním přenosem řetězce) umožňující přípravu kopolymerů s významně nižší dispersitou okolo 1,2. (Moad G. et al., Polymer, 2008. 49(5)) Rovněž polymemí nosiče na bázi HPMA kopolymerů obsahující hydrazidové skupiny vhodné pro vazbu léčiv hydrazonovou vazbou byly připraveny pomocí RAFT polymerace (Chytil P. et al., Eur. J. Pharm. Sci., 2010, 41, 73-82). Hydrazidové skupiny je ovšem třeba chránit během polymerace. Autoři publikace proto použili chránění pomocí terč.-butoxykarbonylové (Boc) skupiny. V následném kroku byly odstraněny dithiobenzoátové skupiny na konci polymemího nosiče redukcí borohydridem sodným a vzniklé -SH skupiny zablokovány reakcí s JV-ethylmaleinimidem. Teprve poté byly Boc skupiny odstraněny pomocí trifluoroctové kyseliny (TFA). Nevýhodou této syntézy nosiče je potřeba několika následných kroků po polymeraci. Především krok odchránění hydrazidových skupin je krokem obtížně reprodukovaným a neumožňuje jednoduchou přípravu větších šarží polymeru potřebnou pro průmyslové využití. Rovněž závěrečné čištění polymem pomocí gelové filtrace znamená komplikace pro přípravu většího množství nosiče. Popsaný postup syntézy nosiče byl použit i v dalších publikacích s tím, že základem je vždy kopolymerace HPMA s monomerem
- 1 CZ 309067 B6 nesoucím Boc chráněné hydrazidové skupiny (např. Šubr V. et al. Biomacromolecules 2014, 15 (8), 3030-3043), Chytil P. et al. Macromol. Biosci. 2015, 15 (6), 839-850, Lomkova E. et al. Biomacromolecules 2016, 17 (11), 3493-3507). Blokace koncových skupin a následné odchránění hydrazidových skupin se mírně lišila. Místo redukce borohydridem bylo použito nadbytku iniciátoru. Nedávno byla publikována práce, ve které je použito k odstranění Boc skupin místo TFA inkubací polymeru rozpuštěného v destilované vodě při 100 °C (Koziolová E. et al. Biomacromolecules 2018, 19 (10), 4003-4013).
Předkládaný vynález si klade za cíl poskytnout takový postup přípravy nosičů léčiv umožňujících vazbu léčiv pomocí pH labilní hydrolyzovatelné hydrazonové vazby, který by poskytoval vysoké výtěžky, byl dobře reprodukovatelný, dovoloval přesně řídit molámí hmotnosti polymemích prekurzorů s nízkou dispersitou a přesně definovanou strukturou. Postup by také měl být snadno převoditelný do průmyslového měřítka.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je postup přípravy polymemích nosičů na bázi HPMA kopolymerů, vhodných pro vazbu léčiv pomocí pH-senzitivní hydrolyzovatelné hydrazonové vazby. Postup přípravy polymemího nosiče umožňuje navíc zavést biologicky aktivní látky na konce polymemích řetězců.
Polymemí nosič je tvořen statistickým lineárním kopolymerem obecného vzorce V,
(V), sestávajícím z alespoň 75 % mol. monomemích jednotek HPMA (75 až 99,5 % mol. HPMA) a od 0,5 do 25 % mol., vztaženo na celkový počet monomemích jednotek, stmktumích jednotek vzorce E
kde X je vybrán ze skupiny tvořené alkylenem majícím 1 až 8 atomů uhlíku; fenylenem; -(CH2)q(C(O)-NH-(CH2)r)p-, kde p = laž5, aqa r jsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; přičemž X může být popřípadě substituován jedním nebo více postranními řetězci přirozené aminokyseliny, přičemž postranní řetězce mohou být stejné nebo různé; X je s výhodou vybrán ze skupiny zahrnující -CH2-CH2- a-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-;
- 2 CZ 309067 B6 x je celé číslo v rozmezí od 25 do 700;
Ri je radikálová odstupující skupina použitého přenosového činidla, s výhodou je Ri vybraný ze skupiny zahrnující 2-kyano-2-propyl a 5-karboxy-2-kyano-2-pentyl;
a R2 je thioetherový derivát daný strukturou použité sloučeniny s dvojnou vazbou (C=C) po adici koncových SH skupin polymemího řetězce nebo vzájemnou reakce koncových SH skupin statistického lineárního kopolymeru za vzniku diblokového polymeru spojeného disulfidovou vazbou; s výhodou je R2 vybraný ze skupiny zahrnující 2-(ethenylsulfonyl)ethyl, l-ethyl-2,5dioxopyrrolidin-3-yl, l-(2-hydroxyethyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl, l-(2-propynyl)-2,5dioxopyrrolidin-3-yl, l-(3-karboxy-l-propyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl, l-(2-aminoethyl)-2,5dioxopyrrolidin-3 -yl, 1 -(3 -aminopropyl)-2,5 -dioxopyrrolidin-3 -yl; a
přičemž molámí hmotnost statistického lineárního kopolymeru je v rozmezí od 4000 do 100 000 g/mol, s výhodou 20 000 až 40 000 g/mol.
Přirozenými aminokyselinami jsou zde míněny přirozeně se vyskytující kyseliny: histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin, threonin, tryptofan, valin, arginin, cystein, glutamin, glycin, prolin, tyrosin, alanin, asparagová kyselina, asparagin, glutamová kyselina, serin, selenocystein. Postranními řetězci jsou řetězce navázané na alfa-uhlíku aminokyseliny, tedy zejména methyl, isopropyl, isobutyl, -CH(CH3)(CH2CH3), -CH2OH, -CH(OH)(CH3), -CH2(C6H4)OH, -(CH2)2-S-CH3, -CH2SH, -(CH2)4-NH2, -CH2COOH, -CH2C(O)NH2, -(CH2)2COOH, -(CH2)2C(O)NH2, -(CH2)3NH-C(=NH)(NH2), benzyl.
Semitelechelický lineární kopolymer je statistický kopolymer vzniklý radikálovou polymerizací. Koncové skupiny výsledného lineárního kopolymeru tudíž obsahují části molekul iniciátoru polymerizace (například azoiniciátory 2,2'-azobis(2-methylpropionitril) (AIBN), 4,4'-azobis(4kyanopentanová kyselina) (ACVA), 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4-dimethylpentannitril) (V70)), a přenosového činidla (s výhodou vybraného ze skupiny 2-kyano-2-propyl benzodithioát, 4-kyano4-(thiobenzoylthio)pentanová kyselina, 2-kyano-2-propyl dodecyl trithiokarbonát, 2-kyano-2propylethyltrithiokarbonát a 4-kyano-4-[(dodecylsulfanylthiokarbonyl)sulfanyl]pentanová kyselina). Koncové skupiny kopolymeru tedy obsahují na jednom konci radikálovou odstupující skupinu přenosového činidla, s výhodou 2-kyano-2-propyl, nebo 5-karboxy-2-kyano-2-pentyl. Na druhém konci je umístěna dithiobenzoátová nebo trithiokarbonátová skupina, která je in sítu redukována na thiolovou skupinu, která se následně aduje na sloučeninu s dvojnou vazbou (C=C), s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující A-substituovaný maleinimid, nebo Ssubstituovaný vinylsulfon, výhodněji je sloučenina s dvojnou vazbou (C=C) vybraná ze skupiny zahrnující divinylsulfon, karboxy-PEG vinylsulfon, A-ethylmaleinimid, A-(2hydroxyethyl)maleinimid, A-propargylmaleinimid, 3-maleinimido propionovou kyselinu, azidoPEG-maleinimid a N-(5-fluoresceinyl)-maleinimid, nebo se koncové thiolové skupiny převedou na aminové pomocí A-aminoethylmaleinimid trifluoracetátu, nebo A-(3-aminopropyl)maleinimid trifluoroacetátu, přičemž reakce probíhá v inertní atmosféře (například Ar nebo N2) za teploty místnosti a v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující methanol, ethanol, dimethylsulfoxid, dimethylacetamid a dimethylformamid.
Postup přípravy polymemích nosičů podle předkládaného vynálezu obsahuje následující kroky:
- 3 CZ 309067 B6
a) poskytnutí monomerů polymemího nosiče,
b) polymeraci monomerů polymemího nosiče,
c) zavedení hydrazidových skupin za současné modifikace koncových skupin polymemího nosiče,
d) volitelně vazba biologicky aktivní látky na koncovou skupinu polymemího řetězce.
Krok a) poskytnutí monomem polymemího nosiče zahrnuje poskytnutí N-(2hydroxypropyljmethakrylamidu (HPMA) a přípravu monomem obecného vzorce II
(Π), kde X je definováno výše a Y je hydroxyl, (Cl-C6)alkoxy, benzoxy, 4-nitrofenoxy, 2,3,4,5,6pentafluorfenoxy skupina, sukcinimidylová skupina, (Cl-C6)alkylthio skupina nebo thiazolidin2-thionová skupina; s výhodou je Y vybrán ze skupiny methoxy, ethoxy, ter.-butoxy nebo tercbutylthio nebo thiazolidin-2-thionová skupina.
HPMA je komerčně dostupný a jeho syntéza je publikována (např. Chytil P. et al., Eur. J. Pharm. Sci., 2010,41,73-81).
HPMA
Syntéza monomem obecného vzorce II spočívá v reakci esteru, thioesteru, či imidu aminokyselin a sloučenin vzorce Y-C(O)-X-NH2, kde X a Y jsou definované výše, s methakryloylchloridem (tuto reakci lze také nazvat methakroylace) dle Schotten-Baumanovy metody, s výhodou prováděnou v diethyletheru, nebo dichlormethanu v přítomnosti bezvodého uhličitanu sodného, nebo ve vodě v přítomnosti alkalického hydroxidu. Vstupní sloučeniny vzorce Y-C(O)-X-NH2 jsou komerčně dostupné. Volitelně může být zahrnut i krok methakroylace komerčně dostupné sloučeniny vzorce HO-C(O)-X-NH2 následovaný krokem esterifikace, thioesterifikace, či imidace karboxylové skupiny, s výhodou pomocí karbodiimidové metody s použitím dicyklohexylkarbodiimidu, diisopropylkarbodiimidu, 1 -ethyl-3 -(3 dimethylaminopropyl)karbodiimidu, nebo jiných činidel s použitím benzotriazol-l-yloxytripyrrolidinofosfonium hexafluorofosfátu nebo (2-(lH-benzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3tetramethyluronium hexafluorofosfátu.
- 4 CZ 309067 B6
Krok b) polymerace monomerů polymemího nosiče spočívá v řízené radikálové RAFT polymerizaci HPMA s monomerem obecného vzorce II v molámím poměru HPMA:monomer vzorce II od 99,5:0,5 do 75:25. Polymerizace probíhá při teplotě v rozmezí od 10 do 100 °C, s výhodou 40 až 80 °C a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, dioxan, terc-butylalkohol, vodu, vodný pufr nebo jejich směsi, za iniciace iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující zejména azoiniciátory 2,2'-azobis(2-methylpropionitril) (AIBN), 4,4'-azobis(4-kyanopentanová kyselina) (ACVA), 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4-dimethylpentannitril) (V70), a za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou vybraného ze skupiny 2-kyano-2-propyl benzodithioát, 4-kyano4-(thiobenzoylthio)pentanová kyselina, 2-kyano-2-propyldodecyltrithiokarbonát, 2-kyano-2propyl ethyl trithiokarbonát a 4-kyano-4-[(dodecylsulfanylthiokarbonyl)sulfanyl]pentanová kyselina. Molámí hmotnost Ma takto připravených kopolymerů je v rozmezí od 4 000 do 100 000 g/mol, s výhodou 20 000 až 40 000 g/mol.
Ve výhodném provedení se syntéza polymemích prekurzorů provede při molámím poměru iniciátor:přenosové čidlo v rozmezí od 1:1 do 1:10.
Ve výhodném provedení se syntéza polymemích prekurzorů provede při molámím poměru přenosové činidlo monomery od 1:50 do 1:1000.
Krok c) zavedení hydrazidových skupin za současné modifikace koncových skupin polymemího nosiče spočívá v převedení skupiny Y (reaktivních esterů, thioesterů a imidů) na hydrazidové skupiny (-NH-NH2) a in situ odstranění síru obsahujících koncových skupin polymemího nosiče, pocházejících z přenosového činidla. Nejprve se přidá redukční činidlo, s výhodou dithiothreitol, následně proběhne hydrazinolýza hydrazinem (hydrazin hydrátem) a vzápětí jsou koncové thiolové skupiny adovány na sloučeniny nesoucí dvojnou vazbu (C=C) za vytvoření thioetherové vazby. Sloučeniny s dvojnou vazbou jsou s výhodou vybrané ze skupiny zahrnující Nsubstituovaný maleinimid a S-substituovaný vinylsulfon, výhodněji jsou vybrané ze skupiny zahrnující divinylsulfon, karboxy-PEG vinylsulfon, A-ethylmaleinimid, N-(2hydroxyethyl)maleinimid, A-propargylmaleinimid, 3-maleinimido propionovou kyselinu, azidoPEG-maleinimid a N-(5-fluoresceinyl)-maleinimid, nebo se koncové thiolové skupiny převedou na aminové pomocí V-aminoethylmaleinimid trifluoracetátu, nebo A-(3-aminopropyl)maleinimid trifluoroacetátu, přičemž reakce probíhá v inertní atmosféře (například Ar nebo N2) za teploty místnosti a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující methanol, ethanol, dimethylsulfoxid, dimethylacetamid a dimethylformamid.
Výslednou strukturu polymemího nosiče lze vyjádřit obecným vzorcem III (III), kde X je definováno výše;
x je celé číslo v rozmezí od 25 do 700, s výhodou v rozmezí od 120 do 300;
Ri je daná strukturou použitého přenosového činidla a tvoří jej tzv. radikálová odstupující skupina, s výhodou 2-kyano-2-propyl, nebo 5-karboxy-2-kyano-2-pentyl;
- 5 CZ 309067 B6 a R2 je daná strukturou použité sloučeniny s dvojnou vazbou (C=C) po adici koncových SH skupin polymemího řetězce, s výhodou je R2 vybrané ze skupiny zahrnující 2(ethenylsulfonyl)ethyl, l-ethyl-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl, l-(2-hydroxyethyl)-2,5-dioxopyrrolidin3 -yl, 1 -(2-propynyl)-2,5 -dioxopyrrolidin-3 -yl, 1 -(3 -karboxy-1 -propyl)-2,5 -dioxopyrrolidin-3 -yl, 1 -(2-aminoethyl)-2,5 -dioxopyrrolidin-3 -yl, nebo 1 -(3 -aminopropyl)-2,5 -dioxopyrrolidin-3 -yl skupina.
Variantní součástí přípravy je hydrazinolýza provedená bez blokace koncových SH skupin adicí na dvojnou vazbu, umožňující jejich reakci za tvorby diblokových polymerů spojených disulfidovou vazbou. Strukturu takového nosiče lze vyjádřit obecným vzorcem IV,
přičemž X, x i Ri jsou stejné, jako je definováno výše.
Struktury obecného vzorce III a obecného vzorce IV spadají do definice statistického lineárního kopolymeru obecného vzorce V.
V jednom provedení může volitelně po kroku c) následovat krok d), ve kterém lze na skupinu R2 obecného vzorce III navázat biologicky aktivní látku (tedy na sloučeninu s dvojnou (C=C) vazbou, zavedenou do polymemí struktury reakcí koncových thiolových skupin polymeru s bifimkčním činidlem obsahujícím dvojnou vazbu a další funkční skupinu - primární aminoskupinu (bifunkčním činidlem je A-aminoethylmaleinimid trifluoracetát, nebo N-(3aminopropyl)maleinimidtrifluoracetát). Biologicky aktivní látka je například fluorescenční značka, obsahující esterovou skupinu. Vznikne tak polymemí konjugát této biologicky aktivní látky a lineárního polymeru, který lze dále využít k fluorescenčnímu značení. Příkladem takovéto adice biologicky aktivní látky je reakce koncové aminové skupiny například s esterovými skupinami dalších biologicky aktivních látek, což umožňuje velkou variabilitu a univerzální využití polymeru.
Příkladem vhodné fluorescenční značky je Cyanine 5.5 NHS ester (2-[5-(l,3-dihydro-l,l,3trimethyl-2H-benz [e] indol-2-yliden)-1,3 -pentadien-1 -yl] -3 -[6-[(2,5 -dioxo-1 -pyrrolidinyl)oxy] -6oxohexyl] -1,1 -dimethyl-1 H-benz [e] indolium).
Předmětem předkládaného vynálezu je dále postup přípravy konjugátu polymemího nosiče na bázi HPMA kopolymerů a léčiva pomocí pH-senzitivní hydrolyzovatelné hydrazonové vazby. Tento postup spočívá v přípravě polymemího nosiče dle kroků a) až c) uvedených výše, po kterých následuje krok d) vazby léčiva k polymemímu nosiči pomocí hydrazonové vazby za vzniku konjugátu.
Postup přípravy zahrnuje reakci polymemího nosiče z kroku c) s léčivem, nebo jeho derivátem obsahujícím keto skupinu, za katalýzy definovaného množství kyseliny octové vedoucí k tvorbě hydrazonové vazby (-C(=O)- skupina léčiva reaguje s -NH-NH2 skupinou postranního řetězce polymemího nosiče za vzniku hydrazonové vazby mezi léčivem a postranním řetězcem
- 6 CZ 309067 B6 polymemího nosiče). S výhodou je léčivo vybrané ze skupiny, zahrnující doxorubicin, dexamethason, pirarubicin, epirubicin, ritonavir, docetaxel, paklitaxel, larotaxel, popřípadě jejich oxo-deriváty. Reakce může být prováděna v methanolu, dimethylsulfoxidu, dimethylformamidu, sušeném ethanolu a dimethylacetamidu. Syntéza polymemích konjugátů s léčivem vychází z již dříve popsaného způsobu vazby doxorubicinu (Etrych, T., et al., J. Control. Release, 2001. 73(1): p. 89-102), pirarubicinu (Nakamura, H., et al., J. Control. Release, 2014. 174: p. 81-87.) a ketoderivátů taxolů (Etrych, T., et al., Mol. Pharm., 2010. 7(4): p. 1015-1026.), dexamethasonu (Krakovičová, Η., T. Etrych, and K. Ulbrich, Eur. J. Pharm. Sci., 2009. 37(3-4): p. 405-412), mitomycinu C (Kostková, H., et al., Macromol. Biosci., 2013. 13(12): p. 1648-60), ketoderivátů ritonaviru (Koziolová, E., et al., J. Control. Release, 2016. 233: p. 136-146) a dalších léčiv obsahujících amino nebo hydroxylovou skupinu.
Ve výhodném provedení je vstupní koncentrace polymemího nosiče pro reakci s keto skupinami léčiva v rozmezí od 100 do 190 mg/ml, koncentrace ledové kyseliny octové je v rozmezí od 30 do 80 mg/ml a koncentrace léčiva je od 1 do 50 mg/ml, výhodněji je vstupní koncentrace polymeru pro reakci s keto skupinami léčiva 170 mg/ml, koncentrace kyseliny octové je 55 mg/ml a koncentrace léčívaje 20 mg/ml při teplotě 25 °C.
Volitelným dalším krokem e) přípravy konjugátu je finální čištění konjugátu od volného nenavázaného léčiva pomocí gelové filtrace, například za použití kolony naplněné zesíťovaným dextranem (například Sephadex LH-20) amethanolu jako mobilní fáze. Gelové filtrace pro čištění polymerů jsou odborníkovi v oboru známé a odborník v oboru by tudíž věděl, jakou stacionární fázi pro gelovou filtraci použít.
Předkládaný vynález tedy poskytuje reprodukovatelný způsob přípravy velice dobře definovaných polymemích nosičů léčiv na bázi kopolymerů HPMA, umožňujících vázat léčiva pH labilní hydrazonovou vazbou k nosiči. Nový způsob přípravy polymemích nosičů pomocí řízené polymerace umožňuje zvýšit výtěžky při polymeraci a díky výhodným kopolymeračním parametrům blízkým jedné dobře řídit obsah komonomemí jednotky (dle vzorce I) v nosiči; syntéza je výrazně jednodušší a levnější, umožňuje „scale-up“ na velké šarže a reprodukovatelnost syntézy je velmi dobrá. Biologická aktivita konjugátů připravených polymemích nosičů s léčivy je stejná jako u konjugátů dříve připravených nosičů.
Objasnění výkresů
Obrázek 1. Časová závislost množství uvolněného DEX z konjugátu poly(HPMA-co-AH-NHN=DEX) inkubovaného v pufrech o pH 5 a 7,4 při 37 °C: DEX, pH 5 (šedá); DEX, pH 7,4 (černá).
Příklady uskutečnění vynálezu
Charakterizace polymemích prekurzorů a konjugátů
Připravené kopolymery byly charakterizovány stanovením váhového i početního průměru molámích hmotností (A/w, M,) a příslušného indexu disperzity (£>) pomocí gelové permeační chromatografie (GPC) na systému vybaveném PDA detektorem (Shimadzu, Japan), Rl detektorem (Optilab REX, Wyatt Technology Corp., USA) a víceúhlovým detektorem rozptylu světla (DAWN Heleos-II, Wyatt Technology Corp., USA). Pro charakterizaci byla v případě SEC použita kolona TSK 3000 Super SW a jako mobilní fáze směs methanolu (80 %) a 0,3 M octanového pufm o pH 6,5 (20 %). Koncentrace vzorků byla ve všech případech 3 mg/ml.
Obsah hydrazidových skupin byl stanoven pomocí TNBSA zkoušky. Obsah methylesterových skupin a dalších esterů byl stanoven pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) na
- 7 CZ 309067 B6 spektrometru Bruker Avance III 600 MHz spectrometer v (CDfSO. Obsah navázaných léčiv byl buď stanoven spektrofotometricky, nebo pomocí HPLC po celkové hydrolýze, tj. uvolnění z polymemího nosiče.
Příklad 1: Syntéza monomerů
JV-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA)
HPMA byl připraven podle dříve popsaného postupu (Chytil P. et al., Eur. J. Pharm. Sci., 2010, 41, 73-82). Produkt byl chromatograficky čistý. Ή-NMR (300 MHz, (CD3)2SO, 296 K): δ 1,001,02 (d, 3H, CHOH-CH3), 1,85 (s, 3H, CH3), 3,00-3,12 (m, 2H, CH2), 3,64-3,73 (m, 1H, CH), 4,68-4,70 (d, 1H, OH), 5,30 a 5,66 (d, 2H, CH2=), 7,59 (br, 1H, NH).
Methylester kyseliny JV-methakryloyl-3-aminopropionové (MA-AP-OMe)
V
HN o
Methyl(3-aminopropionát)hydrochlorid (30 g, 0,215 mol) byl za intenzivního míchání při teplotě místnosti rozpuštěn ve 350 ml dichlormethanu. Roztok byl ochlazen na 10 až 15 °C, přidán bezvodý uhličitan sodný (67 g, 0,645 mol), teplota snížena na 5 až 10 °C a poté přikapán roztok methakroylchloridu (22,5 g, 0,215 mol (ekv.)) ve 100 ml dichlormethanu takovou rychlostí, aby teplota reakční směsi nepřesáhla 15 °C. Po spotřebování veškerého methakroylchloridu byla směs míchána ještě 45 min při teplotě 15 až 20 °C, poté byla chladicí lázeň odstavena, suspenze míchána ještě 20 min, odsáta na fritě č. 3, promyta 300 ml dichlormethanu a filtrát odpařen na rotační vakuové odparce do sucha. Výtěžek činil 29,5 g produktu (84 %). Ή-NMR (300 MHz, (CD3)2SO, 295 K): 1,83 (s, 3H, CH3), 3,30-3,43 (m, 4H, CH2-a, ΟΗ2-β), 5,33 (s, 3H, OCH3), 5,60 a 5,96 (d, 2H, CH2=), 7,97 (br, 1H, NH). Produkt byl chromatograficky čistý.
Methyl ester kyseliny JV-methakryloyl-6-aminohexanové (MA-AH-OMe)
HN
O f
MA-AH-OMe byl připraven podle výše popsaného postupu za použití methyl(3 -aminohexanoát) hydrochloridu. Ή-NMR (300 MHz, (CD3)2SO, 295 K): δ 1,20-1,27 (m, 2H, CH2-y), 1,40-1,54 (m, 4H, CH2-p, CH2-6), 1,82 (s, 3H, CH3), 2,28 (t, 2H, CH2-a), 3,04-3,34 (m, 2H, CH2-s), 3,57 (s, 3H, OCH3), 5,28 a 5,60 (d, 2H, CH2=), 7,88 (br, 1H, NH). Produkt byl chromatograficky čistý.
- 8 CZ 309067 B6
Příklad 2a: Syntéza polymemího prekurzoru (poly(HPMA-co-MA-AH-OMe)) kopolymeru HPMA s MA-AH-OMe
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-OMe) byl připraven řízenou radikálovou RAFT kopolymerizací HPMA a MA-AH-OMe (připravených dle Příkladu 1) iniciovanou AIBN v přítomnosti RAFT přenosového činidla 2-kyano-2-propyl benzodithioátu ve směsi terc.butylalkoholu a dimethyl sulfoxidu při 70 °C.
HPMA (4,0 g, 27,9 mmol) a MA-AH-OMe (0,377 g, 1,8 mmol) bylo rozpuštěno v 35,7 ml tercbutylakoholu, k roztoku bylo přidáno 2-kyano-2-propyl benzodithioátu (18,8 mg, 84,9 pmol) a AIBN (7,0 mg, 42,5 pmol) rozpuštěných v 4,0 ml dimethylsulfoxidu. Polymerizační směs byla vložena v argonové atmosféře do polymerizační ampule (objem 50 ml), probublána argonem po dobu 10 min a zatavena. Polymerizační ampule byla umístěna do termostatu s 70 °C.
Polymerizační směs byla po 16 h vyjmuta z termostatu, ochlazena v lázni na pokojovou teplotu a polymer byl izolován vysrážením do ethylacetátu (celkem 800 ml). Vysrážený polymer byl ponechán sedimentovat cca 0,5 h, roztok nad sraženinou byl odsát a polymer byl izolován filtrací na fritě S4. Sraženina byla promyta ethylacetátem, přemístěna na velké Petriho misky a sušena při teplotě místnosti za vakua membránové vývěvy cca 1 h.
Polymer byl za pomoci ultrazvuku rozpuštěn v 40 ml methanolu (Erlenmayerova baňka o objemu 100 ml) a přesrážen do 800 ml ethylacetátu stejným postupem jako při prvé izolaci. Vysrážený polymer byl po cca 0,5 h sedimentaci izolován filtrací na fritě S4, promyt ethylacetátem a sušen do konstantní hmotnosti (cca 5 h) na membránové vývěvě a dosušen za vakua olejové vývěvy.
Charakterizace kopolymeru: Výtěžek 3,07 g (70 %), obsah methyle stero vých skupin 5,3 % mol., molámí hmotnost = 38800 g/mol, index disperzity £> = 1,19.
Analogicky byly připraveny další kopolymery poly(HPMA-co-MA-AH-OMe) lišící se molámím poměrem monomemích jednotek a RAFT přenosového činidla v polymerizační směsi (viz tabulka 1).
- 9 CZ 309067 B6
Tabulka 1. Charakterizace poly(HPMA-co-MA-AH-OMe)
Vzorek č. [M]:[CTA]: [I]* Doba polymerace (h) Koncentrace monomerů (mol/L) Výtěžek polymerace (%) Mv (g/mol) (g/mol) D Obsah OMe
(%1 teor. nol) exp.
1 400:2:1 6 1 72 23700 22100 1,07 10 9,1
2 600:2:1 16 1 71 41600 34400 1,21 10 9,1
3 650:2:1 16 1 72 44900 37600 1,20 10 9.1
4 700:2:1 16 1 74 49500 38600 1,28 10 9,0
5 600:2:1 16 1 71 40400 35100 1,15 12 10,4
6 700:2:1 16 0,75 70 37900 32200 1,17 6 5,2
7 700:2:1 16 0,75 70 38800 32300 1,20 6 5,1
[M]: [CTA]: [I] je molámí poměr mezi monomery, přenosovým činidlem a iniciátorem v polymerační směsi
Analogicky byly připraveny kopolymery za použití jiných RAFT činidel: S-2-kyano-2-propyl-S'ethyltrithiokarbonát, 4-kyano-4-(thiobenzoylthio)pentanová kyselina, 2-kyano-2-propyl dodecyltrithiokarbonát, 2-kyano-2-propylethyl trithiokarbonát a 4-kyano-4[(dodecylsulfanylthiokarbonyl)sulfanyl]pentanová kyselina.
Příklad 2b: Syntéza polymemího prekurzoru - kopolymeru HPMA s MA-AP-OMe (poly(HPMA-co-MA-AP-OMe))
Provedení a postup polymerizace poly(HPMA-co-MA-AP-OMe) byly stejné jako v příkladu 2a, rozdíl byl ve složení polymerizační směsi. Složení polymerizační směsi bylo následující: HPMA (4,0 g, 27,9 mmol) a MA-AP-OMe (0,308 g, 1,8 mmol) rozpuštěných v 35,7 ml tercbutylalkoholu, 2-kyano-2-propyl benzodithioát (18,8 mg, 84,9 pmol) a AIBN (7,0 mg, 42,5 pmol) rozpuštěných v 4,0 ml dimethyl sulfoxidu. Teplota polymerizace byla 70 °C, doba polymerizace byla 16 h. Polymemí roztok byl srážen do ethylacetátu a srážení polymemího produktu bylo prováděno do 20tinásobného objemu srážedla. Polymer byl zbaven nízkomolekulámích příměsí přesrážením z methanolu do ethylacetátu. Výtěžek byl 3,1 g (72 %), obsah methylesterových skupin 5,1 % mol., molámí hmotnost = 37 700 g/mol, index disperzity £> = 1,17.
Příklad 3a: Syntéza polymemího prekurzom poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) hydrazinolýzou poly(HPMA-co-MA-AH-MeO) a současným zablokováním koncové thiolové skupiny polymemího nosiče
- 10 CZ 309067 B6
Kopolymer s hydrazidovými skupinami poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) byl připraven hydrazinolýzou kopolymeru s methyle stero vými skupinami poly(HPMA-co-MA-AH-OMe), připraveného v příkladu 2a, za současného odstranění síru obsahujících koncových skupin pocházejících z přenosového činidla na koncích polymemích řetězců a zablokování vzniklých koncových thiolových skupin pomocí /V-ethylmaleinimidu.
Roztok poly(HPMA-co-MA-AH-MeO) (500 mg, 0,20 mmol methylesterových skupin) a dithiothreitolu (70 mg, 0,45 mmol) v 3,75 ml sušeného destilovaného methanolu byl probublán argonem po dobu 5 min a následně držen pod argonovou atmosférou. K reakční směsi bylo přidáno 3,75 ml hydrazinhydrátu (77 mmol). Reakce probíhala po dobu 5 min a následně byl hydrazin hydrát společně s rozpouštědlem odstraněn na rotační odparce za vakua olejové vývěvy (1 mbar, 1.5 h). K odparku byl přidán roztok A-ethylmaleinimidu (168 mg, 1,35 mmol) v 10 ml methanolu a reakce probíhala po dobu 20 min. Produkt byl izolován vysrážením do ethylacetátu (celkem 200 ml) a následně filtrován a sušen dle výše popsaného postupu. Polymer byl zbaven nízkomolekulámích příměsí přesrážením z methanolu do ethylacetátu. Výtěžek byl 470 mg (94 %), obsah hydrazidových skupin 5,1 % mol., molámí hmotnost M> = 41 900 g/mol, index disperzity £> = 1,19.
Příklad 3b: Syntéza polymemího prekurzoru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) hydrazinolýzou poly(HPMA-co-MA-AH-MeO) a současným zablokováním koncové thiolové skupiny polymemího nosiče a zavedením fluoresceinu na konec polymemího řetězce
Analogicky k příkladu 3a, byl připraven kopolymer s hydrazidovými skupinami hydrazinolýzou kopolymeru s methylesterovými skupinami poly(HPMA-co-MA-AH-OMe) za současného odstranění sím obsahujících koncových skupin pocházejících z přenosového činidla na koncích
- 11 CZ 309067 B6 polymemích řetězců a zablokování vzniklých koncových thiolových skupin pomocí N-(5fluoresceinyl)-maleinimidu. Obsah hydrazidových skupin 5,2 % mol., obsah aminoskupin 0,5 % mol., molámí hmotnost Mw = 42 800 g/mol, index disperzity D = 1,20.
Příklad 3c: Syntéza polymemího prekurzoru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) hydrazinolýzou poly(HPMA-co-MA-AH-MeO) a současným zablokováním koncové thiolové skupiny polymemího nosiče a zavedením aminoskupiny na konec polymemího řetězce
Analogicky k příkladu 3a, byl připraven kopolymer s hydrazidovými skupinami hydrazinolýzou kopolymeru s methylesterovými skupinami poly(HPMA-co-MA-AH-OMe) za současného odstranění sím obsahujících koncových skupin pocházejících z přenosového činidla na koncích polymemích řetězců a zablokování vzniklých koncových thiolových skupin pomocí Naminoethylmaleinimidtrifluoracetátu. Obsah hydrazidových skupin 5,1 % mol., obsah aminoskupin 0,4 % mol., molámí hmotnostMv = 38 500 g/mol, index disperzity D = 1,16.
Příklad 4: Syntéza polymemího konjugátu poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) s fluorescenční značkou Cyanine 5.5 na konci polymemího řetězce
Polymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) s koncovými aminoskupinami připravený dle příkladu 3c byl použit k navázání fluorescenční značky Cyanine 5.5 NHS esteru.
Roztok 100 mg kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) v 0,5 ml dimethylacetamidu (finální koncentrace 100 mg polymeru/ml) byl smíchán s roztokem 1 mg Cyanine 5.5 NHS esteru v 0,5 ml dimethylacetamidu s přídavkem dimethylisopropylaminu (ekvimolámě k Cyanine 5.5 NHS estem). Po 2 h reakce byl polymemí produkt izolován pomocí gelové filtrace v methanolu. Rozpouštědlo bylo odpařeno za sníženého tlaku na vakuové odparce a produkt byl rozpuštěn ve vodě a lyofilizován. Obsah celkového Cyanine 5.5 byl stanoven spektrofotometricky.
- 12 CZ 309067 B6
Charakterizace polymemího konjugátu s Cyanine 5.5: Celkový výtěžek reakce vazby fluorescenční značky: 80 mg (80 %), obsah celkového Cyanine 5.5 0,3 % mol.
Příklad 5a: Příprava polymemího konjugátu poly(HPMA-co-AH-NH-N=DOX)
Kopolymery s doxorubicinem (DOX) navázaným k PHPMA nosiči hydrolyticky štěpitelnou hydrazonovou vazbou byly připraveny reakcí kopolymerů obsahujících hydrazidové skupiny poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) s doxorubicinhydrochloridem (DOX.HC1) v methanolu za katalýzy octovou kyselinou.
Roztok 1,53 g kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2), připraveného dle příkladu 3a, v 9,2 ml methanolu (167 mg polymeru/ml) byl vložen do termostatované cely, ve které bylo umístěno 0,19 g DOX.HC1 (3,3 mmol). Nehomogenní suspenze byla míchána v temnu při 25 °C a po 1 minutě bylo přidáno 0,5 ml kyseliny octové. V průběhu reakce došlo k pozvolnému rozpuštění suspenze, po 22 h reakce byl z homogenního roztoku polymemí produkt izolován srážením do 100 ml ethylacetátu, precipitát polymemího léčiva byl izolován filtrací na fritě S4, promyt 50 ml ethylacetátu a sušen do konstantní hmotnosti.
Charakterizace polymemího konjugátu s léčivem: Celkový výtěžek reakce vazby léčiva: 17,2 g (96 %), obsah celkového DOX 11,3 % hmota., obsah volného DOX méně jak 1,5 % z celkového obsahu DOX.
Příklad 5b: Příprava polymemího konjugátu poly(HPMA-co-AH-NH-N=DEX)
- 13 CZ 309067 B6
Kopolymery s dexamethasonem navázaným k PHPMA nosiči hydrolyticky štěpitelnou hydrazonovou vazbou byly připraveny reakcí kopolymerů obsahujících hydrazidové skupiny poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) s derivátem dexamethasonu, dexamethason oxopropylbenzoátem (DEX), v methanolu za katalýzy octovou kyselinou.
Roztok 1 g kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) v 5 ml methanolu (finální koncentrace 167 mg polymeru/ml) byl smíchán s roztokem 60 mg DEX (0,1 mmol) v 1 ml methanolu. Po 5 h reakce byl polymemí produkt izolován srážením do 200 ml ethylacetátu, precipitát polymemího léčiva byl izolován filtrací na fritě S4, promyt 150 ml ethylacetátu a sušen do konstantní hmotnosti. Obsah celkového DEX byl stanoven pomocí HPLC dle postupu (Krakovičová, Η., T. Etrych, and K. Ulbrich, HPMA-based polymer conjugates with drug combination. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2009. 37(3-4): p. 405-412).
Charakterizace polymemího konjugátu s léčivem: Celkový výtěžek reakce vazby léčiva: 980 mg (92 %), obsah celkového DEX 5,3 % hmotn., obsah volného DEX méně 1,3 % z celkového obsahu DEX.
Analogicky byly připraveny konjugáty poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) s dalšími léčivy nebo jejich deriváty: pirarubicin, epirubicin, oxo-deriváty ritonavim, oxo-deriváty docetaxelu, paklitaxelu a larotaxelu.
Příklad 6: Uvolňování dexamethasonu z polymemího konjugátu poly(HPMA-co-AH-NHN=DEX)
Uvolňování dexamethasonu z konjugátu poly(HPMA-co-AH-NH-N=DEX) bylo prováděno inkubací v 0,1 M fosfátovém pufm obsahujícím 0,15 M NaCl při 37 °C. pH pufm bylo nastaveno na podmínky v endosomech buněk, tj. mírně kyselé prostředí o pH 5,5. Alikvotní podíl inkubačního media byl odebírán v příslušných časových intervalech a obsah DEX byl stanoven po extrakci do chloroformu a po odpaření rozpouštědla a převedení do methanolového roztoku pomocí HPLC (Shimadzu 20VP) na koloně Chromolith C18 s reverzní fází (Chromolith
- 14 CZ 309067 B6
Performance RP-18e; 100 x 4.6 mm) při průtoku eluentu 5 ml/min a s použitím gradientu od 0 do 100 % roztoku B v průběhu 7 min (roztok A: 5 % acetonitril, 94,9 % voda, 0,1 % trifluoroctové kyseliny (TFA); roztok B: 89,9 % acetonitril; 10 % voda; 0,1 %TFA). Pro detekci byl použit PDA detektor (Shimadzu, Japan) (λ = 230 nm). Kalibrační křivka byla sestrojena pomocí DEX.
Výsledky měření uvolňování léčiva z konjugátu jsou uvedeny na obrázku 1.
Příklad 7. Ukázka cytostatické aktivity polymemího konjugátu poly(HPMA-co-AH-NHN=D0X) in vitro
Na prokázání cytostatické aktivity polymemího konjugátu nesoucího doxorubicin poly(HPMAco-AH-NH-N=DOX) z příkladu 5a byly použity buňky několika stabilních nádorových linií různého původu. Byly to myší nádorové linie (CT26 - linie karcinomu střeva, 4T1 - linie karcinomu mléčné žlázy, obě původem z inbredního kmene myší BALB/c, dále EL4.IL-2 - linie T-buněčného lymfomu původem z myšího inbredního kmene C57BL/6) a FaDu - lidská linie dlaždicobuněčného karcinomu hlavy a krku. Buňky byly kultivovány v 96-ti jamkových kultivačních destičkách s různými koncentracemi poly(HPMA-co-AH-NH-N=DOX) po dobu 72 h. Proliferace buněk byla pak stanovena standardní metodou inkorporace 3H-thymidinu, který byl přidán na posledních 6 h kultivace. Následně byly kultury zpracovány pomocí harvestoru Tomtec Mach III, a po usušení byla radioaktivita získaných vzorků změřena beta-scintilačním počítačem Microbeta Trilux (Wallac) s použitím pevného scintilátoru (Meltilex; Perkin Elmer). Výsledky testu jsou vyjádřeny jako hodnota IC50, rovná koncentraci poly(HPMA-co-AH-NH-N=DOX), která je potřebná k indukci právě 50% inhibice růstu (proliferace) daných nádorových buněk (viz tabulka 2). Cytostatická aktivita poly(HPMA-co-AH-NH-N=DOX) z příkladu 5a byla porovnávána s aktivitou poly(HPMA-co-AH-NH-N=DOX), připraveného dle postupu uvedeného v literatuře (Chytil P. et al., Eur. J. Pharm. Sci., 2010, 41, 73-82), a s volným léčivem.
Tabulka 2: Cytostatická účinnost poly(HPMA-co-AH-NH-N=DOX) z příkladu 5a byla porovnávána s aktivitou poly(HPMA-co-AH-NH-N=DOX), připraveného dle postupu uvedeného v literatuře (Chytil P. et al., Eur. J. Pharm. Sci., 2010, 41, 73-82), a volného doxorubicinu u čtyř vybraných nádorových linií. Hodnoty IC50 jsou uvedeny v ng doxorubicinu/ml a byly vypočteny jako průměr z několika nezávislých stanovení.
CT26 4T1 EL4.IL-2 FaDu
Poly(HPMA-co-AH-NH- N=DOX) z příkladu 5a 220,6 103,5 186,5 56
Poly(HPMA-co-AH-NHN=DOX) z Chytil 2010 232,3 101,6 195,1 63
doxombicin 42,5 14,3 12,2 4,8
U všech testovaných linií, a to citlivých vůči doxorubicinu (FaDu) nebo málo citlivých (CT26) je patrné, že cytostatická aktivita obou konjugátů poly(HPMA-co-AH-NH-N=DOX) je dle očekávání nižší než aktivita volného léčiva, avšak hodnoty pro konjugáty, jejichž polymemí nosiče jsou připraveny jinými metodami, se od sebe významně neliší. Uvedené hodnoty ukazují na vysokou cytostatickou aktivitu poly(HPMA-co-AH-NH-N=DOX) z příkladu 5a vůči nádorovým liniím různého původu in vitro.

Claims (7)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob přípravy statistického lineárního kopolymerů obecného vzorce V
    (V), sestávajícího z alespoň 75 % mol. monomemích jednotek HPMA a od 0,5 do 25 % mol., vztaženo na celkový počet monomemích jednotek, strukturních jednotek vzorce I
    /=°
    HN \
    X
    Q=(
    NH — NHO (I), kde X je vybrán ze skupiny sestávající z alkylenu o počtu atomů uhlíku od 1 do 8; fenylenu; -(CH2)q-(C(O)-NH-(CH2)r)p-, kde p=l až 5, a q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; přičemž X může být popřípadě substituován jedním nebo více postranními řetězci přirozené aminokyseliny, vybranými ze skupiny zahrnující methyl, isopropyl, isobutyl, -CH(CH3)(CH2CH3), -CH2OH, -CH(OH)(CH3), -CH2-(C6H4)OH, -(CH2)2-S-CH3, -ch2sh, -(CH2)4-NH2, -CH2COOH, -CH2C(O)NH2, -(CH2)2COOH, -(CH2)2C(O)NH2, -(CH2)3NHC(=NH)(NH2), benzyl, přičemž postranní řetězce mohou být stejné nebo různé;
    x je celé číslo v rozmezí od 25 do 700;
    Ri je radikálová odstupující skupina použitého přenosového činidla, s výhodou je Ri vybraný ze skupiny zahrnující 2-kyano-2-propyl a 5-karboxy-2-kyano-2-pentyl;
    a R2 je thioetherový derivát daný strukturou použité sloučeniny s dvojnou vazbou (C=C) po adici koncových SH skupin polymemího řetězce nebo vzájemnou reakce koncových SH skupin statistického lineárního kopolymerů za vzniku diblokového polymeru spojeného disulfidovou vazbou; s výhodou je R2 vybraný ze skupiny zahrnující 2-(ethenylsulfonyl)ethyl, l-ethyl-2,5dioxopyrrolidin-3-yl, l-(2-hydroxyethyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl, l-(2-propynyl)-2,5dioxopyrrolidin-3-yl, l-(3-karboxy-l-propyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl, l-(2-aminoethyl)-2,5dioxopyrrolidin-3 -yl, 1 -(3 -aminopropyl)-2,5 -dioxopyrrolidin-3 -yl; a
    - 16 CZ 309067 B6
    přičemž molámí hmotnost statistického lineárního kopolymerů je v rozmezí od 4 000 do 100 000 g/mol;
    vyznačený tím, že obsahuje následující kroky:
    a) příprava monomeru obecného vzorce II
    O=( (Π) kde X je definováno výše a Y je hydroxyl, (Cl-C6)alkoxy, benzoxy, 4-nitrofenoxy, 2,3,4,5,6pentafluorfenoxy, sukcinimidylová nebo (Cl-C6)alkylthioskupina nebo thiazolidin-2-thionová skupina; s výhodou je Y vybrán ze skupiny methoxy, ethoxy, terč, -butoxy nebo terč.-butylthio nebo thiazolidin-2-thionová skupina, přičemž monomer obecného vzorce II se připraví reakcí sloučeniny vzorce Y-C(O)-X-NH2, kde X a Y jsou definované výše, s methakryloylchloridem, nebo esterifikací, íhioesterifikaci, či imidací karboxylové skupiny sloučeniny vzorce HO-C(O)-X-NH2, následovaný reakcí výsledného esteru, thioesteru nebo imidu aminokyseliny s methakryloylchloridem, za vzniku monomeru obecného vzorce II;
    b) řízenou radikálovou polymerací s reverzibilně-fragmentačním přenosem řetězce, RAFT, monomeru obecného vzorce II z kroku a) a HPMA v molámím poměru HPMA ku monomeru obecného vzorce II v rozmezí od 75:25 do 99,5:0,5 a při teplotě v rozmezí od 10 do 100 °C za iniciace iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující 2,2'-azobis(2methylpropionitril), 4,4'-azobis(4-kyanopentanová kyselina), 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4dimethylpentannitril); a za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou vybraného ze skupiny zahrnující 2-kyano-2-propylbenzodithioát, 4-kyano-4-(thiobenzoylthio)pentanovou kyselinu, 2kyano-2-propyldodecyltrithiokarbonát, 2-kyano-2-propylethyltrithiokarbonát a 4-kyano-4[(dodecylsulfanylthiokarbonyl)sulfanyl]pentanovou kyselinu;
    c) zavedení hydrazidových skupin za současné modifikace koncových skupin statistického lineárního kopolymerů, přičemž zavedení hydrazidových skupin za současné modifikace koncových skupin statistického lineárního kopolymerů spočívá v převedení skupiny Y na hydrazidovou skupinu reakcí s redukčním činidlem, s výhodou dithiothreitolem, a hydrazinem, a in situ modifikace síru obsahujících koncových skupin polymemího nosiče reakcí se sloučeninou obsahující dvojnou vazbu (C=C), s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující A-substituovaný maleinimid, nebo S-substituovaný vinylsulfon; výhodněji jsou vybrané ze skupiny zahrnující divinylsulfon, karboxy-PEG vinylsulfon, A-ethylmaleinimid, A-(2-hydroxyethyl)maleinimid, Apropargylmaleinimid, 3-maleinimido propionovou kyselinu, azido-PEG-maleinimid a A-(5
    - 17 CZ 309067 B6 fluoresceinyl)-maleinimid; nebo se koncové thiolové skupiny převedou na aminové pomocí Naminoethylmaleinimid trifluoracetátu, nebo /V-(3-aminopropyl)maleinimidtrifluoroacetátu;
    přičemž reakce se provede v inertní atmosféře za teploty místnosti a v rozpouštědle, s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující methanol, ethanol, dimethylsulfoxid, dimethylacetamid a dimethylformamid;
    za vzniku statistického lineárního kopolymeru obecného vzorce III
    h2n (III), kde X je definováno výše;
    x je celé číslo v rozmezí od 25 do 700;
    Ri je radikálová odstupující skupina použitého přenosového činidla, s výhodou je Ri vybraný ze skupiny zahrnující 2-kyano-2-propyl a 5-karboxy-2-kyano-2-pentyl;
    a R2 je thioetherový derivát daný strukturou použité sloučeniny s dvojnou vazbou (C=C) po adici koncových SH skupin polymemího řetězce, s výhodou je R2 vybraný ze skupiny zahrnující 2(ethenylsulfonyl)ethyl, l-ethyl-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl, l-(2-hydroxyethyl)-2,5-dioxopyrrolidin3 -yl, 1 -(2-propynyl)-2,5 -dioxopyrrolidin-3 -yl, 1 -(3 -karboxy-1 -propyl)-2,5 -dioxopyrrolidin-3 -yl, l-(2-aminoethyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl, nebo l-(3-aminopropyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl;
    nebo zavedení hydrazidových skupin za současné modifikace koncových skupin statistického lineárního kopolymeru spočívá v převedení skupiny Y na hydrazidovou skupinu reakcí s redukčním činidlem, s výhodou dithiothreitolem, a hydrazinem, za současné vzájemné reakce koncových SH skupin statistického lineárního kopolymeru za vzniku diblokových polymerů obecného vzorce IV, spojených disulfidovou vazbou;
    IV, přičemž X, x i Ri jsou definované výše;
    - 18 CZ 309067 B6 tedy za vzniku statistického lineárního kopolymeru obecného vzorce (V).
  2. 2. Způsob přípravy podle nároku 1, vyznačený tím, že krokem b) polymerace monomerů je řízená radikálová RAFT polymerizace HPMA s monomerem obecného vzorce II, která se provede v rozpouštědle vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, dioxan, terč, -butylalkohol, vodu, vodný pufr nebo jejich směsi.
  3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se krok b) provede při molámím poměru iniciátor:přenosové čidlo v rozmezí od 1:1 do 1:10 a/nebo se krok b) provede při molámím poměru přenosové činidlo monomery od 1:50 do 1:1000.
  4. 4. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že po kroku c) následuje krok d), ve kterém skupina R2 sloučeniny obecného vzorce (III), obsahující aminoskupinu, reaguje za využití aminoskupiny s esterovou skupinou fluorescenční značky, za vzniku polymemího konjugátu fluorescenční značky a statistického lineárního kopolymeru.
  5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačený tím, že fluorescenční značkou je 2-[5-(l,3-dihydrol,l,3-trimethyl-2H-benz[e]indol-2-yliden)-l,3-pentadien-l-yl]-3-[6-[(2,5-dioxo-lpyrrolidinyl)oxy] -6-oxohexyl] -1,1 -dimethyl- lH-benz[e]indolium.
  6. 6. Způsob přípravy konjugátu statistického lineárního kopolymeru a léčiva pomocí pHsenzitivní hydrolyzovatelné hydrazonové vazby, vyznačený tím, že obsahuje následující kroky:
    a) připraví se statistický lineární kopolymer podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 3;
    b) ke strukturní jednotce obecného vzorce I statistického lineárního kopolymeru, definované v nároku 1, se pomocí hydrazonové vazby naváže léčivo nebo jeho derivát obsahující keto skupinu, za vzniku konjugátu statistického lineárního kopolymeru a léčiva, přičemž navázání léčiva se provede mezi -C(=O)- skupinou léčiva a -NH-NH2 skupinou postranního řetězce statistického lineárního kopolymeru za katalýzy kyselinou octovou za vzniku hydrazonové vazby.
  7. 7. Způsob přípravy podle nároku 6, vyznačený tím, že léčivo je vybrané ze skupiny zahrnující doxorubicin, pirarubicin, epirubicin, taxol, paclitaxel, docetaxel, larotaxel, mitomicín C, dexamethason, ritonavir, nebo jejich oxo-deriváty; nejvýhodněji je léčivo vybrané ze skupiny, zahrnující doxorubicin, dexamethason, pirarubicin, epirubicin, ritonavir, docetaxel, paklitaxel, larotaxel, nebo jejich oxo-deriváty;
    přičemž reakce se provede v rozpouštědle zvoleném z bezvodých alkoholů s počtem uhlíků 1 až 5 nebo polárních aprotických rozpouštědel, s výhodou je rozpouštědlem methanol, ethanol, dimethylformamid, dimethylacetamid nebo dimethylsulfoxid.
CZ2019649A 2019-10-18 2019-10-18 Způsob přípravy polymerních nosičů pro pH-řízené uvolňování léčiv a jejich konjugátů s léčivy CZ309067B6 (cs)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019649A CZ309067B6 (cs) 2019-10-18 2019-10-18 Způsob přípravy polymerních nosičů pro pH-řízené uvolňování léčiv a jejich konjugátů s léčivy
EP20810857.1A EP4045088A1 (en) 2019-10-18 2020-10-16 Method for the preparation of polymeric carriers for ph- controlled drug release and their conjugates with drugs
PCT/CZ2020/050080 WO2021073667A1 (en) 2019-10-18 2020-10-16 Method for the preparation of polymeric carriers for ph- controlled drug release and their conjugates with drugs

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019649A CZ309067B6 (cs) 2019-10-18 2019-10-18 Způsob přípravy polymerních nosičů pro pH-řízené uvolňování léčiv a jejich konjugátů s léčivy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2019649A3 CZ2019649A3 (cs) 2021-04-28
CZ309067B6 true CZ309067B6 (cs) 2022-01-12

Family

ID=73497482

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2019649A CZ309067B6 (cs) 2019-10-18 2019-10-18 Způsob přípravy polymerních nosičů pro pH-řízené uvolňování léčiv a jejich konjugátů s léčivy

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4045088A1 (cs)
CZ (1) CZ309067B6 (cs)
WO (1) WO2021073667A1 (cs)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ2021423A3 (cs) * 2021-09-13 2023-03-22 Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. Fluorescenčně značený polymer pro vizualizaci nádorů, způsob jeho přípravy a jeho použití

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ2016206A3 (cs) * 2016-04-11 2017-11-01 Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. Blokový kopolymer pro překonání lékové rezistence nádorů k chemoterapii, jeho polymerní konjugát s léčivem, farmaceutická kompozice je obsahující, způsob jejich přípravy a jejich použití

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ2016206A3 (cs) * 2016-04-11 2017-11-01 Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. Blokový kopolymer pro překonání lékové rezistence nádorů k chemoterapii, jeho polymerní konjugát s léčivem, farmaceutická kompozice je obsahující, způsob jejich přípravy a jejich použití

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Blažková: „Dopravní systémy na bázi syntetických hydrofilních polymerů pro přenos a řízené uvolňování siRNA" Přírodovědecká fakulta UK, Praha 2015 *
M. Bittner: "Hvězdicovité polymerní nosiče léčiv pro cílenou dopravu a pH-řízené uvolňování léčiva" Přírodovědecká fakulta UK, Praha 2013 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4045088A1 (en) 2022-08-24
WO2021073667A1 (en) 2021-04-22
CZ2019649A3 (cs) 2021-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Etrych et al. Synthesis of HPMA copolymers containing doxorubicin bound via a hydrazone linkage. Effect of spacer on drug release and in vitro cytotoxicity
Šubr et al. Synthesis and properties of new N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide copolymers containing thiazolidine-2-thione reactive groups
Chytil et al. N-(2-Hydroxypropyl) methacrylamide-based polymer conjugates with pH-controlled activation of doxorubicin for cell-specific or passive tumour targeting. Synthesis by RAFT polymerisation and physicochemical characterisation
EP1922087B1 (en) Method for the preparation of polymeric conjugates of doxorubicin with ph-controlled release of the drug
Etrych et al. Conjugates of doxorubicin with graft HPMA copolymers for passive tumor targeting
US7041818B2 (en) DDS compound and method for measurement thereof
JP5687899B2 (ja) 生理活性物質の高分子結合体
Dvořák et al. High-molecular weight HPMA copolymer–adriamycin conjugates
EP2063914B1 (en) Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation
Etrych et al. HPMA copolymer conjugates with reduced anti-CD20 antibody for cell-specific drug targeting. I. Synthesis and in vitro evaluation of binding efficacy and cytostatic activity
CZ309067B6 (cs) Způsob přípravy polymerních nosičů pro pH-řízené uvolňování léčiv a jejich konjugátů s léčivy
EP2049157B1 (en) Polymeric conjugates of doxorubicin with ph-regulated release of the drug and a method of preparing
EA007353B1 (ru) pH-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ КОНЪЮГАТЫ АНТРАЦИКЛИНОВЫХ КАНЦЕРОСТАТИЧЕСКИХ АКТИВНЫХ АГЕНТОВ ДЛЯ ТЕРАПИИ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ
Mahkam et al. Synthesis and characterization of acrylic type hydrogels containing azo derivatives of 5-amino salicylic acid for colon-specific drug delivery
Sintov et al. Polymeric drug delivery of enzymatically degradable pendant agents: Peptidyl-linked procainamide model system studies
CZ308419B6 (cs) Blokový kopolymer pro překonání lékové rezistence nádorů k chemoterapii, jeho polymerní konjugát s léčivem, farmaceutická kompozice je obsahující, způsob jejich přípravy a jejich použití
Kotrchová et al. Synthesis of water-soluble star polymers based on cyclodextrins
CZ309634B6 (cs) Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo
CZ2020132A3 (cs) Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo
CZ2020137A3 (cs) Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo
CZ309738B6 (cs) Glykopolymer, způsob jeho přípravy a jeho použití jako léčivo
Babazadeh et al. Synthesis, characterization and in-vitro evaluation of novel polymeric prodrugs of mefenamic acid
WO2021121446A1 (en) Copolymer with hydrolytic release of cancerostatic agent cytarabine, method of its preparation and use thereof
WO2021047699A1 (en) Glycopolymer, method of preparation thereof, use thereof as medicament
CN115286669A (zh) 抗体-高分子-药物偶联物的制备方法及应用