CZ310444B6 - Fluorescenčně značený polymer pro vizualizaci nádorů a jeho použití - Google Patents

Fluorescenčně značený polymer pro vizualizaci nádorů a jeho použití Download PDF

Info

Publication number
CZ310444B6
CZ310444B6 CZ2021-423A CZ2021423A CZ310444B6 CZ 310444 B6 CZ310444 B6 CZ 310444B6 CZ 2021423 A CZ2021423 A CZ 2021423A CZ 310444 B6 CZ310444 B6 CZ 310444B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
group
fluorescent
general formula
copolymer
groups
Prior art date
Application number
CZ2021-423A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2021423A3 (cs
Inventor
Tomáš Etrych
Ph.D. DSc Etrych Tomáš RNDr.
Robert POLA
Pola Robert Ing., Ph.D
Eliška Grosmanová
Eliška Ing Grosmanová
Michal Pechar
CSc. Pechar Michal Ing.
Dominik Horák
Dominik Bc. Horák
Original Assignee
Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. filed Critical Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.
Priority to CZ2021-423A priority Critical patent/CZ310444B6/cs
Priority to PCT/CZ2022/050088 priority patent/WO2023036351A1/en
Publication of CZ2021423A3 publication Critical patent/CZ2021423A3/cs
Publication of CZ310444B6 publication Critical patent/CZ310444B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0054—Macromolecular compounds, i.e. oligomers, polymers, dendrimers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0058—Antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/56—Acrylamide; Methacrylamide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/58—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-(meth)acryloylmorpholine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/58—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-(meth)acryloylmorpholine
    • C08F220/585—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-(meth)acryloylmorpholine and containing other heteroatoms, e.g. 2-acrylamido-2-methylpropane sulfonic acid [AMPS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/60—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/60—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen
    • C08F220/603—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen and containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen and nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/60—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen
    • C08F220/606—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen and containing other heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Předkládané řešení se týká fluorescenčního polymeru, na který je navázána fluorescenční značka v množství od 0,1 do 10 mol. %, a jehož fluorescence je aktivována v nádorové tkáni pro zajištění signifikantní vizualizace nádorové tkáně pro diagnostické postupy anebo pro obrazem řízenou navigovanou chirurgii. S výhodou je fluoresceční polymer směrován specifickými molekulami k nádorovým buňkám a nádorové neovaskulatuře. Předkládané řešení se dále týká způsobu výroby fluorescenčního polymeru a jeho použití jako fluorescenční sondy v lékařské diagnostice jako kontrastní látka pro vizualizaci nádorů, celotělové zobrazování a/nebo pro obrazem naváděnou chirurugii.

Description

Fluorescenčně značený polymer pro vizualizaci nádorů a jeho použití
Oblast techniky
Vynález se týká směrovaného fluorescenčního polymeru s aktivovatelnou fluorescencí složeného z polymemího nosiče s postranními řetězci s fluorofory určeného pro vizualizaci nádorové tkáně. Využití polymeruje zaměřeno na zvýraznění nádorové tkáně pro následné chirurgické odstranění nebo neinvazivní sledování průběhu nádorového onemocnění.
Dosavadní stav techniky
Precizní a úplná resekce celého nádoru bez zbytečného odstranění sousední zdravé tkáně je předpokladem úspěšného výsledku onkologické operace. Bohužel vizuální rozlišení mezi maligní a zdravou tkání pouhým okem je pro chirurga často velmi složité, až nemožné. Nicméně, radikální resekce s adekvátními negativními okraji je jedním z nej důležitějších faktorů ovlivňujících prognózu pacientů například se spinocelulámím karcinomem hlavy a krku (Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, HNSCC). Obvykle je bezpečný okraj definován jako větší než 5,0 mm. V kontextu onkologické endoskopické chirurgie zůstává i nadále klíčovou otázkou přesné nastavení hranic nádoru. V tuto chvíli je možné pro zobrazování okrajů nádoru částečně využít neinvazivní zobrazování, jako je například autofluorescence (AF) nádorových tkání. Nicméně metoda využívající AF není přesná a využívá se jen u některých typů nádorových onemocnění. Metoda, která by spolehlivě fungovala pro vedení chirurga během operace v tuto chvíli neexistuje. Fluorescenční zobrazování (Fluorescence Imaging, FI) je založeno na osvětlení tkáně světlem, které excituje blízké infračervené (Near-infrared, NIR) nebo krátko-vlnné infračervené (Short-wave infrared, SWIR) fluorofory nebo kontrastní látky. Vzhledem k prostupnosti světla v NIR a SWIR oblasti tkáněmi, až několik cm, je možné tyto fluorofory použít i pro vizualizaci v rámci označení nádorových ložisek.
V posledních několika desetiletích byly různé polymemí materiály studovány jako biokompatibilní, neimunogenní a netoxické biomateriály pro medicínské aplikace. Byly a jsou studovány biomateriály navržené jako vektory pro dopravu biologicky aktivních molekul, materiály pro tkáňové inženýrství a diagnostiku. Intenzivně se studují systémy pro cílenou dopravu a řízené uvolňování léčiv, tzv. drug delivery systémy (DDS), ve kterých jsou polymemí formy léčiv studovány jako nové formulace „klasických“ léčiv s cílem zajistit navýšenou terapeutickou funkci pro antineoplastickou, protizánětlivou a antimikrobiální léčbu při současném odstranění vedlejších účinků léčby. Mnoho popsaných DDS je založeno na vodorozpustných nebo amfifílních polymemích nosičích nesoucích aktivní molekuly s nízkou molekulovou hmotností, např. kovalentně vázané biologicky rozložitelnými spojky, určené pro řízené uvolňování a aktivaci nesených aktivních molekul v požadovaných tkáních nebo buňkách. Velká pozornost byla zaměřena na biokompatibilní, netoxické a neimunogenní kopolymery na bázi A-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (pHPMA), poly(ethylenglykol)u (PEG), poly (kaprolakton)u (PCL), póly (laktidová kyselina)/poly (kyselina laktid-ko-glykolid) (PLA/PLGA) a jejich kopolymery jako nosiče biologicky aktivních molekul a směrujících skupin. Obecně jsou polymemí nosiče bioaktivních molekul navrženy tak, aby optimalizovaly farmakokinetiku aktivních molekul, prodloužily dobu jejich krevní cirkulace, zlepšily lokalizaci v nádorech, zánětech a/nebo požadovaných buňkách, snížily vedlejší toxicitu a imunogenitu a solubilizovaly ve vodě nerozpustné aktivní molekuly. Aktivní nesené molekuly mohou být uvolňovány/aktivovány enzymatickou hydrolýzou, redukcí nebo hydrolýzou vyvolanou pH snížením pH ze 7,4 (krev) na 5 až 6,5 (endozomy/lysozomy; nádorové mikroprostředí; zánětlivé prostředí). Pro zvýšení akumulace v cílové tkáni, např. nádorové tkáně, a současné minimalizace vedlejších účinků jsou studovány cílené systémy obsahující směmjící skupiny, např. protilátky nebo oligopeptidy, nebo systémy se strukturou a velikostí umožňující „pasivní“ cílení založené
- 1 CZ 310444 B6 na efektu EPR (zvýšená permeabilita a retence) za použití nosičů s vysokou molekulovou hmotností (HMW), např. hvězdicové polymery, nanočástice nebo micely.
V nedávné době byla vyvinuta polymemí terapeutika a diagnostika založená na pHPMA, která mají zvýšenou akumulaci v pevných nádorech. U těchto systémů, terapeutik nesoucích protinádorová léčiva, např. doxorubicin, paclitaxel, byla zjištěna protirakovinná aktivita u různých nádorových modelů u myší. Polymemí systémy obsahující léčivo i fluorescenční značku navázanou napevno byly nejen terapeuticky aktivní, ale byly schopny sledovat vývoj nádoru pomocí fluorescenčního zobrazování (FI). V nedávné době byly popsány lineární pHPMA konstrukty obsahující NIR barvivo Dyomics-782 a EGF (epidermal growth factor) cílící oligopeptidy GE-7 a GE-11. Studie biodistribuce in vivo ukázala velmi slibné výsledky ve vizualizaci nádoru. Polymemí sonda byla lokalizována hlavně na hranici nádoru, což ukazuje potenciál pro obrazem řízenou chimrgii.
V nedávné době byly popsány vysokomolekulámí dopravní systémy pro fluorescenční zobrazování a nádorovou chimrgii, například WO 2020/245447 AI (fluorescenční polypeptidy). Tyto vysokomolekulámí systémy slouží pro zobrazování nádorové tkáně a sice splňují podmínku biokompatibility a vyloučitelnosti, avšak žádný nepřináší selektivní zvýšení fluorescence lokálně v nádorové tkáni.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká směrovaného fluorescenčního polymeru, který tvoří polymemí sondu s možností aktivace fluorescenčního signálu v místě nádorového ložiska. Fluorescenční polymer podle předkládaného vynálezu umožňuje cílenou akumulaci v nádorové tkáni a na ni navazující aktivaci fluorescenčního signálu pro vizualizaci nádorů. Samotný polymemí systém obsahuje polymemí nosič, fluorescenční značku navázanou vazbou, která je v nádorovém prostředí hydrolyticky, enzymaticky nebo reduktivně degradovatelná, případně dále směrující skupinu k nádorovým nebo endoteliálním buňkám a případně zhášeč fluorescence. Výsledný fluorescenční polymer umožňuje amplifíkaci signálu a dosažení významného kontrastu nádorová/zdravá tkáň v okolí nádom tím, že dojde k aktivaci fluorescence dopravované značky až v nádorové tkáni. Zatímco výtěžek fluorescence fluorescenční značky významně klesne po navázání fluorofom na polymemí nosič, a to z důvodu samozhášení fluorescenčních molekul lokalizovaných v blízkém okolí z důvodu nezářivého přenosu energie mezi fluorofory, po uvolnění značky z polymemího nosiče v nádorové tkáni se fluorescenční signál opět obnovuje, což vede k významnému nárůstu poměm signál versus šum právě v nádorovém prostředí. Tento překvapivý efekt zvýšení kontrastu fluorescenčního signálu mezi zdravou a nádorovou tkání nebyl dosud popsán. Kopolymery na bázi A-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) jsou vhodnými prekurzory pro přípravu popsaných fluorescenčních polymerů s aktivovatelnou fluorescencí. Podél řetězce tohoto kopolymem jsou zavedeny funkční skupiny, na které lze navázat vhodné deriváty fluoroforů přes biodegradovatelné spojky a směrující skupiny. Celý systém podle předkládaného vynálezu tak umožňuje zvýšení vizualizace nádorových ložisek pro následnou chimrgickou resekci navigovanou fluorescenčním signálem. Dalším využitím je aplikace fluorescenčních polymerů pro sledování progrese a regrese nádorových onemocnění během léčby jinou terapií. S výhodou je možné fluorescenční polymery využít u nádorů, které nejsou lokalizovány v hloubce tkáně nebo které vyžadují endoskopické techniky, např. nádory hlavy a krku, prsou, kolorektální nádory a melanomy.
Předmětem předkládaného vynálezu je fluorescenční polymer využitelný pro vizualizaci nádorů, který obsahuje semitelechelický statistický lineární kopolymer poly(A-(2hydroxypropyljmethakrylamidu), ve kterém je od 0,1 do 10 % mol. monomemích jednotek, s výhodou 0,4 až 6 % mol. monomemích jednotek, výhodněji 0,5 až 4 % mol. monomemích jednotek, vztaženo na celkový počet monomemích jednotek, statisticky nahrazeno monomemími jednotkami obecného vzorce I
-2CZ 310444 B6
(I), kde p je celé číslo v rozmezí od 1 do 5, a r je vybráno z 1, 2 a 3;
Y je kovalentní vazba nebo -(CH2)P-C(O)-NH-(CH2)P-L-;
a kde L je triazolová spojka vzniklá reakcí DBCO skupiny s azidovou skupinou;
přičemž jeden nebo více vodíkových atomů v CH2 skupinách řetězce -Y-(CH2)P-(C(O)-NH(CH2)r)P-C(O)-NH-C6H4-CH2-O-C(O)- monomemí jednotky I může být dále substituován stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny, vybranými ze skupiny sestávající z methylu, isopropylu, isobutylu, -CH(CH3)(CH2CH3). -CH2OH, -CH(OH)(CH3), -CH2-(C6H4)OH, -(CH2)2-S-CH3, -CH2SH, -(CH2)4-NH2, -CH2COOH, -CH2C(O)NH2, -(CH2)2COOH, -(CH2)2C(O)NH2, -(CH2)3NH-C(=NH)(NH2), -(CH2)3NH-C(=O)(NH2); benzylu;
a přičemž fluorofor (fluorofor nebo jeho aminoderivát, NCS ester nebo Nhydroxysukcinimidylový derivát) má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1500 g/mol, excitační vlnovou délku v rozmezí od 300 do 850 nm a emisní vlnovou délku v rozmezí od 350 do 1200 nm, a je kovalentně vázán k monomemí jednotce obecného vzorce I semitelechelického statistického lineárního kopolymeru přes svou primární aminoskupinu, nebo NCS skupinu, Nhydroxysukcinimidylovou skupinu, keto skupinu, aldehydovou skupinu nebo disulfidovou skupinu;
a přičemž molekulová hmotnost Mn fluorescenčního polymeru je v rozmezí od 6000 do 100 000 g/mol, s výhodou od 10 000 do 60 000 g/mol, výhodněji od 15 000 do 40 000 g/mol (což odpovídá 100 až 280 monomemím jednotkám), výhodněji od 20 000 do 30 000 g/mol (což odpovídá 134 až 210 monomemím jednotkám).
Fluorofor je tedy k postrannímu řetězci semitelechelického statistického lineárního kopolymeru navázaný labilní peptidovou spojkou (Val-Cit (-NH-CH(C(CH3)2)-C(=O)-NH-CH((CH2)3-NHC(=O)-NH2)-C(=O)-), Val-Cit-Aba spojkou (-NH-CH(C(CH3)2)-C(=O)-NH-CH((CH2)3-NHC(=O)-NH2)-C(=O)-NH-C6H4-CH2-O-C(=O)-), která je v nádorovém prostředí enzymaticky degradovatelná.
Přirozenými aminokyselinami se rozumí histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin, threonin, tryptofan, valin, arginin, cystein, glutamin, glycin, prolin, tyrosin, alanin, asparagová kyselina, asparagin, glutamová kyselina, serin, selenocystein. Postranními řetězci jsou řetězce navázané na alfa-uhlíku aminokyseliny.
Termín „alkylenyl“ značí dvouvazný lineární nebo rozvětvený uhlíkový řetězec, například -CH2-, -(CH2)2-, -(CH2)5- nebo -(CH2)2-(CH(CH3))-CH2-.
- 3 CZ 310444 B6
Fluoroforem je míněna organická molekula s alespoň jedním aromatickým jádrem schopná fluorescence, připojená k monomemí jednotce I kovalentní vazbou. Fluoroforem je fluorescenční značka nebo její derivát, obsahující amino skupinu, keto skupinu nebo S-S vazbu, přidané do struktury fluoroforu reakcí fluorescenční značky s vybranou oxokyselinou nebo činidlem obsahujícím aktivovaný disulfíd, například reakcí s 3-(2-pyridyldithio)propionátem, 5-cyklohexyl-5-oxopentanovou kyselinou, 4-(2-oxopropyl)benzenkarboxylovou kyselinou a 4-oxo-4-(2-pyridyl)butanovou kyselinou.
Ve výhodném provedení je fluorofor jednovazný zbytek odvozený od sloučeniny, vybrané ze skupiny zahrnující:
(2E)-2-[(E)-3-(7-azaniumyliden-2-terc-butylchromen-4-yl)prop-2-enyliden]-l-[6-(2,5dioxopyrrolidin-l-yl)oxy-6-oxohexyl]-3,3-dimethylindol-5-sulfonát (DY-615), 2-[3-[2-tercbutyl-7-[ethyl(3-sulfonatopropyl)azaniumyliden]chromen-4-yl]prop-2-enyliden]-l-(5karboxypentyl)-3,3-dimethylindol-5-sulfonát sodný (DY-633), 3-(3-karboxypropyl)-2-[3-(9ethyl-6,8,8-trimethyl-2-fenylpyrano [3,2-g]chinolin-4-yliden)prop-1 -enyl] -3 -methyl-1 -(3 sulfonatopropyl)indol-l-ium-5-sulfonát sodný (DY-676), 3-(3-karboxypropyl)-2-[3-[8,8dimethyl-2-fenyl-6-(sulfonatomethyl)-9-(3-sulfonatopropyl)pyrano[3,2-g]chinolin-4-yliden]propl-enyl]-3-methyl-l-(3-sulfonatopropyl)indol-l-ium-5-sulfonát sodný (DY-678), 2-\5-(2-tercbutyl-7-diethylazaniumylidenchromen-4-yl)penta-2,4-dienyliden] -1 -(5 -karboxypentyl)-3,3 dimethylindol-5-sulfonát (DY-730), 2-[5-(2-íerc-butyl-9-ethyl-6,8,8-trimethylpyrano[3,2g]chinolin-4-yliden)penta-1,3 -dienyl] -1 -(5 -karboxypentyl)-3,3 -dimethylindol-1 -ium-5 -sulfonát sodný (DY-750), 3-(3-karboxypropyl)-2-[5-(9-ethyl-6,8,8-trimethyl-2-fenylpyrano[3,2g]chinolin-4-yliden)penta-1,3 -dienyl] -3 -methyl-1 -(3 -sulfonatopropyl)indol-1 -ium-5 -sulfonát sodný (DY-776), 2-[5-[4-íerc-butyl-7-[ethyl(3-sulfonatopropyl)azaniumyliden]chromen-2yl]penta-2,4-dienyliden]-3-(3-karboxypropyl)-3-methyl-l-(3-sulfonatopropyl)indol-5-sulfonát sodný (DY-782), l-[2-[dimethoxy(fenyl)methyl]fenoxy]-3,4-difenylisochinolin (CY-7), IHbenz[e]indolium, 2-|2-|3-|2-( 1.3-dihydro-l. l.3-trimcthyl-2//-bcnz|c|indol-2-ylidcn)cthylidcn|-lcyklohexen-1 -yl] ethenyl] -3 -[6-[(2,5 -dioxo-1 -pyrrolidinyl)oxy] -6-oxohexyl] -1,1dimethylisochinolin (CY-7.5), 4-[(2E)-2-[(2E,4E,6E)-7-[l,l-dimethyl-3-(4sulfonatobutyl)benzo[e]indol-3-ium-2-yl]hepta-2,4,6-trienyliden]-l,l-dimethylbenzo[e]indol-3yl]butan-l-sulfonát sodný (ICG), 2,3,5-trichlor-4-[2-[[6-(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)oxy-6oxohexyl]amino]-2-oxoethyl]sulfanyl-6-[6,7,7,19,19,20-hexamethyl-9,17-bis(sulfonatomethyl)2-oxa-20-aza-6-azoniapentacyklo[12.8.0.03,12.05,10.016,21]dokosa-l(14),3,5,8,10,12,15,17,21nonaen-13-yl]benzoát (Alexa Fluor 610), popřípadě jejich deriváty obsahující funkční skupinu, vybranou z amino skupiny, isothiokyanátové skupiny a A-hydroxysukcinimidové skupiny. Popřípadě jsou fluorofory modifikovány oxokyselinami za využití amidické reakce aminoskupiny fluoroforu s aktivovaným karboxylem oxokyseliny, výsledným produktem je oxoderivát fluoroforu. Popřípadě je fluorofor modifikován cystaminem s využitím amidické vazby mezi cystamínem a fluoroforem. Popřípadě je fluorofor modifikován pomocí A-(5-Azidopentanoyl-valyl-citrulyl)-4-aminobenzyl (4nitrofenyl) karbonátu nebo pomocí A-(5-Azidopcntanoyl-valyl-citrulylu reakcí sjeho aminoskupinou.
Příkladem fluoroforu, který lze úspěšně navázat do obecného vzorce I, jsou komerčně dostupné: DY-782, DY-782-NHS ester, DY-728-karboxylová kyselina, DY-728-maleimid, DY-728-amin, DY-728-azid, DY-676, DY-676-NHS ester, DY-676-karboxylová kyselina, DY-676-maleimid, DY-676-amin, Cy7, Cy7-NHS ester, Cy7-amin, Cy7,5, Cy7,5-NHS ester, Cy7,5-amin, Cy7,5azid. Fluorofor může být navázaný přes oligopeptidovou spojku o počtu aminokyselin 2 až 5 enzymaticky degradovatelnou lysosomálními enzymy, které umožňující kontrolované uvolnění fluoroforu v nádorovém prostředí. Oligopeptidovou spojkou o počtu aminokyselin 2 až 5 může být například Val-Cit nebo Val-Cit-Aba.
-4CZ 310444 B6
Koncové skupiny výsledného fluorescenčního polymeru obsahují části molekul iniciátoru polymerizace a přenosového činidla. Iniciátorem může být například 2.2'-azobis|A-(2karboxyethyl)-2-methylpropionamidin] (V-70)) a přenosovým činidlem může být například N-(3azidopropyl)-4-ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-4-methyl-pentanamid (CTA-N3)), popřípadě jejich deriváty vzniklé reakcí například s 2,2'-azobisisobutyronitrilem (AIBN). Koncové skupiny kopolymeru tudíž obsahují azidovou skupinu, která může být následně dále modifikována reakcí s dibenzocyklooktyn-maleinimidem (DBCO-MI) na další maleinimidovou reaktivní funkční skupinu, reakcí s dibenzocyklooktyn-karboxylem (DBCO-Cbx), který se následně modifikuje thiazolidin-2-thionem na thiazolidin-2-thionovou reaktivní funkční skupinu, reakcí s dibenzocyklooktyn-A-hydroxysukcinimidylesterem (DBCO-NHS) na Nhydroxysukcinimidylesterovou reaktivní funkční skupinu.
Výše definovaný fluorescenční polymer je při biodistribuci směrovaný do tkání pevných nádorů díky své vysoké molekulové hmotnosti a tím delší době cirkulace, během které se fluorescenční polymer akumuluje v pevných nádorech (EPR efekt - Enhanced Permeability and Retention Effect).
V jednom provedení fluorescenční polymer dále obsahuje směrující skupiny pro posílení směrování fluorescenčního polymeru do nádorových tkání. Tyto směrující skupiny mohou být navázány na koncové skupiny lineárního řetězce fluorescenčního polymeru a/nebo mohou být navázány na postranní řetězce.
Směrující skupina pro směrování fluorescenčního polymeru k nádorovým buňkám nádorů hlavy a krku, prsním nádorům, melanomům a kolorektálním nádorům nebo k buňkám nádorového endothelia, je vybraná ze skupiny zahrnující oligopeptidy o počtu aminokyselin od 3 do 20, a proteiny, s výhodou protilátky, výhodněji monoklonální protilátky, směrující k nádorovým buňkách nádorů hlavy a krku, prsním nádorům, melanomům a kolorektálním nádorům nebo k buňkám nádorového endothelia.
Ve výhodném provedení jsou oligopeptidy o počtu aminokyselin od 3 do 20 vybrané ze skupiny, zahrnující YESIKVAVS, SIGYPLP, RGD a cRGD (nádorové endothelium), CPLHQRPMC (nádory prostaty), NPVVGYIGERPQYRDL zvaný GE7 a YHWYGYTPQNVI zvaný GE11 (k EGF receptoru), WHYPWFQNWAMA (buňky nádorů hlavy a krve), DMPGTVLP (nádory prsu), CNGRC, cyklickým RGDfK, HEWSYLAPYPWF a SYSMEHFRWGKPV. Oligopeptidy a proteiny, které směrují k nádorovým tkáním v těle, jsou odborníkovi v oboru známé.
Ve výhodném provedení jsou monoklonální protilátky vybrané ze skupiny zahrnující herceptin, erbitux, daratuzumab, trastuzumab.
V provedení, kde jsou směrující skupiny navázané na koncové skupiny lineárního řetězce fluorescenčního polymeru, jsou tyto směrující peptidy a/nebo proteiny navázány konjugací aminoskupiny nebo zavedené propargylové, DBCO nebo SH skupiny směrujícího peptidu/proteinu s azidovou, maleinimidovou, thiazolidin-2-thionovou nebo Nhydroxysukcinimidylesterovou koncovou skupinou lineárního řetězce fluorescenčního polymeru.
V provedení, kde jsou směrující skupiny navázané na postranní řetězce fluorescenčního polymeru, obsahuje fluorescenční polymer definovaný výše rovněž monomemí jednotky obecného vzorce II
- 5 CZ 310444 B6
CH 3
ΗΝ ° (He 1 \ - # Mf V ' ·, Κ/ 'fcHjA) '''ζ \· ί λ Cjj ο (Π), kde L je definované výše; přičemž jeden nebo více vodíkových atomů v CH2 skupinách řetězce (CH2)p-(C(O)-NH-(CH2)r)p- monomemí jednotky II může být dále substituován stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny, vybranými ze skupiny sestávající z methylu, isopropylu, isobutylu, -CHiCHfliCFFCH,). -CH2OH, -CH(OH)(CH3), -CH2-(CeH4)OH, -(CH2)2-S-CH3, -CH2SH, -(CH2)4-NH2, -CH2COOH, -CH2C(O)NH2, -(CH2)2COOH, -(CH2)2C(O)NH2, -(CH2)3NH-C(=NH)(NH2), -(CH2)3NH-C(=O)(NH2); benzylu;
a kde Z je směrující skupina pro směrování fluorescenčního polymeru k nádorovým buňkám nádorů hlavy a krku, prsním nádorům, melanomům a kolorektálním nádorům nebo k buňkám nádorového endothelia, rovněž definovaná výše.
V tomto provedení je množství monomemích jednotek obecného vzorce II od alespoň jedné monomemí jednotky do 8 % mol., vztaženo na celkový počet monomemích jednotek.
Celkem je monomemích jednotek obecného vzorce I a II ve fluorescenčním polymem nejvýše 10 % mol., vztaženo na celkový počet monomemích jednotek.
Směmjící skupina může být před konjugací s fluorescenčním polymerem popřípadě modifikována tak, aby obsahovala alespoň jednu skupinu, vybranou z -NH2, -SH, sDBCO (sulfodibenzocyklooktynová skupina), DBCO (dibenzocyklooktynová skupina), azid, propargyl, ke které je fluorescenční polymer kovalentně navázán pomocí funkční skupiny, s výhodou vybrané z 7V-hydroxysukcinimidylového estem, thiozolidin-2-thionového amidu, malenimidu, azidu, DBCO, sDBCO, nebo propargylu. Modifikace oligopeptidů a proteinů s cílem zavést do struktury -NH2, -SH, sDBCO, DBCO nebo azid jsou odborníkovi v obom známé.
Fluorescenční polymer může dále obsahovat od 0 do 9,9 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce III, vztaženo na celkový počet monomemích jednotek,
Λ·.”. O
HN A C (III), kde A je vybrané ze skupiny sestávající z lineárního nebo rozvětveného uhlíkového alkylenylového řetězce s počtem uhlíků od 1 do 7 a Cje vybrané ze skupiny zahmující-S-S(CH2)2-OH , -C(=O)-NH-(CH2)a-CH2(OH); -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)-CH3; -C(=O)-NH(CH2)b-CH(OH)-(CH2)c-CH3; a -NH-C(=O)-CH3, přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo
-6CZ 310444 B6 od 0 do 3 a c je celé číslo od 1 do 4; a přičemž celkem je monomemích jednotek obecného vzorce I, II a III ve fluorescenčním polymeru nejvýše 10 % mol., vztaženo na celkový počet monomemích jednotek.
S výhodou je substituent C vybraný ze skupiny zahrnující -C(=O)-NH-CH2(OH); -C(=O)-NHCH(OH)-CH3; -C(=O)-NH-(CH2)2-CH2(OH); -NH-C(=O)-CH3.
V jednom provedení je fluorescenčním polymerem lineární statistický kopolymer HPMA a monomemích jednotek obecného vzorce I, popřípadě II a III. Tento lineární statistický kopolymer lze zobrazit obecným vzorcem IV, přičemž molekulová hmotnost Mn statistického lineárního kopolymem je v rozmezí od 6000 do 100 000 g/mol, s výhodou v rozmezí od 15 000 do 45 000 g/mol (což odpovídá 100 až 300 monomemím jednotkám), výhodněji je molekulová hmotnost v rozmezí od 20 000 do 40 000 g/mol (což odpovídá 134 až 280 monomemím jednotkám);
(IV), kde A, C, Z, Y, L a fluorofor jsou definované výše, kde celkový počet monomemích jednotek ve fluorescenčním polymeru je v rozmezí od 100 do 300, zastoupení jednotek obecného vzorce I je v tomto statistickém lineárním kopolymem od 0,1 do 10 mol %, vztaženo na celkový počet monomemích jednotek, což odpovídá počtu 1 až 30 monomemích jednotek obecného vzorce I, a zastoupení jednotek obecného vzorce II je v tomto statistickém lineárním kopolymem od 0 do 8 % mol, vztaženo na počet monomemích jednotek, což odpovídá počtu 0 až 24 monomemích jednotek obecného vzorce II, a zastoupení jednotek obecného vzorce III je v tomto statistickém lineárním kopolymem od 0 do 9,9 % mol, vztaženo na počet monomemích jednotek, což odpovídá počtu 0 až 29 monomemích jednotek obecného vzorce III, přičemž celkem je monomemích jednotek obecného vzorce I a II a III nejvýše 10 % mol., vztaženo na celkový počet monomemích jednotek, což odpovídá maximálnímu celkovému počtu 30 jednotek vzorce I + vzorce II + vzorce III. Zbývající monomemí jednotky v počtu cca od 270 do 298 jsou monomemí jednotky HPMA. Koncové skupiny výsledného lineárního kopolymem obecného vzorce IV obsahují části molekul iniciátom polymerizace a přenosového činidla, jak bylo uvedeno výše.
Fluorescenční polymer je semitelechelickým statistickým lineárním kopolymerem, který lze připravit radikálovou polymerizací. Koncové skupiny výsledného lineárního kopolymem jsou zablokované například 2,2'-azobisisobutyronitrilem (AIBN).
Způsob přípravy fluorescenčního polymeru (fluorescenčního polymeru s aktivovatelnou fluorescencí a popřípadě s navázanou směrující skupinou) obsahuje následující kroky:
a) poskytnutí monomem fluorescenčního polymeru,
-7 CZ 310444 B6
b) polymerace těchto monomerů,
c) navázání fluoroforu na statistický lineární kopolymer,
d) volitelně navázání směrující struktury na fluorescenční polymer, přičemž směrující strukturuje vybraná ze skupiny zahrnující oligopeptidy s počtem aminokyselin od 3 do 20 a proteiny, zejména monoklonální protilátky; přičemž směrující struktura může být navázána na konec lineárního řetězce a/nebo na postranní řetězce fluorescenčního polymery (jako součást monomemí jednotky obecného vzorce II).
ad a) Poskytnutí monomerů lineárního kopolymeru zahrnuje poskytnutí N-(2hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA), a monomeru obecného vzorce V
HAL CH3
A
D (V), které jsou prekurzorem pro monomemí jednotky obecného vzorce I, II a III, přičemž A je definované výše;
a D je -karbonyl-thiazolin-2-thionová skupina (TT), (4-nitrofenyl)oxy skupina, (2,3,4,5,6pentafluorfenyl)oxy skupina, (sukcinimidyl)oxy skupina, karboxylová, hydrazidová, azidová, aktivovaná disulfidová skupina nebo NH2-skupina. Aminoskupina a hydrazidová skupina může být popřípadě chráněná chránící skupinou, například terc-butoxykarbonylovou (Boc) chránící skupinou. Karbonylem se rozumí -C(=O)- skupina.
A-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) je komerčně dostupný. Poskytnutím tohoto monomem se tedy rozumí jeho komerční získání.
Látky obecného vzorce V byly buď získány z komerčně dostupných zdrojů, např. methakryolyl6-aminopropylamin chráněný na aminových skupinách íerc-butyloxykarbonylovými skupinami (MA-Pr-NH-Boc), nebo byly připraveny podle postupů uvedených literatuře (Etrych T., et al., N(2-Hydroxypropyl)methacrylamide-Based Polymer Conjugates with pH-Controlled Activation of Doxombicin. I. New Synthesis, Physicochemical Characterization and Preliminary Biological Evaluation, J.Appl.Pol.Sci. 109, 3050-3061 (2008), V. Šubr, et al., Synthesis and properties of new A-(2-hydroxypropyl)-methacrylamide copolymers containing thiazolidine-2-thione reactive groups, React. Funct. Polym. 66 (12) (2006) 1525-1538. ). Poskytnutím látek obecného vzorce V se tedy rozumí buď jejich komerční získání nebo syntéza.
ad b) Polymerace monomem statistického lineárního kopolymem se provede řízenou radikálovou RAFT polymerizací (reversible addition-fragmentation chain transfer, tedy řízenou radikálovou polymerací s reverzibilně-fragmentačním přenosem řetězce) monomem z kroku a) s obsahem od 0,1 do 10 % mol. monomem obecného vzorce V, a alespoň 90 % mol. (90 až 99,9 % mol.) N-(2hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA). Reakce typicky probíhá při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, s výhodou 40 až 80 °C, a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofuran, propanol, terc-butanol nebo jejich směsí.
-8CZ 310444 B6
Reakce je iniciována iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující zejména azoiniciátory 2,2'-azobis(2-methylpropionitril) (AIBN), 4,4'-azobis(4-kyanopentanová kyselina) (ACVA), 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4-dimethylpentannitril) (V70), popřípadě za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou vybraného ze skupiny obsahující 2-kyano-2-propylbenzodithioát, 4-kyano-4-(thiobenzoylthio)pentanovou kyselinu, 2-kyano-2-propyldodecyltrithiokarbonát, 2kyano-2-propylethyltrithiokarbonát, 4-kyano-4[(dodecylsulfanylthiokarbonyl)sulfanyl]pentanovou kyselinu, [4-(3-azidopropylamino)-l-kyanol-methyl-4-oxo-butyl]benzenekarbodithioát, N-(3-azidopropyl)-4-kyano-4-ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-pentanamid, [ 1 -kyano-1 -methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3 yl)butyl]benzenkarbodithioát a 2-ethylsulfanylkarbothioyl-sulfanyl-2-methyl-5-oxo-5-(2-thioxothiazolidin-3-yl)pentannitril. Molámí hmotnost Mn takto připravených lineárních statistických kopolymerů je v rozmezí od 4000 do 100 000 g/mol, s výhodou 25 000 až 50 000 g/mol. Vzniklý semitelechelický lineární kopolymer obsahuje koncové reaktivní skupiny (například azidové a TT).
Připravený lineární kopolymer z kroku b) se může popřípadě dále podrobit odstranění chránících skupin, chránících hydrazidové skupiny postranních řetězců (například Boc-skupin). Odstranění chránících skupin lze provést zavedenými postupy, které jsou odborníkovi v oboru známé, například odstranění Boc-skupiny pomocí kyseliny trifluoroctové nebo zahřátím kopolymerů ve vodě. Výsledný kopolymer/produkt se může skladovat bez rizika jeho dekompozice.
Produktem tohoto kroku je tedy semitelechelický statistický lineární kopolymer, který obsahuje lineární poly(A-(2-hydroxypropyl)methakrylamid), ve kterém je od 0,1 do 10 % mol. monomemích jednotek statisticky nahrazeno monomemí jednotkou obecného vzorce VI
D (Ví), kde A a D jsou definovány výše.
ad c) navázání fluoroforu na skupinu D statistického lineárního kopolymerů z kroku b) se provede konjugací karbonyl-thiazolin-2-thionových skupin, (4-nitrofenyl)oxy skupin, (2,3,4,5,6pentafluorfenyl)oxy skupin, (sukcinimidyl)oxy skupin, karboxylových, hydrazidových, azidových, aktivovaných disulfidových skupin a NH2-skupin (přičemž aminoskupina a hydrazidová skupina, v případě, že byla v předchozím kroku chráněna chránící skupinou, musí být před touto konjugací odchráněna) monomemích jednotek obecného vzorce VI semitelechelického statistického lineárního kopolymerů z kroku b), s nízkomolekulámím fluoroforem. Fluoroforem je fluorescenční značka nebo její derivát, které obsahují vhodné reaktivní skupiny (například aminovou, karboxylovou, aktivovanou karboxylovou, aktivovanou disulfídovou nebo keto skupinu) a které se mohou použít ve volné formě, nebo ve formě soli s kyselinou, např. HC1; přičemž nízkomolekulámím fluoroforem je fluorofor, který má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1500 g/mol. Fluorofor je vybrán podle excitačních a emisních vlnových délek, přičemž excitační vlnové délky jsou v rozsahu od 300 do 850 nm a emisní vlnové délky v rozsahu od 350 do 1200 nm; případná molekula nízkomolekulámího
-9CZ 310444 B6 fluoroforu je k lineárnímu kopolymeru navázána amidovou, disulfidovou nebo hydrazonovou vazbou.
Produktem tohoto kroku je tedy semitelechelický statistický lineární kopolymer, obsahující monomemí jednotky obecného vzorce I, VI, a dále obsahujícího monomemí jednotky N-(2hydroxypropyl)methakrylamidu.
ad dl) navázání směrující struktury na monomemí jednotky obecného vzorce VI semitelechelického statistického lineárního kopolymeru z kroku c) - krok konjugace směrující struktury se zavedenými amino skupinami, SH, azidovými, propargylovými sulfodibenzocyklooktynovými (sDBCO) nebo dibenzocyklooktynovými (DBCO) skupinami ke skupině D definované výše. Směrující struktura je vybraná ze skupiny zahrnující oligopeptidy o počtu aminokyselin od 3 do 20, a proteiny, s výhodou protilátky, výhodněji monoklonální protilátky, směrující k nádorovým buňkách nádorů hlavy a krku, prsním nádorům, melanomům a kolorektálním nádorům nebo k buňkám nádorového endothelia, přičemž oligopeptidy jsou navázanány pomocí click reakci koncového azidu s DBZO skupinami na polymeru; protilátky jsou navázány click reakcí koncové maleinimidové skupiny semitelechelického fluorescenčního polymeru s thiolovou skupinou molekuly protilátky zavedenou mírnou redukcí.
Ve výhodném provedení jsou oligopeptidy o počtu aminokyselin od 3 do 20 vybrané ze skupiny, zahrnující YESIKVAVS, SIGYPLP, RGD a cRGD (nádorové endothelium), CPLHQRPMC (nádory prostaty), NPVVGYIGERPQYRDL zvaný GE7 a YHWYGYTPQNVI zvaný GE11 (k EGF receptem), WHYPWFQNWAMA (buňky nádorů hlavy a krku), DMPGTVLP (nádory prsu), CNGRC, cyklickým RGDfK, HEWSYLAPYPWF a SYSMEHFRWGKPV. Oligopeptidy a proteiny, které směmjí k nádorovým tkáním v těle, jsou odborníkovi v obom známé.
Ve výhodném provedení jsou monoklonální protilátky vybrané ze skupiny zahrnující herceptin, erbitux, daratuzumab, trastuzumab. Peptidové a proteinové struktury se zavedenými amino skupinami, azidovými, sulfodibenzocyklooktynovými (sDBCO) nebo dibenzocyklooktynovými (DBCO) skupinami; skupiny fluorescenčního polymeru reagují s -NH2, propargylovými, sDBCO nebo DBCO skupinami přítomnými na směrující stmktuře v řádu jednotek minut a vysokým výtěžkem a výsledný konjugát si zachovává neovlivněný biologický účinek.
ad d2) navázání směmjící struktury na konce semitelechelického statistického lineárního fluorescenčního polymeru z kroku c)
- krok konjugace směmjící struktury s amino skupinami, zavedenými SH, azidovými, propargylovými, sulfodibenzocyklooktynovými (sDBCO) nebo dibenzocyklooktynovými (DBCO) skupinami ke koncové skupině lineárního polymem, kterou může být meleinimidylová skupina, TT skupina, azid, propargyl, DBCO, nebo sDBCO. Směmjící stmktura je definovaná výše.
Případné nezreagované skupiny D (thiazolidin-2-thionové skupiny, (2,3,4,5,6pentafluorfenyl)oxy skupiny, (sukcinimidyl)oxy skupiny) se mohou odstranit reakcí s aminoalkoholem, vybraným ze skupiny zahrnující NH2-(CH2)a-CH2(OH); NH2-(CH2)bCH(OH)-CH3; NH2-(CH2)b-CH(OH)-(CH2)c-CH3; kde a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 0 do 3 a c je od 1 do 4, s výhodou s l-aminopropan-2-olem, a/nebo se případné nezreagované NH2 skupiny mohou odstranit reakcí s acetythiazolidin-2-thionem, a/nebo se případné nezreagované disulfidové skupiny odstraní reakcí s 2-hydroxyethanthiolem;
za vzniku skupiny C, vybrané ze skupiny zahrnující karboxyl; hydrazid; azid; -S-S-(CH2)2-OH, -C(=O)-NH-(CH2)a-CH2(OH); -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)-CH3; -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)(CH2)c-CH3; a -NH-C(=O)-CH3, přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 0 do 3 a c je celé číslo od 1 do 4, s výhodou za vzniku skupiny -C(=O)-NH-CH2(OH), -C(=O)-NH-CH(OH)CH3, -C(=O)-NH-(CH2)2-CH2(OH) nebo -NH-C(=O)-CH3. Karboxyly, hydrazidy a azidy není nutné odstraňovat.
- 10 CZ 310444 B6
Produktem tohoto kroku je fluorescenční polymer podle předkládaného vynálezu, tedy semitelechelický statistický lineární kopolymer, obsahující monomemí jednotky obecného vzorce I, popřípadě II, a popřípadě III, definované výše, a dále obsahujícího monomemí jednotky N-(2hydroxypropyl)methakrylamidu.
Předmětem předkládaného vynálezu je dále hvězdicový fluorescenční kopolymer, který obsahuje multivalentní nosič, ke kterému je navázaný alespoň jeden fluorescenční polymer dle předkládaného vynálezu, přičemž multivalentní nosič je vybraný ze skupiny zahrnující poly(amidoaminový) dendrimer druhé nebo třetí generace, 2,2-bis(hydroxymethyl)propionový dendrimer nebo dendron druhé až čtvrté generace; polyoly o počtu hydroxylových skupin od 2 do 8, glycerol, penta-erythritol, bis(2-hydroxyethyl)aminotris(hydroxymethyl)methan, dipentaerythritol.
V jednom provedení je hvězdicovým fluorescenčním polymerem kopolymer obecného vzorce VII, který obsahuje multivalentní nosič a alespoň jeden fluorescenční polymer obecného vzorce IV, definovaný výše.
(VII), kde multivalentním nosičem je poly(amidoaminový) (PAMAM) dendrimer (například s jádrem etylendiaminovým, 1,4-diaminobutanovým, 1,6-diaminohexanovým, 1,12-diaminododekanovým, cystaminovým ) druhé nebo třetí generace nebo 2,2-bis(hydroxymethyl)propionový dendrimer nebo dendron (například s trimethylol propanovým jádrem) druhé až čtvrté generace; polyoly o počtu hydroxylových skupin od 2 do 8, například ethylenglykol, polyethylenglycol, trimethyllolpropan (l,l,l-tris(hydroxymethyl)propan), glycerol, penta-erythritol, bis(2hydroxyethyl)aminotris(hydroxymethyl)methan, dipentaerythritol;
přičemž A, C, L, Y, Z a fluorofor jsou definovány výše;
Y ’ je vybrané ze skupiny sestávající z primární aminoskupiny; primární hydroxy skupiny; alkynové skupiny o počtu uhlíků od 3 do 6, např. propargylu; a cyklooktynové skupiny, která může být popřípadě dále nezávisle substituována jednou nebo více skupinami vybranými z alkylové skupiny o počtu uhlíků od 1 do 6 a arylu o počtu uhlíků 6, např. DBCO;
W je amidická vazba mezi primární amino skupinou Y’ multivalentního nosiče a karboxylovou koncovou skupinou polymeru obecného vzorce IV; nebo esterová vazba mezi primární hydroxy skupinou Y’ multivalentního nosiče a karboxylovou koncovou skupinou polymeru obecného vzorce IV nebo triazolová spojka, vzniklá reakcí azidové koncové skupiny polymeru obecného vzorce IV a alkynové nebo cykloalkynové skupiny Y‘ dendrimeru nebo dendronu (multivalentního nosiče).
- 11 CZ 310444 B6
Hvězdicovitý fluorescenční kopolymer tedy sestává z centrální molekuly nosiče (například PAMAM dendrimeru, 2,2-bis(hydroxymethyl)propionového dendrimeru nebo dendronu nebo polyolu) na jehož koncové skupiny je navázán alespoň jeden řetězec fluorescenčního polymeru, s výhodou lineárního statistického kopolymeru obecného vzorce IV, definovaného výše. Koncové skupiny multivalentního nosiče jsou amino skupiny, hydroxy skupiny nebo alkynové skupiny o počtu uhlíků od 3 do 6, např. propargyl, nebo cyklooktynové skupiny, která může být popřípadě dále nezávisle substituována jednou nebo více skupinami vybranými z alkylové skupiny o počtu uhlíků od 1 do 6 a arylu o počtu uhlíků 6, např. DBCO, a fluorescenční polymer (například lineární kopolymer vzorce IV je k nim navázán přes amidickou, esterovou nebo triazolovou spojku.
S výhodou hvězdicovitý fluorescenční kopolymer obsahuje od 2 do 48 navázaných řetězců fluorescenčního polymeru, výhodněji 3 až 32 navázaných řetězců fluorescenčního polymeru, nej výhodněji 4 až 24 navázaných řetězců fluorescenčního polymeru. V nej výhodnějším provedení je fluorescenčním polymerem lineární statistický kopolymer obecného vzorce IV.
Molámí hmotnost Mn hvězdicového fluorescenčního kopolymeru je s výhodou v rozmezí od 60 000 do 1 000 000 g/mol, s výhodou 70 000 až 400 000 g/mol. Molámí hmotnost každého řetězce fluorescenčního polymeru, navázaného na multivalentní nosič, je od 6000 do 100 000 g/mol, s výhodou 40 000 až 70 000 g/mol, zatímco molámí hmotnost samotného multivalentního nosiče, který je součástí hvězdicovitého fluorescenčního kopolymeru, nepřesahuje 50 000 g/mol. Tím je zajištěno, že po rozpadu hvězdicovitého fluorescenčního kopolymeru na multivalentní nosič a fluorescenční polymer v nádorové tkáni a po uvolnění fluorofom, mají všechny výsledné fragmenty molekulovou hmotnost pod limitem renální filtrace, a jsou tedy dobře odstranitelné z organismu renální filtrací.
Způsob přípravy hvězdicového polymem obecného vzorce Vlije znázorněn ve schématu 1.
- 12 CZ 310444 B6
Schéma 1: Schéma přípravy hvězdicovitého kopolymeru, kde n je celé číslo v rozmezí od 1 do 48, kde Y' je primární aminoskupina, hydroxyskupina, C3 až C6 alkynová skupina nebo cyklooktynová skupina poly(amidoaminového) nebo 2,2-bis(hydroxymethyl)propionového dendrimeru nebo dendronu nebo polyolu;
V je azidová nebo TT koncová reaktivní skupina zavedená přenosovým činidlem na konec polymemího řetězce fluorescenčního polymeru obecného vzorce IV při RAFT polymeraci;
W je amidická vazba, esterová vazba nebo triazolová spojka, vzniklá reakcí azidu polymeru obecného vzorce IV a alkynové skupiny nebo cykloalkynové skupiny multivalentního nosiče.
Příklady schematických struktur multivalentních nosičů pro přípravu hvězdicovitých fluorescenčních polymerů jsou uvedené ve schématu 2 níže:
- 13 CZ 310444 B6
(iv)
- 14 CZ 310444 B6
(v)
Schéma 2: Příklady struktur multivalentních nosičů pro syntézu hvězdicovitého fluorescenčního kopolymeru: i) schematické zobrazení bis-MPA dendronu s DBCO skupinami, ii) PAMAM dendrimeru s amino skupinami, iii) bis-MPA dendrimeru s propargylovými skupinami, iv) polyolů o počtu hydroxylů od 4 do 8; a v) příklad struktury hvězdicovitého fluorescenčního kopolymeru s nosičem PAMAM dendrimeru, ve kterém jsou řetězce obsahující lineární fluorescenční polymer vyznačeny schematicky vlnovkou. Maximální počet řetězců lineárního fluorescenčního polymeru, které je možné navázat na multivalentní nosič (například dendrimer), je rovný počtu koncových skupin multivalentního nosiče (v tomto případě 16 koncových amino skupin dendrimeru).
Způsob přípravy hvězdicovitého fluorescenčního polymeru definovaného výše obsahuje následující kroky:
i) poskytnutí multivalentního nosiče, vybraného ze skupiny zahrnující poly(amidoaminový) dendrimer druhé nebo třetí generace, 2,2-bis(hydroxymethyl)propionový dendrimer nebo dendron druhé až čtvrté generace; polyoly o počtu hydroxylových skupin od 2 do 8, glycerol, penta-erythritol, bis(2-hydroxyethyl)aminotris(hydroxymethyl)methan, dipentaerythritol, porfirinové deriváty; zakončeného skupinami Y’, vybranými z primárních aminoskupin, keto skupin, azidových skupin, hydroxy skupin, alkynových skupin o počtu uhlíků od 3 do 6, např. propargylu; a cyklooktynových skupin, které mohou být popřípadě dále nezávisle substituovány jednou nebo více skupinami vybranými z alkylové skupiny o počtu uhlíků od 1 do 6 a arylu o počtu uhlíků 6, např. DBCO.
Uvedené multivalentní nosiče jsou komerčně dostupné, popřípadě lze koncové DBCO skupiny připravit reakcí koncových primárních amino skupin s DBCO-NHS. Poskytnutím je tedy míněno komerční získání multivalentního nosiče, popřípadě následované úpravou jeho koncových skupin.
ii) příprava statistického lineárního kopolymeru, který obsahuje lineární poly(A-(2hydroxypropyl)methakrylamid), ve kterém je od 0,1 do 10 % mol. monomemích jednotek statisticky nahrazeno monomemí jednotkou obecného vzorce VI, který obsahuje koncové reaktivní skupiny (například azidové, DBCO, hydrazidové, amino skupiny a TT); tato příprava je popsaná výše v rámci přípravy lineárního fluorescenčního polymeru;
- 15 CZ 310444 B6 iii) krok roubování koncových reaktivních funkčních skupin (například azidových nebo TT) statistického lineárního kopolymeru připraveného v kroku ii) ke skupinám Y’ multivalentního nosiče z kroku i), za vzniku hvězdicovitého polymeru, který ve svých ramenech obsahuje statistický lineární kopolymerpoly(/V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu), ve kterém je od 0,1 do 10 % mol. monomemích jednotek statisticky nahrazeno monomemí jednotkou obecného vzorce VI. Roubovací reakce polymerů na multivalentní nosiče probíhá v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol a ethanol. Molámí hmotnost Mn takto připravených hvězdicovitých polymerů je v rozmezí od 60 000 do 1 000 000 g/mol, s výhodou 100 000 až 400 000 g/mol.
iv) navázání fluoroforu na skupinu D statistického lineárního kopolymeru z kroku iii) konjugací karbonyl-thiazolin-2-thionových skupin, (4-nitrofenyl)oxy skupin, (2,3,4,5,6pentafluorofenyl)oxy skupin, (sukcinimidyl)oxy skupin, karboxylových, hydrazidových, azidových, aktivovaných disulfidových skupin nebo NH2-skupin monomemích jednotek obecného vzorce VI s aminovou, karboxylovou, aktivovanou karboxylovou, aktivovanou disulfidovou nebo keto skupinou fluoroforu; přičemž fluorofor i jeho navázání ke skupině D jsou popsány výše;
za vzniku fluorescenčního hvězdicovitého kopolymeru, obsahujícího monomemí jednotky obecného vzorce I a VI a dále obsahujícího monomemí jednotky N-(2hydroxypropyl)methakrylamidu;
Navázání fluoroforu na skupinu D se provede konjugací volných hydrazidových skupin, amino skupin, aktivovaných sidulfidových skupin nebo thiazolidin-2-thionových (TT) skupin monomemích jednotek obecného vzorce VI statistického lineárního kopolymeru, popsaného výše, s nízkomolekulámí fluorescenční značkou nebo jejím derivátem (fluoroforem), která obsahuje vhodné reaktivní skupiny (například aminovou, karboxylovou, aktivovanou karboxylovou nebo keto skupinu) a která se může použít ve volné formě, nebo ve formě soli s kyselinou, např. HC1; přičemž nízkomolekulámím fluoroforem je fluorofor, který má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1500 g/mol. Fluorofor je vybrán podle excitačních a emisních vlnových délek, přičemž excitační vlnové délky jsou v rozsahu od 300 do 850 nm a emisní vlnové délky v rozsahu od 350 do 1200 nm; případná molekula nízkomolekulámího fluoroforu je k lineárnímu kopolymem navázána amidovou, disulfidovou nebo hydrazonovou vazbou.
v) volitelně navázání směmjící struktury definované výše (oligopeptidů s počtem aminokyselin od 3 do 20 nebo proteinu, zejména monoklonální protilátky), na skupiny D monomemí jednotky obecného vzorce VI fluorescenčního hvězdicovitého kopolymem z kroku iv).
Navázání směmjící struktury (peptidové struktury se zavedenými amino skupinami, azidovými, sulfodibenzocyklooktynovými (sDBCO) nebo dibenzocyklooktynovými (DBCO) skupinami) se provede reakcí skupiny D monomemí jednotky obecného vzorce VI s -NH2, propargylovými, sDBCO nebo DBCO skupinami přítomnými na směmjící stmktuře. Reakce probíhá v řádu jednotek minut a s vysokým výtěžkem a výsledný konjugát si zachovává neovlivněný biologický účinek.
vi) volitelně navázání směmjící skupiny na konce lineárního řetězce fluorescenčního hvězdicovitého polymeru z kroku iv) nebo v);
Navázání směmjící struktury (peptidové struktury s amino skupinami nebo zavedenými azidovými, maleinimidylovými, propargylovými, sulfodibenzocyklooktynovými (sDBCO) nebo dibenzocyklooktynovými (DBCO) skupinami) se provede reakcí koncové skupiny, TT skupina, azidová, propargylová, DBCO nebo sBCO skupina nebo SH skupina, se skupinami přítomnými na směmjící stmktuře. Reakce probíhá v řádu jednotek minut a s vysokým výtěžkem a výsledný konjugát si zachovává neovlivněný biologický účinek.
- 16 CZ 310444 B6 vii) Případné nezreagované thiazolidin-2-thionové skupiny, (4-nitrofenyl)oxy skupiny, (2,3,4,5,6pentafluorofenyl)oxy skupiny, (sukcinimidyl)oxy skupiny se mohou odstranit reakcí s aminoalkoholem, vybraným ze skupiny zahrnující NH2-(CH2)a-CH2(OH); NH2-(CH2)bCH(OH)-CH3; NH2-(CH2)b-CH(OH)-(CH2)c-CH3; kde a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 0 do 3 a c je od 1 do 4;, s výhodou s l-aminopropan-2-olem, a/nebo se nezreagované NH2 skupiny mohou odstranit reakcí s acetythiazolidin-2-thionem. Aktivované disulfidové skupiny se odstraní pomocí reakce s merkaptoethanolem. Karboxyly, hydrazidy a azidy není nutné odstraňovat.
Předkládaný vynález se dále týká použití fluorescenčních sond pro vizualizaci nádorů pro diagnostické potřeby a pro obrazem naváděnou chirurgii.
Fluorescenční sondou se rozumí fluorescenční polymer podle předkládaného vynálezu definovaný výše a hvězdicovitý fluorescenční polymer podle předkládaného vynálezu, definovaný výše.
V jednom provedení fluorescenční sonda může nést kombinaci fluoroforu, jehož fluorescence se aktivuje v nádoru, a směrující skupiny pro navýšení specifíty vizualizace nádorové tkáně. V tomto provedení obsahuje statistický lineární fluorescenční kopolymer dále alespoň jednu směrující skupinu pro směrování fluorescenční sondy do nádorových tkání, která je vybraná ze skupiny zahrnující oligopeptidy o počtu aminokyselin od 3 do 20 a proteiny pro směrování fluorescenčního polymeru k nádorovým buňkám nádorů hlavy a krku, prsním nádorům, melanomům a kolorektálním nádorům nebo k buňkám nádorového endothelia. Směrující skupina může být navázána na koncovou skupinu lineárního řetězce fluorescenční sondy nebo může být součástí monomemí jednotky, jak bylo popsáno výše.
Předmětem předkládaného vynálezu je tedy použití fluorescenční sondy podle předkládaného vynálezu v lékařské diagnostice, celotělovém zobrazování a/nebo fluorescenčně naváděné chirurgii, s výhodou při diagnostice a monitorování úspěšnosti léčby u nádorových onemocnění, onemocnění krvetvorného systému (leukémie, lymfomy, selhání krvetvorby) a imunitního systému. Fluorescenční sondy podle předkládaného vynálezu lze využít například v technikách celotělového zobrazování založených na detekci fluorescence pro detekci nádorové tkáně; ve fluorescencí naváděné chirurgii pro označení a zobrazení fluorescence v cílových strukturách orgánů a tělesných tkání.
Fluorescenční sondy jsou tedy aktivovatelné lineární i hvězdicovité fluorescenční polymery podle předkládaného vynálezu, ve kterých je fluorofor vázán k polymemímu nosiči biologicky degradovatelnou amidickou, hydrazonovou nebo disulfídovou vazbou, a umožňují významně prodloužit dobu cirkulace vázaného fluoroforu v organismu, což umožňuje na vysokomolekulámím polymemím nosiči dopravit fluorofor do nádoru a zde ho v jeho původní formě uvolnit. Další výhodou těchto aktivovatelných fluorescenčních sond podle vynálezu je aktivace fluorescence, která je daná uvolněním fluoroforu z polymemího nosiče.
Polymemí aktivovatelné fluorescenční sondy podle vynálezu se dále vyznačují tím, že vazba fluoroforu k polymemímu řetězci je poměrně stálá, uvolní se do 10 % fluoroforu za 24 h v průběhu transportu v krevním řečišti a tělních tekutinách, a je hydrolyticky, enzymaticky nebo reduktivně štěpitelná v prostředí nádoru a uvnitř cílových nádorových buněk v lysosomech. To znamená, že fluorofor je transportován krevním řečištěm v neaktivní, málo fluorescenčně aktivní formě, a k jeho uvolnění a aktivaci fluorescence dojde především až po vstupu do nádorové tkáně nebo po průniku do cílových nádorových buněk. Aktivace fluoroforu až v cílových buňkách vede k výnamnému nárůstu fluorescence v nádoru, k nárůstu kontrastu nádorová/zdravá tkáň a tedy k jednoznačné vizualizaci nádorové tkáně. Vazbou fluoroforu na polymemí řetězec dojde k výraznému zvýšení molekulové hmotnosti kontrastní látky a tím k prodloužení doby jeho cirkulace v krevním oběhu a tedy i ke zvýšení jeho biologické využitelnosti (bioavailability). Za
- 17 CZ 310444 B6 cílený transport do nádoru či nádorových buněk je odpovědný polymemí nosič připravený s výhodou na bázi kopolymerů HPMA, jehož molekulová hmotnost a tedy i účinnost akumulace v nádorové tkáni může být řízena změnami ve struktuře polymemího nosiče (lineární polymer, vysokomolekulámí biodegradovatelný hvězdicovitý polymer). Vzhledem ke zvýšené molekulové hmotnosti polymemího nosiče je celý konjugát díky EPR efektu akumulován v pevných nádorech. Polymemí sondy mohou být s výhodou směrovány také aktivně pomocí navázaných směrujících struktur, oligopeptidů a proteinů, což dále zvyšuje selektivitu akumulace v nádorové tkáni a podporuje navýšení kontrastu nádorová/zdravá tkáň.
Předmětem vynálezu je tedy směrovaný a aktivovatelný fluorescenční polymer a hvězdicovitý fluorescenční polymer pro zvýšení vizualizace pevných nádorů. Díky jejich hydrodynamické velikosti v roztoku a směrování k receptorům na nádorových buňkách jsou významně akumulovány v pevných nádorech, čímž dochází k významnému obohacení nádorové tkáně o přítomný fluorofor. Navíc dojde v prostředí nádorové tkáně k uvolnění neseného fluoroforu, což má za následek zvýšení fluorescenční signálu díky snížení zhášení fluorescence, které je spojeno s navázáním fluoroforu na polymemí systém. V důsledku dochází k velmi významnému zvýšení fluorescenčního kontrastu mezi nádorovou a nenádorovou tkání, což významně přispívá kvizualizaci nádorové tkáně při naváděné chimrgii nádorů. Zvýšení kontrastu významně posouvá hranice navigované chirurgie vzhledem k současnému stavu.
Objasnění výkresů
Obr. 1: Intenzita fluorescence fluoroforu před a po hydrolýze konjugátu pol-PYR-Cy7 v příkladu 10.
Obr. 2: Rychlost uvolňování fluoroforu z konjugátů sDY-676 připojenému k polymeru pHsensitivními spojkami s různou strukturou v příkladu 11.
Obr. 3: Obrázky z konfokální mikroskopie - příklad 13.
Obr. 4: In vivo fluorescenční zobrazování polymemích systému s fluorescenční značkou Dyomic 676; A - polymemí systém se značkou vázanou napevno amidickou vazbou k nedegradované spojce; B - polymemí systém se značkou vázanou přes hydrazonovou spojku tvořenou OPB-Dy676 - příklad 14
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklady provedení syntézy meziproduktů a konjugátů podle vynálezu
Příklad 1: Syntéza polymerních prekurzorů
Kopolymer poly(HPMA-co-Ma-AP-TT) byl připraven řízenou roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA (93 %mol, 100 mg ) a 3-(3-Methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2thionu (Ma-AP-TT) (7 % mol, 14,0 mg) prováděnou v přítomnosti iniciátoru 2,2'-azobis(4methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile) (V70) a přenosového činidla 4-kyano-4thiobenzoylsulfanylpentanové kyseliny (CTA). Polymerizační směs byla rozpuštěna v tercbutylalkoholu (751 μΐ), CTA rozpuštěno v 10 % obj. DMA (83 μΐ) a vše přeneseno do skleněné ampule, kde byla směs probublávána Ar a ampule uzavřena. Po 24 hodinách při 40 °C byl polymer izolován vysrážením do acetonu/diethylether, sraženina byla poté promyta diethyletherem a sušena ve vakuu. Koncové dithiobenzoátové skupiny byly z kopolymerů odstraněny reakcí s AIBN (10-ti násobný molámí přebytek) v DMSO (15% roztok polymeru) pod argonovou atmosférou 3 h při 70 ° C v uzavřené ampuli. Polymemí konjugát byl izolován srážením do acetonu. Sraženina byla promyta diethyletherem a sušena ve vakuu do sucha.
- 18 CZ 310444 B6
Připravený konjugát poly(HPMA-co-Ma-AP-TT) měl Mw= 28 000 g/mol, D= 1.05, obsah TT 5,9 % mol.
Prekurzor pro click reakci byl připraven reakcí poly(HPMA-co-Ma-AP-TT) (100 mg, 39,3 pmol) s DBCO-NH2 (5,5 mg, 19,9 pmol) v DMA (1 ml) za přítomnosti báze DIPEA (3,4 pl, 19,9 pmol). Průběh reakce sledován pomocí HPLC. U některých polymerů připravených pro navázání značek amidickou vazbou byl polymer poly(HPMA-co-Ma-AP-TT-co-MA-AP-DBCO) vyseparován a v případě polymerů pro vazbu značky přes click chemii byly zbylé TT skupiny na polymeru odstraněny přídavkem l-aminopropan-2-olu (3,0 pl, 39,3 pmol). Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-AP-DBCO) byl vysrážen do směsi aceton/diethylether a přesrážen z MeOH, promyt diethyletherem a sušen. Stejné polymemí prekurzory byly použity i pro směrované konjugáty s fluoroforem vázaným buď enzymaticky štěpitelně nebo kontrolní konjugáty s pevně vázaným fluoroforem.
Polymemí prekurzory poly(HPMA-co-Ma-X-TT), kde X = GG, GLG, GFG, GLFG, GFLFG, a poly(HPMA-co-Ma-XX-NH-NH-Boc), kde XX= -CH2-CH2-(C=O)- (ethyl); -CH2-CH2-CH2(C=O)- (propyl); -CH2)4-(C=O)- (butyl); -CH2)5-(C=O)- (pentyl); -CH2)6-(C=O)- (hexyl); -CH2)7(C=O)- (heptyl); GG, GLG, GFG, GLFG, GFLFG, byly připraveny analogicky dle tohoto postupu.
Pro vazbu konjugátů s fluorescenčními značkami vázanými přes pH-sensitivní hydrazonové spojky byl použit prekurzory poly(HPMA-co-Ma-XX-NH-NH-Boc), kde byly odstraněny Boc chránící skupiny v TFA a po 10 min vysrážen polymer poly(HPMA-co-Ma-XX-NH-NH2) do diethylethem, přesrážen z MeOH a sušen. Pro syntézu směrovaných konjugátů s pH-sensitivní hydrazonovou vazbou byla část hydrazidových skupin odreagována s DBCO-NHS a pro následnou click reakci s peptidem byl použit poly(HPMA-co-MaXX-NH-NH2-co-MaXX-NHNH-DBCO).
Disulfidický polymer byl připraven reakcí poly(HPMA-co-MaXX-NH-NH2) se sukcinimidyl 3(2-pyridyldithio)propionátem) (SPDS) za vzniku polymemího prekurzom poly(HPMA-co-MaXX-NH-NH-PDS).
Charakteristika připravených polymemích prekurzorů je uvedená v Tabulce 1.
Tabulka 1.
Struktura konjugátu Mw (g/mol) IP Obsah reaktivních skupin (mol %)
poly(HPMA-co-Ma-AP-TT) 28 000 1,05 5,9
poly(HPMA-co-Ma-GG-TT) 27 500 1,10 6,1
poly(HPMA-co-Ma-GFG-TT) 26 800 1,12 5,8
poly(HPMA-co-Ma-GLFG-TT) 28 400 1,12 5,8
poly(HPMA-co-Ma-GFLFG-TT) 27 800 1,13 5,6
poly(HPMA-co-Ma-Ethyl-NH-NH2) 35 300 1,08 8,2
poly(HPMA-co-Ma-Propyl-NH-NH2) 35 000 1,10 8,1
poly(HPMA-co-Ma-Pentyl-NH-NH2) 35 500 1,07 8,2
poly(HPMA-co-Ma-Heptyl-NH-NH2) 35 300 1,08 8,0
poly(HPMA-co-Ma-Hexyl-NH-NH2) 35 000 1,08 8,2
poly(HPMA-co-Ma-Hexyl-NH-NH-PDS) 36 200 1,10 7,8
Příklad 2: Syntéza hvězdicovitého polymem s triazolovou spojkou
Syntéza hvězdicovitého kopolymem probíhala ve dvou krocích. Nejprve byl připraven reaktivní kopolymer p(HPMA-co-Ma-Pentyl-NHNH-Boc)-Ns s využitím přenosového činidla azid-CTA,
- 19 CZ 310444 B6 /V-(3-azidopropyl)-4-ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-4-methyl-pentanamidu, obsahující azidovou skupinu, a to obdobným způsobem jako reaktivní kopolymer v Příkladu 1. Dále byly odstraněny Boc skupiny pomocí povaření ve vodě a následně reagoval polymer s bisMPA dendrimerem obsahujícím koncové DBCO nebo propargylové skupiny s p(HPMA-co-Ma-Pentyl5 NHNH2)-N3 v metanolu po dobu 2 h. Výsledný hvězdicovitý polymemí konjugát byl vysrážen do acetonu a sušen do konstantní hmotnosti. Charakterizace výsledného hvězdicovitého polymemího konjugátu: Mw = 250 000 g/mol, D = 1,20, obsah hydrazidových skupin = 8 % mol. Změnou poměru polymery/dendrimerové jádro a změnou generace dendrimeru je možné řídit Mw polymemích systémů v širokém rozsahu. Obdobně je možné pro přípravu hvězdicovitých ίο konjugátů využít i derivatizovaným bis-MPA dendronem nebo PAMAM dendrimerem, na které jsou zavedeny DBCO nebo propargylové skupiny. Hvězdicovité kopolymery s polymery obsahující jiné spojky byly připraveny obdobných způsobem.
Schéma 3. Syntéza a struktura hvězdicovitých kopolymerů
Příklad 3: Syntéza hvězdicovitého konjugátu s esterovou spojkou
Syntéza hvězdicovitého kopolymem probíhala ve třech krocích. V první kroku byl modifikován pentaerythritol pomocí dibenzocyklooctyn-A-hydroxysuccinimidylového estem. Dále byl připraven reaktivní kopolymer p(HPMA-co-Ma-Pentyl-NHNH-Boc)-N3 s využitím přenosového činidla azid-CTA, A-(3-azidopropyl)-4-ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-4-methyl-pentanamidu, obsahující azidovou skupinu, a to obdobným způsobem jako reaktivní kopolymer v Příkladu 1.
Dále byly odstraněny Boc skupiny pomocí povaření ve vodě a následně reagoval polymer s pentaerythritolem obsahujícím koncové DBCO skupiny s p(HPMA-co-Ma-Pentyl-NHNH2)-N3 v metanolu po dobu 2 h. Výsledný hvězdicovitý polymemí konjugát byl vysrážen do acetonu a sušen do konstantní hmotnosti. Charakterizace výsledného hvězdicovitého polymemího
-20 CZ 310444 B6 konjugátu: Mw = 180 000 g/mol, D = 1,25, obsah hydrazidových skupin = 8 % mol. Hvězdicovité kopolymery s polymery obsahující jiné polyoly byly připraveny obdobných způsobem.
Schéma 4: Příklad struktury hvězdicovitého kopolymeru založeném na pentaerythritolu a lineárním kopolymeru.
Příklad 4: Syntéza hvězdicovitého konjugátu s amidovou spojkou
Syntéza tohoto hvězdicovitého konjugátu probíhala ve dvou krocích. Nejprve byl připraven reaktivní kopolymer p(HPMA-co-Ma-Pentyl-NHNH-Boc)-TT s využitím přenosového činidla TT-CTA, [ 1 -kyano-1 -methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3-yl)butyl]benzenkarbodithioátu, obsahující TT skupinu, a to obdobným způsobem jako kopolymer v příkladu 1. V druhém kroku bis-MPA dendrimer obsahující amino skupiny reagoval s p(HPMA-co-Ma-Pentyl-NH-NH)-TT v metanolu po dobu 2 h. Výsledný hvězdicovitý polymemí konjugát byl vysrážen do acetonu a sušen do konstantní hmotnosti. Charakterizace výsledného hvězdicovitého polymemího konjugátu: Mw = 220 000 g/mol, D = 1,18, obsah hydrazidových skupin = 8 % mol. Změnou poměm polymery/dendrimerové jádro a změnou generace dendrimeru je možné řídit Mw polymemích systémů v širokém rozsahu. Obdobně je možné pro přípravu hvězdicovitých konjugátů možné využít i bis-MPA dendron nebo PAMAM dendrimer s aminoskupinami.
-21 CZ 310444 B6
Schéma 5: Příklad struktury bis-MPA dendronu 2. generace s lineárním kopolymerem navázaným přes amidovou vazbu. Maximální počet řetězců lineárního kopolymeru, které je možné navázat na dendron, je rovný počtu koncových skupin dendronu (v tomto případě 4 koncových amino skupin).
Příklad 5: Příprava derivátů fluoroforů
Příprava derivátu Az-Val-Cit-Aba-DY-676 a Az-Val-Cit-DY-676
5-Azidopentanoyl-valyl-citrulín (Az- Val-Cit-OH)
Derivát dipeptidu byl připraven syntézou peptidů na pevné fázi na 2-chlorotrityl chloridové pryskyřici (0,5 g, substituce 1 mmol/g) reakcí 0,2 M roztoků aminokyselin (Fmoc-Cit-OH, FmocVal-OH, 5-azidopentanová kyselina). Produkt byl odštěpen z pryskyřice 30% roztokem HFIP v DCM, výtěžek reakce byl 121 mg (0,23 mmol, 46%) azido-peptidového derivátu. ESI MS (vypočteno 399,5, naměřeno 422,5 M+Na). Dle HPLC je patrný 1 pík v tr= 1,39 min.
N-(5-Azidopentanoyl-valyl-citrulyl)-DY-676 (Az-Val-Cit-DY-676)
-22 CZ 310444 B6
Az-Val-Cit-OH (0,5 mg, 1,2 pmol) a aminoderivát DY-676 (1 mg, 1,2 pmol) byly rozpuštěny v DMA (0,5 ml) s DIC (0,3 pl, 1,8 pmol) a HOBt (0,3 mg, 1,8 pmol). Průběh reakce byl sledován 5 HPLC. Po 24 h odreagovala barvička i spojka a dle HPLC vznikl jeden pík odpovídající produktu Az-Val-Cit-DY-676.
N-(5-Azídopentanoyl-valyl-cítrulyl)-4-amínobenzyl alkohol (Az-Val-Cit-Aha)
Η/Ύ xch.
Az-Val-Cit-OH (80 mg, 0,2 mmol), 4-aminobenzylalkohol (26 mg, 0,21 mmol), 1hydroxybenzotriazol (35 mg, 0,23 mmol) a DIC (36 pl, 0,23 mmol) byly rozpuštěny v 2 ml směsi 15 DMF: DCM (3:2), reakční směs míchána 1 h při 0 °C a pak necháno reagovat 16 h při 25 °C.
Rozpouštědlo bylo zahuštěno za sníženého tlaku a produkt byl izolován srážením do diethyletheru, odfiltrován a vyčištěn na preparativním HPLC (Chromolith Cl8, lineární gradient voda-acetonitril 0-100 %). Výtěžek reakce byl 53 mg (0,11 mmol, 55 %) bílého prášku. ESI MS (vypočteno 504,6, naměřeno M+H=505,6). Na HPLC je vidět jeden pík v tr= 1,74 min.
-23 CZ 310444 B6
N-(5-Azidopentanoyl-valyl-citrulyl)-4-aminobenzyl (4-nitrofenyl) karbonát (Az-Val-Cit-Aba-Npc)
Az-Val-Cit-Aba (50 mg, 0,1 mmol) byl rozpuštěn v DMA (0,15 ml), 4-nitrofenyl chlorformiát (60 mg, 0,3 mmol) rozpuštěn v DCM (0,5 ml), roztoky byly smíchány a byl přidán pyridin (0,15 ml). Průběh reakce byl sledován pomocí HPLC, produkt vyizolován na preparativním HPLC (Chromolith C18, lineární gradient voda-acetonitril 0-100 %), výtěžek reakce byl 50 mg io (75 mmol, 75 %) bílého prášku. ESI MS (vypočteno 669,7, naměřeno M+H=670,7). Na HPLC je jeden pík v tr = 2,55 min.
N-[N’-(5-Azidopentanoyl-valyl-citrulyl)-4-aminobenzyloxykarbonyl] DY-676
-24 CZ 310444 B6
Az-Val-Cit-Aba-Npc (0,8 mg, 1,2 pmol) a aminoderivát DY-676 (1 mg, 1,2 pmol) bylo rozpuštěno v DMA (0,5 ml) s DIPEA (0,25 pl, 1,4 pmol). Průběh reakce byl sledován HPLC. Po 24 h odreagovala barvička i spojka a dle HPLC vznikl jeden pík odpovídající produktu Az-ValCit-Aba-DY-676.
Obdobným způsobem byly připraveny i deriváty s dalšími fluorescenčními značkami (Dyomics782, Dyomics-633, Dyomics-781, Dyomics-776, Dyomics-777, Dyomics-778, Dyomics 780, Cyanine-7, Cyanine-7.5, Cysanine-5, Cyanine-5.5, indocyaninegreen).
Příklad 6 (není předmětem vynálezu): Derivatizace ketokyselin
Karboxylové ketokyseliny, jako například 5-cyklohexyl-5-oxopentanová (COP), 4-(2-oxopropyl)benzenkarboxylová (OPB) a 4-oxo-4-(2-pyridyl)butanová (PYR) byly aktivovány reakcí s thiazolidin-2-thionem, tuto reakci znázorňuje schéma 6.
Schéma 6
Bylo naváženo 100 mg (0,56 mmol) kyseliny OPB a 132 mg (0,67 mmol, l,2x mol. ekv. vůči ketokyselině) ΛξΑ'-dicyklohexylkarbodiimidu DCC, tyto navážky byly rozpuštěny v 0,78 ml tetrahydrofuranu (THF) (2,45 dnL-moL1). Dále bylo naváženo 39,4 mg (0,59 mmol, l,05x mol. ekv. vůči ketokyselině) thiazolidin-2-thionu TT a 2 mg (katalytické množství) 4-(dimethylamino)pyridinu (DMAP), tyto navážky byly rozpuštěny v 0,30 ml THF (1,12 dnY-mol1).
Následně byly roztoky ochlazeny na -18 °C a po dvaceti minutách smíchány. Za stálého míchání byla udržována tato teplota po dobu jedné hodiny, dalších dvacet hodin teplota 4 °C. Následně byla reakční směs filtrací zbavena W'-dicyklohcxylmočoviny. filtrát byl odpařen za sníženého tlaku a rozpuštěn v ethylacetátu. Tento postup byl ještě jednou zopakován a produkt byl vyčištěn dvojnásobnou krystalizací ve směsi ethyl-acetát : dichlormethan (obj. 1/1). Výtěžky těchto reakcí se pohybují mezi 30 a 50 %.
Tentýž postup byl proveden s COP a PYR.
Takto aktivované kyseliny byly poté derivatizovány amino-derivátem fluorescenční molekuly, např. Cyanine7 (Cy7) nebo Dyomics 676 (DY-676). Bylo naváženo 1,39 mg (4,65 pmol) kyseliny COP a 3,35 mg (4,65 pmol, 1,0 mol. ekv. vůči ketokyselině) Cy7. Obě navážky byly rozpuštěny v 1,193 ml (256,5 dm3-mol-1) rozpouštědla (dimethylformamid - methanol, obj. 3/1) a poté smíchány. K roztoku byl přidán 2,6M roztok hydroxidu sodného (1,10 mol. ekv. vůči ketokyselině). Za stálého míchání probíhala reakce při pokojové teplotě po dobu tří hodin. Průběh reakce byl sledován pomocí HPLC a TLC (ethyl-acetát). Reakce byla ukončena odpařením rozpouštědla. Výtěžky těchto reakcí se pohybují mezi 94 a 99 %.
Tentýž postup byl proveden s OPB a PYR.
Příklad 7: Příprava azído-derívátů peptídu
-25 CZ 310444 B6
Oligopeptidy GE-7, GE-11, CNGRC, cyklický RGDfK, HEWSYLAPYPWF a
SYSMEHFRWGKPV byly připraveny syntézou na pevné fázi za využití mikrovlnného peptidového syntetizátoru standardní Fmoc metodou od C-konce peptidu za využití N-Fmocchráněné aminokyseliny (2,5 ekv.), DIC (2,5 ekv.) jako aktivátoru a Oxymy (2,5 ekv.) jako báze v DMF. Po navázání poslední A-Fmoc-aminokyscliny a odstranění Fmoc skupiny byla navázána 5-azidopentanová kyselina (2,5 ekv.), PyBOP (2,5 ekv.) jako aktivátor a DIPEA (5 ekv.) jako báze.
Příklad 8: Příprava polymerních konjugátů obsahujících fluorescenční značku polymeranalogíckou reakcí
Polymemí konjugát poly(HPMA-co-Ma-GFLG-DY-676) s aminolyticky vázanou barvičkou přes GFLG spojku byl připraven reakcí amino-derivátu barvičky (2 mg) s polymemím prekurzorem poly(A-(2-hydroxypropyl)methakrylamid-co-A-methakryloylglycyl-leucylfenylalanyl-glycin thiazolidin-2-thion) (poly(HPMA-co-Ma-GLFG-TT) (98 mg) v 1 ml DMA za přítomnosti báze DIPEA (ekv. k barvičce). Reakce byla sledována na HPLC a po navázáni veškeré volné barvičky byly zbylé TT skupiny na polymeru odstraněny přídavkem 1 -aminopropan-2-olu (ekv. k TT na počátku reakce). Reakční směs byla přečištěna gelovou filtrací (Sephadex LH20) a polymemí frakce zahuštěna a vysrážena do směsi aceton/diethylether a promyta diethyletherem, sraženina sušena do konstantní hmotnosti. Byl stanoven obsah barvičky a změřena molámí hmotnost pomocí SEC připraveného polymemího konjugátu.
Stejně byl připraven i kontrolní polymemí konjugát poly(HPMA-co-Ma-AP-DY-676) s pevně vázanou barvičkou bez degradovatelné sekvence z polymemího prekurzom poly(A-(2hydroxypropyl)methakrylamid-co-methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion) (poly(HPMAco-Ma-AP-TT). Obsahy fluorescenčních značek v polymerních konjugátech jsou uvedeny v tabulce 2.
Polymemí konjugát poly(HPMA-co-Ma-AP-DBCO-Az-ValCit-Aba-DY-676) byl připraven dvoukrokovou syntézou. V prvním kroku byl (poly(HPMA-co-Ma-AP-TT) převeden napoly(HPMA-co-Ma-AP-DBCO) reakcí s DBCO-NH2 v přítomnosti báze DIPEA (ekv. k DBCO-NH2).V druhém kroku byl k prekurzom poly(HPMA-co-Ma-AP-DBCO) (48,6 mg) rozpuštěném v 300 pl DMA přidán roztok modifikované barvičky Az-Val-Cit-Aba-DY-676 za vzniku triazolového můstku. Po vymizení píku volné barvičky dle HPLC, byla reakční směs vysrážena do směsi aceton/diethylether 2:1, sraženina promyta diethyletherem a sušena. Sraženina byla rozpuštěna v MeOH a přečištěna gelovou filtrací (Sephadex LH20). Polymemí frakce byla zahuštěna a vysrážena do diethylethem. Byl stanoven obsah barvičky a změřena molámí hmotnost pomocí SEC připraveného polymemího konjugátu.
Příklad 9 (není předmětem vynálezu): Příprava konjugátů s pH senzitivní vazbou
Polymemí konjugát s pH senzitivní vazbou poly(HPMA-co-Ma-Heptyl-NH-NH=COP-DY-676) byl připraven reakcí keto kyselinou modifikované barvičky COP-Dy-676 (2 mg) a polymemího prekurzom poly(HPMA-co-Ma-Pentyl-NH-NH2) (98 mg) v 1 ml MeOH s 40 μΐ kyseliny octové a za stálého míchání probíhala při pokojové teplotě 48 hodin. Průběh reakce byl sledován pomocí HPLC a TLC (CHCL/MeOH/kyselina octová - 8/2/1). Poté byly produkty reakce purifikovány sloupcovou gelovou chromatografií pomocí gelu Sephadex LH-20, jako mobilní fáze byl použit methanol. Frakce produktu byly zahuštěny odpařením methanolu za sníženého tlaku a vysráženy do ethyl-acetátu, centrifůgovány a sušeny do konstantní hmotnosti. Výtěžky těchto reakcí se pohybují mezi 50 a 70 %. Následně byl spektrofotometricky stanoven obsah fluoroforu a změřena molámí hmotnost pomocí SEC.
Příklad 10: Příprava směrovaných konjugátů
-26 CZ 310444 B6
Peptidem směrované konjugáty byly připraveny click reakcí azido-derivátu peptidu GE-7 s polymemím prekurzorem s DBCO skupinami, který byl připraven z prekurzoru poly(HPMAco-Ma-GFLG-TT) převedeného na poly(HPMA-co-Ma-GFLG-TT-co-Ma-GFLG-DBCO) reakcí s 0,5 až 4 % mol DBCO-NH2 v přítomnosti báze DIPEA (ekv. kDBCO-NH2). Po vazbě fluoroforu, viz Příklad 8, byl navázán azido-derivát peptidu, a to nekatalyzovanou click reakcí v DMA. Stejně byly připraveny i další směrované konjugáty azido-deriváty peptidů GE-11, CNGRC, cyklickým RGDfK, HEWSYLAPYPWF a SYSMEHFRWGKPV. Kontrolní směrovaný konjugát s pevně vázanou barvičkou byl připraven z poly(HPMA-co-Ma-AP-TT) obdobně jako je popsáno výše.
Peptidem směrované konjugáty s pH senzitivní vazbou byly připraveny stejně jako v příkladu 9 a dále na zbylé hydrazidové skupiny byl navázán DBCO-NHS v přítomnosti báze DIPEA (ekv. k DBCO-NHS) v metanolu. Azido-derivát peptidu byl potom click reakcí přes DBCO připojen k polymemímu konjugátu.
Protilátkou směrované konjugáty byly připraveny ze semitelechelického prekurzoru poly(HPMAco-Ma-Pentyl-NH-NH-Boc)-TT, končeného reaktivní TT skupinou připraveného s využitím přenosového činidla TT-CTA jako v příkladu 4. Koncová TT skupina byla reakcí sN-(2aminoethyljmaleimidem převedena na maleiimid, který byl využit, po odchránění Boc chránící skupiny a navázání fluoroforu, pro reakci s redukovanou protilátkou rituximabem.
Protilátka byla redukována mírnou redukcí dithiothreitolem v PBS pufiru a po redukci byla vyčištěna od volného dithiothreitolu na koloně PD10. Následně byla smíchána s polymemím konjugátem nesoucím hydrazonově vázanou fluorescenční značku a koncovou maleinimidovou skupinu.
Připravené směrované konjugáty, viz tabulka 2, byly charakterizovány, byl stanoven obsah barvičky a pomocí aminokyselinové analýzy stanoven obsah peptidu/protilátky. Molámí hmotnost nemohla být změřena, a to vzhledem k interakci lazeru použitého v detektorech GPC s fluoroforem, což znemožňovalo stanovení těchto charakteristik.
Příklad 11: Zhášení fluorescence na polymeru
Zhášení fluorescence bylo experimentálně provedeno změřením intenzity fluorescence fluorescenčního polymeru poly(HPMA-co-Ma-Acap-NH-NH=COP-DY-676) ve fosfátovém pufm (0,3M, pH 7,4) o koncentraci fluorescenčního polymem 0,1 g-dm3 a intenzity fluorescence tohoto roztoku po totální hydrolýze. Ta byla dosažena přidáním koncentrované k. octové (¼ původního objemu) k původnímu roztoku. Toto ředění bylo kompenzováno vynásobením této intenzity l,25x. Bylo zjištěno, že po navázání dochází k významnému snížení fluorescence navázaných fluoroforů, a fluorescence je opět obnovena po uvolnění z polymem, viz obr. 1. Obdobně byl proveden experiment s polymemími konjugáty s hydrazonově vázanými deriváty OPB a PYR fluorescenční značky DY-676 a dále shodnými deriváty dalších fluorescenčních značek, např. DY-782, Cy-7, DY-767, a dále s fluorescenční značkou DY-676 nebo CY-7 vázanou přes enzymaticky štěpitelné spojky GLG, GFG, GLFG, GFLFG, GFLG, Val-Cit a ValCit-Aba, kde bylo rovněž pozorováno významné zhášení fluorescenčního signálu po vazbě na polymer a následná aktivace fluorescence po inkubaci s modelovým lysosomálním enzymem katepsinem B.
Aktivace fluorescenčního signálu je možné využít pro zvýšení fluorescence v rámci nádorové tkáně u nádorových buněk, kde dochází po pasivní nebo aktivní akumulaci k uvolnění fluoroforu buď díky sníženému pH nádorové tkáně nebo díky aktivitě lysosomálních enzymů po vstupu konjugátů do nádorových buněk. Tato aktivace signálu následně vede k významnému nárůstu kontrastu fluorescenčního signálu v nádorovém prostředí a mimo něj. Nárůst kontrastu lze využít v rámci navigované nádorové chirurgie, kdy zlepšený kontrast nádorová/nenádorová tkáň umožní chirurgovi jasné zvýraznění nádorové masy a tedy přesnou resekci této tkáně.
-27 CZ 310444 B6
Příklad 12: Uvolňovánífluoroforů zpolymerních systémů
Uvolňování fluoroforů bylo měřeno pomocí HPUC. Fluorescenční polymery s hydrazonově vázaným fluroforem byly inkubovány ve fosfátovém pufiru (0,3M, pH 7,4) o koncentraci 0,1 g-dm3 při 37 °C. V časech 0, Ví, 1, 2, 4, 6, 8 a 10 hodin bylo měřeno množství uvolněného fluoroforů. Z obr. 2 je patrné, že rychlost uvolnění fluoroforů je závislé na pH a na typu spojky. Štěpení ve fyziologickém pH 7,4, je oproti štěpení v kyselém pH, simulujícím nádorovou tkáň, pomalejší. Významné zvýšení intenzity fluorescence způsobené uvolněním fluoroforů z polymeru tedy nastane až v nádorové tkáni, kde dojde ke zvýšení kontrastu mezi nádorovou a zdravou tkání. Fluorescenční polymery s fluorescenční značkou vázanou přes enzymaticky degradovatelné spojky byly inkubovány ve fosfátovém pufiru (KH2PO4, NaOH, pH = 6,0, 0,001 M EDTA a 0,01 M glutathionu)) o koncentraci 0,1 g-dm ’ při 37 °C za přítomnosti katepsinu B (2x IO7 mol I1). V časech 0, 1, 2, 8 a 24 hodin bylo měřeno množství uvolněného fluoroforů. Po štěpení katepsinem B bylo zjištěno uvolňování fluoroforů a významné navýšení fluorescence.
Příklad 13: Fyzikální charakterizace konjugátů
Obsah fluoroforů byl stanoven spektrofotometricky a byl určen obsah fluoroforou v konjugátech: pol-COP-Cy7 (ε = 91 000 dm’-mol '-cm ') 0,4 hm. %, pol-OPB-Cy7 (ε = 83 000 dm3-moU1-cm1) 1,8 % hmota. apol-PYR-Cy7 (ε = 60 000 dm3-moU1-cm1) 0,4 % hmota..
Tabulka 2
Struktura konjugátu Obsah fluoroforů (hm %) Obsah peptidu/protilátky (hm %)
poly(HPMA-co-Ma-Heptyl-NH-NH=COP-Cy7) 0,5 -
poly(HPMA-co-Ma-Heptyl-NH-NH=COP-DY-676) 1,4 -
poly(HPMA-co-Ma-Heptyl-NH-NH=OPB-Cy7) 1,8 -
poly(HPMA-co-Ma-Heptyl-NH-NH=OPB-DY676) 1 -
poly(HPMA-co-Ma-Heptyl-NH-NH=PYR-Cy7) 1 -
poly(HPMA-co-Ma-Heptyl-NH-NH=PYR-DY676) 0,9 -
poly(HPMA-co-Ma-AP-DBCO-Az-ValCit-Aba-DY676) 1,8 -
poly(HPMA-co-Ma-GFLG-DY-676) 1,8 -
poly(HPMA-co-Ma-AP-DY-676) 1,9 -
poly(HPMA-co-Ma-Heptyl-NH-NH=OPB-Cy7-co-MaHeptyl-NH-NH-DBCO-cRGDfK) 1,5 10,2
poly(HPMA-co-Ma-GFLG-DY-676-co-Ma-GFLGDBCO-cRGDfK) 1,7 11,2
poly(HPMA-co-Ma-Heptyl-NH-NH=OPB-Cy7-co-Ma- Acap-NH-NH-DBCO-GE-7) 1,6 12,3
-28 CZ 310444 B6
poly(HPMA-co-Ma-AP-DBCO-Az-Val-Cit-Aba-Cy7co-Ma-AP-DBCO-GE-7) 1,5 10,3
poly(HPMA-co-Ma-GFLG-DY-676-co-Ma-GFLGDBCO-GE-11) 1,7 12,1
poly(HPMA-co-Ma-GFLG-DY-676-co-Ma-GFLGDBCO-HEWSYLAPYPWF) 1,7 12,1
PAMAM-P-OPB-Cy7 1,2 -
Bis-MPA-P-OPB-Cy7 1,3 -
Rituximab-(poly(poly(HPMA-co-Ma-Heptyl-NHNH=OPB-Cy7))6 1,2 44,3
Erbitux-(poly(poly(HPMA-co-Ma-Heptyl-NHNH=PYR-DY-676))6 1,3 45,1
Příklad 14 (není předmětem vynálezu): In vitro testování
Buňky s fluorescenčním polymerem poly(HPMA-co-Ma-Acap-NH-NH=OPB-Cy7) o koncentraci 5 mg-dm 3 byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 6 a 24 h. Poté byla měřena fluorescence pomocí konfokálního mikroskopu. Z obr. 3. je patrné, že v čase 24 h dojde k významnému vzrůstu fluorescence díky odštěpení fluoroforu, jelikož měl polymemí konjugát dostatek času proniknout do buněk. Naopak v čase 6 h je zřejmé, že ještě nedošlo k hydrolýze či enzymatickému štěpení spojek a tedy k uvolnění.
Příklad 15 (není předmětem vynálezu): In vivo testování
Byl proveden in vivo pokus na athymických nahých myších (HslCpb:NMRI-Foxnlnu) nesoucích kolorektální nádor DLD-1. Myši byly injektovány fluorescenčními polymery poly(HPMA-coMa-AP-DY-676) nebo poly(HPMA-co-Ma-Acap-NH-NH=OPB-DY676), které měly navázanou fluorescenční značku buď amidickou vazbou k nedegradovatelné spojce v bočním řetězci polymemího nosiče, nebo pH-sensitivní spojkou (hydrazonová vazba). Po 24 h bylo pomocí neinvazivního zobrazovacího systému myšky vyšetřeny, obr. 4. Bylo zjištěno, že zatímco v myškách s napevno vázanou značkou je fluorescence rozprostřena velmi homogenně v rámci těla myšky se mírně zvýšenou intenzitou v místě nádoru (obr. 4A), tak u myšek s podaným pHsensitivním fluorescenčním polymerem (obr. 4B) bylo zjištěno, že fluorescence je převážně lokalizována v nádorové tkáni a že kontrast vzhledem k zdravé tkáni je významně vyšší než u stabilního systému.

Claims (9)

1. Fluorescenční kopolymer pro vizualizaci nádorů, který obsahuje semitelechelický statistický lineární kopolymer poly(/V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu) obecného vzorce X
který obsahuje od 0,1 do 10 % mol. monomemích jednotek, vztaženo na celkový počet monomemích jednotek, obecného vzorce I
(I), kde p je celé číslo v rozmezí od 1 do 5, a r je vybráno z 1, 2 a 3;
kde Y je kovalentní vazba nebo -(CH2)P-C(O)-NH-(CH2)P-L-;
a kde L je triazolová spojka vzniklá reakcí DB CO skupiny s azido vou skupinou;
přičemž jeden nebo více vodíkových atomů v CIL skupinách řetězce -Y-(CH2)P-(C(O)-NH(CH2)r)P-C(O)-NH-C6H4-CH2-O-C(O)- monomemí jednotky (I) může být dále substituován stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny vybranými ze skupiny sestávající z methylu, isopropylu, isobutylu, -CH(CH3)(CH2CH3), -CH2OH, -CH(OH)(CH3), -CH2(C6H4)OH, -(CH2)2-S-CH3, -CH2SH, -(CH2)4-NH2, -CH2COOH, -CH2C(O)NH2, -(CH2)2COOH, -(CH2)2C(O)NH2, -(CH2)3NH-C(=NH)(NH2), -(CH2)3NH-C(=O)(NH2); benzylu;
a kde fluoroforje organická molekula s alespoň jedním aromatickým jádrem, obsahující amino skupinu, keto skupinu nebo S-S vazbu, která má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1500 g/mol aje schopná fluorescence s excitační vlnovou délku v rozmezí od 300 do 850 nm a emisní vlnovou délku v rozmezí od 350 do 1200 nm, přičemž fluoroforje kovalentně vázán k monomemí jednotce obecného vzorce I semitelechelického statistického lineárního kopolymeru přes svou primární aminoskupinu, nebo NCS skupinu, N-hydroxysukcinimidylovou skupinu, keto skupinu nebo disulfidovou skupinu;
a přičemž molekulová hmotnost Mn fluorescenčního kopolymeru je v rozmezí od 6000 do 100 000 g/mol.
-30CZ 310444 B6
2. Fluorescenční kopolymer podle nároku 1, kde fluorofor je jednovazný zbytek odvozený od sloučeniny, vybrané ze skupiny zahrnující:
(2E)-2-[(E)-3-(7-azaniumyliden-2-terc-butylchromen-4-yl)prop-2-enyliden]-l-[6-(2,5dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy-6-oxohexyl] -3,3 -dimethylindol-5 -sulfonát sodný, 2-[3 -[2-terc-butyl-7[ethyl(3-sulfonátopropyl)azaniumyliden]chromen-4-yl]prop-2-enyliden]-l-(5-karboxypentyl)-3,3dimethylindol-5-sulfonát sodný, 3-(3-karboxypropyl)-2-[3-(9-ethyl-6,8,8-trimethyl-2fenylpyrano [3,2 -g] chinolin-4-yliden)prop-1 -enyl] -3 -methyl-1 -(3 -sulfonátopropyl)indol-1 -ium-5 sulfonát sodný, 3-(3-karboxypropyl)-2-[3-[8,8-dimethyl-2-fenyl-6-(sulfonátomethyl)-9-(3sulfonátopropyl)pyrano[3,2-g] chinolin-4-yliden]prop-1 -enyl] -3 -methyl-1 -(3 sulfonátopropyl)indol-l-ium-5-sulfonát sodný, 2-[5-(2-terc-butyl-7-diethylazaniumylidenchromen4-yl)penta-2,4-dienyliden] -1 -(5 -karboxypentyl)-3,3 -dimethylindol-5 -sulfonát sodný, 2-[5-(2-tercbutyl-9-ethyl-6,8,8-trimethylpyrano[3,2-g]chinolin-4-yliden)penta-l,3-dienyl]-l-(5karboxypentyl)-3,3-dimethylindol-l-ium-5-sulfonát sodný, 3-(3-karboxypropyl)-2-[5-(9-ethyl6,8,8-trimethyl-2-fenylpyrano[3,2-g]chinolin-4-yliden)penta-l,3-dienyl]-3-methyl-l-(3sulfonátopropyl)indol-l-ium-5-sulfonát sodný, 2-[5-[4-terc-butyl-7-[ethyl(3sulfonátopropyl)azaniumyliden]chromen-2-yl]penta-2,4-dienyliden]-3-(3-karboxypropyl)-3methyl-l-(3-sulfonátopropyl)indol-5-sulfonát sodný, l-[2-[dimethoxy(fenyl)methyl]fenoxy]-3,4difenylisochinolin, lH-benz[e]indolium, 2-[2-[3-[2-(l,3-dihydro-l,l,3-trimethyl-2H-benz[e]indol2-yliden)ethyliden] -1 -cyklohexen-1 -yl]ethenyl] -3 -[6-[(2,5 -dioxo-1 -pyrrolidinyl)oxy] -6-oxohexyl] 1,1 -dimethylisochinolin, 4-[(2E)-2-[(2E,4E,6E)-7-[ 1,1 -dimethyl-3-(4sulfonátobutyl)benzo[e]indol-3-ium-2-yl]hepta-2,4,6-trienyliden]-l,l-dimethylbenzo[e]indol-3yl]butan-1 -sulfonát sodný, 2,3,5 -trichlor-4-[2-[[6-(2,5 -dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy-6oxohexyl]amino]-2-oxoethyl] sulfanyl-6-[6,7,7,19,19,20-hexamethyl-9,17-bis(sulfonátomethyl)-2oxa-20-aza-6-azoniapentacyklo[12.8.0.03,12.05,10.016,21]dokosa-l(14),3,5,8,10,12,15,17,21nonaen-13-yl]benzoát sodný, popřípadě jejich deriváty obsahující aminoskupinu.
3. Fluorescenční kopolymer podle nároku 1 nebo 2, který dále obsahuje alespoň jednu směrující skupinu pro směrování fluorescenčního kopolymerů do nádorových tkání, která je vybraná ze skupiny zahrnující oligopeptidy o počtu aminokyselin od 3 do 20, vybrané ze skupiny zahrnující YESIKVAVS, SIGYPLP, RGD, cRGD, CPLHQRPMC, NPVVGYIGERPQYRDL, YHWYGYTPQNVI, WHYPWFQNWAMA, DMPGTVLP, CNGRC, cyklický RGDfK, HEWSYLAPYPWF a SYSMEHFRWGKPV, a proteiny pro směrování fluorescenčního kopolymerů k nádorovým buňkám nádorů hlavy a krku, prsním nádorům, melanomům a kolorektálním nádorům nebo k buňkám nádorového endothelia, vybrané ze skupiny zahrnující herceptin, erbitux, daratuzumab, trastuzumab;přičemž uvedená směrující skupina obsahuje aminoskupinu, propargylovou skupinu, DBCO skupinu nebo SH skupinu, přes kterou je navázána ke koncové skupině lineárního řetězce fluorescenčního kopolymerů reakcí s azidovou, maleinimidovou, thiazolidin-2-thionovou nebo A-hydroxysukcinimidylesterovou koncovou skupinou lineárního řetězce fluorescenčního kopolymerů.
4. Fluorescenční kopolymer podle nároku 3, který dále obsahuje monomemí jednotky obecného vzorce II
(Π), kde p je celé číslo v rozmezí od 1 do 5, a r je vybráno z 1, 2 a 3;
- 31 CZ 310444 B6 a kde L je definované v nároku 1;
přičemž jeden nebo více vodíkových atomů v CH2 skupinách řetězce -(CH2)P-(C(O)-NH-(CH2)r)Pmonomemí jednotky II může být dále substituován stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny, vybranými ze skupiny sestávající z methylu, isopropylu, isobutylu, -CH(CH3)(CH2CH3), -CH2OH, -CH(OH)(CH3), -CH2-(C6H4)OH, -(CH2)2-S-CH3,
-CH2SH, -(CH2)4-NH2, -CH2COOH, -CH2C(O)NH2, -(CH2)2COOH, -(CH2)2C(O)NH2, -(CH2)3NH-C(=NH)(NH2), -(CH2)3NH-C(=O)(NH2); benzylu;
Z je směrující skupina pro směrování fluorescenčního kopolymeru do nádorových tkání, která je vybraná ze skupiny zahrnující oligopeptidy o počtu aminokyselin od 3 do 20, vybrané ze skupiny zahrnující YESIKVAVS, SIGYPLP, RGD cRGD, CPLHQRPMC, NPVVGYIGERPQYRDL, YHWYGYTPQNVI, WHYPWFQNWAMA, DMPGTVLP, CNGRC, cyklický RGDfK, HEWSYLAPYPWF a SYSMEHFRWGKPV, a proteiny pro směrování fluorescenčního kopolymeru k nádorovým buňkám nádorů hlavy a krku, prsním nádorům, melanomům a kolorektálním nádorům nebo k buňkám nádorového endothelia, vybrané ze skupiny zahrnující herceptin, erbitux, daratuzumab, trastuzumab, a přičemž množství monomemích jednotek obecného vzorce II ve fluorescenčním kopolymem je od alespoň jedné monomemí jednotky do 8 % mol., vztaženo na celkový počet monomemích jednotek fluorescenčního kopolymem;
přičemž celkem je monomemích jednotek obecného vzorce I a II ve fluorescenčním kopolymem nejvýše 10 % mol., vztaženo na celkový počet monomemích jednotek.
5. Fluorescenční kopolymer podle kteréhokoliv z předchozích nároků, který dále obsahuje alespoň jednu monomemí jednotku obecného vzorce III
(III), kde
A je vybraný ze skupiny sestávající z lineárního nebo rozvětveného uhlíkového alkylenylového řetězce s počtem uhlíků od 1 do 7;
C je vybrané ze skupiny zahrnující -C(=O)-NH-(CH2)a-CH2(OH); -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)CH3; -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)-(CH2)c-CH3; a -NH-C(=O)-CH3, přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 0 do 3 a cje celé číslo od 1 do 4, nebo -S-S-(CH2)2-OH;
přičemž množství monomemích jednotek obecného vzorce III ve fluorescenčním polymeru je od alespoň jedné monomemí jednotky do 9,9 % mol., vztaženo na celkový počet monomemích jednotek fluorescenčního polymeru;
a přičemž celkem je monomemích jednotek obecného vzorce I, II a III ve fluorescenčním polymeru nejvýše 10 % mol., vztaženo na celkový počet monomemích jednotek.
6. Fluorescenční kopolymer podle kteréhokoliv z předchozích nároků, který je lineárním statistickým kopolymerem obsahujícím monomemí jednotku HPMA, monomemí jednotku I podle
-32CZ 310444 B6 nároku 1, monomemí jednotku II podle nároku 4 a monomemí jednotku III podle nároku 5, přičemž uvedený fluorescenční kopolymer má obecný vzorec IV
(IV), přičemž celkový počet monomemích jednotek ve fluorescenčním polymeru je v rozmezí od 100 do 300, a přičemž počet jednotek obecného vzorce I je v rozmezí od 1 do 30; počet jednotek obecného vzorce lije v rozmezí od 0 do 24 a počet jednotek obecného vzorce III je v rozmezí od 0 do 29, přičemž platí, že celkový počet monomemích jednotek I, II a III je nejvýše 30.
7. Hvězdicový fluorescenční kopolymer, který obsahuje multivalentní nosič, ke kterému je navázaný alespoň jeden fluorescenční kopolymer obecného vzorce IV podle nároku 6, přičemž uvedený hvězdicový fluorescenční kopolymer má obecný vzorec VII
(VII), kde
Y’ je vybrané ze skupiny sestávající z primární aminoskupiny; primární hydroxy skupiny; alkynové skupiny o počtu uhlíků od 3 do 6; cyklooktynové skupiny, která může být popřípadě dále nezávisle substituována jednou nebo více skupinami vybranými z alkylové skupiny o počtu uhlíků od 1 do 6 a arylu o počtu uhlíků 6; DBCO skupiny;
W je amidická vazba mezi primární amino skupinou Y’ multivalentního nosiče a karboxylovou koncovou skupinou polymeru obecného vzorce IV; nebo esterová vazba mezi primární hydroxy skupinou Y’ multivalentního nosiče a karboxylovou koncovou skupinou polymeru obecného vzorce IV nebo triazolová spojka, vzniklá reakcí azidové koncové skupiny polymeru obecného vzorce IV a alkynové nebo cykloalkynové skupiny Y’ multivalentního nosiče;
- 33 CZ 310444 B6 přičemž multivalentní nosič je vybraný ze skupiny zahrnující poly(amidoaminový) dendrimer druhé nebo třetí generace, 2,2-bis(hydroxymethyl)propionový dendrimer druhé až čtvrté generace; polyoly o počtu hydroxylových skupin od 2 do 8, glycerol, penta-erythritol, bis(2hydroxyethyl)aminotris(hydroxymethyl)methan, dipentaerythritol, obsahující koncové amino skupiny; hydroxy skupiny; alkynové skupiny o počtu uhlíků od 3 do 6; cyklooktynové skupiny, které mohou být popřípadě dále nezávisle substituovány jednou nebo více skupinami vybranými z alkylové skupiny o počtu uhlíků od 1 do 6 a arylu o počtu uhlíků 6; DBCO skupiny;
přičemž uvedený fluorescenční kopolymer obecného vzorce IV podle nároku 6 je k uvedenému multivalentnímu nosiči navázaný amidickou vazbou mezi primární amino skupinou multivalentního nosiče a karboxylovou koncovou skupinou fluorescenčního kopolymeru; nebo esterovou vazbou mezi primární hydroxy skupinou multivalentního nosiče a karboxylovou koncovou skupinou fluorescenčního kopolymeru nebo triazolovou spojkou, vzniklou reakcí azidové koncové skupiny fluorescenčního kopolymeru a alkynové nebo cykloalkynové skupiny multivalentního nosiče.
8. Hvězdicový fluorescenční kopolymer podle nároku 7, který má molámí hmotnost Mn v rozmezí od 60 000 do 1 000 000 g/mol, přičemž molámí hmotnost samotného multivalentního nosiče je nejvýše 50 000 g/mol.
9. Fluorescenční sonda pro použití v lékařské diagnostice jako kontrastní látka pro vizualizaci nádorů, celotělové zobrazování a/nebo pro obrazem naváděnou chimmgii, zejména ve fluorescenčních zobrazovacích technikách, s výhodou vybraných ze skupiny zahrnující neinvazivní zobrazování, obrazem navigovanou chimrgii, mikroskopii, fluorescenční průtokovou cytometrii, a při diagnostice nádorových, zánětlivých a bakteriálních onemocnění, přičemž fluorescenční sonda je vybraná ze skupiny zahrnující: - fluorescenční kopolymer podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6;
- hvězdicový fluorescenční kopolymer podle nároku 7 až 8.
CZ2021-423A 2021-09-13 2021-09-13 Fluorescenčně značený polymer pro vizualizaci nádorů a jeho použití CZ310444B6 (cs)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2021-423A CZ310444B6 (cs) 2021-09-13 2021-09-13 Fluorescenčně značený polymer pro vizualizaci nádorů a jeho použití
PCT/CZ2022/050088 WO2023036351A1 (en) 2021-09-13 2022-09-09 Fluorescently labelled polymer for tumour visualization, method of its preparation and use thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2021-423A CZ310444B6 (cs) 2021-09-13 2021-09-13 Fluorescenčně značený polymer pro vizualizaci nádorů a jeho použití

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2021423A3 CZ2021423A3 (cs) 2023-03-22
CZ310444B6 true CZ310444B6 (cs) 2025-06-25

Family

ID=83689850

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2021-423A CZ310444B6 (cs) 2021-09-13 2021-09-13 Fluorescenčně značený polymer pro vizualizaci nádorů a jeho použití

Country Status (2)

Country Link
CZ (1) CZ310444B6 (cs)
WO (1) WO2023036351A1 (cs)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116947829B (zh) * 2023-07-05 2025-09-23 上海内瑟汐医疗科技有限公司 一种基于新吲哚菁绿ir820的荧光化合物及其制备和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007028347A2 (en) * 2005-09-05 2007-03-15 Zentiva, A.S. Method for the preparation of polymeric conjugates of doxorubicin with ph- controlled release of the drug
CZ201519A3 (cs) * 2015-01-14 2016-07-27 Ăšstav organickĂ© chemie a biochemie AV ÄŚR, v.v.i. Makromolekulární konjugáty pro izolaci, imobilizaci a vizualizaci proteinů
CZ201520A3 (cs) * 2015-01-14 2016-07-27 Ăšstav organickĂ© chemie a biochemie AV ÄŚR, v.v.i. Makromolekulární konjugáty pro vizualizaci a separaci proteinů a buněk
CZ33418U1 (cs) * 2019-10-09 2019-11-26 I T A – Intertact S R O Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii
CZ2019627A3 (cs) * 2019-10-09 2021-04-21 I.T.A. – Intertact s.r.o. Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití
WO2021073667A1 (en) * 2019-10-18 2021-04-22 Ustav Makromolekularni Chemie Av Cr, V.V.I. Method for the preparation of polymeric carriers for ph- controlled drug release and their conjugates with drugs

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020245447A1 (en) 2019-06-07 2020-12-10 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Method and device for imaging fluorescent proteins in near- and short-wave infrared
WO2021069000A1 (en) * 2019-10-09 2021-04-15 I.T.A. Intertact S.R.O. Fluorescent polymer, fluorescent probe and conjugation kit for advanced functional analysis of cells in haematology, immunology and microbiology, method of preparation and use thereof

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007028347A2 (en) * 2005-09-05 2007-03-15 Zentiva, A.S. Method for the preparation of polymeric conjugates of doxorubicin with ph- controlled release of the drug
CZ201519A3 (cs) * 2015-01-14 2016-07-27 Ăšstav organickĂ© chemie a biochemie AV ÄŚR, v.v.i. Makromolekulární konjugáty pro izolaci, imobilizaci a vizualizaci proteinů
CZ201520A3 (cs) * 2015-01-14 2016-07-27 Ăšstav organickĂ© chemie a biochemie AV ÄŚR, v.v.i. Makromolekulární konjugáty pro vizualizaci a separaci proteinů a buněk
CZ33418U1 (cs) * 2019-10-09 2019-11-26 I T A – Intertact S R O Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii
CZ2019627A3 (cs) * 2019-10-09 2021-04-21 I.T.A. – Intertact s.r.o. Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití
WO2021073667A1 (en) * 2019-10-18 2021-04-22 Ustav Makromolekularni Chemie Av Cr, V.V.I. Method for the preparation of polymeric carriers for ph- controlled drug release and their conjugates with drugs

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
M. STUDENOVSKÝ ET AL: "Dual fluorescent N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide-based conjugates for passive tumor targeting with reduction-sensitive drug release: Proof of the concept, tumor accumulation, and biodistribution", JOURNAL OF BIOACTIVE AND COMPATIBLE POLYMERS, vol. 31, no. 4, 18 January 2016 (2016-01-18), pages 348 - 360, ISSN: 0883-9115 *
P. CHYTIL ET AL: "Dual fluorescent HPMA copolymers for passive tumor targeting with pH-sensitive drug release II: Impact of release rate on biodistribution", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, vol. 172, no. 2, 19 May 2013 (2013-05-19), pages 504 - 512, ISSN: 0168-3659 *
P. CHYTIL ET AL: "N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamide-based polymer conjugates with pH-controlled activation of doxorubicin for cell-specific or passive tumour targeting. Synthesis by RAFT polymerisation and physicochemical characterisation", EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, vol. 41, 7 August 2010 (2010-08-07), pages 473 - 482, ISSN: 0928-0987 *
PETR CHYTIL, EVA KOZIOLOVá, OLGA JANOUšKOVá, LIBOR KOSTKA, KAREL ULBRICH, TOMáš ETRYCH: "Synthesis and Properties of Star HPMA Copolymer Nanocarriers Synthesised by RAFT Polymerisation Designed for Selective Anticancer Drug Delivery and Imaging : Synthesis and Properties of Star HPMA Copolymer Nanocarriers…", MACROMOLECULAR BIOSCIENCE, WILEY-VCH VERLAG GMBH, DE, vol. 15, no. 6, 1 June 2015 (2015-06-01), DE , pages 839 - 850, XP055716878, ISSN: 1616-5187, DOI: 10.1002/mabi.201400510 *
T. ETRYCH ET AL: "Fluorescence Imaging as a Tool in Preclinical Evaluation of Polymer-Based Nano-DDS Systems Intended for Cancer Treatment", PHARMACEUTICS, vol. 11, no. 9, 12 September 2019 (2019-09-12), pages 471, ISSN: 1999-4923 *
T. ETRYCH ET AL: "Fluorescence optical imaging in anticancer drug delivery", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, vol. 226, 16 February 2016 (2016-02-16), pages 168 - 181, ISSN: 0168-3659 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023036351A1 (en) 2023-03-16
CZ2021423A3 (cs) 2023-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102105157B (zh) 聚合物、抗血管生成剂和靶向部分的缀合物及其在制备用于治疗骨相关血管生成状况的药物中的用途
Lee et al. Super pH-sensitive multifunctional polymeric micelle for tumor pHe specific TAT exposure and multidrug resistance
Shukla et al. Tumor angiogenic vasculature targeting with PAMAM dendrimer–RGD conjugates
JP6270981B2 (ja) 腫瘍の標的型画像化のために用いられる化合物にコンジュゲートされたアミノ酸連結基の製造および合成の方法
JP4675028B2 (ja) トリメチルロック型テトラパルテートプロドラッグ
AU2017265310B2 (en) Multi-arm polymeric targeting anti-cancer conjugate
US10308606B2 (en) PSMA-targeted NIR dyes and their uses
KR101578225B1 (ko) 영상화를 위한 표지된 ｈｇｆ 결합성 펩티드
Dvořák et al. High-molecular weight HPMA copolymer–adriamycin conjugates
EP2682131B1 (en) Switching-type fluorescent nanoparticle probe, and fluorescent molecular imaging method using same
JP2012520856A (ja) 光学イメージング剤
US12187708B2 (en) Near-infrared cyanine dyes and conjugates thereof
JP2004530657A (ja) 上皮組織にわたるおよび上皮組織への薬物送達を増強するための組成物および方法
Sano et al. Indocyanine green-labeled polysarcosine for in vivo photoacoustic tumor imaging
WO2005019247A2 (en) Cyclic peptide and imaging compound compositions and uses for targeted imaging and therapy
EP3193945A1 (en) Upar targeting peptide for use in peroperative optical imaging of invasive cancer
US7897142B2 (en) Peptide based-compounds
CZ310444B6 (cs) Fluorescenčně značený polymer pro vizualizaci nádorů a jeho použití
Subrahmanyam et al. HPMA copolymer-collagen hybridizing peptide conjugates targeted to breast tumor extracellular matrix
US20160346438A1 (en) Adhesion-preventing preparation comprising composition comprising polycationic triblock copolymer and polyanionic polymer
EP4401795A1 (en) Fluorescently labelled polymer for tumour visualization, method of its preparation and use thereof
US20240131199A1 (en) Ph responsive cyanine dyes and conjugates thereof
US20070258904A1 (en) Optical Imaging Contrast Agents
RU2833355C2 (ru) Модифицированные цианиновые красители и их конъюгаты
WO2025080822A1 (en) Multifunctional lubricants and methods of making and using the same