CZ2019627A3 - Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití - Google Patents

Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití Download PDF

Info

Publication number
CZ2019627A3
CZ2019627A3 CZ2019-627A CZ2019627A CZ2019627A3 CZ 2019627 A3 CZ2019627 A3 CZ 2019627A3 CZ 2019627 A CZ2019627 A CZ 2019627A CZ 2019627 A3 CZ2019627 A3 CZ 2019627A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
fluorescent
group
mol
polymer
groups
Prior art date
Application number
CZ2019-627A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ309828B6 (cs
Inventor
Ondřej Hovorka
Hovorka Ondřej, Ph.D.
Tomáš KALINA
Kalina Tomáš doc. MUDr., Ph.D.
Tomáš Etrych
Ph.D. DSc. Etrych Tomáš RNDr.
Original Assignee
I.T.A. – Intertact s.r.o.
Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.
Univerzita Karlova
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by I.T.A. – Intertact s.r.o., Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i., Univerzita Karlova filed Critical I.T.A. – Intertact s.r.o.
Priority to CZ2019-627A priority Critical patent/CZ309828B6/cs
Priority to PCT/CZ2020/050078 priority patent/WO2021069000A1/en
Priority to EP20815710.7A priority patent/EP4013834B1/en
Publication of CZ2019627A3 publication Critical patent/CZ2019627A3/cs
Publication of CZ309828B6 publication Critical patent/CZ309828B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/56—Acrylamide; Methacrylamide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L33/00—Compositions of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical, or of salts, anhydrides, esters, amides, imides or nitriles thereof; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L33/24—Homopolymers or copolymers of amides or imides
    • C08L33/26—Homopolymers or copolymers of acrylamide or methacrylamide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2203/00—Applications
    • C08L2203/02—Applications for biomedical use

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

Předkládané řešení se týká fluorescenčního polymeru, obsahujícího semitelechelický statistický lineární kopolymer, na který je navázána alespoň jedna fluorescenční značka v množství od 0,4 do 12 mol. %, přičemž semitelechelický statistický lineární kopolymer obsahuje polyakrylamid, polymethakrylamid, polyakrylát, polymetakrylát nebo poly(N-(2- hydroxypropyl)methakrylamid), ve kterém je od 0,4 do 12 mol. % monomerních jednotek nahrazeno monomerní jednotkou obecného vzorce I, kde R je vybraný ze skupiny sestávající z lineárního nebo rozvětveného uhlíkového alkylenylového řetězce s počtem uhlíků od 1 do 6, a -(CH2)q-(C(O)-NH-(CH2)r)p-, kde p=1 až 5, a q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; Y je vybraný ze skupiny sestávající z vazby, -C(=O)- NH-, -NH-C(=O)-, -NH-C(=S)-NH; molekulová hmotnost Mn semitelechelického statistického lineárního kopolymeru je v rozmezí od 10 000 do 100 000 g/mol; a fluorescenční značka má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1 500 g/mol, excitační vlnovou délku v rozmezí od 300 do 850 nm a emisní vlnovou délku v rozmezí od 350 do 1 200 nm. Předkládané řešení se dále týká fluorescenční sondy, konjugační sady, způsob jejich přípravy a jejich použití.

Description

Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití
Oblast techniky
Vynález se týká fluorescenčního polymeru složeného z polymemího nosiče s postranními řetězci s fluorofory, umožňujícího vysoce efektivní značení protilátek. Dále se vynález týká fluorescenční sondy, konstruktu složeného z polymemího nosiče s fluorofory (fluorescenčního polymeru) a proteinové struktury, například protilátky. Její použití je zaměřeno pro průtokovou cytometrii, mikroskopickou analýzu a další zobrazovací techniky využívající protilátky značené fluorofory pro diagnostiku, kontrolu kvality i vědu a výzkum.
Dosavadní stav techniky
Využití fluorescenčních sond v imunologii, hematologii a mikrobiologii zaznamenalo v posledních dvou dekádách enormní vzestup a jedná se o naprosto základní metody využívané dennodenně na pracovištích po celém světě od základního výzkumu až po nemocniční laboratoře a analytická oddělení. Komerčně dostupné, fluorescenčně značené protilátky jsou využívány v klinické diagnostice pro analýzu stavu imunitního systému pacientů, v hematoonkologii pro diagnózu maligního onemocnění, v patologii pro detekci změn a poruch a změn v tkáních. Dále jsou používány pro stovky aplikací ve vědě a výzkumu od fýziologických a imunologických pro evoluční, anatomické a vývojové analýzy.
V současnosti je na trhu dostupných stovky různých protilátek proti různým biologickým cílům, buď značených fluorofory, nebo ve formě tzv. purifíkátů-tedy bez kovalentně navázané fluorescenční značky, které musí být následně detekovány pomocí tzv. značených sekundárních protilátek.
Rozvoj bioinformatiky a technologický pokrok v konstrukci detekčních systémů (ať průtokových cytometrů, zobrazovacích systémů, čteček čipů a membrán) vedly k masivnímu rozvoji multiplexové analýzy umožňující podstatně násobit množství znaků detekovaných simultánně v jednotlivých experimentech. Teno rozvoj se odrazil i v potřebě nových fluoroforů pro doplnění spektra používaných fluorescenčních značek. V současnosti je na trhu dostupných stovky různých fluoroforů odlišujících se absorpční a emisní charakteristikou a intenzitou fluorescence odvozených z různých modifikací různých výchozích chemických struktur.
Při multiplexové analýze je třeba použít takový panel značených protilátek, kdy každá z nich nese vlastní fluorofor odlišitelný svým spektrálním profilem (absorpčním a emisním maximem) od všech ostatních protilátek v panelu. V případě rozsáhlejších analýz (10 protilátek a více) narážejí uživatelé při sestavování diagnostického / analytického panelu protilátek na problém nedostupnosti konkrétních značených komerčních protilátek proti minoritním, málo experimentálně využívaným nebo prostě jen nově definovaným znakům, které požadují analyzovat.
Na trhuje k dispozici řada produktů umožňujících uživatelům konjugovat konkrétní fluorofor na vlastní neznačenou protilátku. Problémem těchto souprav je ale malá možnost volby fluoroforů většina z nich se spektrálně překrývá s ostatními obvykle dostupnými fluorofory a zejména pak nízká úroveň značení. Výsledkem tak jsou sice fluorescenčně značené protilátky, ale jejich použití je limitované a znaky s nízkou úrovní exprese s těmito produkty nelze detekovat vůbec. Spektrálně „zajímavé“ fluorofory emitující v oblastech kde je možné je snadno rozlišit, pak mají zpravidla nízký kvantový fluorescenční výtěžek a přímo značené konjugáty jsou špatně rozlišitelné. Polymemí fluorescenční sondy amplifikují počet fluorescenčních molekul a tím
CZ 2019 - 627 A3 podstatně zesílí detekovatelný signál. Lze tak využít netradičních, spektrálně i funkčně unikátních fluoroforů a kombinací fluoroform
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká fluorescenčního polymeru, fluorescenční sondy a konjugační sady pro rychlé značení protilátek, proteinů a jiných struktur s vhodně modifikovaným povrchem. Fluorescenční polymer a konjugační sada podle předkládaného vynálezu umožňuje značení vlastních vhodně modifikovaných struktur tak, že zavede na jejich povrch semitelechelické kopolymemí řetězce, které mají na sobě navázány molekuly fluorescenčních značek (fluoroforů). Díky tomuto přístupu lze zavést na vhodnou proteinovou strukturu až několikanásobně vyšší množství fluoroforů, než obvyklými komerčně dostupnými soupravami. Výsledná fluorescenční sonda umožňuje amplifikaci signálu, který dosahuje i přesahuje intenzity značení pomocí komerčně dostupných biomolekul a nanočástic. Pomocí konjugační sady podle předkládaného vynálezu lze vhodnou proteinovou strukturu označit v řádu jednotek minut a s minimálním počtem kroků fluorescenčně značeným hydrofilním kopolymerem, například na bázi N-(2hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA), a připravit tak polymemí fluorescenční sondu. Podél řetězce tohoto kopolymeru jsou zavedeny funkční skupiny, na které lze navázat vhodné deriváty fluoroforů, na jeho jednom konci obsahují reaktivní skupinu pro jednobodové roubování na proteinovou strukturu. Další oblastí použití takových systémů podle předkládaného vynálezu je možnost vytvoření vlastní kombinace několika fluoroforů navázaných v několika různých požadovaných poměrech na sledovanou strukturu tak, že vznikne přesně definovaný fluorescenční vzor (pattern), který bude unikátní pro každou konkrétní strukturu. Rozlišení právě poměrů intenzit nechá vzniknout unikátnímu fluorescenčnímu podpisu, kdy ve dvou kanálech je pak možné odlišit až 8 různých spektrálních kombinací, a tedy odlišit až osm typů buněčných podtypů (subsetů). Tyto spektrální technologie „čárových kódů“ (barcoding) je možné použít pro odlišení různých vzorků, které budou nejprve fluorescenčně „kódovány“ a následně smíchány a označeny najednou, což eliminuje rozdíly v technice značení a umožní přímé porovnání expresí sledovaných znaků. „Barcoding znak“ obsadí jen dvě spektrální pásma, ale umožní rozlišit až osm různých vzorků. Zbývající část detekčního spektra může být využita pro jiné evaluované (diagnostické) markéry. Navíc lze kombinovat dva či více fluoroforů reagujících různě na fýzikálně-chemické či biologické parametry mikroprostředí značených buněk, např. na pH, teplotu, koncentraci iontů, enzymovou aktivitu apod. Jeden z využitých znaků je v prostředí stabilní a umožňuje tak normalizovat signál z různých buněk a ostatní signály mohou být proměnné. Poměrem normalizovaného a senzitivního signálu pak je možné stanovit přímo parametry prostředí. Celý systém podle předkládaného vynálezu tak umožňuje zvýšení detekovatelnosti sledovaných znaků v jedné buňce a současně výrazné zrychlení přípravy fluorescenčně značených struktur s vhodně modifikovaným povrchem.
Předmětem předkládaného vynálezu je fluorescenční polymer pro rychlé značení protilátek, proteinů a dalších struktur s vhodně modifikovaným povrchem, obsahující semitelechelický statistický lineární kopolymer, na který je navázána alespoň jedna fluorescenční značka (fluorofor) v množství od 0,4 do 12 mol. %, s výhodou od 0,5 do 6 mol. %, vztaženo na počet monomemích jednotek, přičemž semitelechelický statistický lineární polymer je na bázi kopolymerů polyakrylamidu, kopolymerů polymethakrylamidu, kopolymerů polyakrylátu nebo kopolymerů polymetakrylátu, s výhodou obsahuje kopolymery poly(N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid)u, přičemž v semitelechelickém statistickém lineárním kopolymeru je od 0,4 do 12 mol. % monomemích jednotek statisticky nahrazeno monomemími jednotkami obecného vzorce (I)
CZ 2019 - 627 A3
(I), kde
Rje vybraný ze skupiny sestávající z lineárního nebo rozvětveného uhlíkového alkylenylového řetězce s počtem uhlíků od 1 do 6 ((Cl až C6)alkylenyl), nebo -(CH2)q-(C(O)-NH-(CH2)r)P-, kde p=l až 5, a q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; přičemž R může být dále substituován jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny; s výhodou jsou těmito řetězci methyl, isopropyl, isobutyl, - CH(CH3)(CH2CH3), CH20H, -CH(0H)(CH3), -CH2-(C6H4)OH, -(CH2)2-S-CH3, -CH2SH, -(CH2)4-NH2, -CH2COOH, CH2C(O)NH2, -(CH2)2COOH, -(CH2)2C(O)NH2, -(CH2)3NH-C(=NH)(NH2), benzyl;
Y je vybraný ze skupiny sestávající z vazby, -C(=O)-NH-, -NH-C(=O)-, -NH-C(=S)-NH-;
přičemž molekulová hmotnost Mn semitelechelického lineárního kopolymeru je v rozmezí od 10 000 do 100 000 g/mol, s výhodou v rozmezí od 15 000 do 40 000 g/mol (což odpovídá 100 až 280 monomemím jednotkám), výhodněji je molekulová hmotnost v rozmezí od 20 000 do 30 000 g/mol (což odpovídá 134 až 210 monomemím jednotkám);
a přičemž fluorescenční značka (fluorofor nebo jeho aminoderivát, NCS derivát nebo Nhydroxysukcinimidylový derivát) má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1 500 g/mol, excitační vlnovou délku v rozmezí od 300 do 850 run a emisní vlnovou délku v rozmezí od 350 do 1 200 nm a je kovalentně vázaná na monomemí jednotku obecného vzorce I semitelechelického lineárního kopolymeru pomocí reakce své primární aminoskupiny, thiokyanátu nebo /V-hydroxysukcinimidylového esteru, přičemž skupiny vzniklé po navázání fluorofom jsou následně součástí skupiny Y;
a přičemž fluorescenční polymer obsahuje na jednom konci polymemího řetězce funkční skupinu pro navázání na proteinovou strukturu (například jednobodovým roubováním), kterážto funkční skupina je vybraná ze skupiny zahrnující estery, s výhodou /V-hydroxysukcinimidylový ester nebo C1-C4 alkyl estery, amidy, s výhodou thiozolidin-2-thionový amid, maleinimid, azid, propargyl, s výhodou je touto funkční skupinou azid nebo maleinimid.
Přirozenými aminokyselinami se rozumí histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin, threonin, tryptofan, valin, arginin, cystein, glutamin, glycin, prolin, tyrosin, alanin, asparagová kyselina, asparagin, glutamová kyselina, serin, selenocystein. Postranními řetězci jsou řetězce navázané na alfa-uhlíku aminokyseliny.
Fluorescenční polymer může dále obsahovat do 11,6 mol. % monomemích jednotek obecného vzorce (II), vztaženo na počet monomemích jednotek,
CZ 2019 - 627 A3
R / z (Π), kde R je definováno výše a Z je vybrané ze skupiny zahrnující -C(=O)-NH-(CH2)a-CH2(OH); C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)-CH3; -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)-(CH2)c-CH3; kde a je celé číslo od O do 4, b je celé číslo od 0 do 3 a c je od 1 do 4; a -NH-C(=0)-CH3, přičemž celkem je monomemích jednotek obecného vzorce (I) a (II) ve fluorescenčním polymeru nejvýše 12 mol. %, vztaženo na počet monomemích jednotek.
Ve výhodném provedení je R vybraný ze skupiny zahrnující ethan-1,2-diyl (-CH2-CH2-); propan1,3-diyl (-CH2-CH2-CH2-); hexan-1,6-diyl (-CIDe-); -CH2-C(=O)-NH-CH2- (odvozený od dipeptidu Gly-Gly); -CH2-C(=O)-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-C(=O)-NH-CH2- (odvozený od tripeptidu Gly-Leu-Gly); -CH2-C(=O)-NH-CH(CH2Ph)-C(=O)-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-C(=O)NH-CH2- (odvozený od tetrapeptidu Gly-Phe-Leu-Gly); -CH2-C(=O)-NH- CH(CH2-CH( 013)2)C(=O)-NH-CH(CH2Ph)-C(=O)-NH-CH2- (odvozený od tetrapeptidu Gly-Leu-Phe-Gly); -CH2C(=O)-NH-CH(CH2Ph)-C(=O)-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-C(=O)-NH-CH(CH2Ph)-C(=O)-NHCH2- (odvozený od pentapeptidu Gly-Phe-Leu-Phe-Gly).
Semitelechelický lineární kopolymer je statistický kopolymer vzniklý radikálovou polymerizací. Koncové skupiny výsledného lineárního kopolymeru tudíž obsahují části molekul iniciátoru polymerizace (iniciátorem může být například 2,2'-azobis[A-(2-karboxyethyl)-2methylpropionamidin] (V-70)) a přenosového činidla (přenosovým činidlem může být například A-(3-azidopropyl)-4-ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-4-methyl-pentanamid (CTA-N3)), popřípadě jejich deriváty vzniklé reakcí například s 2,2'-azobisisobutyronitrilem (AIBN). Koncové skupiny kopolymeru tudíž obsahují azidovou skupinu, která může být následně dále modifikována reakcí s dibenzocyklooktyn-maleinimidem (DBCO-MI) na další maleinimidovou reaktivní funkční skupinu, reakcí s dibenzocyklooktyn-karboxylem (DBCO-Cbx), který se následně modifikuje thiazolidin-2-thionem na thiazolidin-2-thionovou reaktivní funkční skupinu, reakcí s dibenzocyklooktyn-A-hydroxysukcinimidylesterem (DBCO-NHS) na Nhydroxysukcinimidylesterovou reaktivní funkční skupinu.
V jednom výhodném provedení je semitelechelickým lineárním kopolymerem poly(A-(2hydroxypropyl)methakrylamid), výsledná struktura fluorescenčního polymeru obsahuje v tomto provedení obecný vzorec (III),
CZ 2019 - 627 A3
kde R, Y a Z jsou definované výše, n je celé číslo v rozmezí od 100 do 280, zastoupení jednotek obecného vzorce (I) je v tomto statistickém lineárním kopolymeru od 0,4 do 12 mol %, vztaženo na počet monomemích jednotek, a zastoupení jednotek obecného vzorce (II) je v tomto statistickém lineárním kopolymeru od 0 do 11,6 mol %, vztaženo na počet monomemích jednotek, přičemž celkem je monomemích jednotek obecného vzorce (I) a (II) nejvýše 12 mol. %, vztaženo na počet monomemích jednotek. Koncové skupiny výsledného lineárního kopolymeru obecného vzorce (III) obsahují části molekul iniciátom polymerizace a přenosového činidla, a dále funkční skupinu pro navázání na proteinovou stmktum, s výhodou Nhydroxysukcinimidylový ester, thiozolidin-2-thionový amid, maleinimid, azid, nebo propargyl.
V jednom provedení semitelechelické kopolymery, které jsou posléze součástí fluorescenčního polymeru podle předkládaného vynálezu, obsahují koncové Ns-skupiny zavedené při polymerizační reakci, které lze využít na zavedení maleinimidu pro konjugaci s proteinovou strukturou s vhodně modifikovaným povrchem.
Fluorescenční značka (fluorofor) je vybrána podle excitačních a emisních vlnových délek, přičemž excitační vlnové délky jsou v rozsahu od 300 do 850 nm a emisní vlnové délky v rozsahu od 350 do 1 200 nm. Nízkomolekulámím fluoroforem se rozumí fluorofor, který má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1 500 g/mol. S výhodou obsahuje fluorofor nebo jeho derivát funkční skupinu, vybranou z amino skupiny, isothiokyanátové skupiny a Nhydroxysukcinimidylové skupiny, pro navázání na aminovou nebo TT skupinu postranního řetězce lineárního kopolymeru. S výhodou je fluorescenční značka vybraná ze skupiny zahrnující fluorescein, fluoresceinisothiokyanát (FITC), deriváty ruthenium-bipyridinových komplexů Ru(bpy)s, zejména bis(2,2'-bipyridin)-[4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)butan-l-aminium ruthenium tris(perchlorát) (RUB-C4), cyaniny, zejména Cyanine3 nebo Sulfo-Cyanine7.5, dále 3,6-diamino-9-[4-(2-aminoethylkarbamoyl)-2-karboxy-fenyl]-5-(3sulfonatopropylsulfamoyl)xanthen-10-ium-4-sulfonát (Dy-490), (2E)-l-[6-(2,5-dioxopyrrolidinl-yl)oxy-6-oxo-hexyl]-2-[(2E,4E)-5-[l-(2-methoxyethyl)-3,3-dimethyl-5- sulfonato-indol-l-ium2-yl]penta-2,4-dienylidene]-3,3-dimethyl-indoline-5-sulfonát (Dy-647P1), 3-[4-[(E)-2-[6-[6-(2aminoethylamino)-6-oxo-hexoxy]-1,3-benzoxazol-2-yl]vinyl]-1 -pyridyl]propane-1 -sulfonát (Dy396XL), -[4-[6-[[6-(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)oxy-6-oxo-hexyl]karbamoylamino]-l,3benzoxazol-2-yl]pyridin-l -ium-1 -yl]propane-l -sulfonate (Dy-395XL), 3-[[6-(2azaniumylethylamino)-6-oxo-hexyl]karbamoyl]-8-chloro-7-hydroxy-2-oxo- chromene-6sulfonate (Dy-410), 3-[4-[7-[[6-(2-aminoethylamino)-6-oxo-hexyl]-ethyl- amino]-2-oxochromen-3-yl]pyridin-l-ium-l-yl]propan-l-sulfonát (Dy-485XL), l-[6-(2-aminoethylamino)-6oxo-hexyl]-6-[(E)-2-[7-(diethylamino)-2-oxo-chromen-3-yl]vinyl]pyridin-l-ium-3-sulfonát (Dy480), l-[6-(2-aminoethylamino)-6-oxo-hexyl]-4-[(E)- 2-[7-(diethylamino)-2-oxo-chromen-3yl]vinyl]pyridin-l-ium-3-sulfonát (Dy-520XL), (2E)- 2-[(E)-3-(7-amino-2-terc-butylchromenylium-4-yl)prop-2-enyliden]-l-[6-(2-aminoethylamino)-6-oxo-hexyl]-3,3-dimethyl5
CZ 2019 - 627 A3 indoline-5-sulfonát (Dy-615), (2Z)-3-[4-(2-aminoethylamino)-4-oxo-butyl]-2-[(E)-3-[4-tercbutyl-7-[ethyl(3-sulfonatopropyl)amino]chromenylium-2-yl]prop-2-enylidene]-3-methyl-l-(3sulfonatopropyl)indoline-5-sulfonát (Dy-682) a (2Z)-3-[4-(2-aminoethylamino)-4-oxo-butyl]-2[(E)-3 -[7-(diethylamino)-3 -methyl-4-phenyl-chromenylium -2 -yl]prop-2-enyliden] -3 -methyl-1 (3-sulfonatopropyl)indoline-5-sulfonate (Dy-701), popřípadě jejich deriváty obsahující funkční skupinu, vybranou z aminoskupiny, isothiokyanátové skupiny a A-hydroxysukcinimidylové skupiny.
V jednom výhodném provedení obsahuje fluorescenční polymer podle předkládaného vynálezu alespoň dvě různé fluorescenční značky, například kombinace: Dy-490 a Dy-647P1, Dy-396XL a Dy-647P1, Dy-560 a Dy-647P1, Dy-396XL a Dy-560, Dy-490 a Dy-480XL, Dy- 396XL a Dy480XL a celá řada dalších, spektrálně se nepřekrývajících fluoroforů. Tyto různé fluorescenční značky mohou být vázané v jednom fluorescenčním polymeru v různých molámích poměrech, s výhodou od 1:1 do 1:15, čímž vznikne různý poměr intenzit fluorescence. Výhodněji jsou v jednom polymeru kombinovány fluorofory s rozdílnou excitační i emisní vlnovou délkou.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž fluorescenční sonda, která obsahuje alespoň jeden fluorescenční polymer podle předkládaného vynálezu a dále obsahuje proteinovou strukturu vybranou ze skupiny peptid o počtu aminokyselin v rozmezí od 10 do 200, protein, lipoprotein, protilátka, enzym, hormon, receptor, strukturní protein, transportní protein, protein buněčných signalizačních drah, syntetický protein, přičemž proteinová struktura může být před konjugací s fluorescenčním polymerem popřípadě modifikována tak, aby obsahovala alespoň jednu skupinu, vybranou z -NH2, -SH, sDBCO (sulfodibenzocyklooktynová skupina), DBCO (dibenzocyklooktynová skupina), azid, ke které je fluorescenční polymer kovalentně navázán pomocí funkční skupiny, s výhodou vybrané z A-hydroxysukcinimidylového esteru, thiozolidin2-thionového amidu, malenimidu, azidu, nebo propargylu, obsažené na konci lineárního polymemího řetězce fluorescenčního polymeru. Tato funkční skupina se kovalentně váže na NH2 skupinu (například lysinových zbytků), -SH skupinu (zavednou například redukcí disulfidických můstků), nebo na sDBCO, DBCO a azidové skupiny, zavedené na proteinovou strukturu za vzniku kovalentní vazby.
Ve výhodném provedení obsahuje fluorescenční sonda monoklonální protilátku, ke které je kovalentně navázán alespoň jeden fluorescenční polymer podle předkládaného vynálezu. Monoklonální protilátkou může být například anti-CD20, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, antiCD71, anti-MHCII, anti-CD45, anti-INK. Monoklonální protilátky mají monovalentní afinitu a váží se specificky k jednomu epitopu antigenu.
Monoklonální protilátka obsahuje těžký řetězec, který je druhově specifický, a dva lehké řetězce, které obsahují vazebné místo pro navázání antigenu. Fluorescenční polymer je kovalentně navázán buď na lehký řetězec monoklonální protilátky v místech, kde monoklonální protilátka obsahuje disulfidové můstky, které se před navázáním fluorescenčního polymeru zredukují, nebo podél celé struktury protilátky v místech, kde jsou obsaženy volné aminové skupiny, například z lysinových postranních řetězců). Redukci disulfidických můstků lze provést například působením dithiothreitolu (DTT), tris(2-karboxyethyl)fosfmu (TCEP), /?-merkaptoethanolu nebo glutathionu. Takto připravenou monoklonální protilátku lze ihned konjugovat s fluorescenčním polymerem podle předkládaného vynálezu, kdy SH-skupiny, vzniklé redukcí disulfidových můstků monoklonální protilátky, reagují s koncovou skupinou lineárního polymemího řetězce fluorescenčního polymeru, například s maleinimidovou skupinou, nebo lze SH-skupiny protilátky dále převést reakcí s sDBCO-ΜΙ (sulfodibenzocyklooktyn-maleinimidem) na sDBCO skupiny, popřípadě lze volné NH2-skupiny protilátky převést na DBCO skupiny reakcí s DBCO-NHS (dibenzocyklooktyn-JV-hydroxysukcinimidylesterem). Popřípadě je možné NH2-skupiny protilátky převést na azidové skupiny reakcí s NHS-Azidem. Vzniklé DBCO, sDBCO nebo azidové skupiny protilátky potom následně reagují s koncovou skupinou lineárního polymemího řetězce fluorescenčního polymeru, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující azid, nebo propargyl, za vzniku kovalentní vazby mezi fluorescenčním polymerem a protilátkou.
CZ 2019 - 627 A3
Způsob přípravy fluorescenční sondy (fluorescenčního polymeru s navázanou proteinovou strukturou), obsahuje následující kroky:
a) poskytnutí monomerů semitelechelického lineárního kopolymeru,
b) polymerace monomerů semitelechelického lineárního kopolymeru,
c) navázání fluorescenční značky na semitelechelický lineární kopolymer za vzniku fluorescenčního polymeru,
d) volitelně modifikace proteinové struktury,
e) navázání proteinové struktury na fluorescenční polymer.
ad a) Poskytnutí monomerů semitelechelického lineárního kopolymeru zahrnuje poskytnutí N(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA), akrylamidu nebo jeho derivátů, methakryl amidu nebo jeho derivátů, akrylátu nebo jeho derivátů nebo metakrylátu nebo jeho derivátů, a poskytnutí monomerů obecného vzorce (IV)
Η
CHš (IV), kde R je vybraný ze skupiny sestávající z lineárního nebo rozvětveného uhlíkového alkylenového řetězce s počtem uhlíků od 1 do 6 ((Cl až C6)alkylen), a -(CH2)q-(C(=O)-NH-(CH2)r)p-, kde p=l až 5, a q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; přičemž R může být dále substituován jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;
a X je -karbonyl-thiazolin-2-thionová skupina (TT) nebo NH2-skupina. Aminoskupina může být popřípadě chráněná chránící skupinou, například terc-butoxykarbonylovou (Boc) chránící skupinou. Karbonylem se rozumí -C(=O)- skupina.
A-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) a další monomery akrylamidového, methakrylamidového, akrylátové a metakrylátové typu jsou komerčně dostupné.
Látky vzorce (IV) byly buď získány z komerčně dostupných zdrojů, např. mcthakryolyl-6aminoropylamin chráněný na aminových skupinách terc-butyloxykarbonylovými skupinami (MA-Pr-NH-Boc), nebo byly připraveny podle postupů uvedených literatuře (Pola R., Pamica J., Zuska K., Bóhmová E., Filipová M., Pechar M., Pankrác J., Mucksová J., Kalina J., Trefil P., Sefc L., Větvička D., Poučková P., Bouček J., Janoušková O., Etrych T. Multifunct. Mater. 2019, 2: 024004).
ad b) Polymerace monomerů semitelechelického lineárního kopolymeru se provede řízenou radikálovou RAFT polymerizací monomerů z kroku a) s obsahem od 0,4 do 12 mol. % monomeru obecného vzorce (IV), a alespoň 88 mol. % (88 až 99,6 mol. %) monomemích jednotek, vybraných ze skupiny zahrnující A-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) a další monomery na bázi akrylamidů, methakrylamidů, akrylátů a metakrylátů, s výhodou vybraných ze
CZ 2019 - 627 A3 skupiny zahrnující HPMA, akrylamid, methakrylamid. Reakce probíhá při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, s výhodou 40 až 80 °C, a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofuran, propanol, terc-butanol nebo jejich směsí.
Reakce je iniciována iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující V-7O a ABIK-N3, kde V-7O je 2,2'-azobis[A-(2-karboxyethyl)-2-methylpropionamidine] a ABIK-N3 je N-(3azidopropyl)-4-[(Z)-[4-(3-azidopropylamino)-1 -kyano-1 -methyl-4-oxo-butyl]azo] -4-kyanopentanamid, popřípadě za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou CTA-N3, kde CTA-N3 je A-(3-azidopropyl)-4-ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-4-methyl-pentanamid. Polymemí nosič je pak zakončen zbytkem z radikálu vzniklého rozpadem použitého iniciátoru.
Výsledný semitelechelický lineární kopolymer s výhodou obsahuje koncovou N3-skupinu; přičemž koncová N3-skupina tohoto výsledného semitelechelického kopolymeru může dále reagovat s vhodnými deriváty maleinimidu, s výhodou vybranými ze skupiny dibenzocyklooktyn-amin (DBCO-NH2) nebo propargylderivátů.
Připravený semitelechelický lineární kopolymer z kroku b) se může popřípadě dále podrobit odstranění chránících skupin, chránících aminové skupiny postranních řetězců (například Bocskupin). Odstranění chránících skupin lze provést zavedenými postupy, které jsou odborníkovi v oboru známé, například odstranění Boc-skupiny pomocí kyseliny trifluoroctové nebo zahřátím kopolymeru ve vodě. Výsledný kopolymer/produkt se může skladovat bez rizika jeho dekompozice. Typy reakcí, které se s výhodou použijí pro přípravu semitelechelických kopolymerů podle předkládaného vynálezu, jsou RAFT polymerizace (s využitím předem připraveného přenosového činidla, např. CTA-N3) a „klik reakce“ (např. při použití koncových skupin dibenzocyklooktinu, propargylu, resp. azidu, u semitelechelických kopolymerů).
ad c) navázání fluorescenční značky na semitelechelický lineární kopolymer za vzniku fluorescenčního polymeru se provede konjugací volných aminových skupin nebo thiazolidin-2thionových (TT) skupin monomemích jednotek obecného vzorce (IV) semitelechelického lineárního kopolymeru, popsaného výše, s nízkomolekulámí fluorescenční značkou (fluoroforem), která obsahuje vhodné reaktivní skupiny (například aminovou nebo SCN) a která se může použít ve volné formě, nebo ve formě soli s kyselinou, např. HC1; přičemž nízkomolekulámím fluoroforem je fluorofor, který má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1 500 g/mol. Fluorofor je vybrán podle excitačních a emisních vlnových délek, přičemž excitační vlnové délky jsou v rozsahu od 300 do 850 nm a emisní vlnové délky v rozsahu od 350 do 1 200 nm; případná molekula nízkomolekulámího fluoroforu je k semitelechelickému lineárnímu kopolymeru navázána amidovou nebo thioamidovou vazbou;
- případné nezreagované thiazolidin-2-thionové skupiny se mohou odstranit reakcí s aminoalkoholem, vybraným ze skupiny zahrnující NH2-(CH2)a-CH2(OH); Nkf-fCtDi,CH(OH)-CH3; NH2-(CH2)b-CH(OH)-(CH2)c-CH3; kde a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 0 do 3 a c je od 1 do 4;, s výhodou s l-aminopropan-2-olem, a/nebo se nezreagované NH2 skupiny mohou odstranit reakcí s acetythiazolidin-2-thionem;
- volitelný krok přečištění kolonovou chromatografri a lyofilizace výsledného produktu z předchozího kroku.
Případně lze následně fluorescenční polymer podrobit dalším reakcím, vedoucím ke změně reakční skupiny na konci semitelechelického řetězce. Příkladem mohou být klik reakce azidové skupiny s dibenzocyklooktyn-maleinimidem za vzniku fluorescenčního polymeru s maleinimidovou funkční skupinou na jednom konci lineárního polymemího řetězce; nebo klik reakce azidové skupiny s dibenzocyklooktyn-karboxylem a následně s thiazolidin-2-thionem za vzniku fluorescenčního polymeru s thiazolidin-2-thionovou funkční skupinou na jednom konci lineárního polymemího řetězce;
CZ 2019 - 627 A3 nebo klik reakce azidové skupiny s dibenzocyklooktyn-N-hydroxysukcinimidylesterem za vzniku fluorescenčního polymeru s N-hydroxysukcinimidylesterovou funkční skupinou na jednom konci lineárního polymemího řetězce.
ad d) Volitelným krokem je modifikace proteinové struktury vybrané ze skupiny peptid, protein, lipoprotein, protilátka, enzym, hormon, receptor, strukturní protein, transportní protein, protein buněčných signalizačních drah, syntetický protein, s výhodou takové proteinové struktury, která obsahuje disulfídické vazby; přičemž modifikace spočívá v redukci disulfídických můstků pomocí redukčního činidla vybraného ze skupiny dithiothreitol (DTT), tris(2-karboxyethyl)fosfm (TCEP), />-mcrkaptocthanol. glutathion, s výhodou DTT, ve vodném pufiru (pH od 6,5 do 7,5) při laboratorní teplotě za vzniku SH-skupin v proteinové struktuře. Tyto SH-skupiny mohou být následně dále modifikovány pomocí sDBCO-MI (sulfodibenzocyklooktyn-maleinimidem) na sDBCO skupiny, popřípadě lze modifikovat volné NH2-skupiny protilátky (například aminoskupiny lysinových zbytků) na DBCO nebo azidy skupiny reakcí s DBCO-NHS (dibenzocyklooktyn-N-hydroxysukcinimidylesterem) nebo NHS-azidem. Vzniklé -SH, azidové, DBCO a sDBCO skupiny nebo původní -NH2 skupiny protilátky následně v kroku e) reagují s koncovou skupinou lineárního polymemího řetězce fluorescenčního polymeru, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující N-hydroxysukcinimidylový ester, thiozolidin-2-thionový amid, maleinimid propargyl nebo azid, za vzniku kovalentní vazby mezi fluorescenčním polymerem a protilátkou.
ad e) navázání proteinové struktury na fluorescenční polymer - krok konjugace alespoň jednoho fluorescenčního polymeru podle předkládaného vynálezu a proteinové struktury, popřípadě proteinové struktury se zavedenými sulfhydrylovými (-SH), azidovými, sulfodibenzocyklooktynovými (sDBCO) nebo dibenzocyklooktynovými (DBCO) skupinami připravené v předchozím kroku, přičemž reakce probíhá při laboratorní teplotě ve vodném pufru (pH od 6,5 do 7,5); koncová skupina fluorescenčního polymeru reaguje s -NH2, -SH, propargylovými, sDBCO nebo DBCO skupinami přítomnými na proteinové struktuře v řádu jednotek minut a vysokým výtěžkem a výsledný konjugát si zachovává neovlivněný biologický účinek;
- popřípadě krok přečištění kolonovou chromatografií a lyofílizace výsledného produktu z předchozího kroku.
Ve výhodném provedení se na proteinovou strukturu naváží alespoň dva různé fluorescenční polymery, s výhodou s různými fluorofory.
Meziproduktem, který slouží k přípravě fluorescenčního polymeru podle předkládaného vynálezu, je například semitelechelický lineární kopolymer, obsahující poly(N-(2hydroxypropyl)methakrylamid), ve kterém je od 0,4 do 12 mol. % monomemích jednotek nahrazeno monomemí jednotkou obecného vzorce (I), kde
R je vybraný ze skupiny sestávající z lineárního nebo rozvětveného uhlíkového alkylenového řetězce s počtem uhlíků od 1 do 6 ((Cl až C6)alkylen), a -(CH2)q-(C(O)-NH-(CH2)r)P-, kde p=l až 5, a q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; přičemž R může být dále substituován jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny; s výhodou jsou těmito řetězci methyl, isopropyl, isobutyl, -CHiCH jiC tLCH ). -CH2OH, - CH(OH)(CH3), CH2-(C6H4)OH, -(CH2)2-S-CH3, -CH2SH, -(CH2)4-NH2, -CH2COOH, - CH2C(O)NH2, (CH2)2COOH, -(CH2)2C(O)NH2, -(CH2)3NH-C(=NH)(NH2), benzyl;
Y je vybraný ze skupiny sestávající z vazby, -C(=O)-NH-, -NH-C(=O)-, -NH-C(=S)-NH-; přičemž molekulová hmotnost Mn semitelechelického lineárního kopolymeru je v rozmezí od 10
CZ 2019 - 627 A3
000 do 100 000 g/mol, s výhodou v rozmezí od 15 000 do 40 000 g/mol (což odpovídá 100 až 280 monomemím jednotkám), výhodněji je molekulová hmotnost v rozmezí od 20 000 do 30 000 g/mol (což odpovídá 134 až 210 monomemím jednotkám);
a přičemž semitelechelický lineární kopolymer obsahuje na jednom konci polymemího řetězce funkční skupinu pro navázání na proteinovou strukturu (například jednobodovým roubováním), kterážto funkční skupina je vybraná ze skupiny zahrnující estery, s výhodou Nhydroxysukcinimidylový ester nebo C1-C4 alkyl estery, amidy, s výhodou thiozolidin-2thionový amid, maleimid, azid, propargyl, s výhodou je touto funkční skupinou azid nebo maleimid.
Předmětem předkládaného vynálezu je dále konjugační sada pro značení protilátek, která obsahuje fluorescenční polymer podle předkládaného vynálezu, reakční pufir (0,lM fosfátový pufir, 10 mM EDTA, pH 7), dithiothreitol (DTT) a alespoň jednu kolonku o objemu od 0,5 do 2 ml, s výhodou o objemu 0,8 ml, která obsahuje zesíťovaný dextran o molekulové hmotnosti od 100 do 5 000 g/mol, vhodnou pro centrifugační separaci vysokomolekulámích látek od nízkomolekulámích látek.
Postup značení protilátek s využitím výše uvedené konjugační sady spočívá v následujících krocích:
A. Redukce protilátky a odstranění DTT z reakční směsi.
B. Konjugace redukované monoklonální protilátky s fluorescenčním polymerem.
ad A) Protilátka se rozpustí v reakčním pufm a přidá se DTT v reakčním pufm. Reakční směs reaguje za laboratorní teploty. Produkt (redukovaná protilátka v reakčním pufm) se přečistí na kolonce obsahující zesíťovaný dextran o molekulové hmotnosti 100 až 5000 g/mol a v dalším kroku se přidá k fluorescenčnímu polymeru.
ad B) Přečištěná redukovaná protilátka se konjuguje s fluorescenčním polymerem, s výhodou v molámím poměru 1:9.
Pomocí takové konjugační sady je možné označit také vlastní proteinové struktury, které mají ve své molekule vhodné funkční skupiny (disulfidové můstky).
Předmětem předkládaného vynálezu je dále použití fluorescenčního polymeru, fluorescenční sondy a/nebo konjugační sady podle předkládaného vynálezu pro fluorescenční značení proteinových struktur vybraných ze skupiny peptid, protein, lipoprotein, protilátka, enzym, hormon, receptor, strukturní protein, transportní protein, protein buněčných signalizačních drah, syntetický protein.
Fluorescenční polymer podle předkládaného vynálezu může nést kombinaci několika fluoroforů navázaných v několika různých definovaných poměrech a s koncovou skupinou pro jednobodové roubování na proteinovou strukturu. Různé kombinace několika fluoroforů mohou být následně využity k odlišení různých spektrálních kombinací, a tedy odlišení různých typů buněčných subsetů.
Ve výhodném provedení nese fluorescenční polymer nebo fluorescenční sonda kombinaci dvou fluoroforů, z nichž jeden má fluorescenci nezávislou na okolním prostředí a umožňuje tak normalizovat signál z různých buněk nebo prostředí, a druhý fluorofor má fluorescenci závislou na různých parametrech vnějšího prostředí a jeho fluorescence na změnu vnějšího okolí dokáže reagovat. Fluorescenční polymery nesou zároveň koncovou skupinou pro jednobodové roubování na proteinovou strukturu podle předkládaného vynálezu pro použití ke stanovení různých fýzikálně-chemických nebo biologických parametrů buněk nebo prostředí.
CZ 2019 - 627 A3
Předmětem předkládaného vynálezu je dále použití fluorescenčního polymeru, fluorescenční sondy a/nebo konjugační sady podle předkládaného vynálezu ve fluorescenčních zobrazovacích technikách, s výhodou vybraných ze skupiny zahrnující průtokovou cytometrii pro detekci buněčných struktur a znaků, multiplexovou analýzu v průtokové cytometrii pro značení různých protilátek proti buněčným strukturám a znakům, jež je sestavena tak, aby bylo možno tyto protilátky detekovat zároveň na jednotlivých buňkách, fluorescenční „čírové kódování“, kuličkové testy, mikroskopii, western blot, fluorescenční průtokovou cytometrii pro analýzu buněčných dějů, kdy jeden z fluoroforů je responzivní pro tento děj a druhý fluorofor je stabilní, nastavující referenční kvantifikační hladinu. Fluorescenční polymer a/nebo fluorescenční sondu podle předkládaného vynálezu lze využít například jako reportovací sekundární sondu v sendvičových ELISA testech založených na kuličkovém nosiči pro detekci rozpustných proteinů v suspenzi, v mikroskopických technikách založených na detekci fluorescence pro zobrazení a detekci buněčných struktur a znaků, v mikroskopických technikách založených na detekci fluorescence pro multiplexní analýzy a detekci buněčných struktur a znaků, v mikroskopických technikách založených na detekci fluorescence pro analýzu buněčných dějů, kdy jeden z fluoroforů je responzivní pro tento děj a druhý fluorofor je stabilní, nastavující referenční kvantifikační hladinu; v technikách western blot pro přímé značení a detekci proteinů na membráně a pro přímé multiplexní značení a detekci proteinů na membráně.
Další využití je v lékařské diagnostice, celotělovém zobrazování a/nebo fluorescenčně asistované chirurgii, s výhodou při diagnostice a monitorování úspěšnosti léčby u nádorových onemocnění, onemocnění krvetvorného systému (leukémie, lymfomy, selhání krvetvorby) a imunitního sytému (primární i sekundární imunodefícience, imunitní dysregulace, autoimunitní onemocnění) zánětlivých a bakteriálních. Fluorescenční sondu a/nebo fluorescenční sadu podle předkládaného vynálezu lze využít například v technikách celotělového zobrazování založených na detekci fluorescence pro detekci orgánů, jednotlivých buněk, buněčných struktur a znaků; pro multiplexovou detekci orgánů, jednotlivých buněk, buněčných struktur a znaků; pro analýzu fýziologických i buněčných dějů na úrovni orgánů, jednotlivých buněk, buněčných organel či složek i rozpustných proteinů, kdy jeden z fluoroforů je responzivní pro tento děj a druhý fluorofor je stabilní, nastavující referenční kvantifikační hladinu; ve fluorescencí naváděné chirurgii pro označení a zobrazení fluorescence v cílových strukturách orgánů a tělesných tkání.
Shrnutí
Fluorescenční sonda a fluorescenční polymer podle vynálezu tak mohou být připravené na míru dané aplikaci pro průtokovou cytometrii, mikroskopii, celotělové zobrazování, westem-blot a ostatní techniky využívající fluorescence jako reportní systém. Je to umožněno vlastní volbou a libovolnou kombinaci fluoroforů a jakéhokoli proteinu, jako směrovací a specifitu určující struktury. Uživatel si tedy může vytvořit celé spektrum vlastních sond podle svých požadavků přímo v jeho laboratoři, pro jedno- i mnohobarevné experimenty, bez nutnosti zakoupení různých souprav od různých výrobců.
Předkládaný vynález také umožní přípravu fluorescenčního “čárového kódu” sondy pro multiplexní analýzy s možností rozlišit sondou 6 až 8 různých fluorescenčních “čárových kódů“ v jednom jediném experimentu.
Předkládaný vynález dále umožní determinaci parametrů vnějšího prostředí či fyziologických parametrů buněk, a to kombinací jednoho fluoroforů reagujícího na příslušný stimul spolu s druhým fluoroforem sloužícím jako interní fluorescenční standard pro normalizaci výsledku testu, což přináší významný pokrok do fluorescenční průtokové cytometric.
CZ 2019 - 627 A3
Objasnění výkresů
Obr. 1: Soutisk GPC chromatogramů polymemí sondy s navázanou monoklonální protilátkou anti-CD3 (OKT-3) a fluorescenčním polymerem značeným Dy-410 (ex/em 405/460 nm), samotné protilátky a fluorescenčního polymeru.
Obr. 2: Výsledek průtokové cytometric vzorku periferní krve po inkubaci s protilátkou CD20 konjugovanou s rychlou konjugační sadou obsahující fluorescenční polymer s fluorescenční značkou FITC. Histogramy dokladují identický profil značení v rozsahu konjugačních časů 530minut. Detekce fluorescence FITC je znázorněna na ose x.
Obr. 3: Výsledek průtokové cytometric vzorku periferní krve po inkubaci s různými polymemími sondami protilátka polymer fluorofor. Protilátky CD3 OKT a CD20 RTX byly konjugovány s fluorescenčními značkami vyznačenými v popiscích panelů. Kontrolní profil značení komerční CD3 FITC, CD20 FITC a neznačených lymfocytů je pro porovnání znázorněn v posledním řádku panelů.
Obr. 4: Intenzita fluorescence kuliček UltraComp (Invitrogen) obarvených protilátkami konjugovanými s fluorescenčními polymery obsahujícími fluorofory Dy-490 a Dy-647P1 v různých poměrech (MSS-07 až MSS-10) a jednobarevnými fluorescenčními polymery s Dy-490 (OH-44) a Dy-647P1 (OH-45). Jako negativní kontrola slouží kuličky bez vazebných míst pro protilátku (červená negativní populace).
Obr. 5: Klesající poměr fluorescence fluoroforů GREEN/RED = FITC/DY-615 jako funkce poklesu fluorescence FITC po vstupu a po akumulaci v kyselých organelách v závislosti na době inkubace. Zatímco rychle intemalizovaný transferinový receptor dopravil navázanou protilátku anti-CD71 do kyselých organel již v prvních 10 minutách inkubace, pomalu se intranalizující MHC-II vykazuje výrazně pomalejší a slabší míru přechodu do kyselých organel.
Obr. 6: Tkáňový řez z myší sleziny kmene Blab/C označený kombinací fluorescenčních sond připravených dle příkladů 4 a 6 z protilátky anti mouse-CD45 (CapricoBio, USA) + semitelechelické kopolymery nesoucí Dy-485XL a protilátky anti-mouse CD8 (CapricoBio, USA) + semitelechelické kopolymery nesoucí Dy-395XL. Obě protilátky jasně a zřetelně značí specifické populace CD45 všechny lymfocyty a CD8 jen T-buňky.
Obr. 7: Detekce kinázy JNK v buněčném lyzátu technikou Western Blot pomocí komerční soupravy primámí+sekundámí protilátka (králičí anti-JNK + anti-králičí sekundární Ab IRDye 800) obr. 7A. a pomocí primární anti-JNK protilátky přímo značené pomocí fluorescenčních polymerů nesoucích Dy-701. Oba dva systémy specificky a se srovnatelnou intenzitou značí požadovaný protein.
Obr 8: Celotělové zobrazení myši kmene NuNu nesoucí nádor EL-4 vizualizovaný pomocí protilátky anti -Thy 1,2 označené dle příkladů 4 a 6 pomocí kopolymeru nesoucího fluorofor DY701. Specifický fluorescenční signál specifické fluorescenční sondy jasně detekuje a ohraničuje nádor a umožňuje tak jeho přesné vymezení, lokalizaci a případné odstranění.
Obr. 9: Schematické znázornění použití konjugační sady.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Syntéza semitelechelického kopolymeru raft-poly(HPMA-co-MA-βAla-TT)-N3 pomocí řízené radikálové RAFTpolymerizace
CZ 2019 - 627 A3
raft-poly(HPMA-co-MA-pAla-TT)-N3
Semitelechelický kopolymer raft-poly(HPMA-co-MA-pAla-TT)-N;. obsahující koncovou azidovou skupinu (N3) a thiazolidin-2-thionové skupiny (TT) podél polymemího řetězce, byl připraven pomocí řízené radikálové RAFT polymerizace, kdy molámí poměr iniciátoru/přenašeče/komonomerů byl 0,5/1/250. Poměr komonomerů ΗΡΜΑ/ΜΑ-βΑΙη-ΤΤ byl 90,2/9,8 mol%. 600 mg (4,19 mmol) A-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) bylo rozpuštěno v terc-butanolu (5,530 ml), 94,13 mg (0,36 mmol) 3-(3methakryloylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thionu (MA-PAla-TT), 2,8 mg (9,1 pmol) iniciátoru 2,2'-azobis[A-(2-karboxyethyl)-2-methylpropionamidin]u (V-70) a 6,32 mg (18,2 qmol) přenašeče A-(3-azidopropyl)-4-ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-4-methyl-pentanamidu (CTAN3) bylo rozpuštěno v dimethylacetamidu (DMA; 0,7 ml). Tyto roztoky byly smíchány dohromady v polymerizační ampuli. Polymerizační směs byla probublávána 10 min argonem. Kopolymerizace probíhala při 40 °C po dobu 16 hod. v zatavené ampuli. Produkt byl izolován srážením do směsi aceton/diethylether v poměru 1:1, zfiltrován a sušen do konstantní hmotnosti. Reaktivní ω-koncové trithiokarbonátové skupiny (TTC) byly odstraněny pomocí 2,2'azobisisobutyronitrilu (AIBN) tak, že byl připraven 15% roztok polymeru s AIBN (20 hm%) v DMA. Roztok v ampuli byl probublán 10 minut argonem, zataven a ponechán 3 hod. při 80 °C. Produkt byl izolován srážením do směsi aceton/diethylether v poměru 1:1, zfiltrován a sušen do konstantní hmotnosti. Charakterizace výsledného kopolymeru: Ma (SEC) 20 900 g/mol; D ~ 1,16; obsah (TT) ~ 8,7 mol%.
Podle postupu v Příkladu 1 byly analogicky připraveny další kopolymery raft-poly(HPMA-coMA-pAla-TT)-N3 s různými molámími hmotnostmi v intervalu od 8 000 do 37 000 g/mol, přičemž index polydisperzity £> byl ve všech případech v rozmezí 1,01 až 1,15. Obsah TTskupin podél řetězce byl 2,2 až 9,2 mol%. Podle tohoto postupu byly připraveny také další kopolymery raft-poly(HPMA-co-MA-Rl-TT)-N3, které obsahovaly ve své struktuře aminoacyl R1 podle vzorce I. Viz Tabulka 1.
Tabulka 1: Fyzikálně-chemická charakterizace semitelechelických kopolymerů raftpoly(HPMA-co-MA-Rl-TT)-N3 připravených podle Příkladu 1
Vzorek Mn (g/mol) D obsah TT skupin (mol%) počet uhlíků v R1
1-1 8 000 1,10 6,5 3
1-2 11 100 1,09 2,2 3
CZ 2019 - 627 A3
1-3 23 300 1,15 7,5 3
1-4 27 000 1,05 9,2 3
1-5 36 700 1,15 9,0 3
1-6 27 400 1,01 7,6 6
1-7 16 500 1,10 8,3 6
Příklad 2: Syntéza semitelechelického kopolymeru ratf-poly(HPMA-co-MA-Pr-NH-Boc)-N3 pomocí řízené radikálové RAFTpolymerizace
raft-poly(HPMA-co-MA-Pr-NH-Boc)-N3
Semitelechelický kopolymer raft-poly(HPMA-co-MA-Pr-NH-Boc)-N3, obsahující koncovou azidovou skupinu (N3) a chráněné aminové skupiny (-NH-Boc) podél polymemího řetězce, byl připraven pomocí řízené radikálové RAFT polymerizace, kdy molámí poměr iniciátoru/přenašeče/komonomerů byl 0,5/1/200. Poměr komonomerů HPMA/MA-Pr-NH-Boc byl 90/10 mol%. 500 mg (3,49 mmol) A-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) bylo rozpuštěno v ferc-butanolu (4,710 ml), 89,35 mg (0,39 mmol) methakryolyl-<5-aminoropylaminu chráněného na aminových skupinách terc-butyloxykarbonylovými skupinami (MA-Pr-NH-Boc), 2,99 mg (9,7 μτηοΐ) iniciátoru 2,2'-azobis[A-(2-karboxyethyl)-2-methylpropionamidine]u (V-70) a 6,73 mg (19,4 pmol) přenašeče A-(3-azidopropyl)-4-ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-4methyl-pentanamidu (CTA-N3) bylo rozpuštěno v dimethylacetamidu (DMA; 0,6 ml). Tyto roztoky byly smíchány dohromady v polymerizační ampuli. Polymerizační směs byla probublávána 10 min argonem. Kopolymerizace probíhala při 40 °C po dobu 16 hod. v zatavené ampuli. Produkt byl izolován srážením do směsi aceton/diethylether v poměru 1:1, zfiltrován a sušen do konstantní hmotnosti. Reaktivní ω-koncové trithiokarbonátové skupiny (TTC) byly odstraněny pomocí 2,2'-azobisisobutyronitrilu (AIBN) tak, že byl připraven 15% roztok polymeru s AIBN (20 hm%) v DMA. Roztok v ampuli byl probublán 10 minut argonem, zataven a ponechán 3 hod. při 80 °C. Produkt byl izolován srážením do směsi aceton/diethylether v poměru 1:1, zfiltrován a sušen do konstantní hmotnosti. Charakterizace výsledného kopolymeru:
CZ 2019 - 627 A3
Mn (SEC) 23 500 g/mol; D ~ 1,07; obsah (NH2) ~ 9,7 mol%.
Podle postupu v Příkladu 2 byly analogicky připraveny další kopolymery raft-poly(HPMA-coMA-Pr-NH-Boc)-N3 s různými molámími hmotnostmi M„ v intervalu od 24 500 do 44 500 g/mol, přičemž index polydisperzity £> byl ve všech případech v rozmezí 1,03 až 1,10. Podle tohoto postupu byly připraveny také další kopolymery raft-poly(HPMA-co-MA-R2-NH-Boc)N3, které obsahovaly ve své struktuře amicoacyl R2 podle vzorce II. Obsah NH2-skupin podél řetězce byl 6,7 až 8,6 mol%. Viz Tabulka 2.
Tabulka 2: Fyzikálně-chemická charakterizace semitelechelických kopolymerů raftpoly(HPMA-co-MA-R2-NH-Boc)-N3 připravených podle Příkladu 2
Vzorek M (g/mol) D obsah NH2-skupin (mol%) počet uhlíků v R2
2-1 24 700 1,07 6,7 3
2-2 27 800 1,03 7,0 3
2-3 44 400 1,10 8,6 3
2-4 25 700 1,05 8,5 6
2-5 41 300 1,08 7,8 6
Příklad 3: Odstranění chránící skuliny Boc na aminových skulinách semitelechelického kopolymerů raft-poly(HPMA-co-MA-Pr-NH-Boc)-N3
hh2 raft-poly(HPMA-co-MA-Pr-NH2)-N3
Semitelechelický kopolymer raft-poly(HPMA-co-MA-Pr-NH2)-N3 byl připraven ze semitelechelického kopolymerů raft-poly(HPMA-co-MA-Pr-NH-Boc)-N3 z Příkladu 2 (348 mg), který obsahoval aminové skupiny chráněné terc-butyloxykarbonylovou skupinou (Boc). Semitelechelický kopolymer raft-poly(HPMA-co-MA-Pr-NH-Boc)-N3 byl rozpuštěn v 6,96 ml destilované vody a přenesen do polymerizační ampule. Reakční směs byla probublávána 10 minut argonem. Odstranění chránících skupin probíhalo při 150 °C po dobu 1 hod. v zatavené polymerizační ampuli. Produkt byl nakonec zlyofilizován.
Výtěžek 297 mg (85 %). Charakterizace: Mw = 25 200 g/mol, M„ = 23 500 g/mol. Obdobně byly
CZ 2019 - 627 A3 odstraněny chránící skupiny i z dalších polymerů připravených dle postupu 2.
Příklad 4: Přeprava fluorescenčního polymeru raft-poly(HPMA-co-MA-βΑΙα-Όγ-49Q)-Ns pomocí aminolytické reakce
raft-poly(HPMA-co-MA-pAla-Dy-490)-N3
Fluorescenční polymer raft-poly(HPMA-co-MA-pAla-Dy-490)-N3 byl připraven aminolytickou reakcí TT skupin podél řetězce kopolymeru (Příklad 1) a aminoderivátu fluoroforů Dy-490 (ex/em 490/415 nm), který je komerčně dostupný. Výchozí kopolymer raft-poly(HPMA-co-MAPAla-TT)-N3 (15 mg, 0,61 pmol) byl rozpuštěn v bezvodém dimethylsulfoxidu (DMSO, 110 μΐ) a byl k němu přidán roztok aminoderivátu Dy-490 (1,70 mg, 3,57 pmol, 3,5%mol.) v DMSO spolu s DIPEA (1 μΐ, 5,7 pmol). Reakční směs byla za stálého míchání ponechána reagovat 4 hod. v temnu. Nezreagované TT skupiny byly odstraněny přidáním 7-aminopropan-2-olu (5 μΐ, 65 μmol). Produkt byl přečištěn kolonovou chromatografri (Sephadex LH20, methanol). Frakce se vzorkem byla odpařena za vakua a produkt byl lyofilizován z vodného roztoku. Výtěžek 92 % (13,7 mg). Obsah Dy-490 ~ 3,1 mol%.
Podle postupu v Příkladu 4 byly analogicky připraveny další fluorescenční polymery, odvozené od polymerů připravených v Příkladu 1, s aminoderiváty různých fluoroforů, jejichž excitační vlnové délky byly v rozsahu 300-850 nm a emisní vlnové délky v rozsahu 350-1200 nm. Obsah fluoroforů byl v intervalu od 0,4 do 10 mol%. Viz Tabulka 3.
CZ 2019 - 627 A3
Tabulka 3: Fyzikálně-chemická charakterizace fluorescenčních polymerů raft-poly(HPMA-coMA-R-TT)-N3 připravených podle Příkladu 4 (R je alkylen).
Vzorek fluorofor excitace/emise (nm) obsah fluoroforu (mol%) počet uhlíků v R
4-1 Dy-396XL 392/572 1,06 3
4-2 Dy-395XL 396/560 2,36 3
4-3 Dy-410 405/460 2,82 3
4-4 Dy-485XL 485/560 2,04 6
4-5 Dy-490 491/545 0,71 3
4-6 RUB-C4 455/630 9,35 3
4-7 Dy-480 500/630 1,55 6
4-8 Dy-520XL 520/664 0,94 6
4-9 Cyanine3 555/570 1,18 3
4-10 Dy-615 621/641 1,57 6
4-11 Dy-647P1 653/672 0,64 3
4-12 Dy-682 684/718 0,63 3
4-13 Dy-701 706/731 0,52 3
4-14 Sulfo-Cyanine7.5 778/797 0,40 6
CZ 2019 - 627 A3
Příklad 5: Příprava fluorescenčního polymeru raft-poly(HPMA-co-MA-Pr-NH-FITC)-N3
raft-poly(HPMA-co-MA-Pr-NH-FITC)-N3
Fluorescenční polymer raft-poly(HPMA-co-MA-Pr-FITC)-N3 byl připraven reakcí NH2-skupin podél řetězce kopolymeru raft-poly(HPMA-co-MA-Pr-NH2)-N3 a fluoresceinisothiokyanátu (FITC, ex/em 490/520 nm). Výchozí kopolymer (80 mg, 2,88 pmol) byl rozpuštěn v bezvodém dimethylsulfoxidu (DMSO, 570 μΐ) a byl k němu přidán roztok FITC (6,52 mg, 16,8 pmol, 2,7 mol%) v DMSO. Reakční směs byla za stálého míchání ponechána reagovat 4 hod. v temnu. Nezreagované NH2-skupiny byly odstraněny přidáním acetythiazolidin-2-thionu (1,5 mg, 15,3 pmol). Produkt byl přečištěn kolonovou chromatografií (Sephadex LH20, methanol). Frakce se vzorkem byla odpařena za vakua a produkt byl lyofilizován z vodného roztoku. Výtěžek 86 % (74,6 mg). Obsah FITC ~ 2,52 mol%.
Polymemí prekurzor raft-poly(HPMA-co-MA-Pr-NH2)-N3 připravený podle Příkladu 3 byl rovněž použit pro přípravu fluorescenčního polymeru za využití dalších derivátů fluoroforů, např. A-hydroxysukcinimidyl esterů podle postupu uvedeného v Příkladu 5. Další polymemí prekurzory připravené podle Příkladu 3 byly analogicky použity pro přípravu fluorescenčních polymerů.
Podle postupu v Příkladu 5 byly analogicky připraveny další fluorescenční polymery raftpoly(HPMA-co-MA-R-NH-FITC)-N3 s různými obsahy FITC v intervalu od 0,4 do 5 mol%. Viz Tabulka 4 (R je alkylen).
Tabulka 4 Fyzikálně-chemická charakterizace fluorescenčně značených polymemích prekurzorů raft-poly(HPMA-co-MA-R-FITC)-N3 připravených podle Příkladu 5
Vzorek fluorofor excitace/emise (nm) obsah fluorofom (mol%) počet uhlíků v R
5-1 FITC 490/520 0,43 3
5-2 FITC 490/520 0,86 3
CZ 2019 - 627 A3
5-3 FITC 490/520 2,18 6
5-4 FITC 490/520 3,34 6
5-5 FITC 490/520 4,71 3
Příklad 6: Přeprava fluorescenčního polymeru raft-poly(HPMA-co-MA-βAla-Dy-490)maleinimid pomocí click reakce
raft-poly(HPMA-co-MA-pAla-Dy-490)-maleinimid
Fluorescenční polymer raft-poly(HPMA-co-MA-pAla-Dy-490)-maleinimid byl připraven click reakcí azidové skupiny přítomné na konci polymemího řetězce raft-poly(HPMA-co-MA-pAlaDy-490)-N3 (Příklad 4) a dibenzocyklooktyn-maleinimidu (DBCO-MI). Výchozí fluorescenční polymer (13,7 mg, 0,56 pmol) byl rozpuštěn v bezvodém DMSO (115 μΐ) a byl k němu přidán roztok DBCO-MI (0,6 mg, 1,4 pmol) v DMSO. Reakční směs byla po dobu 2 hod ponechána reagovat v temnu za stálého míchání. Vznik produktu byl sledován chromatograficky (Shimadzu HPLC systém vybavený kolonou s reverzní fází Chromolith Performance RP-18e (100* 4,6 mm) a UV-VIS detektoru Shimadzu SPD- lOAVvp (310 nm); eluent 5% acetonitril-95% acetonitril s gradientem 0-95 %obj. 95% acetonitrilu, průtok 1 ml min-1) z úbytku výchozího množství DBCO-MI. Produkt byl přečištěn kolonovou chromatografíí (Sephadex LH20, methanol). Frakce se vzorkem byla odpařena za vakua a produkt byl lyofilizován z vodného roztoku. Výtěžek 93 % (12,7 mg).
Stejným způsobem byly zavedeny maleinimidové koncové skupiny na všechny fluorescenční
CZ 2019 - 627 A3 polymery připravené v Příkladu 4 a 5.
Příklad 7: Příprava fluorescenčního polymeru raft-poly(HPMA-co-MA-βAla-Dy-490)-TTpomocí click reakce
raft-poly(HPMA-co-MA-3Ala-Dy-490)-TT
Fluorescenční polymer raft-poly(HPMA-co-MA-pAla-Dy-490)-TT byl připraven click reakcí azidové skupiny přítomné na konci polymemího řetězce raft-poly(HPMA-co-MA-pAla-Dy-490)N3 (Příklad 4) a dibenzocyklooktyn-karboxylu (DBCO-Cbx), který byl následně modifikován thiazolidin-2-thionem. Výchozí fluorescenční polymer (15,0 mg, 0,61 pmol) byl rozpuštěn v bezvodém DMSO (120 pl) a byl k němu přidán roztok DBCO-Cbx (0,47 mg, 1,52 pmol) v DMSO. Reakční směs byla po dobu 2 hod. ponechána reagovat v temnu za stálého míchání. Vznik produktu byl sledován chromatografícky (Shimadzu HPLC systém vybavený kolonou s reverzní fází Chromolith Performance RP-18e (100* 4,6 mm) a UV-VIS detektoru Shimadzu SPD- lOAVvp (310 nm); eluent 5% acetonitril-95% acetonitril s gradientem 0-95 %obj. 95% acetonitrilu, průtok 1 mi min-1) z úbytku výchozího množství DBCO-Cbx. Následně byl k reakční směsi přidán A-(3-dimethylaminopropyl)-A'-ethylkarbodiimid hydrochlorid (44 mg, 2,31 pmol), thiazolidin-2-thion (0,22 mg, 1,93 pmol) a katalytické množství dimethylaminopyridinu. Reakční směs byla po dobu 2 hod. ponechána reagovat v temnu za stálého míchání. Produkt byl přečištěn kolonovou chromatografn (Sephadex LH20, methanol) Frakce se vzorkem byla odpařena za vakua a produkt byl vysrážen postupem popsaným v Příkladu 1 a 2. Obsah TT byl
CZ 2019 - 627 A3 stanoven spektrofotometricky. Výtěžek 88 % (13,2 mg), obsah TT 0,92 %mol. Stejným způsobem byly zavedeny TT koncové skupiny na všechny fluorescenční polymery připravené v Příkladu 4 a 5.
Příklad 8: Přeprava fluorescenčního polymeru raft-poly(HPMA-co-MA-fiAla-Dy-490)-Nhydroxysukcinímidylesteru pomocí click reakce
raft-poly(HPMA-co-MA-BAla-Dy-490)-NHS
Fluorescenční polymer raft-poly(HPMA-co-MA-BAla-Dy-490)-A-hydroxysukcinimidylester byl připraven click reakcí azidové skupiny přítomné na konci polymemího řetězce raft-poly(HPMAco-MA-BAla-Dy-490)-N3 (Příklad 4) a dibenzocyklooktyn-A-hydroxysukcinimidylesteru (DBCO-NHS). Výchozí fluorescenční polymer (12,0 mg, 0,49 pmol) byl rozpuštěn v bezvodém DMSO (90 μΐ) a byl k němu přidán roztok DBCO-NHS (0,49 mg, 1,22 pmol) v DMSO. Reakční směs byla po dobu 2 hod. ponechána reagovat v temnu za stálého míchání. Vznik produktu byl sledován chromatografícky (Shimadzu HPLC systém vybavený kolonou s reverzní fází Chromolith Performance RP-18e (100* 4,6 mm) a UV-VIS detektoru Shimadzu SPD- lOAVvp (310 nm); eluent 5% acetonitril-95% acetonitril s gradientem 0-95 % obj. 95% acetonitrilu, průtok 1 ml min1) z úbytku výchozího množství DBCO-NHS. Produkt byl přečištěn kolonovou chromatografií (Sephadex LH20, methanol). Frakce se vzorkem byla odpařena za vakua a produkt byl vysrážen postupem popsaným v Příkladu 1 a 2. Stejným způsobem byly zavedeny
CZ 2019 - 627 A3
NHS koncové skupiny na všechny fluorescenční polymery připravené v Příkladu 4 a 5.
Příklad 9: Přeprava fluorescenční sondy s navázanou monoklonální protilátkou anti-CD20 pomocí aminolytické reakce
Fluorescenční sonda PSI s navázanou monoklonální protilátkou anti-CD20 byla připravena pomocí aminolytické reakce koncových TT skupin přítomných na fluorescenčních polymerech (Příklad 7) a aminoskupin přítomných na molekule protilátky. Roztok monoklonální protilátky anti-CD20 byl přidán k fluorescenčnímu polymeru v molámím poměru anti-CD20 : fluorescenční polymer = 1 : 20. Reakční směs byla za stálého míchání ponechána reagovat v temnu 5 min, produkt byl odsolen na kolonce PD10 (Sephadex G25) ve vodě a zlyofílizován. Přítomnost vzniklé fluorescenční sondy byla potvrzena pomocí rozměrově vylučovací chromatografie (SEC) na koloně Superoseó v 0,3M octanovém pufru o pH 6,5. Podle stejného postupu byla připravena fluorescenční sonda PS2 s navázanou monoklonální protilátkou a fluorescenčním polymerem, který obsahuje koncové A-hydroxysukcinimidyloe stero vé skupiny (Příklad 8). Obdobně byly připraveny fluorescenční sondy z dalších monoklonálních protilátek.
Příklad 10: Redukce disufidických můstků přítomných v molekule monoklonální protilátky antiCD3 pomocí dithiothreitolu (DTT)
Redukce disulfídických můstků byla prováděna za přítomnosti dithiothreitolu v reakčním fosfátovém pufru (0,1 M fosfátový pufir, 10 mM EDTA; pH 7), který byl před použitím probubláván argonem po dobu 30 minut. K roztoku monoklonální protilátky anti-CD3 (0,028 pmol; OKT-3) byl přidán dithiothreitol (1,54 mmol; DTT) a směs byla ponechána reagovat za stálého míchání po dobu 5 minut. Produkt byl přečištěn na kolonce PD10 (Sephadex G25) v reakčním pufru. Takto připravená monoklonální protilátka anti-CD3 byla ihned konjugována s fluorescenčním polymerem připraveným podle Příkladu 6. Charakterizace: obsah sulfhydrylových skupin ~ 9,8.
Podle postupu v Příkladu 10 byly analogicky připraveny další redukované monoklonální protilátky, například anti-CD-4, anti-CD-20, anti-CD-8, anti-CD45, anti-Thyl,2, anti-MHC II, anti JNK.
Příklad 11: Příprava polymerní sondy s navázanou monoklonální protilátkou anti-CD3 pomoci click reakce
Fluorescenční sonda PS3 s navázanou monoklonální protilátkou anti-CD3 byla připravena pomocí click reakce koncových maleinimidových skupin přítomných na fluorescenčních polymerech (Příklad 6) a sulfhydrylových skupin přítomných na redukované protilátce (Příklad 10). Roztok přečištěné redukované monoklonální protilátky anti-CD3 byl přidán k fluorescenčnímu polymeru v molámím poměru anti-CD3 : fluorescenční polymer =1:9. Reakční směs byla za stálého míchání ponechána reagovat v temnu 5 min, produkt byl odsolen na
CZ 2019 - 627 A3 kolonce PD10 (Sephadex G25) ve vodě a zlyofilizován. Přítomnost vzniklé fluorescenční sondy byla potvrzena pomocí rozměrově vylučovací chromatografíe (SEC) na koloně Superoseó v 0,3M octanovém pufru o pH 6,5. Chromatografický GPC záznam fluorescenční sondy je uveden na Obr. 1. Podle stejného postupu bylya připraveny fluorescenční sondy PS4 až PS6 z dalších monoklonálních protilátek.
Příklad 12: Modifikace sulfhydrylových skupin přítomných v molekule monoklonální protilátky anti-CD3 click reakce
Na sulfhydrylové skupiny přítomné na redukované protilátce (Příklad 10) byly zavedeny DBCOskupiny pro vazbu fluorescenčních polymerů s koncovou azidovou skupinou (Příklad 4 a 5) pomocí sulfodibenzocyklooktyn-maleinimidem (sDBCO-MI). Vazba sDBCO-MI byla prováděna v reakčním fosfátovém pufru (0,1 M fosfátový pufr, 10 mM EDTA; pH 7), který byl před použitím probubláván argonem po dobu 30 minut. K roztoku monoklonální protilátky anti-CD3 (0,034 pmol; OKT-3) byl přidán sDBCO-MI (0,69 pmol) a směs byla ponechána reagovat za stálého míchání po dobu 60 minut. Produkt byl přečištěn na kolonce PD10 (Sephadex G25) v destilované vodě a lyofilizován. Takto připravená modifikovaná monoklonální protilátka antiCD3 byla použita pro konjugaci s fluorescenčním polymerem podle Příkladu 14.
Podle tohoto postupu byly analogicky připraveny další monoklonální protilátky s modifikovanými sulfhydrylovými skupinami.
Příklad 13: Modifikace aminoskupin přítomných v molekule monoklonální/ protilátky anti-CD3 click reakce
Aminoskupiny lysinových zbytků přítomných na protilátce byly modifikovány pro vazbu fluorescenčních polymerů s koncovou azidovou skupinou (Příklad 4 a 5) pomocí dibenzocyklooktyn-A-hydroxysukcinimidylesteru (DBCO-NHS). Vazba DBCO-NHS byla prováděna v reakčním fosfátovém pufru (0,1 M fosfátový pufr, 10 mM EDTA; pH 7). K roztoku monoklonální protilátky anti-CD3 (0,034 pmol; OKT-3) byl přidán roztok DBCO- NHS (6,80 pmol) v DMSO a směs byla ponechána reagovat za stálého míchání po dobu 60 minut. Produkt byl přečištěn na kolonce PD10 (Sephadex G25) v destilované vodě a lyofilizován. Takto připravená modifikovaná monoklonální protilátka anti-CD3 byla použita pro konjugaci s fluorescenčním polymerem připraveným podle Příkladu 4 a 5.
Podle tohoto postupu byly analogicky připraveny další monoklonální protilátky s modifikovanými aminoskupinami.
Příklad 14: Příprava fluorescenční sondy s navázanou monoklonální protilátkou anti-CD3 pomocí click reakce
Fluorescenční sondy PS7 a PS8 s navázanou monoklonální protilátkou anti-CD3 byly připraveny pomocí click reakce koncových azidových skupin přítomných na fluorescenčních polymerech (Příklad 4 a 5) a DB CO-skupin zavedených na molekuly protilátek (Příklad 12 a 13) . Roztok monoklonální protilátky anti-CD3 v pufru (0,lM fosfátový pufr, 10 mM EDTA, pH 7) byl přidán k fluorescenčnímu polymeru v molámím poměru anti-CD3 : fluorescenční polymer = 1 : 20. Reakční směs byla za stálého míchání ponechána reagovat v temnu 5 min, produkt byl odsolen na kolonce PD10 (Sephadex G25) ve vodě a zlyofilizován. Přítomnost vzniklé fluorescenční sondy byla potvrzena pomocí rozměrově vylučovací chromatografíe (SEC) na koloně Superoseó v 0,3M octanovém pufru o pH 6,5. Podle stejného postupu byly připraveny fluorescenční sondy s dalšími protilátkami a fluorofory.
CZ 2019 - 627 A3
Tabulka 5 Přehled a charakterizace připravených typů fluorescenčních sond.
fluorescen ční sonda koncová skupina na polymeru protilátka reaktivní skupiny na protilátce počet polymemíc h řetězců na protilátce počet fluorofor ů na PS zdánlivá molámí hmotnost4
PSI TT anti-CD3 Lys-NH2 4,3 18,5 255 000
PS2 NHS anti-CD3 Lys-NH2 3,9 20,3 245 000
PS3 MI anti-CD3 Cys-SH1 6,2 26,0 303 000
PS4 MI anti-CD4 Cys-SH1 7,2 33,8 329 000
PS5 MI anti-CD8 Cys-SH1 8,1 43,7 352 000
PS6 MI anti-CD20 Cys-SH1 6,5 28,6 311 000
PS7 N3 anti-CD3 -DBCO2 5,7 26,2 290 000
PS8 N3 anti-CD3 -DBCO3 5,4 24,8 283 000
1 SH-skupiny byly získány redukcí disulfídických můstků.
2 DBCO-skupiny byly na protilátku zavedeny na SH-skupiny za použití sDBCO-maleinimidu.
3 DBCO-skupiny byly na protilátku zavedeny na NH2-skupiny za použití DBCO-NHS.
4 Zdánlivá molámí hmotnost polymemí sondy byla stanovena jako součet molámí hmotnosti protilátky a A/„ polymemích řetězců navázaných na protilátce.
Příklad 15: Příprava fuorescenčního polymeru pro přípravu multispektrální fuorescenční nanosondy
Fluorescenční polymer pro přípravu multispektrální fluorescenční nanosondy byl připraven pomocí aminolytické reakce fluoroforů Dy-490 a Dy-647P1 s příslušným polymemím prekurzorem. Vhodné deriváty Dy-490 a Dy-647P1 byly do reakční směsi přidány v molámím poměru 1:1 postupně po 5 minutách. Následující postup práce byl stejný jako v Příkladech 4, 5 a 6. Charakterizace: obsah fluoroforů: Dy-409 ~ 0,45 mol%; Dy-647P1 ~ 0,40 mol%. Molámí poměr fluoroforů: 1,15 : 1.
Podle postupu v Příkladu 15 byly analogicky připraveny další fluorescenční polymery pro přípravu multispektrálních fluorescenčních nanosond s různými fluorofory a jejich vzájemnými molámími poměry. Jejich excitační vlnové délky byly v rozsahu 300-850 nm a emisní vlnové délky v rozsahu 350-1200 nm. Obsah fluoroforů byl v intervalu od 0,2 do 3 mol%. Viz Tabulka 6. Stejným způsobem byly připraveny i ostatní fluorescenční polymery obsahující dvojice fluoroforů.
Tabulka 6: Fyzikálně-chemická charakterizace fluorescenčních polymerů pro přípravu multispektrální fluorescenční sondy připravených podle Příkladu 15.
CZ 2019 - 627 A3
Vzore k fluorofor 1 (FL1) fluorofor 2 (FL2) poměr FLEFL 2
název ex/em obsah (mol%) název ex/em obsah (mol%)
15-1 Dy-490 490/51 5 0,55 Dy- 647P1 650/67 0 1,49 1:2,7
15-2 Dy-490 490/51 5 1,45 Dy- 647P1 650/67 0 0,28 5,2:1
15-3 Dy-490 490/51 5 0,20 Dy- 647P1 650/67 0 2,06 1:10,8
15-4 Dy-490 490/51 5 2,76 Dy- 647P1 650/67 0 0,48 1:5,8
15-5 Dy- 396XL 396/57 6 0,38 Dy- 647P1 650/67 0 0,43 1:1,1
15-6 Dy- 396XL 396/57 6 0,54 Dy- 647P1 650/67 0 1,66 1:3,1
15-7 Dy- 396XL 396/57 6 1,56 Dy- 647P1 650/67 0 0,47 3,3:1
Příklad 16: Příprava multi spektrální fluorescenční nanosondy za pomocí fluorescenčního polymeru a redukované monoklonální protilátky anti-CD3
Multispektrální fluorescenční nanosonda byla připravena konjugací fluorescenčního polymeru (Příklad 15) a redukované monokonální protilátky anti-CD3 (Příklad 10) podle postupu uvedeného v Příkladu 11.
Příklad 17: Příklad charakterizace fluorescenčních polymerů a fluorescenčních sond
Připravené kopolymery, fluorescenční polymery i fluorescenční sondy s monoklonálními protilátkami byly charakterizovány stanovením váhového i početního průměru molámích hmotností (A/w. A/n) a příslušného indexu polydisperzity (£>) pomocí rozměrově vylučovací chromatografíe (SEC) na systému vybaveném UV detektorem (Shimadzu, Japan), RI detektorem (Optilab REX, Wyatt Technology Corp., USA) a víceúhlovým detektorem rozptylu světla (DAWN Heleos-II, Wyatt Technology Corp., USA). Pro charakterizaci byla v případě SEC použita kolona TSK 3000 Super SW a jako mobilní fáze směs MeOH (80 %) a 0,3M octanového pufiru o pH 6,5 (20 %), v případě charakterizace sond s monoklonálními protilátkami byla použita kolona Superoseó a jako mobilní fáze 0,3M octanový pufr o pH 6,5. Koncentrace vzorků byla ve všech případech 3 mg/ml.
Obsah TT- a NH2-skupin, zakopolymerovaných statisticky podél polymemího řetězce, byl stanoven spektrofotometricky. Všechna měření byla prováděna na UV-VIS spektrofotometru Specord 205 (Analytik Jena, Německo). Obsah TT-skupin byl stanoven podle literatury (Subr, V.; Koňák, Č.; Laga, R.; Ulbrich, K. Biomacromolecules 2006, 7(1): 122-130) v methanolu (ejO5 = 10 800 l-mol1· cm1). Obsah aminových skupin (po deprotekci v destilované vodě při 150 °C v zatavené polymerizační ampuli) byl stanoven dle metody popsané ve Fields R. Methods Enzymol. 1972; 25: 464-468 (6420 = 11 550 l-mol1 cm1). Obsah navázaných fluoroforů byl stanoven spektrofotometricky.
CZ 2019 - 627 A3
Příklad 18: Vliv času reakce na funkci fluorescenční sondy
Fluorescenční polymer (polymemí prekurzor s fluorescenční značkou FITC podle Příkladu 5 a 6) byl použit pro konjugaci s monoklonální protilátkou CD20-RTX po dobu 5 min. (A), 10 min. (B), 15 min. (C) a 30 min. (D). Fluorescenční polymer s FITC a protilátka byly inkubovány 15 minut se vzorkem lidské periferní krve běžnou procedurou (inkubace s protilátkou, lyzace erytrocytů roztokem chloridu amonného a centrifugace). Připravená suspenze buněk byla změřena průtokovým cytometrem (BD Celesta, excitace 488 nm laserem a detekce emise v pásmu 530/30 nm). Všechny testované časy vedly ke stejně výrazné intenzitě fluorescence CD20RTX FITC (Obr. 2), která byla srovnatelná s komerčně dostupnými reagenciemi CD20 FITC.
Krevní vzorek obsahuje dle očekávání směs T-lymfocytů, NK buněk a B-lymfocytů, přičemž pouze B-lymfocyty nesou na povrchu molekulu CD20, která je detekována polymemí sondou a reprezentovaná pozitivním vrcholem v pravé části grafů. Negativní signál v levé části obrázku patří T-lymfocytům a NK buňkám, které CD20 znak nenesou. Fluorescenční sonda tedy poskytuje očekávaný výsledek při extrémně krátké době konjugace. Výsledná polymerní fluorescenční sonda je použitelná pro detekci lidských buněk nesoucích protilátkou cílenou molekulu.
Příklad 19: Příklad použití konjugační sady pro značení protilátek
Konjugační sada pro značení protilátek se skládá z fluorescenčních polymerů, které nesou podél řetězce různé fluorescenční značky (Příklad 4 a 5) a koncové maleinimidové skupiny. Dále obsahuje reakční pufr (0,lM fosfátový pufr, 10 mM EDTA, pH 7), dithiothreitol (DTT) a kolonky obsahující zesíťovaný dextran o molekulové hmotnosti 100 až 5000 g/mol (Sephadex G25) o objemu 0,8 ml (PD SpinTrap G-25), která je vhodná pro centrifůgační separaci vysokomolekulámích látek od nízkomolekulámích příměsí. Postup spočívá ve dvou základních krocích:
A. Redukce monoklonální protilátky a odstranění DTT z reakční směsi. 150 pg monoklonální protilátky bylo rozpuštěno ve 100 μΐ reakčního pufm a přidáno 231 pg DTT v 50 pl reakčním pufiru. Reakční směs byla ponechána reagovat za podmínek uvedených v Příkladu 10. Produkt (150 pg redukované monoklonální protilátky ve 150 pl reakčního pufm) byl přečištěn na kolonce PD SpinTrap G-25 a v dalším kroku přidán k fluorescenčnímu polymem.
B. Konjugace redukované monoklonální protilátky s fluorescenčním polymerem. Redukovaná monoklonální protilátka byla konjugována s fluorescenčním polymerem v molámím poměm 1 : 9 (150 pg redukované monoklonální protilátky a 260 pg fluorescenčního polymem o Mn = 27 800 g/mol) podle postupu uvedeného v Příkladu 11. Směs byla nechána reagovat po dobu 5 minut a následně byl vzniklý produkt použit pro cytometrickou analýzu.
Pomocí takové konjugační sady je možné označit také vlastní proteinové struktury, které mají ve své molekule vhodné funkční skupiny (viz Obr. 9).
Příklad 20: Variabilní konstrukce polymerních fluorescenčních sond
Bylo připraveno několik konjugačních sad, které sestávají z fluorescenčního polymem s fluorescenční značkou (fluoroforem) o různých excitačních a emisních charakteristikách (Dy396XL; Dy395XL; s Dy682; Dy410; Dy480XL). Rychlou konjugací s protilátkou CD3 OKT3 anebo s CD20 RTX jsme připravili polymemí fluorescenční sondy. Tyto sondy byly inkubovány 15 minut se vzorky lidské periferní krve běžnou procedurou. Připravená suspenze buněk byla změřena průtokovým cytometrem BD Celesta, s excitací 488 nm, 405 nm anebo 640 nm a detekce emise v pásmech uvedených v popisku osy x na Obrázku 3. Všechny připravené a testované polymemí fluorescenční sondy vedly k očekávanému profilu značení vzorku lymfocytů, CD3 na T-lymfocytech a CD20 na B-lymfocytech. Separace pozitivních a negativních
CZ 2019 - 627 A3 buněk byla variabilní podle zvoleného fluoroforu a efektivity jeho excitace dostupnými lasery. Polymerní fluorescenční sondy umožňují detekci buněk nesoucích cílovou molekulu. Variabilita konjugační sady umožňuje flexibilitu výběru protilátky dle potřeb uživatele, tyto polymerní fluorescenční sondy lze detekovat v různých kanálech průtokového cytometru a lze tedy zajistit optimální složení konjugátů protilátek na míru výzkumnému či diagnostickému úkolu.
Příklad 21: Multispektrální konjugační sady
Byly připraveny konjugační sady s vícebarevným spektrálním profilem. Fluorescenční polymer byl připraven navázáním směsi dvou fluoroforů Dy-490 a Dy-647P1 v různých poměrech podle Příkladu 15. Zároveň byly připraveny fluorescenční polymery s jednotlivými fluorofory Dy-490 a Dy-647P1. Fluorescenční polymery byly konjugovány na protilátku CD8 OKT-8. Princip možnosti rozlišení partikulí označených jednotlivými typy polymerů s různými spektrálně odlišitelnými charakteristikami jsme otestovali pomocí částic UltraComp (Invitrogen) obarvených protilátkami konjugovanými s polymery obsahujícími fluorofory Dy-490 a Dy647P1 v různých poměrech a jednobarevnými polymery s Dy-490 a Dy-647P1. Částice byly inkubovány v šesti oddělených alikvotech s každým typem fluorescenčního polymeru a protilátky zvlášť. Měření jsme prováděli pomocí průtokového cytometru. Jako kontrolní neznačený vzorek jsme přidali UltraComp částice bez inkubace s polymerní fluorescenční sondou. Jak dokumentuje Obrázek 4, jednotlivé typy spektrálně unikátních polymerů je možné odlišit jako oddělené skupiny částic stejných charakteristik (odlišeno v Obrázku 4). Tímto způsobem lze tedy označit různé typy částic (tzv. barcoding) pro efektivní analýzy směsí vzorků pomocí mnohobarevných panelů protilátek. Kombinací pouhých dvou fluoroforů umožňuje odlišit šest typů barcodu. Bylo zdokumentováno úspěšné použití multispektrálních fluorescenčních sond pro odlišení šesti původních vzorků v pouhých dvou detekčních kanálech průtokového cytometru.
Příklad 22: Fyziologické sondy
Protilátky anti-CD71 a anti-MHCII byly označeny kombinací fluorescenčních polymerů nesoucích kombinaci dvou fluoroforů (Příklad 4, 5 a 6). Jedním fluoroforem je FITC, u kterého dochází ke snížení fluorescence v prostředí s nižším pH, a druhým fluoroforem je Dyomics-615, který v rozsahu pH 3,5-9 vykazuje stabilní fluorescenci nezávislou na pH.
Izolované myší splenocyty (kmen Balb-C) byly homogenizovány a promyty v HBSS. Následně byly ochlazeny a při 4 °C 20 minut značeny s protilátkami. Následně promyty, převedeny do 37°C do kultivačního média a v lOminutovém intervalu byly analyzovány na průtokovém cytometru BD LSR-II a jako parametr byl analyzován v čase poměr emise FITC vs. Dy-615.
Z obrázku 5 je zřejmá výrazná změna poměru emise fluoroforů s prodlužujícím se časem inkubace. Jak protilátka vstupuje do buňky, je intemalizována do kyselých organel (lyzozómů, pozdní endozómů), kde klesá kvantový výtěžek emise FITC zatímco emise Dy-615 zůstává na výchozí úrovni. Rychle se intranalizující transferinový receptor (CD71) vykazuje rychlou změnu poměru fluorescencí, zatímco pomalu intemalizující MHC-II ukazuje kontinuální pomalý pokles.
Tímto způsobem je možné velice přesně monitorovat rychlost intemalizace povrchových struktur v závislosti na použité protilátce a vypočítat a analyzovat kinetiku pohlcení a přechod do kyselých intracelulámích kompartmentů a to buď pomocí průtokové cytometric nebo pomocí kvantitativních zobrazovacích technik.
Příklad 23: Mikroskopie
Protilátka anti mouse-CD45 (CapricoBio, USA) byla označena pomocí fluorescenčního polymeru nesoucího Dy-485XL (Příklad 4 a 6) a protilátka anti-mouse CD8 (CapricoBio, USA) byla označena pomocí fluorescenčního polymeru nesoucího Dy-395XU (Příklad 4 a 6). Tkáně sleziny
CZ 2019 - 627 A3 byly sekcí vyňaty z usmrcených myší kmene Balb/C, nařezány na malé kousky, vloženy do OCT zmrazovacího média (Sakura Finetek, Torrance, CA) a uloženy při -80 ° C. Tkáňové řezy (8 pm silné) byly fixovány v chlazeném acetonu po dobu 5 minut, osušeny na vzduchu, promyty studeným PBS a blokovány 10% normálním koňským sérem (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) po dobu 30 minut při pokojové teplotě (RT) . Značení protilátkami probíhalo při 4 °C 20 minut s připravenou směsí obou protilátek současně. Po promytí studeným PBS byly fixovány 1% paraformaldehydem a přeneseny do vodného média obsahujícího DAPI (Sigma) a vizualizovány na mikroskopu Olympus FV-1000 v příslušných vlnových délkách (Dy-485XL Ex 480nm a Em 570/40nm, Dy-395XL Ex 405nm a Em 570/40nm).
Na Obrázku 6 jsou jasně vidět zeleně označené populace lymfocytů (anti-CD45) a červeně označené T-buňky (anti-CD8), jádra všech buněk v preparátu jsou označena modře DAPI.
Obě uživatelsky značené protilátky tak lze úspěšně použít i v kombinaci pro multiplexní analýzu preparátů pro fluorescenční mikroskopii.
Příklad 24: Western Blot
Protilátka anti JNK byla označena pomocí konjugační sady využívající fluorescenční polymery nesoucí fluorofor Dy-701 (Příklad 4 a 6).
Buněčné lyzáty byly separovány na 12% SDS - PAGE, přeneseny na nitrocelulózové membrány a blokovány v 5% odtučněném mléce v PBS-T. Membrána byla inkubována s neznačenou králičí anti JNK protilátkou nebo s anti-JNK protilátkou označenou fluorescenčním polymerem nesoucím fluorofor Dy-701. Sekundární protilátka použitá pro vizualizaci membrány označené neznačenou protilátkou byla IRDye IRDye 800 (anti králík). Detekce a kvantifikace byla provedena pomocí infračerveného zobrazovacího systému Odyssey (LI-Cor Biosystems).
Z Obrázku 7 je patrné, že protilátka značená přímo pomocí konjugační sady (Obr 7B.) dosahuje identických výsledků jako využití sekundární profesionálně značené protilátky (Obr 7A.).
Příklad 25: In vivo imaging
Protilátka anti mouse Thy 1,2 byla označena pomocí konjugační sady využívající fluorescenční polymer nesoucí fluorofor Dy-701 (Příklad 4 a 6). Celkem 1 · 106 buněk myšího thymomu EL-4 bylo subkutánně injikováno do pravého boku myší NuNu a byl zaznamenán růst nádoru.
Zobrazování in vivo bylo prováděno na OV100 Whole Mouse System (Olympus Corp.) obsahujícím světelný zdroj MT-20 a CCD kameru Orca II ERG (Hamamatsu, Japonsko). Zvířata byla anestetizována intraperitoneální injekcí 300 μΐ na myš 1% Narkamonu. Zobrazování růstu nádoru bylo neinvazivní, pozorování akumulace specifické protilátky v nádorové mase bylo prováděno přes pokožku překrývající nádor. Fluorescence protilátky specificky značící nádorové buňky byla vizualizována pomocí specifických filtrů (Ex 700 nm, Em 750/40). Snímky byly pořizovány samostatně pro fluorescenční kanál a pro odražené světlo, sloučeny a obarveny v softwaru AnalySIS 3.2.822 (SIS Systems).
Obrázek 8 jednoznačně ukazuje akumulaci fluorescence v mase nádoru detekovatelnou již po 12 hodinách po podání značené fluorescenční sondy. Lokalizace fluorescenčního signálu až po periferii nádoru pak jednoznačně umožňuje lokalizovat nádor a vymezit přesně jeho hranice.

Claims (16)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Fluorescenční polymer, obsahující semitelechelický statistický lineární kopolymer, na který je navázána alespoň jedna fluorescenční značka v množství od 0,4 do 12 mol. %, vztaženo na počet monomemích jednotek, přičemž semitelechelický statistický lineární kopolymer obsahuje polyakrylamid, polymethakrylamid, nebo poly(A-(2-hydroxypropyl)methakrylamid), ve kterém je od 0,4 do 12 mol. % monomemích jednotek nahrazeno monomemí jednotkou obecného vzorce (I)
    kde
    Rje vybraný ze skupiny sestávající z lineárního nebo rozvětveného uhlíkového alkylenylového řetězce s počtem uhlíků od 1 do 6, a -(CH2)q-(C(O)-NH-(CH2)r)P-, kde p=l až 5, a q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; přičemž Rmůže být dále substituován jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;
    Y je vybraný ze skupiny sestávající z vazby, -C(=O)-NH-, -NH-C(=O)-, -NH-C(=S)-NH-;
    přičemž molekulová hmotnost Mn semitelechelického statistického lineárního kopolymeru je v rozmezí od 10 000 do 100 000 g/mol;
    a přičemž fluorescenční značka má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1 500 g/mol, excitační vlnovou délku v rozmezí od 300 do 850 nm a emisní vlnovou délku v rozmezí od 350 do 1 200 nm a je kovalentně vázaná v monomemí jednotce obecného vzorce (I) semitelechelického statistického lineárního kopolymem pomocí terminálního aminu nebo thiokyanátu nebo N-hydroxysukcinimidového estem, přičemž skupiny vzniklé po navázání fluorescenční značky jsou následně součástí skupiny Y;
    a přičemž fluorescenční polymer obsahuje na jednom konci polymemího řetězce funkční skupinu pro navázání na proteinovou strukturu, vybranou ze skupiny zahrnující estery, s výhodou Nhydroxysukcinimidylový ester nebo (Cl až C4) alkyl estery, amidy, s výhodou thiozolidin-2thionový amid, maleimid, azid, propargyl, s výhodou je touto funkční skupinou azid nebo maleimid.
    CZ 2019 - 627 A3
  2. 2. Fluorescenční polymer podle nároku 1, kde semitelechelický statistický lineární kopolymer obsahuje poly(/V-(2-hydroxypropyl)methakrylamid), ve kterém je od 0,4 do 12 mol. % monomemích jednotek nahrazeno monomemí jednotkou obecného vzorce (I).
  3. 3. Fluorescenční polymer podle nároku 1 nebo 2, kde R je vybraný ze skupiny zahrnující ethen-l,2-diyl; propan-l,3-diyl; hexen-l,6-diyl; -CH2-C(=O)-NH-CH2-; -CH2-C(=O)-NHCH(CH2-CH(CH3)2)-C(=O)-NH-CH2-; -CH2-C(=O)-NH-CH(CH2Ph)-C(=O)-NH-CH(CH2CH(CH3)2)-C(=O)-NH-CH2-; -CH2-C(=O)-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-C(=O)-NH-CH(CH2Ph)-
    C(=O)-NH-CH2-; -CH2-C(=O)-NH-CH(CH2Ph)-C(=O)-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-C(=O)-NHCH(CH2Ph)-C(=O)-NH-CH2-.
  4. 4. Fluorescenční polymer podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 3, který dále obsahuje do 11,6 mol. % monomemích jednotek obecného vzorce (II), vztaženo na počet monomemích jednotek,
    kde R je definováno v nároku 1 a Z je vybrané ze skupiny zahrnující -C(=O)-NH-(CH2)aCH2(OH); -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)-CH3; -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)-(CH2)c-CH3; kde a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 0 do 3 a c je od 1 do nebo 4; -NH-C(=O)-CH3;
    přičemž celkem je monomemích jednotek obecného vzorce (I) a (II) ve fluorescenčním polymem nejvýše 12 mol. %, vztaženo na počet monomemích jednotek.
  5. 5. Fluorescenční polymer podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 4, kde fluorescenční značka je vybraná ze skupiny zahrnující fluorescein, fluoresceinisothiokyanát, deriváty ruthenium-bipyridinových komplexů Ru(bpy)3, zejména bis(2,2'-bipyridin)-[4-(4'-methyl-2,2'bipyridin-4-yl)butan-l-aminium ruthenium tris(perchlorát), cyaniny, 3,6-diamino-9-[4-(2aminoethylkarbamoyl)-2-karboxy-fenyl] -5 -(3 -sulfonatopropylsulfamoyl)xanthen-10-ium-4sulfonát, (2E)-1 -[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy-6-oxo-hexyl] -2-[(2E,4E)-5-[ 1 -(2- methoxyethyl)-3,3-dimethyl-5-sulfonato-indol-l-ium-2-yl]penta-2,4-dienylidene]-3,3- dimethylindoline-5-sulfonát, 3-[4-[(E)-2-[6-[6-(2-aminoethylamino)-6-oxo-hexoxy]-l,3-benzoxazol-2yl]vinyl]-l-pyridyl]propane-l-sulfonát, -[4-[6-[[6-(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)oxy-6-oxohexyl]karbamoylamino]-l,3-benzoxazol-2-yl]pyridin-l -ium-1 -yl]propane-l-sulfonate, 3-[[6-(2azaniumylethylamino)-6-oxo-hexyl]karbamoyl]-8-chloro-7-hydroxy-2-oxo-chromene-6sulfonate, 3-[4-[7-[[6-(2-aminoethylamino)-6-oxo-hexyl]-ethyl -amino]-2-oxo-chromen-3yl]pyridin-l-ium-l-yl]propan-l -sulfonát, l-[6-(2-aminoethylamino)-6-oxo- hexyl]-6-[(E)-2-[7(diethylamino)-2-oxo-chromen-3-yl]vinyl]pyridin-l-ium-3-sulfonát, l-[6- (2-aminoethylamino)6-oxo-hexyl]-4-[(E)-2-[7-(diethylamino)-2-oxo-chromen-3-yl]vinyl]pyridin-l-ium-3-sulfonát, (2E)-2-[(E)-3-(7-amino-2-terc-butyl-chromenylium-4-yl)prop-2-enyliden]-l-[6-(2aminoethylamino)-6-oxo-hexyl]-3,3-dimethyl-indoline-5-sulfonát, (2Z)-3-[4-(2aminoethylamino)-4-oxo-butyl ]-2-[(E)-3-[4-terc-butyl-7-[ethyl(330
    CZ 2019 - 627 A3 sulfonatopropyl)amino]chromenylium-2-yl]prop-2-enylidene]-3-methyl-l-(3sulfonatopropyl)indoline-5-sulfonát a (2Z)-3-[4-(2-aminoethylamino)-4-oxo-butyl]-2-[(E)-3-[7(diethylamino)-3-methyl-4-phenyl-chromenylium-2-yl]prop-2-enyliden]-3-methyl-1-(3sulfonatopropyl)indoline-5-sulfonate, popřípadě jejich deriváty obsahující funkční skupinu, vybranou z amino skupiny, isothiokyanátové skupiny a N-hydroxysukcinimidové skupiny.
  6. 6. Fluorescenční polymer podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 5, který obsahuje alespoň dvě různé fluorescenční značky.
  7. 7. Fluorescenční sonda, vyznačená tím, že obsahuje alespoň jeden fluorescenční polymer podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, ke kterému je kovalentně přes koncovou skupinu lineárního polymemího řetězce navázána proteinová struktura, vybraná ze skupiny sestávající z peptidu o počtu aminokyselin od 10 do 200, proteinu, lipoproteinu, protilátky, enzymu, hormonu nebo buněčného receptoru, s výhodou je proteinovou strukturou monoklonální protilátka a fluorescenční polymer je kovalentně navázán na lehký řetězec této monoklonální protilátky, výhodněji na lehký řetězec monoklonální protilátky vybrané ze skupiny zahrnující anti-CD20, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD71, anti-MHCII, anti-CD45, anti-JNK.
  8. 8. Způsob přípravy fluorescenční sondy, podle nároku 7, vyznačený tím, že obsahuje následující kroky:
    a) poskytnutí monomerů semitelechelického lineárního kopolymeru, vybraných ze skupiny, zahrnující A-(2-hydroxypropyl)methakrylamid, akrylamid, methakrylamid; a monomerů obecného vzorce (IV)
    (IV), kde R je vybraný ze skupiny sestávající z lineárního nebo rozvětveného uhlíkového alkylenylového řetězce s počtem uhlíků od 1 do 6, a -(CH2)q-(C(O)-NH-(CH2)r)P-, kdep=I až 5, a q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány z 1, 2 a 3; přičemž Rmůže být dále substituován jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;
    a X je -karbonyl-thiazolin-2-thionová skupina nebo -NH2 skupina, přičemž -NH2 skupina může být popřípadě chráněná chránící skupinou;
    b) polymerace monomerů za vzniku semitelechelického lineárního kopolymeru,
    c) navázání fluorescenční značky na semitelechelický lineární kopolymer za vzniku fluorescenčního polymeru,
    d) volitelně modifikace proteinové struktury,
    e) navázání proteinové struktury na fluorescenční polymer.
  9. 9. Způsob přípravy fluorescenční sondy podle nároku 8, vyznačený tím, že krok b) polymerace monomerů se provede řízenou radikálovou RAFT polymerizací monomerů z kroku
    CZ 2019 - 627 A3
    a) s obsahem od 0,4 do 12 mol. % monomeru obecného vzorce (IV), a alespoň 88 mol. % monomemích jednotek, vybraných ze skupiny zahrnující /V-(2-hydroxypropyl)methakrylamid, akrylamid, methakrylamid, , přičemž polymerace se provede při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofuran, propanol, terc-butanol nebo jejich směsi;
    za iniciace iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující 2.2'-azobis|A'-(2karboxyethyl)-2-methylpropionamidine] a /V-(3-azidopropyl)-4-[(Z)-[4-(3-azidopropylamino)-lkyano-1 -methyl-4-oxo-butyl] azo] -4-kyano-pentanamid;
    popřípadě za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou V-(3-azidopropyl)-4ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-4-methyl-pentanamidu;
    popřípadě se následně odstraní chránící skupiny na aminových skupinách postranních řetězců.
  10. 10. Způsob přípravy fluorescenční sondy podle nároku 8 nebo 9, vyznačený tím, že krok c) navázání fluorescenční značky na semitelechelický lineární kopolymer se provede konjugací volných aminových skupin nebo karbonyl-thiazolidin-2-thionových skupin monomemích jednotek obecného vzorce (IV) semitelechelického lineárního kopolymem s fluorescenční značkou, obsahující reaktivní aminovou nebo SCN skupinu, přičemž fluorescenční značka má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1 500 g/mol, excitační vlnovou délku v rozmezí od 300 do 850 nm a emisní vlnovou délku v rozmezí od 350 do 1 200 nm; a přičemž fluorescenční značka se k semitelechelickému lineárnímu kopolymem naváže amidovou nebo thioamidovou vazbou;
    popřípadě se nezreagované thiazolidin-2-thionové skupiny odstraní reakcí s aminoalkoholem, vybraným ze skupiny zahrnující NH2-(CH2)a-CH2(OH); NH2-(CH2)b-CH(OH)-CH3; NH2- (CH2)bCH(OH)-(CH2)c-CH3; kde a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 0 do 3 a c je od 1 do 4 a/nebo se nezreagované NH2 skupiny odstraní reakcí s acetythiazolidin-2-thionem;
    popřípadě se výsledný fluorescenční polymer podrobí dalším reakcím, vedoucím ke změně reakční skupiny na konci semitelechelického řetězce, s výhodou klik reakci azidové skupiny s dibenzocyklooktyn-maleinimidem za vzniku maleinimidové funkční skupiny na jednom konci lineárního polymemího řetězce;
    nebo klik reakci azidové skupiny s dibenzocyklooktyn-karboxylem a následně s thiazolidin-2thionem za vzniku fluorescenčního polymem s thiazolidin-2-thionovou funkční skupinou na jednom konci lineárního polymemího řetězce;
    nebo klik reakci azidové skupiny s dibenzocyklooktyn-/V-hydroxysukcinimidylesterem za vzniku fluorescenčního polymem s /V-hydroxysukcinimidylesterovou funkční skupinou na jednom konci lineárního polymemího řetězce.
  11. 11. Způsob přípravy fluorescenční sondy podle kteréhokoliv z nároků 8, 9 nebo 10, vyznačený tím, že krok d) modifikace proteinové struktury se provede redukcí disulfidických můstků proteinové struktury pomocí redukčního činidla vybraného ze skupiny dithiothreitol, tris(2karboxyethyljfosfm, //-mcrkaptocthanol. glutathion, ve vodném pufm při pH od 6,5 do 7,5, při laboratorní teplotě za vzniku -SH skupin v proteinové stmktuře, které mohou být popřípadě dále modifikovány reakcí se sulfodibenzocyklooktyn-maleinimidem za vzniku sulfodibenzocyklooktynových skupin;
    a/nebo se modifikují volné NH2 skupiny proteinové struktury na dibenzocyklooktynové skupiny reakcí s dibenzocyklooktyn-/V-hydroxysukcinimidylesterem.
    CZ 2019 - 627 A3
  12. 12. Způsob přípravy fluorescenční sondy podle kteréhokoliv z nároků 8, 9, 10 nebo 11, vyznačený tím, že krok e) navázání proteinové struktury na fluorescenční polymer se provede konjugací alespoň jednoho fluorescenčního polymeru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 a proteinové struktury, popřípadě proteinové struktury se zavedenými sulfhydrylovými, sulfodibenzocyklooktynovými nebo dibenzocyklooktynovými skupinami připravené v kroku d), přičemž reakce probíhá při laboratorní teplotě ve vodném pufru a pH od 6,5 do 7,5.
  13. 13. Konjugační sada pro značení protilátek, vyznačená tím, že obsahuje fluorescenční polymer podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6; reakční pufr o pH 7, obsahující O,1M fosfátový pufr a 10 mM EDTA; dithiothreitol a alespoň jednu kolonku o objemu v rozmezí od 0,5 do 2 ml, která obsahuje zesíťovaný dextran o molekulové hmotnosti 100 až 5 000 g/mol.
  14. 14. Použití fluorescenčního polymeru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 a/nebo konjugační sady podle nároku 13, pro fluorescenční značení proteinových struktur vybraných ze skupiny peptid, protein, lipoprotein, protilátka, enzym, hormon, receptor, strukturní protein, transportní protein, protein buněčných signalizačních drah, syntetický protein.
  15. 15. Použití fluorescenčního polymeru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 a/nebo fluorescenčního sondy podle nároku 7, ve fluorescenčních zobrazovacích technikách, s výhodou vybraných ze skupiny zahrnující cytometrii, kuličkové assay, mikroskopii, western blot, fluorescenční průtokovou cytometrii.
  16. 16. Fluorescenční sonda podle nároku 7 pro použití jako kontrastní látky v lékařské diagnostice, celotělovém zobrazování a/nebo fluorescenčně asistované chirurgii, s výhodou při diagnostice nádorových, zánětlivých a bakteriálních onemocnění.
CZ2019-627A 2019-10-09 2019-10-09 Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití CZ309828B6 (cs)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-627A CZ309828B6 (cs) 2019-10-09 2019-10-09 Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití
PCT/CZ2020/050078 WO2021069000A1 (en) 2019-10-09 2020-10-09 Fluorescent polymer, fluorescent probe and conjugation kit for advanced functional analysis of cells in haematology, immunology and microbiology, method of preparation and use thereof
EP20815710.7A EP4013834B1 (en) 2019-10-09 2020-10-09 Fluorescent polymer, fluorescent probe and conjugation kit for advanced functional analysis of cells in haematology, immunology and microbiology, method of preparation and use thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-627A CZ309828B6 (cs) 2019-10-09 2019-10-09 Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2019627A3 true CZ2019627A3 (cs) 2021-04-21
CZ309828B6 CZ309828B6 (cs) 2023-11-15

Family

ID=75488671

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2019-627A CZ309828B6 (cs) 2019-10-09 2019-10-09 Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ309828B6 (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ310444B6 (cs) * 2021-09-13 2025-06-25 Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. Fluorescenčně značený polymer pro vizualizaci nádorů a jeho použití

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ293787B6 (cs) * 2001-12-20 2004-07-14 Zentiva, A.S. pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii
EP2895202A1 (en) * 2012-09-13 2015-07-22 Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Diagnostic agents with enhanced sensitivity/specificity
WO2015136545A1 (en) * 2014-03-13 2015-09-17 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Polymeric systems and uses thereof in theranostic applications
CN106995516B (zh) * 2016-01-22 2019-08-02 北京化工大学 肿瘤特异性富集的纳米载药体系及其制备方法
US11801307B2 (en) * 2016-10-14 2023-10-31 University Of Utah Research Foundation Antibody-polymer-drug conjugates

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ310444B6 (cs) * 2021-09-13 2025-06-25 Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. Fluorescenčně značený polymer pro vizualizaci nádorů a jeho použití

Also Published As

Publication number Publication date
CZ309828B6 (cs) 2023-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP4013834B1 (en) Fluorescent polymer, fluorescent probe and conjugation kit for advanced functional analysis of cells in haematology, immunology and microbiology, method of preparation and use thereof
Radford et al. Multivalent HER2-binding polymer conjugates facilitate rapid endocytosis and enhance intracellular drug delivery
US10302632B2 (en) Macromolecular conjugates for visualization and separation of proteins and cells
US8623995B2 (en) Peptide conjugates and fluorescence detection methods for intracellular caspase assay
US20140234866A1 (en) Ex vivo flow cytometry method and device
AU2013303233B2 (en) Prostate specific antigen agents and methods of using same for prostate cancer imaging
JP2016512814A (ja) 腫瘍の標的型画像化のために用いられる化合物にコンジュゲートされたアミノ酸連結基の製造および合成の方法
JPH0220065B2 (cs)
US20230152306A1 (en) Nanoparticles for sensing use and production method for same
US20180079906A1 (en) Azacyanine dyes and use thereof
Xiao et al. Near-infrared optical imaging in glioblastoma xenograft with ligand-targeting α3 integrin
Li et al. Dendronized polymer conjugates with amplified immunogenic cell death for oncolytic immunotherapy
CZ2019627A3 (cs) Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití
KR20040076874A (ko) 표적 치료요법용 안트라사이클린 종양 정지 약물이 결합된피에이치-감응성 폴리머 결합체
CZ33418U1 (cs) Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii
US10633542B2 (en) Azacyanine dyes and use thereof
AU2016207125B2 (en) Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins
CZ2019649A3 (cs) Způsob přípravy polymerních nosičů pro pH-řízené uvolňování léčiv a jejich konjugátů s léčivy
US12359069B2 (en) Azacyanine dyes and use thereof
EP3768780A1 (en) Azacyanine dyes and use thereof
RU2781974C2 (ru) Конъюгаты пептида и полиаминокислоты, связывающие фактор роста эндотелия сосудов
CZ145593A3 (en) Polymeric conjugate of cyclosporin a, process for preparing and use thereof in in vitro diagnostic tests
CA2319490A1 (en) Energy transfer dyes