CZ293787B6 - pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii - Google Patents

pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii Download PDF

Info

Publication number
CZ293787B6
CZ293787B6 CZ20014653A CZ20014653A CZ293787B6 CZ 293787 B6 CZ293787 B6 CZ 293787B6 CZ 20014653 A CZ20014653 A CZ 20014653A CZ 20014653 A CZ20014653 A CZ 20014653A CZ 293787 B6 CZ293787 B6 CZ 293787B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
amino acids
conjugates
amino acid
polymer
units
Prior art date
Application number
CZ20014653A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20014653A3 (cs
Inventor
Karel Doc. Ing. Drsc. Ulbrich
Tomáš Mgr. Etrych
Blanka Prof. Rndr. Drsc. Říhová
Markéta Mgr. Jelínková Phd.
Marek Mgr. Kovář
Original Assignee
Zentiva, A.S.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zentiva, A.S. filed Critical Zentiva, A.S.
Priority to CZ20014653A priority Critical patent/CZ293787B6/cs
Priority to PT02805243T priority patent/PT1463529E/pt
Priority to EP06025316A priority patent/EP1782833A3/en
Priority to CA002470976A priority patent/CA2470976A1/en
Priority to ES02805243T priority patent/ES2331303T3/es
Priority to SK291-2004A priority patent/SK2912004A3/sk
Priority to SI200230855T priority patent/SI1463529T1/sl
Priority to HU0500541A priority patent/HUP0500541A3/hu
Priority to US10/499,422 priority patent/US7919076B2/en
Priority to DE60233434T priority patent/DE60233434D1/de
Priority to PL370719A priority patent/PL216518B1/pl
Priority to AT02805243T priority patent/ATE439864T1/de
Priority to JP2003554229A priority patent/JP4718117B2/ja
Priority to AU2002366715A priority patent/AU2002366715A1/en
Priority to EA200400802A priority patent/EA007353B1/ru
Priority to EP02805243A priority patent/EP1463529B9/en
Priority to DK02805243.9T priority patent/DK1463529T5/da
Priority to PCT/CZ2002/000070 priority patent/WO2003053473A2/en
Priority to KR10-2004-7009872A priority patent/KR20040076874A/ko
Publication of CZ20014653A3 publication Critical patent/CZ20014653A3/cs
Publication of CZ293787B6 publication Critical patent/CZ293787B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Abstract

Konjugáty sestávající z polymerního nosiče tvořeného 30 až 3000 monomerními jednotkami spojenými do polymerního řetězce, složené z a) 60 až 98,5 % jednotek N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, b) 1 až 25 % jednotek methakryloylovaných hydrazonů .alfa.-aminokyselin, .epsilon.-aminokyselin, aromatických aminokyselin nebo oligopeptidů zakončených molekulou antracyklinového kancerostatika, c) 0,5 až 15 % methakryloylovaných .alfa.-aminokyselin, .epsilon.-aminokyselin, aromatických aminokyselin nebo oligopeptidů či jejich sodných solí zaměřená na cílenou terapii nádorových onemocnění v humánní medicíně.ŕ

Description

Oblast techniky
Vynález se týká polymemích kancerostatik umožňujících cílený transport v organizmu a zaměřených na cílenou terapii nádorových onemocnění v humánní medicíně.
Stav techniky
V posledních letech se vývoj nových léčiv a lékových forem stále více zaměřuje na využití polymemích látek, zvláště vodorozpustných polymerů jako nosičů léčiv. Byla připravena a studována celá řada polymemích konjugátů kancerostatik s rozpustnými polymery, ve kterých bylo léčivo s protinádorovým účinkem připojeno k polymeru neštěpitelnou kovalentní vazbou, hydrolyticky nestabilní iontovou vazbou a nebo kovalentní vazbou náchylnou k enzymatické či prosté hydrolýze. Cílem bylo připravit léčiva se zlepšeným farmakokinetickým a farmakodynamickým chováním, umožňujícím cílenou terapii nádorových onemocnění. Významnou skupinu tvoří polymemí léčiva připravená na bázi kopolymerů ΗΡΜΑ. V těchto látkách je kancerostatikum připojeno k polymemímu JV-(2-hydroxypropyl)methakiylamidovému nosiči enzymaticky štěpitelnou oligopeptidovou sekvencí, připravenou jako substrát pro lysozomální enzymy (enzymy přítomné v savčích buňkách). Struktura, syntéza a vlastnosti takovýchto konjugátů jsou popsány v patentu [Duncan 1985]. Přehled dosud dosažených výsledků v této oblasti velmi dobře zpracoval Kopeček a spol. [Kopeček a spol. 2000]. Polymemí léčiva popsaného typu byla účinná při léčení celé řady nádorů u myší a krys. Dva polymemí konjugáty jsou v současné době dokonce testovány klinicky [Vasey 1999 a spol., Julyan a spol. 1999, Thomson a spol. 1999]. Výsledky klinického testování ukázaly, že polymemí konjugát doxorubicinu je méně nespecificky toxický než volné léčivo. Jeho maximální tolerovaná dávka (MTD) je 320 mg/m2 což je 4 až 5x více než je normálně používaná klinická dávka volného doxorubicinu (60 až 80 mg/m2). Po podání polymemího léčiva nebylo pozorováno žádné závažné ovlivnění srdečních funkcí, ačkoliv individuální kumulativní dávka dosáhla hodnoty až 1680 mg/m2. Všechny ostatní toxicity, pozorované v souvislosti s podáváním volných, tj. nesměřovaných antracyklinových antibiotik, byly významně sníženy. Nevýhodou dosud klinicky testovaných polymemích konjugátů léčiv je poměrně malá specifita účinku, neboť tyto konjugáty buď neobsahují směrující jednotku vůbec, jako například PK1, a nebo poměrně málo specifický uhlovodík (galaktosamin v konjugátu PK2, u kterého se ověřuje schopnost směrovat polymemí léčivo do jater). Ve vývoji jsou proto i konjugáty, u kterých by mělo být dosaženo cíleného specifického účinku připojením specifické směrující molekuly (například protilátky, ale také lektinu, růstového hormonu, transferinu apod.) k molekule nosiče.
Další nevýhodou dosud klinicky testovaných konjugátů, včetně konjugátů poly(HPMA) s doxorubicinem, je skutečnost že léčivo je z nich intracelulámě uvolňováno ve farmakologicky aktivní podobě pouze enzymatickou reakcí, ke které dochází v lysozomech. To znamená, že takové léčivo je účinné pouze v buňkách, ve kterých se vyskytuje vysoká koncentrace lysozomálních enzymů - peptidáz. Další nevýhodou je i poměrně složitá struktura konjugátu, který musí obsahovat sekvenci, z níž se léčivo působením peptidáz uvolňuje, většinou tetrapeptidovou spojku GlyPheLeuGly, což prodražuje a komplikuje syntézu.
V literatuře existuje celá řada informací o přípravě a studiu vlastností polymerů nesoucích připojené kancerostatikum vazbou náchylnou k hydrolýze ve vodném prostředí. Výsledky jsou shrnuty v přehledném článku Kratze [Kratz a spol., 1999], Jako nosiče kancerostatik byly většinou použity přírodní makromolekuly, např. albumin, dextrany, transferin, algináty nebo protilátky. V několika případech byly použity i syntetické polymemí nosiče, poly(ethylenglykol) a polyglutaminy. Léčiva byla k nosičům připojena vazbami umožňujícími hydrolýzou řízené uvolnění aktivního léčiva jak v extracelulámím prostoru, tak i uvnitř buněk. V případě
-1 CZ 293787 B6 doxorubicinu (Dox) to byla nejčastěji vazba tvořená estery kyseliny cis-akonitylové nebo hydrazonová vazba. In vivo testování všech výše zmíněných pH senzitivních konjugátů na pokusných zvířatech však nepřineslo přesvědčivé výsledky, a tak žádný z polymemích konjugátů není při léčení nádorových onemocnění používán ani klinicky testován.
Námi vyvinutá polymemí kancerostatika připravená na bázi kopolymerů HPMA skancerostatikem navázaným pomocí hydrazonové pH senzitivní vazby vykazovala při in vitro i in vivo testech na myších podstatně vyšší protinádorovou účinnost proti řadě nádorových linií, než vykazovaly konjugáty u kterých bylo léčivo připojeno na polymemí nosič enzymaticky štěpitelnou vazbou přes oligopeptidovou spojku. Syntéza konjugátů je ve srovnání s dříve vyvinutými poly(HPMA) konjugáty jednodušší, levnější a lépe zvládnutelná, neboť je možné jako spojku použít místo enzymaticky degradovatelné oligopeptidové sekvence pouze jednu aminokyselinu a vazba léčiva na polymer je jednoduchou reakcí. K uvolnění léčiva dochází na základě změny pH okolí a není proto k aktivaci nutná přítomnost lysozomálních enzymů. Rychlost uvolnění (a tedy okamžitá koncentrace cytostatika) je mnohem vyšší, nežli v případě konjugátů obsahujících sekvence štěpitelné pouze enzymaticky [Říhová a spol., 2001, Etrych a spol., 2001].
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu jsou lineární a větvené polymemí konjugáty doxorubicinu, daunomycinu, farmorubicinu a dalších antracyklínových kancerostatik, obsahujících karbonylovou skupinu, s kopolymery připravenými na bázi V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) a případně s protilátkami, jejich fragmenty či nespecifickým imunoglobulinem (obr. 3). Tyto konjugáty se vyznačují tím, že polymemí nosič spolu s protilátkou (imunoglobulinem) zajistí prodlouženou cirkulaci polymemího léčiva v krevním řečišti a jeho následnou přednostní pasivní nebo aktivní akumulaci v nádoru. Kancerostatikum je k nosiči připojeno vazbou stálou v krevním řečišti (při pH 7,4). Po navázání léčiva na polymer ztrácí kancerostatikum biologický účinek, je transportováno krevním řečištěm v neaktivní formě a k aktivaci cytotoxického léčiva dojde až intracelulámě v organelách cílových buňkách v důsledku poklesu pH a hydrolýzy vazby, kterou je léčivo k polymeru připojeno.
Konjugáty sestávají z polymemího nosiče tvořeného 30 až 3 000 monomemími jednotkami spojenými do polymemího řetězce, z nichž 60 až 98,5 % tvoří jednotky 7V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, 1 až 25 % tvoří jednotky methakryloylovaných hydrazonů α-aminokyselin, εaminokyselin, aromatických aminokyselin nebo oligopeptidů zakončených molekulou antracyklinového kancerostatika (s výhodou doxorubicinu) a 0,5 až 15% tvoří jednotky methakryloylovaných a-aminokyselin, ε-aminokyselin, aromatických aminokyselin nebo oligopeptidů či jejich sodných solí, případně je obsaženo 0,5 až 10 % jednotek methakryloylovaných hydrazidů a-aminokyselin, ε-aminokyselin, aromatických aminokyselin nebo oligopeptidů a konjugát může mít případně navázán 0,5 až 5 % methakryloylovaných α-aminokyselin, εaminokyselin nebo oligopeptidů zakončených molekulovou imunoglobulinu nebo specifické monoklonální nebo polyklonální protilátky.
Větvené vysokomolekulámí struktury obsahují kromě výše uvedených jednotek ještě 0,1 až 5 % jednotek tvořících spojky, propojující jednotlivé polymemí řetězce do vysokomolekulámí větvené struktury, které sestávají z enzymaticky degradovatelných methakryloylovaných oligopeptidů, s výhodou tripeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly nebo tetrapeptidu GlyPheLeuGly, propojených diaminy (ethylendiamin, hexamethylendiamin).
Podstatou polymemích konjugátů s cíleným protinádorovým účinkem podle vynálezu je vazba aktivní složky - cytostatika - na polymemí nosič prostřednictvím hydrazonové skupiny vzniklé reakcí karbonylové skupiny v molekule léčiva s hydrazidovou skupinou polymeru. Vazbou léčiva na polymemí nosič dojde k výraznému zvýšení molekulové hmotnosti léčiva, a tím k prodloužení doby cirkulace v krevním oběhu i celkové doby setrvání účinné látky v organizmu. Vazba léčiva
-2CZ 293787 B6 k polymeruje relativně stálá v průběhu transportu léčiva v krevním řečišti a hydrolyticky štěpitelná v mírně kyselém prostředí uvnitř buněk, jmenovitě v buněčných organelách vyznačujících se kyselým pH. To znamená, že léčivo je transportováno krevním řečištěm v neaktivní, na polymer vázané formě, a k jeho uvolnění a aktivaci dojde až po průniku do cílových nádorových buněk. Aktivace léčiva až v cílových buňkách vede k eliminaci vedlejších účinků jinak toxických cytostatik a k zacílení jejich účinku přednostně na nádorové buňky. Za cílený transport do nádoru či nádorových buněk je odpovědný polymemí nosič na bázi kopolymerů HPMA. V případě větveného vysokomolekulámího poly(HPMA) nosiče dochází k ukládání polymemího léčiva do tkáně pevných nádorů v důsledku pasivního „targetingu“ a EPR efektu (Enhanced Permeability and Retention effect). Polymer může být z organizmu uvolněn po enzymatické degradaci oligopeptidových spojek ve formě kratších polymemích řetězců např. glomerulámí filtraci. V případě nosičů obsahujících protilátky (imunoglobulin) je protilátka připojena k nosiči pomocí hydrazonové vazby vzniklé reakcí aldehydových skupin zavedených do Fc fragmentu protilátky oxidací jodistanem sodným s hydrazonovými skupinami nosiče. Protilátka (imunoglobulin) může být připojena k řetězci polymemího nosiče rovněž za použití bifunkčních činidel. V tomto případě je molekula protilátky modifikována reakcí s 2-iminothiolanem (zavedení -SH skupin), do polymeru jsou zavedeny maleinimidové skupiny reakcí hydrazidových skupin polymeru se sukcinimidovým esterem 3-maleinimidopropionové kyseliny a ke konjugaci dojde adicí -SH skupiny protilátky na dvojnou vazbu maleinimidové skupiny polymeru. Obdobně je možné ke konjugaci použít jiného bifunkčního činidla -SPDP (N-hydroxysukcinimidový ester kyseliny 3(2—pyridyldithio) propionové), kterým je možné konjugovat -SH skupiny obsahující protilátku (imunoglobulin) přímo k hydrazidovým skupinám polymemího nosiče.
Konjugát s protilátkou (imunoglobulinem) je v cílových orgánech/tkáních akumulován pasivně a aktivně. Pasivní akumulaci umožňuje vyšší molekulová váha konjugátu a uplatňuje se při ní tzv. EPR efekt, aktivní akumulaci zajišťuje proces, při kterém dochází k interakci vazebného místa směrující protilátky s odpovídajícími receptory na povrchu cílových buněk. V tomto případě hraje HPMA kopolymer roli nejen nosiče, ale i ochranného obalu, který podstatným způsobem snižuje imunogenicitu směřujícího glykoproteinu v konjugátu.
Polymemí léčivo podle vynálezu může být použito ve třech formách, lišících se detailní strukturou. První struktura představuje lineární polymemí konjugát s léčivem bez směrující protilátky (imunoglobulinu) (obr. 1), druhá struktura je vysokomolekulámí a představuje větvenou strukturu polymeru s biodegradovatelnými oligopeptidovými spojkami (obr. 2) a třetí struktura zahrnuje i směrující protilátku (imunoglobulin) (obr. 3).
Příprava nesměřovaných lineárních polymemích léčiv probíhá ve více reakčních krocích. V prvém kroku je připraven polymemí prekurzor I (viz obr. 4) jako kopolymer HPMA s methakryloylovanými reaktivními estery (4-nitrofenylovými, Λ-hydroxysukcinimidovými apod.) aminokyselin či oligopeptidů, v druhém kroku, vedoucímu k přípravě polymemího prekurzoru II, jsou koncové reaktivní esterové skupiny převedeny hydrazinolýzou na hydrazidy a ve třetím krokuje připojeno k hydrazidovým skupinám chemickou hydrazonovou vazbou kancerostatikum obsahující keto skupinu v molekule.
Při přípravě větveného polymemího léčívaje třeba vyjít z polymemího prekurzoru I obsahujícího v postranních řetězcích enzymaticky degradovatelný oligopeptid, s výhodou GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyPheLeuGly nebo GlyLeuPheGly. Druhý krok je zahájen mírným větvením polymeru reakcí polymemího prekurzoru I s alkylendiaminem (ethyl, butyl, hexyl) a dokončen následnou hydrazinolýzou hydrazin hydrátem jako v předešlém případě.
Protilátkami (imunoglobulinem) směrovaná léčiva je možné připravit z obou předchozích typů léčiv následnou reakcí s protilátkou (imunoglobulinem), do jejíž struktury byly předem zavedeny mírnou oxidací KIO4 nebo NaIO4 aldehydové skupiny a nebo jejich konjugací s protilátkou (imunoglobulinem) pomocí bifunkčních činidel, jak je popsáno výše.
-3CZ 293787 B6
Vynález je využitelný k přípravě polymemích léčiv, použitelných pro léčbu různých typů nádorových onemocnění v humánní medicíně.
Přehled obrázků
Obr. 1 představuje strukturu lineárního polymemího konjugátu s léčivem. Jedná se o nasměrovaná polymemí léčiva. Pro biologické experimenty byl s výhodou používán konjugát s x = 94 % mol., a = 3 % mol., b = 2 % mol., c = 1 % mol a X = AB nebo AK při použití aminokyseliny a 10 GlyPheLeuGly při použití oligopeptidu.
Obr. 2 představuje schéma přípravy a struktury větvených vysokomolekulámích konjugátů s biodegradovatelnými oligopeptidovými spojkami. Vhodná molekulová hmotnost konjugátů je 120 000 g/mol. Obsah příčných vazeb 0,5 % mol., obsah DOX 9 % hmotn., obsah hydrazono15 vých skupin 2 % mol. a karboxylů 2 % mol.
Obr. 3 znázorňuje obecnou strukturu konjugátu zahrnujícího i směrující protilátku.Pro biologické experimenty byl s výhodou použit konjugát s x = 92 % mol., a = 3 % mol., b = 0,7 % mol., c = 2 % mol, d = 2,3 % mol. a X = AB nebo AK při použití aminokyseliny jako „spaceru“ a 20 GlyPheLeuGly při použití oligopeptidu.
Obr. 4 znázorňuje strukturu polymemího prekurzorů.
Obr. 5 znázorňuje výsledky měření rychlosti uvolňování doxorubicinu z konjugátů podle vynále25 zu lišících se složením „spaceru“; A) při pH modelujícím prostředí endozomů (pH 5); B) při pH modelujícím pH krve (7,4). Obsah léčiva v konjugátech byl 10 % hmotn.
Obr. 6 znázorňuje výsledky zjišťování protinádorové aktivity konjugátů podle vynálezu obsahujících hydrolyticky uvolňovaný doxorubicin in vivo (protektivní režim). T buněčný lymfom EL4: 30 105 buněk/myš, s.c.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava nesměřovaného lineárního polymemího léčiva na bázi doxorubicinu
Syntéza polymemího léčiva byla provedena ve čtyřech syntetických krocích. V prvním kroku byly připraveny monomery N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) a 4-nitrofenylové estery methakryloylované aminokyseliny nebo oligopeptidu (MA-X-ONp). Druhým krokem byla příprava polymemího prekurzorů I radikálovou kopolymerizací HPMA s MA-X-ONp. Ve třetím kroku byl hydrazinolýzou prekurzorů I připraven polymemí prekurzor II a v posledním kroku byla provedena vazba Dox na polymemí prekurzor.
Příprava monomerů:
HPMA byl připraven drive popsanou metodou [Ulbrich 2000]. Methakryloylované reaktivní 50 estery byly připraveny methakryloylací příslušné aminokyseliny nebo oligopeptidu (X = Gly, diGly, GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyOheLeuGly, β-alanin, kyselina ε-aminokapronová (AKap), kyselina p-aminobenzoová (AB) a pod.) reakcí dle Schotten-Baumana a následnou reakcí vzniklého derivátu methakrylové kyseliny s 4-nitrofenolem v přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu (DCCI).
-4CZ 293787 B6
Předpis pro přípravu 4-nitrofenylových esterů methakryloylovaných ε-aminokyselin
Postup přípravy monomerů MA-Gly-ONp, MA-GlyGly-ONp a MA-AB-ONp je shodný ve všech třech případech. Níže je uveden postup pro přípravu MA-AB-ONp:
MA-AB-OŇp: N trojhrdlé baňce bylo rozpuštěno 0,024 mol (3,34 g) />-aminobenzoové kyseliny v 15 ml roztoku 0,024 mol (0,97 g) hydroxidu sodného. K vodnému roztoku sodné soli aminokyseliny bylo za míchání a chlazení (5 °C) po kapkách současně přidáno 0,024 mol (2,55 g) methakryioylchloridu a roztoku 0,024 mol (0,97 g) hydroxidu sodného rozpuštěného v 10 ml vody. V průběhu reakce nesmí pH reakční směsi překročit pH 9. Reakční směs byla míchána 1 hod a po okyselení reakční směsi na pH 2 byla vypadlá bílá sraženina odfiltrována na fritě S4. Produkt byl čištěn krystalizací ze směsi ethanol-voda.
4-nitrofenylový ester byl připraven reakcí 0,014 mol (2,85 g) V-methakryloyl 4-aminobenzoové kyseliny s 0,014 mol (1,93 g) 4-nitrofenolu v dimethylformamidu při -10 °C v přítomnosti 0,0153 mol (3,16 g) dicyklohexylkarbodiimidu. Reakce probíhala po dobu 10 hod., potom byla vyloučená dicyklohexylmočovina odfiltrována a produkt přečištěn krystalizací ze směsi acetonvoda. Ostatní dva 4-nitrofenylové estery (MA-X-ONp) se připravují obdobným způsobem.
Methakryloylované deriváty GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly, β-alaninu a kyseliny εaminokaprové byly připraveny rovněž methakryloylací oligopeptidů či kyseliny, methakryloylované kyseliny však po okyselení vodné fáze musely být extrahovány do ethylacetátu a izolovány krystalizací. Příslušné reaktivní esteiy (ONp estery) se připraví obdobným způsobem jako MAAB-ONp, pouze reakčním prostředím pro esterifikaci MA-GlyLeuGly-OH a MA-GlyPheLeuGly-ΌΗ byl tetrahydrofuran.
Příprava polymemího prekurzoru I: 1 g směsi HPMA (95 % mol; 0,89 g) a MA-AB-ONp (5 % mol; 0,11 g) a 0,048 g azo-bis-izobutyronitrilu bylo rozpuštěno v 6,95 g acetonu a roztok předložen do polymerizační ampule. Po probublání polymerizační směsi dusíkem byla ampule zatavena a polymerizace prováděna při 50 °C po dobu 24 hod. Vyloučený polymer byl odfiltrován, třikrát promyt acetonem, diethyletherem a usušen za vakua. Obsah postranních řetězců zakončených reaktivními -ONp skupinami (složení kopolymeru) je možné řídit složením polymerizační násady (poměrem monomerů). Stejným způsobem byly připraveny všechny polymemí prekurzory lišící se složením postranního řetězce.
Příprava polymemího prekurzoru II: Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AB-NHNH2) byl připraven reakcí polymemího prekurzoru I s hydrazin hydrátem. 300 mg polymemího prekurzoru I (1,3 x 1θΛηο1 ONp) bylo rozpuštěno ve 2 ml methanolu a za intenzivního míchání byl přidán roztok 69 mg NH2NH2.H2O v 1 ml methanolu (1,3.10-3 mol, lOnásobný přebytek oproti ONp). Reakční směs byla ponechána reagovat 3 hodiny, potom byl methanolový roztok naředěn destilovanou vodou na 30 ml a produkt zbaven nízkomolekulámích složek pomocí dialýzy proti destilované vodě (2 dny). Finální produkt byl izolován z vodného roztoku lyofilizaci. Molekulová váha (Mw) a polydisperzita polymeru byla stanovena pomocí gelové chromatografie opatřené detektorem rozptylu světla. Množství hydrazidových skupin bylo zjištěno spektrálně po reakci hydrazidových skupin sTNBS (kyselinou trinitrobenzensulfonovou). Stejným způsobem byly připraveny prekurzory obsahující ostatní aminokyseliny a oligopeptidy.
Polymemí prekurzory II byly rovněž připraveny radikálovou srážecí kopolymerizací odpovídajícího N-terc-butyloxykarbonylhydrazidu methakryloylovaného oligopeptidů či aminokyseliny (poly(HPMA-co-MA-X-NHNH-BOC)) sHPMA za podmínek uvedených výše. Polymemí prekurzory II byly po sejmutí chránící BOC skupiny z poly(HPMA-co-MA-X-NHNH-BOC kyselinou trifluoroctovou vysráženy do směsi aceton-diethylether, rozpuštěny ve vodě, dialyzovány proti vodě a lyofilizovány.
-5CZ 293787 B6
Vazba doxorubicinu na polymemí prekurzor: 250 mg polymemího prekurzoru II (po!y(HPMAC0-MA-AB-NHNH2) (0,1 mmol NHNH2) bylo rozpuštěno v 3 ml methanolu. Takto připravený roztok polymeru byl přidán k 23 mg Dox.HCl (40 pmol). Do reakční směsi byly přidány 2 kapky kyseliny octové a tento nehomogenní roztok byl míchán při laboratorní teplotě (ve tmě). Po 48 hodinách reakce byl homogenní roztok dvakrát čištěn gelovou filtrací od volného Dox na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Polymemí frakce byla izolována, zahuštěna na vakuové odparce a produkt srážen do diethyletheru. Produkt byl přesrážen z ethanolu do diethyletheru a sušen do konstantní hmotnosti. Obsah Dox byl stanoven spektrálně (λ 480 nm,s 11 500 L mol-1 cm-1, voda) a obsah hydrazidových skupin TNBS metodou. <MW> a distribuce molekulových hmotností byly zjištěny pomocí kapalinové chromatografie (kolona Superose™6 (300 x 10 mm), 0,3M octanový pufř (CH3COONa/CH3COOH; pH 6,5; 0,5 g/L NaN3), průtok 0,5 ml/min, detekce diferenciálním refraktometrem, detektorem rozptylu světla (DAWN-DSP-F, Wyatt Technology, USA) a UV detektorem (280 a 488 nm).
Uvedený postup byl použit při přípravě všech ostatních polymemích konjugátů doxorubicinu.
Příklad 2
Příprava větveného vysokomolekulámího konjugátu.
400 mg polymemího prekurzoru I obsahujícího oligopeptidové sekvence GlyPheGly, GlyLeuGly nebo GlyPheLeuGI (0,19 mmol ONp) bylo rozpuštěno v 1,1 ml DMSO. Za výrazného míchání roztoku polymeru bylo přidáno 105 μΐ 0,2 M roztoku 1,2-ethylendiaminu v DMSO (21 pmol EDA) a reakční směs byla nechána při laboratorní teplotě reagovat 1 hodinu. Za intenzivního míchání roztoku polymeru byl přidán roztok 100 mg hydrazinhydrátu (2 mmol) v 0,3 ml DMSO a reakční směs byla další 3 hodiny intenzivně míchána. Poté byla reakční směs naředěna destilovanou vodou na 30 ml a produkt byl čištěn dialýzou proti destilované vodě (2 dny). Vysokomolekulámí prekurzor byl lyofilizován <M„> a distribuce molekulových hmotností byla zjištěna pomocí kapalinové chromatografie, obsah hydrazidových skupin byl zjištěn spektrálně TNBSA metodou. Doxorubicin byl vázán k polymeru a konjugát charakterizován za podmínek popsaných v příkladu I.
Příklad 3
Příprava protilátkami (imunoglobulinem) směrovaného konjugátu I
Částečnou modifikací hydrazidových skupin polymemího prekurzoru II s obsahem hydrazidových skupin 10 až 15 % mol pomocí V-hydroxysukcinimidylového esteru kyseliny maleinimidylpropionové (SMP) byl připraven kopolymer nesoucí v postranních řetězcích hydrazidové a maleinimidové skupiny (MI) (poly(HPMA-co-MA-X-NHNH2-co-MA-X-NHNH-MI)). 250 mg prekurzoru II poly(HPMA-co-MA-diGly-NHNH2 (125 pmol hydrazidových skupin) bylo rozpuštěno v 1,2 ml DMSO a přidán roztok 16,6 mg SMP (62,5 pmol) v 0,6 ml DMSO. Reakční směs byla míchána při laboratorní teplotě 8 hodin. Po přečištění na koloně PD-10 (eluent: destilovaná voda) byla stanovena <M„> a distribuce molekulových hmotností konjugátu pomocí kapalinové chromatografie, množství maleinimidových skupin bylo stanoveno modifikovanou Ellmanovou zkouškou a obsah zbývajících hydrazidových skupin metodou TNBS. K tomuto polymeru byl navázán doxorubicin stejným způsobem, jak bylo uvedeno v příkladu 1.
Zavedení -SH skupin do molekuly protilátky (imunoglobulinu): 15 mg protilátek (polyklonální anti-thymocytámí IgG) (0,1 pmol) bylo na koloně PD-10 převedeno do 1 ml fosfátového pufru (0,05M NaH2PO4/Na2HPO4; 0,lM NaCl; 0,01 EDTA; pH 7,4). 0,67 mg 2-iminothionalu (4 pmol) bylo rozpuštěno v 50 pL DMF a přidáno k roztoku intenzivně míchaných protilátek.
-6CZ 293787 B6
Produkt byl po 2,5 hodinách míchání při laboratorní teplotě izolován gelovou filtrací na koloně PD-10 (fosfátový pufr, pH 7,4). Stupeň modifikace protilátky (imunoglobulinu) byl stanoven metodou využívající reakci sulfhydíylových skupin s Ellmanovým činidlem.
Konjugace 60 mg polymeru poly(HPMA-co-MA-diGly-NHN=Dox-co-MA-X-NHNH2-coMA-X-NHNH-MI obsahujícího doxorubicin, hydrazidové a maleinimidové skupiny s 20 mg modifikovaných protilátek byla provedena ve fosfátovém pufru pH 7,4 (viz výše) při pokojové teplotě. Konečný produkt byl čištěn gelovou filtrací a charakterizován pomocí UV spektroskopie (obsah Dox), aminokyselinovou analýzou (obsah protilátek, imunoglobulinu) a elektroforézou Phastsystem - Pharmacia LKB (přítomnost volného proteinu či léčiva).
Příklad 4
Příprava protilátkami (imunoglobulinem) směrovaného konjugátu II.
Polymemí prekurzor II byl modifikován v prvním kroku syntézy pomocí SPDP za obdobných podmínek, za jakých byla provedena modifikace polymeru pomocí SMP uvedená v příkladu 3.
Ke 14 mg -SH skupinou modifikovaných protilátek, imunoglobulinu (viz výše), obsahujících 0,68 gmol SH skupin rozpuštěných v 1,7 ml fosfátovém pufru (0,05 M NaH2PO4/Na2HPO4; 0,1 M NaCl; 0,01 EDTA; pH 7,4) byl za míchání přidán roztok 42 mg polymeru poly(HPMAco-MA-diGly-NHN=Dox-co-MA-diGly-NHNH2-co-MA-diGly-NHNH-PD (obsahujícího 3,3 gmol pyridyldithiových (PD) skupin) v 0,6 pufru. Reakční směs byla míchána 7 hod při laboratorní teplotě. Po této době byly od konjugátu gelovou filtrací odstraněny nízkomolekulámí podíly a nenavázaný polymer, následně byl konjugát zahuštěn ultrafiltrací a charakterizován obdobně jak je uvedeno v příkladu 3.
Příklad 5
Příprava protilátkami (imunoglobulinem) směrovaného konjugátu III.
Tyto konjugáty byly připraveny reakcí protilátek do jejichž molekuly byly zavedeny aldehydové skupiny mírnou oxidací jodistanem sodným s hydrazidovými skupinami zbylými po reakci polymemího prekurzoru II s doxorubicinem.
Příprava oxidovaných protilátek): 40 mg protilátek (polyklonální anti-thymocytámí IgG) bylo na koloně PD-10 převedeno do octanového pufru (0,02 M CH3COONa/CH3COOH; 0,15 M NaCl; pH 5). Ve stejném pufru byl za tmy připraven roztok 0,lM NaIO4. Roztoky protilátek a jodistanu byly smíchány v poměru 4:1 tak, aby výsledná koncentrace NaIO4 byla 0,02 moi/1 a koncentrace protilátek byla 9 mg/ml. Reakční směs byla při laboratorní teplotě ve tmě míchána dvě hodiny a poté bylo přidáno 25 μΐ ethylenglykolu na každý ml reakční směsi. Po 20 minutách byly oxidované protilátky (imunoglobulin) čištěny a izolovány kapalinovou chromatografií na koloně PD-10. Koncentrace protilátek (imunoglobulinu) v roztoku byla stanovena spektrofotometricky. Počet aldehydových skupin byl stanoven metodou využívající reakci aldehydových skupin s barvivém Lucifer Yellow CH.
Příklad přípravy vzorku konjugátu: 36,5 mg oxidovaných protilátek v 5 ml acetátového pufru (0,02 M CH3COONa/CH3COOH; 0,15 M NaCl; pH 5) bylo za chlazení na 15 °C smícháno s roztokem 73 mg polymemího prekurzoru II poly(HPMA-co-MA-diGly-NHN=Dox-co-MAdiGly-NHNH2 s navázaným Dox rozpuštěným v 1 ml pufru. Reakční směs byla míchána ve tmě 16 hod při 15 °C. Po 16 hodinách bylo pH reakční směsi upraveno 0,lM NaOH na pH 7,2. Od konjugátu byly odstraněny gelovou filtrací nízkomolekulámí podíly a nenavázaný polymer,
-7CZ 293787 B6 následně byl konjugát zahuštěn a charakterizován obdobně jako ostatní konjugáty s protilátkami (imunoglobulinem).
Ke konjugacím s polymery byl použit lidský i králičí nespecifický imunoglobulin (IgG), polyklonální anti-thymocytové protilátky (ATG), monoklonální protilátky anti-Thy 1.2, anti-CD4, anti-CD 71, anti-BCLl, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD14 a další protilátky proti tumorasociujícím antigenům (anti-TAA).
Příklad 6
In vitro uvolňování doxorubicinu z polymemích konjugátů
Hydrolytická stabilita konjugátů a rychlost uvolňování aktivního léčiva z polymeru byly měřeny v modelových systémech při různých pH a teplotách. Na obr. 5 jsou uvedeny výsledky měření rychlostí uvolňování doxorubicinu z polymerů lišících se složením „spaceru“ při pH modelujícím pH krve (7,4) a pH modelujícím prostředí endozomů či lysozomů (pH 5 až 6). Při experimentech byla koncentrace vázaného Dox konstantní (0,5 mmol.F1) v 0,lM acetátovém pufru (CH3COONa/CH3COOH, 0,05 M NaCl). Vzorky byly inkubovány ve tmě při 37 °C a v předem daných časových intervalech byly odebírány 0,1 ml části vzorků a analyzovány pomocí HPLC po extrakci Dox z roztoku. Z výsledků je zřejmé, že struktura spojky mezi léčivem a polymemím nosičem ovlivňuje rychlost uvolňování léčiva z nosiče, přičemž rychlost uvolňování je poměrně malá při pH krve a více než o řád rychlejší při pH modelujícím prostředí buňky. Vezmeme-li v úvahu, že doba setrvání léčiva v krevním řečišti je poměrně krátká, experiment potvrzuje relativní stálost polymemího konjugátu v průběhu transportu a jeho schopnost uvolnit aktivní léčivo až po průniku do buněk.
Příklad 7
Cytotoxická aktivita in vitro polymemích konjugátů obsahujících hydrolyticky uvolňovaný doxorubicin u buněk s normálním obsahem lysozomů (tabulka 1)
Schopnost polymemích konjugátů omezit buněčné dělení neboli proliferaci cílových buněk je označována jako cytotoxická nebo cytostatická aktivita. Tato cytotoxická aktivita byla in vitro detekována inhibici inkorporace 3H-thymidinu do jader cílových buněk [Říhová a spol., 2000]. Inkorporace thymidinu a aktivita konjugátů jsou nepřímo úměrné. Nízká inkorporace thymidínu znamená vysokou cytotoxickou aktivitu testovaných látek. Buňky vybraných nádorových linií (myší T leukemické linie EL4, myší B buněčné leukémie BCL1, myšího B buněčného lymfomu 38C13, lidského kolorektálního karcinomu primárního SW 480, lidského kolorektálního karcinomu metastázujícího SW 620, lidského kolorektálního karcinomu SW620 geneticky modifikovaného myším genem pro Thy 1.2 SW620/T) a T buněčným mitogenem tj. konkanavalinem A stimulované myší splenocyty a lidské periferní lymfocyty byly v dávkách 1 x 104 - 5 x 105 (v závislosti na použitých testovacích buněčných systémech) v růstovém médiu RPMI 1640 napipetovány do 96jamkových FB-tkáňových destiček (NUNC, Dánsko). Další kultivace proběhla buď bez další stimulace (všechny nádorové linie a neovlivněné myší a lidské lymfocyty) nebo v přítomnosti T buněčného mitogenu konkanavalinu A, pokud se jednalo o zjištění efektu na normální intenzivně proliferující T lymfocyty. Koncentrace konkanavalinu A, ve které byly buňky kultivovány, byla 1,25 pg/jamku. Ke každé experimentální jamce tkáňové destičky, obsahující testované buňky v médiu bez nebo s přítomností konkanavalinu A, byly přidány testované vzorky nebo volný doxorubicin v konečných koncentracích 0,0016 až 80 pg/ml. Celkový objem jamky byl 250 pl. Každá koncentrace byla paralelně testována u jednoho vzorku a jedné linie tři až pětkrát. Mikrotitrační tkáňové destičky byly inkubovány 24 až 72 hodin při 37 °C v prostředí 5 % CO2. Po ukončené kultivaci bylo do každé jamky přidáno 1 pCi 3H-thymidinu. Po dalších pěti až šesti hodinách (v závislosti na testovacím systému) byly buňky
-8CZ 293787 B6 sesbírány (sběrač buněk-Tomtec) na skleněný vláknitý filtr (Filtermat, Wallac), usušeny a vyhodnoceny na inkorporovanou radioaktivitu (MicroBeta Trilux, Wallac). IC50 pro nesměřované konjugáty obsahující hydrolyticky uvolňovaný doxorubicin se pohybovalo od 0,01 pg doxorubicinu/ml do 1,41 pg doxorubicinu/ml v závislosti na rezistenci (citlivosti použité cílové linie na terapii) a na typu konjugátu. Bylo potvrzeno, že cytotoxicita je výlučnou vlastností konjugátů obsahujících hydrolyticky uvolňovaný doxorubicin, protože konjugát bez léčiva není cytotoxický.
Testy in vitro prokázaly, že a) aktivita konjugátů s hydrolyticky uvolnitelným léčivem nezávisí na enzymatické degradovatelnosti kovalentní vazby mezi tímto léčivem a oligopeptidickou spojkou a že b) konjugáty u kterých je spojka mezi základním polymemím řetězcem a léčivem tvořena pouze ε-aminokapronovou nebo p-aminobenzoovou kyselinou jsou stejně účinné jako konjugáty obsahující di- nebo tetrapeptidovou spojku.
Tabulka 1.
Porovnání in vitro inhibičních aktivit vzorků obsahujících léčivo vázané pomocí různých spojek; testovaná linie myší leukemie EL4 (T buněčný lymfom EL4).
Vzorek IC30 (pg DOX/ml)
P-GELG-DOX (PK1) 19,1
P-GG-DOX (hydrazon) 0,40
P-GFLG-DOX (hydrazon) 0,26
P-p-aminobenzoová-DOX (hydrazon) 0,04
Ρ-ε-aminokapronová-DOX (hydrazon) 0,08
Doxorubicin (DOX) 0,02
IC50 je koncentrace léčiva způsobující 50% inhibici proliferace.
Příklad 8
Cytotoxická aktivita in vitro polymemích konjugátů obsahujících hydrolyticky uvolňovaný doxorubicin u buněk s nízkým obsahem lysozomů
Test cytotoxické aktivity in vitro byl prováděn stejně jako je uvedeno v příkladu 7. Jako cílové buňky byly vybrány buňky erytroleukemické linie K 562 s nízkým obsahem lysozomů. Bylo prokázáno, že konjugáty obsahující hydrolyticky uvolňovaný doxorubicin jsou významně cytotoxické i u této linie, u které jsou jen velmi omezeně cytotoxické konjugáty s enzymaticky uvolňovaným doxorubicinem (tabulka 2). Tento výsledek prokazuje, že konjugáty s hydrolyticky uvolňovaným doxorubicinem jsou účinné i v buněčných systémech, které jsou chudé na lysozomy.
Tabulka 2. Porovnání in vitro inhibičních aktivit vzorků obsahujících léčivo vázané pomocí různých spojek; testovaná erytroleukemická linie K 562.
Vzorek IC50 (Mg DOX/ml)
P-GFLG-DOX (PK1) 9,71
P-GG-DOX (hydrazon) 0,06
Doxorubicin (DOX) 0,28
IC5o je koncentrace léčiva způsobující 50% inhibici proliferace
-9CZ 293787 B6
Příklad 9
Protinádorová aktivita polymemích konjugátů obsahujících hydrolyticky uvolňovaný doxorubicin in vivo (Obr. 6)
Myši inbredního kmene C57BL/10 byly subkutánně transplantovány T buněčným lymfomem (EL4). Nádorové buňky byly injikovány do dolní poloviny zad experimentálních zvířat v dávce 1 x 105 buněk/myš. Den transplantace buněk byl označen jako den 0. Poté byly polymemí konjugáty s hydrolyticky uvolňovaným doxorubicinem podány intraperitoneálně buď v den 1, 3, 5, 7 a 9 (protektivní režim), v den 10,12,14,16 a 18 nebo v den 12,14,16,18 a 20 (terapeutický režim). Denní dávka doxorubicinu byla 50 gg/myš. Konjugáty významným způsobem potlačovaly růst nádoru a zvyšovaly počet dlouhodobě přežívajících experimentálních zvířat. Zatímco polymemí konjugát bez léčiva byl zcela bez účinku a klasický tj. nemodifikovaný doxorubicin měl účinek jen velmi omezený (maximální doba přežití experimentálních zvířat byla 40 dnů oproti 35 dnům u skupiny kontrolní), podání polymemích konjugátů s hydrolyticky uvolňovaným doxorubicinem umožnilo dlouhodobé přežití tj. více než 80 dní v protektivním režimu u 40 % myší, v terapeutickém režimu u 20 % myší.
Myším inbredního kmene Balb/c byla i.p. transplantována myší B buněčná leukémie BCL1. Nádorové buňky byly injikovány v dávce 5 x 105 buněk/myš. Den transplantace byl označen jako den 0. Poté byly polymemí konjugáty s hydrolyticky uvolňovaným doxorubicinem podány intravenózně v den 11, 13 a 17 (terapeutický režim). Denní dávka doxorubicinu byla 100 gg/myš. Testované konjugáty měly výraznou protinádorovou aktivitu. Zatím co kontrolní myši přežívaly maximálně 40 dní, 20 % myší léčených testovanými konjugáty přežilo déle než 100 dní a 10 % déle než 140 dní.
Literatura
R. Duncan, J. B. Lloyd, J. Kopeček, P. Rejmanová, J. Strohalm, K. Ulbrich, B. Říhová, V. Chytrý: Synthetic Polymeric Drugs. Czech. PV 0095/85, Australia AU 589587, Canada CA 130053, Denmark DK 164485, Europe EP 0187 547, US 5 037 883, Japan JP 61 243026
K. Ulbrich, V. Šubr, J. Strohalm, D. Plocová, M. Jelínková, B. Říhová, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules I. Synthesis and Physico-chemical Characterisation. J. Controlled Rel. 64, 63-79 (2000)
Vasey P. A,, Kaye S. B., Morrison R., Twelves C., Wilson P., Duncan R., Thomson A. H., Murray L. S., Hilditch T. E., Murray T., Burtles S., Fraier D., Frigerio E. Cassidy, J.: Phase I clinical and pharmacokinetic study of PK1 [N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymer doxorubidin]: fírst member of a new class of chemotherapeutic agents - drug polymer conjugates, Clinical Cancer Research 5, 83-94 (1994)
Julyan, P. J., Seymour, L. W., Ferry, D. R., Daryani, S. Boivin, CH. M., Doran, J., David, M., Anderson, D., Christodoulou, CH., Young, A. M., Hesslewood, S., Kerr, D. J.: Preliminary clinical study of the distribution of HPMA copolymers bearing doxorubicin and galactosamine, J. Control. Rel. 57, 281-290 (1999)
Thomson A. H., Vasey P. A., Murray L. S., Cassidy J., Fraier D., Frigerio E., Twelves C.: Population pharmacokinetics in phase I drug development: a phase I study of PK1 in patients with solid tumors, Br. J. Cancer. 81,99-107 (1999)
J. Kopeček, P. Kopečková, T. Minko, Z. Lu, HPMA Copolymer-Anticancer Drug Conjugates: Design, Acitivty, and Mechanism of Action. Europ. J. Pharm. Biopharm. 50, 61 - 81 (2000)
-10CZ 293787 B6
F. Kratz, U. Beyer, Η. T. Schutte, Drug-Polymer Conjugates Containing Acid-Cleavable Bonds. Critical Reviews „in Therapeutic Drug Carriers Systems“, 16(3), 245-288 (1999)
B. Říhová, T. Etrych, M. Pechar, M. Jelínková, M. Šťastný, O. Hovorka, M. Kovář, K. Ulbrich, Doxorubicin Bound to a HPMA Copolymer Carrier Through Hydrazone Bond is Effective also in a Cancer Cell Line with a Limited Content of Lysosomes. J. Controlled Release 74, 225-232 (2001)
Tomáš Ettych, Markéta Jelínková, Blanka Říhová, Karel Ulbrich, New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH sensitive linkage. Synthesis, in vitro and in vivo biological properties. J. Controlled Rel. 73, 89-102 (2001)

Claims (11)

1. Konjugáty sestávající z polymemího nosiče tvořeného 30 až 3000 monomemími jednotkami spojenými do polymemího řetězce, složené z
a) 60 až 98,5 % jednotek 7V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu,
b) 1 až 25 % jednotek methakryloylovaných hydrazonů a-aminokyselin, ε-aminokyselin nebo aromatických aminokyselin zakončených molekulou antracyklinového kancerostatika,
c) 0,5 až 15 % jednotek methakryloylovaných a-aminokyselin, ε-aminokyselin, aromatických aminokyselin nebo oligopeptidů či jejich sodných solí a případně
d) 0,5 až 10 % jednotek methakryloylovaných hydrazidů a-aminokyselin, ε-aminokyselin, aromatických aminokyselin nebo oligopeptidů.
2. Konjugáty podle nároku 1, které dále obsahují 0,5 až 5 % methakryloylovaných a-aminokyselin, ε-aminokyselin nebo oligopeptidů zakončených molekulou imunoglobulinu nebo specifické monoklonální nebo polyklonální protilátky.
3. Konjugáty podle nároku 1 nebo 2, které dále obsahují 0,1 až 5 % jednotek enzymaticky odbouratelných methakryloylovaných oligopeptidů propojených alkylendiaminy, které tvoří bivalentní spojku mezi jednotlivými polymemími řetězci, čímž vytvářejí zesítěnou strukturu konjugátu.
4. Konjugáty podle nároku 1, 2 nebo 3, kde antracyklinovým kancerostatikem je doxorubicin.
5. Konjugát podle nároku 1 obecného vzorce
-11 CZ 293787 B6
NHj.HO kde Xi je acylovaný zbytek a-aminokyseliny, ε-aminokyseliny nebo aromatické aminokyseliny, X2 je acylovaný zbytek a-aminokyseliny, ε-aminokyseliny aromatické aminokyseliny nebo 5 oligopeptidu, přičemž jednotlivé strukturní jednotky jsou v řetězci uspořádány náhodně a kde X představuje vhodnou spojku tvořenou aminokyselinovým či oligopeptidovým zbytkem vzniklým z a-aminokyselin, ω-aminokyselin nebo oligopeptidů a x nabývá hodnot 20 až 3000, a je 1 až 750, b i c 10 jsou 1 až 450.
6. Konjugát podle nároku 2 obecného vzorce f4
CH,-ý--c=o
X2
I
COOH
- 12CZ 293787 B6 kde Xi je acylovaný zbytek a-aminokyseliny, ε-aminokyseliny nebo aromatické aminokyseliny, X2 je acylovaný zbytek a-aminokyseliny, ε-aminokyseliny aromatické aminokyseliny nebo oligopeptidu,
S je zbytek olejové kyseliny připojený k polymeru hydrazidovou vazbou, nebo | je v případě protilátkou směrovaného konjugátu jedna z následujících struktur:
nebo g je v případě vysokomolekulámího polymeru biodegradovatelná oligopeptidová spojka obsahující sekvenci GlyPheLeuGly, GlyPheGly, GlyLeuGly apod. a připojující další polymerní řetězce, přičemž protilátka je zvolena ze skupiny zahrnující γ-globulin pro i.v. aplikace, autologní protilátky, protilátky anti-17-ΙΑ, anti-CA 15-3 a další.
7. Konjugáty podle kteréhokoli z předcházejících nároků, kde jsou vázány aminokyseliny nebo oligopeptidy zvolené ze skupiny zahrnující Gly, Ala, Leu, GlyGly, GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly, β-alanin, kyselinu γ-aminomáselnou, kyselinu ε-aminokapronovou AKap, kyselinu p-aminobenzoovou AB.
8. Konjugáty podle nároku 2 nebo 6, kde jsou vázány protilátky zvolené ze skupiny zahrnující γ-globulin pro i.v. aplikace, autologní protilátky, protilátky anti-17-ΙΑ, anti-CA 15-3 a další nádorově specifické a nádorově asociované protilátky.
9. Konjugáty podle nároku 3, kde jsou bivalentní jednotky spojující lineární řetězce voleny z řady GlyPheLeuGly, GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyLeuPheGly.
10. Farmaceutická kompozice kléčbě nádorových onemocnění, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje konjugát podle kteréhokoli z předcházejících nároků.
11. Farmaceutická kompozice podle nároku 10, určená k léčbě nádorů, jako je nádor prsu nebo kolorektálních nádor.
CZ20014653A 2001-12-20 2001-12-20 pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii CZ293787B6 (cs)

Priority Applications (19)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20014653A CZ293787B6 (cs) 2001-12-20 2001-12-20 pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii
PT02805243T PT1463529E (pt) 2001-12-20 2002-12-20 Conjugados poliméricos sensíveis ao ph de uma antraciclina citoestática para terapia-alvo
EP06025316A EP1782833A3 (en) 2001-12-20 2002-12-20 pH-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy
CA002470976A CA2470976A1 (en) 2001-12-20 2002-12-20 Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline drug
ES02805243T ES2331303T3 (es) 2001-12-20 2002-12-20 Conjugados polimericos sensibles al ph de un farmaco cancerostatico de antraciclina para terapia dirigida.
SK291-2004A SK2912004A3 (en) 2001-12-20 2002-12-20 pH-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy
SI200230855T SI1463529T1 (sl) 2001-12-20 2002-12-20 Za pH občutljivi polimerni konjugati antraciklinskega kancerostatičnega zdravila za ciljno terapijo
HU0500541A HUP0500541A3 (en) 2001-12-20 2002-12-20 Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy
US10/499,422 US7919076B2 (en) 2001-12-20 2002-12-20 PH-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy
DE60233434T DE60233434D1 (de) 2001-12-20 2002-12-20 Ph-empfindliche polymere konjugate eines karzinostatischen anthracyclin-arzneimittels für die gezielte therapie
PL370719A PL216518B1 (pl) 2001-12-20 2002-12-20 Polimerowe koniugaty leków przeciwnowotworowych i kompozycja farmaceutyczna
AT02805243T ATE439864T1 (de) 2001-12-20 2002-12-20 Ph-empfindliche polymere konjugate eines karzinostatischen anthracyclin-arzneimittels für die gezielte therapie
JP2003554229A JP4718117B2 (ja) 2001-12-20 2002-12-20 ターゲット療法用アントラサイクリン系制癌薬のｐＨ感受性重合体コンジュゲート
AU2002366715A AU2002366715A1 (en) 2001-12-20 2002-12-20 Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline drug
EA200400802A EA007353B1 (ru) 2001-12-20 2002-12-20 pH-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ КОНЪЮГАТЫ АНТРАЦИКЛИНОВЫХ КАНЦЕРОСТАТИЧЕСКИХ АКТИВНЫХ АГЕНТОВ ДЛЯ ТЕРАПИИ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ
EP02805243A EP1463529B9 (en) 2001-12-20 2002-12-20 Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy
DK02805243.9T DK1463529T5 (da) 2001-12-20 2002-12-20 PH-følsomme polymere konjugater af et cancerostatisk anthracyclinlægemiddel til målrettet terapi
PCT/CZ2002/000070 WO2003053473A2 (en) 2001-12-20 2002-12-20 Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline drug
KR10-2004-7009872A KR20040076874A (ko) 2001-12-20 2002-12-20 표적 치료요법용 안트라사이클린 종양 정지 약물이 결합된피에이치-감응성 폴리머 결합체

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20014653A CZ293787B6 (cs) 2001-12-20 2001-12-20 pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20014653A3 CZ20014653A3 (cs) 2003-08-13
CZ293787B6 true CZ293787B6 (cs) 2004-07-14

Family

ID=5473644

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20014653A CZ293787B6 (cs) 2001-12-20 2001-12-20 pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii

Country Status (18)

Country Link
US (1) US7919076B2 (cs)
EP (2) EP1782833A3 (cs)
JP (1) JP4718117B2 (cs)
KR (1) KR20040076874A (cs)
AT (1) ATE439864T1 (cs)
AU (1) AU2002366715A1 (cs)
CA (1) CA2470976A1 (cs)
CZ (1) CZ293787B6 (cs)
DE (1) DE60233434D1 (cs)
DK (1) DK1463529T5 (cs)
EA (1) EA007353B1 (cs)
ES (1) ES2331303T3 (cs)
HU (1) HUP0500541A3 (cs)
PL (1) PL216518B1 (cs)
PT (1) PT1463529E (cs)
SI (1) SI1463529T1 (cs)
SK (1) SK2912004A3 (cs)
WO (1) WO2003053473A2 (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ297827B6 (cs) * 2005-09-05 2007-04-04 Zentiva, A. S. Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ294996B6 (cs) * 2003-07-16 2005-04-13 Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr Reaktivní polymery a kopolymery na bázi N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, způsob jejich přípravy a jejich použití pro syntézu polymerních léčiv, pro modifikaci biologicky aktivních proteinů a přípravu systémů pro dopravu genů
WO2006020722A2 (en) 2004-08-11 2006-02-23 Arqule, Inc. Polymer conjugates of beta-lapachone and beta-lapachone analogs for tumor targeting
US8614228B2 (en) 2004-08-11 2013-12-24 Arqule, Inc. Quinone prodrug compositions and methods of use
CZ2006207A3 (cs) * 2006-03-28 2008-01-16 Zentiva, A. S. Micelární nosiče léčiv s protinádorovou aktivitou
CN103257222A (zh) 2006-08-09 2013-08-21 住友电木株式会社 糖链捕获物及其用途
CZ299053B6 (cs) * 2006-08-09 2008-04-09 Zentiva, A. S. Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy
CZ298945B6 (cs) * 2006-09-18 2008-03-19 Zentiva, A. S. Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby
CA2685739C (en) 2007-04-30 2016-06-14 Arqule, Inc Hydroxy sulfonate of quinone compounds and their uses
CZ2008661A3 (cs) * 2008-10-23 2009-12-30 Zentiva, A. S Polymerní prípravek se synergickým úcinkem pri lécbe nádorových onemocnení
CZ302830B6 (cs) * 2009-12-15 2011-11-30 Ústav makromolekulární chemie AV CR, v.v.i. Vysokomolekulární polymerní nosice léciv odvozené od dendrimeru a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru
EP3069715A1 (en) 2015-03-20 2016-09-21 Salmon Pharma GmbH Immediate release dosage forms of Atomoxetine
EP3525808A4 (en) 2016-10-14 2020-06-24 University of Utah Research Foundation ANTIBODY-POLYMER-DRUG CONJUGATES
US20220409737A1 (en) * 2019-10-30 2022-12-29 Cis Pharma Ag Biocompatible polymeric drug carriers for delivering active agents

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8500209D0 (en) 1985-01-04 1985-02-13 Ceskoslovenska Akademie Ved Synthetic polymeric drugs

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ297827B6 (cs) * 2005-09-05 2007-04-04 Zentiva, A. S. Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva

Also Published As

Publication number Publication date
JP2005519044A (ja) 2005-06-30
EP1782833A2 (en) 2007-05-09
HUP0500541A2 (hu) 2005-09-28
DK1463529T3 (da) 2009-10-19
EA200400802A1 (ru) 2005-02-24
PL370719A1 (en) 2005-05-30
CA2470976A1 (en) 2003-07-03
PT1463529E (pt) 2009-11-03
US20060057099A1 (en) 2006-03-16
EP1782833A3 (en) 2008-03-19
WO2003053473A2 (en) 2003-07-03
SI1463529T1 (sl) 2010-01-29
DK1463529T5 (da) 2011-06-27
EP1463529B9 (en) 2011-03-23
EP1463529A2 (en) 2004-10-06
WO2003053473A3 (en) 2004-04-29
KR20040076874A (ko) 2004-09-03
DE60233434D1 (de) 2009-10-01
ES2331303T3 (es) 2009-12-29
CZ20014653A3 (cs) 2003-08-13
JP4718117B2 (ja) 2011-07-06
HUP0500541A3 (en) 2011-08-29
ES2331303T9 (es) 2011-08-18
AU2002366715A1 (en) 2003-07-09
US7919076B2 (en) 2011-04-05
EP1463529B1 (en) 2009-08-19
AU2002366715A8 (en) 2003-07-09
EA007353B1 (ru) 2006-10-27
ATE439864T1 (de) 2009-09-15
PL216518B1 (pl) 2014-04-30
SK2912004A3 (en) 2004-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ulbrich et al. Antibody-targeted polymer–doxorubicin conjugates with pH-controlled activation
Etrych et al. New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH-sensitive linkage: synthesis and preliminary in vitro and in vivo biological properties
Ulbrich et al. Structural and chemical aspects of HPMA copolymers as drug carriers
Ulbrich et al. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity
Etrych et al. Biodegradable star HPMA polymer conjugates of doxorubicin for passive tumor targeting
Kopeček et al. HPMA copolymer–anticancer drug conjugates: design, activity, and mechanism of action
Kopeček et al. HPMA copolymers: origins, early developments, present, and future
US8603990B2 (en) Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation
US20110014151A1 (en) Macromolecule conjugate
Etrych et al. Star-shaped immunoglobulin-containing HPMA-based conjugates with doxorubicin for cancer therapy
EP1463529B9 (en) Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy
AU4094300A (en) Amplification of folate-mediated targeting to tumor cells using polymers
Etrych et al. HPMA copolymer conjugates with reduced anti-CD20 antibody for cell-specific drug targeting. I. Synthesis and in vitro evaluation of binding efficacy and cytostatic activity
ES2717836T3 (es) Sistema de administración de fármacos multifuncional a base de ácido polimálico
JP5781084B2 (ja) 樹状高分子量ポリマー薬物担体および特に固形腫瘍の処置のための薬物とのそれらの結合体
Pechar et al. Poly (ethylene glycol)-doxorubicin conjugates with pH-controlled activation
Chytil et al. Structural design and synthesis of polymer prodrugs
CZ2003605A3 (en) pH sensitive polymeric conjugates of anthracycline cancerostatic for targeted therapy
Etrych et al. Micellar and Antibody‐Targeted Polymer Therapeutics
SK9785A3 (en) Polymeric remedy and preparation method thereof
Ulbrich et al. Synthetic polymer-drug conjugates for human therapy

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20211220