CZ302830B6 - Vysokomolekulární polymerní nosice léciv odvozené od dendrimeru a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru - Google Patents

Vysokomolekulární polymerní nosice léciv odvozené od dendrimeru a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru Download PDF

Info

Publication number
CZ302830B6
CZ302830B6 CZ20090844A CZ2009844A CZ302830B6 CZ 302830 B6 CZ302830 B6 CZ 302830B6 CZ 20090844 A CZ20090844 A CZ 20090844A CZ 2009844 A CZ2009844 A CZ 2009844A CZ 302830 B6 CZ302830 B6 CZ 302830B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
polymer
polymeric
hpma
dendrimer
poly
Prior art date
Application number
CZ20090844A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2009844A3 (cs
Inventor
Etrych@Tomáš
Chytil@Petr
Strohalm@Jirí
Ulbrich@Karel
Ríhová@Blanka
Original Assignee
Ústav makromolekulární chemie AV CR, v.v.i.
Mikrobiologický ústav AV CR, v.v.i
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav makromolekulární chemie AV CR, v.v.i., Mikrobiologický ústav AV CR, v.v.i filed Critical Ústav makromolekulární chemie AV CR, v.v.i.
Priority to CZ20090844A priority Critical patent/CZ302830B6/cs
Priority to US13/516,607 priority patent/US9173949B2/en
Priority to PCT/CZ2010/000131 priority patent/WO2011072627A2/en
Priority to ES10812977.6T priority patent/ES2458841T3/es
Priority to JP2012543465A priority patent/JP5781084B2/ja
Priority to CA2783393A priority patent/CA2783393C/en
Priority to EP10812977.6A priority patent/EP2512521B1/en
Publication of CZ2009844A3 publication Critical patent/CZ2009844A3/cs
Publication of CZ302830B6 publication Critical patent/CZ302830B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/593—Polyesters, e.g. PLGA or polylactide-co-glycolide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/595—Polyamides, e.g. nylon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G83/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08G2/00 - C08G81/00
    • C08G83/002—Dendritic macromolecules
    • C08G83/003—Dendrimers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Predložené rešení se týká vysokomolekulárních vodorozpustných polymerních nosicu léciv a jejich konjugátu s lécivy, odvozených od dendrimeru na bázi poly(amidoaminového) a 2,2-bis(hydroxymethyl)propionového dendrimeru, na jejichž koncové amino nebo hydroxyskupiny jsou pres konce retezce navázány prostrednictvím biodegradovatelných spojek semitelechelické kopolymery N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA). Tyto nosice a konjugáty umožnují cílený transport zejména protinádorových léciv do pevných nádoru, u kterých je zajištena biodegradabilita, a s tím spojené rízené uvolnování léciva a následná eliminace polymerního nosice z organizmu. Úcinek polymerního nosice konjugovaného s kancerostatikem je zameren na cílenou terapii nádorových onemocnení v humánní medicíne.

Description

Vysoko molekulární polymerní nosiče léčiv odvozené od dendrimerů a jejich konjugáty s léčivy pro léčbu zejména pevných nádorů
Oblast techniky
Vynález se týká vysokomolekulámích vodorozpustných polymemích nosičů léčiv ajejich konjugátů s léčivy, odvozených od dendrimerů a umožňujících cílený transport zejména protinádorových léčiv do pevných nádorů, u kterých je zajištěna biodegradabilita a s tím spojené řízené uvolňování léčiva a následná eliminace polytnemího nosiče z organizmu. Účinek polymemího nosiče konjugovaného s kancerostatikem je zaměřen na cílenou terapii nádorových onemocnění v humánní medicíně.
Dosavadní stav techniky
V poslední době se vývoj léčiv zaměřuje Čím dále více na hledání lékových forem umožňujících cílený účinek aktivní látky především v místě požadovaného terapeutického účinku. Cíleně působící formy léčiva nalézají uplatnění především u takových látek, jejichž vedlejší účinky mohou vést až k poškození zdravých částí organizmu. Nej aktuálnější nebezpečí poškození zdravých tkání a orgánů u pacientů v případě léčby cytostatiky. Využití polymemích látek, především vodorozpustných polymerů jako nosičů vhodných pro cílenou dopravu léčiv, je jednou z významných možností řešení zmíněného problému. Navázání cytostatika k vodorozpustnému polymeru chemickou vazbou umožňuje zásadním způsobem zvýšit rozpustnost ve vodě špatně rozpustných léčiv a výrazně snížit jejich toxicitu. Vysoká molekulová hmotnost konjugátu polymeru s léčivem zabraňuje rychlému vyloučení léčiva z organizmu glomerulámí filtrací, čímž významně prodlužuje dobu cirkulace v krvi, a tím i celkového setrvání v organizmu vedoucího ke zvýšení biologické využitelnosti léčiva. Kromě tohoto vysoká molekulová hmotnost polymemího konjugátu vede ke zvýšené akumulaci v pevných nádorech díky EPR (enhanced permeability and retention) efektu [Maeda2000].
Tohoto efektu můžeme, v případě navázání kancerostatika na makromolekulámí nosič, využít pro jeho cílenou akumulaci v nádoru. Během minulých dvou desetiletí byla vyvinuta celá řada systémů, které jsou založeny na využití EPR efektu pro cílení léčiv, např. polymerní micely, lipozomy nebo vodorozpustné polymerní konjugáty. Polymerní micely jsou, na rozdíl od rozpustných polymemích systémů, obvykle připravovány uspořádáním amfifilních diblokových kopolymerů do vysokomolekulámích micelámích útvarů tvořících kolo idní roztoky, V mi celách je většinou léčivo vázáno do hydrofobního jádra micely buď fyzikálními (hydrofobní interakce), a nebo kovalentními vazbami [Kataoka 2001, Bae 2003, Bronich 1999]. Na rozdíl od micel, u rozpustných systémů akumuluj ících se v pevných nádorech jsou makromolekuly rozpuštěny ve vodném prostředí molekulárně a obvykle zaujímají tvar náhodného klubka, v němž je léčivo v kontaktu s hydrofilním polymerem. Bylo studováno mnoho typů polymemích konjugátů kancerostatik s rozpustnými polymery, ve kterých bylo léčivo navázáno k polymeru hydrolyticky nestabilní iontovou vazbou nebo kovalentní vazbou náchylnou k enzymatické či prosté chemické hydrolýze. Zmíněné systémy mohou uvolnit kancerostatikum v jeho aktivní formě v nádorové tkáni nebo i specificky přímo v nádorové buňce. Mezi vodorozpustnými systémy tvoří významnou skupinu polymerní konjugáty připravené na bázi kopolymerů A-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA). Rada z nich je aktivně směrována k nádorům prostřednictvím připojené směrující struktury (protilátky, hormony, oligopeptidy). [Duncan 1985, Říhová 2000, Kopeček 2001, Mrkvan 2005].
Jedním z hlavních nedostatků bránících využití HPMA kopolymerů jako nosičů léčiv v humánní medicíně je jejich neštěpitelný uhlíkatý řetězec, a s tím spojené omezení molekulových hmotností použitelných pro přípravu polymemího nosiče na molekulové hmotnosti menší nežli 40 až 50 000 (pod vylučovací mezí organizmu). Polymery o vyšší molekulové hmotností nejsou efek- i CZ 302830 B6 tivně a dostatečně účinně z organizmu vylučovány, a tudíž jejich použití jako léčiva by vedlo k akumulaci polymeru v organizmu. Má-li být dosaženo výrazného EPR efektu, tedy významné akumulace v pevných nádorech, je nutné pracovat s polymery, HPMA kopolymery nevyjímaje, o molekulové hmotnosti vysoko nad vylučovací mezí [Seymour 1995, Noguchi 1998], Proto je nezbytné, aby molekulová hmotnost polymerního nosiče bylo dostatečně vysoká, ale aby po uvolnění účinné složky došlo k degradaci polymeru na fragmenty vylučitelné z organizmu, např. glomerulární filtrací. V nedávné minulosti jsme patentovali struktury a biologické účinky léčiv využívajících HPMA polymerů a jejich asociátů s molekulovou hmotností nad limitem renální filtrace. Jedná se o roubované polymemí nosiče [Etrych patent CZ 298 945 B6, Etrych, 2008] a póly měrní micely [Chytil patent CZ PV 2006-207] na bázi HPMA kopolymeru, ve kterých bylo kancerostatikum napojeno k polymeru kovalentní vazbou enzymaticky, a nebo jen čistě hydrolyticky labilní vazbou a případně polymerní řetězce byly propojeny do vysokomolekulámí roubované struktury přes biodegradovatelné enzymaticky a/nebo reduktivně štěpitelné spojky, jmenovitě oligopeptid GlyPheLeuGly a disulfidický můstek.
Výše uvedený český patent CZ 298945 B6 se tedy týká polymerního léčivy, v němž je na vodorozpustný polymerní nosič na bázi kopolymeru A-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu navázáno kancerostatikum. Struktura polymerního léčiva sestává z hlavního řetězce /V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu nesoucího kancerostatikum a dalšího řetězce TV—(2—hydroxypropyl)methakrylamidu - jako roubu, který případně také nese kancerostatikum, přičemž jsou tyto rouby k hlavnímu řetězci připojeny vazbou v organizmu stálou/nebo vazbou v organizmu štěpitelnou, čímž byla dosažena zvýšená protinádorová účinnost, zejména u doxorubicínu. Podstatou tohoto systému je větvená (roubovaná) struktura polymerního nosiče, celá založená na kopolymeru HPMA a všechny polymemí řetězce nesou léčivo. Nevýhodou tohoto systému je neštěpitelný uhlíkatý řetězec jak polymemích roubů, tak i hlavního polymerního řetězce. Nevýhodou je také poměrně široká distribuce molekulových hmotností, tedy malá definovanost systému a omezená možnost dosáhnout vysokých molekulových hmotností, nezbytných pro účinnou akumulaci polymemího systému v nádoru.
Nyní jsme zjistili, že některé nedostatky těchto nosičů léčiv lze překonat polymemím nosičem léčiv ve kterém jsou řetězce HPMA kopolymeru nesoucí léčivo připojeny ke koncovým skupinám ramen dendrimeru. Struktura takovéhoto nosiče se jasně odlišuje od dosud známých polymerních nosičů léčiv na bázi HPMA v tom, že rouby polymeru vycházejí z jednoho centra tvořeného molekulou dendrimeru. V tomto systému je tedy polymemí struktura hlavního řetězce nahrazena centrální nízkomolekulámí sloučeninou - dendrimerem, což výrazně zlepšuje definovanost systému, zužuje distribuci molekulových hmotností, dovoluje připravit i nosič o vysokých molekulových hmotnostech, usnadňuje vylučování nosiče po dosažení léčebného efektu a přispívá k zlepšené protinádorové aktivitě ve srovnání s původním léčivem o struktuře podle CZ298945.
Předložený vynález se týká struktury a syntézy nového vysokomolekulámího polymerního léčiva s úzkou distribucí molekulových hmotností (In~ 1,5 až 2,5) a s definovaným biodegradovatelným skeletem, který se vyznačuje jak zvýšenou akumulací cytostatika v nádoru, tak i po intracelulámí degradaci i vyloučením polymerního nosiče z organizmu. Struktura vychází z dendritické centrální molekuly nesoucí na větvích dendrimeru polymemí rouby obsahující kovalentně vázané léčivo. Volbou počtu roubů a jejich velikostí je množné dosáhnout vysokých molekulových hmotností takového polymeru (až 1 000 000 g/mol). Podobné systémy již byly popsány dříve [Wang 2000], zásadní rozdíl mezi systémem, který je předmětem vynálezu a dříve publikovanými systémy spočívá v tom, že dříve popsané systémy nemají jednoduše degradovatelný polymemí skelet a léčivo je vázáno pouze enzymaticky degradovatelnou GlyPheLeouGly oligopeptidovou sekvencí. K modifikacím konců větví dendrimerů byl poměrně často použit i poly(ethylenglykol) (PEG) [Gajbhíye 2009, Bai 2009], Hlavní úlohou PEG v těchto systémech bylo odstínění potenciálně toxických aminoskupin dendrimerů, PEG zde neslouží jako nosič biologicky aktivních molekul. Podobně jako v předchozím případě i tyto systémy nejsou biodegradovaelné, a nemá-li docházet kjejich akumulaci v organizmu je jejich využití limitováno na nízké molekulové hmotnosti do 50 000 g/mol. Je také známý článek autorů Ping-Shan Lei a kok. Doxorubicin delivery by polyamidoamine dendrimer conjugation and photochemical internalization for cancer therapy, publikovaný v Journal of Controlled Release 122 (2007), str. 19 až 46, v němž je popisován polyamidoaminový dendrimer jako nosič, s hydrazonově nebo amidicky vázaným doxorubicinem, ale bez jakýchkoliv jiných spojovacích prvků (jakýchkoli polymemích prvků umožňujících dosažení vysoké molekulové hmotnosti) a jeho účinku pro případnou léčbu rakoviny.
V patentové literatuře je dále možné nalézt zmínky o využití dendrimerů ve spojitosti s dalšími, často biodegradovatelnými polymery. Po ly( amino kyše líny) byly využity pro příprav u konjugátů dendrimer-poly(aminokyseliny) [Li patent WO 03055935], kde konjugát byl připraven polymerací NCA anhydridů α-aminokyselin na dendrímerových iniciátorech. V tomto případě nesou polymemí rouby tvořené poly(aminokyselinou) významný záporný náboj (polyglutamová a polyasparagová kyselina), kladný náboj (polyarginin, polyhistidin, polylysin), nebojsou hydrofobní, a tedy v tělních tekutinách nerozpustné. Na tento polymer je léčivo, např. paclitaxel, navázáno přes koval entní esterovou vazbu. Vzhledem k vysoké hustotě náboje na povrchu tohoto systému nebo jeho významné hydrofobicitě a nerozpustnosti může pak docházet k nežádoucím interakcím s různými tkáněmi a akumulaci v organismu (např. v ledvinách), tak jak je to typické např. pro negativně nabité polyaminokyseliny [Rypáček 1982]. Také připojení léčiva k polymeru koválentní esterovou vazbou bez biodegradovatelné spojky není zárukou uvolnění léčiva v jeho původní aktivní formě. V případě systému využívajícího rouby poly(aminokyselin) je doložena jen částečná degradace polyglutamové kyseliny, při které dochází k odštěpování širokého spektra nízkomolekulámích štěpů a aminokyselinových derivátů léčiva, které nemusí být biologicky aktivní. Degradace takovýchto systémů je v literatuře doložena jen v modelovém prostředí cathepsinu B a údaje o jejich degradaci v in vivo prostředí jsou neúplné.
Výhodou systému podle předkládaného vynálezu jsou polymemí rouby tvořené inertním, nenabitým, s organismem neinteragujícím vodorozpustným polymerem na bázi HPMA kopolymerů, na které je léčivo navázáno přes intracelulámě degradovatelné spojky umožňující řízené uvolnění aktivního léčiva v cílových buňkách a tkáních. Za další přednost systému podle vynálezu pokládáme jednoznačně prokázanou intracelulámí reduktivní nebo enzymatickou degradaci nosičového skeletu na polymemí produkty inertního vodorozpustného HPMA kopolymerů vy louč itel ného z organismu glomerulámí filtrací, a tím i zaručenou eliminaci vysoko molekulární polymemího nosiče z organizmu po dopravení kancerostatika do místa nádoru.
Literatura uvádí i další systém, ve kterém byly na lineární a hvězdicovitý poly(e-kaprolakton), poIy(L-Iaktid), poly(D-laktid), poly(D,L-laktid), poly(glykolovou kyselinu) navázány řetězce hydrofilních polymerů na bázi po ly[A-(2-hydroxypropyl)methakryl amidu, poly(/V-vinylpyrroiidon)u, poly(ethylenglykol)methakrylátu, poly(/V-isopropylakrylamid)u, polyakrylové kyseliny, polymethakrylové kyseliny, poly[2-aminoethyl)methakrylát]u, poly[(3_amínopropyl)methakrylamidju, poly[(2-;V,;V-dimethylaminoethyl)methakrylátju, [Lele patent US 7018655]. Autoři uvádějí, že takto připravené systémy tvoří hvězdicovité vysoko molekulární systémy využitelné pro dopravu léčiv. Tyto systémy tvoří v roztocích micely nebo nanočástice, a to díky amfifilnímu charakteru struktury obsahující např. hydrofobní poly(e-kaprolakton) a zároveň hydrofilní polymer na bázi HPMA. Léčivo je pak v těchto systémech hydrofobní interakcí nasorbováno v hydrofobním jádře systému, což neumožňuje řízené uvolňování léčiva v závislosti na vnějších podmínkách a nemůže zabránit uvolňování léčiva již v průběhu transportu. Navíc je tento systém ve většině případů zatížen podobnými problémy, jako systém popsaný patentem [Li patent WO 03055935], tj. povrchovým nábojem a nežádoucími interakcemi v organizmu.
Na rozdíl od výše uvedeného systému je systém podle předkládaného vynálezu ve vodě a tělních tekutinách molekulárně rozpustný, bez možnosti agregací a nese léčivo navázané přes biodegradovatelnou spojku, umožňující řízené uvolňování léčiva až v cílové nádorové buňce a nebo nádorové tkáni.
-3 CZ 302830 B6
V literatuře jsou rovněž popsány systémy využívající PAMAM dendrímery (poly(amidoaminové dendrimery) přímo jako nosiče pro např. protizánětlivá léčiva [Kurtoglu 2009], ve kterých je léčivo GV-acetyl cystein) navázáno k dendrimeru přes reduktivnč štěpitelný disulfidový můstek.
V tomto systému slouží PAMAM dendrimer přímo jako nosič, je tedy vzhledem k velikostem PAMAM dendrimeru obtížné dosáhnout vysoké molekulové hmotnosti důležité pro pasivní směrování do nádorové tkáně.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je vysokomolekulámí polymemí nosič léčiv odvozený od dendrimerů, jehož podstata spočívá vtom, že sestává z centrální molekuly dendrimeru nulté až šesté generace vybraného ze skupiny zahrnující molekuly poly(amidoam i nového) a 2,2bis(hydroxymethyl)propionového dendrimeru, na jejichž koncové amino nebo hydroxyskupiny jsou přes konce řetězce navázány amidickou nebo esterovou vazbou, prostřednictvím biodegradovatelných spojek, tvořených disulfidovou vazbou nebo oligopeptidovou sekvencí, semitelechelické kopolymery A-Q-hvdroxypropyl) methakrylamidu (HPMA) jako rouby, přičemž molární hmotnost roubuje 10 000-50 000 g/mol a molámí hmotnost nosiče je v rozmezí 40 000 až 1 400 000 g/mol.
Dále je předmětem předloženého vynálezu vysokomolekulámí polymemí nosiče odvozený od dendrimerů jehož podstata spočívá v tom, že sestává z centrální molekuly dendrimeru na bázi poly(amidoaminu), jehož koncové aminoskupiny jsou roubovány semitelechelickým HPMA kopolymerem navázaným k dendrimeru pres konec polymemího řetězce amidickou vazbou prostřednictvím biodegradovatelné spojky tvořené disulfidovou vazbou, znázorněný schématickou strukturou I
nebo biodegradovatelnou spojkou tvořenou oligopeptidovou sekvenci SP2, znázorněný strukturou II
-4CZ 302830 B6
Předmětem předloženého vynálezu je dále vysokomolekulámí polymemí nosič odvozený od dendrimerů, jehož podstata spočívá v tom, že sestává z centrální molekuly dendrimeru na bázi
2,2-bis(hydroxymethyl)propionové kyseliny, jehož hydroxyskuptny jsou roubovány semitelechelickým HPMA kopolymerem navázaným k dendrimeru přes konec polymemího řetězce prostřednictvím esterové vazby a biodegradovatelné spojky, tvořené d i sulfidovou vazbou, znázorněný schématickou strukturou III
- 5 CZ 302830 B6
anebo prostřednictvím oligopeptidové sekvence SP2, znázorněný strukturou IV
-6CZ 302830 B6
Význakem předloženého vynálezu je vy sokomo leku lamí polymemí nosič Jehož podstata spočívá v tom, že jeho centrální molekula je tvořena dendrimerem z poly(amidoaminu) nulté až šesté generace, obsahujícím 4 až 256 koncových skupin vybraných ze skupiny zahrnující amíno, pyridyldisulfidové a karboxylové skupiny, se středem tvořeným s výhodou cysteaminem, ethylendiaminem, diaminobutanem, diaminohexanem nebo diamidododekanem.
Význakem vysokomolekulámího polymemí ho nosiče odvozené od dendrimerů podle předložeio ného vynálezu je, že jeho centrální molekula je tvořena dendrimerem na bází 2,2-bis(hydroxymethyl )propionové kyseliny první až šesté generace obsahujícím 8 až 256 koncových skupin vybraných ze skupiny zahrnující hydroxy, pyridyldisulfidové a karboxylové skupiny. Význakem vysokomolekulámího polymemího nosiče odvozeného od dendrimerů podle předloženého vynálezu je to, že obsahuje polymemí rouby v počtu 2 až 28, které jsou tvořeny HPMA kopoly15 merem obsahujícím 0,5 až 8 mol % monomemích jednotek methakryloylovaného hydrazidu aminoacylu SP], kde aminoacyl je s výhodou vybrán ze skupiny glycyl, β-alanyl, 6-aminohexanoyl (AH), 4-aminobenzoyl a nebo sloužený acyl vycházející z oligopeptidů GlyGly, GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly a GlyPheLeuGly.
Vynález dále zahrnuje vysoko molekulární polymemí nosič léčiv odvozený od dendrimerů, ve kterém jsou polymemí rouby k centrální molekule dendritického poly(amidoaminu) nebo dendrimeru na bázi 2,2 b i s( hydroxy methy l)propionové kyseliny připojeny biodegradovatelnou vazbou obsahující d i sulfidovou skupinu nebo biodegradovatelný oligopeptid SP2.
-7 CZ 302830 Β6
Význakem vysokomolekulámího polymemího nosiče léčiv odvozeného od dendrimerů podle předloženého vynálezu je, že oligopeptid SP2 je vybrán s výhodou ze skupiny oligopeptidů zahrnující GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly a GlyLeuPheGly.
Předmětem vynálezu je dále vysoko molekulární polymemí konjugát, jehož podstata spočívá v tom, že sestává z polymemího nosiče odvozeného od dendrimerů podle předloženého vynálezu a kovalentně vázaného léčiva, s výhodou kancerostatika.
Význakem vysokomolekulámího polymemího konjugátu podle předloženého vynálezu je, že sestává z polymemího nosiče podle předloženého vynálezu a kancerostatika, s výhodou doxorubicinu.
Význakem vysokomolekulámího polymemího konjugátu podle předloženého vynálezu je, že doxorubicin je k nosiči připojen hydrolyticky Štěpíte lnou hydrazonovou vazbou.
Dále je význakem vynálezu, že vysokomolekulámí polymemí konjugát podle vynálezu sestává z polymemího nosiče odvozeného od dendrimerů podle předmětného vynálezu a amidícky vázaného kancerostatika, s výhodou doxorubicinu, ve kterém jsou polymemí rouby v počtu 2 až 28 tvořeny HPMA kopolymerem obsahujícím 0,5 až 8 mol % monomemích jednotek methakryloylovaného oligopeptidů SP3 s doxorubicinem navázaným ke konci oligopeptidů přes amidickou vazbu, kde oligopeptid SP2 je s výhodou vybrán ze skupiny oligopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly a GlyPheLeuGly
Význakem vysokomolekulámího polymemího konjugátu podle předmětného vynálezu je to, že molekulová hmotnost takového od dendrimerů odvozeného systému je s výhodou v rozmezí 40 000 až 1 400 000 g/mol, obsah doxorubicinu (Dox), jak v polymemích řetězcích, tak i ve výsledném konjugátu, je v rozmezí 1 a 25 % hmotn., což odpovídá 0,3 až 8 % mol na polymer.
Předmětem předloženého vynálezu je dále farmaceutická kompozice obsahující jako účinnou látku polymemí konjugát podle předmětného vynálezu pro použití při léčení nádorových onemocnění.
Význakem předloženého vynálezu je farmaceutická kompozice pro použití při léčení pevných nádorů.
Vynález dále zahrnuje farmaceutickou kompozici podle předmětného vynálezu pro použití při léčení některých druhů lymfomů a leukémií.
Předmětem předloženého vynálezu je tedy struktura a syntéza nových vysokomolekulámích polymemích nosičů léčiv odvozených od dendrimerů a jejich konjugátů s léčivy, které se liší od dříve popsaných systémů úzkou distribucí molekulových hmotností, vysokou definovaností systému, biodegradovatelným skeletem a zjednodušenou syntézou. Popsaná polymemí léčiva se vyznačují jak zvýšenou akumulací cytostatika v nádoru, tak intracelulámí degradací, a s tím spojenou vyloučitelností polymemího nosiče z organizmu po uvolnění léčiva a splnění úkolu nosiče.
Vysokomolekulámí biodegradovatelné polymemí nosíce podle vynálezu sestávají z centrální molekuly dendrimerů nulté až šesté generace vybraného ze skupiny zahrnující molekuly poly(amidoaminového) a 2,2-bi$(hydroxymethyl)propionového dendrimerů, na jejichž koncové amino nebo hydroxyskupiny jsou přes konce polymemího řetězce navázány prostřednictvím biodegradovatelných spojek semitelechelické kopolymery .V-{2-hydroxypropyl)methakry 1 amidu (HPMA).
Jako biodegradovatelné spojky degradovatelné v živém organizmu, především ve tkáních nebo cílových buňkách, jsou použity reduktivně štěpitelné disulfidové vazby nebo enzymaticky štěpi-8CZ 302830 B6 telné oligopeptidové sekvence. Molekulová hmotnost středového dendrimeru, stejně jako semité lechel i ckých roubů, je volena pod vylučovací mezí organizmu (pro HPMA kopolymery je tato mez cca 50 000 g/mol) tak, aby po degradaci byly všechny složky nosiče vyloučitelné z organizmu glomerulámí filtrací. Enzymaticky degradovatelné oligopeptidové sekvence spojující dendrimer s HPMA kopolymerem obsahují s výhodou sekvence GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly a GlyLeuPheGly.
Biodegradovatelné spojky mohou být do struktury nosiče zavedeny třemi způsoby, jednak reakcí aminoskupin nebo hydroxy skupin na konci větví dendrimeru se semitelechelickým polymerem již obsahujícím degradovatelné spojky, nebo reakcí semitelechelického polymeru s dendrimerem, jehož koncové aminoskupiny byly modifikovány strukturou obsahující biodegradovatelnou spojku a neboje možné zavést reduktivně štěpitelnou disulťídovou vazbu do struktury konjugátu přímo reakcí aktivované sulťhydrilové skupiny dendrimeru s koncovou sulfhydrilovou skupinou semitelechelického polymeru.
V případě polymemího konjugátu nese nosič léčivo připojené biodegradovatelnou vazbou, s výhodou pH-závislou hydrolyticky štěpitelnou hydrazonovou vazbou nebo oligopeptidovou spojkou štěpitelnou lysosomálními enzymy. Póly měrní konjugát je konstruován tak, aby jeho molekulová hmotnost byla dostatečně vysoká, významně převyšovala vylučovací limit organizmu a tím byla zabezpečena prodloužená doba cirkulace v krevním řečišti a dostatečně účinný EPR efekt a záchyt ve tkáni pevných nádorů. Molekulová hmotnost konjugátu může být při syntéze řízena molekulovou hmotností k syntéze použitých sem ite lechel ických polymerů, generací použitého dendrimeru a stupněm substituce koncových skupin dendrimeru. Molekulová hmotnost takového dendritického systému se pohybuje s výhodou mezi 40 000 až 1 400 000 g/mol, obsah Dox jak v polymemích řetězcích, tak i ve výsledném dendritickém konjugátu se pohybuje mezi 1 a 25 % hmotn. (0,3 až 8 % mol. na polymer).
Vysokomolekulámí polymemí konjugát podle vynálezu je převážně určen pro intravenózní aplikaci (injekce nebo infuze), může být ale podán i íntratumorálně či intraperitoneálně. Polymer s chemicky vázaným cytostatikem je stabilní v průběhu cirkulace v krevním řečišti, oligopeptidové spojky nebo disulfidová vazba mezi dendrimerem a polymerem a oligopeptidové spojky nebo hydrazonová vazba mezi léčivem a polymerem jsou relativně stabilní za fyziologických podmínek krevního řečiště (pH 7,4). Po extravasaci a záchytu v pevných nádorech díky EPR efektu dochází k průniku molekulárně rozpuštěného konjugátu do jednotlivých nádorových buněk pinocytózou. V důsledku poklesu pH z vnějšího pH 7,4 na intracelulámí pH 5 až 6 dochází k hydro lýze hydrazonové vazby, uvolnění cytostatika v cílové buňce, a tedy k aktivaci jeho cytotoxického efektu. Podobně, po vstupu do nádorových buněk, jsou v cytoplasmě a v lysosomech buněk štěpeny disulftdové či oligopeptidové spojky a dojde tedy k uvolnění léčiva vázaného pres oligopeptidové spojky a současně dojde i k degradaci polymemího skeletu na polymemí fragmenty vylučitelné z organizmu. Pokud je do struktury konjugátu navíc zabudován PAMAM dendrimer s cystaminovým jádrem, obsahuje již toto jádro biodegradovatelnou disulfidovou vazbu umožňující rozpad celého systému v nádorových buňkách na degradační produkty s nižší molekulovou hmotností.
Oproti v literatuře popsaným systémům je systém podle předloženého vynálezu, po splnění funkce vysokomolekulámího pasivně směrovaného nosiče, degradovatelný na krátké, v organizmu dobře rozpustné a biokompatibilní, polymemí fragmenty. V mírně kyselém reduktivním prostředí buňky (dle literatury koncentrace glutathionu v cytoplasmě živočišných buněk je v rozsahu 1 až 5 mM) dochází k redukci disulfidových vazeb a rozpadu vysokomolekulámího dendritického systému na původní polymemí fragmenty vylučitelné z organizmu. K podobné degradaci nosiče by mělo dojít i u nosiče obsahujícího polymery připojené k dendrimeru enzymaticky štěpitelnými oligopeptidovými sekvencemi. Zde by mělo dojít k degradaci polymemího skeletu účinkem lysosomálních enzymů. Reálnost výše navrženého mechanizmu působení polymerních konjugátů podle vynálezu je doložena modelovým uvolňováním Dox z polymemího nosiče i degradací dendritických polymerů studovanými v prostředí modelujícím poměiy v živočišné
- 9 CZ 302830 B6 buňce. Výsledky těchto testů, včetně testů protinádorové aktivity, jsou uvedeny v příkladové části přihlášky.
Předmětem vynálezu jsou tedy biodegradovatelné vysokomolekulámí nosiče kancerostatik a konjugátů těchto nosičů s vybranými kancerostatiky, s výhodou doxorubicinem, s výrazným cytotoxickým a cytostatickým efektem na pevné nádory.
Struktury polymerních nosičů a jejich konjugátů s léčivy je možné rozdělit do následujících skupin:
Póly měrní nosič typu 1 se vyznačuje tím, že jádro systému je tvořeno dendrimerem na bázi poly(amidoaminu) se středem tvořeným s výhodou cysteaminem, ethylendiaminem, díaminobutanem, diaminohexanem nebo diaminododekanem s koncovými 4 až 256 aminoskupinami (viz struktury ve schématech 11, 13 a 14), na který jsou naroubovány polymemí rouby HPMA kopolymeru o molekulové hmotnosti 10 až 50 000 g/mol v počtu 2 až 28 roubů připojené přes spojku, obsahující reduktivně štěpitelnou disulfidovou vazbu, vyznačující se tím, že polymerní roub je vybrán ze skupiny semitelechelických HPMA kopolymeru o struktuře a složení uvedenými ve schématech 7 až 10.
Polymemí nosič typu 2 se vyznačuje tím, že jádro systému je tvořeno dendrimerem na bázi 2,2bis(hydroxymethyl)propionové kyseliny s koncovými 4 až 256 hydroxy skupinám i (struktura viz. schéma 12 az 14), na který je naroubováno 2 až 28 polymemích roubů HPMA kopolymeru o molekulové hmotnosti 10 až 50 000 g/mol, připojených přes spojku obsahující reduktivně štěpitelnou disulfidovou vazbu, vyznačující se tím, že polymemí roub je vybrán ze skupiny semitelechelických HPMA kopolymerů o struktuře a složení uvedenými ve schématech 7 až 10.
Polymemí nosič typu 3 se vyznačuje tím, že jádro systému je tvořeno dendrimerem stejným jako v případě polymerního nosiče typu 1, semitelechelický polymer je připojen pomocí biodegradovatelné oligopeptidické sekvence, s výhodou GlyPheLeuGly, vyznačující se tím, že polymemí roub je vybrán ze skupiny semitelechelických HPMA kopolymerů o struktuře a složení uvedenými ve schématech l až 6.
Polymemí nosič typu 4 se vyznačuje tím, že jádro systému je tvořeno dendrimerem stejným jako v případě polymerního nosiče typu 2, semitelechelický polymer je připojen pomocí biodegradovatelné oligopeptidické sekvence, s výhodou GlyPheLeuGly, vyznačující se tím, že polymemí roub je vybrán ze skupiny semitelechelických HPMA kopolymerů o struktuře a složení uvedenými ve schématech 1 až 6.
Struktura polymemích konjugátů typu 1 až 4 jsou shodné se strukturami polymemích nosičů, na polymerní rouby je však vázáno kancerostatikům, a to čistě hydrolyticky štěpitelnou hydrazonovou vazbou a nebo enzymaticky štěpitelnou amidovou vazbou umístěnou na konci oligopeptidové sekvence (spaceru). Molekulové hmotnosti polymerních konjugátů se pohybují, podle velikosti centrálního dendrimeru, velikosti semitelechelického polymeru a stupně substituce, v rozmezí 40 000 až 1 400 000 g/mol.
Struktury polymemích dendrítických nosičů a konjugátů s Dox
Syntéza polymerních nosičů a polymemích konjugátů s Dox podle vynálezu je prováděna v několika krocích a sestává ze syntézy monomerů (HPMA, methakryloylované deriváty oligopeptidů s Dox navázaným amidovou vazbou, methakryloylované (MA) deriváty aminokyselin a oligopeptidů zakončených hydrazidovou skupinou případně zakončené hydrazidovou skupinou chráněnou terc-butyloxykarbonylovou skupinou (Boc)), navazující syntézy polymerních prekurzorů (semitelechelické polymery s koncovými reaktivními skupinami sloužícími pro navázání na centrální dendrimer a nesoucími podél řetězce chráněné popřípadě nechráněné hydrazidové skupiny, nebo molekuly léčiva navázaného přes oligopeptidový spacer) připravených radikálovou polymerizací. Syntéza monomerů i semitelechelických polymerů - polymemích prekurzorů byla
- 10CZ 302830 B6 již podrobně popsána dříve [Etrych patent CZ 298 945 B6, Etrych 2008]. Syntéza semitelechelických polymerů je založena buď na radikálové polymerizaci prováděné v přítomnosti přenašeče řetězce (kyseliny sulfanylpropionové (SPK)), na kopolymerizaci iniciovanou bifunkcním azoiniciátorem (3.3'-azo-bis(4-kyanoisovalerová kyselina (ABIK) nebo 3,3'-[4,4'-azobis(4—kyano— 4-methyl-l-oxo-butan-4,l-diyl)]bÍs(thiazolidin-2-thionem), ABIK-TT), nebo byla použita řízená radikálová polymerizace (RAFT, revers i ble addition-fragmentation chain transfer) iniciovaná azo-bis-izobutyronitrilem a 4-kyano-4—thiobenzoylsulfanyl-pentanovou kyselinou následovaná redukcí borohydridem sodným.
Semitelechelické kopolymery se vyznačují tím, že obsahují 85 až 99 mol % HPMA, 1 až 15 % mol jednotek methakryloylovaných Boc-chráněných hydrazidů aminokyselin nebo oligopeptidů nebo methakiyloylovaných oligopeptidů s navázaným léčivem a reaktivní skupinu situovanou u konce polymemího řetězce. Při syntéze nosičů i konjugátů byly použity semitelechelické kopolymery obsahující následující reaktivní skupiny: karboxylová skupina, karboxythiazolidin thionová (TT) skupina, primární aminoskupina, sulfhydrilová (SH) skupina a dithiopyrídylová (PDS) skupina. Struktury těchto polymerů jsou uvedeny níže, ve schématech znázorňujících struktury polymerů, nosičů i konjugátů ajejich popisech jsou použity tyto symboly:
(i) SPi pro aminoacyl v methakryloyl(aminoacyl)hydrazidech, například, glycyl, β-alanyk 6— aminohexanoyl (AH), 4-aminobenzoyl, a nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů GlyGly, GtyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly a GlyPheLeuGly;
ii) SP2 pro složený acyl v methakryloyl(aminoacyl)aminech vycházející z enzymaticky degradovatelné oligopeptidové sekvence obsahující s výhodou biodegradovatelné oligopeptidové sekvence GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly a GlyLeuPheGly);
iii) MA pro methakryloyl iv) AE pro 2-aminoethylovou skupinu
v) SPK pro zbytek kyseliny sulfanylpropionové
Polymer 1
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc—chráněnou hydrazidovou skupinou s terminální reaktivní TV-sukcinimidylesterovou skupinou nebo karboxylovou skupinou, (polymer la). Kopolymer byl připraven kopolymerizaci v přítomnosti přenašeče (H-SPK-OH, sulfanylpropionové kyseliny). Koncová karboxylová skupina H-SPK-OH byla v druhém kroku převedena reakcí s DCC a A-hydroxysukcinimidem na jV-sukcinimidylový ester.
O
CH,
Schéma 1: Struktury polymeru la - poly(HPMA—co-MA-SP1-NHNH-Boc)-SPK-OSu
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a končící karbonylthiazolidin-2-thionovou skupinou (polymer lb) nebo .V sukcinimidylesterovou skupinou (polymer 1c),
Schéma 2: struktury polymeru lb- poly(HPMA-co-MA-SP|-NHNH-Boc)-TT nebo polymeru 5 lc-poly(HPMA^eo-MA-SP,-NHNH-Boc)-OSu
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo olígopeptidy zakončenými
Boc-ch raněnou hydrazidovou skupinou a končící /V-sukcinimidylovým esterem biodegradovatelného oligopeptidu např. GtyPheLeuGly obecně SP2 (polymer ld) byl připraven dvoukrokovou io syntézou. V prvním kroku reagoval A-sukcinimidylový ester kopolymerů pofy(HPMA-co-MAAH-NHNH-Boc)-SPK-OSu s amínoskupinou oligopeptidu GFLG. Koncová karboxylová skupina připraveného kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)~SPK-GFLG-COOH byla v druhém kroku převedena reakcí s DCC a jV-hydroxysukcinimidem na /V-sukcinimidylový ester.
ch3
Schéma 3: struktury polymeru ld - poly(HPMA-co-MA-SPi~NHNH-Boc)-SPK-SP2-Osu
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými oligopeptidy s amidicky navázaným léčivem byl připraven radikálovou potymerizací HPMA prováděnou v přítomnosti přenašeče SPK. Kopolymer je zakončen A-sukcínimidylesterovou skupinou nebo karboxylovou skupinou, (polymer le) Kopolymer byl připraven kopolymerizací v přítomnosti přenašeče H-SPK-OH, Koncová karboxylová skupina byla v druhém kroku převedena reakcí s DCC a V hydroxvsukcinimidem na N25 sukcinimidylový ester.
- 12CZ 302830 B6
Schéma 4: struktury polymeru le - poly(HPMA-co-MA-SP2-Dox>-SPK-OSu
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými oligopeptidy s amidicky navázaným léčivem a končící karbonylthiazolidin-2-thionovou skupinou (polymer If) byl připraven radikálovou kopolymerizací odpovídajících monomerů za iniciace ABIK-TT. Kopolymer končící A-sukcinimidylesterovou skupinou byl připraven obdobným způsobem za iniciace ABIK a následnou aktivací koncové karboxylové skupiny jV-hydroxysukcinimidem (polymer Ig).
Schéma 5: Struktury, polymer If- poly(HPMA-co-MA_SP2-Dox)-TT nebo polymer 1 g - poly(HPMA—co—MA-SP2-Dox)-OSu
Kopolymer HPMA s methakiyloylovanými oligopeptidy s amidicky navázaným léčivem a končící A-sukcinimidylovým esterem biodegradovatelného oligopeptidu (např. GlyPheLeuGly) obecně SP2 (polymer lh) byl připraven dvojkrokovou syntézou. V prvním kroku reagoval Nsukcinimidylový ester kopolymeru poly(HPMA-co-MA-SP2-Dox)-SPK^OSu s aminoskupinou oligopeptidu. Koncové karboxylové skupiny připraveného kopolymeru poly(HPMA-co-MASP2-Dox}-SPK-GFLG-COOH byly v druhém kroku převedeny reakcí s DCC a V-hydroxysukcinimidem naA-sukcinimidylový ester.
Schéma 6: Struktury polymeru lh - poly(HPMA-co-MA-SP2-Dox)-SPK-Sp2-OSu
- 13CZ 302830 B6
Polymery 2
Tyto semitelechelické kopolymery obsahují koncové reaktivní thiolové skupiny.
Základní kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou s řetězcem končícím pouze thiolovou skupinou byl připraven RAFT kopolymer i žací HPMA a příslušného komonomerů a následnou redukcí borohydridem sodným (polymer 2z).
Schéma 7a: Struktury polymeru 2z- poly(HPMA-co~MA-SP|-NHNH-Boc)-SH
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou s řetězcem končícím thiolovou skupinou byl připraven reakcí koncových sukcinimidylových esterů polymeru la s 2-(2-pyridyldithio)ethylaminem (PDEA) a následnou redukcí pomocí dithiothreitolu (DTT) (polymer 2a).
Schéma 7b: struktury polymeru 2a - poly(HPMA-co-MA-SP|-NHNH-Boc)~SPK“AE-SH
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými 25 Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou s řetězcem končící thiolovou skupinou byl připraven reakcí koncových aktivovaných karboxylů polymerů 1b a lc s 2-(2-pyridyldithio)ethylaminem (PDEA) a následnou redukcí pomocí dithiothreitolu (DTT) (polymer 2b).
- 14CZ 302830 B6
ÍJ
SH
Schéma 8: Struktury polymeru 2b - poly(HPMA-co-MA-SPi-NHNH-Boc)-AE-SH
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými oligopeptidy s amidicky navázaným léčivem končící thiolovou skupinou byl připraven reakcí koncových sukcinimidylových esteru polymeru le s 2(2-pyridyldithio)ethylaminem (PDEA) a následnou redukcí pomocí dithiothreitolu (DTT) (polymer 2c).
io
SH
Schéma 9: Struktury polymeru 2c - poly(HPMA—co-MA-SP?*-Dox)-SPK-AE-SH
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými oligopeptidy s amidicky navázaným léčivem končící 15 thiolovou skupinou byl připraven reakcí koncových aktivovaných karboxylů polymerů lf a lg s
2-(2-pyridyldithio)ethylaminem (PDEA) a následnou redukcí pomocí dithiothreitolu (DTT) (polymer 2d).
SH
Schéma 10: Struktury polymeru 2d- poly(HPMA-co~MA-SP2~Dox)-AE-SH
Dendrimer
Jako centrální molekula v polymemích konjugátech byly využity dendrimery nulté až šesté generace. S výhodou byl použit PAMAM dendrimer sjudrem tvořeným cysteaminem, ethylendi- 15CZ 302830 B6 aminem, diaminobutanem, diaminohexanem nebo diaminododekanem a koncovými primárními aminoskupinami (Schéma 11).
NH s
HN
NH, o C y—N
Η,Ν-^Ν^ O H N
H
HN
Γ,
NH
H.N
-Ácj'' 0 i ° o^nh s
NHj
Schéma 11: Příklad struktury PAMAM dendrimeru: dendrimer 1 generace s jádrem tvořeným cystám inem nebo dendrimer na bázi 2,2-bis(hydroxymethyl) propionové kyseliny s koncovými hydroxyio skupinami znázorněný ve schématu 12
OH
OH
Schéma 12: Příklad struktury dendrimeru 2 generace na bázi 2,2-bis(hydroxymethyl)propionové kyseliny (BPA)
V případech syntézy některých biodegrado vatě Iných polymemích nosičů a konjugátů byly aminoskupiny nebo hydroxyskupiny PAMAM nebo BPA dendrimerů před reakcí se semitelechelickým polymerem převedeny na koncové pyrídyldisulfídové skupiny (PDS) (Schéma 13) nebo byl na aminoskupiny zaveden oligopeptid SP2 štěpitelný lysosomálními enzymy (Schéma 14). Pyridy Id i sulfidové skupiny byly zavedeny reakcí ami no skupin se sukcinimidylovými skupinami Nsukcinimidyl—[3-(2-pyridy!thio)]propionátu (SPDP) nebo reakcí hydroxyskupin s 3-( 2-pyridyl dithio)propionovou kyselinou DCC metodou. Oligopeptid byl zaveden reakcí amtnoskupin nebo hydroxyskupiny dendrimeru s Fmoc chráněným oligopeptidem pomocí DCC metody.
- 16 CZ 302830 B6
POS
NH
POS
PDS
O
PDS
Á-s-s-O
Schéma 13: Příklad struktury PAMAM dendrimeru-PDS a BPA dendrimeru-PDS skořicovými PDS skupinami
- 17CZ 302830 B6
GLFG-H
NH s
HN
H-GFLG-N^z^N
H
N-GLFG-H $
HN
Γ / H 0
H 0 'JJ'GLFG-H
H<3FLG-p
O ů /-'A ,Α^—ν ,3
NH $
ΐ'-'Ίί
Ϊ ° •'GLFG-H
GLFG-H
GFLF-H \S
Λ
GFLG-H
GFLG-H νΔζ~,
O nh
GFLG-H
GFLG-H-7 \
GFLGGFLG-H
GFLG-H
X
GFLG-H
GLFG-H
GFLG-H
HN
GLFG-H
GFLG-H
GFLG-H '4
GFLG-H
GFLG-H
O .O
GFLG-H
GFLG-H o «ΎΓνη·
Schéma 14: Příklad struktury PAMAM a BPA dendrimerů s navázaným oligopeptidem GLFG-H 5 Polymerní nosič a polymerní konjugát.
Polymerním nosičem je dále nazýván vysokomolekulámí polymer bez navázaného léčiva odvozený od dendrimerů, polymerním konjugátem pak takovýto polymerní nosič s navázaným léčivem. Léčivo, s výhodou Dox, je navázán na nosič po předchozím odstranění Boc chránící skupiío ny pres hydrazonovou vazbu, a to reakcí prováděnou v methanolu za katalýzy kyselinou octovou.
V případě doxorubicinu vázaného amidovou vazbou je polymerní konjugát připraven přímo reakcí semitelechelických kopolymerů nesoucích vázaný Dox s příslušným dendrimerem.
Vzhledem ke struktuře konjugátů a mechanizmu degradace polymerní struktury jsou polymerní 15 konjugáty dle vynálezu rozděleny do 4 základních skupin:
- 18CZ 302830 B6
Konjugát 1 z PAMAM dendrimerů definovaných výše s hydrazonově nebo amidicky vázaným léčivem a reduktivne degradovatelnou disulťidovou spojkou, jehož schematická struktura je uvedena na schématu 15
Schéma 15: Struktury konjugátu 1 s jádrem tvořeným PAMAM dendrimerem (cystaminové jádio ro, 1 generace), λλλλλλ představuje schematické znázornění polymeru na bázi kopolymeru
HPMA
Konjugát 2 z BPA dendrimerů s hydrazonově nebo amidicky vázaným léčivem a reduktivne degradovatelnou disulťidovou spojkou, jehož schematická struktura je uvedena na schématu 16
- 19CZ 302830 B6
Schéma 16: Struktury konjugátu 2 s jádrem tvořeným BPA dendrimerem (2 generace), λλλλλλ představuje schematické znázornění polymeru na bázi kopolymeru HPMA
Konjugát 3 s hydrazonově nebo amidicky vázaným léčivem a enzymaticky štěpitelnou oligopeptidovou spoj10 kou, jehož schematická struktura je uvedena na schématu 17
- 20CZ 302830 B6
Schéma 17: Struktury konjugátu 3 s jádrem tvořeným PAMAM dendrimerem (cystaminové jádro, 1 generace) λλλλλλ představuje schematické znázornění polymeru na bází kopolymeru
HPMA
Konjugát 4 s hydrazonově nebo amidicky vázaným léčivem a enzymaticky štěpitelnou oligopeptidovou spojio kou, jehož schematická struktura je uvedena na schématu 18
-21 CZ 302830 B6
Schéma 18: Struktury konjugátu 4 s jádrem tvořeným BPA dendrimerem), λλλλλλ představuje schematické znázornění polymeru na bázi kopolymeru HPMA
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 znázorňuje závislost množství uvolněného Dox z dendritických polymemích konjugátu 1 a 2 a lineárního polymemího konjugátu (Dox je vázán přes hydrazonovou vazbu) při inkubaci v pufru o pH 5 (model intracelulámího prostředí) na čase.
Obr. 2 znázorňuje závislost množství uvolněného Dox z dendritických polymemích konjugátu 1 a 2 a lineárního polymemího konjugátu (Dox je vázán přes hydrazonovou vazbu) při inkubaci v pufru o pH 7,4 (model krevního řečiště) na čase.
Obr. 3 znázorňuje závislost molekulové hmotnosti konjugátu 1 na čase v průběhu inkubace ve fosfátovém pufru obsahujícím glutathion [c(glutathion) = 3.10”3 mol/l]
Obr. 4 znázorňuje závislost molekulové hmotnosti polymemího konjugátu 3 na čase v průběhu inkubace ve fosfátovém pufru obsahujícím katepsín B [c(katepsín B) = 5.10’7 mol/l]
Obr. 5 znázorňuje růst nádoru po podání K-l HYD s hydrazonově vázaným doxorubicinem, K-l AM s amidicky vázaným doxorubicin a lineárních polymemích konjugátu LIN HYD a LIN AM.
- 22 CZ 302830 B6
Obr. 6 znázorňuje přežívání myší s nádorem EL4 po podání K-l HYD s hydrazonově vázaným doxorubicinem, K-l AM s amidícky vázaným doxorubicinem a lineárních polymemích konjugátů LIN HYD a LÍN AM.
Obr. 7 znázorňuje přežívání myší vyléčených polymemími konjugáty (viz obr. 5 a 6) a retransplantováných letální dávkou původního nádoru (1 x 105 myší T buněčný lymfom EL4).
Příklady provedení vynálezu
Příklady syntézy meziproduktů a polymemích konjugátů doxorubicinu podle vynálezu.
Příklad 1
Syntéza semitelechelického polymemího prekurzoru (syntéza s přenosem SPK) -Polymer la kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-SPK-OSu
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)~SPK-OSu byl připraven srážecí radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHNH-Boc v acetonu při 50 °C v přítomnosti iniciátoru ABIN a přenosového činidla H-SPK-OH. Koncové karboxyiové skupiny byly v některých případech v druhém kroku převedeny reakcí s DCC a .Y -hydroxysukcinimidem na /Y-sukcinimidylový ester, jak bylo popsáno dříve [Etrych patent CZ 298 945 B6].
Příklad 2
Syntéza semitelechelického polymemího prekurzoru - Polymeru 1 b - kopolymerů poly(HPMAco-M A-A H-N HN H-Boc )-TT
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA~co~MA-AH-NHNH-Boc)-TT byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHNH-Boc v DMSO při 60 °C za iniciace iniciátorem ABIK-TT [Etrych patent CZ 298 945 B6].
Příklad 3
Syntéza semitelechelického polymemího prekurzoru - Polymeru lc - kopolymerů poly(HPMAco-MA-AH-NHNH-Boc)-OSu
Semitelechelický kopolymer poly( HP MA-co-MA-AH-NHN H-Boc )-OSu byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHNH-Boc v ethanolu při 50 °C za iniciace iniciátoru ABIK a následnou aktivací koncových karboxylových skupin na JV-sukcinimidylový ester [Etrych patent CZ 298 945 B6].
Příklad 4
Syntéza semitelechelického polymemího prekurzoru - Polymeru ld - kopolymerů poly(HPMAco-MA-AH-NHNH-Boc)~SPK-GFLG-OSu
Semitelechelický kopolymer po ly(HPMA-co~M A-A H-N HN H-Boc )-SPK-GFLG-OSu byl připraven dvojkrokovou syntézou. V prvním kroku reagoval /V-sukcinimidylový ester kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-OSu s aminoskupinou oligopeptidů GFLG. Koncové karboxyiové skupiny připraveného kopolymerů poIy(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-23CZ 302830 B6
SPK-GFLG-COOH byly v některých případech v druhém kroku převedeny reakcí s DCC a Nhydroxysukcinimidem na Λ - sukcinimidylovy ester [Etrych patent CZ 298 945 B6].
Příklad 5
Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru (syntéza s přenosem SPK) - Polymer le kopolymeru poly(HPMA-co-MA-GFLG-Dox)-SPK-OSu io Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA~GFLG-Dox)-SPK-OSu byl připraven srážecí radikálovou kopolymer izaci HPMA a MA—GFLG-Dox v acetonu při 50 °C v přítomnosti iniciátoru AB1N a přenosového činidla H-SPK-OH. Koncové karboxylové skupiny byly v druhém kroku převedeny reakcí s DCC a A-hydroxysukcinimidem na Λ'-sukcinimidylový ester [Olbřích 2000].
Příklad 6
Syntéza semitelechelického polymemího prekurzoru - Polymeru If - kopolymeru poly(HPMA20 co-MA-GFLG-Dox)-TT
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-GFLG-Dox)-TT byl připraven roztokovou radikálovou kopoiymerizací HPMA a MA-GFLG-Dox v DMSO při 60 °C za iniciace iniciátorem ABIK-TT.
220 mg (1,54 mmol) HPMA, 25 mg (0,025 mmol) MA-GFLG-Dox bylo rozpuštěno v 1,7 ml DMSO a tento roztok byl umístěn do polymerační ampule, ve které bylo již naváženo 84 mg (0,170 mmol) ABIK-TT (4 hm.%). Roztok v ampuli byl 15 min probubláván dusíkem, ampule byla zatavena a umístěna do termostatu vyhřívaného na 60 QC. K rozpuštění iniciátoru došlo po 3 min při teplotě 60 °C. Po 6 h byla reakční směs vy srážen a do 50 ml směsi aceton : diethylether 2:1. Kopolymer byl rozpuštěn ve 3 ml methanolu a opět vysrážen do 50 ml stejné srážecí směsi. Vysrážený kopolymer byl odfiltrován na fritě S4 a sušen do konstantní hmotnosti.
Příklad 7
Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru - Polymeru Ih - kopolymeru poly(HPMAco-MA-GFLG-Dox)-SPK-GFLG—OSu
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-GFLG-Dox)-SPK-GFLG-OSu byl připraven dvou krokovou syntézou popsanou u přípravy poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH—BocýSPK-GFLG-OSu (Příklad 4). V prvním kroku reagoval A-sukcinimidylový ester kopolymeru poly(HPMA-co-MA-GFLG-Dox)-SPK-OSu s aminoskupinou oligopeptidů GLFG. Koncové karboxylové skupiny připraveného kopolymeru poly(HPMA-co-MA-GFLG-Dox)-SPK45 GFLG-COOH byly v druhém kroku převedeny reakcí s DCC a jV-hydroxysukcinimidem na 7Vsukcinimidylový ester.
Příklad 8
Syntéza semitelechelického polymemího prekurzoru - Polymeru 2a - kopolymeru poly(HPMAco-MA-AH—NHNH-Boc)-SPK-AE-SH
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-SPK-AE-SH byl připra55 ven polymeranalogickou reakcí kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-SPK-OSu
- 24CZ 302830 B6 s bifunkčním činidlem hydrochloridem 2—(2-pyridyldisulfanyl)ethvlaminem (PDEA) v DMSO a následnou redukcí pomocí dithiothreitolu (DTT) ve fosfátovém pufru (0,5 M fosfátový pufr, 0,1 MNaCl, pH 7,4).
mg PDEA.HC1 (0,036 mmol) bylo rozpuštěno v 0,5 ml DMSO a za intenzivního míchání bylo přidáno 6 μΐ diisopropylethylaminu (0,036 mmol). Po 5 min byl do tohoto roztoku přidán za intenzivního míchání při teplotě místnosti roztok 300 mg polymeru poly(HPMA-co-MA-AH— NHNH-Boc)-SPK-OSu (0,026 mmol TT skupin) v 4 ml DMSO. Po 2 h byla reakční směs nareděna na 15 ml methanolem a kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou ehromatografií na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu (RI detekce). Polymemí frakce byla jímána, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 6 ml a kopolymer byl izolován vysrážením do 80 ml směsi aceton : diethylether 3:1. V dalším kroku bylo 300 mg polymeru s PDS skupinami (0,024 mmol PDS skupin) rozpuštěno v 5 ml fosfátového pufru a byl přidán roztok 18,5 mg DTT v 0,4 ml destilované vody. Po 1 h byl polymer vyčištěn od nízkomolekulárních příměsí gelovou filtrací na koloně naplněné Sephadex G-25 ve vodě. Polymer byl izolován lyofilizací a skladován pod argonem při -18 °C.
Příklad 9
Syntéza semítelechelického polymerního prekurzoru - Polymeru 2b - kopolymeru poly(HPMA— co-MA-AH-NHNH-Boc)-AE-SH
Semitelechelícký kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-AE-SH byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymeru poly(HPMA-co—MA-AH—NHNH-Boc)-OSu nebo poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT s bifunkčním činidlem PDEA v DMSO a následnou redukcí pomocí DTT ve fosfátovém pufru (0,5 M fosfátový pufr, 0,1 M NaCI, pH 7,4) postupem popsaným v příkladě 8.
Příklad 10
Syntéza semítelechelického polymerního prekurzoru — Polymeru 2c - kopolymeru poly(HPMA— co-MA-GFLG-Dox)-SPK-AE-SH
Semitelechelícký kopolymer poly(HPMA-co-MA-GFLG-Dox)~AE“SPK-SH byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymeru poly(HPMA-co—MA-GFLG-Doxý-SPK-OSu s bifunkčním činidlem PDEA v DMSO a následnou redukcí pomocí DTT ve fosfátovém pufru (0,5 M fosfátový pufr, 0,1 M NaCI, pH 7,4) postupem popsaným v příkladě 8.
Příklad 11
Syntéza semítelechelického polymerního prekurzoru - Polymeru 2d - kopolymeru poly(HPMAco-MA—GFLG-Dox)-AE-SH
Semitelechelícký kopolymer poly(HPMA-co-MA-GFLG-Dox)-AE-SH byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymeru poly(HPMA-co-MA-GFLG-Dox)-OSu nebo poly(HPMA-coMA-GFLG-Dox)-TT s bifunkčním činidlem PDEA v DMSO a následnou redukcí pomocí DTT ve fosfátovém pufru (0,5 M fosfátový pufr, 0,1 M NaCI, pH 7,4) postupem popsaným v příkladě 8.
-25CZ 302830 B6
Příklad 12
Syntéza dendrimeru s PDS skupinami
PAMAM nebo BPA dendrimery obsahující pyridyldisulfidové skupiny (dendrimer-PDS) byly připraveny reakcí amínoskupin nebo hydroxyskupin dendrimeru se sukcinimidylovými skupinami Y- sukcinimidyl-[3-(2-pyridyldithio)|propionátu (SPDP) nebo karboxylovými skupinami 3(2-pyridyldithio)propionové kyseliny s využitím DCC metody.
io 5 mg PAMAM v dendrimeru 2 generace (0,026 mmol amínoskupin) bylo rozpuštěno v 0,5 ml methanolu, za stálého míchání byl přidán roztok 23 mg SPDP (0,071 mmol) v 0,5 ml methanolu. Po 2 hod byl modifikovaný dendrimer vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí getovou chromatografií na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu (Rí detekce). Frakce obsahující dendrimer byla jímána, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 1 ml a dendrimer byl izolován lyofilizací ze směsi methanol: voda (1:3).
Příklad 13
2« Syntéza dendrimeru s navázaným oligopeptidem
PAMAM nebo BPA dendrimery s navázanými oligopeptidy (dendrimer-SP?) zakončenými aminoskupinou byly připraveny reakcí amínoskupin nebo hydroxyskupin dendrimeru s karboxylovými skupinami N~Fmoc-ehráněných oligopeptidů v přítomnosti kondenzačního činidla DCC.
mg V-Fmoc-chráněného oligopeptidů GFLG (0,065 mmol) bylo rozpuštěno v 0,9 ml DMF a po ochlazení na -18 °C přidáno k roztoku 13,5 mg DCC (0,065 mmol) v 0,1 ml DMF. Po 30 min byl k chlazené reakční směsi přidán roztok 10 mg dendrimeru BPA 2 generace (0,052 mmol hydroxyskupin) v 0,5 ml DMF. Reakční směs byla míchána 1,5 h při 4 °C a 2 h při teplotě místnosti.
Následně byla reakční směs naředěna na 5 ml methanolem a modifikovaný dendrimer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadexem LH20 v methanolu (R1 detekce). Frakce obsahující dendrimer byla jímána, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 1 ml a dendrimer byl izolován vy srážením do d i ethyl etheru. Volné aminoskupiny na modifikovaném dendrimeru byly získány deprotekcí FMOC-chráněných ami35 noskupin ve 25% roztoku piperidinu v DMF.
Příklad 14 to Syntéza polymerního konjugátu - konjugát 1 a 2
Polymemí konjugát 1 nebo 2 s léčivem vázaným přes konec oligopeptidové sekvence amidovou vazbou byl připraven reakcí PDS skupin modifikovaného PAMAM nebo BPA dendrimeru-PBS s thiolovými skupinami polymerů 2c nebo 2d.
150 mg poly(HPMA-co-MA-GFLG-Dox)-AE-SH (0,010 mmol SH skupin) bylo rozpuštěno ve 3 ml fosfátového pufru (0,5 M fosfátový pufr, 0,1 M NaCl, 0,01 M ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA), pH 7,4) a přidáno při laboratorní teplotě k míchanému roztoku 6,5 mg dendrimeru-PDS (0,013 mmol PDS skupin) v 1 ml methanolu. Po 4 h reakce při teplotě místnosti byl roztok naředěn na 10 ml methanolem a polymemí konjugát byl zbaven nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Polymemí frakce byla jímána, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 2 ml a kopolymer byl izolován vy srážením do 30 ml ethylacetátu. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti.
-26 CZ 302830 B6
Polymemí konjugát 1 nebo 2 s hydrazonové vázaným léčivem byl připraven reakcí PDS skupin dendrimeru-PDS s SH skupinami polymeru 2a nebo 2b, následným odchráněním hydrazidových skupin pomocí trifluoroctové kyseliny (TFA) a navázáním Dox v methanolu za katalýzy kyseliny octové.
200 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)—SPK-AE-SH (0,014 mmol SH skupin) bylo rozpuštěno ve 4 ml fosfátové pufru (0,5 M fosfátový pufr, 0,1 M NaCl, 0,01 M ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA), pH 7,4) a přidáno při teplotě místnosti k míchanému roztoku 8,5 mg dendrimeru-PDS (0,017 mmol PDS skupin) v 1,5 ml methanolu. Po 4 h reakce při teplotě místnosti byl roztok naředěn na 13 ml methanolem a polymemí nosič zbaven nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografii na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Polymemí frakce byla jímána, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 2 ml a kopolymer byl izolován vy srážením do 30 ml ethylacetátu. Produkt byl vysušena do konstantní hmotnosti. Při odstranění chránících Boc skupin bylo 190 mg polymemího nosiče rozpuštěno ve 5 ml směsi TFA : tríisopropylsilan : voda v poměru 95 : 2,5 : 2,5. Po 15 minutách byla směs opakovaně odpařována s methanolem (v pětinásobném přebytku) na vakuové odparce za vakua vodní vývěvy, dokud se nevyloučily po odpaření krystalky. Produkt byl rozpuštěn ve vodě a pH vodného roztoku bylo zvýšeno na pH - 7 až 8. Polymemí nosič byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografii na koloně naplněné Sephadex G-25 v destilované vodě za R.I detekce. Polymemí frakce byla jímána a polymer byl izolován lyofilizací na lyofilizačním přístroji Lyovac GT-2.
Při vazbě Dox na polymemí nosič bylo 180 mg polymemího nosiče rozpuštěno ve 2 ml methanolu a tento roztok byl nalit do termostatované cely, ve které bylo umístěno 20 mg Dox.HCl (0,034 mmol). Nehomogenní suspenze byla míchána v temnu při 25 °C a po 1 minutě bylo přidáno 100 μί kyseliny octové. V průběhu reakce došlo k pozvolnému rozpuštění suspenze a po 23 h reakce byl polymemí produkt vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí a nenavázaného léčiva gelovou chromatografii na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Polymemí frakce byla jímána, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 3 ml a polymemí konjugát byl izolován vysrážením do 30 ml ethylacetátu. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti.
Příklad 15
Syntéza polymemího konjugátu - konjugát 3 a 4
Polymemí konjugát 3 nebo 4 s amidicky přes ofigopeptid vázaným léčivem byl připraven buď reakcí aminoskupin modifikovaného PAMAM nebo BPA dendrimeru-GFLG~NH2 s TT nebo OSu skupinami polymerů le, lf nebo lg, nebo reakcí sukcinimidylových skupin, případně karboxylových skupin, polymeru lh poly(HPMA-c«-MA-GFLG-DOx)-SPK-GFLG—OSu s aminoskupinami, případně hydroxy skupinám i, dendrimeru.
100 mg polymeru lf (0,006 mmol OSu skupin) bylo rozpuštěno ve 2 ml DMSO a přidáno při laboratorní teplotě k míchanému roztoku 1,9 mg dendrimeru (0,009 mmol GFLG-NH2 skupin) v 1 ml methanolu. Po 2 h reakce při laboratorní teplotě byl roztok naředěn na 8 ml methanolem a polymemí konjugát byl zbaven nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografii na koloně naplněné Sephadexem LH—20 v methanolu. Polymemí frakce byla jímána, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 2 ml a kopolymemí konjugát byl izolován vysrážením do 30 ml ethylacetátu. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti.
Polymemí konjugát 3 nebo 4 s hydrazonové vázaným léčivem byl připraven buď reakcí aminoskupin modifikovaného PAMAM nebo BPA dendrimeru-GFLG-NH2 s TT nebo OSu skupinami polymerů la, lb nebo lc, nebo reakcí sukcinimidylových skupin, případně karboxylových skupin, polymeru Id poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-SPK-GFLG-OSu saminoskupinami, případně hydroxy skup i námi, dendrimeru, následným odchráněním hydrazidových
-27CZ 302830 B6 skupin pomocí trifluoroctové kyseliny (TFA) a navázáním Dox v methanolu za katalýzy kyseliny octové.
120 mg poly(HPMA-ro~MA-AH-NHNH-Boc)-GFLG-OSu (0,008 mmol OSu skupin) bylo rozpuštěno ve 2 ml DMSO a přidáno při laboratorní teplotě k míchanému roztoku 2,2 mg dendrimeru (0,011 mmol NH? skupin) v 1 ml methanolu. Po 2 h reakce při laboratorní teplotě byl roztok naředěn na 9 ml methanolem a polymemí nosič byl zbaven nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografii na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Polymemí frakce byla zachycena, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 2 ml a kopolymemí nosič byl izolován vysrážením do 30 ml ethylacetátu. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti. Odstranění Boc chránících skupin a navázání léčiva hydrazonovou vazbou bylo provedeno postupem popsaným v příkladu 14.
Příklad 16
Uvolňování doxorubicinu z polymemích konjugátů
Bylo měřeno množství doxorubicinu uvolněného z polymemích konjugátů po jejich inkubaci ve fosfátovém pufru o pH 5,0 (0,1 M fosfátový pufr obsahujícím 0,05 M NaCl) modelujícím intracelulámí prostředí a fostátovém pufru pH 7,4 modelujícím prostředí krevního řečiště. Množství uvolňovaného Dox v inkubačním roztoku bylo stanoveno pomocí HPLC (Shimadzu). V předem určených časových intervalech bylo odebíráno 50 μΐ inkubačního roztoku a analyzováno na koloně TSK Gel G 3000x1, izokratícký průtok 0,5 ml/min mobilní fáze složené ze směsi methanol: octanový pufr pH 6,5 (80 : 20 % obj.). Množství Dox bylo vypočteno z ploch píku volného a vázaného Dox (UV-V1S detekce při 488 nm). Po inkubaci konjugátů (koncentrace 5 mg/ml) ve fyziologickém prostředí při 37 °C (fosfátový pufr, pH 7,4) se uvolňuje jen malé množství léčiva (do 7 %/24 hod) obr. 2; naopak lychlost uvolňování Dox z polymemích konjugátů, a tedy rychlost aktivace cytotoxického léčiva, je v mírně kyselém prostředí při pH 5,0 obr. 1 značná. Rychlosti uvolňování léčiva v pH 7,4 a pH 5 z roubovaných polymemích konjugátů jsou plně srovnatelné s rychlostmi uvolňování léčiva zjištěných u hydrazonových konjugátů připravených pouze z lineárních nebo roubovaných kopolymerů [Etrych 2008].
Příklad 17
Degradace polymemího konjugátu 1 s amidicky vázaným léčivem pomocí glutathionu na degradační produkty vy lučí tel né z organismu
Degradace polymemího konjugátu byly studovány ve fosfátovém pufru (0,1 M fosfátový pufr obsahující 0,05 M NaCl, pH 6) v přítomnosti glutathionu jako redukčního činidla, tj. v prostředí modelujícím prostředí buňky (cytoplasma, endosom a sekundární lysosom). Polymemí konjugáty byly rozpuštěny ve fosfátovém pufru v koncentraci 20 mg/ml a těsně před umístěním těchto roztoků do termostatu (teplota 37 °C) byl do těchto roztoků přidán zásobní roztok glutathionu, tak aby výsledná koncentrace glutathionu v inkubačním médiu byla 3.10”3 mol/1. V předem určených intervalech byly z inkubačntch roztoků odebírány alikvotní podíly (200 μΐ), které byly odsoleny na kolonách PD-10 a lyofilizovány. Molekulová hmotnost degradačních produktů byla změřena na kapalinovém chromatografu Shimadzu LC-10AD doplněném diferenciálním refraktometrem (Optilab Rex, Wyatt technology, USA) a mnohoúhlovým detektorem rozptylu světla (DAWN EOS, Wyatt Technology, USA). Analýza byla prováděna na koloně Superose™6 (300 x 10 mm) (Amersham Bioscience). Jako mobilní fáze byl použit 0,3 M octanový pufr (CHjCOONa/CHjCOOH; pH = 6,5; 0,5 g/1 NaNj) o průtoku 0,5 ml/min. Molekulová hmotnost a polydísperzita kopolymeru byla vypočtena pomocí Astra software (Wyatt Technology, USA). Konjugát obsahující disulfidické můstky (konjugát 1) byl v roztoku obsahujícím cytoplasmatickou koncentraci glutathionu (3.10“3 mol/1) rychle degradován. Po 24h inkubace s glutathionem
-28CZ 302830 B6 byly nalezeny polymemí degradační produkty s molekulovou hmotností pod limitem renální filtrace (~ 25000 g/mol). Viz obr. 3.
Příklad 18
Degradace polymemího konjugátu 3 s hydrazonově vázaným léčivem pomocí katepsinu B na degradační produkty vy lučíte lne z organismu io Degradace polymemího konjugátu byly studovány v 0,1 M fosfátovém pufru (NaH2PO4/NaOH, pH = 6,0; 5 mM glutathion; 1 mM EDTA) obsahujícím lysosomální enzym katepsín B, tj. v prostředí modelujícím prostředí sekundárního lysosomu v nádorových buňkách při koncentraci substrátu 50 mg/ml. Polymemí konjugát byl rozpuštěny ve fosfátovém pufru v koncentraci 10 mg/ml a těsně před umístěním do termostatu (teplota 37 °C) byl přidán zásobní roztok katep15 sinu B tak, aby výsledná koncentrace katepsinu B byla 5.10 7 Μ. V předem určených intervalech byly z inkubačních roztoků odebírány alikvotní podíly (200 μΐ), které byly odsoleny na kolonách PD-10 a lyofilízovány. Molekulová hmotnost degradačních produktů byla změřena stejným způsobem popsaným výše.
Konjugát obsahující oligopeptidový spacer GFLG (konjugát 3) byl v roztoku obsahujícím katepsin B (5.10“7 M) pozvolna degradován. Po 48h inkubace s katepsinem B byly nalezeny polymemí degradační produkty s molekulovou hmotností pod limitem renální filtrace (~ 40000 g/mol) viz obr. 4.
Pro následující příklady biologické účinnosti jsou definovány tyto zkratky polymemích konjugátů:
K-l AM dendritický polymemí konjugát 1 s amidicky vázaným léčivem,
A7W = 248 000,/„ = 1,9, Ah= 15,6 nm.
K-l HYD dendritický polymemí konjugát 1 s hydrazonově vázaným léčivem,
199 000,/n = 2,1, 7?h = 14,2 nm.
LIN AM lineární polymemí konjugát s amidicky vázaným léčivem,
Mv= 45 000,7n = 1,85, = 5,2 nm.
LIN HYD lineární polymemí konjugát s hydrazonově vázaným léčivem,
A/w - 36 000, In = 1,87, = 4,5 nm.
Příklad 19
Ukázka in vitro biologické aktivity (cytotoxicity vyjádřené jako IC5o) dendritických a roubovaných konjugátu doxorubicinu při inkubaci s buňkami různých nádorových linií (metoda inkorpo45 race 3H thymidinu byla použita při stanovení cytotoxicity).
-29 CZ 302830 B6
Tabulka 1 - cytotoxicity dendritických a roubovaných konjugátů doxorubícinu při inkubaci s buňkami různých nádorových linií vyjádřené jako IC50
Nádorová linie K-l HYD K-l AM LIN HYD LÍN AM Dox
EL4 0,059 11,886 0,147 24,1 0,014
38C13 0,015 2,000 0,023 1,796 0,003
B16 0,012 1,120 0,030 1,562 0,005
BCL 1 0,003 0,700 0,042 0,945 0,001
Ráji 0,005 1,272 0,028 2,71 0,001
Jurkat 0,016 3,476 0,599 4,83 0,003
3T3 0,015 2,751 0.0269 2,974 0,005
FaDu 0,038 1,873 0,032 6,22 0,001
4T1 0,053 3,657 0,191 19,43 0,012
Pro zjištění inhibiční aktivity studovaných polymerů byly vybrány permanentní nádorové linie myšího a lidského původu. Jde konkrétně o myší T buněčný lymfom EL4, myší B buněčný lymfom 3803, myší melanom B16, myší B buněčnou leukémii BCL1, lidský B buněčný lymfom Ráji, lidskou T buněčnou leukémii Jurkat, myší fíbroblastom 3T3, lidský spinocelulámí karcinom
FaDu a myší karcinom prsu 4T1. Antiproliferační aktivita byla měřena inkorporací 3H thymídinu.
Z tabulky 1 vyplývá, že nej výraznější inhibiční aktivitu u všech testovaných linií mají oba vzorky (K-l HYD a LIN HYD) s hydrazonově vázaným doxorubicinem. Podstatně menší aktivitu mají polymery samidicky vázaným doxorubicinem. Vy sokomo leku lamí polymemí konjugáty K-l
HYD a K-l AM mají v obou případech mírně vyšší antiproliferační aktivitu než lineární konjugáty se stejně vázaným léčivem. Rozdíly ovšem nejsou signifikantní a je možné konstatovat, že vysokomolekulámí polymemí konjugáty mají přibližně totožnou antiproliferační aktivitu jako jejich nízkomolekulámí lineární analoga.
Příklad 20
Ukázka in vivo biologické aktivity dendritických konjugátů doxorubicinu u inbredních myší C57BL/6 transplantovaných s.c. T buněčným lymfomem EL4
Pro in vivo pokusy byly použité inbrední myší C57BL/6 transplantované s.c. T buněčným lymfomem EL4. Dávky byly 1x15 mg Dox eq./kg a 10 mg Dox eq./kg podávané intravenózně (i.v.). Jako aktivní kontrola byla použita skupina myší nesoucí nádor EL4 a léčená pouze doxorubicinem (2x5 mg/kg i.v. v den 8 a 15). Základní kontrola byly neléčené myši s nádorem EL4. Růst nádoru po podání K-l HYD s hydrazonově vázaným doxorubicinem, K-l AM s amidicky vázaným doxorubicinem a lineárních polymemích konjugátů LIN HYD a LIN AM je znázorněný na Obr. 5.
-30CZ 302830 B6
Z obr. 5 a 6 je zřejmé, že v dávce 15 mg Dox eq./kg jsou oba vzorky dendritických vysokomolekulamích polymemích konjugátů (K-l HYD a K-l AM) vysoce účinné a jediná dávka léčiva podaná v době agresivního růstu nádoru vyléčí 100% myší s experimentálním nádorem EL4. Účinnost vysokomolekuiámích polymemích konjugátů je významně vyšší než u lineárních konjugátů nesoucích léčivo navázané obdobným způsobem. U těchto lineárních konjugátů došlo k vyléčení 37% (LIN HYD) nebo 25% (LIN AM) myší s experimentálním nádorem. Při dávce 10 mg Dox eq./kg bylo zjištěno, že K-l HYD s hydrazonově vázaným doxorubicinem je stále vysoce účinný, jelikož jednou dávkou podanou v době agresivního růstu nádoru došlo opět k vyléčení 100% myší. Polymemí konjugát K-l AM s amidicky vázaným doxorubicinem je méně účinný, ale stále jedna nízká dávka vyléčí přes 60% myší s experimentálním nádorem.
Obr. 7 znázorňuje přežívání myší vyléčených polymemími konjugáty (viz obrázky 5 a 6) a retransplantováných letální dávkou původního nádoru (1 x 105 myší T buněčný lymfom EL4). Myši nebyly ničím léčeny. Z výsledků uvedených na obrázku 7 je zřejmé, že u myší léčených polymemími konjugáty se během léčby vyvinula protinádorová rezistence, a to u 30 40% myší vyléčených K-l HYD s hydrazonově vázaným doxorubicinem (dávky 10 a 15 mg Dox eq./kg) a K-l AM s amidicky vázaným doxorubicinem (10 mg Dox eq./kg). Tento výsledek znamená, že nově připravená polymemí léčiva podle předloženého vynálezu mají dvě složky svého účinku: cytostatickou, která přímo zabíjí převážnou většinu nádorových buněk, a složku imunomodulační, která během léčby stimuluje imunitní systém a navozuje protinádorovou rezistenci. Výsledky získané po retransplantaci smrtelné dávky nádorových buněk dříve léčeným zvířatům jsou experimentálním důkazem toho, že terapie polymemími konjugáty podle vynálezu vede nejen k eliminaci nádoru, ale chrání vyléčená zvířata před sekundámí/metastatickým vývojem nemoci, případně její recidivě.
Literatura.
Bae, Y. S.; Fukushima, S.; Harada, A,; Kataoka, K. pH responsive drug-loaded polymeric micelles: Intracellular drug release correlated with in vitro cytotoxicity on human smáli cell lung cancer SBC-3. 2003. Salt Lake City, Utah, US.A. Winter Symposium and llth International Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Systems. 2003.
Bai S., Ahsan F., Synthesis and Evaluation of Pegylated Dendrimeric Nanocarrier for Pulmonary Delivery of Low Molecular Weight Heparin, PHARMACEUTICAL RESEARCH 26, 539-548 (2009)
Bronich, T. K.; Nehls, A.; Eisenberg, A.; Kabanov, V. A.; Kabanov, A. V. Colloids Surf. B 1999, 16, 243—251.
Chán, W. C.; White, P. D., Eds., „Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach“, Oxford University Press, Oxford 2000.
Duncan, R., Lloyd, J. B., J. Kopeček, P. Rejmanová, J. Strohalm, K. Ulbrich, B. Říhová, V. Chytrý: Synthetic Polymeric Drugs (1985). Czech. PV 0095/85, Australia 589587, Canada 130053, Denmark 164485, Europe 0187547, US 5,037,883, Japan 000137/86
Etrych T.; Chytil P.; Ulbrich K., Říhová B, Polymemí léčivo a způsob jeho výroby (Grafted Macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer acitivity and method of their preparatíon), patent CZ 209 945 B6
Etrych T., Chytil P., Mrkvan T., Sírová M., Říhová B., Ulbrich K., Conjugates of doxorubicin with graft HPMA copolymers for passive tumor targeting, J. Controlled Release 132, 184-192 (2008)
-31 CZ 302830 B6
Chytil, P., Etrych T., Hrubý M., Ulbrich K., Říhová B., Micelámí nosiče doxorubicinu s proti nádorovou aktivitou, CZ PV 2006-207
Gajbhiye V., Kumar P., Tekade R., Jain N., PEGylated PPI dendritic architectures for sustained delivery of H-2 receptor antagonist, EUROPEAN JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY 44,1155-1166 (2009)
Kataoka, K.; Harada, A.; Nagasaki, Y. Adv. Drug Delivery Rev. 2001, 47, 113-131.
io Kopeček, J.; Kopečková, P., Minko, T„ Lu, Z. R., Peterson, C. M. (2001) „Water soluble polymers in tumor targeted delivery“. J. Controlled Release 74, 165-173.
F. Kratz, U, Beyer, Μ. T. Schutte, Dmg-polymer conjugates containing acid-cleavable bonds, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 16 (1999) 245-288.
i 5
Lele, B„ Leroux, J.: Amphiphilic diblock, triblock and star-block copolymers and their pharmaceutical compositions, patent US 7,018,655
Maeda, H., J. Wu, T. Sawa, Y. Matsumura, and K. Hoři. 2000. Tumor vascular permeabílity and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J. Control Release 65:271-284.
Li, Ch., Vega, J., Wallace, S., Tansey, W., Chamsangavej, Ch.: DENDRITIC PÓLY (AMINO ACID) CARRIERS AND METHODS OF USE, patent WO 03055935
T, Mrkvan, M, Šírová, T. Etrych, P. Chytil, J. Strohalm, D. Plocová, K. Ulbrich, B. Říhová, Chemotherapy based on HPMA copolymer conjugates with pH-controlled release of doxorubicin triggers anti-tumor imunity, J. Controlled Release 110 (2005) 119-129.
Y. Noguchi, J. Wu, R. Duncan, J, Strohalm, K. Ulbrich, T. Akaike, H. Maeda, Jpn. J. Cancer
Res. 89, 307-314 (1998)
P. Rejmanová, J. Labský, J. Kopeček, Aminolyses of Monomeric and Polymeric 4-nitrophenyl Esters of N-Methacroylamino Acids, Makromol. Chem. 178, 2159-2168 (1977)
F. Rypáček, J. Drobník, V. Chmelař, J. Kálal, The renal excretion and retention of macromolecules - the chemical structure effect, Pflug. Arch. Eur. J. Pgy. 392, 211-217 (1982)
B. Říhová, M. Jelínková, J. Strohalm, V. Šubr, D. Plocová, O, Hovorka, M. Novák, D. Plundrová, Y. Germano, K. Ulbrich, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and
Natural Macromolecules II. Anti-cancer Acitivty of antibody oř (Fab')2-targeted Conjugates and Combined Therapy with Immunomodulators. J. Controlled Rel. 64. 241-261 (2000)
L. W. Seymour, Y. Miyamoto, H. Maeda, M. Brereton, J. Strohalm, K. Ulbrich, R. Duncan, Eur op. J. Cancer 31 A, 766 - 770 (1995)
V. Šubr, K. Ulbrich, B. Říhová, Reactive polymers and copolymers based on N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide, a method of their preparation and their use for synthesis of polymer drugs, for modification of biologically active proteins and for gene transport systems, CZPV 2003-1950
V. Šubr, Č. Koňák, R. Laga, K. Ulbrich, Coating of DNA/poIy(L-lysine) complexes by covalent attachment of póly[N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide], Biomacromolecules 7, 122-130 (2006)
-32 CZ 302830 B6
K. Ulbrich, V. Šubr, J. Strohalm, D. Plocová, M. Jelínková, B. Říhová, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules I. Synthesis and Physico-chemical Characterisation. J. Controlled ReL 64, 63-79 (2000)
K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, Antibody-Targeted Polymer-Doxorubicín Conjugates with pH-Controlled Activation, J. Drug. Targeting 12(8) (2004) 477-489]. (A)
K. Ulbrich, V. Šubr, Polymeric Anticancer Drugs with pH-X3ontrolled Activation, Adv. Drug Delivery Rev. 56/7, 1025-1052 (2004) (B) io
D. Wang, P. Kopečková, T. Minko, V. Nanayakkara, J. Kopeček, Synthesis of Star-Like N-(2Hydroxypropyl)methacrylamide Copolymers - Potential Drug Carriers, Biomacromolecules 1, (2000) 313—319.

Claims (16)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Vysokomolekulámí polymemí nosič léčiv odvozený od dendrimerů, vyznačený tím, že sestává z centrální molekuly dendrimerů nulté až Šesté generace vybraného ze skupiny zahrnující molekuly poly(amidoaminového) a
  2. 2,2-bis(hydroxymethyl)propionového dendrimerů, na jejichž koncové amino nebo hydroxyskupiny jsou přes konce řetězce navázány amidickou nebo
    25 esterovou vazbou, prostřednictvím biodegradovatelných spojek, tvořených disulfidovou vazbou nebo oligopeptidovou sekvencí, semitelechelické kopolymerv V-(2-hydroxypropyl) methakrylamidu (HPMA) jako rouby, přičemž molámí hmotnost roubů je 10 000 až 50 000 g/mol a motámí hmotnost nosiče je v rozmezí 40 000 až 1 400 000 g/mol.
    30 2. Polymemí nosič podle nároku 1, vyznačený tím, že sestává z centrální molekuly dendrimerů na bázi poly(amidoaminu), jehož koncové aminoskupiny jsou roubovány semitelechelickým HPMA kopolymerem navázaným k dendrimerů přes konec polymemího řetězce amidickou vazbou prostřednictvím biodegradovatelné spojky tvořené disulfidovou vazbou, znázorněný schématickou strukturou I
    -33 CZ 302830 B6
    I anebo biodegradovatelnou spojkou tvořenou oligopeptidovou sekvenci SP2, znázorněný strukturou 11
    - 34 CZ 302830 B6
  3. 3. Polymerní nosič podle nároku 1, vyznačený tím, že sestává z centrální molekuly dendrimerů na bázi 2,2-bis(hydroxymethyl)propionové kyseliny, jehož hydroxyskupiny jsou roubovány semitelechelickým HPMA kopolymerem navázaným k dendrimerů přes konec polymer5 ního řetězce prostřednictvím esterové vazby a biodegradovatelné spojky, tvořené disulfidovou vazbou, znázorněný schématickou strukturou III io anebo prostřednictvím oligopeptidové sekvence SP2, znázorněný strukturou IV
    -35 CZ 302830 B6
  4. 4. Polymemí nosič podle nároků 1 a 2, vyznačený tím, že jeho centrální molekula je tvořena dendrimerem z pofy(amidoaminu) nulté až šesté generace, obsahujícím 4 až 256 konco5 vých skupin vybraných ze skupiny zahrnující amino, pyrídyldisulfídové a karboxylové skupiny, se středem tvořeným s výhodou cysteaminem, ethylendi aminem, diaminobutanem, diaminohexanem nebo diaminododekanem.
  5. 5. Polymemí nosič podle nároků 1 a 3, vyznačený tím, že jeho centrální molekula je io tvořena dendrimerem na bázi 2,2-bis(hydroxymethyl)propionové kyseliny první až šesté generace obsahujícím 8 až 256 koncových skupin vybraných ze skupiny zahrnující hydroxy, pyridyldisulfidové a karboxylové skupiny.
  6. 6. Polymemí nosič podle nároků laž 5, vyznačený tím, že polymemí rouby v počtu 2 i? až 28 jsou tvořeny HPMA kopolymerem obsahujícím 0,5 až 8 mol % monomemích jednotek methakryloylovaného hydrazidu aminoacylu SPt, kde aminoacyl je s výhodou vybrán ze skupiny glycyl, β-alanyl, 6-aminohexanoyl (AH), 4~aminobenzoyl a nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů GlyGly, GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly a GlyPheLeuGly.
    20
  7. 7. Polymemí nosič podle nároků laž5, vyznačený tím, že polymemí rouby jsou k centrální molekule dendritíckého poly(amidoaminu) nebo dendrimeru na bázi 2.2 -bis(hydroxy-36CZ 302830 B6 methyljpropionové kyseliny připojeny biodegradovatelnou vazbou obsahující disulfidovou skupinu nebo biodegradovatelný oligopeptid SP2.
  8. 8. Polymerní nosič podle nároku 7, vyznačený tím, že oligopeptid SP2 je vybrán s výhodou ze skupiny oligopeptidů zahrnující GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly a GlyLeuPheGly.
  9. 9. Polymerní konjugát vyznačený tím, že sestává z polymerního nosiče podle nároků 1 až 8 a kovalentně vázaného léčiva s výhodou kancerostatika.
  10. 10. Polymerní konjugát podle nároku 9, vyznačený tím, že sestává z polymerního nosiče podle nároků 1 až 8, a kancerostatika, s výhodou doxorubicinu.
  11. 11. Polymerní konjugát podle nároku 10, vyznačený tím, že doxorubicin je k nosiči připojen hydrolyticky štčpitelnou hydrazonovou vazbou.
  12. 12. Polymerní konjugát, vyznačený tím, že sestává z polymerního nosiče podle některého z nároků 1, 2, 3, 4, 5, 7 a 8 a amidicky vázaného kancerostatika, s výhodou doxorubicinu, ve kterém jsou polymerní rouby v počtu 2 až 28 tvořeny HPMA kopolymerem obsahujícím 0,5 až 8 mol % monomemích jednotek methakryloylováného oligopeptidů SP2 s doxorubicinem navázaným ke konci oligopeptidů přes amidickou vazbu, kde oligopeptid SP2 je s výhodou vybrán ze skupiny oligopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly a GlyPheLeuGly.
  13. 13. Polymerní konjugát podle nároků 9 až 12, vyznačený tím, že molekulová hmotnost takového dendritického systému je s výhodou v rozmezí 40 000 až 1 400 000 g/mol, obsah doxorubicinu (Box) jak v polymemích řetězcích, tak i ve výsledném dendritickém konjugátu je v rozmezí 1 a 25 % hmotn., což odpovídá 0,3 až 8 % mol na polymer.
  14. 14. Farmaceutická kompozice obsahující jako účinnou látku polymerní konjugát podle kteréhokoliv z nároků 9 až 13 pro použití při léčení nádorových onemocnění.
  15. 15. Farmaceutická kompozice podle nároku 14, pro použití při léčení pevných nádorů.
  16. 16. Farmaceutická kompozice podle nároku 14, pro použití při léčení některých druhů lymfomu a leukémií.
CZ20090844A 2009-12-15 2009-12-15 Vysokomolekulární polymerní nosice léciv odvozené od dendrimeru a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru CZ302830B6 (cs)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20090844A CZ302830B6 (cs) 2009-12-15 2009-12-15 Vysokomolekulární polymerní nosice léciv odvozené od dendrimeru a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru
US13/516,607 US9173949B2 (en) 2009-12-15 2010-12-14 Dendritic high-molecular-weight polymer drug carriers and their conjugates with drugs especially for treatment of solid tumours
PCT/CZ2010/000131 WO2011072627A2 (en) 2009-12-15 2010-12-14 Dendritic high-molecular-weight polymer drug carriers and their conjugates with drugs especially for treatment of solid tumours
ES10812977.6T ES2458841T3 (es) 2009-12-15 2010-12-14 Portadores de fármacos de polímero de alto peso molecular dendrítico y sus conjugados con fármacos especialmente para el tratamiento de tumores sólidos
JP2012543465A JP5781084B2 (ja) 2009-12-15 2010-12-14 樹状高分子量ポリマー薬物担体および特に固形腫瘍の処置のための薬物とのそれらの結合体
CA2783393A CA2783393C (en) 2009-12-15 2010-12-14 Dendritic high-molecular-weight polymer drug carriers and their conjugates with drugs for treatment of solid tumours
EP10812977.6A EP2512521B1 (en) 2009-12-15 2010-12-14 Dendritic high-molecular-weight polymer drug carriers and their conjugates with drugs especially for treatment of solid tumours

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20090844A CZ302830B6 (cs) 2009-12-15 2009-12-15 Vysokomolekulární polymerní nosice léciv odvozené od dendrimeru a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2009844A3 CZ2009844A3 (cs) 2011-06-22
CZ302830B6 true CZ302830B6 (cs) 2011-11-30

Family

ID=43877084

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20090844A CZ302830B6 (cs) 2009-12-15 2009-12-15 Vysokomolekulární polymerní nosice léciv odvozené od dendrimeru a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9173949B2 (cs)
EP (1) EP2512521B1 (cs)
JP (1) JP5781084B2 (cs)
CA (1) CA2783393C (cs)
CZ (1) CZ302830B6 (cs)
ES (1) ES2458841T3 (cs)
WO (1) WO2011072627A2 (cs)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ302830B6 (cs) * 2009-12-15 2011-11-30 Ústav makromolekulární chemie AV CR, v.v.i. Vysokomolekulární polymerní nosice léciv odvozené od dendrimeru a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru
CA3023227C (en) 2016-05-06 2021-11-02 Biodynamic Research Foundation Pharmaceutical composition containing macromolecular drug
JP7390000B2 (ja) * 2016-10-14 2023-12-01 ユニヴァーシティー オブ ユタ リサーチ ファウンデーション 抗体－ポリマー－薬物コンジュゲート
IL297129A (en) * 2020-04-06 2022-12-01 Tiba Biotech Llc leading to efficient application of nucleic acids
CN111763315B (zh) * 2020-05-29 2023-07-25 长治医学院 一种聚酯化合物与其为载体的纳米药物及该药物的应用
US11859201B2 (en) 2021-08-16 2024-01-02 Tiba Biotech Llc Nanoparticle compositions containing sugar functionalized nucleic acid carriers

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002026867A2 (en) * 2000-09-29 2002-04-04 The Regents Of The University Of California Dendrimeric support or carrier macromolecule
WO2003055935A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-10 Board Of Regents - The University Of Texas System Dendritic poly (amino acid) carriers and methods of use
CZ298945B6 (cs) * 2006-09-18 2008-03-19 Zentiva, A. S. Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA130053A (en) 1910-10-24 1910-12-27 Pearl A. Parker Tobacco cutting machine
DE3414290A1 (de) 1984-04-14 1985-10-24 Leybold-Heraeus GmbH, 5000 Köln Kristallhalter
JPS61137A (ja) 1984-05-31 1986-01-06 株式会社クラレ 延伸ブロ−多層ボトルおよびその製法
GB8500209D0 (en) 1985-01-04 1985-02-13 Ceskoslovenska Akademie Ved Synthetic polymeric drugs
CZ293787B6 (cs) * 2001-12-20 2004-07-14 Zentiva, A.S. pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii
US7018655B2 (en) 2002-03-18 2006-03-28 Labopharm, Inc. Amphiphilic diblock, triblock and star-block copolymers and their pharmaceutical compositions
WO2004019993A1 (en) * 2002-08-30 2004-03-11 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Self-immolative dendrimers releasing many active moieties upon a single activating event
US20090041825A1 (en) * 2006-02-10 2009-02-12 Kotov Nicholas A Cell culture well-plates having inverted colloidal crystal scaffolds
WO2009140683A1 (en) * 2008-05-16 2009-11-19 Research Foundation Of The City University Of New York Living copolymer protein/peptide hybrids for biomedical applications
ES2333087B2 (es) * 2008-07-31 2010-09-23 Universidade De Santiago De Compostela Micelas polimericas dendriticas sensibles al ph.
CZ302830B6 (cs) * 2009-12-15 2011-11-30 Ústav makromolekulární chemie AV CR, v.v.i. Vysokomolekulární polymerní nosice léciv odvozené od dendrimeru a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002026867A2 (en) * 2000-09-29 2002-04-04 The Regents Of The University Of California Dendrimeric support or carrier macromolecule
WO2003055935A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-10 Board Of Regents - The University Of Texas System Dendritic poly (amino acid) carriers and methods of use
CZ298945B6 (cs) * 2006-09-18 2008-03-19 Zentiva, A. S. Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jayant Khandare, Tamara Minko : Polymer-drug conjugates: Progress in polymeric prodrugs, Progress in Polymer Science, 31 (2006), str. 359 a× 397 *
Ping-Shan Lai a kol. : Doxorubicin delivery by polyamidoamine dendrimer conjugation and photochemical internalization for cancer therapy, Journal of Controlled Release, 122 (2007), str. 39 a× 46 *
Roseita Esfand, Donald A. Tomalia : Poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers: from biomimicry to drug delivery and biomedical applications, DDT Vol. 6, No. 8 April 2001 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011072627A3 (en) 2011-08-11
ES2458841T3 (es) 2014-05-07
CA2783393C (en) 2015-12-22
US9173949B2 (en) 2015-11-03
CA2783393A1 (en) 2011-06-23
CZ2009844A3 (cs) 2011-06-22
JP5781084B2 (ja) 2015-09-16
EP2512521B1 (en) 2014-02-26
JP2013513626A (ja) 2013-04-22
US20120296048A1 (en) 2012-11-22
WO2011072627A2 (en) 2011-06-23
EP2512521A2 (en) 2012-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ulbrich et al. Structural and chemical aspects of HPMA copolymers as drug carriers
US8603990B2 (en) Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation
Etrych et al. Biodegradable star HPMA polymer conjugates of doxorubicin for passive tumor targeting
JP5944836B2 (ja) 高分子薬物送達結合体ならびにその製造および使用方法
Chytil et al. Properties of HPMA copolymer–doxorubicin conjugates with pH-controlled activation: effect of polymer chain modification
El Kazzouli et al. Dendrimer therapeutics: covalent and ionic attachments
CZ302830B6 (cs) Vysokomolekulární polymerní nosice léciv odvozené od dendrimeru a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru
Riber et al. Recent advances in macromolecular prodrugs
Kostka et al. High-molecular-weight HPMA-based polymer drug carriers for delivery to tumor.
Cheng et al. Dendrimer-based prodrugs: design, synthesis, screening and biological evaluation
Singh et al. Polymer drug conjugates: recent advancements in various diseases
EP1463529B1 (en) Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy
CN109762099B (zh) 一种聚合物-抗肿瘤药物偶联物及其制备方法和用途
CZ303072B6 (cs) Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika
Carmali et al. Polyacetals
Chytil et al. Structural design and synthesis of polymer prodrugs
Etrych et al. High-molecular-weight polymers containing biodegradable disulfide bonds: synthesis and in vitro verification of intracellular degradation
Cuchelkar et al. Polymer–drug conjugates
KR101200176B1 (ko) 풀루란 유도체?폴리에틸렌이민 접합체를 포함하는 생리활성 물질 전달체 및 이의 제조방법
Fante et al. Polymer–Drug Conjugates
CZ2003605A3 (en) pH sensitive polymeric conjugates of anthracycline cancerostatic for targeted therapy

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20221215