CZ309828B6 - Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití - Google Patents
Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ309828B6 CZ309828B6 CZ2019-627A CZ2019627A CZ309828B6 CZ 309828 B6 CZ309828 B6 CZ 309828B6 CZ 2019627 A CZ2019627 A CZ 2019627A CZ 309828 B6 CZ309828 B6 CZ 309828B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- fluorescent
- group
- polymer
- groups
- mol
- Prior art date
Links
- 229920001109 fluorescent polymer Polymers 0.000 title claims abstract description 141
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title claims abstract description 79
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 title claims abstract description 38
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 23
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 title 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 50
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 43
- 229920005684 linear copolymer Polymers 0.000 claims abstract description 38
- -1 polymethacrylamide Polymers 0.000 claims abstract description 28
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims abstract description 17
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 60
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 60
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 36
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- WGJCBBASTRWVJL-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine-2-thione Chemical group SC1=NCCS1 WGJCBBASTRWVJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 21
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 20
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 19
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 19
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000012650 click reaction Methods 0.000 claims description 16
- XCEBOJWFQSQZKR-UHFFFAOYSA-N dbco-nhs Chemical compound C1C2=CC=CC=C2C#CC2=CC=CC=C2N1C(=O)CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O XCEBOJWFQSQZKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 claims description 15
- ZUHQCDZJPTXVCU-UHFFFAOYSA-N C1#CCCC2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 Chemical group C1#CCCC2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 ZUHQCDZJPTXVCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 13
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 11
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 10
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 10
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 10
- 125000001494 2-propynyl group Chemical group [H]C#CC([H])([H])* 0.000 claims description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 9
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- NHFQNAGPXIVKND-UHFFFAOYSA-N dbco-maleimide Chemical compound C1C2=CC=CC=C2C#CC2=CC=CC=C2N1C(=O)CCNC(=O)CCN1C(=O)C=CC1=O NHFQNAGPXIVKND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003999 initiator Substances 0.000 claims description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 claims description 7
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- OKPYIWASQZGASP-UHFFFAOYSA-N n-(2-hydroxypropyl)-2-methylprop-2-enamide Chemical compound CC(O)CNC(=O)C(C)=C OKPYIWASQZGASP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000012712 reversible addition−fragmentation chain-transfer polymerization Methods 0.000 claims description 7
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 6
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 5
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 4
- GNUDXXARAXMJLI-UHFFFAOYSA-N S(=O)(=O)(O)C1=C(C2=C(C#CCCC3=C2C=CC=C3)C=C1)C1=CC(=O)NC1=O Chemical compound S(=O)(=O)(O)C1=C(C2=C(C#CCCC3=C2C=CC=C3)C=C1)C1=CC(=O)NC1=O GNUDXXARAXMJLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MHYYGVVQFGATQF-UHFFFAOYSA-N S(=O)(=O)(O)C1=CC=CC=2C#CCCC3=C(C=21)C=CC=C3 Chemical group S(=O)(=O)(O)C1=CC=CC=2C#CCCC3=C(C=21)C=CC=C3 MHYYGVVQFGATQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 4
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 4
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 4
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 3
- UIYBTMZBAPYNRO-UHFFFAOYSA-N N-(3-azidopropyl)-4-ethylsulfanylcarbothioylsulfanyl-4-methylpentanamide Chemical compound N(=[N+]=[N-])CCCNC(CCC(C)(C)SC(=S)SCC)=O UIYBTMZBAPYNRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 3
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Chemical group SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N isothiocyanate group Chemical group [N-]=C=S ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- QYZFTMMPKCOTAN-UHFFFAOYSA-N n-[2-(2-hydroxyethylamino)ethyl]-2-[[1-[2-(2-hydroxyethylamino)ethylamino]-2-methyl-1-oxopropan-2-yl]diazenyl]-2-methylpropanamide Chemical compound OCCNCCNC(=O)C(C)(C)N=NC(C)(C)C(=O)NCCNCCO QYZFTMMPKCOTAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HCEAUICBTPNFQS-UHFFFAOYSA-N 3-[4-[6-[[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-6-oxohexyl]carbamoylamino]-1,3-benzoxazol-2-yl]pyridin-1-ium-1-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CCC[N+]1=CC=C(C=C1)C1=NC2=CC=C(NC(=O)NCCCCCC(=O)ON3C(=O)CCC3=O)C=C2O1 HCEAUICBTPNFQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- JJEZFFHLNMCAQL-UHFFFAOYSA-N 3-[[6-(2-azaniumylethylamino)-6-oxohexyl]carbamoyl]-8-chloro-7-hydroxy-2-oxochromene-6-sulfonate Chemical compound [NH3+]CCNC(CCCCCNC(=O)C=1C(OC2=C(C(=C(C=C2C=1)S(=O)(=O)[O-])O)Cl)=O)=O JJEZFFHLNMCAQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N Bipyridyl Chemical compound N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1 ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- COVLZGPTKIWLOC-UHFFFAOYSA-N NCCNC(CCCCCN(C1=CC=C2C=C(C(OC2=C1)=O)C1=CC=[N+](C=C1)CCCS(=O)(=O)[O-])CC)=O Chemical compound NCCNC(CCCCCN(C1=CC=C2C=C(C(OC2=C1)=O)C1=CC=[N+](C=C1)CCCS(=O)(=O)[O-])CC)=O COVLZGPTKIWLOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical group [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000000816 ethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 claims description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000012632 fluorescent imaging Methods 0.000 claims description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 claims description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- LECPYKYNIWHZFT-UHFFFAOYSA-K ruthenium(3+) triperchlorate Chemical compound [Ru+3].[O-]Cl(=O)(=O)=O.[O-]Cl(=O)(=O)=O.[O-]Cl(=O)(=O)=O LECPYKYNIWHZFT-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003258 trimethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])C([H])([H])C([H])([H])[*:1] 0.000 claims description 2
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 claims 3
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 claims 3
- 125000002820 allylidene group Chemical group [H]C(=[*])C([H])=C([H])[H] 0.000 claims 2
- DVECLMOWYVDJRM-UHFFFAOYSA-N pyridine-3-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=CN=C1 DVECLMOWYVDJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- YRGDVPRMFVUVKE-UHFFFAOYSA-N (2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-4-ylidene)methanone Chemical group O=C=C1CSC(=S)N1 YRGDVPRMFVUVKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims 1
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 claims 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 claims 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical group OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-M propane-1-sulfonate Chemical compound CCCS([O-])(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 30
- 229920002187 poly[N-2-(hydroxypropyl) methacrylamide] polymer Polymers 0.000 abstract description 2
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 abstract description 2
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 abstract description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 35
- 239000000047 product Substances 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 16
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 2-(2-cyanopropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanenitrile Chemical compound N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 11
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 9
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 9
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 9
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 8
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 7
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 7
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 6
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- OZAIFHULBGXAKX-VAWYXSNFSA-N AIBN Substances N#CC(C)(C)\N=N\C(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-VAWYXSNFSA-N 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000007874 V-70 Substances 0.000 description 5
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 5
- 230000001365 aminolytic effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 5
- 238000013379 physicochemical characterization Methods 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 4
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N sulfanyl Chemical compound [SH] PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- HIZCIEIDIFGZSS-UHFFFAOYSA-L trithiocarbonate Chemical group [S-]C([S-])=S HIZCIEIDIFGZSS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229940124292 CD20 monoclonal antibody Drugs 0.000 description 3
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 229940113088 dimethylacetamide Drugs 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- HXKKHQJGJAFBHI-UHFFFAOYSA-N 1-aminopropan-2-ol Chemical compound CC(O)CN HXKKHQJGJAFBHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NMZSJIQGMAGSSO-UHFFFAOYSA-N 3-[[1-amino-2-[[1-amino-1-(2-carboxyethylimino)-2-methylpropan-2-yl]diazenyl]-2-methylpropylidene]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)CCNC(=N)C(C)(C)N=NC(C)(C)C(=N)NCCC(O)=O NMZSJIQGMAGSSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 2
- OHOQEZWSNFNUSY-UHFFFAOYSA-N Cy3-bifunctional dye zwitterion Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCN1C2=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(C)(C)C1=CC=CC(C(C1=CC(=CC=C11)S([O-])(=O)=O)(C)C)=[N+]1CCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O OHOQEZWSNFNUSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 2
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003505 polymerization initiator Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 239000012989 trithiocarbonate Substances 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- GWOGSJALVLHACY-UHFFFAOYSA-N 2-pyridin-2-ylpyridine;ruthenium Chemical class [Ru].N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1 GWOGSJALVLHACY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000002569 MAP Kinase Kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010068304 MAP Kinase Kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- WSZKYABCXJOHOU-RMKNXTFCSA-N NCCNC(CCCCCOC(C=C1)=CC2=C1N=C(/C=C/C1=CCN(CCCS(O)(=O)=O)C=C1)O2)=O Chemical compound NCCNC(CCCCCOC(C=C1)=CC2=C1N=C(/C=C/C1=CCN(CCCS(O)(=O)=O)C=C1)O2)=O WSZKYABCXJOHOU-RMKNXTFCSA-N 0.000 description 1
- WBJINRXIEQKMQT-UHFFFAOYSA-N NCCNC(CCCCC[N+]1=CC(=C(C=C1)\C=C\C=1C(OC2=CC(=CC=C2C=1)N(CC)CC)=O)S(=O)(=O)[O-])=O Chemical compound NCCNC(CCCCC[N+]1=CC(=C(C=C1)\C=C\C=1C(OC2=CC(=CC=C2C=1)N(CC)CC)=O)S(=O)(=O)[O-])=O WBJINRXIEQKMQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYIVRNBKZMWRND-UHFFFAOYSA-N NCCNC(CCCCC[N+]1=CC(=CC=C1\C=C\C=1C(OC2=CC(=CC=C2C=1)N(CC)CC)=O)S(=O)(=O)[O-])=O Chemical compound NCCNC(CCCCC[N+]1=CC(=CC=C1\C=C\C=1C(OC2=CC(=CC=C2C=1)N(CC)CC)=O)S(=O)(=O)[O-])=O UYIVRNBKZMWRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 208000031951 Primary immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 206010054979 Secondary immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000003926 acrylamides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000005466 alkylenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000266 alpha-aminoacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012986 chain transfer agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- OCCYFTDHSHTFER-UHFFFAOYSA-N dbco-amine Chemical compound NCCC(=O)N1CC2=CC=CC=C2C#CC2=CC=CC=C12 OCCYFTDHSHTFER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001480 hydrophilic copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008938 immune dysregulation Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000003331 infrared imaging Methods 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 150000002734 metacrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010526 radical polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
- C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
- C08F220/52—Amides or imides
- C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
- C08F220/56—Acrylamide; Methacrylamide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L33/00—Compositions of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical, or of salts, anhydrides, esters, amides, imides or nitriles thereof; Compositions of derivatives of such polymers
- C08L33/24—Homopolymers or copolymers of amides or imides
- C08L33/26—Homopolymers or copolymers of acrylamide or methacrylamide
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L2203/00—Applications
- C08L2203/02—Applications for biomedical use
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Fluorescenční polymer, obsahující semitelechelický statistický lineární kopolymer, na který je navázána alespoň jedna fluorescenční značka v množství od 0,4 do 12 % mol., přičemž semitelechelický statistický lineární kopolymer obsahuje polyakrylamid, polymethakrylamid, polyakrylát, polymetakrylát nebo poly(N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid), ve kterém je od 0,4 do 12 % mol. monomerních jednotek nahrazeno monomerní jednotkou obecného vzorce I, kde R je vybraný ze skupiny sestávající z lineárního nebo rozvětveného uhlíkového alkylenylového řetězce s počtem uhlíků od 1 do 6; Y je vybraný ze skupiny sestávající z vazby, -C(=O)- NH-, -NH-C(=O)-, -NH-C(=S)-NH; molekulová hmotnost Mn semitelechelického statistického lineárního kopolymeru je v rozmezí od 10 000 do 100 000 g/mol; a fluorescenční značka má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1500 g/mol, excitační vlnovou délku v rozmezí od 300 do 850 nm a emisní vlnovou délku v rozmezí od 350 do 1200 nm; fluorescenční sonda a konjugační sada s obsahem uvedeného polymeru, způsob přípravy fluorescenční sondy a použití sondy a polymeru.
Description
Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití
Oblast techniky
Vynález se týká fluorescenčního polymeru složeného z polymerního nosiče s postranními řetězci s fluorofory, umožňujícího vysoce efektivní značení protilátek. Dále se vynález týká fluorescenční sondy, konstruktu složeného z polymerního nosiče s fluorofory (fluorescenčního polymeru) a proteinové struktury, například protilátky. Její použití je zaměřeno pro průtokovou cytometrii, mikroskopickou analýzu a další zobrazovací techniky využívající protilátky značené fluorofory pro diagnostiku, kontrolu kvality i vědu a výzkum.
Dosavadní stav techniky
Využití fluorescenčních sond v imunologii, hematologii a mikrobiologii zaznamenalo v posledních dvou dekádách enormní vzestup a jedná se o naprosto základní metody využívané dennodenně na pracovištích po celém světě od základního výzkumu až po nemocniční laboratoře a analytická oddělení. Komerčně dostupné, fluorescenčně značené protilátky jsou využívány v klinické diagnostice pro analýzu stavu imunitního systému pacientů, v hematoonkologii pro diagnózu maligního onemocnění, v patologii pro detekci změn a poruch a změn v tkáních. Dále jsou používány pro stovky aplikací ve vědě a výzkumu od fyziologických a imunologických pro evoluční, anatomické a vývojové analýzy.
V současnosti je na trhu dostupných stovky různých protilátek proti různým biologickým cílům, buď značených fluorofory, nebo ve formě tzv. purifikátů - tedy bez kovalentně navázané fluorescenční značky, které musí být následně detekovány pomocí tzv. značených sekundárních protilátek.
Rozvoj bioinformatiky a technologický pokrok v konstrukci detekčních systémů (ať průtokových cytometrů, zobrazovacích systémů, čteček čipů a membrán) vedly k masivnímu rozvoji multiplexové analýzy umožňující podstatně násobit množství znaků detekovaných simultánně v jednotlivých experimentech. Teno rozvoj se odrazil i v potřebě nových fluoroforů pro doplnění spektra používaných fluorescenčních značek. V současnosti je na trhu dostupných stovky různých fluoroforů odlišujících se absorpční a emisní charakteristikou a intenzitou fluorescence odvozených z různých modifikací různých výchozích chemických struktur.
Při multiplexové analýze je třeba použít takový panel značených protilátek, kdy každá z nich nese vlastní fluorofor odlišitelný svým spektrálním profilem (absorpčním a emisním maximem) od všech ostatních protilátek v panelu. V případě rozsáhlejších analýz (10 protilátek a více) narážejí uživatelé při sestavování diagnostického/analytického panelu protilátek na problém nedostupnosti konkrétních značených komerčních protilátek proti minoritním, málo experimentálně využívaným nebo prostě jen nově definovaným znakům, které požadují analyzovat.
Na trhu je k dispozici řada produktů umožňujících uživatelům konjugovat konkrétní fluorofor na vlastní neznačenou protilátku. Problémem těchto souprav je ale malá možnost volby fluoroforů většina z nich se spektrálně překrývá s ostatními obvykle dostupnými fluorofory a zejména pak nízká úroveň značení. Výsledkem tak jsou sice fluorescenčně značené protilátky, ale jejich použití je limitované a znaky s nízkou úrovní exprese s těmito produkty nelze detekovat vůbec. Spektrálně „zajímavé“ fluorofory emitující v oblastech kde je možné je snadno rozlišit, pak mají zpravidla nízký kvantový fluorescenční výtěžek a přímo značené konjugáty jsou špatně rozlišitelné. Polymerní fluorescenční sondy amplifikují počet fluorescenčních molekul a tím podstatně zesílí detekovatelný signál. Lze tak využít netradičních, spektrálně i funkčně unikátních
- 1 CZ 309828 B6 fluoroforů a kombinací fluoroforů.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká fluorescenčního polymeru, fluorescenční sondy a konjugační sady pro rychlé značení protilátek, proteinů a jiných struktur s vhodně modifikovaným povrchem. Fluorescenční polymer a konjugační sada podle předkládaného vynálezu umožňuje značení vlastních vhodně modifikovaných struktur tak, že zavede na jejich povrch semitelechelické kopolymerní řetězce, které mají na sobě navázány molekuly fluorescenčních značek (fluoroforů). Díky tomuto přístupu lze zavést na vhodnou proteinovou strukturu až několikanásobně vyšší množství fluoroforu, než obvyklými komerčně dostupnými soupravami. Výsledná fluorescenční sonda umožňuje amplifikaci signálu, který dosahuje i přesahuje intenzity značení pomocí komerčně dostupných biomolekul a nanočástic. Pomocí konjugační sady podle předkládaného vynálezu lze vhodnou proteinovou strukturu označit v řádu jednotek minut a s minimálním počtem kroků fluorescenčně značeným hydrofilním kopolymerem, například na bázi N-(2hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA), a připravit tak polymerní fluorescenční sondu. Podél řetězce tohoto kopolymeru jsou zavedeny funkční skupiny, na které lze navázat vhodné deriváty fluoroforů, na jeho jednom konci obsahují reaktivní skupinu pro jednobodové roubování na proteinovou strukturu. Další oblastí použití takových systémů podle předkládaného vynálezu je možnost vytvoření vlastní kombinace několika fluoroforů navázaných v několika různých požadovaných poměrech na sledovanou strukturu tak, že vznikne přesně definovaný fluorescenční vzor (pattern), který bude unikátní pro každou konkrétní strukturu. Rozlišení právě poměrů intenzit nechá vzniknout unikátnímu fluorescenčnímu podpisu, kdy ve dvou kanálech je pak možné odlišit až osm různých spektrálních kombinací, a tedy odlišit až osm typů buněčných podtypů (subsetů). Tyto spektrální technologie „čárových kódů“ (barcoding) je možné použít pro odlišení různých vzorků, které budou nejprve fluorescenčně „kódovány“ a následně smíchány a označeny najednou, což eliminuje rozdíly v technice značení a umožní přímé porovnání expresí sledovaných znaků. „Barcoding znak“ obsadí jen dvě spektrální pásma, ale umožní rozlišit až osm různých vzorků. Zbývající část detekčního spektra může být využita pro jiné evaluované (diagnostické) markery. Navíc lze kombinovat dva či více fluoroforů reagujících různě na fyzikálně-chemické či biologické parametry mikroprostředí značených buněk, např. na pH, teplotu, koncentraci iontů, enzymovou aktivitu apod. Jeden z využitých znaků je v prostředí stabilní a umožňuje tak normalizovat signál z různých buněk a ostatní signály mohou být proměnné. Poměrem normalizovaného a senzitivního signálu pak je možné stanovit přímo parametry prostředí. Celý systém podle předkládaného vynálezu tak umožňuje zvýšení detekovatelnosti sledovaných znaků v jedné buňce a současně výrazné zrychlení přípravy fluorescenčně značených struktur s vhodně modifikovaným povrchem.
Předmětem předkládaného vynálezu je fluorescenční polymer pro rychlé značení protilátek, proteinů a dalších struktur s vhodně modifikovaným povrchem, obsahující semitelechelický statistický lineární kopolymer, na který je navázána alespoň jedna fluorescenční značka (fluorofor) v množství od 0,4 do 12 % mol., s výhodou od 0,5 do 6 % mol., vztaženo na počet monomerních jednotek, přičemž semitelechelický statistický lineární polymer je na bázi kopolymerů polyakrylamidu, kopolymerů polymethakrylamidu, kopolymerů polyakrylátu nebo kopolymerů polymetakrylátu, s výhodou obsahuje kopolymery poly(N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid)u, přičemž v semitelechelickém statistickém lineárním kopolymeru je od 0,4 do 12 % mol. monomerních jednotek statisticky nahrazeno monomerními jednotkami obecného vzorce I
- 2 CZ 309828 B6
(I), kde
R je vybraný ze skupiny sestávající z lineárního nebo rozvětveného uhlíkového alkylenylového řetězce s počtem uhlíků od 1 do 6 ((C1 až C6)alkylenyl); přičemž R může být dále substituován jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny; s výhodou jsou těmito řetězci methyl, isopropyl, isobutyl, -CH(CH3)(CH2CH3), -CH2OH, -CH(OH)(CH3), -CH2-(C6H4)OH, -(CH2)2-S-CH3, -CH2SH, -(CH2)4-NH2, -CH2COOH, -CH2C(O)NH2, -(CH2)2COOH, -(CH2)2C(O)NH2, -(CH2)3NH-C(=NH)(NH2), benzyl;
Y je vybraný ze skupiny sestávající z vazby, -C(=O)-NH-, -NH-C(=O)-, -NH-C(=S)-NH-;
přičemž molekulová hmotnost Mn semitelechelického lineárního kopolymeru je v rozmezí od 10 000 do 100 000 g/mol, s výhodou v rozmezí od 15 000 do 40 000 g/mol (což odpovídá 100 až 280 monomerním jednotkám), výhodněji je molekulová hmotnost v rozmezí od 20 000 do 30 000 g/mol (což odpovídá 134 až 210 monomerním jednotkám);
a přičemž fluorescenční značka (fluorofor nebo jeho aminoderivát, NCS derivát nebo Nhydroxysukcinimidylový derivát) má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1500 g/mol, excitační vlnovou délku v rozmezí od 300 do 850 nm a emisní vlnovou délku v rozmezí od 350 do 1200 nm a je kovalentně vázaná na monomerní jednotku obecného vzorce I semitelechelického lineárního kopolymeru pomocí reakce své primární aminoskupiny, thiokyanátu nebo N-hydroxysukcinimidylového esteru, přičemž skupiny vzniklé po navázání fluoroforu jsou následně součástí skupiny Y;
a přičemž fluorescenční polymer obsahuje na jednom konci polymerního řetězce funkční skupinu pro navázání na proteinovou strukturu (například jednobodovým roubováním), kterážto funkční skupina je vybraná ze skupiny zahrnující estery, s výhodou N-hydroxysukcinimidylový ester nebo C1-C4 alkylestery, amidy, s výhodou thiozolidin-2-thionový amid, maleinimid, azid, propargyl, s výhodou je touto funkční skupinou azid nebo maleinimid.
Přirozenými aminokyselinami se rozumí histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin, threonin, tryptofan, valin, arginin, cystein, glutamin, glycin, prolin, tyrosin, alanin, asparagová kyselina, asparagin, glutamová kyselina, serin, selenocystein. Postranními řetězci jsou řetězce navázané na alfa-uhlíku aminokyseliny.
Fluorescenční polymer může dále obsahovat do 11,6 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce II, vztaženo na počet monomerních jednotek,
- 3 CZ 309828 B6 ch3
--f—ch2-\---o
HN /R Z (II), kde R je definováno výše a Z je vybrané ze skupiny zahrnující -C(=O)-NH-(CH2)a-CH2(OH); -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)-CH3; -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)-(CH2)c-CH3; kde a je celé číslo od 0 do 4, Z? je celé číslo od 0 do 3 a c je od 1 do 4; a -NH-C(=O)-CH3, přičemž celkem je monomerních jednotek obecného vzorce I a II ve fluorescenčním polymeru nejvýše 12 % mol., vztaženo na počet monomerních jednotek.
Ve výhodném provedení je R vybraný ze skupiny zahrnující ethan-1,2-diyl (-CH2-CH2-); propan1,3-diyl (-CH2-CH2-CH2-); hexan-1,6-diyl (-CH2)6-)·
Semitelechelický lineární kopolymer je statistický kopolymer vzniklý radikálovou polymerizací. Koncové skupiny výsledného lineárního kopolymeru tudíž obsahují části molekul iniciátoru polymerizace (iniciátorem může být například 2,2'-azobis[,V-(2-karboxycthyl)-2methylpropionamidin] (V-70)) a přenosového činidla (přenosovým činidlem může být například V-(3-azidopropyl)-4-ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-4-methyl-pentanamid (CTA-N3)), popřípadě jejich deriváty vzniklé reakcí například s 2,2'-azobisisobutyronitrilem (AIBN). Koncové skupiny kopolymeru tudíž obsahují azidovou skupinu, která může být následně dále modifikována reakcí s dibenzocyklooktyn-maleinimidem (DBCO-MI) na další maleinimidovou reaktivní fůnkční skupinu, reakcí s dibenzocyklooktyn-karboxylem (DBCO-Cbx), který se následně modifikuje thiazolidin-2-thionem na thiazolidin-2-thionovou reaktivní fůnkční skupinu, reakcí s dibenzocyklooktyn-V-hydroxysukcinimidylesterem (DBCO-NHS) na Nhydroxysukcinimidylesterovou reaktivní fůnkční skupinu.
V jednom výhodném provedení je semitelechelickým lineárním kopolymerem poly(V-(2hydroxypropyljmethakrylamid), výsledná struktura fluorescenčního polymeru obsahuje v tomto provedení obecný vzorec III,
(III),
-4 CZ 309828 B6 kde R, Y a Z jsou definované výše, n je celé číslo v rozmezí od 100 do 280, zastoupení jednotek obecného vzorce I je v tomto statistickém lineárním kopolymeru od 0,4 do 12 % mol., vztaženo na počet monomerních jednotek, a zastoupení jednotek obecného vzorce II je v tomto statistickém lineárním kopolymeru od 0 do 11,6 % mol., vztaženo na počet monomerních jednotek, přičemž celkem je monomerních jednotek obecného vzorce I a II nejvýše 12 % mol., vztaženo na počet monomerních jednotek. Koncové skupiny výsledného lineárního kopolymeru obecného vzorce III obsahují části molekul iniciátoru polymerizace a přenosového činidla, a dále funkční skupinu pro navázání na proteinovou strukturu, s výhodou N-hydroxysukcinimidylový ester, thiozolidin-2-thionový amid, maleinimid, azid, nebo propargyl.
V jednom provedení semitelechelické kopolymery, které jsou posléze součástí fluorescenčního polymeru podle předkládaného vynálezu, obsahují koncové N3-skupiny zavedené při polymerizační reakci, které lze využít na zavedení maleinimidu pro konjugaci s proteinovou strukturou s vhodně modifikovaným povrchem.
Fluorescenční značka (fluorofor) je vybrána podle excitačních a emisních vlnových délek, přičemž excitační vlnové délky jsou v rozsahu od 300 do 850 nm a emisní vlnové délky v rozsahu od 350 do 1200 nm. Nízkomolekulárním fluoroforem se rozumí fluorofor, který má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1500 g/mol. S výhodou obsahuje fluorofor nebo jeho derivát funkční skupinu, vybranou z amino skupiny, isothiokyanátové skupiny a Nhydroxysukcinimidylové skupiny, pro navázání na aminovou nebo TT skupinu postranního řetězce lineárního kopolymeru. S výhodou je fluorescenční značka vybraná ze skupiny zahrnující fluorescein, fluoresceinisothiokyanát (FITC), deriváty ruthenium-bipyridinových komplexů Ru(bpy)3, zejména bis(2,2'-bipyridin)-[4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)butan-1 aminiumruthenium tris(perchlorát) (RUB-C4), cyaniny, zejména Cyanine3 nebo SulfoCyanine7.5, dále 3,6-diamino-9-[4-(2-aminoethylkarbamoyl)-2-karboxyfenyl]-5-(3sulfonátopropylsulfamoyl)xanthen- 10-ium-4-sulfonát (Dy-490), (2E)- 1-[6-(2,5-dioxopyrrolidin1-yl)oxy-6-oxohexyl]-2-[(2E,4E)-5-[1-(2-methoxyethyl)-3,3-dimethyl-5-sulfonátoindol-1-ium-2yl]penta-2,4-dienyliden]-3,3-dimethylindolin-5-sulfonát (Dy-647P1), 3-[4-[(E)-2-[6-[6-(2aminoethylamino)-6-oxohexoxy]- 1,3-benzoxazol-2-yl]vinyl]-1 -pyridyl]propan-1 -sulfonát (Dy396XL), 3-[4-[6-[[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-6-oxohexyl]karbamoylamino]-1,3benzoxazol-2-yl]pyridin-1 -ium-1 -yl]propan-1 -sulfonát (Dy-395XL), 3-[[6-(2azaniumylethylamino)-6-oxo-hexyl]karbamoyl]-8-chloro-7-hydroxy-2-oxochromen-6-sulfonát (Dy-410), 3-[4-[7-[[6-(2-aminoethylamino)-6-oxohexyl]-ethylamino]-2-oxochromen-3yl]pyridin-1 -ium-1 -yl]propan-1 -sulfonát (Dy-485XL), 1-[6-(2-aminoethylamino)-6-oxohexyl]-6[(E)-2-[7-(diethylamino)-2-oxochromen-3-yl]vinyl]pyridin-1-ium-3-sulfonát (Dy-480), 1-[6-(2aminoethylamino)-6-oxohexyl]-4-[(E)-2-[7-(diethylamino)-2-oxochromen-3-yl]vinyl]pyridin-1ium-3-sulfonát (Dy-520XL), (2E)-2-[(E)-3-(7-amino-2-terc-butylchromenylium-4-yl)prop-2enyliden]-1-[6-(2-aminoethylamino)-6-oxohexyl]-3,3-dimethylindolin-5-sulfonát (Dy-615), (2 Z) 3-[4-(2-aminoethylamino)-4-oxobutyl]-2-[(E)-3-[4-terc-butyl-7-[ethyl(3sulfonátopropyl)amino]chromenylium-2-yl]prop-2-enyliden]-3-methyl-1-(3sulfonátopropyl)indolin-5-sulfonát (Dy-682) a (2Z)-3-[4-(2-aminoethylamino)-4-oxobutyl]-2[(E)-3-[7-(diethylamino)-3-methyl-4-fenylchromenylium-2-yl]prop-2-enyliden]-3-methyl-1-(3sulfonátopropyl)indolin-5-sulfonát (Dy-701), popřípadě jejich deriváty obsahující funkční skupinu, vybranou z aminoskupiny, isothiokyanátové skupiny a N-hydroxysukcinimidylové skupiny.
V jednom výhodném provedení obsahuje fluorescenční polymer podle předkládaného vynálezu alespoň dvě různé fluorescenční značky, například kombinace: Dy-490 a Dy-647P1, Dy-396XL a Dy-647P1, Dy-560 a Dy-647P1, Dy-396XL a Dy-560, Dy-490 a Dy-480XL, Dy-396XL a Dy480XL a celá řada dalších, spektrálně se nepřekrývajících fluoroforů. Tyto různé fluorescenční značky mohou být vázané v jednom fluorescenčním polymeru v různých molárních poměrech, s výhodou od 1:1 do 1:15, čímž vznikne různý poměr intenzit fluorescence. Výhodněji jsou v jednom polymeru kombinovány fluorofory s rozdílnou excitační i emisní vlnovou délkou.
- 5 CZ 309828 B6
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž fluorescenční sonda, která obsahuje alespoň jeden fluorescenční polymer podle předkládaného vynálezu a dále obsahuje proteinovou strukturu vybranou ze skupiny peptid o počtu aminokyselin v rozmezí od 10 do 200, protein, lipoprotein, protilátka, enzym, hormon, receptor, strukturní protein, transportní protein, protein buněčných signalizačních drah, syntetický protein, přičemž proteinová struktura může být před konjugací s fluorescenčním polymerem popřípadě modifikována tak, aby obsahovala alespoň jednu skupinu, vybranou z -NH2, -SH, sDBCO (sulfodibenzocyklooktynová skupina), DBCO (dibenzocyklooktynová skupina), azid, ke které je fluorescenční polymer kovalentně navázán pomocí funkční skupiny, s výhodou vybrané z N-hydroxysukcinimidylového esteru, thiozolidin2-thionového amidu, malenimidu, azidu, nebo propargylu, obsažené na konci lineárního polymerního řetězce fluorescenčního polymeru. Tato funkční skupina se kovalentně váže na -NH2 skupinu (například lysinových zbytků), -SH skupinu (zavedenou například redukcí disulfidických můstků), nebo na sDBCO, DBCO a azidové skupiny, zavedené na proteinovou strukturu za vzniku kovalentní vazby.
Ve výhodném provedení obsahuje fluorescenční sonda monoklonální protilátku, ke které je kovalentně navázán alespoň jeden fluorescenční polymer podle předkládaného vynálezu.
Monoklonální protilátkou může být například anti-CD20, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, antiCD71, anti-MHCII, anti-CD45, anti-JNK. Monoklonální protilátky mají monovalentní afinitu a váží se specificky k jednomu epitopu antigenu.
Monoklonální protilátka obsahuje těžký řetězec, který je druhově specifický, a dva lehké řetězce, které obsahují vazebné místo pro navázání antigenu. Fluorescenční polymer je kovalentně navázán buď na lehký řetězec monoklonální protilátky v místech, kde monoklonální protilátka obsahuje disulfidové můstky, které se před navázáním fluorescenčního polymeru zredukují, nebo podél celé struktury protilátky v místech, kde jsou obsaženy volné aminové skupiny, například z lysinových postranních řetězců). Redukci disulfidických můstků lze provést například působením dithiothreitolu (DTT), tris(2-karboxyethyl)fosfinu (TCEP), β-merkaptoethanolu nebo glutathionu. Takto připravenou monoklonální protilátku lze ihned konjugovat s fluorescenčním polymerem podle předkládaného vynálezu, kdy SH-skupiny, vzniklé redukcí disulfidových můstků monoklonální protilátky, reagují s koncovou skupinou lineárního polymerního řetězce fluorescenčního polymeru, například s maleinimidovou skupinou, nebo lze SH-skupiny protilátky dále převést reakcí s sDBCO-MI (sulfodibenzocyklooktyn-maleinimidem) na sDBCO skupiny, popřípadě lze volné NH2-skupiny protilátky převést na DBCO skupiny reakcí s DBCO-NHS (dibenzocyklooktyn-N-hydroxysukcinimidylesterem). Popřípadě je možné NH2-skupiny protilátky převést na azidové skupiny reakcí s NHS-Azidem. Vzniklé DBCO, sDBCO nebo azidové skupiny protilátky potom následně reagují s koncovou skupinou lineárního polymerního řetězce fluorescenčního polymeru, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující azid, nebo propargyl, za vzniku kovalentní vazby mezi fluorescenčním polymerem a protilátkou.
Způsob přípravy fluorescenční sondy (fluorescenčního polymeru s navázanou proteinovou strukturou), obsahuje následující kroky:
a) poskytnutí monomerů semitelechelického lineárního kopolymeru,
b) polymerace monomerů semitelechelického lineárního kopolymeru,
c) navázání fluorescenční značky na semitelechelický lineární kopolymer za vzniku fluorescenčního polymeru,
d) volitelně modifikace proteinové struktury,
e) navázání proteinové struktury na fluorescenční polymer.
- 6 CZ 309828 B6 ad a) Poskytnutí monomerů semitelechelického lineárního kopolymeru zahrnuje poskytnutí N-(2hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA), akrylamidu nebo jeho derivátů, methakrylamidu nebo jeho derivátů, akrylátu nebo jeho derivátů nebo metakrylátu nebo jeho derivátů, a poskytnutí monomerů obecného vzorce IV
R (IV), kde R je vybraný ze skupiny sestávající z lineárního nebo rozvětveného uhlíkového alkylenového řetězce s počtem uhlíků od 1 do 6 ((C1 až C6)alkylen); přičemž R může být dále substituován jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;
a X je -karbonyl-thiazolin-2-thionová skupina (TT) nebo NH2-skupina. Aminoskupina může být popřípadě chráněná chránící skupinou, například terc-butoxykarbonylovou (Boc) chránící skupinou. Karbonylem se rozumí -C(=O)- skupina.
N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) a další monomery akrylamidového, methakrylamidového, akrylátové a metakrylátové typu jsou komerčně dostupné.
Látky vzorce IV byly buď získány z komerčně dostupných zdrojů, např. methakryolyl-6aminoropylamin chráněný na aminových skupinách terc-butyloxykarbonylovými skupinami (MA-Pr-NH-Boc), nebo byly připraveny podle postupů uvedených literatuře (Pola R., Parnica J., Zuska K., Bohmová E., Filipová M., Pechar M., Pankrác J., Mucksová J., Kalina J., Trefil P., Šefc L., Větvička D., Poučková P., Bouček J., Janoušková O., Etrych T. Multifunct. Mater. 2019, 2: 024004).
ad b) Polymerace monomerů semitelechelického lineárního kopolymeru se provede řízenou radikálovou RAFT polymerizací monomerů z kroku a) s obsahem od 0,4 do 12 % mol. monomeru obecného vzorce IV, a alespoň 88 % mol. (88 až 99,6 % mol.) monomerních jednotek, vybraných ze skupiny zahrnující N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) a další monomery na bázi akrylamidů, methakrylamidů, akrylátů a metakrylátů, s výhodou vybraných ze skupiny zahrnující HPMA, akrylamid, methakrylamid. Reakce probíhá při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, s výhodou 40 až 80 °C, a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofuran, propanol, terc-butanol nebo jejich směsí.
Reakce je iniciována iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující V-70 a ABIK-N3, kde V-70 je 2,2'-azobis[N-(2-karboxyethyl)-2-methylpropionamidin] a ABIK-N3 je N-(3azidopropyl)-4-[( Z)-[4-(3-azidopropylamino)-1-kyano-1-methyl-4-oxo-butyl]azo]-4-kyanopentanamid, popřípadě za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou CTA-N3, kde CTA-N3 je N-(3-azidopropyl)-4-ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-4-methyl-pentanamid. Polymerní nosič je pak zakončen zbytkem z radikálu vzniklého rozpadem použitého iniciátoru.
Výsledný semitelechelický lineární kopolymer s výhodou obsahuje koncovou N3-skupinu; přičemž koncová N3-skupina tohoto výsledného semitelechelického kopolymeru může dále reagovat s vhodnými deriváty maleinimidu, s výhodou vybranými ze skupiny
- 7 CZ 309828 B6 dibenzocyklooktyn-amin (DBCO-NH2) nebo propargylderivátů.
Připravený semitelechelický lineární kopolymer z kroku b) se může, popřípadě dále podrobit odstranění chránících skupin, chránících aminové skupiny postranních řetězců (například Bocskupin). Odstranění chránicích skupin lze provést zavedenými postupy, které jsou odborníkovi v oboru známé, například odstranění Boc-skupiny pomocí kyseliny trifluoroctové nebo zahřátím kopolymeru ve vodě. Výsledný kopolymer/produkt se může skladovat bez rizika jeho dekompozice. Typy reakcí, které se s výhodou použijí pro přípravu semitelechelických kopolymerů podle předkládaného vynálezu, jsou RAFT polymerizace (s využitím předem připraveného přenosového činidla, např. CTA-N3) a „klik reakce“ (např. při použití koncových skupin dibenzocyklooktinu, propargylu, resp. azidu, u semitelechelických kopolymerů).
ad c) navázání fluorescenční značky na semitelechelický lineární kopolymer za vzniku fluorescenčního polymeru se provede konjugací volných aminových skupin nebo thiazolidin-2thionových (TT) skupin monomerních jednotek obecného vzorce IV semitelechelického lineárního kopolymeru, popsaného výše, s nízkomolekulární fluorescenční značkou (fluoroforem), která obsahuje vhodné reaktivní skupiny (například aminovou nebo SCN) a která se může použít ve volné formě, nebo ve formě soli s kyselinou, např. HCl; přičemž nízkomolekulárním fluoroforem je fluorofor, který má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1500 g/mol. Fluorofor je vybrán podle excitačních a emisních vlnových délek, přičemž excitační vlnové délky jsou v rozsahu od 300 do 850 nm a emisní vlnové délky v rozsahu od 350 do 1200 nm; případná molekula nízkomolekulárního fluoroforu je k semitelechelickému lineárnímu kopolymeru navázána amidovou nebo thioamidovou vazbou;
- případné nezreagované thiazolidin-2-thionové skupiny se mohou odstranit reakcí s aminoalkoholem, vybraným ze skupiny zahrnující NH2-(CH2)a-CH2(OH); NH2-(CH2)bCH(OH)-CH3; NH2-(CH2)b-CH(OH)-(CH2)c-CH3; kde a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 0 do 3 a c je od 1 do 4;, s výhodou s 1-aminopropan-2-olem, a/nebo se nezreagované NH2 skupiny mohou odstranit reakcí s acetythiazolidin-2-thionem;
- volitelný krok přečištění kolonovou chromatografií a lyofilizace výsledného produktu z předchozího kroku.
Případně lze následně fluorescenční polymer podrobit dalším reakcím, vedoucím ke změně reakční skupiny na konci semitelechelického řetězce. Příkladem mohou být klik reakce azidové skupiny s dibenzocyklooktyn-maleinimidem za vzniku fluorescenčního polymeru s maleinimidovou funkční skupinou na jednom konci lineárního polymerního řetězce;
nebo klik reakce azidové skupiny s dibenzocyklooktyn-karboxylem a následně s thiazolidin-2thionem za vzniku fluorescenčního polymeru s thiazolidin-2-thionovou funkční skupinou na jednom konci lineárního polymerního řetězce;
nebo klik reakce azidové skupiny s dibenzocyklooktyn-N-hydroxysukcinimidylesterem za vzniku fluorescenčního polymeru s N-hydroxysukcinimidylesterovou funkční skupinou na jednom konci lineárního polymerního řetězce.
ad d) Volitelným krokem je modifikace proteinové struktury vybrané ze skupiny peptid, protein, lipoprotein, protilátka, enzym, hormon, receptor, strukturní protein, transportní protein, protein buněčných signalizačních drah, syntetický protein, s výhodou takové proteinové struktury, která obsahuje disulfidické vazby; přičemž modifikace spočívá v redukci disulfidických můstků pomocí redukčního činidla vybraného ze skupiny dithiothreitol (DTT), tris(2-karboxyethyl)fosfin (TCEP), β-merkaptoethanol, glutathion, s výhodou DTT, ve vodném pufru (pH od 6,5 do 7,5) při teplotě místnosti za vzniku SH-skupin v proteinové struktuře. Tyto SH-skupiny mohou být následně dále modifikovány pomocí sDBCO-MI (sulfodibenzocyklooktyn-maleinimidem) na sDBCO skupiny, popřípadě lze modifikovat volné NH2-skupiny protilátky (například
- 8 CZ 309828 B6 aminoskupiny lysinových zbytků) na DBCO nebo azidy skupiny reakcí s DBCO-NHS (dibenzocyklooktyn-N-hydroxysukcinimidylesterem) nebo NHS-azidem. Vzniklé -SH, azidové, DBCO a sDBCO skupiny nebo původní -NH2 skupiny protilátky následně v kroku e) reagují s koncovou skupinou lineárního polymerního řetězce fluorescenčního polymeru, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující N-hydroxysukcinimidylový ester, thiozolidin-2-thionový amid, maleinimid propargyl nebo azid, za vzniku kovalentní vazby mezi fluorescenčním polymerem a protilátkou.
ad e) navázání proteinové struktury na fluorescenční polymer - krok konjugace alespoň jednoho fluorescenčního polymeru podle předkládaného vynálezu a proteinové struktury, popřípadě proteinové struktury se zavedenými sulfhydrylovými (-SH), azidovými, sulfodibenzocyklooktynovými (sDBCO) nebo dibenzocyklooktynovými (DBCO) skupinami připravené v předchozím kroku, přičemž reakce probíhá při teplotě místnosti ve vodném pufru (pH od 6,5 do 7,5); koncová skupina fluorescenčního polymeru reaguje s -NH2, -SH, propargylovými, sDBCO nebo DBCO skupinami přítomnými na proteinové struktuře v řádu jednotek minut a vysokým výtěžkem a výsledný konjugát si zachovává neovlivněný biologický účinek;
- popřípadě krok přečištění kolonovou chromatografií a lyofilizace výsledného produktu z předchozího kroku.
Ve výhodném provedení se na proteinovou strukturu naváží alespoň dva různé fluorescenční polymery, s výhodou s různými fluorofory.
Meziproduktem, který slouží k přípravě fluorescenčního polymeru podle předkládaného vynálezu, je například semitelechelický lineární kopolymer, obsahující poly(N-(2hydroxypropyl)methakrylamid), ve kterém je od 0,4 do 12 % mol. monomerních jednotek nahrazeno monomerní jednotkou obecného vzorce I, kde
R je vybraný ze skupiny sestávající z lineárního nebo rozvětveného uhlíkového alkylenového řetězce s počtem uhlíků od 1 do 6 ((C1 až C6)alkylen); přičemž R může být dále substituován jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny; s výhodou jsou těmito řetězci methyl, isopropyl, isobutyl, -CH(CH3)(CH2CH3), -CH2OH, -CH(OH)(CH3), -CH2-(C6H4)OH, -(CH2)2-S-CH3, -CH2SH, -(CH2)4-NH2, -CH2COOH, -CH2C(O)NH2, -(CH2)2COOH, -(CH2)2C(O)NH2, -(CH2)3NH-C(=NH)(NH2), benzyl;
Y je vybraný ze skupiny sestávající z vazby, -C(=O)-NH-, -NH-C(=O)-, -NH-C(=S)-NH-;
přičemž molekulová hmotnost Mn semitelechelického lineárního kopolymeru je v rozmezí od 10 000 do 100 000 g/mol, s výhodou v rozmezí od 15 000 do 40 000 g/mol (což odpovídá 100 až 280 monomerním jednotkám), výhodněji je molekulová hmotnost v rozmezí od 20 000 do 30 000 g/mol (což odpovídá 134 až 210 monomerním jednotkám);
a přičemž semitelechelický lineární kopolymer obsahuje na jednom konci polymerního řetězce funkční skupinu pro navázání na proteinovou strukturu (například jednobodovým roubováním), kterážto funkční skupina je vybraná ze skupiny zahrnující estery, s výhodou Nhydroxysukcinimidylový ester nebo C1-C4 alkyl estery, amidy, s výhodou thiozolidin-2-thionový amid, maleimid, azid, propargyl, s výhodou je touto funkční skupinou azid nebo maleimid.
Předmětem předkládaného vynálezu je dále konjugační sada pro značení protilátek, která obsahuje fluorescenční polymer podle předkládaného vynálezu, reakční pufr (0,1M fosfátový pufr, 10 mM EDTA, pH 7), dithiothreitol (DTT) a alespoň jednu kolonku o objemu od 0,5 do 2 ml, s výhodou o objemu 0,8 ml, která obsahuje zesíťovaný dextran o molekulové hmotnosti od
- 9 CZ 309828 B6
100 do 5000 g/mol, vhodnou pro centrifugační separaci vysokomolekulárních látek od nízkomolekulárních látek.
Postup značení protilátek s využitím výše uvedené konjugační sady spočívá v následujících krocích:
A. Redukce protilátky a odstranění DTT z reakční směsi.
B. Konjugace redukované monoklonální protilátky s fluorescenčním polymerem.
ad A) Protilátka se rozpustí v reakčním pufru a přidá se DTT v reakčním pufru. Reakční směs reaguje za teploty místnosti. Produkt (redukovaná protilátka v reakčním pufru) se přečistí na kolonce obsahující zesíťovaný dextran o molekulové hmotnosti 100 až 5000 g/mol a v dalším kroku se přidá k fluorescenčnímu polymeru.
ad B) Přečištěná redukovaná protilátka se konjuguje s fluorescenčním polymerem, s výhodou v molárním poměru 1:9.
Pomocí takové konjugační sady je možné označit také vlastní proteinové struktury, které mají ve své molekule vhodné funkční skupiny (disulfidové můstky).
Předmětem předkládaného vynálezu je dále použití fluorescenčního polymeru, fluorescenční sondy a/nebo konjugační sady podle předkládaného vynálezu pro fluorescenční značení proteinových struktur vybraných ze skupiny peptid, protein, lipoprotein, protilátka, enzym, hormon, receptor, strukturní protein, transportní protein, protein buněčných signalizačních drah, syntetický protein.
Fluorescenční polymer podle předkládaného vynálezu může nést kombinaci několika fluoroforů navázaných v několika různých definovaných poměrech a s koncovou skupinou pro jednobodové roubování na proteinovou strukturu. Různé kombinace několika fluoroforů mohou být následně využity k odlišení různých spektrálních kombinací, a tedy odlišení různých typů buněčných subsetů.
Ve výhodném provedení nese fluorescenční polymer nebo fluorescenční sonda kombinaci dvou fluoroforů, z nichž jeden má fluorescenci nezávislou na okolním prostředí a umožňuje tak normalizovat signál z různých buněk nebo prostředí, a druhý fluorofor má fluorescenci závislou na různých parametrech vnějšího prostředí a jeho fluorescence na změnu vnějšího okolí dokáže reagovat. Fluorescenční polymery nesou zároveň koncovou skupinou pro jednobodové roubování na proteinovou strukturu podle předkládaného vynálezu pro použití ke stanovení různých fyzikálně-chemických nebo biologických parametrů buněk nebo prostředí.
Předmětem předkládaného vynálezu je dále použití fluorescenčního polymeru, fluorescenční sondy a/nebo konjugační sady podle předkládaného vynálezu ve fluorescenčních zobrazovacích technikách, s výhodou vybraných ze skupiny zahrnující průtokovou cytometrii pro detekci buněčných struktur a znaků, multiplexovou analýzu v průtokové cytometrii pro značení různých protilátek proti buněčným strukturám a znakům, jež je sestavena tak, aby bylo možno tyto protilátky detekovat zároveň na jednotlivých buňkách, fluorescenční „čárové kódování“, kuličkové testy, mikroskopii, western blot, fluorescenční průtokovou cytometrii pro analýzu buněčných dějů, kdy jeden z fluoroforů je responzivní pro tento děj a druhý fluorofor je stabilní, nastavující referenční kvantifikační hladinu. Fluorescenční polymer a/nebo fluorescenční sondu podle předkládaného vynálezu lze využít například jako reportovací sekundární sondu v sendvičových ELISA testech založených na kuličkovém nosiči pro detekci rozpustných proteinů v suspenzi, v mikroskopických technikách založených na detekci fluorescence pro zobrazení a detekci buněčných struktur a znaků, v mikroskopických technikách založených na detekci fluorescence pro multiplexní analýzy a detekci buněčných struktur a znaků,
- 10 CZ 309828 B6 v mikroskopických technikách založených na detekci fluorescence pro analýzu buněčných dějů, kdy jeden z fluoroforů je responzivní pro tento děj a druhý fluorofor je stabilní, nastavující referenční kvantifikační hladinu; v technikách western blot pro přímé značení a detekci proteinů na membráně a pro přímé multiplexní značení a detekci proteinů na membráně.
Další využití je v lékařské diagnostice, celotělovém zobrazování a/nebo fluorescenčně asistované chirurgii, s výhodou při diagnostice a monitorování úspěšnosti léčby u nádorových onemocnění, onemocnění krvetvorného systému (leukémie, lymfomy, selhání krvetvorby) a imunitního sytému (primární i sekundární imunodeficience, imunitní dysregulace, autoimunitní onemocnění) zánětlivých a bakteriálních. Fluorescenční sondu a/nebo fluorescenční sadu podle předkládaného vynálezu lze využít například v technikách celotělového zobrazování založených na detekci fluorescence pro detekci orgánů, jednotlivých buněk, buněčných struktur a znaků; pro multiplexovou detekci orgánů, jednotlivých buněk, buněčných struktur a znaků; pro analýzu fyziologických i buněčných dějů na úrovni orgánů, jednotlivých buněk, buněčných organel či složek i rozpustných proteinů, kdy jeden z fluoroforů je responzivní pro tento děj a druhý fluorofor je stabilní, nastavující referenční kvantifikační hladinu; ve fluorescencí naváděné chirurgii pro označení a zobrazení fluorescence v cílových strukturách orgánů a tělesných tkání.
Shrnutí
Fluorescenční sonda a fluorescenční polymer podle vynálezu tak mohou být připravené na míru dané aplikaci pro průtokovou cytometrii, mikroskopii, celotělové zobrazování, western-blot a ostatní techniky využívající fluorescence jako reportní systém. Je to umožněno vlastní volbou a libovolnou kombinaci fluoroforu a jakéhokoli proteinu, jako směrovací a specifitu určující struktury. Uživatel si tedy může vytvořit celé spektrum vlastních sond podle svých požadavků přímo v jeho laboratoři, pro jedno- i mnohobarevné experimenty, bez nutnosti zakoupení různých souprav od různých výrobců.
Předkládaný vynález také umožní přípravu fluorescenčního “čárového kódu” sondy pro multiplexní analýzy s možností rozlišit sondou 6 až 8 různých fluorescenčních “čárových kódů“ v jednom jediném experimentu.
Předkládaný vynález dále umožní determinaci parametrů vnějšího prostředí či fyziologických parametrů buněk, a to kombinací jednoho fluoroforu reagujícího na příslušný stimul spolu s druhým fluoroforem sloužícím jako interní fluorescenční standard pro normalizaci výsledku testu, což přináší významný pokrok do fluorescenční průtokové cytometrie.
Objasnění výkresů
Obr. 1: Soutisk GPC chromatogramů polymerní sondy s navázanou monoklonální protilátkou anti-CD3 (OKT-3) a fluorescenčním polymerem značeným Dy-410 (ex/em 405/460 nm), samotné protilátky a fluorescenčního polymeru.
Obr. 2: Výsledek průtokové cytometrie vzorku periferní krve po inkubaci s protilátkou CD20 konjugovanou s rychlou konjugační sadou obsahující fluorescenční polymer s fluorescenční značkou FITC. Histogramy dokladují identický profil značení v rozsahu konjugačních časů 5 až 30 minut. Detekce fluorescence FITC je znázorněna na ose x.
Obr. 3: Výsledek průtokové cytometrie vzorku periferní krve po inkubaci s různými polymerními sondami protilátka polymer fluorofor. Protilátky CD3 OKT a CD20 RTX byly konjugovány s fluorescenčními značkami vyznačenými v popiscích panelů. Kontrolní profil značení komerční CD3 FITC, CD20 FITC a neznačených lymfocytů je pro porovnání znázorněn v posledním řádku panelů.
- 11 CZ 309828 B6
Obr. 4: Intenzita fluorescence kuliček UltraComp (Invitrogen) obarvených protilátkami konjugovanými s fluorescenčními polymery obsahujícími fluorofory Dy-490 a Dy-647P1 v různých poměrech (MSS-07 až MSS-10) a jednobarevnými fluorescenčními polymery s Dy490 (OH-44) a Dy-647P1 (OH-45). Jako negativní kontrola slouží kuličky bez vazebných míst pro protilátku (červená negativní populace).
Obr. 5: Klesající poměr fluorescence fluoroforů GREEN/RED = FITC/DY-615 jako funkce poklesu fluorescence FITC po vstupu a po akumulaci v kyselých organelách v závislosti na době inkubace. Zatímco rychle internalizovaný transferinový receptor dopravil navázanou protilátku anti-CD71 do kyselých organel již v prvních 10 minutách inkubace, pomalu se intranalizující MHC-II vykazuje výrazně pomalejší a slabší míru přechodu do kyselých organel.
Obr. 6: Tkáňový řez z myší sleziny kmene Blab/C označený kombinací fluorescenčních sond připravených dle příkladů 4 a 6 z protilátky anti mouse-CD45 (CapricoBio, USA) + semitelechelické kopolymery nesoucí Dy-485XL a protilátky anti-mouse CD8 (CapricoBio, USA) + semitelechelické kopolymery nesoucí Dy-395XL. Obě protilátky jasně a zřetelně značí specifické populace CD45 všechny lymfocyty a CD8 jen T-buňky.
Obr. 7: Detekce kinázy JNK v buněčném lyzátů technikou Western Blot pomocí komerční soupravy primární+sekundární protilátka (králičí anti-JNK + anti-králičí sekundární Ab IRDye 800) obr. 7A. a pomocí primární anti-JNK protilátky přímo značené pomocí fluorescenčních polymerů nesoucích Dy-701. Oba dva systémy specificky a se srovnatelnou intenzitou značí požadovaný protein.
Obr 8: Celotělové zobrazení myši kmene NuNu nesoucí nádor EL-4 vizualizovaný pomocí protilátky anti-Thyl,2 označené dle příkladů 4 a 6 pomocí kopolymeru nesoucího fluorofor DY701. Specifický fluorescenční signál specifické fluorescenční sondy jasně detekuje a ohraničuje nádor a umožňuje tak jeho přesné vymezení, lokalizaci a případné odstranění.
Obr. 9: Schematické znázornění použití konjugační sady.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Syntéza semitelechelického kcpolymeru rGft-poly(HPMA-ko-MA-βAla-TΊ)-N3 pomoci řízené radikálové RAFTpolymerizace
raft-poly(HPMA-ko-MA-pAla-TT)-N3
Semitelechelický kopolymer raft-poly(HPMA-Z:o-MA-/yAla-TT)-Ní, obsahující koncovou
- 12CZ 309828 B6 azidovou skupinu (N3) a thiazolidin-2-thionové skupiny (TT) podél polymerního řetězce, byl připraven pomocí řízené radikálové RAFT polymerizace, kdy molární poměr iniciátoru/přenašeče/komonomerů byl 0,5/1/250. Poměr komonomerů HPMA/MA-βAla-TT byl 90,2/9,8 % mol. 600 mg (4,19 mmol) N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) bylo rozpuštěno v terc-butanolu (5,530 ml), 94,13 mg (0,36 mmol) 3-(3 methakryloylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thionu (MA-βAla-TT), 2,8 mg (9,1 pmol) iniciátoru 2,2'-azobis[ N-(2-karboxyethyl)-2-methylpropionamidin]u (V-70) a 6,32 mg (18,2 pmol) přenašeče N-(3-azidopropyl)-4-ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-4-methyl-pentanamidu (CTAN3) bylo rozpuštěno v dimethylacetamidu (DMA; 0,7 ml). Tyto roztoky byly smíchány dohromady v polymerizační ampuli. Polymerizační směs byla probublávána 10 min argonem. Kopolymerizace probíhala při 40 °C po dobu 16 h v zatavené ampuli. Produkt byl izolován srážením do směsi aceton/diethylether v poměru 1:1, zfiltrován a sušen do konstantní hmotnosti. Reaktivní ω-koncové trithiokarbonátové skupiny (TTC) byly odstraněny pomocí 2,2'azobisisobutyronitrilu (AIBN) tak, že byl připraven 15% roztok polymeru s AIBN (20 % hmotn.) v DMA. Roztok v ampuli byl probublán 10 minut argonem, zataven a ponechán 3 h při 80 °C. Produkt byl izolován srážením do směsi aceton/diethylether v poměru 1:1, zfiltrován a sušen do konstantní hmotnosti. Charakterizace výsledného kopolymeru: Mn (SEC) 20 900 g/mol; D ~ 1,16; obsah (TT) ~ 8,7 % mol.
Podle postupu v příkladu 1 byly analogicky připraveny další kopolymery raft-poly(HPMA-ko MA-βAla-TT)-N3 s různými molárními hmotnostmi Mn v intervalu od 8 000 do 37 000 g/mol, přičemž index polydisperzity D byl ve všech případech v rozmezí 1,01 až 1,15. Obsah TT-skupin podél řetězce byl 2,2 až 9,2 % mol. Podle tohoto postupu byly připraveny také další kopolymery raft-poly(HPMA-ko-MA-R1-TT)-N3, které obsahovaly ve své struktuře aminoacyl R1 podle vzorce I. Viz tabulka 1.
Tabulka 1: Fyzikálně-chemická charakterizace semitelechelických kopolymerů raft-poly(HPMAko-MA-R1-TT)-N3 připravených podle příkladu 1
| Vzorek | Mn (g/mol) | D | obsah TT skupin (% mol.) | počet uhlíků v R1 |
| 1-1 | 8 000 | 1,10 | 6,5 | 3 |
| 1-2 | 11 100 | 1,09 | 2,2 | 3 |
| 1-3 | 23 300 | 1,15 | 7,5 | 3 |
| 1-4 | 27 000 | 1,05 | 9,2 | 3 |
| 1-5 | 36 700 | 1,15 | 9,0 | 3 |
| 1-6 | 27 400 | 1,01 | 7,6 | 6 |
| 1-7 | 16 500 | 1,10 | 8,3 | 6 |
- 13 CZ 309828 B6
Příklad 2: Syntéza semitelechelického kcpolymeru rcfl-polytllPMA-ko-MA-Pr-SlI-Bocj-Nj pomoci řízené radikálové RAFTpolymerizace
raft-poly(HPMA-ko-MA-Pr-NH-Boc)-N3
Semitelechelický kopolymer raft-poly(HPMAAo-MA-Pr-NH-Boc)-N;, obsahující koncovou azidovou skupinu (N3) a chráněné aminové skupiny (-NH-Boc) podél polymerního řetězce, byl připraven pomocí řízené radikálové RAFT polymerizace, kdy molární poměr iniciátoru/přenašeče/komonomerů byl 0,5/1/200. Poměr komonomerů HPMA/MA-Pr-NH-Boc byl 90/10 % mol. 500 mg (3,49 mmol) V-(2-hydroxypropyl)metaakrylamid (HPMA) bylo rozpuštěno v fórc-butanolu (4,710 ml), 89,35 mg (0,39 mmol) methakryolyl-d-aminoropylaminu chráněného na aminových skupinách terc-butyloxykarbonylovými skupinami (MA-Pr-NH-Boc), 2,99 mg (9,7 pmol) iniciátoru 2,2'-azobis[V-(2-karboxyetayl)-2-metaylpropionamidine]u (V-70) a 6,73 mg (19,4 pmol) přenašeče V-(3-azidopropyl)-4-etaylsulfanylkarbotaioylsulfanyl-4methyl-pentanamidu (CTA-N3) bylo rozpuštěno v dimethylacetamidu (DMA; 0,6 ml). Tyto roztoky byly smíchány dohromady v polymerizační ampuli. Polymerizační směs byla probublávána 10 min argonem. Kopolymerizace probíhala při 40 °C po dobu 16 h v zatavené ampuli. Produkt byl izolován srážením do směsi aceton/diethylether v poměru 1:1, zfiltrován a sušen do konstantní hmotnosti. Reaktivní ω-koncové trithiokarbonátové skupiny (TTC) byly odstraněny pomocí 2,2'-azobisisobutyronitrilu (AIBN) tak, že byl připraven 15% roztok polymeru s AIBN (20 % hmota.) v DMA. Roztok v ampuli byl probublán 10 minut argonem, zataven a ponechán 3 h při 80 °C. Produkt byl izolován srážením do směsi aceton/dietayletaer v poměru 1:1, zfiltrován a sušen do konstantní hmotnosti. Charakterizace výsledného kopolymeru: Mn (SEC) 23 500 g/mol; D ~ 1,07; obsah (NH2) ~ 9,7 % mol.
Podle postupu v příkladu 2 byly analogicky připraveny další kopolymery raft-poly(HPMA-koMA-Pr-NH-Boc)-N3 s různými molárními hmotnostmi Mn v intervalu od 24 500 do 44 500 g/mol, přičemž index polydisperzity B byl ve všech případech v rozmezí 1,03 až 1,10. Podle tohoto postupu byly připraveny také další kopolymery raft-poly(HPMA-ko-MA-R2-NHBoc)-N3, které obsahovaly ve své struktuře amicoacyl R2 podle vzorce II. Obsah NH2-skupin podél řetězce byl 6,7 až 8,6 % mol. Viz tabulka 2.
- 14CZ 309828 B6
Tabulka 2: Fyzikálně-chemická charakterizace semitelechelických kopolymerů raft-poly(HPMAΛο-Μ A-R2-NH-Boc)-N3 připravených podle příkladu 2
| Vzorek | M„ (g/mol) | D | obsah NH2-skupin (% mol.) | počet uhlíků v R2 |
| 2-1 | 24 700 | 1,07 | 6,7 | 3 |
| 2-2 | 27 800 | 1,03 | 7,0 | 3 |
| 2-3 | 44 400 | 1,10 | 8,6 | 3 |
| 2-4 | 25 700 | 1,05 | 8,5 | 6 |
| 2-5 | 41 300 | 1,08 | 7,8 | 6 |
Příklad 3: Odstraněni chránící skupiny Boc na aminových skupinách semitelechelického kopolymeru reft-poly(HPMA-ko-MA-Pr-NH-Boc)-Ni
raft-poly(HPMA-ko-MA-Pr-NH2)-N3
Semitelechelický kopolymer raft-poly(HPMA-&o-MA-Pr-NH2)-N3 byl připraven ze semitelechelického kopolymeru raft-poly(HPMAAo-MA-Pr-NH-Boc)-N3 z příkladu 2 (348 mg), který obsahoval aminové skupiny chráněné terc-butyloxykarbonylovou skupinou (Boc). Semitelechelický kopolymer raft-poly(HPMA-ko-MA-Pr-NH-Boc)-N3 byl rozpuštěn v 6,96 ml destilované vody a přenesen do polymerizační ampule. Reakční směs byla probublávána 10 minut argonem. Odstranění chránících skupin probíhalo při 150 °C po dobu 1 h v zatavené polymerizační ampuli. Produkt byl nakonec zlyofilizován.
Výtěžek 297 mg (85 %). Charakterizace: Mw = 25 200 g/mol, Mn = 23 500 g/mol. Obdobně byly odstraněny chránící skupiny i z dalších polymerů připravených dle postupu 2.
- 15CZ 309828 B6
Příklad 4: Příprava fluorescenčního polymeru rGft-poly(HPMA-ko-MAflAla-Oy-49ty-N3 pomocí aminolytické reakce
o-|yo o raft-poly(HPMA-ko-MA-^Ala-Dy-490)-N3
Fluorescenční polymer raft-poly(HPMA-&o-MA-/ÍAla-Dy-490)-N3 byl připraven aminolytickou reakcí TT skupin podél řetězce kopolymeru (příklad 1) a aminoderivátu fluoroforů Dy-490 (ex/em 490/415 nm), který je komerčně dostupný. Výchozí kopolymer raft-poly(HPMA-ko-MA^Ala-TT)-N3 (15 mg, 0,61 pmol) byl rozpuštěn v bezvodém dimethylsulfoxidu (DMSO, 110 pl) a byl k němu přidán roztok aminoderivátu Dy-490 (1,70 mg, 3,57 pmol, 3,5% mol.) v DMSO spolu s DIPEA (1 pl, 5,7 pmol). Reakční směs byla za stálého míchání ponechána reagovat 4 h v temnu. Nezreagované TT skupiny byly odstraněny přidáním Y-aminopropan-2-olu (5 pl, 65 pmol). Produkt byl přečištěn kolonovou chromatografií (Sephadex LH20, methanol). Frakce se vzorkem byla odpařena za vakua a produkt byl lyofilizován z vodného roztoku. Výtěžek 92 % (13,7 mg). Obsah Dy-490 ~ 3,1 % mol.
Podle postupu v příkladu 4 byly analogicky připraveny další fluorescenční polymery, odvozené od polymerů připravených v příkladu 1, s aminoderiváty různých fluoroforů, jejichž excitační vlnové délky byly v rozsahu 300 až 850 nm a emisní vlnové délky v rozsahu 350 až 1200 nm. Obsah fluoroforů byl v intervalu od 0,4 do 10 % mol. Viz tabulka 3.
- 16CZ 309828 B6
Tabulka 3: Fyzikálně-chemická charakterizace fluorescenčních polymerů raft-poly(HPMA-koMA-R-TT)-N3 připravených podle příkladu 4 (R je alkylen).
| Vzorek | fluorofor | excitace/emise (nm) | obsah fluoroforu (% mol.) | počet uhlíků v R |
| 4-1 | Dy-396XL | 392/572 | 1,06 | 3 |
| 4-2 | Dy-395XL | 396/560 | 2,36 | 3 |
| 4-3 | Dy-410 | 405/460 | 2,82 | 3 |
| 4-4 | Dy-485XL | 485/560 | 2,04 | 6 |
| 4-5 | Dy-490 | 491/545 | 0,71 | 3 |
| 4-6 | RUB-C4 | 455/630 | 9,35 | 3 |
| 4-7 | Dy-480 | 500/630 | 1,55 | 6 |
| 4-8 | Dy-520XL | 520/664 | 0,94 | 6 |
| 4-9 | Cyanine3 | 555/570 | 1,18 | 3 |
| 4-10 | Dy-615 | 621/641 | 1,57 | 6 |
| 4-11 | Dy-647P1 | 653/672 | 0,64 | 3 |
| 4-12 | Dy-682 | 684/718 | 0,63 | 3 |
| 4-13 | Dy-701 | 706/731 | 0,52 | 3 |
| 4-14 | Sulfo-Cyanine7.5 | 778/797 | 0,40 | 6 |
- 17 CZ 309828 B6
Příklad 5: Příprava fluorescenčního polymeru reft-poly(HPMA-ko-MA-Pr-NH-FITC)-Ni
raft-poly(HPMA-ko-MA-Pr-NH-FITC)-N3
Fluorescenční polymer raft-poly(HPMA-ko-MA-Pr-FITC)-N3 byl připraven reakcí NH2-skupin podél řetězce kopolymeru raft-poly(HPMA-ko-MA-Pr-NH2)-N3 a fluoresceinisothiokyanátu (FITC, ex/em 490/520 nm). Výchozí kopolymer (80 mg, 2,88 pmol) byl rozpuštěn v bezvodém dimethylsulfoxidu (DMSO, 570 pl) a byl k němu přidán roztok FITC (6,52 mg, 16,8 pmol, 2,7 % mol.) v DMSO. Reakční směs byla za stálého míchání ponechána reagovat 4 h v temnu. Nezreagované NH2-skupiny byly odstraněny přidáním acetythiazolidin-2-thionu (1,5 mg, 15,3 pmol). Produkt byl přečištěn kolonovou chromatografií (Sephadex LH20, methanol). Frakce se vzorkem byla odpařena za vakua a produkt byl lyofilizován z vodného roztoku. Výtěžek 86 % (74,6 mg). Obsah FITC ~ 2,52 % mol.
Polymerní prekurzor raft-poly(HPMA-ko-MA-Pr-NH2)-N3 připravený podle příkladu 3 byl rovněž použit pro přípravu fluorescenčního polymeru za využití dalších derivátů fluoroforů, např. /V-hydroxysukcinimidyl esterů podle postupu uvedeného v příkladu 5. Další polymerní prekurzory připravené podle příkladu 3 byly analogicky použity pro přípravu fluorescenčních polymerů.
Podle postupu v příkladu 5 byly analogicky připraveny další fluorescenční polymery raftpolyřHPMAAo-MA-R-NH-FITCj-Ní s různými obsahy FITC v intervalu od 0,4 do 5 % mol. Viz tabulka 4 (R je alkylen).
Tabulka 4 Fyzikálně-chemická charakterizace fluorescenčně značených polymerních prekurzorů raft-polylHPMAAo-MA-R-FITCj-Ní připravených podle příkladu 5
| Vzorek | fluorofor | excitace/emise (nm) | obsah fluoroforu (% mol.) | počet uhlíků v R |
| 5-1 | FITC | 490/520 | 0,43 | 3 |
| 5-2 | FITC | 490/520 | 0,86 | 3 |
- 18CZ 309828 B6
| 5-3 | FITC | 490/520 | 2,18 | 6 |
| 5-4 | FITC | 490/520 | 3,34 | 6 |
| 5-5 | FITC | 490/520 | 4,71 | 3 |
Příklad 6: Příprava fluorescenčního polymeru rGft-poly(HPMA-ko-MA-βAla-Dy-49G)-maleinimid pomocí click reakce
o^l^o o raft-poly(HPMA-&o-MA-/?Ala-Dy-490)-maleinimid
Fluorescenční polymer raft-poly(HPMA-ko-MA-^Ala-Dy-490)-maleinimid byl připraven click 10 reakcí azidové skupiny přítomné na konci polymerního řetězce raft-poly(HPMA-&o-MA-/?AlaDy-490)-N3 (příklad 4) a dibenzocyklooktyn-maleinimidu (DBCO-MI). Výchozí fluorescenční polymer (13,7 mg, 0,56 pmol) byl rozpuštěn v bezvodém DMSO (115 μΐ) a byl k němu přidán roztok DBCO-MI (0,6 mg, 1,4 pmol) v DMSO. Reakční směs byla po dobu 2 h ponechána reagovat v temnu za stálého míchání. Vznik produktu byl sledován chromatograficky (Shimadzu 15 HPLC systém vybavený kolonou s reverzní fází Chromolith Performance RP-18e (100 x 4,6 mm) a UV-VIS detektoru Shimadzu SPD- lOAVvp (310 nm); eluent 5% acetonitril-95% acetonitril s gradientem 0 až 95 % obj. 95% acetonitrilu, průtok 1 mi min ') z úbytku výchozího množství DBCO-MI. Produkt byl přečištěn kolonovou chromatografií (Sephadex LH20, methanol). Frakce se vzorkem byla odpařena za vakua a produkt byl lyofilizován z vodného roztoku. Výtěžek 93 % 20 (12,7 mg).
- 19CZ 309828 B6
Stejným způsobem byly zavedeny maleinimidové koncové skupiny na všechny fluorescenční polymery připravené v příkladu 4 a 5.
Příklad 7: Příprava fluorescenčního polymeru rGft-poly(HPMA-ko-MA-βAla-Dy-49G)-TT pomocí click reakce
raft-poly(HPMAAo-MA-^Ala-Dy-490)-TT
Fluorescenční polymer raft-poly(HPMA-&o-MA-/Ala-Dy-490)-TT byl připraven click reakcí azidové skupiny přítomné na konci polymerního řetězce raft-poly(HPMA Ao-MA-/ÍAIa-Dy-490)N3 (příklad 4) a dibenzocyklooktyn-karboxylu (DBCO-Cbx), který byl následně modifikován thiazolidin-2-thionem. Výchozí fluorescenční polymer (15,0 mg, 0,61 pmol) byl rozpuštěn vbezvodém DMSO (120 pl) a byl k němu přidán roztok DBCO-Cbx (0,47 mg, 1,52 pmol) v DMSO. Reakční směs byla po dobu 2 h ponechána reagovat v temnu za stálého míchání. Vznik produktu byl sledován chromatograficky (Shimadzu HPLC systém vybavený kolonou s reverzní fází Chromolith Performance RP-18e (100 x 4,6 mm) a UV-VIS detektoru Shimadzu SPDlOAVvp (310 nm); eluent 5% acetonitril-95% acetonitril s gradientem 0 až 95 % obj. 95% acetonitrilu, průtok 1 mi min1) z úbytku výchozího množství DBCO-Cbx. Následně byl k reakční směsi přidán A-(3-dimethylaminopropyl)-A'-ethylkarbodiimid hydrochlorid (44 mg, 2,31 pmol), thiazolidin-2-thion (0,22 mg, 1,93 pmol) a katalytické množství dimethylaminopyridinu. Reakční směs byla po dobu 2 h ponechána reagovat v temnu za stálého míchání. Produkt byl přečištěn kolonovou chromatografií (Sephadex LH20, methanol) Frakce se
-20CZ 309828 B6 vzorkem byla odpařena za vakua a produkt byl vysrážen postupem popsaným v příkladu 1 a 2. Obsah TT byl stanoven spektrofotometricky. Výtěžek 88 % (13,2 mg), obsah TT 0,92 % mol. Stejným způsobem byly zavedeny TT koncové skupiny na všechny fluorescenční polymery připravené v příkladu 4 a 5.
Příklad 8: Příprava fluorescenčního polymeru rcft-poly(HPMA-ko-MA-βAla-Dy-49G)-Nhydroxysukcinimidylesteru pomocí click reakce
raft-poly(HPMAVo-MA^AIa-Dy-490)-NHS
Fluorescenční polymer raft-poly(HPMA-Áz>-MA-/AJa-Dy-490)-7V-hydroxysukcin-imidylester byl připraven click reakcí azidové skupiny přítomné na konci polymerního řetězce raft-poly(HPMA£o-MA-^Ala-Dy-490)-N3 (Příklad 4) a dibenzocyklooktyn-V-hydroxysukcinimidylesteru (DBCO-NHS). Výchozí fluorescenční polymer (12,0 mg, 0,49 pmol) byl rozpuštěn v bezvodém DMSO (90 μΐ) a byl kněmu přidán roztok DBCO-NHS (0,49 mg, 1,22 pmol) v DMSO. Reakční směs byla po dobu 2 h ponechána reagovat v temnu za stálého míchání. Vznik produktu byl sledován chromatograficky (Shimadzu HPLC systém vybavený kolonou s reverzní fází Chromolith Performance RP-18e (100 x 4,6 mm) a UV-VIS detektoru Shimadzu SPD- lOAVvp (310 nm); eluent 5% acetonitril-95% acetonitril s gradientem 0-95 % obj. 95% acetonitrilu, průtok 1 mi min1) z úbytku výchozího množství DBCO-NHS. Produkt byl přečištěn kolonovou chromatografií (Sephadex LH20, methanol). Frakce se vzorkem byla odpařena za vakua a produkt byl vysrážen postupem popsaným v příkladu 1 a 2. Stejným způsobem byly zavedeny NHS koncové skupiny na všechny fluorescenční polymery připravené v příkladu 4 a 5.
-21 CZ 309828 B6
Příklad 9: Příprava fluorescenční sondy s navázanou monoklonální protilátkou anti-CD20 pomocí aminolytické reakce
Fluorescenční sonda PSI s navázanou monoklonální protilátkou anti-CD20 byla připravena pomocí aminolytické reakce koncových TT skupin přítomných na fluorescenčních polymerech (příklad 7) a aminoskupin přítomných na molekule protilátky. Roztok monoklonální protilátky anti-CD20 byl přidán k fluorescenčnímu polymeru v molárním poměru anti-CD20 : fluorescenční polymer = 1 : 20. Reakční směs byla za stálého míchání ponechána reagovat v temnu 5 min, produkt byl odsolen na kolonce PD10 (Sephadex G25) ve vodě a zlyofilizován. Přítomnost vzniklé fluorescenční sondy byla potvrzena pomocí rozměrově vylučovací chromatografie (SEC) na koloně Superose6 v 0,3M octanovém pufru o pH 6,5. Podle stejného postupu byla připravena fluorescenční sonda PS2 s navázanou monoklonální protilátkou a fluorescenčním polymerem, který obsahuje koncové A-hydroxysukcinimidyloesterové skupiny (příklad 8). Obdobně byly připraveny fluorescenční sondy z dalších monoklonálních protilátek.
Příklad 10: Redukce disufidických můstků přítomných v molekule monoklonálníprotilátky antiCD3pomocí dithiothreitolu (DTl)
Redukce disulfidických můstků byla prováděna za přítomnosti dithiothreitolu v reakčním fosfátovém pufru (0,1 M fosfátový pufr, 10 mM EDTA; pH 7), který byl před použitím probubláván argonem po dobu 30 minut. K roztoku monoklonální protilátky anti-CD3 (0,028 pmol; OKT-3) byl přidán dithiothreitol (1,54 mmol; DTT) a směs byla ponechána reagovat za stálého míchání po dobu 5 minut. Produkt byl přečištěn na kolonce PD10 (Sephadex G25) v reakčním pufru. Takto připravená monoklonální protilátka anti-CD3 byla ihned konjugována s fluorescenčním polymerem připraveným podle příkladu 6. Charakterizace: obsah sulfhydrylových skupin ~ 9,8.
Podle postupu v příkladu 10 byly analogicky připraveny další redukované monoklonální protilátky, například anti-CD-4, anti-CD-20, anti-CD-8, anti-CD45, anti-Thyl,2, anti-MHC II, anti JNK.
Příklad 11: Příprava polymerní sondy s navázanou monoklonální protilátkou anti-CD3 pomocí click reakce
Fluorescenční sonda PS3 s navázanou monoklonální protilátkou anti-CD3 byla připravena pomocí click reakce koncových maleinimidových skupin přítomných na fluorescenčních polymerech (příklad 6) a sulfhydrylových skupin přítomných na redukované protilátce (příklad 10). Roztok přečištěné redukované monoklonální protilátky anti-CD3 byl přidán k fluorescenčnímu polymeru v molárním poměru anti-CD3 : fluorescenční polymer =1:9. Reakční směs byla za stálého míchání ponechána reagovat v temnu 5 min, produkt byl odsolen na kolonce PD10 (Sephadex G25) ve vodě a zlyofilizován. Přítomnost vzniklé fluorescenční sondy byla potvrzena pomocí rozměrově vylučovací chromatografie (SEC) na koloně Superose 6
-22CZ 309828 B6 v 0,3M octanovém pufru o pH 6,5. Chromatografický GPC záznam fluorescenční sondy je uveden na obr. 1. Podle stejného postupu byly připraveny fluorescenční sondy PS4 až PS6 z dalších monoklonálních protilátek.
Příklad 12: Modifikace sufhydrylových skupin přítomných v molekule monoklonální protilátky anti-CD3 click reakce
Na sulfhydrylové skupiny přítomné na redukované protilátce (příklad 10) byly zavedeny DBCOskupiny pro vazbu fluorescenčních polymerů s koncovou azidovou skupinou (příklad 4 a 5) pomocí sulfodibenzocyklooktyn-maleinimidem (sDBCO-MI). Vazba sDBCO-MI byla prováděna v reakčním fosfátovém pufru (0,1 M fosfátový pufr, 10 mM EDTA; pH 7), který byl před použitím probubláván argonem po dobu 30 minut. K roztoku monoklonální protilátky anti-CD3 (0,034 μmol; OKT-3) byl přidán sDBCO-MI (0,69 μmol) a směs byla ponechána reagovat za stálého míchání po dobu 60 minut. Produkt byl přečištěn na kolonce PD10 (Sephadex G25) v destilované vodě a lyofilizován. Takto připravená modifikovaná monoklonální protilátka antiCD3 byla použita pro konjugaci s fluorescenčním polymerem podle příkladu 14.
Podle tohoto postupu byly analogicky připraveny další monoklonální protilátky s modifikovanými sulfhydrylovými skupinami.
Příklad 13: Modifikace aminoskupin přítomných v molekule monoklonálníprotilátky anti-CD3 click reakce
Aminoskupiny lysinových zbytků přítomných na protilátce byly modifikovány pro vazbu fluorescenčních polymerů s koncovou azidovou skupinou (příklad 4 a 5) pomocí dibenzocyklooktyn-N-hydroxysukcinimidylesteru (DBCO-NHS). Vazba DBCO-NHS byla prováděna v reakčním fosfátovém pufru (0,1 M fosfátový pufr, 10 mM EDTA; pH 7). K roztoku monoklonální protilátky anti-CD3 (0,034 pmol; OKT-3) byl přidán roztok DBCO-NHS (6,80 pmol) v DMSO a směs byla ponechána reagovat za stálého míchání po dobu 60 minut. Produkt byl přečištěn na kolonce PD10 (Sephadex G25) v destilované vodě a lyofilizován. Takto připravená modifikovaná monoklonální protilátka anti-CD3 byla použita pro konjugaci s fluorescenčním polymerem připraveným podle příkladu 4 a 5.
Podle tohoto postupu byly analogicky připraveny další monoklonální protilátky s modifikovanými aminoskupinami.
Příklad 14: Příprava fluorescenční sondy s navázanou monoklonální protilátkou anti-CD3 pomocí click reakce
Fluorescenční sondy PS7 a PS8 s navázanou monoklonální protilátkou anti-CD3 byly připraveny pomocí click reakce koncových azidových skupin přítomných na fluorescenčních polymerech (příklad 4 a 5) a DBCO-skupin zavedených na molekuly protilátek (příklad 12 a 13). Roztok monoklonální protilátky anti-CD3 v pufru (0,1M fosfátový pufr, 10 mM EDTA, pH 7) byl přidán k fluorescenčnímu polymeru v molárním poměru anti-CD3 : fluorescenční polymer = 1 : 20. Reakční směs byla za stálého míchání ponechána reagovat v temnu 5 min, produkt byl odsolen na kolonce PD10 (Sephadex G25) ve vodě a zlyofilizován. Přítomnost vzniklé fluorescenční sondy byla potvrzena pomocí rozměrově vylučovací chromatografie (SEC) na koloně Superose 6 v 0,3M octanovém pufru o pH 6,5. Podle stejného postupu byly připraveny fluorescenční sondy s dalšími protilátkami a fluorofory.
- 23 CZ 309828 B6
Tabulka 5 Přehled a charakterizace připravených typů fluorescenčních sond.
| fluorescen ční sonda | koncová skupina na polymeru | protilátka | reaktivní skupiny na protilátce | počet polymerních řetězců na protilátce | počet fluoroforů na PS | zdánlivá molární hmotnost4 |
| PS1 | TT | anti-CD3 | Lys-NH2 | 4,3 | 18,5 | 255 000 |
| PS2 | NHS | anti-CD3 | Lys-NH2 | 3,9 | 20,3 | 245 000 |
| PS3 | MI | anti-CD3 | Cys-SH1 | 6,2 | 26,0 | 303 000 |
| PS4 | MI | anti-CD4 | Cys-SH1 | 7,2 | 33,8 | 329 000 |
| PS5 | MI | anti-CD8 | Cys-SH1 | 8,1 | 43,7 | 352 000 |
| PS6 | MI | anti-CD20 | Cys-SH1 | 6,5 | 28,6 | 311 000 |
| PS7 | N3 | anti-CD3 | -DBCO2 | 5,7 | 26,2 | 290 000 |
| PS8 | N3 | anti-CD3 | -DBCO3 | 5,4 | 24,8 | 283 000 |
1 SH-skupiny byly získány redukcí disulfidických můstků.
2 DBCO-skupiny byly na protilátku zavedeny na SH-skupiny za použití sDBCO-maleinimidu.
3 DBCO-skupiny byly na protilátku zavedeny na NH2-skupiny za použití DBCO-NHS.
4 Zdánlivá molární hmotnost polymerní sondy byla stanovena jako součet molární hmotnosti protilátky a Mn polymerních řetězců navázaných na protilátce.
Příklad 15: Příprava fluorescenčního polymeru pro přípravu multispektrální fluorescenční nanosondy
Fluorescenční polymer pro přípravu multispektrální fluorescenční nanosondy byl připraven pomocí aminolytické reakce fluoroforů Dy-490 a Dy-647P1 s příslušným polymerním prekurzorem. Vhodné deriváty Dy-490 a Dy-647P1 byly do reakční směsi přidány v molárním poměru 1:1 postupně po 5 minutách. Následující postup práce byl stejný jako v příkladech 4, 5 a 6. Charakterizace: obsah fluoroforů: Dy-409 ~ 0,45 % mol.; Dy-647P1 ~ 0,40 % mol. Molární poměr fluoroforů: 1,15 : 1.
Podle postupu v příkladu 15 byly analogicky připraveny další fluorescenční polymery pro přípravu multispektrálních fluorescenčních nanosond s různými fluorofory a jejich vzájemnými molárními poměry. Jejich excitační vlnové délky byly v rozsahu 300 až 850 nm a emisní vlnové délky v rozsahu 350 až 1200 nm. Obsah fluoroforů byl v intervalu od 0,2 do 3 % mol. Viz tabulka 6. Stejným způsobem byly připraveny i ostatní fluorescenční polymery obsahující dvojice fluoroforů.
- 24 CZ 309828 B6
Tabulka 6: Fyzikálně-chemická charakterizace fluorescenčních polymerů pro přípravu multispektrální fluorescenční sondy připravených podle příkladu 15.
| Vzore k | fluorofor 1 (FL1) | fluorofor 2 (FL2) | poměr FL1:F L2 | ||||
| název | ex/em | obsah (% mol.) | název | ex/em | obsah (% mol.) | ||
| 15-1 | Dy-490 | 490/515 | 0,55 | Dy-647P1 | 650/670 | 1,49 | 1:2,7 |
| 15-2 | Dy-490 | 490/515 | 1,45 | Dy-647P1 | 650/670 | 0,28 | 5,2:1 |
| 15-3 | Dy-490 | 490/515 | 0,20 | Dy-647P1 | 650/670 | 2,06 | 1:10,8 |
| 15-4 | Dy-490 | 490/515 | 2,76 | Dy-647P1 | 650/670 | 0,48 | 1:5,8 |
| 15-5 | Dy-396XL | 396/576 | 0,38 | Dy-647P1 | 650/670 | 0,43 | 1:1,1 |
| 15-6 | Dy-396XL | 396/576 | 0,54 | Dy-647P1 | 650/670 | 1,66 | 1:3,1 |
| 15-7 | Dy-396XL | 396/576 | 1,56 | Dy-647P1 | 650/670 | 0,47 | 3,3:1 |
Příklad 16: Příprava multispektrální fluorescenční nanosondy za pomoci fluorescenčního polymeru a redukované monoklonálníprotilátky anti-CD3
Multispektrální fluorescenční nanosonda byla připravena konjugací fluorescenčního polymeru (příklad 15) a redukované monokonální protilátky anti-CD3 (příklad 10) podle postupu uvedeného v příkladu 11.
Příklad 17: Příklad charakterizace fluorescenčních polymerů a fluorescenčních sond
Připravené kopolymery, fluorescenční polymery i fluorescenční sondy s monoklonálními protilátkami byly charakterizovány stanovením váhového i početního průměru molárních hmotností (Mw, Mn) a příslušného indexu polydisperzity (D) pomocí rozměrově vylučovací chromatografie (SEC) na systému vybaveném UV detektorem (Shimadzu, Japan), RI detektorem (Optilab REX, Wyatt Technology Corp., USA) a víceúhlovým detektorem rozptylu světla (DAWN Heleos-II, Wyatt Technology Corp., USA). Pro charakterizaci byla v případě SEC použita kolona TSK 3000 Super SW a jako mobilní fáze směs MeOH (80 %) a 0,3M octanového pufru o pH 6,5 (20 %), v případě charakterizace sond s monoklonálními protilátkami byla použita kolona Superose 6 a jako mobilní fáze 0,3M octanový pufr o pH 6,5. Koncentrace vzorků byla ve všech případech 3 mg/ml.
Obsah TT- a NH2-skupin, zakopolymerovaných statisticky podél polymerního řetězce, byl stanoven spektrofotometricky. Všechna měření byla prováděna na UV-VIS spektrofotometru Specord 205 (Analytik Jena, Německo). Obsah TT-skupin byl stanoven podle literatury (Šubr, V.; Koňák, Č.; Laga, R.; Ulbrich, K. Biomacromolecules 2006, 7(1): 122-130) v methanolu (e305 = 10 800 l-mol-1· cm-1). Obsah aminových skupin (po deprotekci v destilované vodě při 150 °C v zatavené polymerizační ampuli) byl stanoven dle metody popsané ve Fields R.
Methods Enzymol. 1972; 25: 464-468 (e420 = 11 550 l-mol-1 -cm-1). Obsah navázaných fluoroforů
- 25 CZ 309828 B6 byl stanoven spektrofotometricky.
Příklad 18: Vliv času reakce na funkci fluorescenční sondy
Fluorescenční polymer (polymerní prekurzor s fluorescenční značkou FITC podle příkladu 5 a 6) byl použit pro konjugaci s monoklonální protilátkou CD20-RTX po dobu 5 min. (A), 10 min. (B), 15 min. (C) a 30 min. (D). Fluorescenční polymer s FITC a protilátka byly inkubovány 15 minut se vzorkem lidské periferní krve běžnou procedurou (inkubace s protilátkou, lyzace erytrocytů roztokem chloridu amonného a centrifugace). Připravená suspenze buněk byla změřena průtokovým cytometrem (BD Celesta, excitace 488 nm laserem a detekce emise v pásmu 530/30 nm). Všechny testované časy vedly ke stejně výrazné intenzitě fluorescence CD20-RTX FITC (obr. 2), která byla srovnatelná s komerčně dostupnými reagenciemi CD20 FITC.
Krevní vzorek obsahuje dle očekávání směs T-lymfocytů, NK buněk a B-lymfocytů, přičemž pouze B-lymfocyty nesou na povrchu molekulu CD20, která je detekována polymerní sondou a reprezentovaná pozitivním vrcholem v pravé části grafu. Negativní signál v levé části obrázku patří T-lymfocytům a NK buňkám, které CD20 znak nenesou. Fluorescenční sonda tedy poskytuje očekávaný výsledek při extrémně krátké době konjugace. Výsledná polymerní fluorescenční sonda je použitelná pro detekci lidských buněk nesoucích protilátkou cílenou molekulu.
Příklad 19: Příklad použití konjugační sady pro značení protilátek
Konjugační sada pro značení protilátek se skládá z fluorescenčních polymerů, které nesou podél řetězce různé fluorescenční značky (příklad 4 a 5) a koncové maleinimidové skupiny. Dále obsahuje reakční pufr (0,1M fosfátový pufr, 10 mM EDTA, pH 7), dithiothreitol (DTT) a kolonky obsahující zesíťovaný dextran o molekulové hmotnosti 100 až 5000 g/mol (Sephadex G-25) o objemu 0,8 ml (PD SpinTrap G-25), která je vhodná pro centrifugační separaci vysokomolekulárních látek od nízkomolekulárních příměsí. Postup spočívá ve dvou základních krocích:
A. Redukce monoklonální protilátky a odstranění DTT z reakční směsi. 150 μg monoklonální protilátky bylo rozpuštěno ve 100 μl reakčního pufru a přidáno 231 μg DTT v 50 μl reakčním pufru. Reakční směs byla ponechána reagovat za podmínek uvedených v Příkladu 10. Produkt (150 μg redukované monoklonální protilátky ve 150 μl reakčního pufru) byl přečištěn na kolonce PD SpinTrap G-25 a v dalším kroku přidán k fluorescenčnímu polymeru.
B. Konjugace redukované monoklonální protilátky s fluorescenčním polymerem. Redukovaná monoklonální protilátka byla konjugována s fluorescenčním polymerem v molárním poměru 1 : 9 (150 μg redukované monoklonální protilátky a 260 μg fluorescenčního polymeru o Mn = 27 800 g/mol) podle postupu uvedeného v příkladu 11. Směs byla nechána reagovat po dobu 5 minut a následně byl vzniklý produkt použit pro cytometrickou analýzu.
Pomocí takové konjugační sady je možné označit také vlastní proteinové struktury, které mají ve své molekule vhodné funkční skupiny (viz obr. 9).
Příklad 20: Variabilní konstrukce polymerních fluorescenčních sond
Bylo připraveno několik konjugačních sad, které sestávají z fluorescenčního polymeru s fluorescenční značkou (fluoroforem) o různých excitačních a emisních charakteristikách (Dy396XL; Dy395XL; s Dy682; Dy410; Dy480XL). Rychlou konjugací s protilátkou CD3 OKT3 anebo s CD20 RTX jsme připravili polymerní fluorescenční sondy. Tyto sondy byly inkubovány 15 minut se vzorky lidské periferní krve běžnou procedurou. Připravená suspenze buněk byla změřena průtokovým cytometrem BD Celesta, s excitací 488 nm, 405 nm anebo 640 nm
- 26 CZ 309828 B6 a detekce emise v pásmech uvedených v popisku osy x na Obrázku 3. Všechny připravené a testované polymerní fluorescenční sondy vedly k očekávanému profilu značení vzorku lymfocytů, CD3 na T-lymfocytech a CD20 na B-lymfocytech. Separace pozitivních a negativních buněk byla variabilní podle zvoleného fluoroforu a efektivity jeho excitace dostupnými lasery. Polymerní fluorescenční sondy umožňují detekci buněk nesoucích cílovou molekulu. Variabilita konjugační sady umožňuje flexibilitu výběru protilátky dle potřeb uživatele, tyto polymerní fluorescenční sondy lze detekovat v různých kanálech průtokového cytometru a lze tedy zajistit optimální složení konjugátů protilátek na míru výzkumnému či diagnostickému úkolu.
Příklad 21: Multispektrální konjugační sady
Byly připraveny konjugační sady s vícebarevným spektrálním profilem. Fluorescenční polymer byl připraven navázáním směsi dvou fluoroforů Dy-490 a Dy-647P1 v různých poměrech podle příkladu 15. Zároveň byly připraveny fluorescenční polymery s jednotlivými fluorofory Dy-490 a Dy-647P1. Fluorescenční polymery byly konjugovány na protilátku CD8 OKT-8. Princip možnosti rozlišení partikulí označených jednotlivými typy polymerů s různými spektrálně odlišitelnými charakteristikami jsme otestovali pomocí částic UltraComp (Invitrogen) obarvených protilátkami konjugovanými s polymery obsahujícími fluorofory Dy-490 a Dy647P1 v různých poměrech a jednobarevnými polymery s Dy-490 a Dy-647P1. Částice byly inkubovány v šesti oddělených alikvotech s každým typem fluorescenčního polymeru a protilátky zvlášť. Měření jsme prováděli pomocí průtokového cytometru. Jako kontrolní neznačený vzorek jsme přidali UltraComp částice bez inkubace s polymerní fluorescenční sondou. Jak dokumentuje obrázek 4, jednotlivé typy spektrálně unikátních polymerů je možné odlišit jako oddělené skupiny částic stejných charakteristik (odlišeno v obrázku 4). Tímto způsobem lze tedy označit různé typy částic (tzv. barcoding) pro efektivní analýzy směsí vzorků pomocí mnohobarevných panelů protilátek. Kombinací pouhých dvou fluoroforů umožňuje odlišit šest typů barcodu. Bylo zdokumentováno úspěšné použití multispektrálních fluorescenčních sond pro odlišení šesti původních vzorků v pouhých dvou detekčních kanálech průtokového cytometru.
Příklad 22: Fyziologické sondy
Protilátky anti-CD71 a anti-MHCII byly označeny kombinací fluorescenčních polymerů nesoucích kombinaci dvou fluoroforů (příklad 4, 5 a 6). Jedním fluoroforem je FITC, u kterého dochází ke snížení fluorescence v prostředí s nižším pH, a druhým fluoroforem je Dyomics-615, který v rozsahu pH 3,5 až 9 vykazuje stabilní fluorescenci nezávislou na pH.
Izolované myší splenocyty (kmen Balb-C) byly homogenizovány a promyty v HBSS. Následně byly ochlazeny a při 4 °C 20 minut značeny s protilátkami. Následně promyty, převedeny do 37 °C do kultivačního média a v 10minutovém intervalu byly analyzovány na průtokovém cytometru BD LSR-II a jako parametr byl analyzován v čase poměr emise FITC vs. Dy-615.
Z obrázku 5 je zřejmá výrazná změna poměru emise fluoroforů s prodlužujícím se časem inkubace. Jak protilátka vstupuje do buňky, je internalizována do kyselých organel (lyzozómů, pozdní endozómů), kde klesá kvantový výtěžek emise FITC zatímco emise Dy-615 zůstává na výchozí úrovni. Rychle se intranalizující transferinový receptor (CD71) vykazuje rychlou změnu poměru fluorescencí, zatímco pomalu internalizující MHC-II ukazuje kontinuální pomalý pokles.
Tímto způsobem je možné velice přesně monitorovat rychlost internalizace povrchových struktur v závislosti na použité protilátce a vypočítat a analyzovat kinetiku pohlcení a přechod do kyselých intracelulárních kompartmentů a to buď pomocí průtokové cytometrie nebo pomocí kvantitativních zobrazovacích technik.
Příklad 23: Mikroskopie
Protilátka anti mouse-CD45 (CapricoBio, USA) byla označena pomocí fluorescenčního polymeru
- 27 CZ 309828 B6 nesoucího Dy-485XL (příklad 4 a 6) a protilátka anti-mouse CD8 (CapricoBio, USA) byla označena pomocí fluorescenčního polymeru nesoucího Dy-395XL (příklad 4 a 6).
Tkáně sleziny byly sekcí vyňaty z usmrcených myší kmene Balb/C, nařezány na malé kousky, vloženy do OCT zmrazovacího média (Sakura Finetek, Torrance, CA) a uloženy při -80 ° C. Tkáňové řezy (8 μm silné) byly fixovány v chlazeném acetonu po dobu 5 minut, osušeny na vzduchu, promyty studeným PBS a blokovány 10% normálním koňským sérem (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) po dobu 30 minut při pokojové teplotě (RT). Značení protilátkami probíhalo při 4 °C 20 minut s připravenou směsí obou protilátek současně. Po promytí studeným PBS byly fixovány 1% paraformaldehydem a přeneseny do vodného média obsahujícího DAPI (Sigma) a vizualizovány na mikroskopu Olympus FV-1000 v příslušných vlnových délkách (Dy-485XL Ex 480nm a Em 570/40nm, Dy-395XL Ex 405nm a Em 570/40nm).
Na obrázku 6 jsou jasně vidět zeleně označené populace lymfocytů (anti-CD45) a červeně označené T-buňky (anti-CD8), jádra všech buněk v preparátu jsou označena modře DAPI.
Obě uživatelsky značené protilátky tak lze úspěšně použít i v kombinaci pro multiplexní analýzu preparátů pro fluorescenční mikroskopii.
Příklad 24: Western Blot
Protilátka anti JNK byla označena pomocí konjugační sady využívající fluorescenční polymery nesoucí fluorofor Dy-701 (příklad 4 a 6).
Buněčné lyzáty byly separovány na 12% SDS - PAGE, přeneseny na nitrocelulózové membrány a blokovány v 5% odtučněném mléce v PBS-T. Membrána byla inkubována s neznačenou králičí anti JNK protilátkou nebo s anti-JNK protilátkou označenou fluorescenčním polymerem nesoucím fluorofor Dy-701. Sekundární protilátka použitá pro vizualizaci membrány označené neznačenou protilátkou byla IRDye IRDye 800 (anti králík). Detekce a kvantifikace byla provedena pomocí infračerveného zobrazovacího systému Odyssey (LI-Cor Biosystems).
Z obrázku 7 je patrné, že protilátka značená přímo pomocí konjugační sady (obr. 7B.) dosahuje identických výsledků jako využití sekundární profesionálně značené protilátky (obr. 7A.).
Příklad 25: In vivo imaging
Protilátka anti mouse Thy 1,2 byla označena pomocí konjugační sady využívající fluorescenční polymer nesoucí fluorofor Dy-701 (příklad 4 a 6). Celkem 1·106 buněk myšího thymomu EL-4 bylo subkutánně injikováno do pravého boku myší NuNu a byl zaznamenán růst nádoru.
Zobrazování in vivo bylo prováděno na OV100 Whole Mouse System (Olympus Corp.) obsahujícím světelný zdroj MT-20 a CCD kameru Orca II ERG (Hamamatsu, Japonsko). Zvířata byla anestetizována intraperitoneální injekcí 300 pl na myš 1% Narkamonu. Zobrazování růstu nádoru bylo neinvazivní, pozorování akumulace specifické protilátky v nádorové mase bylo prováděno přes pokožku překrývající nádor. Fluorescence protilátky specificky značící nádorové buňky byla vizualizována pomocí specifických filtrů (Ex 700 nm, Em 750/40). Snímky byly pořizovány samostatně pro fluorescenční kanál a pro odražené světlo, sloučeny a obarveny v softwaru AnalySIS 3.2.822 (SIS Systems).
Obrázek 8 jednoznačně ukazuje akumulaci fluorescence v mase nádoru detekovatelnou již po 12 hodinách po podání značené fluorescenční sondy. Lokalizace fluorescenčního signálu až po periferii nádoru pak jednoznačně umožňuje lokalizovat nádor a vymezit přesně jeho hranice.
- 28 CZ 309828 B6
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (16)
1. Fluorescenční polymer, obsahující semitelechelický statistický lineární kopolymer, na který je navázána alespoň jedna fluorescenční značka v množství od 0,4 do 12 % mol., vztaženo na počet monomerní ch j ednotek, přičemž semitelechelický statistický lineární kopolymer obsahuje polyakrylamid, polymethakrylamid, nebo poly(V-(2-hydroxypropyl)methakrylamid), ve kterém je od 0,4 do 12 % mol. monomerních jednotek nahrazeno monomerní jednotkou obecného vzorce I
kde
R je vybraný ze skupiny sestávající z lineárního nebo rozvětveného uhlíkového alkylenylového řetězce s počtem uhlíků od 1 do 6; přičemž R může být dále substituován jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;
Y je vybraný ze skupiny sestávající z vazby, -C(=O)-NH-, -NH-C(=O)-, -NH-C(=S)-NH-; přičemž molekulová hmotnost Mn semitelechelického statistického lineárního kopolymeru je v rozmezí od 10 000 do 100 000 g/mol;
a přičemž fluorescenční značka má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1500 g/mol, excitační vlnovou délku v rozmezí od 300 do 850 nm a emisní vlnovou délku v rozmezí od 350 do 1200 nm a je kovalentně vázaná v monomerní jednotce obecného vzorce I semitelechelického statistického lineárního kopolymeru pomocí terminálního aminu nebo thiokyanátu nebo Nhydroxysukcinimidového esteru, přičemž skupiny vzniklé po navázání fluorescenční značky jsou následně součástí skupiny Y;
a přičemž fluorescenční polymer obsahuje na jednom konci polymerního řetězce fůnkční skupinu pro navázání na proteinovou strukturu, vybranou ze skupiny zahrnující estery, s výhodou Nhydroxysukcinimidylový ester nebo (Cl až C4) alkylestery, amidy, s výhodou thiozolidin-2thionový amid, maleimid, azid, propargyl, s výhodou je touto fůnkční skupinou azid nebo maleimid.
2. Fluorescenční polymer podle nároku 1, kde semitelechelický statistický lineární kopolymer obsahuje poly(A-(2-hydroxypropyl)methakrylamid), ve kterém je od 0,4 do 12 % mol. monomerních jednotek nahrazeno monomerní jednotkou obecného vzorce I.
3. Fluorescenční polymer podle nároku 1 nebo 2, kde R je vybraný ze skupiny zahrnující ethan1,2-diyl; propan-1,3-diyl; hexan-1,6-diyl.
4. Fluorescenční polymer podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 3, který dále obsahuje do 11,6 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce II, vztaženo na počet monomerních jednotek,
-29CZ 309828 B6
Z (Π), kde R je definováno v nároku 1 a Z je vybrané ze skupiny zahrnující -C(=O)-NH-(CH2)aCH2(OH); -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)-CH3; -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)-(CH2)c-CH3; kde a je celé číslo od 0 do 4, Z? je celé číslo od 0 do 3 a c je od 1 do nebo 4; -NH-C(=O)-CH3;
přičemž celkem je monomerních jednotek obecného vzorce I a II ve fluorescenčním polymeru nejvýše 12 % mol., vztaženo na počet monomerních jednotek.
5. Fluorescenční polymer podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 4, kde fluorescenční značka je vybraná ze skupiny zahrnující fluorescein, fluoresceinisothiokyanát, deriváty ruthenium bipyridinových komplexů Ru(bpy)3, zejména bis(2,2'-bipyridin)-[4-(4'-methyl-2,2l-bipyridin-4yl)butan-l-aminiumruthenium tris(perchlorát), cyaniny, 3,6-diamino-9-[4-(2aminoethylkarbamoyl)-2-karboxyfenyl]-5-(3-sulfonátopropylsulfamoyl)xanthen-10-ium-4sulfonát, (2E)-1 -(6-(2,5-dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy-6-oxohcxyl]-2-((2E,4E)-5-[ I -(2-mcthoxycthyl)3,3-dimethyl-5-sulfonátoindol-l-ium-2-yl]penta-2,4-dienyliden]-3,3-dimethylindolin-5-sulfonát, 3[4-[(5)-2-[6-[6-(2-aminoethylamino)-6-oxohexoxy]-l,3-benzoxazol-2-yl]vinyl]-l-pyridyl]propan1 -sulfonát, 3 - [4- [6- [[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy-6-oxohexyl]karbamoylamino] -1,3- benzoxazol-2-yl]pyridin-1 -ium-1 -yl]propan-1 -sulfonát, 3-[[6-(2-azaniumylethylamino)-6-oxohexyl]karbamoyl] -8-chloro-7-hydroxy-2-oxochromen-6-sulfonát, 3 - [4- [7- [ [ 6 - (2 aminoethylamino)-6-oxohexyl]-ethylamino]-2-oxochromen-3-yl]pyridin-1 -ium-1 -yl]propan-1 sulfonát, l-[6-(2-aminoethylamino)-6-oxohexyl]-6-[(5)-2-[7-(diethylamino)-2-oxochromen-3yl]vinyl]pyridin-1 -ium-3 -sulfonát, 1 - [6-(2-aminoethylamino)-6-oxohexyl] -4-((5)-2-(7(diethylamino)-2-oxochromen-3-yl]vinyl]pyridin-l-ium-3-sulfonát, (25)-2-[(5)-3-(7-amino-2-tercbutylchromenylium-4-yl)prop-2-enyliden]-l-[6-(2-aminoethylamino)-6-oxohexyl]-3,3dimethylindolin-5-sulfonát, (2Z)-3-[4-(2-aminoetiiylamino)-4-oxobutyl]-2-[(5)-3-[4-terc-butyl-7[ethyl(3-sulfonátopropyl)amino]chromenylium-2-yl]prop-2-enyliden]-3-methyl-l-(3sulfonátopropyl)indolin-5-sulfonát a (2Z)-3-[4-(2-aminocthylamino)-4-oxobutyl]-2-[(E)-3-[7(diethylamino)-3-methyl-4-fenylchromenylium-2-yl]prop-2-enyliden]-3-methyl-l-(3sulfonátopropyl)indolin-5-sulfonát, popřípadě jejich deriváty obsahující fůnkční skupinu, vybranou z amino skupiny, isothiokyanátové skupiny a X-hydroxysukcinimidové skupiny.
6. Fluorescenční polymer podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 5, který obsahuje alespoň dvě různé fluorescenční značky.
7. Fluorescenční sonda, vyznačená tím, že obsahuje alespoň jeden fluorescenční polymer podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, ke kterému je kovalentně přes koncovou skupinu lineárního polymerního řetězce navázána proteinová struktura, vybraná ze skupiny sestávající z peptidu o počtu aminokyselin od 10 do 200, proteinu, lipoproteinu, protilátky, enzymu, hormonu nebo buněčného receptoru, s výhodou je proteinovou strukturou monoklonální protilátka a fluorescenční polymer je kovalentně navázán na lehký řetězec této monoklonální protilátky, výhodněji na lehký řetězec monoklonální protilátky vybrané ze skupiny zahrnující anti-CD20, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD71, anti-MHCII, anti-CD45, anti-JNK.
-30CZ 309828 B6
8. Způsob přípravy fluorescenční sondy podle nároku 7, vyznačený tím, že obsahuje následující kroky:
a) poskytnutí monomerů semitelechelického lineárního kopolymeru, vybraných ze skupiny, zahrnující V-(2-hydroxypropyl)methakrylamid, akrylamid, methakrylamid; a monomerů obecného vzorce IV
kde R je vybraný ze skupiny sestávající z lineárního nebo rozvětveného uhlíkového alkylenylového řetězce s počtem uhlíků od 1 do 6; přičemž R může být dále substituován jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;
a X je -karbonyl-thiazolin-2-thionová skupina nebo -NH2 skupina, přičemž -NH2 skupina může být popřípadě chráněná chránící skupinou;
b) polymerace monomerů za vzniku semitelechelického lineárního kopolymeru, c) navázání fluorescenční značky na semitelechelický lineární kopolymer za vzniku fluorescenčního polymeru,
d) volitelně modifikace proteinové struktury,
e) navázání proteinové struktury na fluorescenční polymer.
9. Způsob přípravy fluorescenční sondy podle nároku 8, vyznačený tím, že krok b) polymerace monomerů se provede řízenou radikálovou RAFT polymerizací monomerů z kroku a) s obsahem od 0,4 do 12 % mol. monomeru obecného vzorce IV, a alespoň 88 % mol. monomerních jednotek, vybraných ze skupiny zahrnující V-(2-hydroxypropyl)methakrylamid, akrylamid, methakrylamid, přičemž polymerace se provede při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C a v rozpouštědle, s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující:
dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydro furan, propanol, terc-butanol nebo jejich směsi;
za iniciace iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující 2,2'-azobis[V-(2karboxyethyl)-2-methylpropionamidin] a V-(3-azidopropyl)-4-[(Z)-[4-(3-azidopropylamino)-1 kyano-1 -methyl-4-oxobutyl]azo]-4-kyanopentanamid;
popřípadě za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou ,V-(3-azidopropyl)-4ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-4-methylpentanamidu;
popřípadě se následně odstraní chránící skupiny na aminových skupinách postranních řetězců.
10. Způsob přípravy fluorescenční sondy podle nároku 8 nebo 9, vyznačený tím, že krok c) navázání fluorescenční značky na semitelechelický lineární kopolymer se provede konjugací volných aminových skupin nebo karbonyl-thiazolidin-2-thionových skupin monomerních jednotek obecného vzorce IV semitelechelického lineárního kopolymeru s fluorescenční značkou, obsahující reaktivní aminovou nebo SCN skupinu, přičemž fluorescenční značka má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1500 g/mol, excitační vlnovou délku v rozmezí od 300 do 850 nm a emisní vlnovou délku v rozmezí od 350 do 1200 nm; a přičemž fluorescenční značka se k semitelechelickému lineárnímu kopolymeru naváže amidovou nebo thioamidovou vazbou;
-31 CZ 309828 B6 popřípadě se nezreagované thiazolidin-2-thionové skupiny odstraní reakcí s aminoalkoholem, vybraným ze skupiny zahrnující NH2-(CH2)a-CH2(OH); NH2-(CH2)b-CH(OH)-CH3; NH2TCH2K CH(OH)-(CH2)c-CH3; kde a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 0 do 3 a c je od 1 do 4 a/nebo se nezreagované NH2 skupiny odstraní reakcí s acetythiazolidin-2-thionem;
popřípadě se výsledný fluorescenční polymer podrobí dalším reakcím, vedoucím ke změně reakční skupiny na konci semitelechelického řetězce, s výhodou klik reakci azidové skupiny s dibenzocyklooktyn-maleinimidem za vzniku maleinimidové funkční skupiny na jednom konci lineárního polymerního řetězce;
nebo klik reakci azidové skupiny s dibenzocyklooktyn-karboxylem a následně s thiazolidin-2 thionem za vzniku fluorescenčního polymeru s thiazolidin-2-thionovou funkční skupinou na jednom konci lineárního polymerního řetězce;
nebo klik reakci azidové skupiny s dibenzocyklooktyn-N-hydroxysukcinimidylesterem za vzniku fluorescenčního polymeru s N-hydroxysukcinimidylesterovou funkční skupinou na jednom konci lineárního polymerního řetězce.
11. Způsob přípravy fluorescenční sondy podle kteréhokoliv z nároků 8, 9 nebo 10, vyznačený tím, že krok d) modifikace proteinové struktury se provede redukcí disulfidických můstků proteinové struktury pomocí redukčního činidla vybraného ze skupiny dithiothreitol, tris(2karboxyethyl)fosfin, β-merkaptoethanol, glutathion, ve vodném pufru při pH od 6,5 do 7,5, při teplotě místnosti za vzniku -SH skupin v proteinové struktuře, které mohou být popřípadě dále modifikovány reakcí se sulfodibenzocyklooktyn-maleinimidem za vzniku sulfodibenzocyklooktynových skupin;
a/nebo se modifikují volné NH2 skupiny proteinové struktury na dibenzocyklooktynové skupiny reakcí s dibenzocyklooktyn-N-hydroxysukcinimidylesterem.
12. Způsob přípravy fluorescenční sondy podle kteréhokoliv z nároků 8, 9, 10 nebo 11, vyznačený tím, že krok e) navázání proteinové struktury na fluorescenční polymer se provede konjugací alespoň jednoho fluorescenčního polymeru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 a proteinové struktury, popřípadě proteinové struktury se zavedenými sulfhydrylovými, sulfodibenzocyklooktynovými nebo dibenzocyklooktynovými skupinami připravené v kroku d), přičemž reakce probíhá při teplotě místnosti ve vodném pufru a pH od 6,5 do 7,5.
13. Konjugační sada pro značení protilátek, vyznačená tím, že obsahuje fluorescenční polymer podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6; reakční pufr o pH 7, obsahující 0,1M fosfátový pufr a 10 mM EDTA; dithiothreitol a alespoň jednu kolonku o objemu v rozmezí od 0,5 do 2 ml, která obsahuje zesíťovaný dextran o molekulové hmotnosti 100 až 5000 g/mol.
14. Použití fluorescenčního polymeru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 a/nebo konjugační sady podle nároku 13, pro fluorescenční značení proteinových struktur vybraných ze skupiny peptid, protein, lipoprotein, protilátka, enzym, hormon, receptor, strukturní protein, transportní protein, protein buněčných signalizačních drah, syntetický protein.
15. Použití fluorescenčního polymeru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 a/nebo fluorescenčního sondy podle nároku 7, ve fluorescenčních zobrazovacích technikách, s výhodou vybraných ze skupiny zahrnující cytometrii, kuličkové assay, mikroskopii, western blot, fluorescenční průtokovou cytometrii.
- 32 CZ 309828 B6
16. Fluorescenční sonda podle nároku 7 pro použití jako kontrastní látky v lékařské diagnostice, celotělovém zobrazování a/nebo fluorescenčně asistované chirurgii, s výhodou při diagnostice nádorových, zánětlivých a bakteriálních onemocnění.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2019-627A CZ309828B6 (cs) | 2019-10-09 | 2019-10-09 | Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití |
| PCT/CZ2020/050078 WO2021069000A1 (en) | 2019-10-09 | 2020-10-09 | Fluorescent polymer, fluorescent probe and conjugation kit for advanced functional analysis of cells in haematology, immunology and microbiology, method of preparation and use thereof |
| EP20815710.7A EP4013834A1 (en) | 2019-10-09 | 2020-10-09 | Fluorescent polymer, fluorescent probe and conjugation kit for advanced functional analysis of cells in haematology, immunology and microbiology, method of preparation and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2019-627A CZ309828B6 (cs) | 2019-10-09 | 2019-10-09 | Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2019627A3 CZ2019627A3 (cs) | 2021-04-21 |
| CZ309828B6 true CZ309828B6 (cs) | 2023-11-15 |
Family
ID=75488671
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2019-627A CZ309828B6 (cs) | 2019-10-09 | 2019-10-09 | Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ309828B6 (cs) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003053473A2 (en) * | 2001-12-20 | 2003-07-03 | Zentiva, A.S. | Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline drug |
| WO2014041546A1 (en) * | 2012-09-13 | 2014-03-20 | Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority | Diagnostic agents with enhanced sensitivity/specificity |
| WO2015136545A1 (en) * | 2014-03-13 | 2015-09-17 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Polymeric systems and uses thereof in theranostic applications |
| CN106995516A (zh) * | 2016-01-22 | 2017-08-01 | 北京化工大学 | 肿瘤特异性富集的纳米载药体系及其制备方法 |
| WO2018071767A1 (en) * | 2016-10-14 | 2018-04-19 | University Of Utah Research Foundation | Antibody-polymer-drug conjugates |
-
2019
- 2019-10-09 CZ CZ2019-627A patent/CZ309828B6/cs unknown
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003053473A2 (en) * | 2001-12-20 | 2003-07-03 | Zentiva, A.S. | Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline drug |
| WO2014041546A1 (en) * | 2012-09-13 | 2014-03-20 | Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority | Diagnostic agents with enhanced sensitivity/specificity |
| WO2015136545A1 (en) * | 2014-03-13 | 2015-09-17 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Polymeric systems and uses thereof in theranostic applications |
| CN106995516A (zh) * | 2016-01-22 | 2017-08-01 | 北京化工大学 | 肿瘤特异性富集的纳米载药体系及其制备方法 |
| WO2018071767A1 (en) * | 2016-10-14 | 2018-04-19 | University Of Utah Research Foundation | Antibody-polymer-drug conjugates |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHYTIL, Petr, et al. Synthesis and properties of star HPMA copolymer nanocarriers synthesised by RAFT polymerisation designed for selective anticancer drug delivery and imaging. Macromolecular bioscience, 2015, 15.6: 839-850; ISSN: 1616-5187 * |
| ETRYCH, Tomáš, et al. HPMA copolymer conjugates with reduced anti-CD20 antibody for cell-specific drug targeting. I. Synthesis and in vitro evaluation of binding efficacy and cytostatic activity. Journal of controlled release, 2009, 140.1:18-26; ISSN: 0168-3659 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2019627A3 (cs) | 2021-04-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9670318B2 (en) | Bright fluorochromes based on multimerization of fluorescent dyes | |
| US10302632B2 (en) | Macromolecular conjugates for visualization and separation of proteins and cells | |
| Radford et al. | Multivalent HER2-binding polymer conjugates facilitate rapid endocytosis and enhance intracellular drug delivery | |
| JP2010509570A (ja) | エクスビボフローサイトメトリーの方法および装置 | |
| JP2016512814A (ja) | 腫瘍の標的型画像化のために用いられる化合物にコンジュゲートされたアミノ酸連結基の製造および合成の方法 | |
| EP4013834A1 (en) | Fluorescent polymer, fluorescent probe and conjugation kit for advanced functional analysis of cells in haematology, immunology and microbiology, method of preparation and use thereof | |
| JPH0220065B2 (cs) | ||
| US20230152306A1 (en) | Nanoparticles for sensing use and production method for same | |
| US20210040326A1 (en) | Azacyanine dyes and use thereof | |
| US20180079906A1 (en) | Azacyanine dyes and use thereof | |
| US20230003727A1 (en) | Luminescent zwitterionic polymeric nanoparticles | |
| KR20040076874A (ko) | 표적 치료요법용 안트라사이클린 종양 정지 약물이 결합된피에이치-감응성 폴리머 결합체 | |
| Tappertzhofen et al. | Synthesis of Maleimide‐Functionalyzed HPMA‐Copolymers and in vitro Characterization of the aRAGE‐and Human Immunoglobulin (huIgG)–Polymer Conjugates | |
| CZ309828B6 (cs) | Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití | |
| Hintersteiner et al. | Covalent fluorescence labeling of His-tagged proteins on the surface of living cells | |
| CZ33418U1 (cs) | Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii | |
| Kudláčová et al. | Hybrid Macromolecular Constructs as a Platform for Spectral Nanoprobes for Advanced Cellular Barcoding in Flow Cytometry | |
| AU2016207125B2 (en) | Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins | |
| CZ2019649A3 (cs) | Způsob přípravy polymerních nosičů pro pH-řízené uvolňování léčiv a jejich konjugátů s léčivy | |
| WO2019180475A1 (en) | Azacyanine dyes and use thereof |