CZ2006505A3 - Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy - Google Patents

Abstract

Polymerní kancerostatické lécivo, které je ve forme konjugátu kopolymeru N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) s doxorubicinem, vázaným na polymerprostrednictvím spojek obsahujících hydrolyticky štepitelné hydrazonové vazby vzorce I, kde SP.sub.1.n. predstavuje aminoacylovou spojku, x = 40 až 335, y = 1 až 25, sestávající z 90 až 99,5 % mol. jednotek HPMA a 10 až 0,5 % mol. komonomerních jednotek obsahujících doxorubicin. Konjugát se pripravuje prímou kopolymerací monomeru obsahujícího doxorubicin vzorce II s HPMA.

Description

jejich přípravy

Oblast techniky

Vynález se týká nového způsobu přípravy vodorozpustných polymemích kancerostatik umožňujících cílený transport a řízené uvolňování cytostatik v organizmu, preferenčně v nádorové tkáni a nádorových buňkách. Polymemí kancerostatika jsou připravována přímo kopolymerizací s monomerem obsahujícím ve své struktuře kancerostatikum. Použití polymemích konjugátů je zaměřeno na cílenou terapii nádorových onemocnění v humánní medicíně.

Dosavadní stav techniky U nových farmakologicky účinných látek, nevyjímaje kancerostatika, se jejich vývoj stále více zaměřuje na nové formy, které umožňují specifické působení aktivního léčiva pouze v určité tkáni a nebo dokonce jen v určitém typu buněk. Cíleně působící léčiva nalézají uplatnění především v oblastech, kdy vedlejší účinky aktivní složky mohou vést k poškození zdravých částí organizmu. Při přípravě cíleně působících látek se stále více uplatňuje použití makromolekul -polymerů, a to přírodních nebo syntetických. V minulosti bylo připraveno a studováno velké množství polymemích konjugátů kancerostatik a bylo prokázáno, že ve většině případů je nezbytné pro dosažení farmakologické účinnosti polymemí formy léčiva zajistit uvolnění původní nízkomolekulámí cytotoxické látky z její polymemí formy. Připojení cytostatika k vodorozpustnému polymeru chemickou vazbou umožňuje ovšem také zásadním způsobem zvýšit rozpustnost nerozpustných nebo málo rozpustných léčiv a výrazně snížit jejich toxicitu. V neposlední řadě vyšší molekulová hmotnost polymerů zabraňuje rychlému vyloučení léčiva z organizmu glomerulámí filtrací, a tím zajišťuje prodlouženou dobu cirkulace v krvi a setrvání v organizmu a tím i větší biologickou využitelnost léčiva. Uvolnění cytostatika z polymemího nosiče může být s výhodou vyřešeno prostřednictvím biodegradovatelné spojky, použité k napojení léčiva na polymer, jejíž degradace v cílové tkáni vede k cílenému a řízenému uvolnění léčiva v této tkáni. Významnou skupinu výše popsaných léčiv tvoří polymemí léčiva připravená na bázi kopolymerů V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA). Přehled doposud dosažených

3 5 ) > * I > * > » * j s ) < ϊ

t * i i > J — 2 *— výsledků v této oblasti je velmi dobře zpracován v publikaci G.S. Kwona a práci J. Kopečka a spol. [Kopeček a kol. 2000, Kwon 2005]. V poslední době byly publikovány práce o přípravě a působení polymemích léčiv, ve kterých bylo kancerostatikum doxorubicin navázáno na polymemí nosič, připravený na bázi kopolymerů HPMA, prostřednictvím hydrolyticky nestálé hydrazonové vazby [Etrych a kol. 2001 a 2002, Říhová a kol. 2001, Ulbrich a kol. 2003, 2004a, 2004b] a tyto látky byly patentovány [Ulbrich a kol.]. Popsaná léčiva vykazovala podstatné snížení vedlejších, především toxických účinků na organizmus za současného výrazného zvýšení protinádorového účinku ve srovnání s běžně užívanými nízkomolekulámími cytostatiky [Říhová a kol. 2001, Kovář a kol. 2004, Hovorka a kol. 2002].

Syntéza takovýchto konjugátů byla prováděna nejdříve polymeranalogickou reakcí polymemích 4-nitrofenylových esterů (ONp) s hydrazinem a později kopolymerizací HPMA s N-Boc (terč-~ butyloxykarbonyl) skupinou chráněnými methakryloylovanými hydrazidy. V pozdější době byla vyvinuta nová metoda přípravy polymemích konjugátů spočívající v přípravě monomem 6-- (methakryloylamino)hexanoylhydrazinu a jeho kopolymerizací s HPMA. Tato metoda znamenala významný pokrok v syntéze a poskytla možnost přesně řídit molekulové hmotnosti polymemích prekurzorů a konečného produktu [Etrych patent]. Ve všech zmíněných postupech bylo léčivo navázáno na polymemí prekurzor obsahující volné hydrazidové skupiny polymeranalogickou reakcí. Předmětem tohoto vynálezu je nový způsob přípravy polymemích cytostatik na bázi kopolymerů HPMA s doxorubicinem vázaným pH-labilní hydrazonovou vazbou k polymemímu nosiči. Námi navrhovaný postup přípravy umožňuje zabudování léčiva do struktury polymemího konjugátu přímo kopolymerizací HPMA s monomerem obsahujícím doxorubicin připojený k polymerizovatelné skupině hydrazonovou vazbou přes spojku (spacer), tedy bez nezbytnosti následné reakce vazby léčiva na polymemí prekurzor. Použití zmíněného monomem při syntéze umožňuje přípravu polymemích konjugátů o přesně dané struktuře polymemího řetězce obsahujícího pouze monomemí jednotky HPMA a monomemí jednotky nesoucí hydrazonové navázané léčivo. — 3 —

Literatura:

Etrych, T., Jelínková, M., Říhová, B. and Ulbrich K., New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH sensitive linkage. Synthesis, in vitro and in vivo biological properties. J. Controlled Release 73, 89-102 (2001). T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, K. Ulbrich, Synthesis of HPMA Copolymers Containing Doxorubicin Bound via a Hydrazone Linkage. Efřect of Spacer on Drug Release and in vitro Cytotoxicity. Macromolecular Biosci. 2, 43-52 (2002)

Etrych T., Chytil P., Pechar M., Studenovský M., Říhová B., Ulbrich K.: Způsob přípravy polymemích konjugátů doxorubicinu s pH-řízeným uvolňováním léčiva, CZ PV2005-558 O. Hovorka, T. Etrych, M. Šubr, J. Strohalm, K. Ulbrich, B. Říhová, Differences in the Intracellular Fate of Free and Polymer-Bound Doxorubicin. J. Controlled Release 80, 101-117 (2002) J. Kopeček, P. Kopečková, T. Minko, Z. Lu, HPMA Copolymer-Anticancer Drug Conjugates: Design, Activity, and Mechanism of Action. Europ. J. Pharm. Biopharm. 50, 61 - 81 (2000) M. Kovář, L.Kovář, V. Šubr, T. Etrych, K. Ulbrich, T. Mrkvan, J. Loucká and B.Říhová, HPMA Copolymers Containing Doxorubicin Bound by Proteolytically oř Hydrolytically Cleavable Bond: Comparison of Biological Properties In Vitro. J. Controlled Release 99,301-314 (2004) G.S. Kwon, Polymeric Drug Delivery Systems, Series: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol. 148, Dekker, Marcel Incorporated, 2005 B. Říhová, T. Etrych, M. Pechar, M. Jelínková, M. Šťastný, O. Hovorka, M. Kovář, K. Ulbrich, Doxorubicin Bound to a HPMA Copolymer Carrier Through Hydrazone Bond is Effective also in a Cancer Cell Line with a Limited Content of Lysosomes. J. Controlled Release 74, 225-232 (2001) 4- K. Ulbrich, V. Šubr, J. Strohalm, D. Plocová, M. Jelínková, B. Říhová, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules I. Synthesis and Physico-chemical Characterisation. J. ControlledRel. 64, 63-79 (2000) K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, HPMA Copolymers with pH-Controlled Release of Doxorubicin. In vitro Cytotoxicity and in vivo Antitumor Activity. J. Controlled Release 87, 33-47 (2003) K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, Antibody-Targeted Polymer-Doxorubicin Conjugates with pH-Controlled Activation, J. Drug Targeíing 12(8) (2004) 477-489]. (A) K. Ulbrich, V. Šubr, Polymeric Anticancer Drugs with pH-Controlled Activation, Adv. Drug Delivery Rev. 56/7, 1025-1052 (2004) (B)

v K. Ulbrich, T. Etrych, B. Říhová, M. Jelínková, M. Kovář: pH Senzitivní polymemí konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii. CZ 29^87, CZ 29^886

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je postup přípravy polymemího konjugátu HPMA kopolymeru s doxorubicinem vázaným na polymer prostřednictvím různých spojek obsahujících hydrolyticky štěpitelné hydrazonové vazby. Postup přípravy vychází ze dvoustupňové syntézy sestávající ze syntézy monomerů, a to HPMA a methakryloylovaných derivátů aminokyselin a oligopeptidů zakončených hydrazonovou vazbou připojeným doxorubicinem, a přímé syntézy polymemích konjugátů kopolymerizací s uvedeným monomerem obsahujícím kancerostatikum doxorubicin vázané kovalentní hydrazonovou vazbou.

Polymemí léčivo připravené podle vynálezu se vyznačuje tím, že je jeho struktura tvořena hydrofilním ve vodě rozpustným kopolymerem obsahujícím jednotky HPMA a jednotky methakryloylovaného derivátu aminokyselin nebo oligopeptidů zakončeného doxorubicinem připojeným k aminokyselinovým nebo oligopeptidovým zbytkům (spacerům) pH-senzitivní hydrolyticky štěpitelnou hydrazonovou vazbou. Spacery mohou být tvořeny jednotlivými

> f ’ * 5 } 7 * ) \ i > * » I * * I i > - 5 — aminokyselinami, oligopeptidy a nebo dalšími strukturami dovolujícími jejich zakončení hydrazidovou skupinou a kní připojení doxorubicinu hydrazonovou vazbou. Obsah komonomemích (Dox obsahujících) jednotek vkopolymeru může být 0,5 až 10 % mol. Kopolymer neobsahuje žádné další málo definované jednotky, např. methakryloylované hydrazidy.

Polymer s chemicky vázaným cytostatikem je stabilní v průběhu cirkulace v krevním řečišti, hydrazonová vazba mezi doxorubicinem a polymerem je relativně stabilní za fyziologických podmínek krevního řečiště (pH 7,4). Po extravasaci a záchytu v nádorech dochází k průniku molekulárně rozpuštěného konjugátu do jednotlivých nádorových buněk pinocytózou a v důsledku poklesu pH z vnějšího pH 7,4 na intracelulámí pH 5 až 6 by mělo dojít k hydrolýze hydrazonové vazby, uvolnění cytostatika v cílové buňce a tedy k aktivaci jeho cytotoxického efektu. Reálnost výše navrženého mechanizmu působení polymemích léčiv podle vynálezu je doložena experimenty modelového uvolňování doxorubicinu zpolymemího nosiče. Výsledky těchto testů jsou uvedeny v příkladové části přihlášky.

Syntéza monomerů vychází ze syntézy HPMA monomeru již dříve popsaným způsobem [Ulbrich 2000]. Syntéza methakryloyl(aminoacyl)hydrazidů lišících se strukturou acylové komponenty je velmi obdobná u všech připravených monomerů a provádí se již dříve popsaným způsobem [Ulbrich patenty, Etrych patent]. Tato syntéza vychází z methakryloylace methylesteru hydrochloridu příslušné aminokyseliny nebo oligopeptidu methakryloylchloridem prováděné v dichlormethanu v přítomnosti bezvodého uhličitanu sodného. Výsledný produkt se převede na methakryloylovaný aminoacylhydrazin hydrazinolýzou příslušného methylesteru hydrazin hydrátem prováděnou v methanolovém nebo 2-propanolovém roztoku. Jako aminoacyl v methakryloyl(aminoacyl)hydrazinech je možno s výhodou použít glycyl, glycylglycyl, β-alanyl, 6-aminohexanoyl, 4-aminobenzoyl a nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly nebo GlyPheLeuGly. Jako příklad syntézy methakryloyl(aminoacyl)hydrazinu je uvedena v příkladě 1 syntéza 6-methakroyl(aminohexanoyl)hydrazidu. Příprava (methakryloylamino)acylhydrazid-doxorubicinů vychází z vazebné reakce doxorubicin hydrochloridu na methakryloyl(aminoacyl)hydraziny za vzniku hydrazonové vazby. Reakce se provádí s výhodou v methanolu za katalýzy definovaného množství kyseliny octové s přídavkem inhibitoru. Reakce může být prováděna i v dimethylsulfoxidu, dimethylformamidu, sušeném ethanolu nebo dimethylacetamidu. Při použití jiných rozpouštědel nežli methanol reakce probíhá - 6- » i ·' » ? » > J > > '· t » i » 1 > * nn ) ^ t t ti J i » i * 3 3 JI» * i * dobře, její výtěžky jsou však nižší. Vliv struktury spojky na průběh vazebné reakce je minimální. Pro dosažení optimálního výtěžku vazby a minimálního obsahu nenavázaného doxorubicinu v produktu je ve všech případech důležité dodržet koncentrace reaktantů a kyseliny octové vreakční směsi: koncentrace doxorubicinu (DOX) 19 mg/ml, koncentrace kyseliny octové 51 mg/ml. Optimální doba reakce je 24 h při teplotě 25 °C. Výše uvedené podmínky jsou optimální, vedoucí k maximálním výtěžkům. Reakce může být prováděna i za mírně pozměněných reakčních podmínek, přizpůsobených typu použitého rozpouštědla i (methakryloylamino)acylhydrazidu. Pokud je použita nižší koncentrace DOX (10 mg/ml), je třeba pracovat při vyšší teplotě (až do 35 °C), je možné snížit koncentraci kyseliny octové až na 35 mg/ml, případně prodloužit dobu reakce (až do 28 hodin). Při vyšší koncentraci DOX (30 mg/ml) je výhodné zvýšit koncentraci kyseliny octové až max. na 60 mg/ml a zkrátit reakční dobu na 20 hodin, případně snížit teplotu na 20 °C. Na odstranění volného léčiva z produktu je možné s výhodou použít malý přídavek polymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2), jehož hydrazidové skupiny vyváží nezreagovaný doxorubicin (DOX). Reakční směs je následně vyčištěna gelovou filtrací, s výhodou na koloně LH-20 vmethanolu. Frakce monomemího derivátu DOX je po zahuštění izolována vysrážením do diethyletheru. Příprava 6--(methakryloylamino)hexanoylhydrazid-doxorubicinu a methakroylglycylfenylalanylleucyl-glycylhydrazid-doxorubicinu jako příklady syntézy (methakryloylamino)acylhydrazid-doxorubicinů jsou uvedeny v příkladové části.

Syntéza polymerních konjugátu doxorubicinu - kopolymerů HPMA s meťhakryloylovanými deriváty aminokyselin a oligopeptidů zakončených hydrazonovou vazbou připojeným doxorubicinem je založena na přímé radikálové kopolymerizaci HPMA s odpovídajícími methakryloylovanými deriváty DOX vzorce II } > > })M * *

Cu)

Polymerace je prováděna v roztoku za použití methanolu, ethanolu, dimethylsulfoxidu nebo dimethylformamidu jako polymeračního prostředí. Polymerizace je iniciována tepelně rozložitelnými iniciátory^adikálové polymerizace na bázi azo nebo peroxy iniciátorů. S výhodou je možno použít azobis(i$obutyronitril) (AIBN), azobis(i$okyan#valerová kyselina) (ABIK) nebo diiéopropylperkarbonát (DIP). Teplota polymerizace se řídí příslušným iniciátorem a použitým rozpouštědlem (AIBN, ABIK v methanolu, ethanolu, DMF a DMSO 50 až 60 °C, DIP 40 až 50 °C). Obvyklá doba polymerizace je 15 až 24 h. Příprava všech polymemích konjugátů radikálovou polymerizací je analogická, například kopolymerizace HPMA s methakryloylovaným derivátem DOX je uvedena v příkladu 3. Oproti dříve používané polymeranalogické vazebné reakci DOX na polymemí prekurzor poly(HPMA-co-MA-AH-— NHNH2) vede přímá kopolymerizace HPMA s methakryloylovaným derivátem DOX k přesně definovaným polymemím konjugátům.

Polvmerní koniueát je kopolymer HPMA s methakryloylovanými deriváty aminokyselin a oligopeptidů zakončených hydrazonovou vazbou připojeným doxorubicinem vzorce I - 8- ti » * • > : a i * » » un > * * a 3i 9 a » > t > * > »19 1 ® »

u) jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje 90 až 99,5 % mol. HPMA a 10 až 0,5 % mol. jednotek (methakryloylamino)acylhydrazid-doxorubicinů. V používaných strukturních schématech je zavedena zkratka pro spojky (spacery) v bočních řetězcích konjugátů a monomerů - SPi je aminoacyl v methakryloylacylhydrazid-doxorubicinech, například glycyl, glycylglycyl, β-alanyl, 6-aminohexanoyl (AH), 4-aminobenzoyl a nebo složený acyl vycházející z olígopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly a GlyPheLeuGly. Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 představuje schéma struktury methakryloylovaných derivátů aminokyselin a olígopeptidů zakončených hydrazonovou vazbou připojeným doxorubicinem ((methakryloylamino)--acylhydrazid-doxorubicin)).

Obr. 2 představuje schéma struktury konjugátu 1 - kopolymeru HPMA a methakryloylovaného derivátu aminokyselin a olígopeptidů zakončených hydrazonovou vazbou připojeným doxorubicinem (x = 40 až 335, y = 1 až 25). - 9- »3 ϊ > ~ > » ϊ i 4 S Í ϊ i ϊ > 5 > * • ? 3 * ’ * 3 » I 3 ♦ t 1 t i I i !3Í * * ®

Obr. 3 představuje graf rychlosti uvolňování DOX z polymemího konjugátu 1 a polymemího konjugátu připraveného polymeranalogickou reakcí (patent Etrych) vpufřu o pH 5 (model intracelulámího prostředí).

Obr. 4 představuje graf rychlosti uvolňování DOX z polymemího konjugátu 1 a polymemího konjugátu připraveného polymeranalogickou reakcí (patent Etrych) vpufřu o pH 7,4 (model krevního řečiště). Příklady provedení vynálezu Příklad 1: Syntéza monomerů HPMA byl připraven podle dříve popsaného postupu [Ulbrich a kol. 2000]. Elementární analýza: vypočteno 58,8 % C, 9,16 % H, 9,79 % N; nalezeno 58,98 % C, 9,18 % H, 9,82 % N. Produkt byl chromatografícky čistý. 6-(methakryloylamino)hexanoylhydrazid (A^1-(6-hydrazino-6-oxohexyl)-2-methylakrylamid) (MA-AH-NHNH2) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Ulbrich patenty, Etrych patent].

Methakroylglycylfenylalanylleucylglycylhydrazid (MA-Gly-D,L-PheLeuGly-NHNH2) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Etrych patent]. 6-(Methakryloylamino)hexanoylhydrazid-doxorubicin (MA-AH-NHN=DOX) 6-(Methakryloylamino)hexanoylhydrazid (40 mg, 0,188 mmol) byl rozpuštěn při teplotě místnosti v 6 ml methanolu. Tento roztok byl nalit do reakční nádobky, ve které byl umístěn doxombicin.HCl (115 mg, 0,198 mmol), a suspenze byla intenzivně míchána. Do této suspenze bylo přidáno 310 μΐ kyseliny octové a reakční směs byla míchána 24 hodin při 25 °C. Průběh reakce sledován na TLC - destičky Silikagel 60 F254 (methanol:chloroform:kyselina octová 2:8:1,

Rf(DOX)= 0,75, Rf(MA-AH-NHN=DOX)= 0,9). V průběhu reakce došlo k pozvolnému rozpuštění suspenze a po 20 h reakce byl roztok homogenní. Po 24 hodinách bylo do homogenní reakční směsi přidáno 100 mg kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) (na vyvázání zbytkového volného DOX) a reakční směs míchána další 4 h při teplotě místnosti. Produkt byl vyčištěn od polymemích a nízkomolekulámích příměsí pomocí gelové chromatografie na koloně (30cm x 3cm) naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Nízkomolekulámí frakce byla / zahuštěna na 2 ml a produkt vysrážen do 30 ml diethyleteru. Produkt byl odsát, promyt malým 3 t 5 · * * I i > * » * » a * > * • II» » » *»J 1 ' 1 - 10-ί množstvím diethyleteru a vakuově sušen do konstantní hmotnosti. Výtěžek činil 110 mg produktu (79 %) s teplotou tání 172 až 175 °C. TLC (methanol:chloroform:kyselina octová 2:8:1) jedna skvrna při Rf= 0,9. MALDI-TOF MS: 762 (M+Na).

Methakroylglycylfenylalanylleucylglycylhydrazid-doxorubicin (MA-GFLG-NHN=DOX) Příprava MA- GFLG-NHN=DOX byla prováděna za podobných podmínek, jako v případě MA-AH-NHN=DOX. Methakroylglycylfenylalanylleucylglycylhydrazid (122 mg, 0,258 mmol) byl rozpuštěn při teplotě místnosti v 8,2 ml methanolu. Tento roztok byl nalit do reakční nádobky, ve které byl umístěn doxorubicin.HCl (157 mg, 0,271 mmol), a suspenze byla intenzivně míchána. Do této suspenze bylo přidáno 420 μΐ kyseliny octové a reakční směs byla míchána 24 hodin při 25 °C. Průběh reakce sledován na TLC - destičky Silikagel 60 F254 (methanol:chloroform:kyselina octová 2:8:1, Rf(DOX)= 0,75, Rf(MA-GFLG-NHN=DOX)= 0,95). V průběhu reakce došlo k pozvolnému rozpuštění suspenze a po 19 h reakce byl roztok homogenní. Po 24 hodinách bylo do homogenní reakční směsi přidáno 130 mg kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) (na vyvázání zbytkového volného DOX) a reakční směs míchána další 4 h při teplotě místnosti. Produkt byl vyčištěn od polymemích a nízkomolekulámích příměsí pomocí gelové chromatografíe na koloně (30cm x 3cm) naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Nízkomolekulámí frakce byla zahuštěna na 2,5 ml a produkt t 1 vysrážen do 40 ml diethyleteru. Produkt byl odsát, promyt malým množstvím diethyleteru a vakuově sušen do konstantní hmotnosti. Výtěžek činil 210 mg produktu (78 %) s teplotou tání 179 až 182 °C. TLC (methanol:chloroform:kyselina octová 2:8:1) jedna skvrna při Rf= 0,95. MALDI-TOF MS: 1023 (M+Na).

Příklad 2: Syntéza polymerního konjugátu - Konjugátu 1 - kopolymeru HPMA s MA-AH· - NHN=DOX

Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHN=DOX)] byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHN=DOX v methanolu při 60 °C. 840 mg HPMA a 165 mg MA-AH-NHN=DOX (18 hm%jjionomerů) bylo rozpuštěno v 5,7 ml metanolu, k roztoku bylo přidáno 67 mg ABIN (1,2 hm%). Po filtraci byla polymerizační směs vložena v argonové atmosféře do polymerizačního reaktoru (objem 20 ml) umístěného v termostatu. Nad hladinu byl ještě několik minut zaváděn dusík. Teplota polymerizační směsi byla nastavena na 60 °C a polymerizace probíhala za míchání (50 rpm) v dusíkové atmosféře. 3 t 3 * * • 333 » > ί » 1 t 1 í » > > 3 -,11-

Polymerizační směs byla po 22 h vyjmuta z termostatu, ochlazena v lázni na pokojovoiy teplotu a polymer byl izolován vysrážením do ethylacetátu (celkem 100 ml). Vysrážený polymer byl izolován filtrací na fritě S4. Sraženina byla promyta ethylacetátem a sušena při teplotě místnosti za vakua membránové vývěvy cca 1 h. Polymemí produkt byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí a nenavázaného léčiva gelovou chromatografíí na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Polymemí frakce byla zachycena, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 5 ml a kopolymer byl izolován vysrážením do 50 ml ethylacetátu. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti.

Obsah celkového DOX byl stanoven spektrálně. Mw a Mn byly stanoveny kapalinovou chromatografíí (LC AKTA) s detekcí rozptylem světla (Multiangel detector DAWN DSP, Wyatt).

Charakterizace polymerního léčiva: Výtěžek polymerizační reakce: 750 mg (75 %), obsah celkového DOX 10,8 % váhovýeh, obsah volného DOX 0,35 % z celkového obsahu DOX, molekulová hmotnost Mw = 3 Ϊ 00,indexpolydisperzity Mw/ Mn- 1,72.

Příklad 3: Syntéza polymerního konjugátu - Konjugátu 2 - kopolymeru HPMA s MA-AH-NHN=DOX 5,5 % vahovýeh,

Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHN=DOX) byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHN=DOX v methanolu při 60 °C stejným způsobem jako v příkladu 2, s tím rozdílem, že složení polymerizační směsi bylo následinící: 770 mg HPMA, 235 mg MA-AH-NHN=DOX, 5,7 ml metanolu, 67 mg ABIN (1,2 hm%)^ Izolace a čištění produktu bylo prováděno stejným způsobem, jako u příkladu 2. Charakterizace polj léčiva: Výtěžek polymerizační reakce: 740 mg (74 %), obsah celkového DOX 16,: obsah volného DOX 0,45 % z celkového obsahu DOX, molekulová hmotnost Mw = 32800, index polydisperzity Mw/ Mn= 1,78.

Příklad 4: Syntéza polymerního konjugátu - Konjugátu 3 - kopolymeru HPMA s MA-- GFLG-NHN=DOX

Kopolymer poly(HPMA-co-MA-GFLG-NHN=DOX) byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-GFLG-NHN=DOX v methanolu při 60 °C stejným způsobem jako v příkladu 2, s tím rozdílem, že složení polymerizační směsi bylo následující: 700 mg HPMA, - 12 — 3 i i i > 5 a ? · s 9 * 5

a ? i 3 '* J

» * 9 » * S tlí 5 *

Mil 3» * 9 J * - * 183 mg MA-AH-NHN=DOX, 5 ml metanolu, 64 mg ABIN (1,3 hm%). Izolace a čištění produktu bylo prováděno stejným způsobem, jako u příkladu 2. Charakterizace polymemíha j f^ léčiva: Výtěžek polymerizační reakce: 670 mg (76 %), obsah celkového DOX 10,5 % váhovyeh·, obsah volného DOX 0,32 % z celkového obsahu DOX, molekulová hmotnost Mw = 34800, indexpolydisperzity Mwl Mn= 1,82. Příklad 5: Uvolňování doxorubicinu z roubovaných polymerních konjugátů

Bylo měřeno množství doxorubicinu uvolněného z polymerních konjugátů po jejich inkubaci ve fosfátovém pufru o pH 5,0 (0,1 M fosfátový pufř obsahujícím 0,05 M NaCl) modelujícím intracelulámí prostředí a fosfátovém pufru pH 7,4 modelujícím prostředí krevního řečiště. Množství uvolňovaného DOX v inkubačním roztoku bylo stanoveno pomocí HPLC (Shimadzu). V předem určených časových intervalech bylo odebíráno 50 μΐ inkubačního roztoku a analyzováno na koloně TSKGel G 3000x1, izokratický průtok 0,5 ml/min mobilní fáze složené ze směsi methanol:octanový pufř pH 6,5 (80 : 20 % obj.). Množství DOX bylo vypočteno z ploch píků volného a vázaného DOX (UV-VIS detekce při 488 nm). Po inkubaci konjugátů (koncentrace 5 mg/ml) ve fyziologickém prostředí při 36 °C (fosfátový pufř, pH 7,4) se uvolňuje jen malé množství léčiva (do 10 %/24 hod) (Obr. 4); naopak rychlost uvolňování DOX z roubovaných polymerních konjugátů, a tedy rychlost aktivace cytotoxického léčiva, je v mírně kyselém prostředí při pH 5,0 (Obr. 3) značná. Rychlosti uvolňování léčiva v pH 7,4 a pH 5 z polymerních konjugátů připravených přímou kopolymerizací s využitím 6--(methakryloylamino)acylhydrazid-doxorubicinů jsou plně srovnatelné s rychlostmi uvolňování léčiva zjištěných u hydrazonových konjugátů připravených polymeranalogickou reakcí (PA reakce) [Etrych patent]. Výsledky měření rychlosti in vitro uvolňování aktivního léčiva z polymemího nosiče v prostředí modelujícím prostředí krve (při dopravě léčiva organizmem) a intracelulámí prostředí cílové buňky potvrzuje vhodnost použití navrhovaného polymemího cytostatika pro nádorově specifické terapie.

Claims (14)

1. J 1 13 — PATENTOVÉ NÁROKY 1. Polymemí léčivo ve formě konjugátu kopolymeru iV-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu HPMA s doxorubicinem vázaným na polymer prostřednictvím spojek obsahujících hydrolyticky štěpitelné hydrazonové vazby vzorce I

   HO (O kde SPi představuje aminoacylovou spojku, zvolenou ze skupiny zahrnující glycyl, glycylglycyl, β-alanyl, 6-aminohexanoyl, 4-aminobenzoyl nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly nebo GlyPheLeuGly, x = 40 až 335, y = 1 až 25, sestávající z 90 až 99,5 % mol. jednotek HPMA a 10 až 0,5 % mol. komonomemích jednotek obsahujících doxorubicin.
2. 2. Způsob výroby polymemího konjugátu vzorce I podle nároku 1, vyznačující se přímou kopolymerací monomeru obsahujícího doxorubicin vzorce II — 14 — 3 * > > — 14 — 3 * > > 1 » Ϊ J > ) 9 ·» » > J í I » 5 I > tm

   (Π), kde SPi má význam uvedený v nároku 1, s HPMA v molámím poměru 90 až 99,5 :10 až 0,5.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se polymerace provádí v prostředí methanolu, ethanolu, dimethylsulfoxidu nebo dimethylflljjmamidu a je iniciována tepelně rozložitelnými iniciátory radikálové polymerace. ^ d/niiibýlfortottoiclu
4. 4. Způsob podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že jsou iniciátory radikálové polymerace zvoleny ze skupiny, kterou tvoři azobisoUtyronitnl) AIBN, azobis(i$okyan$valerovájkyselina ABIK a dii$opropylperkarbonát DIP.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že je iniciátor zvolen ze skupiny AIBN nebo ABIK a reakce probíhá při 50 až 60 °C po dobu 15 až 24 hodin.
6. 6. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že je jako iniciátor zvolen DIP a reakce probíhá při 40 až 50 °C pod dobu 15 až 24 hodin.
7. 7. Způsob podle nároků 2 až 6, vyznačující se tím, že je monomemí jednotka vzorce II vyrobena reakcí doxorubicin hydrochloridu s methakryloyl(aminoacyl)hydraziny vzorce MA-SP1NHNH2, kde MA je methakryloyl a SPi má význam uvedený v nároku 1, v organickém rozpouštědle za přítomnosti kyseliny octové. - 15- * i i
8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že je ve výchozí směsi koncentrace doxorubicinu volena v rozmezí koncentrací 10 až 30 mg/ml a kyseliny octové v rozmezí 35 až 60 mg/ml.
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že je ve výchozí reakční směsi koncentrace doxorubicinu hydrochloridu 19 mg/ml a kyseliny octové 51 mg/ml.
10. 10. Způsob podle libovolného z nároků 7 až 9, vyznačující se tím, že reakce se provádí při teplotě 20 až 35 °C po dobu 20 až 28 hodin.
11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že reakce se provádí při teplotě 25 °C po dobu 24 h. £
12. 12. Způsob podle nároku 7 až 11, vyznačující se tím, že se po ukončení reakce pro odstranění přebytečného doxorubicinu použije kopolymer HPMA s methakryloylovaným (aminoacyl)hydrazidem.
13. 13. Způsob podle nároku 7 až 12, vyznačující se tím, že je reakční prostředí tvořeno organickým rozpouštědlem zvoleným ze skupiny, kterou tvoří methanol, bezvodý ethanol, dimethylsulfoxid, dimethylformamid a dimethylacetamid.
14. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že je reakční prostředí tvořeno methanolem.