CZ2006505A3 - Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy - Google Patents

Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy Download PDF

Info

Publication number
CZ2006505A3
CZ2006505A3 CZ20060505A CZ2006505A CZ2006505A3 CZ 2006505 A3 CZ2006505 A3 CZ 2006505A3 CZ 20060505 A CZ20060505 A CZ 20060505A CZ 2006505 A CZ2006505 A CZ 2006505A CZ 2006505 A3 CZ2006505 A3 CZ 2006505A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
doxorubicin
hpma
reaction
polymer
dox
Prior art date
Application number
CZ20060505A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ299053B6 (cs
Inventor
Etrych@Tomáš
Ulbrich@Karel
Original Assignee
Zentiva, A. S.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zentiva, A. S. filed Critical Zentiva, A. S.
Priority to CZ20060505A priority Critical patent/CZ299053B6/cs
Priority to DE602007012111T priority patent/DE602007012111D1/de
Priority to AT07785504T priority patent/ATE495759T1/de
Priority to UAA200902032A priority patent/UA95814C2/ru
Priority to PT07785504T priority patent/PT2049157E/pt
Priority to EA200900295A priority patent/EA200900295A1/ru
Priority to ES07785504T priority patent/ES2356991T3/es
Priority to EP07785504A priority patent/EP2049157B1/en
Priority to US12/376,915 priority patent/US20100190928A1/en
Priority to PL07785504T priority patent/PL2049157T3/pl
Priority to PCT/CZ2007/000077 priority patent/WO2008017277A2/en
Publication of CZ2006505A3 publication Critical patent/CZ2006505A3/cs
Publication of CZ299053B6 publication Critical patent/CZ299053B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Polymerní kancerostatické lécivo, které je ve forme konjugátu kopolymeru N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) s doxorubicinem, vázaným na polymerprostrednictvím spojek obsahujících hydrolyticky štepitelné hydrazonové vazby vzorce I, kde SP.sub.1.n. predstavuje aminoacylovou spojku, x = 40 až 335, y = 1 až 25, sestávající z 90 až 99,5 % mol. jednotek HPMA a 10 až 0,5 % mol. komonomerních jednotek obsahujících doxorubicin. Konjugát se pripravuje prímou kopolymerací monomeru obsahujícího doxorubicin vzorce II s HPMA.

Description

Oblast techniky
Vynález se týká nového způsobu přípravy vodorozpustných polymerních kancerostatik umožňujících cílený transport a řízené uvolňování cytostatik v organizmu, preferenčně v nádorové tkáni a nádorových buňkách. Polymerní kancerostatika jsou připravována přímo kopolymerizací s monomerem obsahujícím ve své struktuře kancerostatikum. Použití polymerních konjugátů je zaměřeno na cílenou terapii nádorových onemocnění v humánní medicíně.
Dosavadní stav techniky
U nových farmakologicky účinných látek, nevyjímaje kancerostatika, se jejich vývoj stále více zaměřuje na nové formy, které umožňují specifické působení aktivního léčiva pouze v určité tkáni a nebo dokonce jen v určitém typu buněk. Cíleně působící léčiva nalézají uplatnění především v oblastech, kdy vedlejší účinky aktivní složky mohou vést k poškození zdravých částí organizmu. Při přípravě cíleně působících látek se stále více uplatňuje použití makromolekul polymerů, a to přírodních nebo syntetických. V minulosti bylo připraveno a studováno velké množství polymerních konjugátů kancerostatik a bylo prokázáno, že ve většině případů je nezbytné pro dosažení farmakologické účinnosti polymerní formy léčiva zajistit uvolnění původní nízkomolekulámí cytotoxické látky z její polymerní formy. Připojení cytostatika k vodorozpustnému polymeru chemickou vazbou umožňuje ovšem také zásadním způsobem zvýšit rozpustnost nerozpustných nebo málo rozpustných léčiv a výrazně snížit jejich toxicitu. V neposlední řadě vyšší molekulová hmotnost polymerů zabraňuje rychlému vyloučení léčiva z organizmu glomerulámí filtrací, a tím zajišťuje prodlouženou dobu cirkulace v krvi a setrvání v organizmu a tím i větší biologickou využitelnost léčiva. Uvolnění cytostatika z polymerního nosiče může být s výhodou vyřešeno prostřednictvím biodegradovatelné spojky, použité k napojení léčiva na polymer, jejíž degradace v cílové tkáni vede k cílenému a řízenému uvolnění léčiva v této tkáni. Významnou skupinu výše popsaných léčiv tvoří polymerní léčiva připravená na bázi kopolymerů V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA). Přehled doposud dosažených « ?
i } i S i > » » i > * > * i i 9 }
- 2'—výsledků v této oblasti je velmi dobře zpracován v publikaci G.S. Kwona a práci J. Kopečka a spol. [Kopeček a kol. 2000, Kwon 2005]. V poslední době byly publikovány práce o přípravě a působení polymemích léčiv, ve kterých bylo kancerostatikum doxorubicin navázáno na polymerní nosič, připravený na bázi kopolymerů HPMA, prostřednictvím hydrolyticky nestálé hydrazonové vazby [Etrych a kol. 2001 a 2002, Říhová a kol. 2001, Ulbrich a kol. 2003, 2004a, 2004b] a tyto látky byly patentovány [Ulbrich a kol.]. Popsaná léčiva vykazovala podstatné snížení vedlejších, především toxických účinků na organizmus za současného výrazného zvýšení protinádorového účinku ve srovnání s běžně užívanými nízkomolekulámími cytostatiky [Říhová a kol. 2001, Kovář a kol. 2004, Hovorka a kol. 2002].
Syntéza takovýchto konjugátů byla prováděna nejdříve polymeranalogickou reakcí polymemích 4-nitrofenylových esterů (ONp) s hydrazinem a později kopolymerizací HPMA s A-Boc (terc- butyloxykarbonyl) skupinou chráněnými methakryloylovanými hydrazidy. V pozdější době byla vyvinuta nová metoda přípravy polymemích konjugátů spočívající v přípravě monomeru 6_ (methakryloylamino)hexanoylhydrazinu ajeho kopolymerizací s HPMA. Tato metoda znamenala významný pokrok v syntéze a poskytla možnost přesně řídit molekulové hmotnosti polymemích prekurzoru a konečného produktu [Etrych patent]. Ve všech zmíněných postupech bylo léčivo navázáno na polymerní prekurzor obsahující volné hydrazidové skupiny polymeranalogickou reakcí.
Předmětem tohoto vynálezu je nový způsob přípravy polymemích cytostatik na bázi kopolymerů HPMA s doxorubicinem vázaným pH-labilní hydrazonovou vazbou k polymemímu nosiči. Námi navrhovaný postup přípravy umožňuje zabudování léčiva do struktury polymemího konjugátu přímo kopolymerizací HPMA s monomerem obsahujícím doxorubicin připojený k polymerizovatelné skupině hydrazonovou vazbou přes spojku (spacer), tedy bez nezbytnosti následné reakce vazby léčiva na polymerní prekurzor. Použití zmíněného monomem při syntéze umožňuje přípravu polymemích konjugátů o přesně dané struktuře polymemího řetězce obsahujícího pouze monomerní jednotky HPMA a monomerní jednotky nesoucí hydrazonové navázané léčivo.
í ‘ ΐ » i i iii ? i * 9 í *
1 » » >
a 3 i » J i
Literatura:
Etrych, T., Jelínková, M., Říhová, B. and Ulbrich K., New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH sensitive linkage. Synthesis, in vitro and in vivo biological properties.
J. Controlled Release 73, 89-102 (2001).
T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, K. Ulbrich, Synthesis of HPMA Copolymers Containing Doxorubicin Bound via a Hydrazone Linkage. Effect of Spacer on Drug Release and in vitro Cytotoxicity. Macromolecular Biosci. 2, 43-52 (2002)
Etrych T., Chytil P., Pechar M., Studenovský M., Říhová B., Ulbrich K.: Způsob přípravy polymerních konjugátů doxorubicinu s pH-řízeným uvolňováním léčiva, CZPV 2005-558
O. Hovorka, T. Etrych, M. Šubr, J. Strohalm, K. Ulbrich, B. Říhová, Differences in the Intracellular Fate of Free and Polymer-Bound Doxorubicin. J. Controlled Release 80, 101-117 (2002)
J. Kopeček, P. Kopečková, T. Minko, Z. Lu, HPMA Copolymer-Anticancer Drug Conjugates: Design, Activity, and Mechanism of Action. Europ. J. Pharm. Biopharm. 50, 61 - 81 (2000)
M. Kovář, L.Kovář, V. Šubr, T. Etrych, K. Ulbrich, T. Mrkvan, J. Loucká and B.Říhová, HPMA Copolymers Containing Doxorubicin Bound by Proteolytically oř Hydrolytically Cleavable Bond: Comparison of Biological Properties In Vitro. J. Controlled Release 99,301-314 (2004)
G.S. Kwon, Polymeric Drug Delivery Systems, Series: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol. 148, Dekker, Marcel Incorporated, 2005
B. Říhová, T. Etrych, M. Pechar, M. Jelínková, M. Šťastný, O. Hovorka, M. Kovář, K. Ulbrich, Doxorubicin Bound to a HPMA Copolymer Carrier Through Hydrazone Bond is Effective also in a Cancer Cell Line with a Limited Content of Lysosomes. J. Controlled Release 74, 225-232 (2001) * :·
3 *
Κ. Ulbrich, V. Šubr, J. Strohalm, D. Plocová, M. Jelínková, B. Říhová, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules I. Synthesis and Physico-chemical Characterisation. J. ControlledRel. 64, 63-79(2000)
K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, HPMA Copolymers with pHControlled Release of Doxorubicin. In vitro Cytotoxicity and in vivo Antitumor Activity. J. Controlled Release 87, 33-47 (2003)
K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, Antibody-Targeted PolymerDoxorubicin Conjugates with pH-Controlled Activation, J. Drug Targeting 12(8) (2004) 477489]. (A)
K. Ulbrich, V. Šubr, Polymeric Anticancer Drugs with pH-Controlled Activation, Adv. Drug DeliveryRev. 56/7, 1025-1052 (2004) (B)
K. Ulbrich, T. Etrych, B. Říhová, M. Jelínková, M. Kovář: pH Senzitivní polymemí konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii. CZ 293787, CZ 293886
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je postup přípravy polymemího konjugátu HPMA kopolymerů s doxorubicinem vázaným na polymer prostřednictvím různých spojek obsahujících hydrolyticky štěpítelné hydrazonové vazby. Postup přípravy vychází ze dvoustupňové syntézy sestávající ze syntézy monomerů, a to HPMA a methakryloylovaných derivátů aminokyselin a oligopeptidů zakončených hydrazonovou vazbou připojeným doxorubicinem, a přímé syntézy polymerních konjugátů kopolymerizací s uvedeným monomerem obsahujícím kancerostatikum doxorubicin vázané kovalentní hydrazonovou vazbou.
Polymemí léčivo připravené podle vynálezu se vyznačuje tím, že je jeho struktura tvořena hydrofilním ve vodě rozpustným kopolymerem obsahujícím jednotky HPMA a jednotky methakryloylovaného derivátu aminokyselin nebo oligopeptidů zakončeného doxorubicinem připojeným k aminokyselinovým nebo oligopeptidovým zbytkům (spacerům) pH-senzitivní hydrolyticky štěpitelnou hydrazonovou vazbou. Spacery mohou být tvořeny jednotlivými
3 5 i 3
C; » ) » i i > ’ i > * » 1 « í » >
- 5—· aminokyselinami, oligopeptidy a nebo dalšími strukturami dovolujícími jejich zakončení hydrazidovou skupinou a kní připojení doxorubicinu hydrazonovou vazbou. Obsah komonomemích (Dox obsahujících) jednotek vkopolymeru může být 0,5 až 10 % mol. Kopolymer neobsahuje žádné další málo definované jednotky, např. methakryloylované hydrazidy.
Polymer s chemicky vázaným cytostatikem je stabilní v průběhu cirkulace v krevním řečišti, hydrazonová vazba mezi doxorubicinem a polymerem je relativně stabilní za fyziologických podmínek krevního řečiště (pH 7,4). Po extravasaci a záchytu v nádorech dochází k průniku molekulárně rozpuštěného konjugátu do jednotlivých nádorových buněk pinocytózou a v důsledku poklesu pH z vnějšího pH 7,4 na intracelulámí pH 5 až 6 by mělo dojít k hydrolýze hydrazonové vazby, uvolnění cytostatika v cílové buňce a tedy k aktivaci jeho cytotoxického efektu. Reálnost výše navrženého mechanizmu působení polymerních léčiv podle vynálezu je doložena experimenty modelového uvolňování doxorubicinu z polymemího nosiče. Výsledky těchto testů jsou uvedeny v příkladové části přihlášky.
Syntéza monomerů vychází ze syntézy HPMA monomeru již dříve popsaným způsobem [Ulbrich 2000]. Syntéza methakryloyl(aminoacyl)hydrazidů lišících se strukturou acylové komponenty je velmi obdobná u všech připravených monomerů a provádí se již dříve popsaným způsobem [Ulbrich patenty, Etrych patent]. Tato syntéza vychází z methakryloylace methylesteru hydrochloridu příslušné aminokyseliny nebo oligopeptidu methakryloylchloridem prováděné v dichlormethanu v přítomnosti bezvodého uhličitanu sodného. Výsledný produkt se převede na methakryloylovaný aminoacylhydrazin hydrazinolýzou příslušného methylesteru hydrazin hydrátem prováděnou v methanolovém nebo 2-propanolovém roztoku. Jako aminoacyl v methakryloyl(aminoacyl)hydrazinech je možno s výhodou použít glycyl, glycylglycyl, β-alanyl,
6-aminohexanoyl, 4-aminobenzoyl a nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly nebo GlyPheLeuGly. Jako příklad syntézy methakryloyl(aminoacyl)hydrazinu je uvedena v příkladě 1 syntéza 6-methakroyl(aminohexanoyl)hydrazidu.
Příprava (methakryloylamino)acylhydrazid-doxorubicinů vychází z vazebné reakce doxorubicin hydrochloridu na methakryloyl(aminoacyl)hydraziny za vzniku hydrazonové vazby. Reakce se provádí s výhodou v methanolu za katalýzy definovaného množství kyseliny octové s přídavkem inhibitoru. Reakce může být prováděna i v dimethylsulfoxidu, dimethylformamidu, sušeném ethanolu nebo dimethylacetamidu. Při použití jiných rozpouštědel nežli methanol reakce probíhá ί i ’ i i > '<
» » 1 > ϊ
J 1 » í J >
- 6dobře, její výtěžky jsou však nižší. Vliv struktury spojky na průběh vazebné reakce je minimální. Pro dosažení optimálního výtěžku vazby a minimálního obsahu nenavázaného doxorubicinu v produktu je ve všech případech důležité dodržet koncentrace reaktantů a kyseliny octové v reakční směsi: koncentrace doxorubicinu (DOX) 19 mg/ml, koncentrace kyseliny octové 51 mg/ml. Optimální doba reakce je 24 h při teplotě 25 °C. Výše uvedené podmínky jsou optimální, vedoucí k maximálním výtěžkům. Reakce může být prováděna i za mírně pozměněných reakčních podmínek, přizpůsobených typu použitého rozpouštědla i (methakryloylamino)acylhydrazidu. Pokud je použita nižší koncentrace DOX (10 mg/ml), je třeba pracovat při vyšší teplotě (až do 35 °C), je možné snížit koncentraci kyseliny octové až na 35 mg/ml, případně prodloužit dobu reakce (až do 28 hodin). Při vyšší koncentraci DOX (30 mg/ml) je výhodné zvýšit koncentraci kyseliny octové až max. na 60 mg/ml a zkrátit reakční dobu na 20 hodin, případně snížit teplotu na 20 °C. Na odstranění volného léčiva z produktu je možné s výhodou použít malý přídavek polymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2), jehož hydrazidové skupiny vyváží nezreagovaný doxorubicin (DOX). Reakční směs je následně vyčištěna gelovou filtrací, s výhodou na koloně LH-20 v methanolu. Frakce monomemího derivátu DOX je po zahuštění izolována vysrážením do diethyletheru. Příprava 6-'(methakryloylamino)hexanoylhydrazid-doxorubicinu a methakroylglycylfenylalanylleucylglycylhydrazid-doxorubicinu jako příklady syntézy (methakryloylamino)acylhydraziddoxorubicinů jsou uvedeny v příkladové části.
Syntéza polymerních konjugátů doxorubicinu - kopolymerů HPMA s methakryloylovanými deriváty aminokyselin a oligopeptidů zakončených hydrazonovou vazbou připojeným doxorubicinem je založena na přímé radikálové kopolymerizací HPMA s odpovídajícími methakryloylovanými deriváty DOX vzorce II i t Μ t t i i Ϊ ) )
Ž $ >
lir* »*
ί·Ό
Polymerace je prováděna v roztoku za použití methanolu, ethanolu, dimethylsulfoxidu nebo dimethylformamidu jako polymeračního prostředí. Polymerizace je iniciována tepelně rozložitelnými iniciátory_radikálové polymerizace na bázi azo nebo peroxy iniciátorů. S výhodou je možno použít azobis(ifobutyronitril) (AIBN), azobis(i|okyan#valerová kyselina) (ABIK) nebo diiřopropylperkarbonát (DIP). Teplota polymerizace se řídí příslušným iniciátorem a použitým rozpouštědlem (AIBN, ABIK v methanolu, ethanolu, DMF a DMSO 50 až 60 °C, DIP 40 až 50 °C). Obvyklá doba polymerizace je 15 až 24 h. Příprava všech polymerních konjugátů radikálovou polymerizací je analogická, například kopolymerizace HPMA s methakryloylovaným derivátem DOX je uvedena v příkladu 3. Oproti dříve používané polymeranalogické vazebné reakci DOX na polymerní prekurzor poly(HPMA-co-MA-AHNHNH2) vede přímá kopolymerizace HPMA s methakryloylovaným derivátem DOX k přesně definovaným polymemím konjugátům.
Polymerní konjusát je kopolymer HPMA s methakryloylovanými deriváty aminokyselin a oligopeptidů zakončených hydrazonovou vazbou připojeným doxorubicinem vzorce I t i t ? Í
S » ϊ Ϊ t i » 3 i i » i ř » » í » 3 » »
U) jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje 90 až 99,5 % mol. HPMA a 10 až 0,5 % mol. jednotek (methakryloylamino)acylhydrazid-doxorubicinů.
V používaných strukturních schématech je zavedena zkratka pro spojky (spacery) v bočních řetězcích konjugátů a monomerů - SPi je aminoacyl v methakryloylacylhydrazid-doxorubicinech, například glycyl, glycylglycyl, β-alanyl, 6-aminohexanoyl (AH), 4-aminobenzoyl a nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly a GlyPheLeuGly.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 představuje schéma struktury methakryloylovaných derivátů aminokyselin a oligopeptidů zakončených hydrazonovou vazbou připojeným doxorubicinem ((methakryloylamino)acylhydrazid-doxorubicin)).
Obr. 2 představuje schéma struktury konjugátu 1 - kopolymerů HPMA a methakryloylo váného derivátu aminokyselin a oligopeptidů zakončených hydrazonovou vazbou připojeným doxorubicinem (x = 40 až 335, y = 1 až 25).
) S 3 i > » ί ί »
» i »
- 9Obr. 3 představuje graf rychlosti uvolňování DOX z poiymerního konjugátu 1 a poiymerního konjugátu připraveného polymeranalogickou reakcí (patent Etrych) v pufru o pH 5 (model intracelulámího prostředí).
Obr. 4 představuje graf rychlosti uvolňování DOX z poiymerního konjugátu 1 a poiymerního konjugátu připraveného polymeranalogickou reakcí (patent Etrych) v pufru o pH 7,4 (model krevního řečiště).
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Syntéza monomerů
HPMA byl připraven podle dříve popsaného postupu [Ulbrich a kol. 2000]. Elementární analýza: vypočteno 58,8 % C, 9,16 % H, 9,79 % N; nalezeno 58,98 % C, 9,18 % H, 9,82 % N. Produkt byl chromatografícky čistý.
6-(methakryloylamino)hexanoylhydrazid (Ařl-(6-hydrazino-6-oxohexyl)-2-methylakrylamid) (MA-AH-NHNH2) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Ulbrich patenty, Etrych patent].
Methakroylglycylfenylalanylleucylglycylhydrazid (MA-Gly-D,L-PheLeuGly-NHNH2) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Etrych patent],
6-(Methakryloylamino)hexanoylhydrazid-doxorubicin (MA-AH-NHN=DOX)
6-(Methakryloylamino)hexanoylhydrazid (40 mg, 0,188 mmol) byl rozpuštěn pri teplotě místnosti v 6 ml methanolu. Tento roztok byl nalit do reakční nádobky, ve které byl umístěn doxorubicin.HCl (115 mg, 0,198 mmol), a suspenze byla intenzivně míchána. Do této suspenze bylo přidáno 310 μΐ kyseliny octové a reakční směs byla míchána 24 hodin pri 25 °C. Průběh reakce sledován na TLC - destičky Silikagel 60 F254 (methanol:chloroform:kyselina octová 2:8:1, Rf(DOX)= 0,75, Rf(MA-AH-NHN=DOX)= 0,9). V průběhu reakce došlo k pozvolnému rozpuštění suspenze a po 20 h reakce byl roztok homogenní. Po 24 hodinách bylo do homogenní reakční směsi přidáno 100 mg kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) (na vyvázání zbytkového volného DOX) a reakční směs míchána další 4 h při teplotě místnosti. Produkt byl vyčištěn od polymemích a nízkomolekulámích příměsí pomocí gelové chromatografie na koloně (30cm x 3cm) naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Nízkomolekulámí frakce byla zahuštěna na 2 ml a produkt vysrážen do 30 ml diethyleteru. Produkt byl odsát, promyt malým i * > i ) i »3 3 J i i i i 3 · ‘ » *» ?
-ϊ Ϊ 3 5 t
- 10 — množstvím diethyleteru a vakuově sušen do konstantní hmotnosti. Výtěžek činil 110 mg produktu (79 %) s teplotou tání 172 až 175 °C. TLC (methanol:chloroform:kyselina octová 2:8:1) jedna skvrna při Rf= 0,9. MALDI-TOF MS: 762 (M+Na).
Methakroylglycylfenylalanylleucylglycylhydrazid-doxorubicin (MA-GFLG-NHN=DOX)
Příprava MA- GFLG-NHN=DOX byla prováděna za podobných podmínek, jako v případě MAΑΗ-ΝΗΝ=ΟΟΧ. Methakroylglycylfenylalanylleucylglycylhydrazid (122 mg, 0,258 mmol) byl rozpuštěn při teplotě místnosti v 8,2 ml methanolu. Tento roztok byl nalit do reakční nádobky, ve které byl umístěn doxorubicin.HCl (157 mg, 0,271 mmol), a suspenze byla intenzivně míchána. Do této suspenze bylo přidáno 420 μΐ kyseliny octové a reakční směs byla míchána 24 hodin při 25 °C. Průběh reakce sledován na TLC - destičky Silikagel 60 F254 (methanol:chloroform:kyselina octová 2:8:1, Rf(DOX)= 0,75, Rf(MA-GFLG-NHN=DOX)= 0,95). V průběhu reakce došlo k pozvolnému rozpuštění suspenze a po 19 h reakce byl roztok homogenní. Po 24 hodinách bylo do homogenní reakční směsi přidáno 130 mg kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) (na vyvázání zbytkového volného DOX) a reakční směs míchána další 4 h při teplotě místnosti. Produkt byl vyčištěn od polymerních a nízkomolekulámích příměsí pomocí gelové chromatografie na koloně (30cm x 3cm) naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Nízkomolekulámí frakce byla zahuštěna na 2,5 ml a produkt vysrážen do 40 ml diethyleteru. Produkt byl odsát, promyt malým množstvím diethyleteru a vakuově sušen do konstantní hmotnosti. Výtěžek činil 210 mg produktu (78 %) s teplotou tání 179 až 182 °C. TLC (methanol:chloroform:kyselina octová 2:8:1) jedna skvrna při Rf= 0,95. MALDI-TOF MS: 1023 (M+Na).
Příklad 2: Syntéza polymemího konjugátu - Konjugátu 1 - kopolymeru HPMA s MA-AH- NHN=DOX
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHN=DOX)] byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHN=DOX v methanolu při 60 °C.
840 mg HPMA a 165 mg MA-AH-NHN=DOX (18 hm%jponomerů) bylo rozpuštěno v 5,7 ml metanolu, k roztoku bylo přidáno 67 mg ABIN (1,2 hm%). Po filtraci byla polymerizační směs vložena v argonové atmosféře do polymerizačního reaktoru (objem 20 ml) umístěného v termostatu. Nad hladinu byl ještě několik minut zaváděn dusík. Teplota polymerizační směsi byla nastavena na 60 °C a polymerizace probíhala za míchání (50 rpm) v dusíkové atmosféře.
ž } 5 > ϊ j :· i i ϊ >
ί ϊ » • a 3 i s >
-11ϊ ϊ ί ’
Polymerizační směs byla po 22 h vyjmuta z termostatu, ochlazena v lázni na pokojovou teplotu a polymer byl izolován vysrážením do ethylacetátu (celkem 100 ml). Vysrážený polymer byl izolován filtrací na fritě S4. Sraženina byla promyta ethylacetátem a sušena při teplotě místnosti za vakua membránové vývěvy cca 1 h. Polymerní produkt byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí a nenavázaného léčiva gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Polymerní frakce byla zachycena, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 5 ml a kopolymer byl izolován vysrážením do 50 ml ethylacetátu. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti.
Obsah celkového DOX byl stanoven spektrálně. Mw a Mn byly stanoveny kapalinovou chromatografií (LC AKTA) s detekcí rozptylem světla (Multiangel detector DAWN DSP, Wyatt).
Charakterizace polymerního léčiva; Yýýěžek polymerizační reakce: 750 mg (75 %), obsah celkového DOX 10,8 %váhovýeh, obsah volného DOX 0,35 % z celkového obsahu DOX, molekulová hmotnost M w = 34^)00, index polydisperzity Afw/ Mn = 1,72.
Příklad 3: Syntéza polymerního konjugátu - Konjugátu 2 - kopolymerů HPMA s MA-AHNHN=DOX
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHN=DOX) byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizaci HPMA a MA-AH-NHN=DOX v methanolu při 60 °C stejným způsobem jako v příkladu 2, s tím rozdílem, že složení polymerizační směsi bylo následující: 770 mg HPMA,
235 mg MA-AH-NHN=DOX, 5,7 ml metanolu, 67 mg ABIN (1,2 hm%f Izolace a čištění produktu bylo prováděno stejným způsobem, jako u příkladu 2. Charakterizace polyperního z./^ léčiva: Výtěžek polymerizační reakce: 740 mg (74 %), obsah celkového DOX 16,5 % vanových, obsah volného DOX 0,45 % z celkového obsahu DOX, molekulová hmotnost = 3^800, index polydisperzity Mw! M„ = 1,78.
Příklad 4: Syntéza polymerního konjugátu - Konjugátu 3 - kopolymerů HPMA s MAGFLG-NHN=DOX
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-GFLG-NHN=DOX) byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizaci HPMA a MA-GFLG-NHN=DOX v methanolu při 60 °C stejným způsobem jako v příkladu 2, s tím rozdílem, že složení polymerizační směsi bylo následující: 700 mg HPMA, ί ?
! ί 5 ϊ * ?
» J » ί > Í ♦ » »
- 12183 mg MA-AH-NHN=DOX, 5 ml metanolu, 64 mg ABIN (1,3 hm%). Izolace a čištění produktu bylo prováděno stejným způsobem, jako u příkladu 2. Charakterizace polymemíha i léčiva: Výtěžek polymerizační reakce: 670 mg (76 %), obsah celkového DOX 10,5 % váhových·, obsah volného DOX 0,32 % z celkového obsahu DOX, molekulová hmotnost Mw - 34800, indexpolydisperzity Mw! Mn=l,%2.
Příklad 5: Uvolňování doxorubicinu z roubovaných polymemích konjugátů Bylo měřeno množství doxorubicinu uvolněného z polymemích konjugátů po jejich inkubaci ve fosfátovém pufru o pH 5,0 (0,1 M fosfátový pufr obsahujícím 0,05 M NaCl) modelujícím intracelulámí prostředí a fosfátovém pufru pH 7,4 modelujícím prostředí krevního řečiště. Množství uvolňovaného DOX v inkubačním roztoku bylo stanoveno pomocí HPLC (Shimadzu).
V předem určených časových intervalech bylo odebíráno 50 μΐ inkubačního roztoku a analyzováno na koloně TSKGel G 3000x1, izokratický průtok 0,5 ml/min mobilní fáze složené ze směsi methanokoctanový pufr pH 6,5 (80 : 20 % obj.). Množství DOX bylo vypočteno z ploch píků volného a vázaného DOX (UV-VIS detekce při 488 nm). Po inkubaci konjugátů (koncentrace 5 mg/ml) ve fyziologickém prostředí při 36 °C (fosfátový pufr, pH 7,4) se uvolňuje jen malé množství léčiva (do 10 %/24 hod) (Obr. 4); naopak rychlost uvolňování DOX z roubovaných polymemích konjugátů, a tedy rychlost aktivace cytotoxického léčiva, je v mírně kyselém prostředí při pH 5,0 (Obr. 3) značná. Rychlosti uvolňování léčiva v pH 7,4 a pH 5 z polymemích konjugátů připravených přímou kopolymerizací s využitím 6-(methakryloylamino)acylhydrazid-doxorubicinů jsou plně srovnatelné s rychlostmi uvolňování léčiva zjištěných u hydrazonových konjugátů připravených polymeranalogickou reakcí (PA reakce) [Etrych patent]. Výsledky měření rychlosti in vitro uvolňování aktivního léčiva z polymerního nosiče v prostředí modelujícím prostředí krve (při dopravě léčiva organizmem) a intracelulámí prostředí cílové buňky potvrzuje vhodnost použití navrhovaného polymerního cytostatika pro nádorově specifické terapie.
> » >
> í i s : * I
S 3 ’>
) Μ } >3 » » » » » « í i i > *
- 13 —

Claims (13)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Polymerní léčivo ve formě konjugátu kopolymeru V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu HPMA s doxorubicinem vázaným na polymer prostřednictvím spojek obsahujících hydrolyticky štěpitelné hydrazonové vazby vzorce I (’), kde SPi představuje aminoacylovou spojku, zvolenou ze skupiny zahrnující glycyl, glycylglycyl, β-alanyl, 6-aminohexanoyl, 4-aminobenzoyl nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly nebo GlyPheLeuGly, x = 40 až 335, y= 1 až 25, sestávající z 90 až 99,5 % mol. jednotek HPMA a 10 až 0,5 % mol. komonomemích jednotek obsahujících doxorubicin.
  2. 2. Způsob výroby polymerního konjugátu vzorce I podle nároku 1, vyznačující se přímou kopolymerací monomeru obsahujícího doxorubicin vzorce II i ϊ ·> i > ί JI JI* ί » » ϊ 5 3 — 14 — (π), kde SPj má význam uvedený v nároku 1, s HPMA v molámím poměru 90 až 99,5 : 10 až 0,5.
    azobis(i$okyan$valero
  3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se polymerace provádí v prostředí methanolu, ethanolu, dimethylsulfoxidu nebo dimethylfi^mamidu a je iniciována tepelně rozložitelnými iniciátory radikálové polymerace.
  4. 4. Způsob podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že jsou iniciátory radikálové polymerace zvoleny ze skupiny, kterou tvoří azobis(ijiobutyronitril) AIBN, vá^kyselina ABIK a diifopropylperkarbonát DIP.
  5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že je iniciátor zvolen ze skupiny AIBN nebo ABIK a reakce probíhá při 50 až 60 °C po dobu 15 až 24 hodin.
  6. 6. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že je jako iniciátor zvolen DIP a reakce probíhá při 40 až 50 °C pod dobu 15 až 24 hodin.
  7. 7. Způsob podle nároků 2 až 6, vyznačující se tím, že je monomemí jednotka vzorce II vyrobena reakcí doxorubicin hydrochloridu s methakryloyl(aminoacyl)hydraziny vzorce MA-SP1NHNH2, kde MA je methakryloyl a SPi má význam uvedený v nároku 1, v organickém rozpouštědle za přítomnosti kyseliny octové.
    - 158. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že je ve výchozí směsi koncentrace doxorubicinu volena v rozmezí koncentrací 10 až 30 mg/ml a kyseliny octové v rozmezí 35 až 60 mg/ml.
  8. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že je ve výchozí reakční směsi koncentrace doxorubicinu hydrochloridu 19 mg/ml a kyseliny octové 51 mg/ml.
  9. 10. Způsob podle libovolného z nároků 7 až 9, vyznačující se tím, že reakce se provádí při teplotě 20 až 35 °C po dobu 20 až 28 hodin.
  10. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že reakce se provádí při teplotě 25 °C po dobu 24 h.
  11. 12. Způsob podle nároku 7 až 11, vyznačující se tím, že se po ukončení reakce pro odstranění přebytečného doxorubicinu použije kopolymer HPMA s methakryloylo váným (aminoacyl)hydrazidem.
  12. 13. Způsob podle nároku 7 až 12, vyznačující se tím, že je reakční prostředí tvořeno organickým rozpouštědlem zvoleným ze skupiny, kterou tvoří methanol, bezvodý ethanol, dimethylsulfoxid, dimethylformamid a dimethylacetamid.
  13. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, zeje reakční prostředí tvořeno methanolem.
    ΊΧοΡ- pop-
CZ20060505A 2006-08-09 2006-08-09 Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy CZ299053B6 (cs)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20060505A CZ299053B6 (cs) 2006-08-09 2006-08-09 Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy
DE602007012111T DE602007012111D1 (de) 2006-08-09 2007-08-08 Polymerkonjugate von doxorubicin mit ph-regulierter freisetzung des arzneimittels und herstellungsverfahren
AT07785504T ATE495759T1 (de) 2006-08-09 2007-08-08 Polymerkonjugate von doxorubicin mit ph- regulierter freisetzung des arzneimittels und herstellungsverfahren
UAA200902032A UA95814C2 (ru) 2006-08-09 2007-08-08 ПОЛИМЕРНЫЕ КОНЬЮГАТЫ ДОКСОРУБИЦИНА С рН-РЕГУЛИРОВАННЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
PT07785504T PT2049157E (pt) 2006-08-09 2007-08-08 Conjugados poliméricos de doxorubicina com libertação do fármaco regulada pelo ph e método de preparação
EA200900295A EA200900295A1 (ru) 2006-08-09 2007-08-08 Полимерные конъюгаты доксорубицина с рн-регулируемым высвобождением лекарственного средства и способ получения
ES07785504T ES2356991T3 (es) 2006-08-09 2007-08-08 Conjugados poliméricos de doxorubicina con liberación del fármaco regulada por ph y un método de preparación.
EP07785504A EP2049157B1 (en) 2006-08-09 2007-08-08 Polymeric conjugates of doxorubicin with ph-regulated release of the drug and a method of preparing
US12/376,915 US20100190928A1 (en) 2006-08-09 2007-08-08 Polymeric conjugates of doxorubicin with ph-regulated release of the drug and a method of preparing
PL07785504T PL2049157T3 (pl) 2006-08-09 2007-08-08 Polimeryczne koniugaty doksorubicyny o uwalnianiu leku regulowanym za pomocą pH i sposób wytwarzania
PCT/CZ2007/000077 WO2008017277A2 (en) 2006-08-09 2007-08-08 Polymeric conjugates of doxorubicin with ph-regulated release of the drug and a method of preparing

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20060505A CZ299053B6 (cs) 2006-08-09 2006-08-09 Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2006505A3 true CZ2006505A3 (cs) 2008-04-09
CZ299053B6 CZ299053B6 (cs) 2008-04-09

Family

ID=38828704

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20060505A CZ299053B6 (cs) 2006-08-09 2006-08-09 Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20100190928A1 (cs)
EP (1) EP2049157B1 (cs)
AT (1) ATE495759T1 (cs)
CZ (1) CZ299053B6 (cs)
DE (1) DE602007012111D1 (cs)
EA (1) EA200900295A1 (cs)
ES (1) ES2356991T3 (cs)
PL (1) PL2049157T3 (cs)
PT (1) PT2049157E (cs)
UA (1) UA95814C2 (cs)
WO (1) WO2008017277A2 (cs)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090311182A1 (en) * 2004-03-31 2009-12-17 Dong Wang Macromolecular Delivery Systems for Non-Invasive Imaging, Evaluation and Treatment of Arthritis and Other Inflammatory Diseases
CZ303072B6 (cs) * 2009-02-13 2012-03-21 Zentiva, K.S. Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika
CN102740795B (zh) * 2009-09-09 2016-11-02 内布拉斯加大学董事委员会 用于检测和治疗植入物松动和骨质溶解的组合物和方法
CN103936945B (zh) * 2013-01-23 2017-02-08 中国科学院化学研究所 一类高效抗肿瘤靶向药物载体及其制备方法
CN105963706B (zh) * 2016-04-15 2019-03-15 四川大学 一种支化hpma共聚物-dox偶联物及其制备方法和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4619457B2 (ja) * 1993-11-18 2011-01-26 シルテックス、メディカル、リミテッド 徐放性製剤
US6060518A (en) * 1996-08-16 2000-05-09 Supratek Pharma Inc. Polymer compositions for chemotherapy and methods of treatment using the same
CZ293787B6 (cs) * 2001-12-20 2004-07-14 Zentiva, A.S. pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii
CZ297827B6 (cs) * 2005-09-05 2007-04-04 Zentiva, A. S. Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva

Also Published As

Publication number Publication date
EA200900295A1 (ru) 2009-06-30
PL2049157T3 (pl) 2011-04-29
WO2008017277A2 (en) 2008-02-14
UA95814C2 (ru) 2011-09-12
PT2049157E (pt) 2011-02-23
ES2356991T3 (es) 2011-04-15
DE602007012111D1 (de) 2011-03-03
CZ299053B6 (cs) 2008-04-09
US20100190928A1 (en) 2010-07-29
ATE495759T1 (de) 2011-02-15
EP2049157B1 (en) 2011-01-19
EP2049157A2 (en) 2009-04-22
WO2008017277A3 (en) 2008-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104383554B (zh) 用于传递治疗剂的以环糊精为基础的聚合物
JP4883515B2 (ja) 均一分子量ポリマー
EP2063914B1 (en) Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation
WO1999061061A1 (fr) Composites medicamenteux
CN101541347A (zh) 药物载体、其合成及其使用方法
CA3046541A1 (en) Biocompatible and hydrophilic polymer conjugate for targeted delivery of an agent
EP1922087B1 (en) Method for the preparation of polymeric conjugates of doxorubicin with ph-controlled release of the drug
EP1463529B1 (en) Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy
EP2049157B1 (en) Polymeric conjugates of doxorubicin with ph-regulated release of the drug and a method of preparing
KR20180085761A (ko) 능동 타겟팅 나노입자
CZ303072B6 (cs) Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika
WO2007110003A2 (en) Micellar carriers for drugs with anti-cancer activity
CZ2009844A3 (cs) Dendritické vysokomolekulární polymerní nosice léciv a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru
Chytil et al. Structural design and synthesis of polymer prodrugs
Sintov et al. Polymeric drug delivery of enzymatically degradable pendant agents: Peptidyl-linked procainamide model system studies
Class et al. Patent application title: POLYMERIC CONJUGATES OF DOXORUBICIN WITH PH-REGULATED RELEASE OF THE DRUG AND A METHOD OF PREPARING Inventors: Tomas Etrych (Praha, CZ) Karel Ulbrich (Praha, CZ)
KR102266865B1 (ko) 지방산을 유효성분으로 포함하는 수용성 광감작제 결합체 및 이의 제조방법
WO2021121446A1 (en) Copolymer with hydrolytic release of cancerostatic agent cytarabine, method of its preparation and use thereof
Kotrchová et al. Synthesis of water-soluble star polymers based on cyclodextrins
RO138087A2 (ro) Conjugate polimerice pe bază de poli(2-izopropenil-2-oxazolină) şi doxorubicină pentru imuno-chimio-terapia cancerului şi procedeu de obţinere al acestora

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20210809