CZ2005558A3 - Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva - Google Patents

Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva Download PDF

Info

Publication number
CZ2005558A3
CZ2005558A3 CZ20050558A CZ2005558A CZ2005558A3 CZ 2005558 A3 CZ2005558 A3 CZ 2005558A3 CZ 20050558 A CZ20050558 A CZ 20050558A CZ 2005558 A CZ2005558 A CZ 2005558A CZ 2005558 A3 CZ2005558 A3 CZ 2005558A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
process according
polymer
doxorubicin
polymerization
polymeric
Prior art date
Application number
CZ20050558A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ297827B6 (cs
Inventor
Etrych@Tomás
Chytil@Petr
Studenovský@Martin
Pechar@Michal
Ulbrich@Karel
Ríhová@Blanka
Original Assignee
Zentiva, A. S.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zentiva, A. S. filed Critical Zentiva, A. S.
Priority to CZ20050558A priority Critical patent/CZ2005558A3/cs
Priority to PCT/CZ2006/000056 priority patent/WO2007028347A2/en
Priority to AT06775676T priority patent/ATE520419T1/de
Priority to US12/065,745 priority patent/US20080318879A1/en
Priority to EA200800756A priority patent/EA015091B1/ru
Priority to UAA200804282A priority patent/UA94594C2/ru
Priority to EP06775676A priority patent/EP1922087B1/en
Publication of CZ297827B6 publication Critical patent/CZ297827B6/cs
Publication of CZ2005558A3 publication Critical patent/CZ2005558A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)

Abstract

Zpusob prípravy polymerních konjugátu N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu a methakryloylaminoacylhydrazonu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva, zahrnující tri stupne syntézy: a. prípravu monomerního methakryloylaminoacylhydrazinu, kde aminoacyl je odvozen od aminokyseliny nebo oligopeptidu,reakcí methakryloyl halogenidu s príslusným peptidem, aminokyselinou nebo jejich derivátem a následnou hydrazinolýzou, b. syntézu polymerních prekurzoru prímou kopolymerací N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu s methakryloyl aminoacylhydrazinem a c. navázání doxorubicinu na polymerní prekurzor jaho reakcí s doxorubicin hydrochloridem.

Description

Oblast techniky
Vynález se týká způsobu přípravy vodorozpustných polymemích kancerostatik umožňujících cílený transport a řízené uvolňování cytostatik v organizmu, preferenčně v nádorové tkáni a nádorových buňkách. Použití polymemích konjugátů je zaměřeno na cílenou terapii nádorových onemocnění v humánní medicíně.
Dosavadní stav techniky
Vývoj nových farmakologicky účinných látek, především kancerostatik, se stále více zaměřuje na formy, které umožňují specifické působení aktivní složky pouze v určité tkáni a nebo dokonce jen v určitém typu buněk. Při přípravě těchto látek se stále více uplatňuje použití přírodních a nebo syntetických makromolekul - polymerů. Byla připravena a studována celá řada polymemích konjugátů kancerostatik a bylo ukázáno, že ve většině případů je nezbytné pro dosažení farmakologické účinnosti polymemí formy léčiva zajistit uvolnění cytotoxické látky z její polymemí formy. Dále bylo ukázáno, že vhodná molekulová hmotnost polymemího nosiče může zajistit přednostní ukládání polymemího léčiva v nádorové tkáni celé řady pevných nádorů (tzv. EPR efekt) [H. Maeda, J. Wu, T. Sawa, Y. Matsumura, K. Hoři, Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J Control Release 65, 271-284 (2000)]. Uvolnění cytostatika z polymemího nosiče může být řešeno prostřednictvím biodegradovatelné spojky, použité k vazbě léčiva na polymer, jejíž degradace v cílové tkáni vede k cílené a řízené aktivaci léčiva přednostně v této tkáni. Významnou skupinu takovýchto léčiv tvoří polymemí léčiva připravená na bázi kopolymerů 7V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA). Přehled dosud dosažených výsledků v této oblasti je velmi dobře zpracován v monografii G.S. Kwona a práci J. Kopečka a spol. [J. Kopeček, P. Kopečková, T. Minko, Z. Lu, HPMA CopolymerAnticancer Drug Conjugates: Design, Activity, and Mechanism of Action. Europ. J. Pharm. Biopharm. 50, 61 - 81 (2000), G.S. Kwon, Polymeric Drug Delivery Systems, Senes: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol. 148, Dekker, Marcel Incorporated, 2005], V poslední době byly publikovány studie o působení polymemích léčiv, ve kterých bylo kancerostatikum ( « t doxorubicin navázáno na polymemí nosič, připravený na bázi kopolymerů HPMA, prostřednictvím hydrolyticky nestálé hydrazonové vazby [T. Etrych, M. Jelínková, B. Říhová,
K. Ulbrich, New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH sensitive linkage. Synthesis, in vitro and in vivo biological properties. J. Controlled Rel. 73, 89-102 (2001), T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, K. Ulbrich, Synthesis of HPMA Copolymers Containing Doxorubicin Bound via a Hydrazone Linkage. Effect of Spacer on Drug Release and in vitro Cytotoxicity. Macromolecular Biosci. 2, 43-52 (2002), B. Říhová, T. Etrych, M. Pechar, M. Jelínková, M. Šťastný, O. Hovorka, M. Kovář, K. Ulbrich, Doxorubicin Bound to a HPMA Copolymer Carrier Through Hydrazone Bond is Effective also in a Cancer Cell Line with a Limited Content of Lysosomes. J. Controlled Release 74, 225-232 (2001), K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, HPMA Copolymers with pH-Controlled Release of Doxorubicin. In vitro Cytotoxicity and in vivo Antitumor Activity. J. Controlled Release 87, 33-47 (2003), K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, Antibody-Targeted Polymer-Doxorubicin Conjugates with pH-Controlled Activation. J. Drug Targeting, 12, 477-490 (2004), K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M. Pechar, M. Jelínková, B. Říhová, Polymeric Anticancer Drugs with pH-Controlled Activation. Int. J. Pharm. 277/1-2 67-72 (2004)] a tyto látky byly patentovány [K. Ulbrich, T. Etrych, B. Říhová, M. Jelínková, M. Kovář: pH Senzitivní polymemí konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii. CZ 293787; CZ 293886]. Takováto léčiva vykazovala podstatné snížení vedlejších, především toxických účinků na zdravý organizmus za současného výrazného zvýšení protinádorového účinku ve srovnání s běžně užívanými cytostatiky [B. Říhová, T. Etrych, M. Pechar, M. Jelínková, M. Šťastný, O. Hovorka, M. Kovář, K. Ulbrich, Doxorubicin Bound to a HPMA Copolymer Carrier Through Hydrazone Bond is Effective also in a Cancer Cell Line with a Limited Content of Lysosomes. J. Controlled Release 74, 225-232 (2001), M. Kovář,
L. Kovář, V. Šubr, T. Etrych, K. Ulbrich, T. Mrkvan, J. Loucká and B. Říhová, HPMA Copolymers Containing Doxorubicin Bound by Proteolytically or Hydrolytically Cleavable Bond: Comparison of Biological Properties In Vitro. J. Controlled Release 99,301-314 (2004), O. Hovorka, T. Etrych, M. Šubr, J. Strohalm, K. Ulbrich, B. Říhová, Differences in the Intracellular Fate of Free and Polymer-Bound Doxorubicin. J. Controlled Release 80,101 117(2002)].
Syntéza takovýchto konjugátů byla prováděna nejdříve polymeranalogickou reakcí polymemích 4-nitrofenylových esterů (ONp) s hydrazinem a později kopolymerizací HPMA s/V-Boc (t-butyloxykarbonyl) skupinou chráněnými methakryloylovanými hydrazidy. Ani jeden z postupů nevedl k přípravě přesně definovaných preparátů (v případě ONp esterů
S i «
I « i dochází k přenosovým reakcím a hydrolýze části ONp skupin v průběhu hydrazinolýzy, v případě Boc hydrazidů kdegradačním reakcím v průběhu odblokování hydrazidových skupin) a zároveň neumožňoval volbu širokého rozmezí molekulových hmotností polymemího řetězce, syntéza neumožňovala přípravu velkých šarží a reprodukovatelnost přípravy jednotlivých šarží byla poměrně nízká. Navíc syntézy byly vícekrokové, což představovalo jistou časovou a finanční náročnost příprav.
Předmětem tohoto vynálezu je optimalizovaný a reprodukovatelný způsob přípravy polymemích cytostatik na bázi kopolymerů HPMA s doxorubicinem vázaným pH labilní hydrazonovou vazbou kpolymemímu nosiči, který odstraňuje prakticky všechny výše uvedené nedostatky dříve publikovaných příprav, především umožňuje zvýšit výtěžky při syntéze monomerů i polymemího prekurzoru, poskytuje možnost přesně řídit molekulové hmotnosti polymemích prekurzorů a konečného produktu, struktura je díky výhodným kopolymeračním parametrům dobře definovaná, syntéza je výrazně jednodušší a levnější, umožňuje „scale-up“ na velké šarže a reprodukovatelnost syntézy je velmi dobrá. Protinádorová aktivita polymemích cytostatik připravených podle patentovaného postupu je stejná, nebo dokonce i lepší nežli u cytostatik připravených původními postupy.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je postup přípravy polymemího konjugátu HPMA kopolymerů s doxorubicinem vázaným na polymer prostřednictvím různých spojek obsahujících hydrolyticky štěpitelné hydrazonové vazby. Postup přípravy zahrnuje třístupňovou syntézu sestávající ze syntézy monomerů, tj. přípravy monomemího methakryloyl aminoacylhydrazinu, syntézy polymemích prekurzorů a finální vazby kancerostatika doxorubicinu na polymemí nosič kovalentní hydrazonovou vazbou.
Syntéza monomerů vychází ze syntézy HPMA monomeru již dříve popsaným způsobem [K. Ulbrich, V. Šubr, J. Strohalm, D. Plocová, M. Jelínková, B. Říhová, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules I. Synthesis and Physico-chemical Characterisation. J. Controlled Rel. 64, 63-79 (2000)]. Syntéza methakryloyl(aminoacyl)hydrazinů lišících se strukturou acylové komponenty byla velmi podobná u všech připravených monomerů a vychází z methakryloylace methylesteru hydrochloridu příslušné aminokyseliny nebo oligopeptidu methakryloylchloridem prováděné v dichlormethanu v přítomnosti bezvodého uhličitanu sodného. Výsledný produkt byl převeden na methakryloylovaný aminoacylhydrazin hydrazinolýzou příslušného methylesteru hydrazin hydrátem prováděnou v methanolovém roztoku v přítomnosti NaOH. Jako aminoacyl v methakryloyl(aminoacyl)hydrazinech byl s výhodou použit glycyl, glycylglycyl, B-alanyl, 6-aminohexanoyl, 4-aminobenzoyl a nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly nebo GlyPheLeuGly. Jako příklad syntézy methakryloyl(aminoacyl)hydrazinu je uvedena v příkladu 1 syntéza 6-methakroyl(aminohexanoyl)hydrazinu jako příklad syntézy jednoduchého acylu (spaceru), methakroylglycylglycylhydrazinu jako monomeru s dipeptidovým spacerem a methakroylglycylfenylalanylleucylglycylhydrazinu jako monomeru s enzymaticky degradovatelným oligopeptidem.
Syntéza polymerních prekurzorů - kopolymerů HPMA s methakryloylovanými aminoacylhydraziny je založena na přímé radikálové kopolymerizaci HPMA s odpovídajícími methakryloylovanými hydraziny. Polymerace je prováděna v roztoku za použití methanolu, ethanolu, dimethylsulfoxidu nebo dimethylformamidu jako polymeraěního prostředí. V obou případech je polymerizace iniciována tepelně rozložitelnými iniciátory radikálové polymerizace na bázi azo nebo peroxy iniciátorů. S výhodou byl použit azobis(isobutyronitril) (AIBN), azobis(isokyanovalerová kyselina) (ABIK) nebo diisopropylperkarbonát (DIP). Teplota polymerizace se řídí příslušným iniciátorem a použitým rozpouštědlem (AIBN, ABIK v methanolu, ethanolu, DMF a DMSO 50 až 60 °C, DIP 40 až 50 °C). Obvyklá doba polymerizace je 15 až 18 h. Příprava všech polymerních prekurzorů radikálovou polymerizací je analogická, příklady kopolymerizace HPMA s methakrylovanými hydrazidy jsou uvedeny v příkladech 2a až 2c. Oproti dříve používané hydrazinolýze reaktivních esterů nebo kopolymerizaci Boc skupinou chráněných hydrazidů vede přímá kopolymerizace k definovaným a reprodukovatelně připraveným polymerům přepravitelným ve velkých šaržích a ve velkém výtěžku.
Vazba doxorubicinu na polymerní prekurzor vychází z vazebné reakce doxorubicin hydrochloridu na polymerní acylhydrazin za vzniku hydrazonové vazby. Reakce se provádí s výhodou v methanolu za katalýzy definovaného množství kyseliny octové. Reakce může být prováděna i v dimethylsulfoxidu, dimethylformamidu, sušeném ethanolu a dimethylacetamidu. Při použití jiných rozpouštědel nežli methanol reakce probíhá dobře, její výtěžky jsou však nižší. Vliv struktury spojky na průběh vazebné reakce je minimální. Pro dosažení optimálního výtěžku vazby a minimálního obsahu nenavázaného doxorubicinu v produktu je ve všech případech důležité dodržet koncentrace polymeru a kyseliny octové v reakční směsi:
·,. :
koncentrace polymeru 170 mg/ml, koncentrace kyseliny octové 55 mg/mL. Optimální doba reakce je 22 h při teplotě 25 °C. Polymemí léčivo je izolováno z reakční směsi srážením do ethylacetátu a přesrážením z methanolu opět do ethylacetátu. Příprava polymemího doxorubicinu vázaného na polymemí prekurzor - kopolymer poly(HPMA-co-MA-AHNHNH2) hydrazonovou vazbou (PHPMA-AH-NH-N=DOX) je uvedena v příkladu 3.
Součástí přípravy, i když ne nezbytnou, je i finální čištění konjugátu od volného nenavázaného léčiva pomocí gelové filtrace za použití kolony naplněné Sephadexem LH-20 a methanolu jako mobilní fáze.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 znázorňuje graf uvolňování DOX z polymemích konjugátů lišících se strukturou použité spojky mezi léčivem a polymerem. Teplota 37 °C, fosfátový pufř pH 5,5. GFLG je spojka tvořená sekvencí -GlyPheLeuGly-, GLG je -GlyLeuGly-, Aminobenzoic je 4-aminobenzoyl a Acap je 6-aminohexanoyl.
Příklady provedení vynálezu:
Příklad 1: Syntéza monomerů
HPMA byl připraven podle dříve popsaného postupu [K. Ulbrich, V. Šubr, J. Strohalm, D. Plocová, M. Jelínková, B. Říhová, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules I. Synthesis and Physico-chemical Characterisation. J. Controlled Rel. 64, 63-79 (2000)]. Elementární analýza: vypočteno 58,8 % C, 9,16 % H, 9,79 % N; nalezeno 58,98 % C, 9,18 % H, 9,82 % N. Produkt byl chromatograficky čistý.
6-(Methakroylamino)hexanoylhydrazin (MA-AH-NHNH2)
Methyl(6-aminohexanoát)hydrochlorid (30 g, 0,165 mol) byl za intenzivního míchání při laboratorní teplotě rozpuštěn ve 350 ml dichlormethanu s přídavkem cca 100 mg hydrochinonu. Roztok byl ochlazen na 10 až 15 °C, přidán bezvodý uhličitan sodný (50 g, 0,48 mol), teplota snížena na 5 až 10 °C a poté přikapán roztok methakroylchloridu (17,3 g, 0,165 mol (ekv.)) ve 100 ml dichlormethanu takovou rychlostí, aby teplota reakční směsi nepřesáhla 15 °C. Po spotřebování veškerého methakroylchloridu byla směs míchána ještě 45 , r .....
Xif ; ; ,ιι i , ,ιι II I ' min pň teplotě 15 až 20 °C, poté byla chladící lázeň odstavena, suspenze míchána ještě 20 min, odsáta na fritě č. 3, promyta 300 ml dichlormethanu a filtrát odpařen na rotační vakuové odparce do sucha. Odparek byl rozpuštěn ve 150 ml methanolu, přidán hydrazin hydrát (13 ml « 13,4 g, 0,267 mol), NaOH (1,5 g, 37,5 mmol) a reakční směs byla míchána 3 h při laboratorní teplotě. Po skončení hydrazinolýzy bylo pH roztoku upraveno přídavkem 35%
HC1 (cca 12 ml) na 6,2 až 6,5, přidáno 300 g bezvodého síranu sodného a směs i se sušidlem odpařena k suchu. K odparku bylo přidáno 500 ml dichlormethanu, suspenze intenzivně míchána 2 h, odsáta na fritě č. 4, důkladně promyta dalšími 500 ml dichlormethanu a filtrát zahuštěn na odparce na objem 150 až 200 ml. Roztok byl zředěn 1500 ml ethylacetátu, zahuštěn ke krystalizaci na odparce na objem 300 až 350 ml a ponechán dokrystalovat po dobu 24 h v mrazícím boxu. Produkt byl odsát, promyt malým množstvím chladného ethylacetátu a vakuově sušen. Výtěžek po první krystalizaci činil 29,5 g produktu (84 %) b&piotott r spodem/tání 79 až 81 °C, opakovaná krystalizace stejným postupem poskytla 27,0 g produktu teplotou (ΊΊ %) sjbedefiqftání 80 až 82 °C. Elementární analýza: Vypočteno: C 56,32 %, H 8,98 %, N 19,70 % Nalezeno: C 56,49 %, H 8,63 %, N 19,83 %. H-NMR 300 MHz (CDC13, 297 K): 1,35 m (2H, CH^CH^-N); 1,50-1,69 m (4H, CÍECHjCIhCHrN); 1,95 dd (3H, CH3); 2,171 (2H, ((C=O)-CH2); 3,26 dt (2H, N-CH2); 3,91 s (2H, NH2); 5,301 (1H, C=CH2 E); 5,671 (1H, C=CH2 Z); 6,10 s (1H, NHNH2); 7,45 s (1H, NH-CH2). Produkt byl chromatograficky čistý, 1 pík při 4,72 min (kolona s reverzní fází Tessek SGX Cis (7 pm, 125x4 mm), průtok 0,5 ml/min, gradient od 40 do 100 % roztoku B v průběhu 35 min (roztok A: 10 % methanol, 89,9 % voda, 0,1 % trifluoroctové kyseliny (TFA); roztok B: 89,9 % methanol; 10 % voda; 0,1 % TFA), UV detekce).
Methakroylglycylglycylhydrazin (MA-GlyGly-NHNH2)
Příprava MA-GlyGly-NHNH2 byla prováděna za podobných podmínek, jako v případě MAAH-NHNH2. Glycylglycin methylester (21,4 g, 0,1 mol) byl rozpuštěn ve 250 ml dichlormethanu s přídavkem 60 mg hydrochinonu. Po ochlazení na cca 12 °C byl přidán bezvodý uhličitan sodný (30,2 g, 0,29 mol), a za chlazení na 5 až 10 °C pomalu přikapán roztok methakroylchloridu (10,4 g, 0,1 mol) v 60 ml dichlormethanu. Po ukončení reakce, odfiltrování a promytí sraženiny cca 230 ml dichlormethanu bylo odpařeno veškeré rozpouštědlo. Odparek byl rozpuštěn ve 120 ml methanolu a provedena hydrazinolýza hydrazin hydrátem (7,9 ml « 8,1 g, 0,166 mol), prováděná v přítomnosti NaOH (0,91 g, 22,7 mmol). Po skončení hydrazinolýzy bylo pH roztoku upraveno přídavkem 35% HC1 (cca 12 ml) na 6,2 až 6,5, přidáno 230 g bezvodého síranu sodného a směs i se sušidlem odpařena
t * k suchu. Po extrakci 300 ml dichlormethanu byla suspenze odsáta na fritě, promyta dalšími
300 ml dichlormethanu a filtrát zahuštěn na objem cca 120 ml. Roztok byl zředěn 900 ml ethylacetátu a po zahuštění na odparce na 250 ml ponechán krystalovat v mrazícím boxu. Po rekrystalizaci byl produkt izolován filtrací, promyt malým množstvím chladného ethylacetátu t az* a sušen za vakua. Výtěžek byl 15,0 g produktu (70 %), J^.t. 172/(174 °C. Elementární analýza: Vypočteno: C 44,86 %, H 6,54 %, N 26,16 % Nalezeno: C 45,01 %, H 6,57 %, N 26,02 %. Produkt byl chromatograficky čistý, jeden pík při 21,97 min.
Methakroylglycylfenylalanylleucylglycylhydrazin (MA-Gly-D,L-PheLeuGly-NHNH2) Syntéza tohoto monomeru byla prováděna obdobně jako v obou předchozích případech (postup viz výše). Složení reakční směsi a podmínky byly následující:
Glycylfenylalanylleucylglycin methylester (22,32 g, 0,05 mol), dichlormethan 510 ml (270 + 240 ml), hydrochinon (60 mg), uhličitan sodný (15,1 g, 0,145 mol) a methakroylchlorid 5,2 g (0,05 mol) byly použity pro přípravu methakrylovaného methylesteru. K hydrazinolýze bylo použito 4,1 g (0,085 mol) hydrazin hydrátu ve 120 ml methanolu a 0,46 (11,3 mmol) NaOH. Pro sušení bylo použito 210 g bezvodého síranu sodného a pro extrakce 2 x 290 ml dichlormethanu. Produkt byl krystalován ze směsi dichlormethan - ethylacetát. Výtěžek byl 60 % produktu o ^.t. 139 až 140 °C. Elementární analýza: Vypočteno: C 58,10 %, H 7,36 %, N 17,68 % Nalezeno: C 58,21 %, H 7,39 %, N 17,54 %. Produkt byl chromatograficky čistý, dva píky o shodné ploše při 19,39 (monomer obsahující L-Phe) a 19,91 min (D-Phe).
Příklad 2a: Syntéza polymerního prekurzoru - kopolymeru HPMA s 6- (meth akr oy lamin o)hexanoylhydrazinem (poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2))
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHNH2 iniciovanou AIBN v metanolu při 60 °C.
122,8 g HPMA a 13,94 g MA-AH-NHNH2 (18 hn^% monomerů) bylo rozpuštěno v 780 ml metanolu, k roztoku bylo přidáno 6,06 g ABIN (0,8 hmotn. %). Po filtraci byla polymerizační směs vložena v argonové atmosféře do polymerizačního reaktoru (objem 1,5 1) umístěného v termostatu. Polymerizační směs byla míchána při vyšších otáčkách (kolem 100 rpm). Nad hladinu byl ještě několik minut zaváděn dusík. Teplota polymerizační směsi byla nastavena na 60 °C a polymerizace probíhala za míchání (50 rpm) v dusíkové atmosféře. Dusík byl odváděn přes probublávací zařízení.
Polymerizační směs byla po 17 h vyjmuta z termostatu, ochlazena v lázni na pokojovou teplotu a polymer byl izolován vysrážením do ethylacetátu (celkem 8 1). Vysrážený polymer
I t t i i í « <
< ( ( <
i < < « < i « » , i » t » ( » t < i » » byl ponechán sedimentovat cca 0,5 h, roztok nad sraženinou byl odsát a polymer byl izolován filtrací na fřitě S4. Sraženina byla promyta ethylacetátem, přemístěna na velké Petriho misky a sušena při laboratorní teplotě za vakua membránové vývěvy cca 1 h.
Polymer byl za pomoci ultrazvuku rozpuštěn v 550 ml methanolu (Erlenmayerova baňka o objemu 1 1) a přesrážen do 7,5 1 ethylacetátu stejným postupem jako při prvé izolaci. Vysrážený polymer byl po cca 0,5 h sedimentaci izolován filtrací na fřitě S4, promyt ethylacetátem a sušen do konstantní hmotnosti (cca 5 h) na membránové vývěvě a dosušen za vakua olejové vývěvy.
Charakterizace kopolymeru:
Výtěžek 114 g (83 %), obsah hydrazidových skupin 5,83 mol %, molekulová hmotnost Mw = 28500 g/mol, index polydispersity In = 1,9.
Příklad 2b: Syntéza polymerního prekurzoru - kopolymeru HPMA s methakroylglycylglycylhydrazinem (poly(HPMA-co-MA-GlyGly-NHNH2))
Provedení a postup polymerizace byly stejné jako v příkladu 2a, rozdíl byl ve složení polymerizaění směsi. Složení polymerizační směsi bylo následující: HPMA 10 g (70 mmol), MA-GlyGly-NHNH2 1,5 g (7mmol), diisopropylperkarbonát 1,15 g (0,91 % hmotn.) a dimethylformamid 115 ml. Teplota polymerizace byla 50 °C, doba polymerizace byla 16 h. Polymemí roztok byl před srážením do přebytku ethylacetátu zahuštěn na vakuové odparce na cca 2/3 původního objemu a srážení polymerního produktu bylo prováděno do 20tinásobného objemu srážedla. Polymer byl zbaven nízkomolekulámích příměsí přesrážením z methanolu do ethylacetátu. Výtěžek byl 8,5 g (70 %), obsah hydrazidových skupin 9,5 mol. %, molekulová hmotnost Mw = 41 700 g/mol, index polydispersity In = 2,1.
Příklad 2c: Syntéza polymerního prekurzoru - kopolymeru HPMA s meth akroylglycylfenylalanylleucvlglycy Ihydrazinem (póly(HPMA-co-MA- GlyPheLeuGly-NHNHz))
Postup polymerizace byl stejný jako v příkladu 2a, rozdíl byl opět jen ve složení polymerizační směsi. Složení polymerizační směsi bylo následující:
HPMA 10 g (70 mmol), HPMA-co-MA-GlyPheLeuGly-NHNH2 2,5 g (5,6 mmol), azobis(isokyanovalerová kyselina) 1,125 g (1 % hmotn.) a dimethylsulfoxid 100 ml. Polymerizace byla prováděna při 55 °C a ukončena po 18 h. Polymer byl z polymerizační směsi izolován vysrážením do 20tinásobného přebytku ethylacetátu. Polymer byl přečištěn přesrážením z methanolu do ethylacetátu.
<1 t ( I t til t t lift i i I í * » < » « ·
I « lit lítí· « i < » «I ‘ ‘
Výtěžek byl 9,75 g (78 %), obsah hydrazidových skupin byl 5,5 mol %, molekulová hmotnost Mw = 43 200 g/mol, index polydispersity In - 2,1.
Příklad 3: Příprava polymerního konjugátu PHPMA-AH-NH-N=DOX
Kopolymery sDOX navázaným kPHPMA nosiči hydrolyticky štěpitelnou hydrazonovou vazbou byly připraveny reakcí kopolymerů obsahujících hydrazidové skupiny poly(HPMA-C0-MA-AH-NHNH2) s DOX.HC1 v methanolu za katalýzy octovou kyselinou.
Roztok 15,384 g kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) v 92,1 ml methanolu (167 mg polymeru/ml) byl vložen do termostatované cely, ve které bylo umístěno 2,5 g DOX.HC1 (4,3 mmol). Nehomogenní suspenze byla míchána v temnu při 25 °C a po 1 minutě bylo přidáno 4,9 ml kyseliny octové (celkový objem 116 ml). V průběhu reakce došlo k pozvolnému rozpuštění suspenze, po 22 h reakce byl z homogenního roztoku polymemí produkt izolován srážením do 1 1 ethylacetátu, precipitát polymemího léčiva byl izolován filtrací na fritě S4, promyt 150 ml ethylacetátu a sušen do konstantní hmotnosti. Obsah celkového DOX byl stanoven spektrálně. Λ/A a M, byly stanoveny kapalinovou chromatografií (LC AKTA) s detekcí rozptylem světla (Multiangel detector DAWN DSP, Wyatt).
Charakterizace polymemího léčiva: Celkový výtěžek reakce vazby léčiva: 17,2 g (96 %), obsah celkového DOX 11,3 %váhových, obsah volného DOX 1,52 % z celkového obsahu DOX.
Příklad 4: Uvolňování doxorubicinu z polymerních konjugátů
Uvolňování doxorubicinu z konjugátů lišících se strukturou spojky mezi léčivem a polymerem („spacer“) bylo prováděno inkubací v 0,1 M fosfátovém pufru obsahujícím 0,15 M NaCl při 37 °C. pH pufru bylo nastaveno na podmínky v endosomech buněk, tj. mírně kyselé prostředí o pH 5,5. Alikvotní podíl inkubačního media byl odebírán v příslušných časových intervalech a obsah DOX byl stanoven po přidání uhličitanového pufru (0,1 M Na2CO3 + 4M NaCl), po extrakci do chloroformu a po odpaření rozpouštědla a převedení do methanolového roztoku pomocí HPLC (Shimadzu VP) na koloně Cl8 s reverzní fází Tessek SGX Cig (7 pm, 125x4 mm) při průtoku eluentu 0,5 ml/min a s použitím gradientu od 40 do 100 % roztoku B v průběhu 35 min (roztok A: 10 % methanol, 89,9 % voda, 0,1 % trifluoroctové kyseliny (TFA); roztok B: 89,9 % methanol; 10 % voda; 0,1 % TFA). Pro detekci byl použit fluorescenční detektor (Shimadzu RF-10AXL) (λ«χε = 480 nm, Xem = 560 nm). Kalibrační křivka byla sestrojena pomocí doxorubicinu.
< i
Výsledky měření uvolňováni léčiva z konjugátů lišících se strukturou použité spojky („spaceru“) jsou uvedeny na obr. 1.

Claims (12)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob přípravy polymemích konjugátů N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu a methakryloylaminoacylhydrazonu doxorubicinu s pH-řízeným uvolňováním léčiva, vyznačující se třemi stupni syntézy:
    a) reakcí methakryloyl halogenidu s peptidem nebo aminokyselinou vybranými ze skupiny zahrnující glycin, glycylglycin, β-alanin, kyselinu 6-aminohexanovou, kyselinu 4-aminobenzoovou a oligopeptidy GlyPheGly, GlyLeuGly nebo GlyPheLeuGly, nebo jejich derivátem, za vzniku methakryloylaminoacylhydrazinu a následnou reakcí s hydrátem hydrazinu,
    b) přímou kopolymerací N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu se vzniklým methakryloyl aminoacylhydrazinem za vzniku polymemího prekurzoru a
    c) reakcí získaného polymemího prekurzoru s doxorubicin hydrochloridem.'
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se acylace ve stupni a) provádí reakcí methylesteru hydrochloridu příslušné aminokyseliny nebo oligopeptidu s methakryloylchloridem v chlorovaném uhlovodíku v přítomnosti bezvodého uhličitanu sodného.
    O
  3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se reakce s hydrátem hydrazinu provádí reakcí methylesteru methakryloylované aminokyseliny nebo oligopeptidu s hydrátem hydrazinu za přítomnosti silné báze.
  4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se ve stupni b) provádí radikálová kopolymerace N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu s methakryloylaminoacylhydrazinem, iniciovaná tepelně rozložitelnými iniciátory na bázi azo nebo peroxy iniciátorů, s výhodou azobis(isobutyronitrilem), azobis(isokyanovalerovou kyselinou) nebo diisopropylperkarbonátem.
  5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím že se polymerace provádí v rozpouštědle zvoleném buď z nízkých Cl až C5 alkoholů, nebo z aprotického polárního rozpouštědla.
  6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že rozpouštědlo je zvoleno z methanolu, ethanolu, dimethylformamidu nebo dimethylsufoxidu.
    t < I
  7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že je-li iniciátor zvolen z azobis(isobutyronitrilu) nebo azobis(isokyanovalerové kyseliny), provádí se polymerace při teplotě 45 až 70 °C, a použije-li se jako iniciátor diisopropylperkarbonát, provádí se polymerace při 30 až 60 °C.
  8. 8. Způsob podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se reakce polymemího prekurzoru ve stupni c) provádí v rozpouštědle zvoleném z bezvodých alkoholů C1 až C5 nebo polárních aprotických rozpouštědel za katalýzy kyselinou octovou a výsledný konjugát se vysráží ethylacetátem.
  9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se rozpouštědlo zvolí z methanolu, sušeného ethanolu, dimethylformamidu nebo dimethylsufoxidu.
  10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se vstupní koncentrace polymeru zvolí v rozmezí 100 až 190 mg/ml a koncentrace kyseliny octové 30 až 80 mg/ml.
  11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že je koncentrace polymeru 170 mg/ml a kyseliny octové 55 mg/ml při teplotě 25 °C.
  12. 12. Způsob podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se výsledný produkt čisti gelovou filtrací.
CZ20050558A 2005-09-05 2005-09-05 Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva CZ2005558A3 (cs)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20050558A CZ2005558A3 (cs) 2005-09-05 2005-09-05 Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva
PCT/CZ2006/000056 WO2007028347A2 (en) 2005-09-05 2006-09-05 Method for the preparation of polymeric conjugates of doxorubicin with ph- controlled release of the drug
AT06775676T ATE520419T1 (de) 2005-09-05 2006-09-05 Verfahren zur herstellung von polymer-konjugaten von doxorubicin mit ph-kontrollierter freisetzung des arzneimittels
US12/065,745 US20080318879A1 (en) 2005-09-05 2006-09-05 Method for the Preparation of Polymeric Conjugates of Doxorubicin with Ph-Controlled Release of the Drug
EA200800756A EA015091B1 (ru) 2005-09-05 2006-09-05 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНЫХ КОНЪЮГАТОВ ДОКСОРУБИЦИНА С КОНТРОЛИРУЕМЫМ pH ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА
UAA200804282A UA94594C2 (ru) 2005-09-05 2006-09-05 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНЫХ КОНЪЮГАТОВ ДОКСОРУБИЦИНА С рН-КОНТРОЛИРОВАННЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ ЛЕКАРСТВЕННОГО ВЕЩЕСТВА
EP06775676A EP1922087B1 (en) 2005-09-05 2006-09-05 Method for the preparation of polymeric conjugates of doxorubicin with ph-controlled release of the drug

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20050558A CZ2005558A3 (cs) 2005-09-05 2005-09-05 Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ297827B6 CZ297827B6 (cs) 2007-04-04
CZ2005558A3 true CZ2005558A3 (cs) 2007-04-04

Family

ID=37667174

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20050558A CZ2005558A3 (cs) 2005-09-05 2005-09-05 Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20080318879A1 (cs)
EP (1) EP1922087B1 (cs)
AT (1) ATE520419T1 (cs)
CZ (1) CZ2005558A3 (cs)
EA (1) EA015091B1 (cs)
UA (1) UA94594C2 (cs)
WO (1) WO2007028347A2 (cs)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ2006505A3 (cs) * 2006-08-09 2008-04-09 Zentiva, A. S. Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy
EP2503332A3 (en) * 2006-08-09 2013-11-13 Sumitomo Bakelite Company, Ltd. Sugar chain-capturing substance and use thereof
CZ298945B6 (cs) * 2006-09-18 2008-03-19 Zentiva, A. S. Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby
WO2008139457A2 (en) * 2007-05-10 2008-11-20 Clear Direction Ltd. Methods and compositions for drug targeting
WO2010127271A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Intezyne Technologies, Incorporated Polymer micelles containing anthracylines for the treatment of cancer
US8524784B2 (en) 2009-04-30 2013-09-03 Intezyne Technologies, Incorporated Polymer micelles containing anthracylines for the treatment of cancer
CN103936945B (zh) * 2013-01-23 2017-02-08 中国科学院化学研究所 一类高效抗肿瘤靶向药物载体及其制备方法
CN105727309B (zh) * 2016-03-31 2019-04-30 中国药科大学 双敏感两亲性多糖-阿霉素偶联物及其药学组合物的制备和应用
CN105963706B (zh) * 2016-04-15 2019-03-15 四川大学 一种支化hpma共聚物-dox偶联物及其制备方法和应用
CN105903031A (zh) * 2016-05-05 2016-08-31 上海交通大学 肿瘤微环境敏感的药物控释纳米体系的制备方法及其应用
GB2551979A (en) * 2016-06-30 2018-01-10 Rs Arastirma Egitim Danismanlik Llac Sanayi Ticaret Ltd Cleavable polymer drug conjugates
US20220008543A1 (en) * 2018-10-26 2022-01-13 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Macromolecular prodrug-based thermosensitive injectable gel as a novel drug delivery platform

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6060518A (en) * 1996-08-16 2000-05-09 Supratek Pharma Inc. Polymer compositions for chemotherapy and methods of treatment using the same
DE19636889A1 (de) * 1996-09-11 1998-03-12 Felix Dr Kratz Antineoplastisch wirkende Transferrin- und Albuminkonjugate zytostatischer Verbindungen aus der Gruppe der Anthrazykline, Alkylantien, Antimetabolite und Cisplatin-Analoga und diese enthaltende Arzneimittel
CZ293787B6 (cs) * 2001-12-20 2004-07-14 Zentiva, A.S. pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii
AU2002953073A0 (en) * 2002-11-21 2003-01-16 Access Pharmaceuticals Australia Pty Limited Amplification of biotin-mediated targeting
CZ293886B6 (cs) * 2002-12-20 2004-08-18 Zentivaźáa@S pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii
CZ294996B6 (cs) * 2003-07-16 2005-04-13 Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr Reaktivní polymery a kopolymery na bázi N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, způsob jejich přípravy a jejich použití pro syntézu polymerních léčiv, pro modifikaci biologicky aktivních proteinů a přípravu systémů pro dopravu genů
WO2005117932A1 (en) * 2004-06-04 2005-12-15 The Board Of Governors For Higher Education, State Of Rhode Island And Providence Plantations Bisubstrate inhibitors of protein tyrosine kinases as therapeutic agents
GB0413613D0 (en) * 2004-06-17 2004-07-21 Univ London Small molecule carriers
US7968085B2 (en) * 2004-07-05 2011-06-28 Ascendis Pharma A/S Hydrogel formulations

Also Published As

Publication number Publication date
CZ297827B6 (cs) 2007-04-04
ATE520419T1 (de) 2011-09-15
UA94594C2 (ru) 2011-05-25
EA015091B1 (ru) 2011-06-30
US20080318879A1 (en) 2008-12-25
EP1922087B1 (en) 2011-08-17
WO2007028347A2 (en) 2007-03-15
WO2007028347A3 (en) 2007-05-10
EA200800756A1 (ru) 2008-06-30
EP1922087A2 (en) 2008-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ2005558A3 (cs) Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva
JP5944836B2 (ja) 高分子薬物送達結合体ならびにその製造および使用方法
Chytil et al. N-(2-Hydroxypropyl) methacrylamide-based polymer conjugates with pH-controlled activation of doxorubicin for cell-specific or passive tumour targeting. Synthesis by RAFT polymerisation and physicochemical characterisation
JP4883515B2 (ja) 均一分子量ポリマー
EP2063914A1 (en) Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation
EP2049157B1 (en) Polymeric conjugates of doxorubicin with ph-regulated release of the drug and a method of preparing
Freeman et al. Fully synthetic macromolecular prodrug chemotherapeutics with EGFR targeting and controlled camptothecin release kinetics
Arslan et al. A modular and orthogonally reactive platform for fabrication of polymer–drug conjugates for targeted delivery
EP1463529A2 (en) Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy
CA3046541A1 (en) Biocompatible and hydrophilic polymer conjugate for targeted delivery of an agent
Mahkam et al. Synthesis and characterization of acrylic type hydrogels containing azo derivatives of 5-amino salicylic acid for colon-specific drug delivery
CZ2006207A3 (cs) Micelární nosiče léčiv s protinádorovou aktivitou
CZ20031950A3 (cs) Reaktivní polymery a kopolymery na bázi N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, způsob jejich přípravy a jejich použití pro syntézu polymerních léčiv, pro modifikaci biologicky aktivních proteinů a přípravu systémů pro dopravu genů
Chytil et al. Structural design and synthesis of polymer prodrugs
CZ309067B6 (cs) Způsob přípravy polymerních nosičů pro pH-řízené uvolňování léčiv a jejich konjugátů s léčivy
Sintov et al. Polymeric drug delivery of enzymatically degradable pendant agents: Peptidyl-linked procainamide model system studies
EP3442594A1 (en) Block copolymer for overcoming drug resistance of tumours to chemotherapy, its polymer-drug conjugate, pharmaceutical composition containing them, method of preparation and use thereof
Class et al. Patent application title: POLYMERIC CONJUGATES OF DOXORUBICIN WITH PH-REGULATED RELEASE OF THE DRUG AND A METHOD OF PREPARING Inventors: Tomas Etrych (Praha, CZ) Karel Ulbrich (Praha, CZ)
WO2021121446A1 (en) Copolymer with hydrolytic release of cancerostatic agent cytarabine, method of its preparation and use thereof
CN115286669A (zh) 抗体-高分子-药物偶联物的制备方法及应用
CZ293886B6 (cs) pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20210905