CZ2006592A3 - Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby - Google Patents
Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2006592A3 CZ2006592A3 CZ20060592A CZ2006592A CZ2006592A3 CZ 2006592 A3 CZ2006592 A3 CZ 2006592A3 CZ 20060592 A CZ20060592 A CZ 20060592A CZ 2006592 A CZ2006592 A CZ 2006592A CZ 2006592 A3 CZ2006592 A3 CZ 2006592A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- polymer
- hpma
- copolymer
- groups
- terminated
- Prior art date
Links
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 57
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract 7
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims abstract description 188
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 55
- -1 2-hydroxypropyl Chemical group 0.000 claims abstract description 26
- WEZDRVHTDXTVLT-GJZGRUSLSA-N 2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 WEZDRVHTDXTVLT-GJZGRUSLSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 108010009504 Gly-Phe-Leu-Gly Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000003327 cancerostatic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N Gly-Leu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 108010077435 glycyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 claims abstract description 7
- IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N Gly-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N 0.000 claims abstract description 5
- OKPYIWASQZGASP-UHFFFAOYSA-N n-(2-hydroxypropyl)-2-methylprop-2-enamide Chemical group CC(O)CNC(=O)C(C)=C OKPYIWASQZGASP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 6
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 claims description 133
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 130
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 claims description 67
- 108010038807 Oligopeptides Chemical class 0.000 claims description 48
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims description 48
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 37
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 35
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 34
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 29
- 229920000578 graft copolymer Polymers 0.000 claims description 26
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 24
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 19
- WGJCBBASTRWVJL-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine-2-thione Chemical compound SC1=NCCS1 WGJCBBASTRWVJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 claims description 18
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 13
- 125000005414 dithiopyridyl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 11
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 10
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 9
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000003999 initiator Substances 0.000 claims description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N sulfanyl Chemical compound [SH] PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 claims description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 238000010526 radical polymerization reaction Methods 0.000 claims description 3
- 125000000266 alpha-aminoacyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 3
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims 1
- 239000012704 polymeric precursor Substances 0.000 claims 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 10
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 abstract description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 141
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 57
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- VHSHLMUCYSAUQU-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropyl methacrylate Chemical compound CC(O)COC(=O)C(C)=C VHSHLMUCYSAUQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 20
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 19
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 17
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 17
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 16
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 14
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 14
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 12
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 11
- 229920006251 semi-telechelic polymer Polymers 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- 229920001897 terpolymer Polymers 0.000 description 9
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 8
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 8
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 8
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 description 7
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 description 7
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101000609947 Homo sapiens Rod cGMP-specific 3',5'-cyclic phosphodiesterase subunit alpha Proteins 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 102100039177 Rod cGMP-specific 3',5'-cyclic phosphodiesterase subunit alpha Human genes 0.000 description 7
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920001977 poly(N,N-diethylacrylamides) Polymers 0.000 description 7
- CNHYKKNIIGEXAY-UHFFFAOYSA-N thiolan-2-imine Chemical compound N=C1CCCS1 CNHYKKNIIGEXAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101000663001 Mus musculus TNFAIP3-interacting protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 5
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 5
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 4
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 4
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- WGGFHAVVTPGHRD-UHFFFAOYSA-N 2-(pyridin-2-yldisulfanyl)ethanamine Chemical compound NCCSSC1=CC=CC=N1 WGGFHAVVTPGHRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 3
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 3
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;(2s)-2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 2
- WZIMSXIXZTUBSO-UHFFFAOYSA-N 2-[[bis(carboxymethyl)amino]methyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O WZIMSXIXZTUBSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLSJEUQOXVVCPN-UHFFFAOYSA-N 3-sulfanylpropanamide Chemical compound NC(=O)CCS JLSJEUQOXVVCPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODRSRVOISOPFMY-UHFFFAOYSA-N 3-sulfanylpropanehydrazide Chemical group NNC(=O)CCS ODRSRVOISOPFMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XHSSRBLTUVPKQU-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylbutanimidamide Chemical group NC(=N)CCCS XHSSRBLTUVPKQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical group C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N hydrazine monohydrate Substances O.NN IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- LYUQWAGPWZUFNV-UHFFFAOYSA-N n-(6-hydrazinyl-6-oxohexyl)-2-methylprop-2-enamide Chemical compound CC(=C)C(=O)NCCCCCC(=O)NN LYUQWAGPWZUFNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000013878 renal filtration Effects 0.000 description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- VGBQHLBGAWFZEV-UHFFFAOYSA-N 2-(pyridin-2-yldisulfanyl)ethylhydrazine Chemical compound NNCCSSC1=CC=CC=N1 VGBQHLBGAWFZEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLHXFCAZRFMVTK-UHFFFAOYSA-N 3-(4-nitrophenoxy)-1,3-thiazolidine-2-thione Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1ON1C(=S)SCC1 ZLHXFCAZRFMVTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YWBVHKLGQIBVKJ-UHFFFAOYSA-N 3-[(1-carboxy-3-cyano-2-methylpropan-2-yl)diazenyl]-4-cyano-3-methylbutanoic acid Chemical compound N#CCC(C)(CC(O)=O)N=NC(C)(CC#N)CC(O)=O YWBVHKLGQIBVKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CORXEUSRKLNMDW-UHFFFAOYSA-N 3-[[1-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)-2h-pyridin-2-yl]disulfanyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)CCSSC1C=CC=CN1N1C(=O)CCC1=O CORXEUSRKLNMDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RLBSRNURNIRFIG-UHFFFAOYSA-N 4-(pyridin-2-yldisulfanyl)butan-1-amine Chemical compound NCCCCSSC1=CC=CC=N1 RLBSRNURNIRFIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004736 B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- MWWSFMDVAYGXBV-RUELKSSGSA-N Doxorubicin hydrochloride Chemical compound Cl.O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MWWSFMDVAYGXBV-RUELKSSGSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102100024165 G1/S-specific cyclin-D1 Human genes 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000980756 Homo sapiens G1/S-specific cyclin-D1 Proteins 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KHSISQHEYNBRJX-UHFFFAOYSA-N NCCC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 Chemical group NCCC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 KHSISQHEYNBRJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- HPZOOQSXPMEJBV-ODCFVKFUSA-N Tirilazad mesylate Chemical compound CS(O)(=O)=O.O=C([C@@H]1[C@@]2(C)CC=C3[C@@]4(C)C=CC(=O)C=C4CC[C@H]3[C@@H]2C[C@H]1C)CN(CC1)CCN1C(N=1)=CC(N2CCCC2)=NC=1N1CCCC1 HPZOOQSXPMEJBV-ODCFVKFUSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 125000004744 butyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000012986 chain transfer agent Substances 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229920000359 diblock copolymer Polymers 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 229920006158 high molecular weight polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 125000000717 hydrazino group Chemical group [H]N([*])N([H])[H] 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 229920005684 linear copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 1
- FTGNTBPAUKKJOJ-UHFFFAOYSA-N n'-amino-4-sulfanylbutanimidamide Chemical group NNC(=N)CCCS FTGNTBPAUKKJOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000012667 polymer degradation Methods 0.000 description 1
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001866 silicon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Polymerní lécivo, v nemž je na vodorozpustný polymerní nosic pripravený na bázi kopolymeru N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu navázáno kancerostatikumpripojené pomocí spojek obsahující hydrolyticky štepitelné hydrazonové vazby, kde struktura polymerního léciva sestává z hlavního retezce N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu nesoucího kancerostatikum adalšího retezce N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu- roubu, který prípadne nese rovnež kancerostatikum, pricemž tyto rouby jsou k hlavnímu retezci pripojeny vazbou v organizmu stálou a/nebo vazbou v organizmu štepitelnou, zejména oligopeptickou spojkou zvolenou z rady GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly a GlyLeuPheGly, a zpusob jeho výroby.
Description
Vynález se týká vysokomolekulámích vodorozpustných polymemích nosičů kancerostatik umožňujících cílený transport protinádorových léčiv, zejména doxorubicinu (DOX), do pevných nádorů a zajišťujících eliminaci polymeru z organizmu. Účinek konjugátu polymemího nosiče s kancerostatikem je zaměřen na cílenou terapii nádorových onemocnění v humánní medicíně.
Dosavadní stav techniky
Nejnovější trendy vývoje léčiv se zaměřují na lékové formy umožňující cílený účinek biologicky aktivní látky přednostně v místě požadovaného terapeutického efektu. Cíleně působící léčiva nalézají uplatnění především v oblastech, kdy vedlejší účinky aktivní složky mohou vést k poškození zdravých částí organizmu. Toto nebezpečí je nej aktuálnější při léčbě cytostatiky. Použití polymemích látek, zvláště vodorozpustných polymerů jako nosičů léčiv nabízí jednu z významných možností řešení zmíněného problému. Připojení cytostatika k vodorozpustnému polymeru chemickou vazbou umožňuje zásadním způsobem zvýšit rozpustnost nerozpustných nebo málo rozpustných léčiv a výrazně snížit jejich toxicitu. Vysoká molekulová hmotnost polymerů zabraňuje rychlému vyloučení léčiva z organizmu glomerulámí filtrací, a tím zajišťuje prodlouženou dobu cirkulace v krvi a setrvání v organizmu a tím i větší biologickou využitelnost léčiva. Navíc se mohou makromolekulámí látky a zvláště syntetické polymery akumulovat v pevných nádorech díky EPR (enhanced permeability and retention) efektu [Maeda 2000, 2001], Této skutečnosti je možné, v případě navázání kancerostatika na makromolekulámí nosič, využít pro jeho cílenou akumulaci v nádoru. Byla vyvinuta celá řada systémů, které jsou založeny na tomto principu. Jedním z nich jsou polymemí micely. Jsou strukturně jiným nosičovým systémem nežli rozpustné polymery vyvíjené s cílem nádorově specifické dopravy cytostatik do pevných nádorů, využívají rovněž EPR efektu pevných nádorů pro zvýšenou akumulaci vysokomolekulámího léčiva v nádoru, ale jsou obvykle připravovány uspořádáním amfifilních diblokových kopolymerů do vysokomolekulámích micelámích útvarů tvořících koloidní roztoky. V micelách je obvykle léčivo vázáno do hydrofobního jádra micely fyzikálními (hydrofobní • < ec interakce, iontové vazby) a nebo kovalentními vazbami [Kataoka 2001, Yokoyama 1999, Bae 2003, Yoo 2002, Bronich 1999]. Má-li být léčivo zmicely uvolněno, musí dojít k přerušení chemické vazby a zároveň i rozrušení hydrofobních interakcí v jádře micely. To platí předeyším pro bydrofobní léčiva. Oproti tomu v rozpustných systémech akumuluj ících se v pevných nádorech jsou makromolekuly rozpuštěny ve vodném prostředí molekulárně a molekula obvykle zaujímá tvar náhodného klubka. Léčivo je pak v kontaktu s hydrofilním polymerem a při uvolnění nemusí překonávat bariéru hydrofobních interakcí. Byly připraveny a studovány polymemí konjugáty kancerostatik s rozpustnými polymery, ve kterých bylo léčivo s protinádorovým účinkem připojeno k polymeru neštěpitelnou kovalentní vazbou, hydrolyticky nestabilní iontovou vazbou a nebo kovalentní vazbou náchylnou k enzymatické či prosté chemické hydrolýze. Takové systémy jsou schopny uvolnit kancerostatikum z nosiče v jeho aktivní formě buď v nádoru, nebo i více specificky, přímo v nádorové buňce. Významnou skupinu tvoří polymemí léčiva připravená na bázi kopolymerů V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA), z nichž je řada aktivně směrována k nádorům prostřednictvím k polymeru připojené směrující struktury (protilátky, hormony). [Duncan 1985, Říhová 2000, Kopeček 2001, 2000], Jejich syntéza je však značně složitá. V literatuře existuje celá řada informací o přípravě a studiu vlastností polymerů nesoucích kancerostatikum připojené k polymeru vazbou náchylnou k hydrolýze ve vodném prostředí [Kratz 1999]. Mezi nimi zaujímají významné postavení rovněž kopolymery HPMA, nesoucí kancerostatikum doxorubicin vázaný k polymemímu řetězci hydrolyticky štěpitelnou hydrazonovou vazbou [Etrych 2002, Ulbrich 2004a, Ulbrich 2004b, Ulbrich - patenty]. Tato vazba je relativně stálá v prostředí krevního řečiště (v průběhu transportu v organizmu) a hydrolyticky labilní v mírně kyselém prostředí živé buňky. Rychlost hydrolýzy této vazby řídí i rychlost uvolňování léčiva, a tedy i koncentraci aktivní látky v místě požadovaného účinku. Takováto polymemí kancerostatika vykazovala při in vitro i in vivo testech na myších podstatně vyšší protinádorovou účinnost proti řadě nádorových linií nežli volné léčivo a v řadě případů vedlo jejich použití k úplnému vyléčení pokusných zvířat i při terapeutickém způsobu podání. [Říhová 2001, Etrych 2001]. Hlavním problémem použití HPMA kopolymerů je jejich neštěpitelný uhlíkatý řetězec, a tak obor molekulových hmotností použitelných pro přípravu polymemího nosiče je omezen na molekulové hmotnosti menší nežli 40 000 až 50 000, tedy pod vylučovací mezí organizmu. Polymery o vyšší molekulové hmotnosti nemohou být efektivně a dostatečně účinně z organizmu vyloučeny a jejich použití by vedlo k jejich nadměrné akumulaci • · « e • · * • · · β · · · •··· ·· ·«·
-3 — v organizmu. Pro dosažení účinného EPR efektu, tedy výrazné akumulace v nádorech, je však třeba pracovat s polymery, a to platí i pro kopolymery HPMA, o molekulové hmotnosti vysoko nad vylučovací mezí (Seymour 1995, Noguchi 1998). Proto je výhodné, aby molekulová hmotnost polymemího nosiče byla dostatečně vysoká, ale aby po uvolnění účinné složky došlo k degradaci polymeru na fragmenty vylučitelné z organizmu např. glomerulámí filtrací* Ve vynálezu proto navrhujeme a dokládáme účinnost vysokomolekulámího polymemího léčiva s definovaným a biodegradovatelným skeletem nosiče, umožňujícím jak dopravu cytostatika do nádoru, tak i pozdější vyloučení polymemího nosiče z organizmu.
Literatura:
Bae, Y. S.; Fukushima, S.; Harada, A.; Kataoka, K. pH responsi ve drug-loaded polymeric micelles: Intracellular drug release correlated with in vitro cytotoxicity on human smáli cell lung cancer SBC-3. 2003. Salt Lake City, Utah, U.S.A. Winter Symposium and llth International Symposium on Recent Advances in DrugDelivery Systems. 2003.
Bronich, T. K.; Nehls, A.; Eisenberg, A.; Kabanov, V. A.; Kabanov, A. V. Colloids Surf. B 1999, 16, 243-251.
R. Duncan, J.B. Lloyd, J. Kopeček, P. Rejmanová, J. Strohalm, K. Ulbrich, B. Říhová, V. Chytrý: Synthetic Polymeric Drugs (1985). Czech. PV 0095/85, Australia 589587, Canada 130053, Denmark 164485, Europe 0187547, US 5,037,883, Japan 000137/86
Etrych, T., Jelínková, M., Říhová, B. and Ulbrich K., New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH sensitive linkage. Synthesis, in vitro and in vivo biological properties.
J. Controlled Release 73, 89-102 (2001).
T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, K. Ulbrich, Synthesis of HPMA Copolymers Containing Doxorubicin Bound via a Hydrazone Linkage. Effect of Spacer on Drug Release and in vitro Cytotoxicity. Macromolecular Biosci. 2, 43-52 (2002) • · • · c · • · · · · · >
·/ * ·' «
Etrych T., Chytil P., Pechar M., Studenovský M., Říhová B., Ulbrich K.: Způsob přípravy polymemích konjugátů doxorubicinu s pH-řízeným uvolňováním léčiva, CZ PV 2005-558
Kataoka, K.; Harada, A.; Nagasaki, Y. Adv. Drug Delivery Rev. 2001, 47, 113-131.
Kopeček J., Kopečková P., Minko T., Lu Z., HPMA Copolymer-Anticancer Drug Conjugates: Design, Activity and Mechanism of Action. Europ. J. Pharm. Biopharm. 50, 61 - 81 (2000)
Kopeček, J., Kopečková, P., Minko, T., Lu, Z.R., Peterson, C.M. (2001) “Water soluble polymere in tumor targeted delivery”. J. Controlled Release 74, 165-173.
F. Kratz, U. Beyer, M.T. Schutte, Drug-polymer conjugates containing acid-cleavable bonds, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 16 (1999) 245-288.
Maeda, H., J. Wu, T. Sawa, Y. Matsumura, and K. Hoři. 2000. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J Control Release 65:271-284.
Maeda, H. 2001. The enhanced permeability and retention (EPR) effect in tumor vasculature: the key role of tumor-selective macromolecular drug targeting. Adv Enzyme Regul 41:189-207.
Y. Noguchi, J. Wu, R. Duncan, J. Strohalm, K. Ulbrich, T. Akaike, H. Maeda, Jpn. J. Cancer Res. 89, 307-314 (1998)
P. Rejmanová, J. Labský, J. Kopeček, Aminolyses of Monomeric and Polymeric 4-nitrophenyl Estere of N-Methacroylamino Acids, Makromol. Chem. 178, 2159 -2168 (1977)
B. Říhová, M. Jelínková, J. Strohalm, V. Šubr, D. Plocová, O. Hovorka, M. Novák, D. Plundrová, Y. Germano, K. Ulbrich, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules II. Anti-cancer Activity of antibody or (Fab')2-targeted Conjugates and Combined Therapy with Immunomodulators. J. Controlled Rel. 64, 241-261 (2000) • · · « C í
L.W. Seymour, Y. Miyamoto, H. Maeda, M. Brereton, J. Strohalm, K. Ulbrich, R. Duncan, Europ. J. Cancer 31 A, 766 - 770 (1995)
V.Subr, K.Ulbrich, B.Říhová, Reactive polymers and copolymers based on N-(2hydroxypropyl)methacrylamide, a method of their preparation and their use for synthesis of polymer drugs, for modification of biologically active proteins and for gene transport systems, PV 1950/03
V.Šubr, Č.Koňák, R.Laga, K.Ulbrich, Coating of DNA/poly(L-lysine) complexes by covalent attachment of poly[ N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide], Biomacromolecules 7, 122-130 (2006)
K. Ulbrich, V. Šubr, J. Strohalm, D. Plocová, M. Jelínková, B. Říhová, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules I. Synthesis and Physico-chemical Characterisation. J. Controlled Rel. 64, 63-79(2000)
K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, Antibody-Targeted PolymerDoxorubicin Conjugates with pH-Controlled Activation, J. Drug Targeting 12(8) (2004) 477489]. (A)
K. Ulbrich, V. Šubr, Polymeric Anticancer Drugs with pH-Controlled Activation, Adv. Drug Delivery Rev. 56/7, 1025-1052 (2004) (B)
K. Ulbrich, T. Etrych, B. Říhová, M. Jelínková, M. Kovář: pH Senzitivní polymemí konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii. CZ 2931787, CZ 293B86
Yokoyama, M.; Okano, T.; Sakurai, Y.; Fukushima, S.; Okamoto, K.; Kataoka, K. J. Drug Targeting 1999, 7, 171-186.
Yoo, H. S.; Lee, E. A.; Park, T. G. J. Controlled Release 2002, 82, 17-27.
Podstata vynálezu • · · * • · · • · · · • · · · • · · · • · · · • · · • · · · · · ·
Podstata polymemího léčiva podle vynálezu spočívá v tom, že je na vodorozpustný polymemí nosič připravený na bázi kopolymeru HPMA navázáno kancerostatikum doxorubicin, připojený kpolymemím řetězcům pomocí spojek (spacerů) obsahujících pH-senzitivní hydrolyticky štěpitelné hydrazonové vazby. Tyto spojky mohou být tvořeny jednotlivými aminokyselinami, oligopeptidy a nebo dalšími strukturami dovolujícími jejich zakončení hydrazidovou skupinou. Struktura polymemího léčívaje volena tak, že sestává z hlavního polymemího řetězce tvořeného kopolymerem HPMA nesoucího doxorubicin připojený přes spojku hydrazonovou vazbou, na který jsou roubovány další řetězce HPMA homopolymeru a nebo kopolymeru rovněž nesoucí doxorubicin připojený hydrazonovou vazbou. Výrazným znakem léčiv podle vynálezu je, že polymemí rouby jsou připojeny k hlavnímu řetězci buď vazbou v organizmu stálou a nebo vazbami v organizmu štěpitelnými, s výhodou vazbami štěpitelnými v cílové nádorové buňce, jako například enzymaticky štěpitelnou oligopeptidovou sekvencí a nebo reduktivně štěpitelnou vazbou disulfídovou. Molekulová hmotnost hlavního řetězce je volena pod vylučovací mezí organizmu, s výhodou v rozmezí 10 000 až 50 000 g/mol, molekulové hmotnosti polymemích roubů se pohybují v rozmezí 5 000 až 50 000 g/mol. Enzymaticky degradovatelné oligopeptidové sekvence obsahují s výhodou oligopeptidové sekvence GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly nebo GlyLeuPheGly, reduktivně štěpitelné vazby obsahující disulfidové struktury různého složení. Molekulová hmotnost polymemích roubů i hlavního řetězce jsou voleny tak, aby jak samostatný hlavní řetězec před vazbou roubů, tak i samostatné rouby byly vylučitelné z organizmu, s výhodou glomerulámí filtrací. Molekulová hmotnost roubovaného polymeru je pak vysoká, převyšující vylučovací limit organizmu a zabezpečující prodlouženou dobu cirkulace a dostatečný EPR efekt a záchyt ve tkáni pevných nádorů. Molekulové hmotnosti nových roubovaných konjugátů doxorubicinu je možné řídit nejen molekulovou hmotností základního polymeru a roubů, ale i poměrem počtu roubů na jeden hlavní řetězec. Molekulová hmotnost takového roubovaného polymeru se pohybuje s výhodou mezi 50 000 až 400 000 g/mol, obsah doxorubicinu jak v hlavním řetězci, tak i v roubech se pohybuje mezi 1 a 25 % hmotn. (0,3 až 8 % mol).
Polymemí léčivo podle vynálezu by mělo být podáváno převážně intravenósně (injekce nebo infuze), může být ale podáno i intratumorálně či intraperitoneálně. Polymer s chemicky vázaným cytostatikem je stabilní v průběhu cirkulace v krevním řečišti, hydrazonová vazba mezi « · « * • · · • < · * « · · · • · · • · · · · · doxorubicinem a polymerem je relativně stabilní za fyziologických podmínek krevního řečiště (pH 7,4). Po extravasaci a záchytu v pevných nádorech díky EPR efektu dochází k průniku molekulárně rozpuštěného konjugátu do jednotlivých nádorových buněk pinocytózou a v důsledku poklesu pH z vnějšího pH 7,4 na intracelulámí pH 5 až 6 by mělo dojít k hydrolýze hydrazonové vazby, uvolnění cytostatika v cílové buňce a tedy k aktivaci jeho cytotoxického efektu. V mírně kyselém reduktivním prostředí buňky (literatura uvádí koncentrace glutathionu vcytoplasmě živočišných buněk v rozsahu 1 až 5 mmol) by pak mělo dojít khydrolýzou řízenému uvolnění léčiva a redukci disulfidových vazeb a rozpadu vysokomolekulámího roubovaného polymeru na původní polymemí fragmenty vylučitelné z organizmu. K podobné degradaci nosiče by mělo dojít i u nosiče obsahujícího rouby připojené enzymaticky štěpitelnými oligopeptidovými sekvencemi. Zde by mělo dojít k degradaci polymemího skeletu účinkem lysosomálních buněčných enzymů. Reálnost výše navrženého mechanizmu působení polyrritmích léčiv podle vynálezu je doložena experimenty modelového uvolňování doxorubicinu z polymemího nosiče i experimenty degradací polymeru prováděné ve fyziologickém prostředí modelujícím poměry v živočišné buňce. Výsledky těchto testů, včetně testů protinádorové aktivity, jsou uvedeny v příkladové části přihlášky.
Syntéza a struktury polymer nich konjugátů
Syntéza polymemích konjugátů podle vynálezu je prováděna v několika krocích, detailní finální struktura konjugátu významně záleží na zvolené syntetické cestě.
V prvním kroku syntézy jsou syntetizovány základní monomery: HPMA, methakryloylované deriváty aminokyselin a oligopeptidů zakončených 4-nitrofenoxy (ONp) nebo thiazolidin-2thionovou (TT) skupinou, methakryloylované deriváty aminokyselin a oligopeptidů zakončených hydrazidovou (NHNH2) skupinou, případně zakončené hydrazidovou skupinou chráněnou t.butyloxykarbonylovou skupinou (Boc) nebo zakončené hydrazonovou vazbou připojeným doxorubicinem a methakryloylované makromonomery připravené methakryloylací HPMA semitelechelického kopolymeru zakončeného primární amino skupinou (NH2).
Ve druhém kroku jsou syntetizovány polymemí prekurzory, tj. náhodné HPMA kopolymery (random copolymers) sloužící jako hlavní řetězec, a semitelechelické polymery s koncovými reaktivními skupinami sloužícími pro roubování hlavního polymemího řetězce.
-8 Hlavní polymerní řetězec nesoucí podél řetězce funkční skupiny, 4-nitrofenoxy, thiazolidin-2thionové, hydrazidové, primární amino, sulfhydrylové (SH) nebo dithiopyridylové (PDS), je možné připravit buď radikálovou kopolymerizací výše uvedených funkčních monomerů s HPMA, nebo polymeranalogickou přeměnou základního kopolymeru nesoucího funkční skupiny.
Základní kopolymer je kopolymer HPMA a methakryloylovaných hydrazidů aminokyselin nebo oligopeptidů, jehož podstatou je, že obsahuje 70 až 98 mol % HPMA a 2 až 30 % mol jednotek s funkčními skupinami. V níže uvedených strukturních schématech jsou zavedeny dvě zkratky pro spojky (spacery) v bočních řetězcích kopolymeru: i) SPi je aminoacyl v methakryloyl(aminoacyl)hydrazidech a methakryloyl(aminoacyl)aminech, například glycyl, glycylglycyl, β-alanyl, 6-aminohexanoyl (AH), 4-aminobenzoyl a nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly, GlýLeuPheGly nebo GlyPheLeuGly; ii) SP2 je složený acyl v methakryloyl(aminoacyl)hydrazidech a methakryloyl(aminoacyl)aminech vycházející z enzymaticky degradovatelné oligopeptidové sekvence obsahující s výhodou oligopeptidové sekvence GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly nebo GlyLeuPheGly.
Kopolymeracemi a nebo polymeranalogickými reakcemi je možné připravit následující náhodné (random) kopolymery o výše uvedeném zastoupení monomemích jednotek:
Kopolymery 1:
Tyto kopolymery nesou podle řetězce reaktivní 4-nitrofenylesterové nebo acylthiazolidin-2thionové skupiny.
Radikálovou kopolymerizací byl připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a methakryloylovaným biodegradovatelným oligopeptidem (např. GlyPheLeuGly) zakončeným 4nitrofenoxy (Kopolymer la) nebo thiazolidin-2-thionovou skupinou (Kopolymer lb).
··· ·««· « t » ·»·· « · · · · » · · · c ·«··· ··· « · ··· • ··· · · ·«· ··· · · ·
Schéma struktury Kopolymerufl^
(b)
Kopolymery 2:
Tyto kopolymery nesou podle řetězce reaktivní hydrazidové nebo primární amino skupiny. Radikálovou kopolymerizací HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými hydrazidovou skupinou byl připraven Kopolymer 2a.
d^p
H,C' CH, CH,
Schéma struktury Kopolymeruí2a\
Radikálovou kopolymerizací byl připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a methakryloylovaným biodegradovatelným oligopeptidem (např. GlyPheLeuGly) zakončeným hydrazidovou skupinou. (Kopolymer 2b) • · · i <« • « • · * • · · • · » • · ·
-10 —
H,C I CHj CHj
Schéma struktury Kopolymeru
Polymeranalogickou reakcí s využitím Kopolymeru la a lb byl připraven Kopolymer 2c. Reakcí 4-nitrofenylesterových (Kopolymer la) nebo acylthiazolidin-2-thionových skupin (Kopolymer lb) s nadbytkem hydrazin hydrátu, ethylendiaminu, butylendiaminu nebo hexametylendiaminu byl připraven náhodný kopolymer nesoucí podle řetězce reaktivní hydrazidové nebo primární amino skupiny.
Kopolymery 3:
Tyto náhodné kopolymery nesou podle řetězce reaktivní dithiopyridylové skupiny.
4 · · ·· · 4 · · t • 4 « · · • · · 4 · • · · ··« · 4 4
-11 Po sejmutí chránící skupiny byl polymeranalogickou reakcí kopolymeru 2a s jV-sukcinimidyl-[3(2-pyridyldithio)]propionátem (SPDP) (obecně s bifunkčním činidlem s aktivovaným karboxylem a pyridyldisulfidovou skupinou jako např. SPDP, 4-sukcinimidyloxykarbonyl-a-methyl-a-(2pyridyldithio)toluen£ 7V-sukcinimidyl-[4-(2-pyridyldithio)]butyrát, A-(2-sulfosukcinimidyl-[3-(2pyridyldithio)]propionát) připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými hydrazidovou skupinou a methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými A-[3-(2-pyridyldithio)propionyl]ethylamidovou skupinou. (Kopolymer 3a)
Polymeranalogickou reakcí kopolymeru 2b a 2c s N-sukcinimidyl-[3-(2-pyridyldithío)]propionátem (SPDP) byl připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chránénou hydrazidovou skupinou a methakryloylovaným biodegradovatelným oligopeptidem (např. GlyPheLeuGly) zakončeným N-[3-(2-pyridyldithio)propionyl]ethylamidovou skupinou. (Kopolymer 3b) • · · · • · · • « · · • · · · • · · • · · · · · • · * · • · · · » » c • · · * · • · · · · « • · · · « ·«· ··· · · « mt
Schéma struktury Kopolymeru^b)
Polymeranalogickou reakcí kopolymerů la a lb s 2-(2-pyridyldithio)ethylaminem (PDEA) (obecně s bifunkčním činidlem s primární amino nebo hydrazidovou skupinou a pyridyldisulfidovou skupinou jako např. PDEA, 2-(2-pyridyldithio)ethylhydrazinem, 4-(2-pyridyldithio)butylaminem) byl připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a methakryloylovaným biodegradovatelným oligopeptidem (např. GlyPheLeuGly) zakončeným 2-(2-pyridyldithio)ethylamidovou skupinou. (Kopolymer 3c).
» · «»«·<( • · · · · · « • · · · « • · · · « •«· ·«· · · ·
Schéma struktury Kopolymeru^3c
Kopolymery 4:
Tyto náhodné kopolymery nesou podle řetězce reaktivní sulfhydrylové skupiny.
Po sejmutí chránící skupiny byl polymeranalogickou reakcí kopolymeru 2a s 2-imino-thiolanem (ITH) připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými hydrazidovou skupinou a methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými 4-sulfanylbutanimidohydrazidovou skupinou. (Kopolymer 4a)
Schéma struktury Kopolymeru 4a ·· ♦· • · · • · · · • · « · • · · ···» «· • · · · « • · · <
• · · · · • · · i • · · · « · «
-14 Polymeranalogickou reakcí kopolymerů 2b a 2c s 2-imino-thiolanem (ITH) byl připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a methakryloylovaným oligopeptidem (např. GlyPheLeuGly) zakončeným 4-sulfanylbutanimidamidovou skupinou. (Kopolymer 4b)
Polymeranalogickou reakcí kopolymerů 3a s dithiothreitolem (DTT) byl připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými hydrazidovou skupinou a methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými 3sulfanylpropanohydrazidovou skupinou (Kopolymer 4c).
Schéma struktury Kopolymerů 4c ·· ·· * · · » « · · • « φ · • · · « · · · · t • · « · « I • » · « « · κι «t » ι « « • « 4 « · C » · · ♦ * · t · »
-15Polymeranalogickou reakcí kopolymerů 3b a 3c s dithiothreitolem (DTT) byl připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a methakryloylovaným oligopeptidem (např. GlyPheLeuGly) zakončeným 3-sulfanylpropanamidovou (Kopolymer 4d) nebo 2sulfanylethylaminovou skupinou (Kopolymer 4e).
Semitelechelické kopolymery jsou charakteristické tím, že obsahují 85 až 99 mol % HPMA, 1 až 15 % mol jednotek methakryloylováných Boc-chráněných hydrazidů aminokyselin nebo oligopeptidů a reaktivní skupinu situovanou u konce polymemího řetězce. Tyto polymery byly připraveny radikálovou kopolymerizací prováděnou v přítomnosti přenašeče řetězce [kyselina sulfanylpropionová (SPK) nebo cysteaminem], za iniciace azoiniciátorem 3,3'-azo-bis(4-kyan^isovalerovou kyselinou) (ABIK) a nebo za iniciace reaktivním azoiniciátorem 3,3'-[4,4'-azobis(4-kyanft-4-methyl-1 -oxo-butan-4,1 -diyl)]bis(thiazolidin-2-thionem) (ABIK-TT).
Kopolymerizacemi a případnými modifikacemi koncových funkčních skupin byly připraveny následující semitelechelické kopolymery jako rouby pro přípravu roubovaných kopolymerů:
• ·
I » I t s
• · · · « ··· · · · ·· «
-16 —
Schéma struktury ABIK-TT
Rouby 1:
Do této skupiny polymerů patří semitelechelické kopolymery obsahují koncové reaktivní Nsukcinimidylesterové nebo acylthiazolidin-2-thionové skupiny.
Radikálovou polymerizací HPMA iniciovanou iniciátorem ABIK-TT byl připraven homopolymer HPMA s koncovou reaktivní acylthiazolidin-2-thionovou skupinou (Roub la).
Schéma struktury Roubala
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou byl připraven radikálovou polymerizací HPMA prováděnou v přítomnosti přenašeče SPK. Kopolymer je zakončen A-sukcinimidylesterovou skupinou. (Roub lb).
• · · · • · · • · · · • · ····♦» • · · · · · « • · · · · • · · · · · • · · · · · ·· · —17 —
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a končící acylthiazolidin-2-thionovou skupinou byl připraven radikálovou kopolymerizací odpovídajících monomerů za iniciace ABIK-TT. Kopolymer končící A-sukcinimidylesterovou skupinou byl připraven obdobným způsobem za iniciace ABIK a následnou aktivací koncové karboxylové skupiny A-hydroxysukcinimidem (Roub lc).
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a končící A-sukcinimidylovým esterem • · · · • · * · · · • · ·
-18 biodegradovatelného oligopeptidu (např.GlyPhe LeuGly-OSu) obecně SP2 (Roub ld) byl připraven radikálovou kopolymerizací HPMA s příslušnými monomery iniciovanou ABIK a následnou aktivací koncové karboxylové skupiny A-hydroxysukcinimidem.
Schéma struktury Roubu ld
Rouby 2:
Tyto semitelechelické kopolymery obsahují koncové reaktivní hydrazidové nebo primární amino skupiny.
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou byl připraven radikálovou kopolymerizací prováděnou v přítomnosti cysteaminu. Tento kopolymer končí primární aminoskupinou. (Roub 2a) • · · · • · • · · · • · ·
Schéma struktury Roubu
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou končící primární aminoskupinou byl připraven reakcí koncových aktivovaných karboxylů Roubů lb a lc s nadbytkem hydrazin hydrátu, ethylendiaminu, butylendiaminu nebo hexametylendiaminu (Roub 2b).
Schéma struktury Roubu(2b
Rouby 3:
Tyto semitelechelické kopolymery obsahují koncové reaktivní dithiopyridylové skupiny. Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou zakončený 2-(2-pyridyldithio)ethylamidovou skupinou byl připraven reakcí koncových reaktivních skupin roubů lb a lc s PDEA (Roub 3a).
•· «· · · ····«· • · ···· ·· · * · 4 4 · « · · « ··· · 4 · 4 ·
4··· ·· 444 444 44 4
Schéma struktury Roubu (3a)
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou zakončený A-[3-(2-pyridyldithio)propionyl]amidovou skupinou byl připraven reakcí koncových reaktivních skupin roubů 2a a 2b s SPDP (Roub 3b).
Rouby 4:
Tyto semitelechelické kopolymery obsahují koncové reaktivní sulfhydrylové skupiny.
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou byl připraven reakcí roubů 2a a 2b s ITH. Polymemí • · • · « · • 4 4 «
444 444 4«
-21 — řetězec tohoto kopolymeru končí 4-sulfanylbutanimidamidovou skupinou nebo 4sulfanylbutanimidohydrazidovou skupinou (Roub 4a)
ΊΗ* ci
N
H
CH,
SH
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou byl připraven reakcí roubů 3a a 3b s DTT. Řetězec tohoto kopolymeru končí 3-sulfanylpropanohydrazidovou, 3-sulfanylpropanamidovou skupinou nebo 2sulfanylethylaminovou skupinou (Roub 4b) ch,
Schéma struktury Roubu[4b • · ·
-22 Polymerní nosič a polymeruj konjugát. Polymemí nosič je roubovaný vysokomolekulámí polymer bez navázaného léčiva, připravený roubovací reakcí semitelechelického kopolymerů na základní kopolymer, jak je ukázáno v příkladové části. K reakcím se ve většině případů používají výše uvedené kopolymery, jejichž hydrazidová skupina je chráněna Boc skupincu (t.-butyloxykarbonyl). V poslední fázi syntézy konjugátů je sejmuta chránící skupina z hydrazidové skupiny a na konjugát je navázán doxorubicin hydrazonovou vazbou reakcí vmethanolu za katalýzy kyselinou octovou. Finální polymemí léčivo (konjugát) je čištěno přesrážením a případně kolonovou chromatografií, jak je uvedeno v příkladové části.
Předmětem patentu jsou polymemí konjugáty doxorubicinu, jejichž detailní struktury jsou uvedeny v obrazové části a jejichž syntéza je popsána v příkladové části.
Vzhledem k typu reagujících skupin u základních polymerů a semitelechelických roubů jsou dále polymemí konjugáty rozděleny do 5 základních skupin. Byly připraveny následující konjugáty:
Konjugáty 1
Tyto konjugáty nesou DOX vázaný na polymer hydrazonovou vazbou, rouby jsou k hlavnímu řetězci vázány nedegradovatelnou vazbou. Pro přípravu těchto polymemích konjugátů byly použity kopolymery nesoucí podél hlavního řetězce hydrazidové nebo primární aminoskupiny a semitelechelické kopolymery s koncovými V-sukcinimidylesterovými nebo acylthiazolidin-2-thionovými skupinami.
Konjugát la byl připraven reakcí hydrazidových skupin Kopolymerů 2a s acylthiazolidin-2-thionovými skupinami Roubu la, odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
< c C £i ···· · · tl • · · · · · · ·· c » · · · · · ·· t • · · · · · · * • · · · ·· ··· ··· · · ·
- 23 —
Schéma struktury Konjugátuflaj(n = 40 - 335, m = 0 - 85, p = 1 - 20, q = 1 -10, r = 34 - 350).
Konjugát lb byl připraven reakcí hydrazidových skupin Kopolymerů 2a s thiazolidin-2thionovými nebo TV-sukcinimidylovými skupinami Roubu lb nebo lc, odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
-24 —
Konjugát lc byl připraven reakcí hydrazidových skupin Kopolymerů 2a s Nsukcinimidylesterovými skupinami Roubu ld, odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
« · · · ·· t · · «
N
II
CH, Dox
Schéma struktury Konjugátu (l<| (n = 40 - 335, m = 0 - 85, p = 1 - 20, q = 1 - 10, r = 34 - 350, s = 0 - 50, t = 1 20).
Konjugát ld byl připraven reakcí hydrazidových nebo primárních amino skupin Kopolymerů 2b nebo 2c s acylthiazolidin-2-thionovými nebo Y-sukcinimidylesterovými skupinami Roubu lb nebo lc , odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
NH SP, SP, ty SP2 ,OH HNX
HN„ x = 0, 2, 4, 6
NH, HNV
Dox O^.NH
Schéma struktury Konjugátu(l^ (n = 40 - 335, m = 0 - 85, p = 1- 20, q = 1 - 10, r = 34 - 350, s = 0-50, t = l20).
CH,
CN • · β « t <· ·* «· • · · • · · · « · · · • · · • β · · 4 · • 4 · · · · ť • · · « « • · · 4 · « • · · · ( • ·· * · 4 «4 t
-26 Konjugáty 2
Tyto konjugáty nesou DOX vázaný na polymer hydrazonovou vazbou, rouby jsou k hlavnímu řetězci vázány biodegradovatelnou vazbou - enzymaticky štěpitelnou oligopeptidovou sekvencí. Pro přípravu těchto polymemích konjugátů byly použity kopolymery nesoucí podél hlavního řetězce reaktivní 4-nitrofenoxy nebo thiazolidin-2-thionové skupiny a semitelechelické kopolymery s koncovými hydrazidovými nebo primárními amino skupinami.
Konjugát 2 byl připraven reakcí acylthiazolidin-2-thionových nebo 4-nitrofenylesterových skupin Kopolymeru la nebo lb s hydrazidovými nebo primárními amino skupinami Roubu 2a nebo 2b , odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
Schéma struktury Konjugátu^. (n = 40 - 335, m = 0 - 85, p = 1 - 20, q = 1 - 10, r = 34 - 350, s = 0-50, t = l20).
Konjugáty 3
Tyto konjugáty nesou DOX vázaný na polymer hydrazonovou vazbou, rouby jsou k hlavnímu řetězci vázány biodegradovatelnou vazbou - disulfidovými můstky reduktivně štěpitelnými v cytoplasmě cílových buněk. Pro přípravu těchto polymemích konjugátů byly použity kopolymery nesoucí podél hlavního řetězce reaktivní dithiopyridylové skupiny a semitelechelické kopolymery s koncovými sulfhydrylovými skupinami.
·» «· • « · < · t · • · · · « · · « · · · « » • · «
9 * « » » « f
9»
9 · · • · » • · ·
-27 —
Konjugát 3a byl připraven reakcí dithiopyridylových skupin Kopolymeru 3a nebo 3b s sulfhydrylovými skupinami Roubu 4a nebo 4b, odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
Schéma struktury Konjugátu^ (n = 40 - 335, m = 0 - 85, p = 1 - 20, q = 1 - 10, r = 34 - 350, s = 0 - 50, t = 1 20).
Konjugát 3b byl připraven reakcí dithiopyridylových skupin Kopolymeru 3c s sulfhydrylovými skupinami Roubu 4a nebo 4b, odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
* t l| » c « « · t » • · · III · «I»
11«
mr i
CH.
Dox x 0,2,4, 6
Schéma struktury Konjugátu (3 b) (n = 40 - 335, m = 0 - 85, p = 1 - 20, q = 1 - 10, r = 34 - 350, s = 0-50, t = 1 20).
Konjugáty 4
Tyto konjugáty nesou DOX vázaný na polymer hydrazonovou vazbou, rouby jsou k hlavnímu řetězci vázány biodegradovatelnou vazbou - disulfidovými můstky reduktivně štěpitelnými v cytoplasmě cílových buněk. Pro přípravu těchto polymemích konjugátů byly použity kopolymery nesoucí podél hlavního řetězce sulfhydrylové skupiny a semitelechelické kopolymery s koncovými reaktivní dithiopyridylovými skupinami.
Konjugát 4a byl připraven reakcí sulfhydrylových skupin Kopolymeru 4a nebo 4b s dithiopyridylovými skupinami Roubu 3a nebo 3b, odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
• · • « (• · · · • · • · • · • · · · · · • · · • · * • · » • · · • · * •« «
Schéma struktury Konjugátu|4d (n = 40 - 335, m = 0 - 85, p = 1 - 20, q = 1 - 10, r = 34 - 350, s = 0 - 50, t = 1 20).
Konjugát 4b byl připraven reakcí sulfhydrylových skupin Kopolymeru 4c nebo 4d s dithiopyridylovými skupinami Roubu 3a nebo 3b, odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
• · · «
Schéma struktury Konjugátu (n = 40 - 335, m = 0 - 85, p = 1 - 20, q = 1 - 10, r = 34 - 350, s = 0 - 50, t = 1 20).
Konjugát 4c byl připraven reakcí sulfhydrylových skupin Kopolymeru 4e s dithiopyridylovými skupinami Roubu 3 a nebo 3b, odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
-31 —
Konjugáty 5
Tyto konjugáty nesou DOX vázaný na polymer hydrazonovou vazbou, rouby jsou k hlavnímu řetězci vázány biodegradovatelnou vazbou - enzymaticky štěpitelnou oligopeptidovou sekvencí a byly připraveny radikálovou terpolymerizací HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a methakryloylovanými makromonomery připravenými methakryloylací HPMA semitelechelického kopolymeru zakončeného primární aminoskupinou (Makromonomery, Obr. 32). Makromomery byly připraveny reakcí hydrazidových nebo primárních aminoskupin Roubů 2a a 2b s methakryloylovanými deriváty biodegradovaných oligopeptidů zakončených 4-nitrofenoxy nebo thiazolidin-2-thionovou skupinou.
Schéma struktury Makromonomerů (r = 34 - 350, s = 1 - 70).
Schéma struktury Konjugátu(s)(n = 40 - 335, m = 0 - 85, p = 1 - 20, q = 1 -10, r = 34 - 350, s = 0 - 50, t = 1 - 20).
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 znázorňuje graf rychlosti uvolňování DOX z roubovaných polymemích konjugátů a lineárního polymemího konjugátu v pufru o pH 5 (model intracelulámího prostředí).
Obr. 2 znázorňuje graf rychlosti uvolňování DOX z roubovaných polymemích konjugátů a lineárního polymemího konjugátu v pufru o pH 7,4 (model krevního řečiště).
Obr. 3 znázorňuje závislost molekulové hmotnosti roubovaných polymemích konjugátů na čase při degradaci těchto konjugátů - A) degradace Konjugátu ld pomocí lysosomálního enzymu kathepsinu B [c(kathepsin B) = 5.10’7 mol/1]; B) degradace Konjugátu 3a pomocí glutathionu [c(glutathion) = 3.10'3 mol/1].
Obr. 4 znázorňuje graf přežívání B/6 myší s inokulovaným myším lymfomem EL 4 léčených roubovanými konjugáty DOX po i.v. podání jedné dávky 15 mg/kg ekvivalentu DOX v terapeutickém režimu podání léčiva.
« · ·
-33 •» »· * · · » « » · « · ♦ • · « * « * · ♦ · < « e • ·
• · · • · *
Příklady provedení syntézy meziproduktů a konjugátů podle vynálezu
Přiklad 1: Syntéza monomerů a iniciátoru ABIK-TT
3,3'-[4,4'-Azobis(4-kyan$-4-methyl-l-oxo-butan-4,l-diyl)]bis(thiazolidin-2-thion) (ABIK-TT) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Šubr 2006]
HPMA byl připraven podle dříve popsaného postupu [Ulbrich a kol. 2000]. Elementární analýza: vypočteno 58,8 % C, 9,16 % H, 9,79 % N; nalezeno 58,98 % C, 9,18 % H, 9,82 % N. Produkt byl chromatograficky čistý.
6-(Methakryloylamino)hexanoyl-yV'-(/é77. -butyloxykarbonyl)hydrazin (MA-AH-NHNH-Boc) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Ulbrich 2004a]
6-(Methakryloylamino)hexanoylhydrazin (//'-(ó-hydrazino-ó-oxohexylýž-methylakrylamid) (MA-AH-NHNH2) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Ulbrich patenty, Etrych patent], MA-GFLG-TT nebo MA-GFLG-ONp
4-Nitrofenyl ester A-methakryloylglycyl-DL-fenylalanylleucylglycinu (MA-GFLG-ONp) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Rejmanová 1977]
Thiazolidin-2-thion 7V-methakryloylglycyl-DL-fenylalanylleucylglycinu (MA-GFLG-TT) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Šubr patent]
6-(Methakryloylamino)hexanoylhydrazin-Doxorubicin (MA-AH-NHN=DOX)
6-(Methakryloylamino)hexanoylhydrazin (40 mg, 0,188 mmol) byl rozpuštěn při teplotě místnosti v 6 ml methanolu. Tento roztok byl nalit do reakční nádobky, ve které byl umístěn Doxorubicin.HCl (115 mg, 0,198 mmol), a suspenze byla intenzivně míchána. Do této suspenze bylo přidáno 310 μΐ kyseliny octové a reakční směs byla míchána 24 hodin při teplotě místnosti. Průběh reakce sledován na TLC - destičky Silikagel 60 F254 (methanol:chloroform:kyselina octová 2:8:1, Rf(DOX)= 0,75, Rf(MA-AH-NHN=DOX)= 0,9). Poté bylo do homogenní reakční směsi přidáno 100 mg kopolymeru 1 (na vyvázání zbytkového volného DOX) a reakční směs míchána další 4 h při teplotě místnosti. Produkt byl vyčištěn od polymemích a nízkomolekulámích příměsí pomocí gelové chromatografie na koloně (30cm x 3cm naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Filtrát byl zahuštěn na 2 ml a produkt vysrážen do 30 ml ·
-34 • · 4 •
4 4 4 diethyleteru. Produkt byl odsát, promyt malým množstvím diethyleteru a vakuově sušen do konstantní hmotnosti. Výtěžek činil 110 mg produktu (79 %) s teplotou tání 172 až 175 °C. TLC (methanol:chloroform:kyselina octová 2:8:1) jedna skvrna při Rf= 0,9. MALDI-TOF MS: 762 (M+Na).
Methakryloylovaný makromonomer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-GLFG-MA byl připraven reakcí koncových hydrazidových nebo primárních amino skupin semitelechelických kopolymerů (Roubů 2a a 2b) s 4-nitrofenoxy nebo thiazolidin-2-thionovými skupinami methakryloylovaných derivátů biodegradovaných oligopeptidů.
200 mg kopolymerů Roub 2a (0,0125 mmol NH2 skupin) bylo rozpuštěno v 2 ml methanolu a za rychlého míchání při teplotě místnosti byl přidán roztok 7,7 mg MA-GFLG-TT (0,0137 mol, 110% vzhledem kNH2 skupinám) 1 ml methanolu. Po 2 h byla reakční směs naředěna na 6 ml methanolem a methakrylovaný makromonomer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 3 ml a makromonomer byl izolován vysrážením do 30 ml ethylacetátu. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti.
Příklad 2: Syntéza polymerního prekurzoru -Kopolymerů lb - kopolymerů HPMA s MAGFLG-TT
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-TT) byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA, MA-AH-NHNH-Boc a MA-GFLG-TT v DMSO při 60 °C. 465 mg (3,25 mmol) HPMA, 44,5 mg (0,14 mmol) MA-AH-NHNH-Boc, 100 mg (0,18 mmol) MA-GFLG-TT (12,5 hm% monomerů) a 98,3 mg (0,60 mmol) ABIN (2 Ijm %) bylo rozpuštěno v 3,8 ml DMSO. Ampule s roztokem polymerizační směsi byla 10 min probublávána dusíkem, poté zatavena a na 6 h umístěna do termostatu vyhřívaného na 60 °C. Následně byla reakční směs vysrážena do 80 ml směsi aceton : diethylether 3:1a zcentrifugována. Polymer byl přesrážen z methanolu do stejné směsi, zfiltrován na fritě S4 a sušen do konstantní hmotnosti.
« · • · *
-35 • « · · • · · « ·· · « ♦ « · • · · « · · · · ·
Příklad 3: Syntéza polymerního prekurzoru -Kopolymeru 2a - kopolymeru HPMA s MAAH-NHNH2
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHNH2 v methanolu při 60 °C podle dříve popsaného postupu [Etrych patent].
Příklad 4: Syntéza polymerního prekurzoru -Kopolymeru 2c - kopolymeru poly(HPMA-coMA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-NH2)
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-NH2) byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG— TT) s nadbytkem ethylendiaminu (EDA).
410 mg polymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-TT) (0,10 mmol TT skupin) bylo rozpuštěno v 6 ml methanolu. Do intenzivně míchaného nažloutlého roztoku bylo přidáno 70 μΐ EDA (1,05 mmol). Po 30 min byl odbarvený roztok vysrážen do 120 ml směsi aceton : diethylether 3:1, přesrážen z methanolu do stejné směsi a zfiltrován. Polymer byl usušen do konstantní hmotnosti.
Příklad 5: Syntéza polymerního prekurzoru -Kopolymeru 3a - kopolymeru poly(HPMA-co- MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-PDS)
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-PDS) byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) s bifunkčním činidlem SPDP.
400 mg polymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) (0,17 mmol NHNH2 skupin) bylo rozpuštěno v 7 ml methanolu a do intenzivně míchaného roztoku byl přidán roztok 30 mg SPDP (0,094 mmol) v 1 ml methanolu. Po 2 h byla reakční směs naředěna na 15 ml methanolem a kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 8 ml a kopolymer byl izolován vysrážením do 100 ml ethylacetátu. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti « ·
-36 £ · ·
C <
< « · · · · • · « « • · · • · « • · 1
Příklad 6: Syntéza polymerního prekurzoru -Kopolymerů 3c - kopolymerů poly(HPMA-co- MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-AH-PDS)
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-AH-PDS) byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymerů poly(HPMA-co- MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-AH-TT) s bifunkčním činidlem PDEA.
mg PDEA.HC1 (0,089 mmol) bylo rozpuštěno v 1 ml DMSO a za intenzivního míchání bylo přidáno 14,5 μΐ diisopropylethylaminu (0,089 mmol). Po 5 min byl do tohoto roztoku přidán za intenzivního míchání při teplotě místnosti roztok 300 mg polymeru poly(HPMA-co- MA.-AHNHNH-Boc-co-MA-AH-TT) (0,073 mmol TT skupin) ve 4 ml DMSO. Po 2 h byla reakční směs naředěna na 15 ml methanolem a kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 6 ml a kopolymer byl izolován vysrážením do 80 ml směsi aceton : diethylether 1:3. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti.
Příklad 7: Syntéza polymerního prekurzoru -Kopolymerů 4b - kopolymerů poly(HPMA-co- MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-SH)
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-SH) byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG- NH2) s ITH ve fosfátovém pufru.
350 mg kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-NH2) (0,11 mmol NH2 skupin) bylo rozpuštěno v 7 ml fosfátového pufru (0,05 M fosfátový pufr s 0,1 M NaCl, pH 7,4). 80 mg ITH (0,58 mmol) bylo rozpuštěno v 1 ml destilované vody a tento roztok byl za intenzivního míchání při teplotě místnosti přidán do roztoku kopolymerů. Po 30 min byla reakční směs naředěna na 20 ml destilovanou vodou a kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadex G-25 v destilované vodě za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena a zlyofilizována na lyofilizačním přístroji Lyovac GT2.
Příklad 8: Syntéza polymerního prekurzoru -Kopolymerů 4c - kopolymerů poly(HPMA-co- MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-SH) « · · « ♦ ♦· « <
• » • · · · · ·
-37 —
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2^co-MA-AH-SH) byl připraven redukcí PDS skupin kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-PDS) pomocí DTT v destilované vodě.
300 mg kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-PDS) (0,075 mmol PDS skupin) bylo rozpuštěno v 5 ml destilované vody. 40 mg DTT (0,26 mmol) bylo rozpuštěno v 1 ml destilované vody a tento roztok byl za intenzivního míchání při teplotě místnosti přidán do roztoku kopolymeru. Po 20 min byla reakční směs naředěna na 15 ml destilovanou vodou a kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadex G-25 v destilované vodě za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena a zlyofilizována na lyofílizačním přístroji Lyovac GT-2.
Příklad 9: Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru -Roubu lb - kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHNH-Boc vDMSO při 60 °C za iniciace iniciátorem ABIK-TT.
367 mg (2,57 mmol) HPMA, 70 mg (0,224 mmol) MA-AH-NHNH-Boc (14 bm% monomerů) bylo rozpuštěno v 2,7 ml DMSO a tento roztok byl umístěn do polymerační ampule, ve které bylo již naváženo 140 mg (0,290 mmol) ABIK-TT (4 hm%). Roztok v ampuli byl 15 min probubláván dusíkem, ampule byla zatavena a umístěna do termostatu vyhřívaného na 6$C. K rozpuštění iniciátoru došlo po 3 min při teplotě 6(^C. Po 6 h byla reakční směs vysrážena do 80 ml směsi aceton : diethylether 2:1. Kopolymer byl rozpuštěn ve 4 ml methanolu a opět vysrážen do 60 ml stejné srážecí směsi. Vysrážený kopolymer byl odfiltrován na fritě S4 a sušen do konstantní hmotnosti.
Příklad 10: Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru -Roubu lc - kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-OSu
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-OSu byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHNH-Boc v etbanolu při 50 °C za iniciace iniciátoru ABIK a následnou aktivací koncových karboxylových skupin na Nsukcinimidylový ester.
-38 ·« · · • · · • ♦ · · • · · · • · · • · · · · ·
• » * ί·
3,33 g (23,2 mmol) ΗΡΜΑ, 674 mg ( 2,16 mmol) MA-AH-NHNH-Boc (12 hní% monomerů) a 600 mg (2,14 mmol) ABIK (1,8 hm%) bylo rozpuštěno v 35 ml ethanolu. Roztok byl umístěn do polymerizační ampule a 15 min probubláván dusíkem. Následně byla ampule zatavena a umístěna do termostatu vyhřívaného na 50 °C. Po 21 h byla reakční směs vysrážena do 700 ml acetonu a zcentrifugována. Kopolymer byl přesrážen z methanolu do stejného srážedla, zfiltrován na fřitě S4 a sušen do konstantní hmotnosti. V druhém kroku bylo 400 mg polymeru (0,027 mmol COOH) rozpuštěno v 1,75 ml DMF. 27,5 mg dicyklohexylcarbodiimidu (DCC) (0,133 mmol) a 15,4 mg A-hydroxysukcinimidu (0,133 mmol) bylo rozpuštěno v 0,2 ml DMF a přidáno k míchanému a na 4 °C chlazenému (směsí voda - led) roztoku kopolymerů. Reakční směs byla míchána 1,5 h při 4 °C a 2 h při teplotě místnosti. Polymer byl vysrážen do 50 ml acetonu a odfiltrován na fřitě S4. Po usušení do konstantní hmotnosti byl vzorek skladován pod argonem při -18°C.
Příklad 11: Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru (syntéza s přenosem SPK) -Roubu lc - kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-OSu
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-OSu byl připraven srážecí radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHNH-Boc v acetonu při 50 °C v přítomnosti iniciátoru ABIN a přenosového činidla SPK. Koncové karboxylové skupiny byly v druhém kroku převedeny reakcí s DCC a N-hydroxysukcinimidem na N-sukcinimidylový ester.
438 mg (3,07 mmol) HPMA, 76 mg (0,36 mmol) MA-AH-NHNH-Boc, 4,6 mg (0,028 mmol) ABIN a 6 mg (0,057 mmol) SPK bylo rozpuštěno v 3,86 ml acetonu a roztok byl umístěn do polymerizační ampule. Roztok v ampuli byl 10 min probubláván dusíkem, ampule byla zatavena a na 19 h umístěna do termostatu vyhřívaného na 50 °C. Vyloučený polymer byl odfiltrován, rozpuštěn v 2 ml methanolu a fřakcionován na koloně naplněné Sephadexem LH-60 při použití methanolu jako eluentu. Po oddělení oligomemí frakce byl roztok polymeru vakuově zahuštěn a vysrážen do lOnásobného přebytku směsi acetonu s diethyletherem (1:1). Polymer byl odfiltrován na fritě S4 a sušen do konstantní hmotnosti. V druhém kroku bylo 340 mg polymeru (0,028 mmol COOH) rozpuštěno v 1,6 ml DMF. 28,5 mg dicyklohexylcarbodiimidu (DCC) (0,138 mmol) a 15,9 mg (V-hydroxysukcinimidu (0,138 mmol) bylo rozpuštěno v 0,2 ml DMF a přidáno k míchanému a na 4°C chlazenému roztoku kopolymerů. Reakční směs byla míchána 3,5 h při 4
-39 f ·· • · • · · · • ·· · ·· °C a 3 h při teplotě místnosti. Polymer byl izolován srážením do 50 ml acetonu a filtrací na fritě S4. Po usušení do konstantní hmotnosti byl vzorek skladován pod argonem při -18 °C.
Příklad 12: Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru -Roubu ld - kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-GFLG-OSu
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-GFLG-OSu byl připraven dvojkrokovou syntézou. V prvním kroku reagoval A-sukcinimidylový ester kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-OSu samino skupinou oligopeptidu GFLG. Koncové karboxylové skupiny připraveného kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-GFLGCOOH byly v druhém kroku převedeny reakcí sDCC a A-hydroxysukcinimidem na Nsukcinimidylový ester.
300 mg kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-OSu (0,025 mmol OSu skupin) bylo rozpuštěno v 2 ml DMF a k tomuto roztoku byl přidán roztok 14 mg oligopeptidu GFLG (0,036 mmol) v 0,2 ml DMF. Reakční směs byla míchána 3,5 h při teplotě místnosti. Polymer byl izolován srážením do 40 ml acetonu a filtrací na fritě S4. Po usušení do konstantní hmotnosti byl vzorek skladován pod argonem při -18 °C. V druhém kroku bylo 320 mg polymeru (0,027 mmol COOH) rozpuštěno v 1,6 ml DMF. 28,5 mg dicyklohexylcarbodiimidu (DCC) (0,138 mmol) a 15,9 mg A-hydroxysukcinimidu (0,138 mmol) bylo rozpuštěno v 0,2 ml DMF a přidáno k míchanému a na jřfc chlazenému roztoku kopolymeru. Reakční směs byla míchána 4 h při 4 °C a 3 h při teplotě místnosti. Polymer byl izolován srážením do 50 ml acetonu a filtrací na fritě S4. Po usušení do konstantní hmotnosti byl vzorek skladován pod argonem při -18 °C.
Příklad 13: Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru (syntéza s přenosem cysteaminem) -Roubu 2a - kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NH2 Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NH2 byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHNH-Boc v metanolu při 50 °C v přítomnosti iniciátoru ABIN a přenosového činidla cysteaminu.
385 mg (2,69 mmol) HPMA, 76 mg (0,36 mmol) MA-AH-NHNH-Boc, 1,55 mg (0,0095 mmol) ABIN a 2,8 mg (0,036 mmol) cysteaminu bylo rozpuštěno v 4 ml methanolu a roztok byl umístěn do polymerizační ampule. Roztok v ampuli byl 10 min probubláván dusíkem, ampule byla zatavena a na 24 h umístěna do termostatu vyhřívaného na 50 °C. Polymer byl izolován • 9 « « · ·« » « · • » • · • · · · ·♦
-40~ vysráženém do 60 ml směsi aceton : diethylether 2:1. Kopolymer byl odfiltrován na fritě S4 a přesrážen z methanolu (3 ml) do 40 ml stejné srážecí směsi. Polymer byl odfiltrován na fritě S4 a sušen do konstantní hmotnosti.
Příklad 14: Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru-Roubu 2b - kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NH2
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NH2 byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT s ethylendiaminem v methanolu.
450 mg polymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT (0,041 mmol TT skupin) bylo rozpuštěno v 6 ml methanolu. Do intenzivně míchaného nažloutlého roztoku bylo přidáno 30 μΐ EDA (0,45 mmol). Po 30 min byl odbarvený roztok vysrážen do 120 ml směsi aceton : diethylether 3:1, přesrážen z methanolu do stejné směsi a zfiltrován. Polymer byl usušen do konstantní hmotnosti.
Příklad 15: Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru - Roubu 3a - kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-PDS
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-PDS byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT s bifunkěním činidlem PDEA v DMSO.
mg PDEA.HC1 (0,045 mmol) bylo rozpuštěno v 0,5 ml DMSO a za intenzivního míchání bylo přidáno 7,3 μΐ diisopropylethylaminu (0,045 mmol). Po 5 min byl do tohoto roztoku přidán za intenzivního míchání při teplotě místnosti roztok 400 mg polymeru poly(HPMA-co- MA-AH- NHNH-Boc)-TT (0,036 mmol TT skupin) v 5 ml DMSO. Po 2 h byla reakční směs naředěna na 15 ml methanolem a kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu (RI detekce). Polymemí frakce byla zachycena, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 6 ml a kopolymer byl izolován vysrážením do 80 ml směsi aceton : diethylether 3:1. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti.
-41 — β· »· • < · · ·· • 4 · · · · >444 ♦ <
4« ·
4 «Μ C · ?
4« • 4 9 *
4 4
Μ ·
Příklad 16: Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru - Roubu 3b - kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-PDS
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-PDS byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NH2 s bifunkčním činidlem SPDP v methanolu.
300 mg polymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NH2 (0,025 mmol NHNH2 skupin) bylo rozpuštěno v 4 ml methanolu a do intenzivně míchaného roztoku byl přidán roztok 11 mg SPDP (0,035 mmol) v 1 ml. Po 2 h byla reakční směs naředěna na 15 ml methanolem a kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 8 ml a kopolymer byl izolován vysrážením do 100 ml ethylacetátu. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti.
Příklad 17: Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru - Roubu 4a - kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-SH
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-SH byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NH2 sITH ve fosfátovém pufru.
250 mg kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NH2 (0,021 mmol NH2 skupin) bylo rozpuštěno v 5 ml fosfátového pufru (0,05 M fosfátový pufr s 0,1 M NaCl, pH 7,4). 16 mg ΙΊΉ (0,116 mmol) bylo rozpuštěno v 0,5 ml destilované vody a tento roztok byl za intenzivního míchání při teplotě místnosti přidán do roztoku kopolymeru. Po 25 min byla reakční směs naředěna na 15 ml destilovanou vodou a kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadex G-25 v destilované vodě za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena a zlyofilizována na lyofilizačním přístroji Lyovac GT-2.
Příklad 18: Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru - Roubu 4b - kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-SH
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-SH byl připraven redukcí PDS skupin kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-PDS pomocí DTT v destilované vodě.
• · · · · e • · · « « • »··«£• · · · <
• · · ··· · · Γ
-42300 mg kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2)-PDS (0,022 mmol PDS skupin) bylo rozpuštěno v 5 ml destilované vody. 20 mg DTT (0,13 mmol) bylo rozpuštěno v 1 ml destilované vody a tento roztok byl za intenzivního míchání při teplotě místnosti přidán do roztoku kopolymeru. Po 20 min byla reakční směs naředěna na 15 ml destilovanou vodou a kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadex G25 v destilované vodě za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena a zlyofilizována na lyofilizačním přístroji Lyovac GT-2.
Příklad 19: Syntéza polymerního konjugátu - Konjugát ld - kopolymeru poly(HPMA-co- MA-AH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-GFLG-NH-)-graft-[(GFLG)-poly(HPMA-co- MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX)]
Polymemí konjugát poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-GFLG~ NH-)-graft-[(GFLG)-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX)] byl připraven reakcí amino skupin kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-NH2) s TT skupinami kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT, následným odchráněním hydrazidových skupin pomocí triflouroctové kyseliny (TFA) a navázáním DOX v metanolu za katalýzy kyseliny octové.
180 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT (0,015 mmol TT) bylo rozpuštěno ve 3 ml DMSO a přidáno při teplotě místnosti k míchanému roztoku 70 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-NH2) (0,017 mmol NH2) ve 2 ml DMSO. Po 2,5 h reakce při teplotě místnosti byl roztok vysrážen do 50 ml směsi ethylacetát: diethyleťher 3:1a odfiltrován na fritě S4. Roubovaný kopolymer byl rozpuštěn ve 4 ml methanolu, vysrážen opět do směsi ethylacetát: diethylether, zfiltrován a vysušen do konstantní hmotnosti. Při odstranění chránících Boc skupin bylo 220 mg roubovaného kopolymeru rozpuštěno ve 6 ml směsi TFA : triisopropylsilan : voda 95 : 2,5 : 2,5. Po 15 minutách byla směs opakovaně odpařována s methanolem (v pětinásobném přebytku) na vakuové odparce za vakua vodní vývěvy, dokud se nevyloučily po odpaření krystalky. Produkt byl rozpuštěn ve vodě a pH vodného roztoku bylo zvýšeno na pH = 7 - 8. Kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadex G-25 v destilované vodě za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena a zlyofilizována na lyofilizačním přístroji Lyovac GT-2. Při vazbě DOX na roubovaný kopolymer bylo 200 mg kopolymeru rozpuštěno ve 2 ml methanolu a tento roztok byl nalit do termostatované • · · · ··· · · · · · « • · · · · · · * ·»·· « «·«< • · · · · · e • · · · « · · · · ·*· tl
-43 — cely, ve které bylo umístěno 20 mg DOX.HC1 (0,034 mmol). Nehomogenní suspenze byla míchána v temnu při 25 °C a po 1 minutě bylo přidáno 100 μΐ kyseliny octové. V průběhu reakce došlo k pozvolnému rozpuštění suspenze a po 23 h reakce byl z homogenního roztoku polymerní produkt vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí a nenavázaného léčiva gelovou chromatografn na koloně naplněné Sephadexem LH-20 vmethanolu. Polymerní frakce byla zachycena, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 3 ml a kopolymer byl izolován vysrážením do 30 ml ethylacetátu. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti.
Příklad 20: Syntéza polymerního konjugátu - Konjugát 2 - kopolymeru poly(HPMA-co-MA- AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-GFLG-NH-)-graft-[(GFLG)-poly(HPMA-co-MA- AH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX)]
Polymerní konjugát poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-GFLGNH-)-graft-[(GFLG)-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX)] byl připraven reakcí ONp skupin kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-ONp) s hydrazidovými skupinami kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NHNH2, následným odchráněním hydrazidových skupin pomocí triflouroctové kyseliny (TFA) a navázáním DOX v metanolu za katalýzy kyseliny octové.
250 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NHNH2 (0,019 mmol TT) bylo rozpuštěno ve 4 ml DMSO a přidáno při teplotě místnosti k míchanému roztoku 90 mg poly(HPMA-co-MA-AH— NHNH-Boc-co-MA-GFLG-ONp) (0,021 mmol NH2) ve 2,5 ml DMSO. Po 3 h reakce při teplotě místnosti byl roztok vysrážen do 50 ml směsi aceton : diethylether 3:1a odfiltrován na fritě S4. Roubovaný kopolymer byl rozpuštěn v 5 ml methanolu, vysrážen opět do směsi ethylacetát : diethylether, zfiltrován a vysušen do konstantní hmotnosti. Odstranění chránících Boc skupin a navázání léčiva na roubovaný kopolymer bylo provedeno obdobným způsobem jako v příkladu
19.
Příklad 21: Syntéza polymerního konjugátu - Konjugát 3a - kopolymeru poly(HPMA-co- MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-AH-SS-)-graft-[(SS)-poly(HPMA-co-MAAH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX)] • · ca* c • · · · · • · · · · • · · · • · · · · « » · ·
Polymemí konjugát poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-AH-SS-)graft-[(SS)-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX)] byl připraven reakcí PDS skupin kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-PDS) s sulfhydrylovými skupinami kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-SH, následným odchráněním hydrazidových skupin pomocí triflouroctové kyseliny (TFA) a navázáním DOX v metanolu za katalýzy kyseliny octové.
330 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-SH (0,021 mmol SH skupin) bylo rozpuštěno v 7 ml fosfátového pufru (0,05 M fosfátový pufř s0,l M NaCl, 0,01 M ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA), pH 7,4) a přidáno při teplotě místnosti k míchanému roztoku 108 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-c0-MA-AH-PDS) (0,025 mmol PDS skupin) ve 2,5 ml téhož pufru. Po 3 h reakce při teplotě místnosti byl roubovaný kopolymer vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadexem G-25 v destilované vodě za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena a zlyofilizována na lyofilizačním přístroji Lyovac GT-2. Odstranění chrámcích Boc skupin a navázání léčiva na roubovaný kopolymer bylo provedeno obdobným způsobem jako v příkladu 19.
Příklad 22: Syntéza polymerního konjugátu - Konjugát 3a - kopolymeru poly(HPMA-co- MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-AH-SS-)-graft-[(SS)-poly(HPMA-co-MA- AH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX)]
Polymemí konjugát poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-AH-SS-)graft-[(SS)-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX)] byl připraven reakcí SH skupin kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-AH-SH) sPDS skupinami kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-PDS, následným odchráněním hydrazidových skupin pomocí triflouroctové kyseliny (TFA) a navázáním DOX v metanolu za katalýzy kyseliny octové.
280 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-PDS (0,019 mmol PDS skupin) bylo rozpuštěno v 6 ml fosfátového pufru (0,05 M fosfátový pufř s 0,1 M NaCl, 0,01 M ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA), pH 7,4) a přidáno při teplotě místnosti k míchanému roztoku 95 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-AH-SH) (0,024 mmol SH skupin) ve 2,5 ml téhož pufru. Po 3 h reakce při teplotě místnosti byl roubovaný kopolymer vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí pomocí gelové chromatografie na koloně naplněné Sephadex G-25 v destilované vodě za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena a zlyofilizována na lyofílizačním přístroji Lyovac GT-2. Odstranění chránících Boc skupin a navázání léčiva na roubovaný kopolymer bylo provedeno obdobným způsobem jako v příkladu 19.
Příklad 23: Syntéza polymemího konjugátu - Konjugát 5 - kopolymeru poly(HPMA-co-MA AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-GFLG-NH-)-graft-[(GFLG)-poly(HPMA-co-MA_ AH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX)]
Polymemí konjugát poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-GFLG_ NH-)-graft-[(GFLG)-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX)] byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA, MA-AH-NHNH2 a poly(HPMA-co-MA-AH_NHNH-Boc)-GLFG-MA v methanolu při 60 °C.
465 mg (3,25 mmol) HPMA, 44,5 mg (0,20 mmol) MA-AH-NHNH2, 950 mg (0,076 mmol) poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-GLFG-MA a 98,3 mg (0,60 mmol) ABIN bylo rozpuštěno v 9 ml methanolu. Ampule s roztokem polymerizační směsi byla 10 min probublávána dusíkem, poté zatavena a na 24 h umístěna do termostatu vyhřívaného na 60 °C. Následně byla reakční směs vysrážena do 100 ml směsi aceton : diethylether 3:1a zcentrifugována. Polymer byl přesrážen z methanolu do stejné směsi, zfíltrován na ťritě S4 a sušen do konstantní hmotnosti. Odstranění chránících Boc skupin a navázání léčiva na roubovaný kopolymer bylo provedeno obdobným způsobem jako v příkladu 19.
Příklad 24: Uvolňování doxorubicinu z roubovaných polymemích konjugátů
Bylo měřeno množství doxorubicinu uvolněného z roubovaných polymemích konjugátů po jejich inkubaci ve fosfátovém puffu o pH 5,0 (0,1 M fosfátový pufř obsahujícím 0,05 M NaCl) modelujícím intracelulámí prostředí a fosfátovém pufru pH 7,4 modelujícím prostředí krevního řečiště. Množství uvolňovaného DOX v inkubačním roztoku bylo stanoveno pomocí HPLC (Shimadzu). V předem určených časových intervalech bylo odebíráno 50 μΐ inkubačního roztoku a analyzováno na koloně TSKGel G 3000x1, izokratický průtok 0,5 ml/min mobilní fáze složené ze směsi methanokoctanový pufř pH 6,5 (80 : 20 % obj.). Množství DOX bylo vypočteno z ploch píků volného a vázaného DOX (UV-VIS detekce při 488 nm). Po inkubaci konjugátů (koncentrace 5 mg/ml) ve fyziologickém prostředí při 36 °C (fosfátový pufř, pH 7,4) se uvolňuje jen malé množství léčiva (do 8 %/24 hod) (Obr.33); naopak rychlost uvolňování DOX • · * ··· β · · · · · · · « • · · · · · · »· ·«·· · · · · t • · · · · · ···· tl «·· · · · ·« —46 — z roubovaných polymemích konjugátů, a tedy rychlost aktivace cytotoxického léčiva, je v mírně kyselém prostředí při pH 5,0 (Obr. 35) značná. Rychlosti uvolňování léčiva vpH 7,4 a pH 5 z roubovaných polymemích konjugátů jsou plně srovnatelné s rychlostmi uvolňování léčiva zjištěných u hydrazonových konjugátů připravených pouze z lineárních kopolymerů [Etrych patent].
Příklad 25: Degradace roubovaných polymemích konjugátů pomocí glutathionu nebo cathepsinu B na degradační produkty vylučitelné z organizmu
Degradační experimenty byly provedeny ve fosfátovém pufru (0,1 M fosfátový pufr obsahujícím 0,05 M NaCl, pH 6) v přítomnosti katepsinu B nebo glutathionu jako degradačních činidel, tj. v prostředí modelujícím prostředí buňky (cytoplasma, endosom a sekundární lysosom). Roubované polymemí konjugáty byly rozpuštěny ve fosfátovém pufru v koncentraci 50 mg/ml a těsně před umístěním těchto roztoků do termostatu (teplota 37^C) byl do těchto roztoků přidán zásobní roztok katepsinu B nebo glutathionu, tak aby výsledná koncentrace těchto Činidel byla pro kathepsin B 5.10'7 mol/1 a pro glutathion 3.10'3 mol/1 vinkubačním médiu. V předem určených intervalech byly zinkubačních roztoků odebírány alikvoty (200 μΐ), které byly odsoleny na kolonách PD-10 a zlyofilizovány. Molekulová hmotnost degradačních produktů byla změřena na kapalinovém chromatografu Shimadzu SIL-HT doplněném diferenciálním refraktometrem (Shimadzu RID-10A) a mnohoúhlovým detektorem rozptylu světla (DAWN EOS, Wyatt Technology, USA). Analýza byla prováděna na koloně Superose™6 (300 x 10 mm) (Amersham Bioscience). Jako mobilní fáze byl použit 0,3 M octanový pufr (CH3COONa/CH3COOH; pH = 6,5; 0,5 g/1 NaN3) o průtoku 0,5 ml/min. Molekulová hmotnost a polydisperzita kopolymerů byla vypočtena pomocí Astra software (Wyatt Technology, USA).
Konjugáty obsahující enzymaticky degradovatelné sekvence GlyPheLeuGly (Konjugát ld) byly degradovány během 24h katepsinem B na degradační produkty s molekulovou hmotností pod limitem renální filtrace (Obr.37). V roztoku obsahujícím koncentraci glutathionu (3.10’3 mol/1) jsme zjistili rychlou degradaci roubovaných konjugátů obsahujících disulfídické můstky. Tyto roubované konjugáty byly po 24h degradovány na polymemí degradační produkty s molekulovou hmotností pod limitem renální filtrace (~ 25000 g/mol).
• · ·
Příklad 26. Ukázka in vitro biologické aktivity roubovaných konjugátů doxorubicinu při inkubaci s buňkami různých nádorových linií.
Tabulka 1: Cytotoxicity roubovaných polymerů, srovnání s Hydrazonem
| Vzorek č.: | Struktura: | EL4 | 3803 | SW620 | ConA | 3T3 | Ráji | Jurkat |
| B-578 | P- Acap-Dox (Hydrazon) | <0,016 0,342 0.035 | 0,004 <0,016 | 0,034 | 0,09 | 0,019 | <0,016 | 0,258 |
| B-624 | P -AK-NH- N=Dox \ GFLG-OH | 0,152 0,290 | 0,0094 0,0008 | 0,900* 0,040 | 0,051 0,213 | 0.045 1 0,04 | 0,003 0,0107 | 0,835* 0.461 1 |
| B-599 | P-AK-HN- N=Dox \ gr-GFLG-P- NHN=Dox | 0,557 | <0,016 | |||||
| B-613 | P -AK-NH- N=Dox \ gr-S-S-P-AK- NH-N=Dox | 0,017 | 0,01 | 0,019 | 0,098 | |||
| Dox | 0,015 0,007 | 0,0005 0,0002 | 0,003 | 0,029 0,008 | 0,009 0,003 | 0,0005 1 0,0014 | 0,119* 0,119 |
Oba typy roubovaných konjugátů Dox (s enzymaticky štěpitelnou vazbou i reduktivně štěpitelnou vazbou připojenými rouby) byly in vitro testovány na škále nádorových linií jak myšího (EL 4; 3803; 3T3; BCL1) tak lidského původu (SW 620). Bylo zjištěno, že hodnota IC50 konjugátů je u všech linií 5 - 10 x nižší než je IC50 pro volný nemodifikovaný doxorubicin. Všechny testované linie jsou na konjugáty velmi citlivé, závisí ale na jejich původu. Nejcitlivější je linie myšího B buněčného lymfomu 3803. Méně citlivá je linie lidského kolorektálního karcinomu a myšího fibrosarkomu, následuje linie myší B leukémie. Nejméně citlivý je myší T buněčný lymfom.
• · · ( ··· ··» «<
Příklad 27. Ukázka in vivo biologické aktivity roubovaných konjugátů doxorubicinu u myší inokulovaných T buněčným lymfomem EL4
Pro in vivo pokusy byl použit model myšího T buněčného lymfomu EL 4, experimentální zvířata byly myši (samci) kmene B/6, kterým bylo v den 0 subkutánně implantováno 105 nádorových buněk. Konjugáty byly podány intravenózně 1x15 mg/kg DOX ekvivalentu. Jednorázové podání se uskutečnilo devátý den po transplantaci nádorových buněk, tj. v době, kdy byl nádor hmatatelný a o velikosti cca 400 mm3. Všechny experimentální skupiny vykázaly již třetí den po první aplikaci významně zpomalený růst nádorů při srovnání s kontrolami. Oba roubované konjugáty (Konjugát ld a Konjugát 3a) vykázaly velmi výrazný protinádorový efekt. V obou případech došlo k potlačení růstu nádoru a u většiny pokusných zvířat dokonce k vymizení nádoru. Po aplikaci Konjugátu 3a (SS můstek) přežívalo 100 % myší 70. den po podání nádorových buněk, což byl konec experimentu. V případě podání Konjugátu ld přežilo 88 % laboratorních zvířat rovněž 70. den, kdy byl experiment ukončen. U obou experimentálních skupin léčených vzorky roubovaných konjugátů byl zřetelný významný ústup nádoru po podání zmíněných konjugátů, úbytek váhy jako znak toxicity, nebyl pozorován. U kontrolní léčby lineárním rozpustným konjugátem bylo vyléčeno pět myší z osmi. U kontrol došlo k úhynu všech zvířat, nejkratší interval přežití je 28 dní a nejdelší 35 dní. Příklady výsledky in vivo testů jsou demonstrovány na obr. 4 a v tabulce 1 (LTS - long term survivors, dlouhodobě přežívající).
• · · · • · · « · · · • · · • · · • · · · · ·
| Konjugát 1d | Konjugát 3a | Lineární konjugát | Kontroly |
| 39 | LTS | 41 | 28 |
| LTS | LTS | 41 | 29 |
| LTS | LTS | 49 | 29 |
| LTS | LTS | LTS | 29 |
| LTS | LTS | LTS | 29 |
| LTS | LTS | LTS | 32 |
| LTS | LTS | LTS | 34 |
| LTS | LTS | LTS | 35 |
Tabulka 1. Přežívání B/6 myší s inokulovaným myším lymfomem EL 4 (den 0, 105 buněk, s.c.) léčených roubovanými konjugáty DOX po i.v. podání jedné dávky 15 mg/kg ekvivalentu DOX v terapeutickém režimu podání léčiva (den 9). Lineární konjugát je kontrolní „klasický“ rozpustný neroubovaný konjugát. Dny znamenají jednotlivé dny úhynu zvířat, LTS přežívající zvířata byla bez hmatatelného nádoru.
Claims (26)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Polymemí léčivo, v němž je na vodorozpustný polymemí nosič připravený na bázi kopolymerů N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu navázáno kancerostatikum doxorubicin, připojené pomocí spojek obsahující hydrolyticky štěpitelné hydrazonové vazby, vyznačující se tím, že struktura polymemího léčiva sestává z hlavního řetězce N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu nesoucího doxorubicin a dalšího řetězce N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu jako roubu, který případně nese rovněž doxorubicin, přičemž tyto rouby jsou k hlavnímu řetězci připojeny vazbou v organizmu stálou a/nebo vazbou v organizmu štěpitelnou.
- 2. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se tím, že jsou rouby připojeny k hlavnímu řetězci vazbou štěpitelnou v nádorové buňce, a to enzymaticky a/nebo reduktivně.
- 3. Polymemí léčivo podle nároku 2, vyznačující se tím, že jsou rouby připojeny k hlavnímu řetězci oligoptidickou sekvencí a/nebo disulfidovou vazbou.
- 4. Polymemí léčivo podle nároku 3, vyznačující se tím, že jsou rouby připojeny k hlavnímu řetězci oligopeptickou spojkou zvolenou z řady GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly a GlyLeuPheGly.
- 5. Polymemí léčivo podle nároku 1 až 4, vyznačující se tím, že jsou molekulové hmotnosti hlavního řetězce i roubů voleny tak, aby jak hlavní řetězec před vazbou roubů, tak i samotné rouby byly po degradaci vyloučitelné z organizmu, zatímco celková molekulová hmotnost roubovaného polymeru převyšovala vylučovací limit organizmu.
- 6. Polymemí léčivo podle nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že molekulová hmotnost roubovaného polymeru je 50 000 až 400 000 g/mol a obsah doxorubicinu se pohybuje mezi 1 až 25 % hmotn.* · · · · · >4 » * · · «· 4 <···· · · ·« • · · · · ···« • · · « · « t-51
- 7. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou la kde n nabývá hodnot 40 až 335, m 0 až 85, p 1 až 20, q 1 až 10 a r 34 až 350, Dox znamená zbytek doxorubicinu a SPi představuje aminoacyl, zejména glycyl, glycylglycyl, β-alanyl, 6aminohexanoyl (AH) nebo 4-aminobenzoyl a/nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly nebo GlyPheLeuGly.9 · • ♦ *· • · · • · · · « · « · • · · · « «-52 —
- 8. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou lb (lb) kde s nabývá hodnot 0až50atlaž20a ostatní symboly mají význam uvedený v nároku 7.• · · · ···· · · ···- 53
- 9. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou lcNH,CH, nDox (ic) kde SP2 představuje složený acyl vycházející z enzymaticky odbouratelné oligopeptidické sekvence typu GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly nebo GlyPheLeuGly a ostatní symboly mají význam uvedený v nároku 8> .• · »· · · · * v ··· ·· ·· · * • « · · · · · · • · · · ···· »· ··· —54
- 10. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou ld kde jednotlivé symboly mají význam uvedený v nároku 9.• 40« * · · » • · · t · «4 · , • •44 4 4 · · ••44 4 4 · 4 4 • · · ·4 4 »4444 44 «44 444 ·4
- 11. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou 2 kde jednotlivé symboly mají význam uvedený v nároku 9.• · «· • · · • · · ·-56 —
- 12. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou 3a νύ, kde jednotlivé symboly mají význam uvedený v nároku 8.·· ·· • · · · • · · · • · · • · · · · · « • «ve • · · · • · · —57 —
- 13. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou 3b ?H, (3b), kde jednotlivé symboly mají význam uvedený v nároku 8.
• 4 • · · • 4 • · • * 4 • · • 4 • 4 • « « • · 4 · • · • • t 4 4 • · · · • · • · * • 4 · • 4 — 58 - 14. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou 4a . .H/ kde jednotlivé symboly mají význam uvedený v nároku 8.—59 —
- 15. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou 4b (4b), kde jednotlivé symboly mají význam uvedený v nároku 8.
- 16. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou 4c ♦ · «« » · «4 • · · «· * · «· • · · · · · t « • · · t f « * • · · · · · ««· *« · C · —60 kde jednotlivé symboly mají význam uvedený v nároku 8.
- 17. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou 5 kde jednotlivé symboly mají význam uvedený v nároku 9.
- 18. Farmaceutická kompozice obsahující jako účinnou složku látku podle kteréhokoli předchozího nároku, určená k léčbě nádorových onemocnění.
- 19. Farmaceutická kompozice podle nároku 18, určená k léčbě pevných tumorů.
- 20. Farmaceutická kompozice podle nároku 18, určená k léčbě některých typů lymfomů a leukémií.
- 21. Způsob výroby polymemího léčiva podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se sestává z následujících stupňů:a. příprava základních monomenfaích jednotek, kterými je xV-(2- hydroxypropyl)methakrylamid a další methakryloylované deriváty aminokyselin nebo oligopeptidů zakončené reaktivní 4-nitrofenoxy- nebo <· «4 • « » • « « · • · · · • · · * « · · t Λ ·» « « • * • f • t c · · « < s-61 — thiazolidinthionovou skupinou; nebo jsou zakončeny hydrazinovou skupinou chráněnou butyloxykarboxylovou skupinou; nebo jsou zakončeny doxorubicinem; nebo methakryloylované makromonomery připravené metakryloylací semitelechelického kopolymerů N-(2“hydroxypropyl)methakrylamidu zakončené primární amino skupinou;b. syntéza polymemích prekursorů, tj.: (a) základního řetězce nesoucího funkční skupiny 4-nitrofenoxy, thiazolidin-2-thionové, hydrazidové, primární amino, sulfhydrylové (SH) nebo dithiopyridylové (PDS), buď polymerací základních monomerů nesoucích tyto skupiny nebo modifikací funkčních skupin polymeranalogickou reakcí, a (b) roubů zakončených reaktivní skupinou, připravených radikálovou polymerací základních monomemích jednotek, popřípadě radikálovou kopolymerací prováděnou v přítomnosti přenašeče nebo iniciovanou iniciátorem 3,3'-[4>4'-azobis(4-kyan^-4-methyl-l-oxo-butan-4,1- diyl)]bis(thiazolidin-2-thionem) (ABIK-TT) s následnými modifikacemi koncových skupin;c. reakce funkčních skupin základního řetězce a reaktivních skupin roubu za vzniku polymemího nosiče, popřípadě hotového polymemího konjugátu, pokud byly použity k přípravě polymerů monomemí jednotky s obsahem doxorubicinu;d. případné odstranění tybutyloxykarbonylové (Boc) skupiny chránící hydrazidové skupiny a jejich následná reakce s příslušným kancerostatikem.
- 22. Způsob podle nároku 21 pro výrobu polymemího léčiva vzorce la; lb; lc nebo ld, vyznačující se tím, že základní řetězec při reakci podle bodu c. nese ve své struktuře buď hydrazidové nebo primární aminoskupiny, zatímco rouby jsou zakončeny skupinami /V-sukcinimidylesterovou nebo acyltbiazolidin-2-thionovou.
- 23. Způsob podle nároku 21 pro výrobu polymemího léčiva vzorce 2, vyznačující se tím, že základní řetězec při reakci podle bodu c. nese ve své struktuře reaktivní 4-nitrofenoxy nebo thiazolidin-2-thionové skupiny, zatímco rouby jsou zakončeny koncovou hydrazidovou nebo primárními aminoskupinou.«· <· * c v « · β · «4 • « · · · · • · · 4 « · * · · · * ·««· ·· i « · III t t » * < e « « « i • e-62 —
- 24. Způsob podle nároku 21 pro výrobu polymemího léčiva vzorce 3a nebo 3b, vyznačující se tím, že základní řetězec při reakci podle bodu c. nese ve své struktuře reaktivními dithiopyridilové skupiny, zatímco rouby jsou zakončeny sulfhydrylovou skupinou.
- 25. Způsob podle nároku 21 pro výrobu polymemího léčiva vzorce 4a ; 4b nebo 4c, vyznačující se tím, že základní řetězec při reakci podle bodu c. nese ve své struktuře sulfhydrylové skupiny, zatímco rouby jsou zakončeny dithiopyridylovou skupinou.
- 26. Způsob podle nároku 21 pro výrobu polymemího léčiva vzorce 5, vyznačující se radikálovou terpolymerací V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými tÁ- butyloxykarbonyl hydrazinovou skupinou a makromonomery připravenými methakryloylací N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu semitelechelického kopolymeru zakončeného aminoskupinou vzorce:
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20060592A CZ2006592A3 (cs) | 2006-09-18 | 2006-09-18 | Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby |
| UAA200903818A UA97812C2 (ru) | 2006-09-18 | 2007-09-18 | Прививочные макромолекулярные конъюгаты доксорубицина с противоопухолевой активностью и способ их получения |
| EP07801128.5A EP2063914B1 (en) | 2006-09-18 | 2007-09-18 | Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation |
| EA200900453A EA017073B1 (ru) | 2006-09-18 | 2007-09-18 | Привитые макромолекулярные конъюгаты доксорубицина, обладающие противораковой активностью, и способ их получения |
| US12/441,619 US8603990B2 (en) | 2006-09-18 | 2007-09-18 | Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation |
| PCT/CZ2007/000087 WO2008034391A1 (en) | 2006-09-18 | 2007-09-18 | Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20060592A CZ2006592A3 (cs) | 2006-09-18 | 2006-09-18 | Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ298945B6 CZ298945B6 (cs) | 2008-03-19 |
| CZ2006592A3 true CZ2006592A3 (cs) | 2008-03-19 |
Family
ID=38982478
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20060592A CZ2006592A3 (cs) | 2006-09-18 | 2006-09-18 | Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8603990B2 (cs) |
| EP (1) | EP2063914B1 (cs) |
| CZ (1) | CZ2006592A3 (cs) |
| EA (1) | EA017073B1 (cs) |
| UA (1) | UA97812C2 (cs) |
| WO (1) | WO2008034391A1 (cs) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012505228A (ja) | 2008-10-07 | 2012-03-01 | レクサン ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | Ｈｐｍａ−ドセタキセルまたはゲムシタビンコンジュゲートおよびその使用 |
| CZ301288B6 (cs) * | 2008-10-23 | 2009-12-30 | Zentiva, A. S | Polymerní prípravek se synergickým úcinkem pri lécbe nádorových onemocnení |
| CZ303072B6 (cs) * | 2009-02-13 | 2012-03-21 | Zentiva, K.S. | Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika |
| KR101721865B1 (ko) * | 2009-10-13 | 2017-04-03 | 렉산 파마슈티컬스, 인코포레이티드 | 항암제의 전달을 위한 폴리머 시스템 |
| CZ302830B6 (cs) | 2009-12-15 | 2011-11-30 | Ústav makromolekulární chemie AV CR, v.v.i. | Vysokomolekulární polymerní nosice léciv odvozené od dendrimeru a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru |
| ES2673672T3 (es) | 2011-02-11 | 2018-06-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Composiciones tripeptídicas y su uso para el tratamiento de la diabetes |
| EP2716633B1 (en) | 2011-05-26 | 2017-05-17 | Xuanzhu Pharma Co., Ltd. | Quinazoline derivative as tyrosine-kinase inhibitor, preparation method therefor and application thereof |
| CN103936945B (zh) * | 2013-01-23 | 2017-02-08 | 中国科学院化学研究所 | 一类高效抗肿瘤靶向药物载体及其制备方法 |
| CN106995516B (zh) * | 2016-01-22 | 2019-08-02 | 北京化工大学 | 肿瘤特异性富集的纳米载药体系及其制备方法 |
| CZ308419B6 (cs) * | 2016-04-11 | 2020-08-12 | Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. | Blokový kopolymer pro překonání lékové rezistence nádorů k chemoterapii, jeho polymerní konjugát s léčivem, farmaceutická kompozice je obsahující, způsob jejich přípravy a jejich použití |
| CN105963706B (zh) * | 2016-04-15 | 2019-03-15 | 四川大学 | 一种支化hpma共聚物-dox偶联物及其制备方法和应用 |
| CZ309585B6 (cs) * | 2019-12-17 | 2023-05-03 | Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. | Polymerní konjugát s hydrolytickým uvolňováním kancerostatika cytarabinu, způsob jeho přípravy a jeho použití |
| CN112940248B (zh) * | 2021-02-04 | 2023-07-18 | 西安交通大学 | 一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子及其制备方法 |
| CN113908289B (zh) * | 2021-10-09 | 2023-07-25 | 北京化工大学 | 一种具有精确调控药物比例的抗肿瘤多元载药体系及其制备方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1139380A (zh) * | 1993-11-18 | 1997-01-01 | 癌症研究所 | 控释制剂 |
| US6060518A (en) * | 1996-08-16 | 2000-05-09 | Supratek Pharma Inc. | Polymer compositions for chemotherapy and methods of treatment using the same |
| US7279318B1 (en) * | 1999-06-09 | 2007-10-09 | Hybrid Systems Limited | Modification of biological elements |
| CZ293787B6 (cs) * | 2001-12-20 | 2004-07-14 | Zentiva, A.S. | pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii |
| CZ294996B6 (cs) * | 2003-07-16 | 2005-04-13 | Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr | Reaktivní polymery a kopolymery na bázi N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, způsob jejich přípravy a jejich použití pro syntézu polymerních léčiv, pro modifikaci biologicky aktivních proteinů a přípravu systémů pro dopravu genů |
| CZ297827B6 (cs) * | 2005-09-05 | 2007-04-04 | Zentiva, A. S. | Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva |
-
2006
- 2006-09-18 CZ CZ20060592A patent/CZ2006592A3/cs not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-09-18 UA UAA200903818A patent/UA97812C2/ru unknown
- 2007-09-18 EP EP07801128.5A patent/EP2063914B1/en not_active Not-in-force
- 2007-09-18 US US12/441,619 patent/US8603990B2/en active Active
- 2007-09-18 EA EA200900453A patent/EA017073B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2007-09-18 WO PCT/CZ2007/000087 patent/WO2008034391A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2063914A1 (en) | 2009-06-03 |
| EP2063914B1 (en) | 2018-12-26 |
| CZ298945B6 (cs) | 2008-03-19 |
| US8603990B2 (en) | 2013-12-10 |
| US20090306004A1 (en) | 2009-12-10 |
| UA97812C2 (ru) | 2012-03-26 |
| WO2008034391A1 (en) | 2008-03-27 |
| EA200900453A1 (ru) | 2009-10-30 |
| EA017073B1 (ru) | 2012-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ2006592A3 (cs) | Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby | |
| JP5944836B2 (ja) | 高分子薬物送達結合体ならびにその製造および使用方法 | |
| JP5781084B2 (ja) | 樹状高分子量ポリマー薬物担体および特に固形腫瘍の処置のための薬物とのそれらの結合体 | |
| US20190358341A1 (en) | Biocompatible and hydrophilic polymer conjugate for targeted delivery of an agent | |
| EP1463529B9 (en) | Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy | |
| CZ303072B6 (cs) | Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika | |
| Etrych et al. | Comparison of the pharmacological and biological properties of HPMA copolymer-pirarubicin conjugates: A single-chain copolymer conjugate and its biodegradable tandem-diblock copolymer conjugate | |
| CZ2006207A3 (cs) | Micelární nosiče léčiv s protinádorovou aktivitou | |
| Chytil et al. | Structural design and synthesis of polymer prodrugs | |
| WO2017177991A1 (en) | Block copolymer for overcoming drug resistance of tumours to chemotherapy, its polymer-drug conjugate, pharmaceutical composition containing them, method of preparation and use thereof | |
| CZ2006505A3 (cs) | Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy | |
| Etrych et al. | High-molecular-weight polymers containing biodegradable disulfide bonds: synthesis and in vitro verification of intracellular degradation | |
| Cuchelkar et al. | Polymer–drug conjugates | |
| CZ2019778A3 (cs) | Kopolymer s hydrolytickým uvolňováním kancerostatika cytarabinu, způsob jeho přípravy a jeho použití | |
| CZ2003605A3 (en) | pH sensitive polymeric conjugates of anthracycline cancerostatic for targeted therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20190918 |