CN112940248B - 一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子及其制备方法，该纳米粒子为氨基酸和阿霉素与丙炔酸酯连接形成的无规聚前药，然后络合不同功能金属离子而形成；以丙炔酸酯和含有活性亲核基团的氨基酸为反应原料，通过炔‑胺、炔‑酚或炔‑巯反应生成聚合物，与抗癌药物阿霉素继续反应，生成氨基酸‑阿霉素聚前药，然后配置金属离子盐溶液，搅拌滴入聚前药，聚合物主链中的羧基和氨基进一步络合不同功能金属离子，在低温条件下反应，透析，最后冻干得到产物；该金属配位纳米粒子构筑方法简单、尺寸稳定，且重复性能较好，磁共振成像效果显著，同时对癌细胞的杀伤力较大，能够进一步应用于肿瘤诊疗一体化的研究中。

Description

一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子及其制备方法
技术领域
本发明涉及聚前药/纳米材料制备技术领域，特别涉及一种pH响 应型金属配位聚前药纳米粒子及其制备方法。
背景技术
目前肿瘤临床治疗的化疗药物仍依赖于小分子药物，但小分子药 物存在着明显的缺陷，如溶解性差，体内循环时间短，毒副作用严重 等。聚前药是指通过高分子化学方法对预修饰的药物分子进行聚合得 到的聚合物，在机体内降解出原药而发挥作用。将小分子药物制备成 聚前药，不仅可以在一定程度上改善其溶解性，还能通过修饰靶向分 子，使其具有一定的特异性，从而减少化疗药物的毒副作用。目前聚 前药的合成方法中相对简便的方法主要有迈克尔加成反应、可逆加成 -链转移聚合及缩合聚合等，但是这些方法依然对反应条件有较高的 要求，而且产率较低。点击反应，是指通过小单元的拼接，完成各种 分子的化学合成，由于其反应条件简单且效率高，因此在聚前药的制 备方面有很广阔的应用前景。
点击化学的代表反应是叠氮-炔加成反应，反应原理是通过铜的 催化，炔基与叠氮基发生环加成反应，生成区域选择性的1,4-二取代 -1,2,3-三氮唑，该反应条件温和且产率较高，然而，由于反应中引入 了铜作为催化剂，会对生物体产生了一定的毒害作用。同时，目前的 聚合物前药分子功能较为单一，即大多数只能进行化疗，无法实现多 种治疗手段的结合或者诊疗一体化。因此，如何通过简单高效且无金 属催化的点击反应制备出可以实现诊疗一体化的聚前药分子是目前 生物医药领域的研究热点和难点。
发明内容
为了克服和解决上述聚前药分子制备过程中的问题和缺陷，本发 明的目的在于提供一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子及其制备 方法，以临床药物阿霉素原料为聚前药，络合不同功能金属离子形成 纳米粒子，所得产物具有诊断和治疗一体化的效果。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子，为氨基酸和阿霉素与 丙炔酸酯连接形成的无规聚前药，然后络合不同功能金属离子形成纳 米粒子。
所述的氨基酸是含有活性亲核基团的氨基酸，含两个活性亲核官 能团，官能团包括氨基、巯基或酚羟基。
所述的氨基酸包括赖氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸或组氨酸。
所述的丙炔酸酯由三元醇与丙炔酸通过酯化反应制备得到。
所述的无规聚前药，具有式I所示结构：
所述的功能金属离子包括Mn2+、Fe2+、Fe3+、Gd3+、Cu2+、Zn2+。
一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子的制备方法，包括如下 步骤：
(1)、以丙炔酸酯和含有活性亲核基团的氨基酸为反应原料，通 过炔-胺、炔-酚或炔-巯反应生成聚合物，然后与抗癌药物阿霉素继续 反应，生成氨基酸-阿霉素聚前药；
(2)、配置金属离子盐溶液，搅拌滴入步骤(1)聚前药，聚合 物主链中的羧基和氨基进一步络合不同功能金属离子，在低温条件下 反应，透析，最后冻干得到产物。
所述的丙炔酸酯由三元醇与丙炔酸通过酯化反应制备得到。
所述的氨基酸、丙炔酸酯及阿霉素的反应摩尔比为10:10:1～3。
所述的氨基酸与丙炔酸酯反应时所用的溶剂为乙腈和超纯水的 混合物，体积比为1:1，反应温度为40℃，反应时间为4～6小时，加 入阿霉素后继续反应时间为2～3小时。
所述的金属离子盐溶液为1mM，聚前药分子与金属离子溶液的 体积比为5:1～2，金属离子溶液中金属包括Mn2+、Fe2+、Fe3+、Gd3+、 Cu2+或Zn2+，对应的金属离子盐溶液为MnCl2、FeCl2、FeCl3、GdCl3、 CuCl2、ZnCl2.。
所述的络合金属离子的温度为0～4℃，反应时间为8～12小时。
所述的透析，透析袋的截留分子量为2000～3500Da，透析时间 为48小时。
本发明的优点：
(1)、根据本发明提供方法所制备的纳米粒子，具有较小的纳米 尺寸(100-150nm)和分散稳定性能，有优异的磁共振成像性能，且 在575-585nm范围内有荧光发射性能。
(2)、本发明提供了一种具有I式所示结构的聚前药分子，将该 聚前药分子用于制备金属配位的纳米粒子。本发明中所涉及的化合物 制备工艺简单，成本较低。所得聚前药可溶于二甲基亚砜，N,N-二 甲基甲酰胺等常用有机溶剂，并且具有一定的紫外吸收性能及荧光发 射性能。此外，该金属配位纳米粒子构筑方法简单、尺寸稳定，且重 复性能较好，磁共振成像效果显著，同时对癌细胞的杀伤力较大，能 够进一步应用于肿瘤诊疗一体化的研究中。
附图说明
图1为本发明实施例一中的赖氨酸(Lys)、1,1,1-三丙酸酯(TMP)、 阿霉素(DOX)单体，赖氨酸-1,1,1-三丙酸酯共聚物(LT)、赖氨酸 -1,1,1-三丙酸酯-阿霉素共聚物(LTD)，及络合锰离子后的纳米粒子 LTD@Mn2+的红外光谱图。
图2为本发明实施例一中的赖氨酸(Lys)、1,1,1-三丙酸酯(TMP)、 阿霉素(DOX)单体，赖氨酸-1,1,1-三丙酸酯共聚物(LT)、赖氨酸 -1,1,1-三丙酸酯-阿霉素共聚物(LTD)及络合锰离子后的纳米粒子 LTD@Mn2+的紫外-可见吸收光谱图。
图3为本发明中自组装纳米粒子的透射电镜图。
图4为本发明中自组装纳米粒子在暗场下的透射电镜图及元素(C、N、O、Mn)分布图像。
图5为本发明中纳米粒子的磁性能和磁共振造影能力的表征示意 图。
图6为本发明中纳米粒子在不同缓冲溶液中的释放曲线，图6(a) 释放的是阿霉素，图6(b)释放的是锰离子。
图7(a)为本发明中纳米材料在4T1(鼠源乳腺癌细胞)中的毒性 及相容性能示意图，孵育时间为48小时；图7(b)为本发明中纳米 材料在HeLa(人源宫颈癌细胞)中的毒性及相容性能示意图，孵育 时间为48小时。
图8为本发明中基于纳米粒子在荷瘤小鼠体内不同时间的磁共振 成像图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的做详细叙述。
本发明所述的一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子，为氨基 酸和阿霉素与丙炔酸酯连接形成的无规聚前药，然后络合不同功能金 属离子形成纳米粒子。
所述的氨基酸是含有活性亲核基团的氨基酸，含两个活性亲核官 能团，官能团包括氨基、巯基或酚羟基。
所述的氨基酸包括赖氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸或组氨酸。
所述的丙炔酸酯由三元醇与丙炔酸通过酯化反应制备得到。
所述的无规聚前药，具有式I所示结构：
所述的功能金属离子包括Mn2+、Fe2+、Fe3+、Gd3+、Cu2+或Zn2+。
实施例一
本实施例一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子的制备方法， 包括如下步骤：丙炔酸酯与赖氨酸在乙腈和水混合溶液中，40℃条 件下反应4小时，再加入阿霉素，继续反应2小时。反应结束后，滴 加MnCl2溶液，4℃条件下反应12小时，再用超纯水透析48小时后，冻干得到目标产物。
具体操作为：向100mL锥形瓶中加入用10mL乙腈溶解的丙 炔酸酯(0.28g,1mmol)和10mL超纯水溶解的赖氨酸(0.15g, 1mmol)；在40℃条件下反应4小时后，加入阿霉素(0.01g,0.02 mmol)继续反应2小时；反应结束后，取10mL产物搅拌滴加2 mL的MnCl2溶液(1mM)，再取10mL产物搅拌滴加2mL超纯水 作为对照组，在4℃条件下反应12小时，然后用超纯水透析(2000 Da)48小时，每隔两小时换一次水，冷冻干燥后得到目标产物。
所述的丙炔酸酯由三元醇与丙炔酸通过酯化反应制备得到,具体 为以丙炔酸和三羟甲基乙烷等为反应原料，在对甲苯磺酸催化作用 下，甲苯回流反应48小时生成末端炔基化合物1,1,1-三甲基丙酸酯；
反应式为：
具体操作为：在250mL单口瓶中加入丙炔酸(2.8g，40mm ol)，三羟甲基乙烷(1.24g，10mmol)和对甲苯磺酸(0.6g,3 mmol)，加入甲苯150mL溶解，加热到110℃后回流反应48小时； 之后，用饱和碳酸氢钠和水洗2-3次，用无水MgSO4干燥过夜，减 压去除溶剂后获得粗产物；选用石油醚和乙酸乙酯作为洗脱剂，经 柱层析分离提纯后获得白色固体产物2.04g，产率为74％。
产物的核磁波谱图为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝4.59(s, 3H),4.12(s,6H),0.98(s,3H)ppm.13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ＝ 152.3,75.9,74.1,67.2,38.4,16.5ppm。
图1为本实施例中各阶段产物的赖氨酸(Lys)、1,1,1-三丙酸酯 (TMP)、阿霉素(DOX)单体，赖氨酸-1,1,1-三丙酸酯共聚物(LT)、 赖氨酸-1,1,1-三丙酸酯-阿霉素共聚物(LTD)，及络合锰离子后的纳 米粒子LTD@Mn2+的红外光谱图，图2为本实施例一中的赖氨酸(Lys)、1,1,1-三丙酸酯(TMP)、阿霉素(DOX)单体，赖氨酸-1,1,1- 三丙酸酯共聚物(LT)、赖氨酸-1,1,1-三丙酸酯-阿霉素共聚物(LTD)， 及络合锰离子后的纳米粒子LTD@Mn2+的紫外-可见吸收光谱图。从 图中可以看出，LTD@Mn2+在红外光谱图2434cm-1,1724cm-1处的吸 收峰，以及在紫外光谱290nm,490nm处的吸收峰说明了聚前药分子 的成功制备。图3为本发明中自组装纳米粒子的透射电镜图，图4为 本发明中自组装纳米粒子在暗场下的透射电镜图及元素(C、N、O、 Mn)分布图像，图5为该纳米材料的磁共振造影能力的表征示意图， 结果显示，随着纳米粒子浓度的增大，T1成像效果也越来越明显。图 6为纳米粒子在不同pH条件下阿霉素(a)和锰离子(b)的释放曲线示意 图，结果表明在pH为5.0的环境中，药物的释放量更大，持续时间 更长，进一步说明该纳米粒子更倾向于在肿瘤微环境中裂解并释放药 物。图7为4T1细胞和HeLa细胞分别与纳米粒子在不同浓度条件下 共培养48小时后的存活率示意图，由图可知，本发明构筑的纳米粒 子有较大的肿瘤杀伤力。图8为纳米粒子通过尾静脉注射进小鼠体内 后的磁共振成像示意图，该图证明了制备的纳米粒子可以富集于肿瘤 部位，具备磁共振成像的功能，因此该纳米粒子在肿瘤诊疗一体化中 有巨大的应用潜力。
实施例二
本实施例一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子的制备方法， 包括如下步骤：1,1,1-三甲基丙酸酯与半胱氨酸在乙腈和水混合溶液 中，在三乙胺催化条件下40℃反应6小时，再加入阿霉素，继续反 应3小时；反应结束后，滴加MnCl2溶液，0℃条件下反应12小时，再用超纯水透析48小时后，冻干得到目标产物。
具体操作为：向100mL锥形瓶中加入用10mL乙腈溶解的1,1, 1-三甲基丙酸酯(0.28g,1mmol)和10mL超纯水溶解的半胱氨酸 (0.12g,1mmol)，加入三乙胺20微升，在40℃条件下反应6小 时后，加入阿霉素(0.015g,0.03mmol)继续反应3小时；反应结 束后，取10mL产物搅拌滴加4mL的MnCl2溶液(1mM)，再取 10mL产物搅拌滴加4mL超纯水作为对照组，在0℃条件下反应1 2小时，然后用超纯水透析(2000Da)48小时，每隔两小时换一次 水，冷冻干燥后得到目标产物。
通过测定产物的红外光谱图和紫外-可见吸收光谱图，证明了聚 前药分子的成功制备。自组装的纳米粒子尺寸均匀且T1磁共振成像 效果显著。通过测定纳米粒子的药物释放曲线再次证明了其更倾向于 在偏酸性的肿瘤微环境中裂解和释放药物。同时，在细胞和动物水平 上也进一步证明本发明构筑的纳米粒子有较大的肿瘤杀伤力且可以 富集于肿瘤部位，具备磁共振成像的功能。因此该纳米粒子在肿瘤诊 疗一体化中有巨大的应用潜力。
实施例三
本实施例一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子的制备方法， 包括如下步骤：1,1,1-三甲基丙酸酯与酪氨酸在乙腈和水混合溶液中， 在三乙胺催化条件下40℃反应5小时，再加入阿霉素，继续反应2 小时；反应结束后，滴加MnCl2溶液，0℃条件下反应8小时，再用 超纯水透析48小时后，冻干得到目标产物。
具体操作为：向100mL锥形瓶中加入用10mL乙腈溶解的1,1, 1-三甲基丙酸酯(0.28g,1mmol)和10mL超纯水溶解的酪氨酸(0. 18g,1mmol)；在40℃条件下反应5小时后，加入阿霉素(0.005 g,0.01mmol)继续反应2小时；反应结束后，取10mL产物搅拌 滴加2mL的MnCl2溶液(1mM)，再取10mL产物搅拌滴加2m L超纯水作为对照组，在0℃条件下反应8小时，然后用超纯水透析 (3500Da)48小时，每隔两小时换一次水，冷冻干燥后得到目标产 物。
通过测定产物的红外光谱图和紫外-可见吸收光谱图，证明了聚 前药分子的成功制备。自组装的纳米粒子尺寸均匀且T1磁共振成像 效果显著。通过测定纳米粒子的药物释放曲线再次证明了其更倾向于 在偏酸性的肿瘤微环境中裂解和释放药物。同时，在细胞和动物水平 上也进一步证明本发明构筑的纳米粒子有较大的肿瘤杀伤力且可以 富集于肿瘤部位，具备磁共振成像的功能。因此该纳米粒子在肿瘤诊 疗一体化中有巨大的应用潜力。

Claims (9)

1.一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子，其特征在于，为氨基酸和阿霉素与丙炔酸酯连接形成的无规聚前药，然后络合不同功能金属离子形成纳米粒子；
所述的氨基酸是含有活性亲核基团的氨基酸，含两个活性亲核官能团，官能团包括氨基、巯基或酚羟基；
所述的丙炔酸酯由三元醇与丙炔酸通过酯化反应制备得到；
所述的无规聚前药，具有式I所示结构：
所述的功能金属离子包括Mn2+、Fe2+、Fe3+、Gd3+、Cu2+或Zn2+。
2.根据权利要求1所述的一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子，其特征在于，氨基酸包括赖氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸或组氨酸。
3.基于权利要求1或2所述的一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、以丙炔酸酯和含有活性亲核基团的氨基酸为反应原料，通过炔-胺、炔-酚或炔-巯反应生成聚合物，然后与抗癌药物阿霉素继续反应，生成氨基酸-阿霉素聚前药；
(2)、配置金属离子盐溶液，搅拌滴入步骤(1)聚前药，聚合物主链中的羧基和氨基进一步络合不同功能金属离子，在低温条件下反应，透析，最后冻干得到产物。
4.根据权利要求3所述的一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述的丙炔酸酯由三元醇与丙炔酸通过酯化反应制备得到。
5.根据权利要求3所述的一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述的氨基酸、丙炔酸酯及阿霉素的反应摩尔比为10:10:1～3。
6.根据权利要求3所述的一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述的氨基酸与丙炔酸酯反应时所用的溶剂为乙腈和超纯水的混合物，体积比为1:1，反应温度为40℃，反应时间为4～6小时，加入阿霉素后继续反应时间为2～3小时。
7.根据权利要求3所述的一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述的金属离子盐溶液为1mM，聚前药分子与金属离子溶液的体积比为5:1～2，金属离子溶液中金属包括Mn2+、Fe2+、Fe3+、Gd3+、Cu2+或Zn2+，对应的金属离子盐溶液为MnCl2、FeCl2、FeCl3、GdCl3、CuCl2、ZnCl2。
8.根据权利要求3所述的一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述的络合金属离子的温度为0～4℃，反应时间为8～12小时。
9.根据权利要求3所述的一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述的透析，透析袋的截留分子量为2000～3500Da，透析时间为48小时。
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